JP2021012200A - Ｔｉｍタンパク質結合担体、当該担体を用いた細胞外膜小胞及びウイルスの取得方法、除去方法、検出方法並びに当該担体を含むキット - Google Patents

Ｔｉｍタンパク質結合担体、当該担体を用いた細胞外膜小胞及びウイルスの取得方法、除去方法、検出方法並びに当該担体を含むキット Download PDF

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Abstract

【課題】試料中に存在する細胞外膜小胞又はウイルスを、純度良く、インタクトな状態で簡便且つ効率的に取得又は除去し、或いは高感度に検出するための担体及び方法の提供を課題とする。【解決手段】試料中の細胞外膜小胞を検出する方法；（１）カルシウムイオン存在下、担体に結合したＴ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子４（Ｔｉｍ４）タンパク質と試料中の細胞外膜小胞との複合体を形成させる工程（複合体形成工程）（２）当該複合体を細胞外膜小胞に対して結合する抗体を用いて検出する工程を含む。【選択図】なし

Description

本発明は、Ｔｉｍタンパク質結合担体、当該担体を用いた細胞外膜小胞及びウイルスの取得方法、除去方法、検出方法並びに当該担体を含むキットに関する。
細胞外膜小胞は、その粒子内部にタンパク質やｍｉｃｒｏＲＮＡ等の核酸が存在し、細胞間の物質伝達を担っていることが知られている。細胞外膜小胞は、血液等の体液中にも分泌されており、細胞外膜小胞中のタンパク質やｍｉｃｒｏＲＮＡ等が疾患の診断マーカーとして注目されている。また、核酸医薬のデリバリーツールとしての応用も注目されている。
また、ウィルスには表面に膜状のエンベロープをまとったエンベロープウィルスが数多く存在している。エンベロープウィルスは、インフルエンザウィルスやヒト免疫不全ウィルスなど疾患を引き起こすものが多いため、研究対象として注目されている。また、エンベロープウィルスは無毒化してワクチンやベクターなどに利用され、疾患の予防や治療に応用されている。
このように細胞外膜小胞の診断や医薬品への利用、エンベロープウィルスのワクチンやベクターとしての利用、細胞外膜小胞やエンベロープウィルスの機能解析等の基礎研究等を行う上で、細胞外膜小胞やエンベロープウィルスを高純度に取得する工程は必要不可欠であり、簡便に高純度な細胞外膜小胞やエンベロープウィルスを取得できる手法が待ち望まれている。また、生物由来細胞外膜小胞やエンベロープウィルスのコンタミネーションを防ぐため、使用する体液由来材料から効率的に細胞外膜小胞やエンベロープウィルスを除去する手法の開発が期待されている。さらに取得した細胞外膜小胞やエンベロープウィルス、また検体中の細胞外膜小胞やエンベロープウィルスを高感度に検出する手法も待ち望まれている。
細胞外膜小胞を取得する方法としては、サンプルを超遠心分離処理し、細胞外膜小胞を沈殿画分として得る方法が最も一般的な方法として知られている（非特許文献１）。しかし、この方法では細胞外膜小胞以外に、サンプル中に含まれるタンパク質複合体や凝集体、ＨＤＬなどのリポタンパク質等も共沈し、純度の高い細胞外膜小胞を得るのが困難である。前記超遠心分離処理により得られた沈殿画分をショ糖密度勾配法により密度分画することでタンパク質複合体や凝集体を分離することはできるが、密度が等しいＨＤＬとの分離は困難である。また、この方法は超遠心分離処理が必要なことから多検体を同時に処理することも困難である。加えて、超遠心分離処理には、高価な機械が必要である。
また、ＥｘｏＱｕｉｃｋ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）やＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に代表される市販の試薬を添加して遠心分離処理により沈殿画分として細胞外膜小胞を得る方法もある（非特許文献１）が、前記超遠心分離処理による方法よりも得られる細胞外膜小胞の純度がさらに低いという問題がある。
これらの従来法の他に、細胞外膜小胞の表面抗原タンパク質に対する抗体を用いて、当該表面抗原タンパク質と抗体のアフィニティーによって細胞外膜小胞を取得する方法（抗ＣＤ６３抗体固定化法、Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ６３ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）等）がある（非特許文献１）。これらの方法では、高純度な細胞外膜小胞が得られるものの、抗体に対する表面抗原タンパク質を有する細胞外膜小胞しか得ることができない、細胞外膜小胞の収量が少ない、抗体から細胞外膜小胞を溶出させるために界面活性剤や酸性バッファー等を用いる必要があり、インタクトな（即ち、細胞外膜小胞の本来の機能を保ったままの状態で）細胞外膜小胞を得ることが困難である、等の問題がある。
ウィルスを取得する方法としてはサンプルを超遠心分離処理し、ウィルスを沈殿画分として得る方法が最も一般的な方法として知られている（非特許文献１）。しかし、この方法ではウィルス以外に、サンプル中に含まれるタンパク質複合体や凝集体、ＨＤＬなどのリポタンパク質等も共沈し、純度の高いウィルスを得るのが困難である。前記超遠心分離処理により得られた沈殿画分をショ糖密度勾配法により密度分画することでタンパク質複合体や凝集体を分離することはできるが、密度が等しい凝集体との分離は困難である。また、超遠心分離処理によりウィルスの活性が落ちてしまうという問題もある（非特許文献２）。また、これらの方法は超遠心分離処理が必要なことから多検体を同時に処理することも困難である。加えて、超遠心分離処理には、高価な機械が必要である。
これらの方法の他にイオン交換クロマトグラフィーでウィルスを精製する方法が知られている（非特許文献３）。しかし、この方法ではそれぞれのウィルスに対して最適な条件を設定する必要がある。また、条件設定が困難な場合もあり、すべてのウィルスの精製に適用させるのは困難である。
細胞外膜小胞を除去する方法としては、サンプルを超遠心分離処理し、細胞外膜小胞を沈殿分画し、その上清画分を除去サンプルとして得る方法が最も一般的な方法として知られている。しかしこの方法では完全に細胞外膜小胞を除去することは困難であり、除去しきれない細胞外膜小胞がサンプルに残存してしまう。
さらに、ＥｘｏＱｕｉｃｋ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）やＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に代表される市販の試薬を添加して遠心分離処理により細胞外膜小胞を沈殿分画し、その上清画分を除去サンプルとして得る方法もある。しかしこの方法においても除去しきれずサンプル中に細胞外膜小胞が残存し、完全に細胞外膜小胞を除去することが困難であった。またサンプル中に添加した試薬が混入するため、その試薬が細胞外膜小胞の生物活性などに問題を引き起こす場合があった。
ウイルスを除去する方法としても同様の方法が知られており、細胞外膜小胞を除去する方法と同様の問題があった。
細胞外膜小胞を検出する方法としては、細胞外膜小胞の表面抗原に対する抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡが一般的な方法として知られている。しかし通常の発色シグナルを検出する抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系の最低検出感度は精製エクソソームで３μｇ程度と報告されており、血清などの体液サンプルを測定する上で十分な感度が得られていなかった（非特許文献４）。ウイルスを検出する方法としても同様の方法が知られており、ウイルスの検出についても十分な感度が得られていなかった。
またその他の細胞外膜小胞を検出する方法としては、フローサイトメトリー法が知られている。しかし、細胞外膜小胞の表面抗原に対する抗体を固定化した担体を用いて細胞外膜小胞を捕捉する通常の方法では、十分な感度が得られておらず、培養上清又は体液などのサンプルから直接検出するのは困難で、サンプルから細胞外膜小胞を濃縮又は精製してから検出する必要があった。
Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｗ． Ｗｉｔｗｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ２０１３ Ｍａｙ ２７；２． ｄｏｉ： １０．３４０２ Ｇ．Ｙ． Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． ２５ （２００９） １６６９ Ｐｅｔｒａ Ｇｅｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ， １２９０ （２０１３） ３６-４５ Ｍａｒｉａｎｔｏｎｉａ Ｌｏｇｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ ４ （２００９） ５２１９
以上のように、従来の細胞外膜小胞又はウィルスを取得する方法は、純度の高い細胞外膜小胞又はウィルスをインタクトな状態で簡便に且つ効率よく取得することが困難である。また、従来の細胞外膜小胞又はウィルスを除去する方法は、サンプル中の細胞外膜小胞又はウィルスを効率よく除去することが困難である。さらに従来の細胞外膜小胞又はウィルスの検出方法は十分な感度が得られていない。
従って、本発明の課題は、試料中に存在する細胞外膜小胞又はウィルスを、純度良く、またインタクトな状態で簡便且つ効率的に取得又は除去し、細胞外膜小胞又はウィルスを高感度に検出することである。
本発明は、前記課題を解決する目的でなされたものであり、以下の構成よりなる。
１．Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子４（Ｔｉｍ４）タンパク質、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子３（Ｔｉｍ３）タンパク質、及びＴ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子１（Ｔｉｍ１）タンパク質から選ばれるタンパク質（Ｔｉｍタンパク質）が結合した担体（Ｔｉｍ担体）。
２．以下の工程を含むことを特徴とする試料中の細胞外膜小胞又はウイルスを取得する方法；
（１）カルシウムイオン存在下、担体に結合したＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体を形成させる工程（複合体形成工程）
（２）当該複合体と試料とを分離する工程（複合体分離工程）
（３）当該複合体から細胞外膜小胞又はウイルスを分離し、細胞外膜小胞又はウイルスを取得する工程（取得工程）。
３．以下の工程を含むことを特徴とする試料中の細胞外膜小胞又はウイルスを除去する方法；
（１）カルシウムイオン存在下、担体に結合したＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体を形成させる工程（複合体形成工程）
（２）当該複合体と試料とを分離する工程（複合体分離工程）。
４．以下の工程を含むことを特徴とする試料中の細胞外膜小胞又はウイルスを検出する方法；
（１）カルシウムイオン存在下、担体に結合したＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体を形成させる工程（複合体形成工程）
（２）当該複合体を検出する工程（検出工程）
５．Ｔｉｍ担体を含んでなる、細胞外膜小胞又はウイルスの捕捉用キット。
６．Ｔｉｍタンパク質を含んでなる試薬と、担体を含んでなる試薬とを含んでなる細胞外膜小胞又はウィルスの捕捉用キット。
前記状況に鑑み、本発明者らは、鋭意研究の結果、Ｔｉｍ１タンパク質、Ｔｉｍ３タンパク質及びＴｉｍ４タンパク質から選ばれる少なくとも１種のタンパク質を用いることにより、ホスファチジルセリンを表面に有する細胞外膜小胞又はウィルスを高純度で得られること、当該細胞外膜小胞又はウィルスをインタクトな状態で得られること、当該細胞外膜小胞又はウィルスを効率よく除去すること、これらを高感度に検出することができることを見出し、本発明を発明するに至った。
細胞外膜小胞の表面にはリン脂質のホスファチジルセリンが存在（露出）している。ホスファチジルセリンに対して結合能を有するタンパク質（以下、「ホスファチジルセリン結合タンパク質」「ＰＳタンパク質」と略記する場合がある）としては、例えばＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｔｉｍ１（Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子１、Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｍｕｃｉｎ−ｄｏｍａｉｎ １）、Ｔｉｍ１（Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子１、Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｍｕｃｉｎ−ｄｏｍａｉｎ １）タンパク質、Ｔｉｍ３（Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子３、Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｍｕｃｉｎ−ｄｏｍａｉｎ ３）タンパク質、Ｔｉｍ４（Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子４、Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｍｕｃｉｎ−ｄｏｍａｉｎ ４）タンパク質等が知られている（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６５， ４９２３−４９２８ （２５ Ｍａｒｃｈ １９９０）、Ｎａｔｕｒｅ ４１７， １８２−１８７ （９ Ｍａｙ ２００２）、Ｎａｔｕｒｅ ４５０， ４３５−４３９ （１５ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００７）。
しかしながら、これらのＰＳタンパク質のうち、Ｔｉｍ１タンパク質、Ｔｉｍ３タンパク質及びＴｉｍ４タンパク質以外のＰＳタンパク質を用いた場合には、細胞外膜小胞又はウィルスを取得、除去又は検出することは困難であることが判った。
本発明によれば、試料中に存在する細胞外膜小胞又はウイルスを高純度で、またインタクトな状態で簡便且つ効率的に取得、除去でき、高感度に検出できる。
図１は実施例１−８において、細胞外膜小胞の取得の有無をウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。 図２は実施例９−１６において、細胞外膜小胞の取得の有無をウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。 図３は実施例１７−１８において、細胞外膜小胞の取得の有無をウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。 図４−Ａは実施例１９−２０及び比較例１−３において、細胞外膜小胞の取得の有無をウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。図４−Ｂは実施例１９−２０及び比較例１−３において、細胞外膜小胞の取得の有無を銀染色により確認した電気泳動図である。 図５は実施例２１において、本発明の方法により取得した細胞外膜小胞を、電子顕微鏡により観察した図である。 図６は実施例２２−２５において、細胞外膜小胞の取得の有無をウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。 図７は実施例２６−２７及び比較例４−９において、細胞外膜小胞の取得の有無を銀染色により確認した電気泳動図である。 図８は実施例２８−３３において、細胞外膜小胞の取得の有無を、ウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。 図９は実施例３４−３５及び比較例１０−１３において、細胞外膜小胞の取得の有無をウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。 図１０は実施例３６−３８において、細胞外膜小胞の取得の有無をウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。 図１１は実施例３９−４０において、細胞外膜小胞の取得の有無をウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。 図１２は実施例４１−４７において、細胞外膜小胞の取得（除去）の有無をウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。 図１３は実施例４８−５５において、細胞外膜小胞の取得（除去）の有無をウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。 図１４は実施例５６−６７及び比較例１４−１５において、細胞外膜小胞の取得の有無をウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。 図１５は実施例６８−７９において、細胞外膜小胞の取得の有無をウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。 図１６は実施例８０−８３及び比較例１６−１９において、細胞外膜小胞の取得の有無をウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。 図１７は実施例８４−９５及び比較例２０−２１において、ウイルスの取得の有無をウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。 図１８は実施例９６−９９及び比較例２２−２５において、ウイルスの取得の有無をウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。 図１９は実施例１００−１０５及び比較例２６−３３において、細胞外膜小胞をＥＬＩＳＡ法により検出した結果である。 図２０は実施例１０６−１０９において、細胞外膜小胞をＥＬＩＳＡ法により検出した結果である。 図２１は実施例１１０−１１５及び比較例３４−３９において、ウイルスをＥＬＩＳＡ法により検出した結果である。 図２２は実施例１１６−１１９において、ウイルスの取得の有無をウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。 図２３は実施例１２０−１２１及び比較例４０−４１において、細胞外膜小胞をフローサイトメトリー法により検出した結果である。 図２４は実施例１２２−１２３及び比較例４２−４３において、ウイルスの取得の有無をウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。 図２５は実施例１２４−１２５及び比較例４４−４５において、ウイルスの取得の有無をウエスタンブロッティングにより確認した電気泳動図である。
＜１．本発明に係る細胞外膜小胞＞
本発明に係る細胞外膜小胞としては、生体内の細胞又は培養細胞から分泌される、脂質二重膜で構成され、その膜表面にホスファチジルセリンを有する小型膜小胞である。当該小胞の直径は、通常２０ｎｍから１０００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍから５００ｎｍ、より好ましくは５０ｎｍから２００ｎｍである。
本発明に係る細胞外膜小胞は、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９， ５８１−５９３ （Ａｕｇｕｓｔ ２００９）、「肥満研究」Ｖｏｌ．１３ Ｎｏ．２ ２００７ トピックス 青木直人等に記載の通り、その発生起源及び小型膜小胞の大きさ等により様々に分類されるものが挙げられる。具体的には、エクソソーム（Ｅｘｏｓｏｍｅｓ）、微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）、エクトソーム（Ｅｃｔｏｓｏｍｅｓ）、膜粒子（Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、エクソソーム様小胞（Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｌｉｋｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、アポトーシス性小胞（Ａｐｐｏｔｏｔｉｃ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、アディボソーム（Ａｄｉｐｏｓｏｍｅ）等が挙げられる。
エクソソームは、後期エンドソームに由来する、脂質二重膜で構成され、その膜表面にホスファチジルセリンを有する小型膜小胞である。当該小胞の直径は、通常５０ｎｍから２００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍから１５０ｎｍ、より好ましくは５０ｎｍから１００ｎｍである。エクソソームは、ＣＤ６３やＣＤ９等のテトラスパニン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎｓ）、Ａｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、Ｌａｍｐ−１、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ等のタンパク質を含むことが知られている。
微小胞は、細胞膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｎｍｂｒａｎｅ）に由来する、脂質二重膜で構成され、その膜表面にホスファチジルセリンを有する小型膜小胞である。微小胞は、通常１００ｎｍから１０００ｎｍ、好ましくは１００ｎｍから８００ｎｍ、より好ましくは１００ｎｍから５００ｎｍである。微小胞は、インテグリン、セレクチン、ＣＤ４０リガンド等のタンパク質を含むことが知られている。
エクトソームは、細胞膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｎｍｂｒａｎｅ）に由来する、脂質二重膜で構成され、その膜表面にホスファチジルセリンを有する小型膜小胞である。エクトソームは、通常５０ｎｍから２００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍから１５０ｎｍ、より好ましくは５０ｎｍから１００ｎｍである。エクトソームは、ＣＲ１、タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）を含むが、ＣＤ６３は含まないことが知られている。
膜粒子は、細胞膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｎｍｂｒａｎｅ）に由来する、脂質二重膜で構成され、その膜表面にホスファチジルセリンを有する小型膜小胞である。膜粒子は、通常５０ｎｍから８０ｎｍである。膜粒子は、ＣＤ１３３を含むが、ＣＤ６３は含まないことが知られている。
エクソソーム様小胞は、初期エンドソームに由来する、脂質二重膜で構成され、その膜表面にホスファチジルセリンを有する小型膜小胞である。エクソソーム様小胞は、通常２０ｎｍから５０ｎｍである。エクソソーム様小胞は、ＴＮＦＲＩを含むことが知られている。
アポトーシス性小胞は、アポトーシス細胞に由来する、脂質二重膜で構成され、その膜表面にホスファチジルセリンを有する小型膜小胞である。アポトーシス性小胞は、通常５０ｎｍから５００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍから３００ｎｍ、より好ましくは５０ｎｍから２００ｎｍである。アポトーシス性小胞は、ヒストンを含むことが知られている。
アディボソームは、脂肪細胞に由来する、脂質二重膜で構成され、その膜表面にホスファチジルセリンを有する小型膜小胞である。アディボソームは、通常１００ｎｍから１０００ｎｍ、好ましくは１００ｎｍから８００ｎｍ、より好ましくは１００ｎｍから５００ｎｍである。アディボソームは、ＭＦＧ−Ｅ８（ｍｉｌｋ ｆａｔ ｇｌｏｂｕｌｅ−ＥＧＦ ｆａｃｔｏｒ ８）を含むことが知られている。
＜２．本発明に係るウイルス＞
本発明に係るウイルスとしては、宿主細胞の細胞膜、核膜、ゴルジ体、小胞体などに由来する脂質二重膜から構成されるエンベロープをウイルスのカプシド（外殻）に有し、エンベロープ表面にホスファチジルセリンを有するウイルス（以下、「エンベロープウイルス」とよぶ）である。当該本発明に係るウイルスの直径は、通常２０ｎｍ〜３２０ｎｍである。本発明に係るエンベロープウイルスとしては、生化学辞典 第２版、東京化学同人、１９９０、１５０３ｐ―１５０５ｐに記載されている科に属するエンベロープを有するウイルスが挙げられる。具体的には、ポックスウイルス科、バキュロウイルス科、ラブドウイルス科、ブニヤウイルス科、トガウイルス科、ヘルペスウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、レトロウイルス科、アレナウイルス科、コロナウイルス科などが挙げられる。
＜３．本発明に係るＴｉｍタンパク質＞
本発明に係るＴｉｍタンパク質とは、本発明に係るＴ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子１（Ｔｉｍ１）タンパク質（以下、「本発明に係るＴｉｍ１タンパク質」と略記する場合がある）、本発明に係るＴ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子３（Ｔｉｍ３）タンパク質（以下、「本発明に係るＴｉｍ３タンパク質」と略記する場合がある）、及び本発明に係るＴ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子４（Ｔｉｍ４）タンパク質（以下、「本発明に係るＴｉｍ４タンパク質」と略記する場合がある）から選ばれる少なくとも１種のＴｉｍタンパク質である。
本発明に係るＴｉｍ４（Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子４）タンパク質としては、本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスに結合し得るものであればよく、動物に由来するＴｉｍ４タンパク質が好ましい。なかでも、ヒト、又はマウスが有するＴｉｍ４タンパク質が好ましい（以下、ヒトが有するＴｉｍ４タンパク質を「ヒト由来Ｔｉｍ４タンパク質」、マウスが有するＴｉｍ４タンパク質を「マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質」と略記する場合がある）。
より具体的には、少なくとも、ホスファチジルセリンに対する結合ドメイン（ＩｇＶドメイン）のアミノ酸配列を有しているものであればよく、Ｔｉｍ４タンパク質の全長のアミノ酸配列を有するものであっても、Ｔｉｍ４タンパク質の一部でもよい。
前記ホスファチジルセリンに対する結合ドメイン（ＩｇＶドメイン）のアミノ酸配列としては、例えば配列番号１（マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のＮ末端２２〜１３５アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿８４８８７４．３）、配列番号２（ヒト由来Ｔｉｍ４タンパク質のＮ末端２５〜１３７アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿６１２３８８．２）等が挙げられる。
前記Ｔｉｍ４タンパク質の全長のアミノ酸配列としては、配列番号３（マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質の全長配列１〜３４３アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿８４８８７４．３））、配列番号４（ヒト由来Ｔｉｍ４タンパク質の全長配列１〜３７８アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿６１２３８８．２））等が挙げられる。
当該Ｔｉｍ４タンパク質の一部としては、配列番号５（マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のＮ末端２２〜２７３アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿８４８８７４．３））、配列番号６ マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のＮ末端２２〜２７９アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿８４８８７４．３）、配列番号７ ヒト由来Ｔｉｍ４タンパク質のＮ末端２５〜３１５アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿６１２３８８．２）等のホスファチジルセリンに対する結合ドメイン（ＩｇＶドメイン）及びムチンドメインのアミノ酸配列を有するもの等が挙げられる。要すれば、これらの配列はシグナル配列を有するものであってもよい。
本発明に係るＴｉｍ１（Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子１）タンパク質としては、本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスに結合し得るものであればよく、動物に由来するＴｉｍ１タンパク質が好ましい。なかでもヒト又はマウスが有するＴｉｍ１タンパク質が好ましい（以下、ヒトが有するＴｉｍ１タンパク質を「ヒト由来Ｔｉｍ１タンパク質」、マウスが有するＴｉｍ１タンパク質を「マウス由来Ｔｉｍ１タンパク質」と略記する場合がある）。
より具体的には、少なくとも、ホスファチジルセリンに対する結合ドメイン（ＩｇＶドメイン）のアミノ酸配列を有しているものであればよく、Ｔｉｍ１タンパク質の全長のアミノ酸配列を有するものであっても、Ｔｉｍ１タンパク質の一部でもよい。
前記ホスファチジルセリンに対する結合ドメイン（ＩｇＶドメイン）のアミノ酸配列としては、例えば配列番号８（マウス由来Ｔｉｍ１タンパク質のＮ末端２２〜１３１アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１１６０１０４．１）、配列番号９（ヒト由来Ｔｉｍ１タンパク質のＮ末端２１〜１３０アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０３６３３８．２）等が挙げられる。
前記Ｔｉｍ１タンパク質の全長のアミノ酸配列としては、配列番号１０（マウス由来Ｔｉｍ１タンパク質の全長配列１〜２８２アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１１６０１０４．１）））、配列番号１１（ヒト由来Ｔｉｍ１タンパク質の全長配列１〜３６４アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０３６３３８．２）等が挙げられる。
当該Ｔｉｍ１タンパク質の一部としては、配列番号１２（マウス由来Ｔｉｍ１タンパク質のＮ末端２２〜２１２アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１１６０１０４．１））、配列番号１３ ヒト由来Ｔｉｍ１タンパク質のＮ末端２１〜２９５アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿６１２３８８．２）等のホスファチジルセリンに対する結合ドメイン（ＩｇＶドメイン）及びムチンドメインのアミノ酸配列を有するもの等が挙げられる。要すれば、これらの配列はシグナル配列を有するものであってもよい。
本発明に係るＴｉｍ３（Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子３）タンパク質としては、本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスに結合し得るものであればよく、動物に由来するＴｉｍ３タンパク質が好ましい。なかでも、ヒト又はマウスが有するＴｉｍ３タンパク質が好ましい（以下、ヒトが有するＴｉｍ３タンパク質を「ヒト由来Ｔｉｍ３タンパク質」、マウスが有するＴｉｍ３タンパク質を「マウス由来Ｔｉｍ３タンパク質」と略記する場合がある）。
より具体的には、少なくとも、ホスファチジルセリンに対する結合ドメイン（ＩｇＶドメイン）のアミノ酸配列を有しているものであればよく、Ｔｉｍ３タンパク質の全長のアミノ酸配列を有するものであっても、Ｔｉｍ３タンパク質の一部でもよい。
前記ホスファチジルセリンに対する結合ドメイン（ＩｇＶドメイン）のアミノ酸配列としては、例えば配列番号１４（マウス由来Ｔｉｍ３タンパク質のＮ末端２２〜１３４アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿５９９０１１．２）、配列番号１５（ヒト由来Ｔｉｍ３タンパク質のＮ末端２２〜１３５アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿１１６１７１．３）等が挙げられる。
前記Ｔｉｍ３タンパク質の全長のアミノ酸配列としては、配列番号１６（マウス由来Ｔｉｍ３タンパク質の全長配列１〜２８１アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿５９９０１１．２）））、配列番号１７（ヒト由来Ｔｉｍ３タンパク質の全長配列１〜３０１アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿１１６１７１．３）等が挙げられる。
当該Ｔｉｍ３タンパク質の一部としては、配列番号１８（マウス由来Ｔｉｍ３タンパク質のＮ末端２２〜１８９アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿５９９０１１．２））、配列番号１９ ヒト由来Ｔｉｍ３タンパク質のＮ末端２２〜２００アミノ酸領域（ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿１１６１７１．３）等のホスファチジルセリンに対する結合ドメイン（ＩｇＶドメイン）及びムチンドメインのアミノ酸配列を有するもの等が挙げられる。要すれば、これらの配列はシグナル配列を有するものであってもよい。
また、本発明に係るＴｉｍタンパク質は、本発明に係る細胞外膜小胞又はウィルスに結合し得るものであれば、上記したアミノ酸配列の１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加した変異体であってもよい。
本発明に係るＴｉｍタンパク質は、上記した性質を有するものであればよく、マウスやヒト等の動物や植物等のＴｉｍタンパク質を有する生物の細胞（例えばマクロファージ等の免疫細胞）や組織等から抽出したもの、これをもとに遺伝子組換え技術により調製したもの等、何れも用いることができる。
本発明に係るＴｉｍタンパク質として、遺伝子組換え技術により調製したものを用いる場合、精製の簡便さから、１又は複数のアフィニティータグを有するものが好ましい。
当該アフィニティータグとしては、遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する際に用いられるものであればいずれでもよく、例えば、Ｆｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓｔｒｅｐ（ＩＩ）タグ、ＰＡタグ等のアフィニティータグが挙げられる。
当該アフィニティータグは、本発明に係るＴｉｍタンパク質のＣ末端側に融合される。
従って、本発明に係るＴｉｍタンパク質には、Ｔｉｍタンパク質のアミノ酸配列（全長又は一部配列）のみからなるタンパク質だけでなく、Ｔｉｍタンパク質のアミノ酸配列（全長又は一部配列）と前記した如きアフィニティータグのアミノ酸配列を有するタンパク質も含まれる。
また、前記したアフィニティータグとＴｉｍタンパク質とは、直接結合していても、「「昆虫培養細胞由来無細胞蛋白質合成試薬キットＴｒａｎｓｄｉｒｅｃｔ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌを用いた蛋白質発現」江連徹、鈴木崇、伊東昌章、四方正光（島津製作所・分析計測事業部）公開日 ２００８／６／９： 蛋白質科学会アーカイブ， １， ｅ００５ （２００８）」等に記載のスペーサーを介して結合していてもよい。従って、本発明に係るＴｉｍタンパク質には、Ｔｉｍタンパク質のアミノ酸配列（全長又は一部配列）と前記した如きアフィニティータグのアミノ酸配列とスペーサーのアミノ酸配列とを有するタンパク質も含まれる。
＜４．本発明に係るＴｉｍタンパク質の調製方法＞
本発明に係るＴｉｍタンパク質は、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学的製法により製造することができる。例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル法（Ｆｍｏｃ法）、ｔ−ブチルオキシカルボニル法（ｔＢｏｃ法）等の通常の化学的製法（化学合成法）により、本発明に係るＴｉｍタンパク質を得ることができる。また、市販のペプチド合成機を用いて化学合成することもできる。
更に、本発明に係るＴｉｍタンパク質は、本発明に係るＴｉｍタンパク質をコードする核酸分子を適当なプラスミドやファージなどの発現用ベクターに組み込み、宿主細胞を組換え発現ベクターを用いて形質転換（又は形質導入）させ、得られた宿主細胞を増幅させて、細胞内又は細胞外に分泌させる、という遺伝子組み換え技術を用いた周知の方法でも得ることができる。
本発明に係るＴｉｍタンパク質の調製方法について、遺伝子組換え技術により調製する場合について、以下に説明する。
＜本発明に係る発現用ベクター＞
本発明に係るＴｉｍタンパク質を発現させる為の発現用ベクター（以下、本発明に係る発現用ベクターとする）は、本発明に係るＴｉｍタンパク質をコードする核酸配列（以下、「本発明に係るＴｉｍコード配列」と略記する場合がある）を含むものであれば、いずれでもよい。
本発明に係るＴｉｍコード配列のうち、Ｔｉｍ４タンパク質をコードする核酸配列としては、例えば配列番号２０（マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質の全長配列１〜３４３アミノ酸領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列（ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏ．ＮＭ＿１７８７５９．４）。末端３塩基に終止コドン（ｔｇａ）を含む）、配列番号２１（ヒト由来Ｔｉｍ４タンパク質の全長配列１〜３７８アミノ酸領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列（ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏ．ＮＭ＿１３８３７９．２）。末端３塩基に終止コドン（ｔａａ）を含む）等が挙げられる。
本発明に係るＴｉｍ１タンパク質をコードする核酸配列としては、例えば配列番号２２（マウス由来Ｔｉｍ１タンパク質の全長配列１〜２８２アミノ酸領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列（ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１６６６３２．１）。末端３塩基に終止コドン（ｔｇａ）を含む）、配列番号２３（ヒト由来Ｔｉｍ１タンパク質の全長配列１〜３６４アミノ酸領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列（ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏ．ＮＭ＿０１２２０６．３）。末端３塩基に終止コドン（ｔａａ）を含む）等が挙げられる。
本発明に係るＴｉｍ３タンパク質をコードする核酸配列としては例えば配列番号２４（マウス由来Ｔｉｍ３タンパク質の全長配列１〜２８１アミノ酸領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列（ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏ．ＮＭ＿１３４２５０．２）。末端３塩基に終止コドン（ｔｇａ）を含む）、配列番号２５（ヒト由来Ｔｉｍ３タンパク質の全長配列１〜３０１アミノ酸領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列（ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏ．ＮＭ＿０３２７８２．４）。末端３塩基に終止コドン（ｔａｇ）を含む）等が挙げられる。
本発明に係る発現用ベクターとしては、市販されているベクターに、常法のクローニング方法に従い、本発明に係るＴｉｍコード配列を遺伝子導入すればよい。本発明に係る発現用ベクターとしては、例えば、常法のクローニング技術に従い、配列番号２６（マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のＮ末端１〜２７３アミノ酸領域をコードするｃＤＮＡ、末端３塩基に終止コドン（ｔｇａ）を含む）、配列番号２７（マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のＮ末端１〜２７９アミノ酸領域をコードするｃＤＮＡ、末端３塩基に終止コドン（ｔｇａ）を含む）、配列番号２８（ヒト由来Ｔｉｍ４タンパク質のＮ末端１〜３１５アミノ酸領域をコードするｃＤＮＡ、末端３塩基に終止コドン（ｔｇａ）を含む）、配列番号２９（マウス由来Ｔｉｍ１タンパク質のＮ末端１〜２１２アミノ酸領域をコードするｃＤＮＡ、末端３塩基に終止コドン（ｔｇａ）を含む）、配列番号３０（ヒト由来Ｔｉｍ１タンパク質のＮ末端１〜２９５アミノ酸領域をコードするｃＤＮＡ、末端３塩基に終止コドン（ｔｇａ）を含む）、配列番号３１（マウス由来Ｔｉｍ３タンパク質のＮ末端１〜１８９アミノ酸領域をコードするｃＤＮＡ、末端３塩基に終止コドン（ｔｇａ）を含む）、又は配列番号３２（ヒト由来Ｔｉｍ３タンパク質のＮ末端１〜２００アミノ酸領域をコードするｃＤＮＡ、末端３塩基に終止コドン（ｔｇａ）を含む）を例えば市販のｐＣＡＧ−Ｎｅｏベクター（和光純薬工業（株）製）等の発現ベクターに組み込んだベクター等が挙げられる。Ｔｉｍコード配列を遺伝子導入するベクターとしては、宿主細胞中で本発明に係るＴｉｍタンパク質を発現し、生産する機能を有するものであればよく、市販されているベクターを用いれば簡便である。この目的に使用される市販されているベクターとしては、宿主が動物細胞の場合には、ｐＣＡＧ−Ｎｅｏベクター、ｐｃＤＮＡベクターなどが挙げられる。
＜宿主＞
宿主としては、本発明に係るＴｉｍタンパク質を発現可能なものであれば、いずれでもよく、例えば、大腸菌、昆虫細胞、哺乳類細胞、植物細胞、酵母細胞等が挙げられ、哺乳類細胞が好ましい。哺乳類細胞としては、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞等が挙げられる。
＜宿主への遺伝子導入＞
本発明に係る発現用ベクターを、「目的別で選べるタンパク質発現プロトコール、第３章タンパク質発現プロトコール、ＩＳＢＮ９７８−４−７５８１−０１７５−２、羊土社」等に記載のベクターを宿主へ遺伝子導入する手法の常法に従って、宿主へ遺伝子導入する。
＜宿主の培養＞
遺伝子導入を行った宿主を、宿主を培養する手法の常法に従って、培養する。培養条件としては、遺伝子導入を行った宿主により異なるが、宿主毎の常法に従えばよく、例えば、動物細胞であれば、通常５〜１０％、好ましくは５〜８％ＣＯ２下、通常３６℃〜３８℃、好ましくは３６．５℃〜３７．５℃で、１日〜１０日間、好ましくは３日〜４日間培養すればよい。尚、本発明に係るＴｉｍタンパク質は膜貫通ドメインと細胞内ドメインを含まないため、培養上清中に発現、分泌される。
＜本発明に係るＴｉｍタンパク質の精製＞
次いで、得られた遺伝子導入した宿主の培養液を、遠心分離処理（通常２００〜４００×ｇで３分間〜１０分間、好ましくは３００×ｇで３分間〜６分間）して培養上清を回収し、要すれば、（ｉ）通常１０００〜２０００×ｇで２０分間〜６０分間、好ましくは１２００×ｇで２０分間〜４０分間、回収した培養上清を遠心分離処理し、及び／又は（ｉｉ）フィルターろ過処理を行い、不純物を分離して、培養上清濾過液を得てもよい。
さらに、要すれば、得られた培養上清濾過液を、限外濾過等の常法に従って、通常５倍〜２０倍、好ましくは８倍〜１２倍に濃縮して培養上清濾過液の濃縮液を得てもよい。
次いで、本発明に係るＴｉｍタンパク質がアフィニティータグを有する場合は、「目的別で選べるタンパク質発現プロトコール、第３章タンパク質発現プロトコール、第６節タンパク質の精製 タグによる精製、ＩＳＢＮ９７８−４−７５８１−０１７５−２、羊土社」等に記載のアフィニティータグ毎のアフィニティータグを利用したタンパク質の精製方法の常法（例えば、アフィニティータグに親和性を有する物質を固定化した担体を用いた方法）に従い、得られた培養上清、得られた培養上清濾過液、又は得られた培養上清濾過液の濃縮液から、本発明に係るＴｉｍタンパク質（Ｔｉｍタンパク質とアフィニティータグの融合タンパク質）を精製すればよい。
本発明に係るＴｉｍタンパク質がアフィニティータグを有さない場合は、「目的別で選べるタンパク質発現プロトコール、第３章タンパク質発現プロトコール、第６節タンパク質の精製 クロマトグラフィーによる精製、ＩＳＢＮ９７８−４−７５８１−０１７５−２、羊土社」等に記載のタンパク質の精製方法の常法に従い、各種クロマトグラフィーにより、得られた培養上清、得られた培養上清濾過液、又は得られた培養上清濾過液の濃縮液から、本発明に係るＴｉｍタンパク質を精製すればよい。
上記精製方法を適宜組み合わせて精製を行ってもよい。
＜本発明に係るＴｉｍタンパク質の具体的な調製方法＞
本発明に係るＴｉｍタンパク質の具体的な調製方法としては、例えばアフィニティータグとしてＦｃタグを用いた場合、以下の方法が挙げられる。先ず、常法に従い、本発明に係るＴｉｍコード配列をｐＥＦ−Ｆｃベクター又は市販のベクターに組み込み、本発明に係る発現用ベクターを構築する。次いで、常法に従い、宿主細胞へ本発明に係る発現用ベクターを遺伝子導入し、通常５〜１０％、好ましくは５〜８％ＣＯ２下、３６℃〜３８℃、好ましくは３６．５℃〜３７．５℃で、１日〜１０日間、好ましくは３日〜４日間培養する。次いで、得られた遺伝子導入した宿主の培養液を、遠心分離処理（通常２００〜４００×ｇで３分間〜１０分間、好ましくは３００×ｇで３分間〜６分間）して培養上清を回収し、要すれば、（ｉ）通常１０００〜２０００×ｇで２０分間〜６０分間、好ましくは１２００×ｇで２０分間〜４０分間、回収した培養上清を遠心分離処理し、及び／又は（ｉｉ）フィルターろ過処理を行い、不純物を分離して、培養上清濾過液を得てもよい。さらに、要すれば、得られた培養上清濾過液を、限外濾過等の常法に従って、通常５倍〜２０倍、好ましくは８倍〜１２倍に濃縮して培養上清濾過液の濃縮液を得てもよい。その後、本発明に係るＴｉｍタンパク質がアフィニティータグを有する場合には、アフィニティータグ毎の、アフィニティータグを利用した精製方法の常法に従い、得られた培養上清、得られた培養上清濾過液、又は得られた培養上清濾過液の濃縮液から本発明に係るＴｉｍタンパク質を精製することにより、本発明に係るＴｉｍタンパク質が得られる。
＜５．本発明のＴｉｍ担体＞
本発明のＴｉｍタンパク質が結合した担体（以下、「本発明のＴｉｍ担体」と略記する場合がある）は、前記した如き本発明に係るＴｉｍタンパク質を本発明に係る担体に結合させたものである。
具体的には、本発明のＴｉｍ担体としては、本発明に係るＴｉｍ１タンパク質が結合した担体（以下、「本発明のＴｉｍ１担体」と略記する場合がある）、本発明に係るＴｉｍ３タンパク質が結合した担体（以下、「本発明のＴｉｍ３担体」と略記する場合がある）、本発明に係るＴｉｍ４タンパク質が結合した担体（以下、「本発明のＴｉｍ４担体」と略記する場合がある）等が挙げられる。また、本発明に係るＴｉｍ１タンパク質、本発明に係るＴｉｍ３タンパク質、及び本発明に係るＴｉｍ４タンパク質から選ばれる２種以上のタンパク質を結合させた担体も本発明のＴｉｍ担体に包含される。
本発明のＴｉｍ担体としては、本発明のＴｉｍ４担体が特に好ましい。
＜本発明に係る担体＞
本発明に係る担体としては、通常の免疫学的測定法で用いられる不溶性の担体であれば何れも使用可能であるが、例えば、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリルアミド、ポリグリシジルメタクリレート、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリイミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリ塩化ビニール、ポリエチレン、ポリクロロカーボネート、シリコーン樹脂、シリコーンラバー、アガロース、デキストラン、エチレン−無水マレイン酸共重合物等の有機物；ガラス、酸化ケイ素、ケイソウ、多孔性ガラス、スリガラス、アルミナ、シリカゲル、金属酸化物等の無機物質；鉄、コバルト、ニッケル、マグネタイト、クロマイト等の磁性体等；及びこれらの磁性体の合金を材料として調製されたものが挙げられる。また、これら担体は、マイクロプレート、チューブ、ディスク状片、粒子（ビーズ）等多種多様の形態で使用し得る。
尚、後述する本発明の取得方法及び本発明の除去方法に用いる場合には、粒子（ビーズ）で用いるのが好ましく、粒子の大きさは特に限定されないが、目的、用途に合わせて、通常１０ｎｍ〜１００μｍ、好ましくは１００ｎｍから１０μｍのものが挙げられる。
また、後述する本発明の検出方法に用いる場合には、粒子（ビーズ）又はマイクロプレートが好ましく、粒子の大きさは特に限定されないが、目的、用途に合わせて、通常１０ｎｍ〜１００μｍ、好ましくは１００ｎｍから１０μｍのものが挙げられ、またマイクロプレートのウェルの数、大きさは特に限定されないが、目的、用途に合わせて、通常１２穴から１５３６穴、好ましくは９６穴から３８４穴のものが挙げられる。
＜本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体との結合方法＞
本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体との結合方法としては、タンパク質を担体に結合させる自体公知の方法に従えばよく、例えば、アフィニティー結合により結合させる方法；化学結合により結合させる方法（例えば、特許３２６９５５４号公報、ＷＯ２０１２／０３９３９５公報に記載の方法）；物理的吸着により結合させる方法（例えば、特公平５−４１９４６号公報に記載の方法）等が挙げられるが、アフィニティー結合により結合させる方法及び物理的吸着により結合させる方法が好ましい。
尚、後述する本発明の取得方法及び除去方法に用いる場合には、アフィニティー結合により結合させる方法が好ましい。また、後述する本発明の検出方法に用いる場合には、アフィニティー結合により結合させる方法又は物理的吸着が好ましい。
＜発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体との結合様式＞
本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体との結合様式としては、本発明に係る担体と本発明に係るＴｉｍタンパク質とが結合していれば結合様式は問わないが、本発明に係る担体が本発明に係るＴｉｍタンパク質のＳＨ基に結合したものが好ましい。また、本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体とを直接結合させても、化学的リンカー、アフィニティー物質［例えば、アフィニティータグに親和性を有する物質（後述）、本発明のＴｉｍタンパク質に対する抗体、ビオチン類（後述）、アビジン類（後述）、抗体等］等を介して間接的に結合させてもよい。
＜アフィニティー結合により結合させる方法＞
上記したアフィニティー結合により結合させる方法としては、物質間のアフィニティー結合（親和性）を利用して結合させる方法であれば何れでもよく、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）が挙げられる。
（ａ）ビオチン類とアビジン類とのアフィニティー結合により結合させる方法
例えば、ビオチン類（ビオチン、イミノビオチン、デスチオビオチン、ビオシチン、ビオチンスルホキド等）及びアビジン類（アビジン、タマビジン、タマビジン２、ストレプトアビジン等）の組み合わせ等からなる、互いにアフィニティー（親和性）を有する２種以上の物質（アフィニティー物質）を用いることにより、当該アフィニティー物質を介して本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体とを結合させることができる。
尚、アフィニティー物質は、何れか一方を本発明に係るＴｉｍタンパク質に結合させ、残りの一方を本発明に係る担体に結合させておけばよいが、例えば、ビオチン類とアビジン類を用いる場合には、アビジン類を本発明に係る担体に結合させ、ビオチン類を本発明に係るＴｉｍタンパク質に結合させておくのが一般的である。
（ｂ）アフィニティータグとアフィニティータグに親和性を有する物質とのアフィニティー結合により結合させる方法
例えば、アフィニティータグに親和性を有する物質（ＰｒｏｔｅｉｎＡ、ＰｒｏｔｅｉｎＧ等）等の本発明に係るＴｉｍタンパク質にアフィニティー（親和性）を有する物質（アフィニティー物質）を用いることにより、当該アフィニティー物質を介して本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体とを結合させることができる。
尚、アフィニティー物質は、本発明に係る担体に結合させておくのが一般的である。
（ｃ）本発明のＴｉｍタンパク質に対する抗体と本発明のＴｉｍタンパク質とのアフィニティー結合により結合させる方法
例えば、本発明に係るＴｉｍタンパク質に対する抗体（抗ＦＬＡＧタグ抗体、抗Ｈｉｓタグ抗体、抗ＨＡタグ抗体、抗Ｍｙｃタグ抗体、抗ＭＢＰタグ抗体、抗ＧＳＴタグ抗体、抗Ｓｔｒｅｐ（ＩＩ）タグ抗体等のアフィニティータグに対する抗体、及びＡｎｔｉ−ＴＩＭ４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （ｃｌｏｎｅ ＲＭＴ４−５４）（ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）等）等の本発明に係るＴｉｍタンパク質にアフィニティー（親和性）を有する物質（アフィニティー物質）を用いることにより、当該アフィニティー物質を介して本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体とを結合させることができる。
尚、アフィニティー物質は、本発明に係る担体に結合させておくのが一般的である。
尚、上記方法において、本発明に係るＴｉｍタンパク質又は／及び本発明に係る担体とアフィニティー物質とを結合させる方法も、自体公知の物理的吸着により結合させる方法や化学結合により結合させる方法が使用でき、直接結合させても、リンカー等を介して間接的に結合させてもよい。
＜本発明に係る担体に結合させる本発明に係るＴｉｍタンパク質量＞
本発明に係る担体に結合させる本発明に係るＴｉｍタンパク質の量は、例えば本発明に係る担体がビーズの場合、担体１ｍｇに対して、通常０．１μｇ〜５０μｇ、好ましくは０．５μｇ〜３０μｇ、より好ましくは１．０μｇ〜２０μｇである。
また、本発明に係る担体がマイクロプレートの場合、１ウェルに対して、通常０．１μｇ〜１０μｇ、好ましくは０．２μｇ〜５μｇ、より好ましくは０．５μｇ〜２μｇである。
＜本発明のＴｉｍ担体の具体的な調製方法＞
以下に、本発明のＴｉｍ担体の具体的な調製方法を、前記（ａ）−（ｃ）の方法により、本発明のＴｉｍ担体を調製する場合を例にとって説明する。
＜（ａ）ビオチン類とアビジン類とのアフィニティー結合により結合させる方法＞
まず、（ａ）の方法では、前記の本発明に係るＴｉｍタンパク質の調製方法に従い、本発明に係るＴｉｍタンパク質を調製する。次いで、本発明に係るＴｉｍタンパク質とビオチン類とを結合させ（以下、「ビオチン標識」又は「ビオチン化」と略記する場合がある）、本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体を形成させる。一方、本発明に係る担体にアビジン類を結合させ、本発明に係る担体−アビジン類複合体を形成させる（以下、「アビジン類を結合させた本発明に係る担体」と略記する場合がある）。得られた本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体と本発明に係る担体−アビジン類複合体とを接触させて、本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体中のビオチン類と担体−アビジン類複合体中のアビジン類とを結合させて、本発明のＴｉｍ担体を得る。
−本発明に係るＴｉｍタンパク質とビオチン類との結合（ビオチン標識）−
前記（ａ）の方法において、本発明に係るＴｉｍタンパク質とビオチン類との結合は、市販のタンパク質のビオチン標識キットを用いても、必要な試薬類を適宜調整してタンパク質のビオチン標識の常法に従って行ってもよい。市販のタンパク質のビオチン標識キット（ビオチン化キット）を用いる方法としては、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ（（株）同仁科学研究所）又はＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（（株）同仁科学研究所）に添付のプロトコールに記載の方法に従えばよい。
本発明に係るＴｉｍタンパク質１μｇと結合させるビオチン類の量は、通常１０ｎｇ〜１．０μｇ、好ましくは２０ｎｇ〜２００ｎｇ、より好ましくは３０ｎｇ〜１５０ｎｇである。
本発明に係るＴｉｍタンパク質にビオチン類を結合させる部位としては、本発明に係るＴｉｍタンパク質のＳＨ基が好ましい。
−本発明に係る担体−アビジン類複合体（アビジン類を結合させた本発明に係る担体）−
前記（ａ）の方法において、本発明に係る担体−アビジン類複合体（アビジン類を結合させた本発明に係る担体）は、市販のものを用いても、必要な試薬類を適宜調整して、常法に従って調製してもよい。本発明に係る担体−アビジン類複合体としては、例えば、アビジンを結合させたビーズ又はマイクロプレート、タマビジンを結合させたビーズ又はマイクロプレート、タマビジン２を結合させたビーズ又はマイクロプレート、ストレプトアビジンを結合させたビーズ又はマイクロプレート等が挙げられ、市販のものとしては、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ＦＧビーズストレプトアビジン（多摩川精機社製）、アビジンプレート（住友ベークライト社製）等が挙げられる。
本発明に係る担体とアビジン類との結合において、例えば本発明に係る担体がビーズの場合、本発明に係る担体１ｍｇと接触させるアビジン類の量は、通常５．０〜１５０μｇ、好ましくは１０〜１００μｇ、より好ましくは２０〜５０μｇである。例えば、本発明に係る担体がマイクロプレートのとき１ウェルに接触させるアビジン類の量は、通常０．１μｇ〜１０μｇ、好ましくは０．２μｇ〜５μｇ、より好ましくは０．５μｇ〜２μｇである。
−本発明に係る担体−アビジン類複合体と本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体との結合
前記（ａ）の方法において、（本発明に係る担体−アビジン類複合体と本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体とを結合させて）本発明のＴｉｍ担体を得るには、例えば、本発明に係る担体がビーズの場合、本発明に係る担体−アビジン類複合体を通常０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは０．３ｍｇ〜５．０ｍｇ、より好ましくは０．５〜３．０ｍｇと、本発明に係る担体−アビジン類複合体１ｍｇ当たり発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体を通常１．０〜５０μｇ、好ましくは１．０〜３０μｇ、より好ましくは１．０〜２０μｇとを接触させ、また本発明に係る担体がマイクロプレートの場合、１ウェル当たりの本発明に係る担体−アビジン類複合体と本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体を通常１．０〜１０μｇ、好ましくは１．０〜５．０μｇ、より好ましくは１．０〜２．０μｇとを接触させ、通常４．０℃〜３７℃、好ましくは１１℃〜３０℃、より好ましくは２０℃〜２５℃で、通常０．５時間〜２４時間、好ましくは０．５時間〜８．０時間、より好ましくは０．５時間〜２．０時間反応させ、アビジン類とビオチン類を結合させればよい。これにより、本発明に係る担体−アビジン類複合体と本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体とが結合され、本発明のＴｉｍ担体が得られる。
尚、一般に、本発明に係る担体−アビジン類複合体と本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体との接触は、本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体を含有する溶液と本発明に係る担体−アビジン類複合体とを接触させることにより行われる。
本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体を含有させる溶液としては、本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体を安定な状態で溶解させるものであればよく、例えば精製水、例えばｐＨ ７．０〜８．０、好ましくは７．２ 〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＰＢＳ、ＴＢＳ、ＨＢＳ等）が挙げられる。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常５．０〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲から適宜選択され、ＮａＣｌ濃度は通常１００〜２００ｍＭ、好ましくは１４０〜１６０ｍＭの範囲から適宜選択される。また、この溶液中には、本発明に係る担体−アビジン類複合体と本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体を含有する溶液とを接触後、本発明に係る担体−アビジン類複合体と本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体との結合を妨げない量であれば、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤、蛋白質等が含まれていても良い。界面活性剤としては、例えばＴｗｅｅｎ２０等が挙げられ、本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体を含有させる溶液における界面活性剤の濃度は、通常０．００００１〜０．２％、好ましくは通常０．０００５〜０．１％である。尚、これらの溶媒に本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体を溶解した溶液を、「本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体含有溶液」と略記する場合がある。
−前記（ａ）の方法による本発明のＴｉｍ担体の具体的な調製方法−
前記（ａ）の方法における、本発明のＴｉｍ担体の具体的な調製方法は、例えば以下の方法で行えばよい。
まず、前記の本発明に係るＴｉｍタンパク質の調整方法に従い、本発明に係るＴｉｍタンパク質を調製する。次いで、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ（（株）同仁科学研究所）、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（（株）同仁科学研究所）に添付のプロトコール、又はタンパク質のビオチン標識における常法に従って、本発明に係るＴｉｍタンパク質にビオチン類を結合させて、本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体を形成する。
その後、本発明に係る担体がビーズの場合、本発明に係る担体−アビジン類複合体を通常０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは０．３ｍｇ〜５．０ｍｇ、より好ましくは０．５〜３．０ｍｇと、本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体を本発明に係る担体−アビジン類複合体１ｍｇ当たり本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体を通常１．０〜５０μｇ、好ましくは１．０〜３０μｇ、より好ましくは１．０〜２０μｇ含有する溶液（例えば精製水、又はｐＨ ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液等中に、本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体を含有する溶液）通常５０μＬ〜１５００μＬ、好ましくは１００μＬ〜１０００μＬ、より好ましくは２００μＬ〜５００μＬとを接触させ、通常４．０℃〜３７℃、好ましくは１１℃〜３０℃、より好ましくは２０℃〜２５℃で、通常０．５時間〜２４時間、好ましくは０．５時間〜８．０時間、より好ましくは０．５時間〜２．０時間反応させ、本発明に係る担体−アビジン類複合体中のアビジン類と本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体中のビオチン類とを結合させることにより、本発明のＴｉｍ担体を得る。
本発明に係る担体がマイクロプレートの場合、１ウェル当たりの本発明に係る担体−アビジン類複合体と本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体を通常１．０〜１０μｇ、好ましくは１．０〜５．０μｇ、より好ましくは１．０〜２．０μｇ含有する溶液（例えば精製水、又はｐＨ ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液等中に、本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体を含有する溶液）通常５０μＬ〜３００μＬ、好ましくは５０μＬ〜２００μＬ、より好ましくは１００μＬ〜２００μＬとを接触させ、通常４．０℃〜３７℃、好ましくは１１℃〜３０℃、より好ましくは２０℃〜２５℃で、通常０．５時間〜２４時間、好ましくは０．５時間〜８．０時間、より好ましくは０．５時間〜２．０時間反応させ、本発明に係る担体−アビジン類複合体中のアビジン類と本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体中のビオチン類とを結合させることにより、本発明のＴｉｍ担体を得る。
＜（ｂ）アフィニティータグとアフィニティータグに親和性を有する物質のアフィニティー結合により結合させる方法＞
（ｂ）の方法では、まず、前記の本発明に係るＴｉｍタンパク質の調整方法に従い、アフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質を調製する。一方、アフィニティータグに親和性を有する物質（アフィニティー物質）を本発明に係る担体に結合させ、本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体を形成させる（以下、「アフィニティー物質を結合させた本発明に係る担体」と略記する場合がある）。得られた本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体とアフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質とを接触させ、本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体中のアフィニティー物質とアフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質中のアフィニティータグとを結合させ、本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体とアフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質とを結合させて、本発明のＴｉｍ担体を得る。
−本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体−
前記（ｂ）の方法における、本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体としては、市販のものを用いても、必要な試薬類を適宜調整して常法に従って調製してもよい。本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体としては、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇを結合させたビーズ又はマイクロプレート、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを結合させたビーズ又はマイクロプレート等が挙げられ、市販のものとしては、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ＦＧビーズ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（多摩川精機製）、ＦＧビーズ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（多摩川精機製）等が挙げられる。
本発明に係る担体とアフィニティー物質との結合において、本発明に係る担体１ｍｇと接触させるアフィニティー物質の量としては、本発明に係る担体がビーズの場合、通常５．０〜５０μｇ、好ましくは１０〜５０μｇ、より好ましくは２０〜５０μｇである。本発明に係る担体がマイクロプレートの場合、１ウェルに接触させるアフィニティー物質の量は、通常０．１μｇ〜１０μｇ、好ましくは０．２μｇ〜５μｇ、より好ましくは０．５μｇ〜２μｇである。
−本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体とアフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質との結合−
前記（ｂ）の方法において、（本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体とアフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質との結合により）本発明のＴｉｍ担体を得るには、例えば以下の方法で行えばよい。本発明に係る担体がビーズの場合、本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体を通常０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは０．３ｍｇ〜５．０ｍｇ、より好ましくは０．５〜３．０ｍｇと、本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体１ｍｇ当たりアフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質を通常１．０〜５０μｇ、好ましくは１．０〜３０μｇ、より好ましくは１．０〜２０μｇとを接触させ、本発明に係る担体がマイクロプレートの場合、１ウェル当たりの本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体とアフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質を通常１．０〜１０μｇ、好ましくは１．０〜５．０μｇ、より好ましくは１．０〜２．０μｇとを接触させ、通常４．０℃〜３７℃、好ましくは１１℃〜３０℃、より好ましくは２０℃〜２５℃で、通常０．５時間〜２４時間、好ましくは０．５時間〜８．０時間、より好ましくは０．５時間〜２．０時間反応させ、本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体とアフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質とを結合させ、本発明のＴｉｍ担体を得る。
尚、一般に、前記（ｂ）の方法における、本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体とアフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質との接触は、本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体とアフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液とを接触させることにより行われる。
アフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有させる溶液としては、アフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質を安定な状態で溶解させたものであればよく、例えば精製水、例えばｐＨ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＰＢＳ、ＴＢＳ、ＨＢＳ等）が挙げられる。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常５．０〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲から適宜選択され、ＮａＣｌ濃度は通常１００〜２００ｍＭ、好ましくは１４０〜１６０ｍＭの範囲から適宜選択される。
また、この溶液中には、アフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液と本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体とを接触後、アフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体との結合を妨げない量であれば、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤、蛋白質等が含まれていても良い。界面活性剤としては、例えばＴｗｅｅｎ２０等が挙げられ、アフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有させる溶液における界面活性剤の濃度は、通常０．００００１〜０．２％、好ましくは通常０．０００５〜０．１％である。尚、これらの溶液にアフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質を溶解した溶液を、「アフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質含有溶液」と略記する場合がある。
−前記（ｂ）の方法による本発明のＴｉｍ担体の具体的な調製方法−
前記（ｂ）の方法における、本発明のＴｉｍ担体の具体的な調製方法は、例えば以下の方法で行えばよい。
まず、前記の本発明に係るＴｉｍタンパク質の調製方法に従い、アフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質を調製する。
次いで、本発明に係る担体がビーズの場合、本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体を通常０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは０．３ｍｇ〜５．０ｍｇ、より好ましくは０．５〜３．０ｍｇと、アフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質を本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体１ｍｇ当たりアフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質を通常１．０〜５０μｇ、好ましくは１．０〜３０μｇ、より好ましくは１．０〜２０μｇ含有する溶液（例えば精製水、ｐＨ７．０〜８．０の緩衝液等中に、アフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液）通常５０μＬ〜１５００μＬ、好ましくは１００μＬ〜１０００μＬ、より好ましくは２００μＬ〜５００μＬとを接触させ、通常４．０℃〜３７℃、好ましくは１１℃〜３０℃、より好ましくは２０℃〜２５℃で、通常０．５時間〜２４時間、好ましくは０．５時間〜８．０時間、より好ましくは０．５時間〜２．０時間、本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体中のアフィニティー物質とアフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質中のアフィニティータグとを結合させ、本発明のＴｉｍ担体を得る。
本発明に係る担体がマイクロプレートの場合、１ウェル当たりの本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体と本発明に係るアフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質１．０〜１０μｇ、好ましくは１．０〜５．０μｇ、より好ましくは１．０〜２．０μｇ含有する溶液（例えば精製水、又はｐＨ ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液等中に、本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体を含有する溶液）通常５０μＬ〜３００μＬ、好ましくは５０μＬ〜２００μＬ、より好ましくは１００μＬ〜２００μＬとを接触させ、通常４．０℃〜３７℃、好ましくは１１℃〜３０℃、より好ましくは２０℃〜２５℃で、通常０．５時間〜２４時間、好ましくは０．５時間〜８．０時間、より好ましくは０．５時間〜２．０時間、本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体中のアフィニティー物質とアフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質中のアフィニティータグとを結合させ、本発明のＴｉｍ担体を得る。
＜（ｃ）本発明のＴｉｍタンパク質に対する抗体と本発明のＴｉｍタンパク質とのアフィニティー結合により結合させる方法＞
まず、前記の本発明に係るＴｉｍタンパク質の調整方法に従い、本発明に係るＴｉｍタンパク質を調製する。一方、本発明に係るＴｉｍタンパク質に対する抗体（以下、「抗Ｔｉｍ抗体」と略記する場合がある）を本発明に係る担体に結合させ、本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体を形成させる。得られた本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体と本発明に係るＴｉｍタンパク質とを接触させて、本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体中のＴｉｍタンパク質に対する抗体と本発明に係るＴｉｍタンパク質とを結合させることにより、本発明のＴｉｍ担体を得る。
尚、上記において、本発明に係るＴｉｍタンパク質として、アフィニティータグを有するＴｉｍタンパク質（Ｔｉｍタンパク質のアミノ酸配列とアフィニティータグのアミノ酸配列を有するタンパク質）を用いる場合には、抗Ｔｉｍ抗体としては、Ｔｉｍタンパク質を認識する抗体（Ｔｉｍタンパク質のアミノ酸配列に基づくタンパク質部分を認識する抗体）でも、アフィニティータグを認識する抗体（アフィニティータグのアミノ酸配列に基づくタンパク質部分を認識する抗体）でも何れを用いてもよい。また、本発明に係るＴｉｍタンパク質として、アフィニティータグを有さないＴｉｍタンパク質（Ｔｉｍタンパク質のアミノ酸配列のみからなるタンパク質）を用いる場合には、抗Ｔｉｍ抗体としては、Ｔｉｍタンパク質を認識する抗体（Ｔｉｍタンパク質のアミノ酸配列に基づくタンパク質部分を認識する抗体）を使用すればよい。
−本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体（抗体を結合させた本発明に係る担体）−
前記（ｃ）の方法において、本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体としては、市販のものを用いても、必要な試薬類を適宜調整して常法に従って調製してもよい。本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体としては、例えば、抗Ｆｃタグ抗体を結合させたビーズ又はマイクロプレート、抗ＦＬＡＧタグ抗体を結合させたビーズ又はマイクロプレート、抗Ｈｉｓタグ抗体を結合させたビーズ又はマイクロプレート、抗ＧＳＴタグを結合させたビーズ又はマイクロプレート、抗ＭＢＰタグを結合させたビーズ又はマイクロプレート、抗ＨＡタグを結合させたビーズ又はマイクロプレート、抗Ｍｙｃタグを結合させたビーズ又はマイクロプレート、抗Ｓｔｒｅｐ（ＩＩ）タグを結合させたビーズ又はマイクロプレート、抗Ｔｉｍタンパク質に対する抗体を結合させたビーズ又はマイクロプレート等が挙げられ、市販のものとしては、抗ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ抗体磁気ビーズ（和光純薬工業（株）製）等が挙げられる。
前記の抗Ｔｉｍ抗体の由来については特に限定されない。また、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも何れでも良いが、モノクローナル抗体の方が好ましい。また、前記の抗Ｔｉｍ抗体は、市販のものを用いても、必要な試薬類を適宜調整して常法に従って調製してもよい。抗Ｔｉｍ抗体の具体例は、前記の通りである。
本発明に係る担体と抗Ｔｉｍ抗体との結合において、本発明に係る担体がビーズの場合、本発明に係る担体１ｍｇと接触させる本発明に係るＴｉｍタンパク質に対する抗体の量としては、本発明の取得方法及び本発明の除去方法に用いる場合、通常５．０〜５０μｇ、好ましくは１０〜５０μｇ、より好ましくは２０〜５０μｇである。本発明に係る担体がマイクロプレートのとき１ウェルに、通常０．１μｇ〜１０μｇ、好ましくは０．２μｇ〜５μｇ、より好ましくは０．５μｇ〜２μｇである。
−本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体と本発明に係るＴｉｍタンパク質との結合−
前記（ｃ）の方法において、本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体と本発明に係るＴｉｍタンパク質との結合により本発明のＴｉｍ担体を得る方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。即ち、本発明に係る担体がビーズの場合、本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体を通常０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは０．３ｍｇ〜５．０ｍｇ、より好ましくは０．５〜３．０ｍｇと、本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体１ｍｇ当たり本発明に係るＴｉｍタンパク質を通常１．０〜５０μｇ、好ましくは１．０〜３０μｇ、より好ましくは１．０〜２０μｇとを接触させ、本発明に係る担体がマイクロプレートの場合、１ウェル当たりの本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体と本発明に係るＴｉｍタンパク質を通常１．０〜１０μｇ、好ましくは１．０〜５．０μｇ、より好ましくは１．０〜２．０μｇとを接触させ、通常４．０℃〜３７℃、好ましくは１１℃〜３０℃、より好ましくは２０℃〜２５℃で、通常０．５時間〜２４時間、好ましくは０．５時間〜８．０時間、より好ましくは０．５時間〜２．０時間反応させ、本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体中の抗Ｔｉｍ抗体と本発明に係るＴｉｍタンパク質とを結合させ、本発明のＴｉｍ４担体を得る。
尚、一般に、前記（ｃ）の方法における、本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体と本発明に係るＴｉｍタンパク質との接触は、本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体と本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液とを接触させることにより行われる。
本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有させる溶液としては、本発明に係るＴｉｍタンパク質を安定な状態で溶解させるものであればよく、例えば精製水、例えばｐＨ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＰＢＳ、ＴＢＳ、ＨＢＳ等）が挙げられる。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常５〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲から適宜選択され、ＮａＣｌ濃度は通常１００〜２００ｍＭ、好ましくは１４０〜１６０ｍＭの範囲から適宜選択される。また、この溶液中には、本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液と本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体とを接触後、本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体との結合を妨げない量であれば、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤、蛋白質等が含まれていても良い。界面活性剤としては、例えばＴｗｅｅｎ２０等が挙げられ、当該本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液における界面活性剤の濃度は、通常０．００００１〜０．２％、好ましくは通常０．０００５〜０．１％である。尚、これらの溶液に本発明に係るＴｉｍタンパク質を溶解した溶液を、「本発明に係るＴｉｍタンパク質含有溶液」と略記する場合がある。
−前記（ｃ）の方法による本発明のＴｉｍ担体の具体的な調製方法−
前記（ｃ）の方法における、本発明のＴｉｍ担体の具体的な調製方法は、例えば以下の方法で行えばよい。
まず、前記の本発明に係るＴｉｍタンパク質の調製方法に従い、本発明に係るＴｉｍタンパク質を調製する。次いで、本発明に係る担体がビーズの場合、本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体を通常０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは０．３ｍｇ〜５．０ｍｇ、より好ましくは０．５〜３．０ｍｇと、本発明に係るＴｉｍタンパク質を本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体１ｍｇ当たり通常１．０〜５０μｇ、好ましくは１．０〜３０μｇ、より好ましくは１．０〜２０μｇ含有する溶液（例えば精製水、例えばｐＨ７．０〜８．０の緩衝液等中に本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液）通常１００〜１０００μＬ、好ましくは２００〜５００μＬを接触させ、通常４℃〜３７℃、好ましくは１１℃〜３０℃、より好ましくは２０℃〜２５℃で、通常０．５時間〜２４時間、好ましくは０．５時間〜８．０時間、より好ましくは０．５時間〜２．０時間反応させ、本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体中の本発明に係るＴｉｍタンパク質に対する抗体と本発明に係るＴｉｍタンパク質とを結合させることにより、本発明のＴｉｍ担体を得る。本発明に係る担体がマイクロプレートの場合、１ウェル当たりの本発明に係る担体−抗Ｔｉｍ抗体複合体と本発明に係る係るＴｉｍタンパク質１．０〜１０μｇ、好ましくは１．０〜５．０μｇ、より好ましくは１．０〜２．０μｇ含有する溶液（例えば精製水、又はｐＨ ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液等中に、本発明に係るＴｉｍタンパク質−ビオチン類複合体を含有する溶液）通常５０μＬ〜３００μＬ、好ましくは５０μＬ〜２００μＬ、より好ましくは１００μＬ〜２００μＬとを接触させ、通常４．０℃〜３７℃、好ましくは１１℃〜３０℃、より好ましくは２０℃〜２５℃で、通常０．５時間〜２４時間、好ましくは０．５時間〜８．０時間、より好ましくは０．５時間〜２．０時間、本発明に係る担体−アフィニティー物質複合体中のアフィニティー物質とアフィニティータグを有する本発明に係るＴｉｍタンパク質中のアフィニティータグとを結合させ、本発明のＴｉｍ担体を得る。
＜物理的吸着により結合させる方法＞
本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体とを物理的吸着により結合させる方法としては、自体公知の方法に従い、本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体とが結合する条件下、本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体とを接触させればよい。
本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体との反応温度としては、通常２℃〜３７℃、好ましくは４℃〜１１℃である。
本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体との反応時間としては、通常４時間〜４８時間、好ましくは１２時間〜２４時間である。
本発明に係るＴｉｍタンパク質としては、本発明に係る担体がビーズの場合、本発明に係る担体１ｍｇと接触させる本発明に係るＴｉｍタンパク質の量は、通常５．０〜５０μｇ、好ましくは１０〜５０μｇ、より好ましくは２０〜５０μｇである。本発明に係る担体がマイクロプレートの場合、１ウェルに接触させる本発明に係るＴｉｍタンパク質の量は、通常０．１μｇ〜１０μｇ、好ましくは０．２μｇ〜５μｇ、より好ましくは０．５μｇ〜２μｇである。
尚、一般に、前記本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体との物理的吸着は、本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液と本発明に係る担体とを接触させることにより行われる。
本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有させる溶液としては、本発明に係るＴｉｍタンパク質を安定な状態で溶解させるものであればよく、例えば精製水、例えばｐＨ６．０〜９．５、好ましくは７．０〜８．０に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＭＯＰＳなどのグッド緩衝液、炭酸緩衝液、ＰＢＳ、ＴＢＳ、ＨＢＳ等）が挙げられる。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常５〜１００ｍＭ、好ましくは１０〜５０ｍＭの範囲から適宜選択され、ＮａＣｌを添加する場合の濃度は通常１００〜２００ｍＭ、好ましくは１４０〜１６０ｍＭの範囲から適宜選択される。また、この溶液中には、本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液と本発明に係る担体とを接触後、本発明の担体と細胞外膜小胞又はウイルスとのとの結合を妨げない量であれば、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤、蛋白質等が含まれていても良い。尚、これらの溶液に本発明に係るＴｉｍタンパク質を溶解した溶液を、「本発明に係るＴｉｍタンパク質含有溶液」と略記する場合がある。
本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体との結合方法における、物理的吸着により結合させる方法の具体例としては、例えば以下の方法が挙げられる。
まず、前記の本発明に係るＴｉｍタンパク質の調製方法に従い、本発明に係るＴｉｍタンパク質を調製する。次いで、本発明に係る担体がビーズの場合、本発明に係る担体１ｍｇに、Ｔｉｍタンパク質を通常５．０〜５０μｇ、好ましくは１０〜５０μｇ、より好ましくは２０〜５０μｇ含有する溶液（例えば精製水、例えばｐＨ７．０〜８．０の緩衝液等中に本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液）を通常５０μＬ〜３００μＬ、好ましくは５０μＬ〜２００μＬ、より好ましくは５０μＬ〜１００μＬ接触させ、また本発明に係る担体がマイクロプレートの場合１ウェルに、Ｔｉｍタンパク質を通常０．１μｇ〜１０μｇ、好ましくは０．２μｇ〜５μｇ、より好ましくは０．５μｇ〜２μｇ含有する溶液（例えば精製水、例えばｐＨ７．０〜８．０の緩衝液等中に本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液）を通常５０μＬ〜３００μＬ、好ましくは５０μＬ〜２００μＬ、より好ましくは５０μＬ〜１００μＬ接触させ、通常２℃〜３７℃、好ましくは４℃〜１１℃で通常４時間〜４８時間、好ましくは１２時間〜２４時間反応させ、本発明に係る担体と本発明に係るＴｉｍタンパク質とを結合させることにより、本発明のＴｉｍ担体を得る。
＜本発明のＴｉｍ担体の処理＞
前記のようにして得られた本発明のＴｉｍ担体を、通常この分野で行われるブロッキング処理に付してもよい。
前記のようにして得られた本発明のＴｉｍ担体を、要すれば、通常この分野で行われる精製処理に付してもよい。精製処理としては、担体表面に付着している不純物を除去することが出来ればよく、例えば、本発明のＴｉｍ担体を洗浄溶液により洗浄する方法（以下、「洗浄操作」と略記する場合がある）が挙げられる。
本発明に係る担体として、磁性粒子を用いる場合を例に取り説明する。
まず、前記のようにして得られた本発明のＴｉｍ担体を含有する溶液を含む容器を、マグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁に本発明のＴｉｍ担体を集合させ、前記容器内の溶液を捨てる。次いで、容器内に洗浄溶液を加え、攪拌する。その後、前記と同様に前記容器を、マグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁に本発明のＴｉｍ担体を集合させ、前記容器内の溶液を捨てる。これらの洗浄操作は、必要に応じて数回繰り返し行ってもよい。当該洗浄操作において用いられる洗浄溶液としては、本発明のＴｉｍ担体における本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明の担体との結合に影響を与えない溶液であればいずれでもよく、例えば精製水、例えばｐＨ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＰＢＳ、ＴＢＳ、ＨＢＳ等）が挙げられる。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常５〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲から適宜選択され、ＮａＣｌ濃度は通常１００〜２００ｍＭ、好ましくは１４０〜１６０ｍＭの範囲から適宜選択される。この溶液中には、本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体との結合を妨げない量であれば、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤、蛋白質等が含まれていても良い。
界面活性剤としては、例えばＴｗｅｅｎ２０等が挙げられ、当該洗浄溶液における界面活性剤の濃度は、通常０．００００１〜０．２％、好ましくは通常０．０００５〜０．１％である。
本発明のＴｉｍ担体を用いれば、細胞外膜小胞又はウィルスを効率的に取得することができ、試料中の細胞外膜小胞又はウィルスを高純度に取得することができる。また、試料中の細胞外膜小胞又はウィルスを効率よく除去することもできる。さらに試料中の細胞外膜小胞又はウィルスを高感度に検出することもできる。
＜６．試料中の細胞外膜小胞又はウイルスの取得方法＞
本発明の細胞外膜小胞又はウイルスを取得する方法（以下、「本発明の取得方法」と略記する場合がある）は、以下の工程を含むことを特徴とする。
（１）カルシウムイオン存在下、担体に結合したＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体を形成させる工程（以下、「複合体形成工程」と略記する場合がある）
（２）当該複合体と試料とを分離する工程（以下、「複合体分離工程」と略記する場合がある）
（３）当該複合体から細胞外膜小胞又はウイルスを分離し、細胞外膜小胞又はウイルスを取得する工程（以下、「取得工程」と略記する場合がある）。
＜６−１．複合体形成工程について＞
複合体形成工程は、カルシウムイオン存在下、Ｔｉｍタンパク質と担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体を形成させる工程である。
＜本発明に係る試料＞
本発明に係る試料は、液体中に本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを含有するもの或いは本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを含有する可能性があるもののいずれであってもよい。本発明に係る試料は、生体に由来するものでも、培地や緩衝液等の溶液に本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを溶解又は懸濁させたもののいずれでもよい。本発明に係る試料として、具体的には、血液、唾液、尿、乳汁、羊水、腹水等の体液、細胞培養上清等が挙げられる。
当該本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを含有（溶解又は懸濁）させる溶液としては、本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを安定な状態で溶解又は懸濁させ、担体に結合したＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体の結合を妨げないものであればよく、例えば水、ｐＨ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＴＢＳ、ＨＢＳ等）等が挙げられる。尚、リン酸バッファーはカルシウムと結合して沈殿が生じるので好ましくない。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常５〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲から適宜選択され、ＮａＣｌ濃度は通常１００〜２００ｍＭ、好ましくは１４０〜１６０ｍＭの範囲から適宜選択される。
この溶液中には、担体に結合したＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体の結合を妨げない量であれば、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤、蛋白質等が含まれていても良い。界面活性剤としては、例えばＴｗｅｅｎ２０等が挙げられ、当該本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを含有させる溶液における界面活性剤の濃度は、通常０．００００１〜０．２％、好ましくは通常０．０００５〜０．１％である。
＜カルシウムイオン濃度・カルシウムイオンの由来＞
本発明において、カルシウムイオンは、本発明に係るＴｉｍタンパク質と担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体を形成させる際に存在させる。より具体的には、本発明に係るＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞とを接触させる際に、カルシウムイオンを存在させる。
本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させる際のカルシウムイオン濃度は、通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは１．０〜１０ｍＭ、より好ましくは２．０〜５．０ｍＭである。尚、本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体が形成され、取得工程を実施するまで、即ち、当該複合体を分離する工程に付すまでの当該複合体を含有する溶液中には、前記した如き濃度のカルシウムイオンが必要であることは言うまでもない。
また、カルシウムイオンの由来は特に限定されず、例えば塩化カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸水素カルシウム、ヨウ化カルシウム、臭化カルシウム、酢酸カルシウム等が挙げられ、好ましくは塩化カルシウム、炭酸水素カルシウム、ヨウ化カルシウムであり、より好ましくは塩化カルシウム、炭酸水素カルシウムである。
尚、本発明に係るＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させる際に、カルシウムイオンを存在させる方法としては、一般的には、本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させる際のカルシウムイオン濃度が上記した範囲となるように、本発明のＴｉｍ担体を含有する溶液、試料、本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液又は／及び本発明に係る担体を含有する溶液に、前記した如きカルシウムイオンを含有させればよい。また、本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させる際のカルシウムイオン濃度が上記した範囲となるようにカルシウムイオンを含有させた溶液を用いて、当該溶液と本発明のＴｉｍ担体を含有する溶液、試料、本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液又は／及び本発明に係る担体を混合させてもよい。
カルシウムイオンを含有させる溶液としては、前記の本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを含有（溶解又は懸濁）させる溶液と同様であり、具体例等も同様である。
＜試料の量＞
複合体形成工程において、本発明のＴｉｍタンパク質１μｇと接触させる試料の量としては、通常０．１〜１００ｍｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｌ、より好ましくは０．１〜１．０ｍｌである。
＜温度＞
複合体形成工程において、本発明のＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させる際の温度としては、通常４〜３７℃、好ましくは４〜２５℃、より好ましくは４〜１１℃である。
＜時間＞
複合体形成工程において、本発明に係るＴｉｍタンパク質と試料との接触時間としては、通常０．５〜２４時間、好ましくは０．５〜８時間、より好ましくは０．５〜４時間である。
複合体形成工程は、（１−Ａ）予め調製された、本発明のＴｉｍ担体を用いる場合（即ち、本発明に係るＴｉｍタンパク質が結合した担体を用いる場合）と、（１−Ｂ）本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体とを別々に用いる場合との２つの場合に分けられる。
＜（１−Ａ）について＞
（１−Ａ）は、カルシウムイオン存在下、本発明のＴｉｍ担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させて、本発明に係る担体に結合したＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体（以下、「本発明に係る複合体」と略記する場合がある）を形成させる方法である。（１−Ａ）において、カルシウムイオンは、本発明のＴｉｍ担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させる際に存在させればよい。具体的には、本発明に係るＴｉｍタンパク質が結合した担体を含有する溶液又は／及び試料中にカルシウムイオンを含有させたものを用いても、本発明に係るＴｉｍタンパク質が結合した担体を含有する溶液と試料とカルシウムイオンを含有する溶液とを用いてもよい。
−本発明に係る試料の量−
（１−Ａ）において、本発明のＴｉｍ担体１ｍｇと接触させる試料の量としては、通常０．１〜１００ｍｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｌ、より好ましくは０．１〜１．０ｍｌである。
−接触温度−
（１−Ａ）において、本発明のＴｉｍ担体と試料を接触させる際の温度としては、通常４．０〜３７℃、好ましくは４．０〜２５℃、より好ましくは４．０〜１１℃である。
−接触時間−
（１−Ａ）において、本発明のＴｉｍ担体と試料（細胞外膜小胞又はウイルス）との接触時間としては、通常０．５〜２４時間、好ましくは０．５〜８．０時間、より好ましくは０．５〜４．０時間である。
−本発明のＴｉｍ担体の量−
（１−Ａ）において、本発明のＴｉｍ担体の量としては、本発明に係る複合体を形成させる際の溶液１ｍＬ当たり通常０．１〜２０ｍｇ、好ましくは０．３〜１０ｍｇ、より好ましくは０．５〜６．０ｍｇである。
−１−Ａの具体例−
（１−Ａ）は、例えば以下の方法で行えばよい。即ち、本発明のＴｉｍ担体を、本発明のＴｉｍ担体と試料とカルシウムイオンを含有する溶液とを混合後の溶液（本発明に係る複合体を形成させる際の溶液）１ｍＬ当たり通常０．１〜２０ｍｇ、好ましくは０．３〜１０ｍｇ、より好ましくは０．５〜６．０ｍｇと、本発明に係る複合体を形成させる際の溶液中のカルシウムイオン濃度が通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは１．０〜１０ｍＭ、より好ましくは２．０〜５．０ｍＭとなる量のカルシウムイオンを含有する溶液と、本発明のＴｉｍ担体１ｍｇ当たり通常０．１〜１００ｍｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｌ、より好ましくは０．１〜１．０ｍｌの試料とを、通常４．０〜３７℃、好ましくは４．０〜２５℃、より好ましくは４．０℃〜１１℃、通常０．５〜２４時間、好ましくは０．５〜８．０時間、より好ましくは０．５〜４．０時間接触させて、本発明に係る担体に結合したＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体を形成させる。
＜（１−Ｂ）について＞
（１−Ｂ）は、本発明のＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体とを別々に用いる方法である。例えば、本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体とをアフィニティー結合を利用して結合させる場合には、以下の（１−Ｂ−ｉ）、（１−Ｂ−ｉｉ）、又は（１−Ｂ−ｉｉｉ）のようにすればよい。
（１−Ｂ−ｉ）本発明のＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを、カルシウムイオンの存在下で同時に接触させて、本発明に係る複合体を形成させる。
（１−Ｂ−ｉｉ）本発明のＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを、カルシウムイオンの存在下で接触させて、本発明のＴｉｍタンパク質と細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体を形成させた後、更に当該複合体と本発明に係る担体とを接触させて、本発明に係る複合体を形成させる。
（１−Ｂ−ｉｉｉ）本発明の担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させた後、更に本発明のＴｉｍタンパク質をカルシウムイオンの存在下で接触させて、本発明に係る複合体を形成させる。
−（１−Ｂ−ｉ）について−
（１−Ｂ−ｉ）は、本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを、カルシウムイオンの存在下で同時に接触させて、［細胞外膜小胞又はウイルス−（本発明に係るＴｉｍタンパク質）−アフィニティー物質−（本発明に係る担体）］からなる本発明に係る複合体を形成させる方法である。
具体的には、例えば、アフィニティー物質として互いに親和性を有する２種以上の物質を用いる場合には、一方のアフィニティー物質が結合した本発明に係るＴｉｍタンパク質（アフィニティー物質結合Ｔｉｍタンパク質）と残りのアフィニティー物質が結合した担体（アフィニティー物質結合担体）と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを、カルシウムイオンの存在下で同時に接触させて、アフィニティー物質結合Ｔｉｍタンパク質中の本発明に係るＴｉｍタンパク質と細胞外膜小胞又はウイルスとを結合させると共に、アフィニティー物質結合Ｔｉｍタンパク質中のアフィニティー物質とアフィニティー物質結合担体中のアフィニティー物質とを結合させることによって、［試料中の細胞外膜小胞又はウイルス−（本発明に係るＴｉｍタンパク質）−アフィニティー物質−（本発明に係る担体）］からなる本発明に係る複合体を形成させる。
（１−Ｂ−ｉ）において、カルシウムイオンは、本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを同時に接触させる際に存在させればよい。具体的には、本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液、本発明に係る担体を含有する溶液、及び試料中の少なくとも一種以上にカルシウムイオンを含有させたものを用いても、本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液、本発明に係る担体を含有する溶液、及び試料とカルシウムイオンを含有する溶液とを接触させることにより行ってもよい。
−本発明に係る試料の量−
（１−Ｂ−ｉ）において、本発明に係るＴｉｍタンパク質１μｇと接触させる試料の量としては、通常０．１〜１００ｍｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｌ、より好ましくは０．１〜１．０ｍｌである。
−本発明に係るＴｉｍタンパク質の量−
（１−Ｂ−ｉ）において、本発明に係るＴｉｍタンパク質の量としては、本発明に係る複合体を形成させる際の溶液１ｍＬ当たり通常０．０１〜２００μｇ、好ましくは０．１５〜５０μｇ、より好ましくは０．５〜２４μｇである。
−本発明に係る担体の量−
（１−Ｂ−ｉ）において、本発明に係る担体の量としては、本発明に係る複合体を形成させる際の溶液１ｍＬ当たり通常０．１〜２０ｍｇ、好ましくは０．３〜１０ｍｇ、より好ましくは０．５〜６．０ｍｇである。
−接触温度−
（１−Ｂ−ｉ）において、本発明のＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させる際の温度としては、通常４〜３７℃、好ましくは４〜２５℃、より好ましくは４〜１１℃である。
−接触時間−
本発明のＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの接触時間としては、通常０．５〜２４時間、好ましくは０．５〜８時間、より好ましくは０．５〜４時間である。
尚、本発明のＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの接触は、通常、本発明のＴｉｍタンパク質を含有する溶液と本発明に係る担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとカルシウムイオンを含有する溶液とを接触させることにより行われる。
本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有させる溶液としては、本発明に係るＴｉｍタンパク質を安定な状態で溶解させ、本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体と細胞外膜小胞又はウイルスとの結合を妨げないものであればよく、例えば精製水、例えばｐＨ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＰＢＳ、ＴＢＳ、ＨＢＳ等）が挙げられる。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常５〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲から適宜選択され、ＮａＣｌ濃度は通常１００〜２００ｍＭ、好ましくは１４０〜１６０ｍＭの範囲から適宜選択される。この溶液中には、本発明に係るＴｉｍタンパク質を安定な状態で溶解させ、本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体と細胞外膜小胞又はウイルスとの結合を妨げない量であれば、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤、蛋白質等が含まれていても良い。界面活性剤としては、例えばＴｗｅｅｎ２０等が挙げられ、当該本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有させる溶液における界面活性剤の濃度は、通常０．００００１〜０．２％、好ましくは通常０．０００５〜０．１％である。
カルシウムイオンを含有させる溶液としては、前記の本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを含有（溶解又は懸濁）させる溶液と同様であり、具体例等も同様である。
カルシウムイオンを含有する溶液としては、カルシウムイオンを含有させる溶液中、本発明に係る複合体を形成させる際の溶液中のカルシウムイオンの濃度が通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ、より好ましくは２〜５ｍＭとなる量のカルシウムイオンを含有する溶液である。
−（１−Ｂ−ｉ）の具体例−
（１−Ｂ−ｉ）は、例えば以下の方法で行えばよい。即ち、本発明に係る複合体を形成させる際の溶液１ｍＬ当たり通常０．０１〜２００μｇ、好ましくは０．１５〜５０μｇ、より好ましくは０．５〜２４μｇの本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液（例えば精製水、例えばｐＨ ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液中に本発明のＴｉｍタンパク質を含有させた溶液）を通常０．５μＬ〜１ｍｌ、好ましくは０．５μＬ〜１００μＬ、より好ましくは０．５μＬ〜１０μＬと、試料を本発明に係るＴｉｍタンパク質１μｇ当たり通常０．１〜１００ｍｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｌ、より好ましくは０．１〜１ｍｌと、本発明に係る複合体を形成させる際の溶液中のカルシウムイオン濃度が通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ、より好ましくは２〜５ｍＭとなる量のカルシウムイオンを含有する溶液と、本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液と試料とカルシウムイオンを含有する溶液と本発明に係る担体とを混合後の溶液（本発明に係る複合体を形成させる際の溶液）１ｍＬ当たり通常０．１〜２０ｍｇ、好ましくは０．３〜１０ｍｇ、より好ましくは０．５〜６ｍｇの本発明に係る担体とを、通常０．５〜２４時間、好ましくは０．５〜８時間、より好ましくは０．５〜４時間接触させ、本発明に係る複合体を形成させる。
−（１−Ｂ−ｉｉ）について−
（１−Ｂ−ｉｉ）は、本発明のＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを、カルシウムイオンの存在下で接触させて、本発明のＴｉｍタンパク質と細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体を形成させた後、更に当該複合体と本発明に係る担体とを接触させて、［細胞外膜小胞又はウイルス−（本発明に係るＴｉｍタンパク質）−アフィニティー物質−（本発明に係る担体）］からなる複合体を形成させる方法である。
具体的には、例えばアフィニティー物質として互いに親和性を有する２種以上の物質を用いた場合は、一方のアフィニティー物質が結合したＴｉｍタンパク質（アフィニティー物質結合Ｔｉｍタンパク質）と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを、カルシウムイオンの存在下で接触させて、アフィニティー物質結合Ｔｉｍタンパク質中のＴｉｍタンパク質と細胞外膜小胞とを結合させて、［細胞外膜小胞又はウイルス−（本発明に係るＴｉｍタンパク質−アフィニティー物質）］複合体を形成させる。次いで、［細胞外膜小胞−（本発明に係るＴｉｍタンパク質−アフィニティー物質）］複合体ともう一方のアフィニティー物質が結合した担体（アフィニティー物質結合担体）とを接触させて、［細胞外膜小胞又はウイルス−（本発明に係るＴｉｍタンパク質−アフィニティー物質）］複合体中のアフィニティー物質とアフィニティー物質結合担体中のアフィニティー物質とを結合させることによって、［細胞外膜小胞又はウイルス−（本発明に係るＴｉｍタンパク質−アフィニティー物質）−（アフィニティー物質−本発明に係る担体）］複合体を形成させる。
また、例えばアフィニティー物質としてアフィニティータグに親和性を有する物質や抗Ｔｉｍ抗体を用いる場合は、本発明に係るＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを、カルシウムイオン存在下で接触させて、本発明に係るＴｉｍタンパク質と細胞外膜小胞又はウイルスとを結合させて、［細胞外膜小胞又はウイルス−本発明に係るＴｉｍタンパク質］複合体を形成させる。次いで、［細胞外膜小胞又はウイルス−本発明に係るＴｉｍタンパク質］複合体とアフィニティー物質が結合した担体（アフィニティー物質結合担体）とを接触させて、［細胞外膜小胞又はウイルス−本発明に係るＴｉｍタンパク質］複合体中の本発明に係るＴｉｍタンパク質とアフィニティー物質結合担体中のアフィニティー物質とを結合させることによって、［細胞外膜小胞又はウイルス−本発明に係るＴｉｍタンパク質−（アフィニティー物質−本発明に係る担体）］複合体を形成させる。
（１−Ｂ−ｉｉ）において、カルシウムイオンは、本発明に係るＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させる際に存在させればよい。具体的には、本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液又は／及び試料中にカルシウムイオンを含有させたものを用いても、本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液と試料とカルシウムイオンを含有する溶液とを用いてもよい。
−本発明に係る試料の量−
（１−Ｂ−ｉｉ）において、本発明に係るＴｉｍタンパク質１μｇと接触させる試料の量としては、通常０．１〜１００ｍｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｌ、より好ましくは０．１〜１．０ｍｌである。
−本発明に係るＴｉｍタンパク質の量−
（１−Ｂ−ｉｉ）において、本発明に係るＴｉｍタンパク質の量としては、本発明に係る複合体を形成させる際の溶液１ｍＬ当たり通常０．０１〜２００μｇ、好ましくは０．１５〜５０μｇ、より好ましくは０．５〜２４μｇである。
−本発明に係る担体の量−
（１−Ｂ−ｉｉ）において、本発明に係る担体の量としては、本発明に係る複合体を形成させる際の溶液１ｍＬ当たり通常０．１〜２０ｍｇ、好ましくは０．３〜１０ｍｇ、より好ましくは０．５〜６ｍｇである。
−接触温度−
（１−Ｂ−ｉｉ）において、本発明のＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させる際の温度としては、通常４〜３７℃、好ましくは４〜２５℃、より好ましくは４〜１１℃である。
（１−Ｂ−ｉｉ）において、本発明のＴｉｍタンパク質と細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体を形成させた後、更に当該複合体と本発明に係る担体とを接触させる際の温度としては、通常４〜３７℃、好ましくは４〜２５℃、より好ましくは４〜１１℃である。
−接触時間−
（１−Ｂ−ｉｉ）において、本発明のＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体と本発明に係る試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの接触時間としては、通常０．５〜２４時間、好ましくは０．５〜８時間、より好ましくは０．５〜４時間である。
（１−Ｂ−ｉｉ）において、本発明のＴｉｍタンパク質と細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体を形成させた後、更に当該複合体と本発明に係る担体とを接触させる際の時間としては、通常０．５〜２４時間、好ましくは０．５〜８時間、より好ましくは０．５〜４時間である。
尚、通常、本発明に係るＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの接触は、本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液と試料とカルシウムイオンを含有する溶液を接触させることにより行われる。
本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有させる溶液としては、本発明に係るＴｉｍタンパク質を安定な状態で溶解させ、本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体と本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスとの結合を妨げないものであればよく、例えば精製水、例えばｐＨ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液（例えば、ＴＢＳ、ＨＢＳ等）が挙げられる。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常５〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲から適宜選択され、ＮａＣｌ濃度は通常１００〜２００ｍＭ、好ましくは１４０〜１６０ｍＭの範囲から適宜選択される。この溶液中には、本発明に係るＴｉｍタンパク質を安定な状態で溶解させ、本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体と細胞外膜小胞又はウイルスとの結合を妨げない量であれば、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤、蛋白質等が含まれていても良い。界面活性剤としては、例えばＴｗｅｅｎ２０等が挙げられ、当該本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有させる溶液における界面活性剤の濃度は、通常０．００００１〜０．２％、好ましくは通常０．０００５〜０．１％である。
カルシウムイオンを含有させる溶液としては、前記の本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを含有（溶解又は懸濁）させる溶液と同様であり、具体例等も同様である。
カルシウムイオンを含有する溶液としては、カルシウムイオンを含有させる溶液中、本発明に係る複合体を形成させる際の溶液中のカルシウムイオンの濃度が通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ、より好ましくは２〜５ｍＭとなる量のカルシウムイオンを含有する溶液である。
−（１−Ｂ−ｉｉ）の具体例−
（１−Ｂ−ｉｉ）は、例えば以下の方法で行えばよい。即ち、本発明に係る複合体を形成させる際の溶液１ｍＬ当たり通常０．０１〜２００μｇ、好ましくは０．１５〜５０μｇ、より好ましくは０．５〜２４μｇの本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液（例えば精製水、例えばｐＨ ７．０〜８．０、好ましくは７．２ 〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液中に本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液）を通常０．５μＬ〜１ｍｌ、好ましくは０．５μＬ〜１００μＬ、より好ましくは０．５μＬ〜１０μＬと、試料を本発明に係るＴｉｍタンパク質１μｇ当たり通常０．１〜１００ｍｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｌ、より好ましくは０．１〜１ｍｌと、試料とカルシウムイオンを含有する溶液と本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液とを混合した溶液中及びさらに当該溶液と本発明に係る担体を接触後の溶液中におけるカルシウムイオンの濃度が通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ、より好ましくは２〜５ｍＭとなる量のカルシウムイオンを含有する溶液とを、通常４〜３７℃、好ましくは４〜２５℃、より好ましくは４〜１１℃、通常０．５〜２４時間、好ましくは０．５〜８時間、より好ましくは０．５〜４時間接触させ、本発明のＴｉｍタンパク質と細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体を形成させた後、更に本発明に係る複合体を形成させる際の溶液１ｍＬ当たり本発明に係る担体を通常０．１〜２０ｍｇ、好ましくは０．３〜１０ｍｇ、より好ましくは０．５〜６ｍｇ加えて、通常４〜３７℃、好ましくは４〜２５℃、より好ましくは４〜１１℃、通常０．５〜２４時間、好ましくは０．５〜８時間、より好ましくは０．５〜４時間、得られた本発明のＴｉｍタンパク質と細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体と本発明に係る担体とを接触させて、本発明に係る複合体を形成させる。
−（１−Ｂ−ｉｉｉ）について−
（１−Ｂ−ｉｉｉ）は、本発明の担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させた後、更に本発明のＴｉｍタンパク質をカルシウムイオンの存在下で接触させて、［細胞外膜小胞又はウイルス−（本発明に係るＴｉｍタンパク質）−アフィニティー物質−（本発明に係る担体）］からなる本発明に係る複合体を形成させる方法である。
具体的には、例えばアフィニティー物質として互いに親和性を有する２種以上の物質を用いる場合は、一方のアフィニティー物質が結合した担体（アフィニティー物質結合担体）と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させ、次いで、これと、もう一方のアフィニティー物質が結合したＴｉｍタンパク質（アフィニティー物質結合Ｔｉｍタンパク質）とを、カルシウムイオンの存在下で同時に接触させて、アフィニティー物質結合Ｔｉｍタンパク質中のＴｉｍタンパク質と細胞外膜小胞又はウイルスとを結合させると共に、アフィニティー物質結合Ｔｉｍタンパク質中のアフィニティー物質とアフィニティー物質結合担体中のアフィニティー物質とを結合させることによって、［細胞外膜小胞又はウイルス−（本発明に係るＴｉｍタンパク質−アフィニティー物質）−（アフィニティー物質−本発明に係る担体）］複合体を形成させる。
また、例えばアフィニティー物質としてアフィニティータグに親和性を有する物質や抗Ｔｉｍ抗体を用いる場合は、アフィニティー物質が結合した担体（アフィニティー物質結合担体）と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させ、次いで、これと、本発明に係るＴｉｍタンパク質とを、カルシウムイオン存在下で同時に接触させて、本発明に係るＴｉｍタンパク質と細胞外膜小胞又はウイルスとを結合させると共に、本発明に係るＴｉｍタンパク質とアフィニティー物質結合担体中のアフィニティー物質とを結合させることによって、［細胞外膜小胞又はウイルス−本発明に係るＴｉｍタンパク質−（アフィニティー物質−本発明に係る担体）］複合体を形成させる。
（１−Ｂ−ｉｉｉ）において、カルシウムイオンは、本発明に係るＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させる際に存在させればよい。具体的には、本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液、又は／及び試料中の細胞外膜小胞又はウイルスにカルシウムイオンを含有させたものを用いても、本発明に係るＴｉｍ４タンパク質を含有する溶液と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとカルシウムイオンを含有する溶液とを用いてもよい。
−本発明に係る試料の量−
（１−Ｂ−ｉｉｉ）において、本発明に係るＴｉｍタンパク質１μｇと接触させる試料の量は、通常０．１〜１００ｍｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｌ、より好ましくは０．１〜１ｍｌである。
−本発明に係るＴｉｍタンパク質の量−
（１−Ｂ−ｉｉｉ）において、本発明に係るＴｉｍタンパク質の量としては、本発明に係る複合体を形成させる際の溶液１ｍＬ当たり通常０．０１〜２００μｇ、好ましくは０．１５〜５０μｇ、より好ましくは０．５〜２４μｇである。
−本発明に係る担体の量−
（１−Ｂ−ｉｉｉ）において、本発明に係る担体の量としては、本発明に係る複合体を形成させる際の溶液１ｍＬ当たり通常０．１〜２０ｍｇ、好ましくは０．３〜１０ｍｇ、より好ましくは０．５〜６ｍｇである。
−接触温度−
（１−Ｂ−ｉｉｉ）において、本発明に係る担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させる際の温度としては、通常４〜３７℃、好ましくは４〜２５℃、より好ましくは４〜１１℃である。
（１−Ｂ−ｉｉｉ）において、本発明の担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させた後、更に本発明のＴｉｍタンパク質を接触させる際の温度としては、通常４〜３７℃、好ましくは４〜２５℃、より好ましくは４〜１１℃である。
−接触時間−
（１−Ｂ−ｉｉｉ）において、本発明に係る担体と試料とを接触させる際の接触時間としては、通常０．５〜２４時間、好ましくは０．５〜８時間、より好ましくは０．５〜４時間である。
（１−Ｂ−ｉｉｉ）において、本発明の担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させた後、更に本発明に係るＴｉｍタンパク質を接触させる際の接触時間としては、通常０．５〜２４時間、好ましくは０．５〜８時間、より好ましくは０．５〜４時間である。
尚、一般には、本発明の担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させた後、更に本発明に係るＴｉｍタンパク質との接触は、本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液とカルシウムイオンを含有する溶液とを用いて行われる。
本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有させる溶液としては、本発明に係るＴｉｍタンパク質を安定な状態で溶解させ、本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体と細胞外膜小胞又はウイルスとの結合を妨げないものであればよく、例えば精製水、例えばｐＨ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＰＢＳ、ＴＢＳ、ＨＢＳ等）が挙げられる。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常５〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲から適宜選択され、ＮａＣｌ濃度は通常１００〜２００ｍＭ、好ましくは１４０〜１６０ｍＭの範囲から適宜選択される。この溶液中には、本発明に係るＴｉｍ４タンパク質を安定な状態で溶解させ、本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体と細胞外膜小胞又はウイルスとの結合を妨げない量であれば、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤、蛋白質等が含まれていても良い。界面活性剤としては、例えばＴｗｅｅｎ２０等が挙げられ、当該本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有させる溶液における界面活性剤の濃度は、通常０．００００１〜０．２％、好ましくは通常０．０００５〜０．１％である。
カルシウムイオンを含有させる溶液としては、前記の本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを含有（溶解又は懸濁）させる溶液と同様であり、具体例等も同様である。
カルシウムイオンを含有する溶液としては、カルシウムイオンを含有させる溶液中、本発明に係る複合体を形成させる際の溶液中のカルシウムイオンの濃度が通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ、より好ましくは２〜５ｍＭとなる量のカルシウムイオンを含有する溶液である。
−（１−Ｂ−ｉｉｉ）の具体例−
（１−Ｂ−ｉｉｉ）は、例えば以下の方法で行えばよい。即ち、本発明に係る試料を本発明に係るＴｉｍタンパク質１μｇ当たり通常０．１〜１００ｍｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｌ、より好ましくは０．１〜１ｍｌと、本発明に係る複合体を形成させる際の溶液１ｍＬ当たり本発明に係る担体を通常０．１〜２０ｍｇ、好ましくは０．３〜１０ｍｇ、より好ましくは０．５〜６ｍｇとを、通常４〜３７℃、好ましくは４〜２５℃、より好ましくは４〜１１℃、通常０．５〜２４時間、好ましくは０．５〜８時間、より好ましくは０．５〜４時間接触させた後、カルシウムイオンを、本発明に係る試料とカルシウムイオンを含有する溶液と本発明に係る担体とを接触させてさらに本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液を接触させた溶液中におけるカルシウムイオンの濃度が通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは１．０〜１０ｍＭ、より好ましくは２〜５ｍＭとなる量含有するカルシウムイオン含有溶液と通常０．０１〜２００μｇ、好ましくは０．１５〜５０μｇ、より好ましくは０．５〜２４μｇの本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液（例えば精製水、例えばｐＨ ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液中に本発明に係るＴｉｍタンパク質を含有する溶液）を本発明に係る複合体を形成させる際の溶液１ｍＬ当たり通常０．５μＬ〜１ｍｌ、好ましくは０．５μＬ〜１００μＬ、より好ましくは０．５μＬ〜１０μＬ加えて、通常４〜３７℃、好ましくは４〜２５℃、より好ましくは４〜１１℃、通常０．５〜２４時間、好ましくは０．５〜８時間、より好ましくは０．５〜４時間接触させて、本発明に係る複合体を形成させる。
＜６−２．複合体分離工程＞
本発明の取得方法における複合体分離工程は、複合体形成工程の後、得られた本発明に係る担体に結合したＴｉｍタンパク質（本発明のＴｉｍ担体）と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体（本発明に係る複合体）と試料とを分離し、分離された本発明に係る複合体を取得する工程である。
本発明の取得方法における複合体分離工程は、本発明に係る複合体と試料とを分離して本発明に係る複合体を取得することができればどのような方法であってもよいが、例えば以下のような方法が挙げられる。
（１）磁気担体を本発明に係る担体として用いる場合、複合体形成工程をおこなった容器を要すればマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁に本発明に係る複合体を集合させ、上清の試料を除くことによりこれらを分離する方法。
（２）本発明の担体がビーズ状である場合、複合体形成工程をおこなった容器を遠心分離処理し、本発明に係る複合体を沈殿として集合させた後、上清の試料を除くことによりこれらを分離する方法。
（３）本発明の担体がビーズ状でないプレートなどを用いた場合、試料のみを除くことによりこれらを分離する方法。
（４）ろ過により本発明に係る複合体と試料とを分離する方法。
このようにして本発明の複合体と試料とを分離した後、分離された本発明の複合体を自体公知の方法により取得（回収）すればよい。
−複合体分離工程の具体例−
磁気担体を本発明に係る担体として用いる場合、複合体形成工程をおこなった容器を要すればマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁に本発明に係る複合体を集合させ、上清の試料を除く。
＜６−３．洗浄操作＞
複合体形成工程、複合体分離工程の後、要すれば得られた本発明に係る複合体をカルシウムイオン含有洗浄溶液を用いて洗浄してもよい（以下、「洗浄操作」と略記する場合がある）。洗浄操作により、本発明に係る担体表面に付着した細胞由来成分等の本発明に係る試料中の夾雑物を除去することができる。洗浄方法としては、上記した如きカルシウムイオン含有洗浄液を使用する以外は、通常この分野で行われている洗浄方法が使用できる。当該洗浄操作において用いられるカルシウムイオン含有洗浄溶液としては、カルシウムイオンを通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは通常１〜１０ｍＭ、より好ましくは通常２〜５ｍＭ含有し、当該複合体における本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスと本発明に係るＴｉｍ４タンパク質と本発明の担体との結合に影響を与えない溶液であればいずれでもよく、例えば、カルシウムイオンを通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは通常１〜１０ｍＭ、より好ましくは通常２〜５ｍＭ含有する、ｐＨ ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有するカルシウムを沈殿させない緩衝液（例えばＴＢＳ、ＨＢＳ）が挙げられる。尚、リン酸バッファーはカルシウムと結合して沈殿が生じるので好ましくない。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常５〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲から適宜選択され、ＮａＣｌ濃度は通常１００〜２００ｍＭ、好ましくは１４０〜１６０ｍＭの範囲から適宜選択される。この溶液中には、当該複合体における本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスと本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明の担体との結合を妨げない量であれば、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤、蛋白質等が含まれていても良い。界面活性剤としては、例えばｔｗｅｅｎ ２０（和光純薬工業（株）製）等が挙げられ、当該洗浄溶液における界面活性剤の濃度は、通常０．００００１〜０．２％、好ましくは通常０．０００５〜０．１％である。
例えば、本発明に係る担体として、磁性粒子を用いる場合を例に取り説明する。まず、複合体分離工程により得られた本発明に係る複合体を含む容器内にカルシウムイオン含有洗浄溶液を加え、攪拌する。その後、前記容器を、マグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁に当該複合体を集合させ、前記容器内の溶液を捨てる。これらの洗浄操作は、必要に応じて数回繰り返し行ってもよい。
−洗浄操作の具体例−
まず、複合体分離工程により得られた本発明に係る複合体を含む容器内にカルシウムイオン含有洗浄溶液（例えば、カルシウムイオンを通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは通常１〜１０ｍＭ、より好ましくは通常２〜５ｍＭ含有する、ｐＨ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有するカルシウムを沈殿させない緩衝液。但し、リン酸バッファーはカルシウムと結合して沈殿することから好ましくない。）を加え、攪拌する。その後、前記容器を、マグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁に当該複合体を集合させ、前記容器内の溶液を捨てる。これらの洗浄操作は、必要に応じて数回繰り返し行ってもよい。
＜６−４．取得工程について＞
取得工程は、複合体形成工程、複合体分離工程を行い、要すれば洗浄工程（洗浄操作）を行った後、得られた本発明に係る担体に結合したＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体から細胞外膜小胞又はウイルスを分離し、本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを取得する工程である。
これにより、本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを高純度に取得することが出来る。
取得工程の具体例としては、例えば以下の（２−Ａ）及び（２−Ｂ）が挙げられる。
（２−Ａ）タンパク質変性剤を用いる方法
（２−Ｂ）カルシウムイオン濃度を低下させる方法
＜（２−Ａ）：タンパク質変性剤を用いる方法＞
（２−Ａ）は、複合体形成工程、複合体分離工程を行った後、要すれば洗浄操作を行った後、得られた本発明に係る複合体に、タンパク質変性剤を作用させて、本発明に係る複合体中の本発明に係るＴｉｍタンパク質を変性させ、本発明に係る複合体から、細胞外膜小胞又はウイルスを分離する方法である。これにより、本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを高純度に取得することができる。
−タンパク質変性剤−
（２−Ａ）で用いられるタンパク質変性剤としては、この分野において一般にタンパク質を変性させる化合物として用いられるものであればいずれでもよく、例えば、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｎ−ラウロイルサルコシン等の陰イオン性界面活性剤；ＣＨＡＰＳ（３−（３−コラミドプロピル）シエツルアミノ−１−プロパンスルホン酸塩）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１２（Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート）等の両イオン性界面活性剤；Ｂｒｉｊ ３５（タカラバイオ（株）製）、Ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ（ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド）、ノニデット Ｐ−４０、Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（オクチル−β−Ｄ−グルコシド）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル）、Ｔｗｅｅｎ ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）等の非イオン性界面活性剤；尿素、ホルムアミド、グアニジン等のカオトロピック剤等が挙げられ、陰イオン性界面活性剤が好ましく、ＳＤＳが特に好ましい。
（２−Ａ）において、これらのタンパク質変性剤を本発明に係る複合体に作用させるには、一般的には、タンパク質変性剤を含有させた溶液（以下、「タンパク質変性剤含有溶液」と略記する場合がある）と、本発明に係る担体に結合したＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体とを接触させ、タンパク質変性剤含有溶液を本発明に係る複合体に作用させることにより行われる。
尚、タンパク質変性剤含有溶液と本発明に係る複合体との接触は、例えば、当該溶液に当該複合体を懸濁させる方法（担体がビーズである場合等）、当該溶液に当該複合体を浸漬させる方法（担体がディスク状片、チューブである場合等）、当該溶液を当該複合体（担体）に添加する方法（担体がマイクロプレート、チューブである場合等）等により行うことができる。
−タンパク質変性剤を含有させる溶液−
（２−Ａ）において、タンパク質変性剤を含有させる溶液としては、精製水、タンパク質変性剤を溶解させることができる緩衝液等が挙げられる。当該緩衝液としては、通常ｐＨが６〜９、好ましくは７〜８に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＴｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ等）が挙げられる。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常５〜１００ｍＭ、好ましくは１０〜５０ｍＭの範囲から適宜選択される。
−タンパク質変性剤含有溶液−
（２−Ａ）において、タンパク質変性剤含有溶液のｐＨは通常６．０〜９．０、好ましくは７．０〜８．０である。タンパク質変性剤含有溶液中のタンパク質変性剤の濃度としては、タンパク質変性剤の種類により異なるが、一般にこの分野において用いられる濃度範囲であればよく、例えばＳＤＳの場合、通常０．１〜１０％、好ましくは０．３〜４％、より好ましくは０．５〜２％である。また、タンパク質変性剤含有溶液は、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、防腐剤、蛋白質等を含んでいてもよい。（２−Ａ）において、タンパク質変性剤含有溶液は、本発明のＴｉｍ担体１ｍｇに対して通常１０μＬ〜５００μＬ、好ましくは２０μＬ〜２００μＬ、より好ましくは５０μＬ〜１００μＬ用いられる。
−作用（接触）条件−
（２−Ａ）において、複合体にタンパク質変性剤を作用（接触）させる温度や時間としては、通常４．０〜３７℃、好ましくは１０〜３０℃、より好ましくは２０〜３０℃で、通常５．０〜６０秒間、好ましくは１０〜３０秒間、より好ましくは１０〜２０秒間である。
−Ｔｉｍタンパク質−
タンパク質変性剤を作用（接触）させる（即ち（２−Ａ）の）場合、細胞外膜小胞を取得する場合における本発明に係るＴｉｍタンパク質としては、前記の本発明に係るＴｉｍタンパク質であればいずれでも用いることができるが、本発明に係るＴｉｍ４タンパク質及び本発明に係るＴｉｍ１タンパク質が好ましく、本発明に係るＴｉｍ４タンパク質が特に好ましく、またウイルスを取得する場合には、本発明に係るＴｉｍ４タンパク質及び本発明に係るＴｉｍ３タンパク質が特に好ましい。
−（２−Ａ）の具体例−
（２−Ａ）は、例えば以下の方法で行えばよい。即ち、複合体形成工程、複合体分離工程を行い、要すれば洗浄操作を行った後、得られた本発明に係る複合体に、タンパク質変性剤を通常０．１〜１０％、好ましくは０．３〜４．０％、より好ましくは０．５〜２．０％含有する溶液（精製水、又は通常ｐＨが６〜９、好ましくは７〜８に緩衝作用を有する緩衝液中にタンパク質変性剤を含有する溶液）を、本発明のＴｉｍ担体１ｍｇに対して通常１０μＬ〜５００μＬ、好ましくは２０μＬ〜２００μＬ、より好ましくは５０μＬ〜１００μＬ添加し、ボルテックスミキサー等を用いて撹拌しながら通常４〜３７℃、好ましくは１０〜３０℃、より好ましくは２０〜３０℃で、通常５〜６０秒間、好ましくは１０〜３０秒間、より好ましくは１０〜２０秒間反応させ、本発明に係る複合体中の本発明に係るＴｉｍタンパク質とタンパク質変性剤とを接触させることにより作用させ、本発明に係る複合体から細胞外膜小胞又はウイルスを分離させる。
＜（２−Ｂ）：カルシウムイオン濃度を低下させる方法＞
（２−Ｂ）は、複合体形成工程、複合体分離工程を行い、要すれば洗浄操作を行った後、得られた本発明に係る複合体と結合しているカルシウムイオン及び複合体を含有する溶液中のカルシウムイオンの濃度を低下させることによって、本発明に係る複合体から、本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを分離させる方法である。
これにより、本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを高純度で、且つインタクトな状態で取得することができる。
ところで、Ｔｉｍタンパク質とホスファチジルセリンの結合においては、カルシウムイオンが介在していることが知られている（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００７ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；２７（６）：９４１−９５１）。複合体形成工程、複合体分離工程を行い、要すれば洗浄操作を行った後、得られた本発明に係る複合体も、本発明に係る複合体中の本発明に係るＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの結合を保つために、カルシウムイオンを共存させておく必要がある。例えば本発明に係る複合体を溶液中に共存させる場合には、本発明に係る複合体の溶液中に０．５ｍＭ以上のカルシウムイオンが必要である。ここで、本発明に係る複合体を溶液中に共存させる場合には、複合体形成工程、複合体分離工程、要すれば洗浄操作を行った後のペレット状態の担体も包含される。
なお、複合体形成工程、複合体分離工程、要すれば洗浄操作を行った後の本発明に係る複合体が乾燥したとしても、取得工程を行わない限り当該複合体からカルシウムイオンが溶出することはなく、本発明の担体と細胞外膜小胞又はウイルスとの結合は保たれる。
（２−Ｂ）は、本発明に係る複合体と結合しているカルシウムイオンから持ち込まれたカルシウムイオンの濃度を上記した如き本発明に係るＴｉｍタンパク質と細胞外膜小胞又はウイルスとの結合を保つために必要な濃度（有効濃度）より低下させることによって、本発明に係る複合体から、本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを分離させることが可能となる。
具体的には、本発明に係る複合体を含有される溶液中のカルシウムイオンの濃度を通常０．５ｍＭ未満、好ましくは０．４ｍＭ未満、より好ましくは０．２ｍＭ未満とすればよい。
カルシウムイオンの（有効）濃度を低下させる方法としては、例えば以下の（２−Ｂ−ｉ）、（２−Ｂ−ｉｉ）等が挙げられる。
（２−Ｂ−ｉ）カルシウムイオンキレート剤を使用する方法
（２−Ｂ−ｉｉ）カルシウムイオンを含まない溶液を用いる方法
−（２−Ｂ−ｉ）：カルシウムイオンキレート剤を使用する方法−
（２−Ｂ−ｉ）は、複合体形成工程、複合体分離工程を行い、要すれば洗浄操作を行った後、得られた本発明に係る複合体と結合しているカルシウムイオン及び複合体を含有する溶液から持ち込まれたカルシウムイオンにカルシウムイオンキレート剤を作用させた後、本発明に係る複合体と結合しているカルシウムイオン及び複合体を含有する溶液から持ち込まれたカルシウムイオンの（有効）濃度を低下させる（カルシウムイオンをキレートさせる）ことによって、本発明に係る複合体から細胞外膜小胞又はウイルスを分離させる方法である。
これにより、本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを高純度で、且つインタクトな状態で取得することができる。
−カルシウムイオンキレート剤−
カルシウムイオンキレート剤としては、カルシウムイオンをキレートし得る化合物であればいずれでもよく、例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＧＬＤＡ（Ｌ−グルタミン酸二酢酸）、ＨＥＤＴＡ（ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸）、ＧＥＤＴＡ（エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−四酢酸）、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸）、ＨＩＤＡ（２−ヒドロキシエチルイミノ二（酢酸））、ＤＨＥＧ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、ＣｙＤＴＡ（ｔｒａｎｓ−１，２−Ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ， ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）等が挙げられ、ＥＤＴＡ、ＧＥＤＴＡ、ＣｙＤＴＡが好ましい。これらのカルシウムイオンキレート剤を本発明に係る複合体と結合しているカルシウムイオンに作用させるには、一般には、カルシウムイオンキレート剤を含有させた溶液（以下、「カルシウムイオンキレート剤含有溶液」と略記する場合がある）をペレット状の本発明に係る複合体と接触させ、本発明に係る複合体と結合しているカルシウムイオンとカルシウムイオンキレート剤含有溶液中のカルシウムイオンキレート剤とを反応させることにより行われる。
尚、カルシウムイオンキレート剤含有溶液と本発明に係る複合体との接触は、例えば当該溶液に当該複合体を懸濁させる方法（担体がビーズである場合等）、当該溶液に当該複合体を浸漬させる方法（担体がディスク状片、チューブである場合等）、当該溶液を当該複合体（担体）に添加する方法（担体がマイクロプレート、チューブである場合等）等により行うことができる。
−カルシウムイオンキレート剤含有溶液−
（２−Ｂ−ｉ）において、カルシウムイオンキレート剤を含有させる溶液としては、カルシウムイオンキレート剤を溶解させるものであればよく、例えば、精製水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液としては、通常ｐＨが７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＰＢＳ、ＴＢＳ、ＨＢＳ等）が好ましい。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常５〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲から適宜選択され、ＮａＣｌ濃度は通常１００〜２００ｍＭ、好ましくは１４０〜１６０ｍＭの範囲から適宜選択される。カルシウムイオンキレート剤含有溶液は、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、防腐剤、蛋白質等が含まれていても良い。
（２−Ｂ−ｉ）において、カルシウムイオンキレート剤含有溶液中のカルシウムイオンキレート剤の濃度としては、通常０．５〜５００ｍＭ、好ましくは０．５〜１００ｍＭ、より好ましくは０．５〜５０ｍＭである。
（２−Ｂ−ｉ）において、カルシウムイオンキレート剤含有溶液のｐＨは、通常６．０〜９．０、好ましくは７．０〜８．０、より好ましくは７．２〜７．６である。
（２−Ｂ−ｉ）において、反応溶液に混合するカルシウムイオンキレート剤含有溶液の量としては、反応溶液中のカルシウムイオンの濃度を有効濃度未満とし、本発明に係る複合体から細胞外膜小胞又はウイルスが分離される量であればよい。
−作用（接触）条件−
（２−Ｂ−ｉ）において、複合体にカルシウムイオンキレート剤を作用（接触）させる温度や時間としては、通常４．０〜３７℃、好ましくは１０〜３０℃、より好ましくは２０〜３０℃で通常５〜６０秒間、好ましくは１０〜３０秒間、より好ましくは１０〜２０秒間行う。
−Ｔｉｍ担体−
（２−Ｂ−ｉ）において、本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体との結合様式としては、本発明に係る担体と本発明に係るＴｉｍタンパク質とが結合していれば結合様式は問わない。カルシウムイオンキレート剤を用いて細胞外膜小胞又はウイルスを溶出させる場合（即ち（２−Ｂ−ｉ）の場合）には、多くの細胞外膜小胞又はウイルスを取得可能であることから本発明に係る担体が本発明に係るＴｉｍタンパク質のＳＨ基に結合したものが好ましく、本発明に係る担体が本発明に係るＴｉｍ４タンパク質のＳＨ基に結合したものが特に好ましい。
−（２−Ｂ−ｉ）の具体例−
（２−Ｂ−ｉ）は、例えば以下の方法で行えばよい。即ち、複合体形成工程、複合体分離工程を行い、要すれば洗浄操作を行った後、得られた本発明に係る複合体に、通常０．５〜５００ｍＭ、好ましくは０．５〜１００ｍＭ、より好ましくは０．５〜５０ｍＭカルシウムイオンキレート剤を含有する溶液（精製水、又は通常ｐＨが７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液中にカルシウムイオンキレート剤を含有する溶液）を本発明のＴｉｍ担体１ｍｇ当たり通常１０〜５００μＬ、好ましくは２０〜２００μＬ、より好ましくは５０〜１００μＬ添加し、ボルテックスミキサー等を用いて撹拌しながら通常４．０〜３７℃、好ましくは１０〜３０℃、より好ましくは２０〜３０℃で通常５〜６０秒間、好ましくは１０〜３０秒間、より好ましくは１０〜２０秒間反応させ、本発明に係る複合体から、細胞外膜小胞又はウイルスを分離させる。
−（２−Ｂ−ｉｉ）：カルシウムイオンを含まない溶液を用いる方法−
（２−Ｂ−ｉｉ）は、複合体形成工程を行い、複合体分離工程を行い、要すれば洗浄操作を行った後、得られた本発明に係る複合体を、カルシウムイオンを含まない溶液と接触させることにより、本発明に係る複合体と結合しているカルシウムイオンの（有効）濃度を低下させる（希釈する）ことによって、本発明に係る複合体から細胞外膜小胞又はウイルスを分離させる方法である。
即ち、本発明に係る複合体に、カルシウムイオンを含まない溶液を接触させることにより、本発明に係る複合体中の本発明に係るＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの結合を保つ為に必要なカルシウムイオンの（有効）濃度を低下させ（希釈し）、本発明に係る複合体から、細胞外膜小胞を分離させることが可能となる。
尚、カルシウムイオンを含まない溶液と本発明に係る複合体との接触は、例えば、当該溶液に当該複合体を懸濁させる方法（担体がビーズである場合等）、当該溶液に当該複合体を浸漬させる方法（担体がディスク状片、チューブである場合等）、当該溶液を当該複合体（担体）に添加する方法（担体がマイクロプレート、チューブである場合等）等により行うことができる。
−カルシウムイオンを含まない溶液−
（２−Ｂ−ｉｉ）において、得られた本発明に係る複合体に添加するカルシウムイオンを含まない溶液としては、細胞外膜小胞又はウイルスを変性させない溶液であればよく、例えば、精製水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液としては、通常ｐＨが７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＰＢＳ、ＴＢＳ、ＨＢＳ等）が好ましい。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常５〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲から適宜選択され、ＮａＣｌ濃度は通常１００〜２００ｍＭ、好ましくは１４０〜１６０ｍＭの範囲から適宜選択される。カルシウムイオンを含まない溶媒は、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、防腐剤、蛋白質等を含んでいてもよい。
（２−Ｂ−ｉｉ）において、得られた本発明に係る複合体に添加するカルシウムイオンを含まない溶液の量としては、カルシウムイオンの濃度を有効濃度未満にできる量であればよい。
−（２−Ｂ−ｉｉ）の具体例−
複合体形成工程、複合体分離工程を行い、要すれば洗浄操作を行った後、得られた本発明に係る複合体に、カルシウムイオンを含まない溶液を、本発明に係る複合体を含む溶液中のカルシウムイオンの濃度を通常０．５ｍＭ未満、好ましくは０．１ｍＭ未満、より好ましくは０．０１ｍＭ未満となるように添加することにより行われる。
尚、複合体形成工程、複合体分離工程を行い、要すれば洗浄操作を行った後、得られた本発明に係る複合体がカルシウムイオンを含有する溶液中（例えば、複合体形成工程を行った後の反応液、カルシウムイオン含有洗浄液）に存在する場合は、最終的なカルシウムイオンの濃度が上記した有効濃度未満となるように、当該カルシウムイオンを含有する溶液を、カルシウムイオンを含まない溶液に置換又は／及びカルシウムイオンを含まない溶液により希釈すればよい。
取得工程により得られた細胞外膜小胞を含有する溶液の（体積増加）量が、（２−Ｂ−ｉｉ）の方が（２−Ｂ−ｉ）よりも多いことから、（２−Ｂ−ｉ）の方が好ましい。
前記において、複合体と接触・作用させた溶液（タンパク質変性剤含有溶液、カルシウムイオンキレート剤含有溶液、カルシウムイオンを含まない溶液）中には、担体と、担体（複合体）から分離（遊離）した細胞外膜小胞又はウイルスが含有していることとなる。従って、当該溶液から担体を除去し、溶液だけを回収すれば、細胞外膜小胞又はウイルスを含有する溶液を得ることが出来る。
本発明のＴｉｍ担体を用いれば、試料から細胞外膜小胞又はウイルスを効率よく除去でき、夾雑物の少ない試料を得ることができる。
本発明の除去方法は、超遠心分離法やポリマー沈殿処理等の従来法では除去しきれない試料中の細胞外膜小胞又はウイルスを精度よく効率的に除去することが出来る。
＜７．試料中の細胞外膜小胞又はウイルスの除去方法＞
本発明の細胞外膜小胞又はウイルスを取得する方法（以下、「本発明の除去方法」と略記する場合がある）は、以下の工程を含むことを特徴とする。
（１）カルシウムイオン存在下、担体に結合したＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体を形成させる工程（以下、「複合体形成工程」と略記する場合がある）
（２）当該複合体と試料とを分離する工程（以下、「複合体分離工程」と略記する場合がある）。
＜７−１．複合体形成工程＞
本発明の除去方法における複合体形成工程は、本発明の取得方法における複合体形成工程と同じであり、各種の好ましい条件も同じである。
＜７−２．複合体分離工程＞
本発明の除去方法における複合体分離工程は、複合体形成工程を行った後、得られた本発明に係る担体に結合したＴｉｍタンパク質（本発明のＴｉｍ担体）と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体（本発明に係る複合体）と試料とを分離し、分離された試料を取得する工程である。
これにより、細胞外膜小胞又はウイルスが除去された試料を得ることができる。
本発明の除去方法における複合体分離工程は、本発明に係る複合体を試料から除去することができればどのような方法であってもよく、前記本発明の取得方法における複合体分離工程と同じ方法が挙げられる。このようにして本発明の複合体と試料とを分離した後、分離された試料を自体公知の方法により取得（回収）すればよい。
これにより、超遠心分離法やポリマー沈殿処理等の従来法では除去しきれない試料中の細胞外膜小胞又はウイルスを精度よく効率的に除去することが出来る。
また、前記の複合体形成工程及び複合体分離工程を複数回繰り返し行うことにより、試料からの細胞外膜小胞又はウイルスの除去をより効率的に行うことができる。前記の複合体形成工程及び複合体分離工程を繰り返し行う際には、新たな担体を用いても使用済みの担体を再利用することもできる。担体の再利用は、本発明の除去方法における複合体分離工程で除去した本発明に係る複合体を、カルシウムイオンキレート剤含有溶液又はカルシウムイオンを含まない溶液を用いて本発明の取得方法の取得工程（（２−Ｂ）カルシウムイオン濃度を低下させる方法）と同様の処理に付せばよい。これにより、本発明に係る複合体から本発明のＴｉｍ担体と細胞外膜小胞又はウイルスとを分離させることができる。即ち、本発明のＴｉｍ担体は、再度本発明の除去方法に用いることができるため、当該本発明のＴｉｍ担体を再利用することで試料中の細胞外膜小胞又はウイルスの除去を精度よく効率的に行うことができる。
本発明のＴｉｍ担体を用いれば、試料中の細胞外膜小胞又はウイルスを精度よく高感度で検出することができる。
＜８．試料中の細胞外膜小胞又はウイルスを検出する方法＞
本発明の細胞外膜小胞又はウイルスを検出する方法（以下、「本発明の検出方法」と略記する場合がある）は、以下の工程を含むことを特徴とする。
（１）カルシウムイオン存在下、担体に結合したＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体を形成させる工程（複合体形成工程）
（２）当該複合体を検出する工程（検出工程）
＜８−１．複合体形成工程＞
本発明の検出方法における複合体形成工程は、カルシウムイオン存在下、本発明のＴｉｍ担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体を形成させる工程である。
−本発明に係る試料−
本発明に係る試料は、本発明の取得方法における試料と同様である。
−カルシウムイオン濃度・カルシウムイオンの由来−
本発明の検出方法において、カルシウムイオンは本発明に係るＴｉｍ担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体（本発明に係る複合体）を形成させる際に存在させる。
本発明の検出方法において、本発明に係るＴｉｍ担体と本発明に係る試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させる際のカルシウムイオン濃度は、通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ、より好ましくは２〜５ｍＭである。尚、本発明に係るＴｉｍ担体と本発明に係る試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体が形成され、検出工程を実施するまで、即ち当該複合体を検出する工程に付すまでの当該複合体を含有する溶液中には、前記した如き濃度のカルシウムイオンが必要であることは言うまでもない。
また、カルシウムイオンの由来は特に限定されず、本発明の取得方法におけるカルシウムイオンの由来と同様の具体例が挙げられる。
尚、本発明のＴｉｍ担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させる際にカルシウムイオンを存在させる方法としては、一般的には、本発明のＴｉｍ担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させる際のカルシウムイオン濃度が上記した範囲となるように、試料に前記した如きカルシウムイオンを含有させればよい。
カルシウムイオンを含有させる溶液としては、前記の本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを含有（溶解又は懸濁）させる溶液と同様であり、具体例等も同様である。
−試料の量−
本発明の検出方法の複合体形成工程において試料の量としては、本発明に係る担体としてビーズを用いる場合、本発明のＴｉｍ担体１ｍｇ当たり通常０．１〜１０００ｍｌ、好ましくは０．１〜５００ｍｌ、より好ましくは０．１〜１００ｍｌ、本発明に係る担体としてマイクロプレートを用いる場合、１ウェルあたり通常５０μＬ〜３００μＬ、好ましくは１００μＬ〜２００μＬである。
−温度−
本発明の検出方法の複合体形成工程において、本発明のＴｉｍ担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとを接触させる際の温度としては、通常２〜３７℃、好ましくは２〜３０℃である。
−時間−
本発明の検出方法の複合体形成工程において、本発明に係るＴｉｍタンパク質と試料との接触時間としては、通常０．５〜２４時間、好ましくは１〜２０時間、より好ましくは１〜１２時間である。
−Ｔｉｍタンパク質−
本発明の検出方法における本発明に係るＴｉｍタンパク質としては、前記の本発明に係るＴｉｍタンパク質であればいずれでも用いることができるが、本発明に係るＴｉｍ４タンパク質が特に好ましい。
−Ｔｉｍ担体−
本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明に係る担体との結合様式としては、本発明に係る担体と本発明に係るＴｉｍタンパク質とが結合していれば結合様式は問わないが、高感度に細胞外膜小胞又はウイルスを検出可能であることから本発明に係る担体が本発明に係るＴｉｍタンパク質のＳＨ基に結合したものが好ましく、本発明に係る担体が本発明に係るＴｉｍ４タンパク質のＳＨ基に結合したものが特に好ましい。
−本発明の検出方法における複合体形成工程の具体例−
本発明の検出方法における複合体形成工程は、例えば以下の方法で行えばよい。
即ち、本発明に係る担体としてビーズを用いる場合、本発明のＴｉｍ担体を、本発明のＴｉｍ担体と試料とカルシウムイオンを含有する溶液とを混合後の溶液（本発明に係る複合体を形成させる際の溶液）１ｍＬ当たり通常０．００１〜２０ｍｇ、好ましくは０．００５〜１０ｍｇ、より好ましくは０．０１〜６．０ｍｇと、本発明に係る複合体を形成させる際の溶液中のカルシウムイオン濃度が通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは１．０〜１０ｍＭ、より好ましくは２．０〜５．０ｍＭとなる量のカルシウムイオンを含有する溶液と、本発明のＴｉｍ担体１ｍｇ当たり通常０．１〜１０００ｍｌ、好ましくは０．１〜５００ｍｌ、より好ましくは０．１〜１００ｍｌの試料とを、通常２〜３７℃、好ましくは２〜３０℃、通常０．５〜２４時間、好ましくは１〜２０時間、より好ましくは１〜１２時間接触させて、本発明に係る担体に結合したＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体を形成させる。
本発明に係る担体としてマイクロプレートを用いる場合、Ｔｉｍタンパク質を固定化したマイクロプレートの各ウェル（本発明のＴｉｍ担体）に、本発明に係る複合体を形成させる際の溶液中のカルシウムイオン濃度が通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは１．０〜１０ｍＭ、より好ましくは２．０〜５．０ｍＭとなる量のカルシウムイオンを含有する溶液と、本発明に係る試料を１ウェルあたり通常５０μＬ〜３００μＬ、好ましくは１００μＬ〜２００μＬ添加し、通常２℃〜３７℃、好ましくは２℃〜３０℃で通常０．５時間〜２４時間、好ましくは１時間〜２０時間、より好ましくは１〜１２時間反応させることにより、本発明のＴｉｍ担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体（本発明に係る複合体）を形成させる。
＜８−２．本発明の検出方法における検出工程＞
本発明の検出方法における検出工程は、複合体形成工程を行った後、要すれば試料の複合体分離工程を行い、要すればさらに洗浄操作を行った後、本発明のＴｉｍ担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体（本発明に係る複合体）を検出する工程である。
−複合体分離工程−
本発明の検出方法における複合体分離工程は、複合体形成工程の後、要すれば、得られた本発明に係る担体に結合したＴｉｍタンパク質（本発明のＴｉｍ担体）と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体（本発明に係る複合体）から試料を除去する工程である。
本発明の検出方法における複合体分離工程は、本発明に係る複合体と試料とを分離する、言い換えればいわゆるＢ／Ｆ分離することができればどのような方法であってもよく、この分野で用いられるＢ／Ｆ分離法が使用できる。このような方法としては、本発明の取得方法における複合体分離工程と同じである。
−複合体分離工程の具体例−
本発明の検出方法における複合体分離工程は、この分野における常法に従えばよいが、本発明に係る担体として磁気ビーズを用いる場合、例えば複合体形成工程をおこなった容器を要すればマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁に本発明に係る複合体を集合させ、上清の試料を除く。
本発明に係る担体としてマイクロプレートを用いる場合、例えば複合体形成工程をおこなったマイクロプレートから、要すればマイクロピペット又はプレートウォッシャーを用いて試料を除く。
＜８−３．洗浄操作＞
複合体形成工程の後、要すれば複合体分離工程を行い、要すれば、さらに得られた本発明に係る複合体を、カルシウムイオン含有洗浄溶液を用いて洗浄してもよい（以下、「洗浄操作」と略記する場合がある）。洗浄操作により、本発明に係る担体表面に付着した細胞由来成分等の本発明に係る試料中の夾雑物を除去することができる。洗浄方法等の各種条件は、本発明の取得方法における洗浄操作と同様である。
−洗浄操作の具体例−
本発明に係る担体として磁気ビーズを用い１．５ｍＬ容チューブで行う場合、まず、複合体分離工程により得られた本発明に係る複合体を含む容器内にカルシウムイオン含有洗浄溶液（例えば、カルシウムイオンを通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは通常１〜１０ｍＭ、より好ましくは通常２〜５ｍＭ含有する、ｐＨ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有するカルシウムを沈殿させない緩衝液。但し、リン酸バッファーはカルシウムと結合して沈殿することから好ましくない。）を通常１００μＬ〜１５００μＬ、好ましくは２００μＬ〜１０００μＬ添加し、攪拌する。その後、前記容器を、マグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁に当該複合体を集合させ、前記容器内の溶液を捨てる。これらの洗浄操作は、必要に応じて数回繰り返し行ってもよい。
本発明に係る担体としてマイクロプレートを用いる場合、まず、複合体分離工程により得られた本発明に係る複合体を含むウェルにカルシウムイオン含有洗浄溶液（例えば、カルシウムイオンを通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは通常１〜１０ｍＭ、より好ましくは通常２．０〜５．０ｍＭ含有する、ｐＨ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有するカルシウムを沈殿させない緩衝液。但し、リン酸バッファーはカルシウムと結合して沈殿することから好ましくない。）を通常１００μＬ〜３００μＬ、好ましくは２００μＬ〜３００μＬ添加し加え、次いで加えた洗浄液を除去する。これらの洗浄操作は、必要に応じて複数回繰り返し行ってもよい。
＜８−４．検出工程＞
本発明の検出方法における検出工程は、本発明に係る複合体の有無及び／又は量を検出可能な方法であればいずれでもよく、自体公知の免疫学的測定に用いられる方法はいずれも利用できる。
本発明の検出工程は、上記した如き方法により調製された本発明のＴｉｍ担体を用いる以外は特に限定されない。このような免疫学的測定法としては、例えば、逆受身凝集反応法（東京化学同人 続生化学実験講座５ 免疫生化学研究法 ｐ．３６−３７、金原出版株式会社 臨床検査法提要 第３０版 ｐ．８４４−８４５等）等の凝集反応を利用した測定法、例えば、比ろう法（金原出版株式会社 臨床検査法提要 第３０版 ｐ．８５１−８５３等）、免疫比濁法（金原出版株式会社 臨床検査法提要 第３０版 ｐ．８５３−８５４等）等の凝集反応を応用した光学的測定法、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）（東京化学同人 続生化学実験講座５ 免疫生化学研究法 ｐ．５７−６１、金原出版株式会社臨床検査法提要 第３０版 ｐ．８５６−８６２等）、イムノラジオメトリックアッセイ法（ＩＲＭＡ）（金原出版株式会社 臨床検査法提要 第３０版 ｐ．８５６−８６２等）、エンザイムイムノアッセイ法（ＥＩＡ）（東京１０化学同人 続生化学実験講座５免疫生化学研究法 ｐ．６２−６５、金原出版株式会社 臨床検査法提要 第３０版 ｐ．８６２−８６５、特開昭５６−１０６１５４号公報、特開昭５８−２３７９６号公報等）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（金原出版株式会社 臨床検査法提要 第３０版 ｐ．１１４５−１１４９等）、蛍光・発光免疫測定法（金原出版株式会社 臨床検査法提要 第３０版 ｐ．８６５−８６７等）、フローサイトメトリー法等の自体公知の免疫学的測定方法は全て挙げられ、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）又はフローサイトメトリー法が好ましい。
本発明の検出工程を固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）又はフローサイトメトリー法により行う場合、本発明に係る複合体を検出対象とする限りにおいて、自体公知の方法に従って行えばよい。例えば、細胞外膜小胞又はウイルスに対して結合する抗細胞外膜小胞抗体、抗ウイルス抗体等の標識物を用いて１次抗体を標識した標識１次抗体、又は当該１次抗体と当該１次抗体に対して結合する標識２次抗体を用いる方法が挙げられる。当該標識１次抗体及び標識２次抗体としては、ＥＬＩＳＡ法又はフローサイトメトリー法の標識抗体に用いられるものであればいずれでもよく、例えばＣｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ローダミン、ＰＥ等の蛍光物質で標識した蛍光標識抗体、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した酵素標識抗体、磁気ビーズ標識抗体、赤外標識抗体等が挙げられる。これらの標識抗体に係る蛍光等は、当該標識抗体の標識方法（標識物）に対応する自体公知の方法により測定すればよい。
−標識抗体の希釈液−
本発明の検出方法において、本発明に係る複合体と反応させる標識１次抗体、又は１次抗体及び標識２次抗体の希釈液としては、カルシウムイオンを含有する以外は、Ｔｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体と当該抗体との結合を妨げないものであればよく、例えば水、ｐＨ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＴＢＳ、ＨＢＳ等）等が挙げられる。尚、リン酸バッファーはカルシウムと結合して沈殿が生じるので好ましくない。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常５〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲から適宜選択され、ＮａＣｌ濃度は通常１００〜２００ｍＭ、好ましくは１４０〜１６０ｍＭの範囲から適宜選択される。この溶液中には、本発明に係るＴｉｍ担体と試料中の細胞外膜小胞又はウイルスとの複合体の結合を妨げない量であれば、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤、蛋白質等が含まれていても良い。界面活性剤としては、例えばＴｗｅｅｎ２０等が挙げられ、当該本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスを含有させる溶液における界面活性剤の濃度は、通常０．００００１〜０．２％、好ましくは通常０．０００５〜０．１％である。また当該希釈液のカルシウムイオン含有濃度は通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは通常１〜１０ｍＭ、より好ましくは通常２〜５ｍＭである。
本発明の検出方法において、本発明に係る複合体と反応させる標識１次抗体、又は１次抗体及び標識２次抗体の希釈倍率は、抗体の活性や濃度によって異なるが、通常１０倍〜１００００００倍、好ましくは１０００倍〜１０００００倍である。
本発明の検出方法において、本発明に係る複合体と反応させる標識１次抗体、又は１次抗体及び標識２次抗体溶液の希釈溶液の量は、本発明に係る担体がビーズの場合、本発明に係る担体１ｍｇに対し通常０．１ｍＬ〜１０００ｍＬ、好ましくは０．１ｍＬ〜５００ｍＬ、より好ましくは０．１ｍＬ〜１００ｍＬで、本発明に係る担体がマイクロプレートの場合、１ウェルに、通常５０μＬ〜３００μＬ、好ましくは５０μＬ〜２００μＬ、より好ましくは５０μＬ〜１００μＬである。
−反応（接触）温度−
本発明の検出方法において、本発明に係る複合体と標識１次抗体、又は１次抗体及び標識２次抗体の反応温度は、通常２〜３７℃、好ましくは１１〜３３７℃、より好ましくは２０〜３０℃である。
−反応（接触）時間−
本発明の検出方法において、本発明に係る複合体と標識１次抗体、又は１次抗体及び標識２次抗体の反応時間は、通常０．５〜１２時間、好ましくは１〜４時間、より好ましくは１〜２時間である。
本発明の検出方法における検出工程の検出操作において、標識１次抗体を用いる場合、本発明に係る複合体と標識１次抗体を反応させた後、洗浄操作により、未反応の標識１次抗体を除去することができる。また、１次抗体と標識２次抗体を用いる場合、本発明に係る複合体と１次抗体を反応させた後や本発明に係る複合体と１次抗体の複合体と標識２次抗体を反応させた後に、洗浄操作により、未反応の１次抗体及び標識２次抗体を除去することができる。洗浄方法としては、上記した如きカルシウムイオン含有洗浄液を使用する以外は、通常この分野で行われている洗浄方法が使用できる。当該洗浄操作において用いられるカルシウムイオン含有洗浄溶液としては、カルシウムイオンを通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは通常１〜１０ｍＭ、より好ましくは通常２〜５ｍＭ含有し、当該複合体における本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスと本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明の担体との結合に影響を与えない溶液であればいずれでもよく、例えば、カルシウムイオンを通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは通常１〜１０ｍＭ、より好ましくは通常２〜５ｍＭ含有する、ｐＨ ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有するカルシウムを沈殿させない緩衝液（例えばＴＢＳ、ＨＢＳ）が挙げられる。尚、リン酸バッファーはカルシウムと結合して沈殿が生じるので好ましくない。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常５〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲から適宜選択され、ＮａＣｌ濃度は通常１００〜２００ｍＭ、好ましくは１４０〜１６０ｍＭの範囲から適宜選択される。この溶液中には、当該複合体における本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスと本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明の担体との結合を妨げない量であれば、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤、蛋白質等が含まれていても良い。界面活性剤としては、例えばｔｗｅｅｎ ２０（和光純薬工業（株）製）等が挙げられ、当該洗浄溶液における界面活性剤の濃度は、通常０．００００１〜０．２％、好ましくは通常０．０００５〜０．１％である。本発明に係る担体がビーズの場合、本発明に係る担体１ｍｇに対し、通常０．１ｍＬ〜１０００ｍＬ、好ましくは０．１ｍＬ〜５００ｍＬ、より好ましくは０．１ｍＬ〜１００ｍＬで、本発明に係る担体がマイクロプレートの場合、１ウェルに使用する洗浄液の量は通常１００μＬ〜３００μＬ、好ましくは２００μＬ〜３００μＬで、添加した後に洗浄液を除去する。これらの洗浄操作は、必要に応じて複数回繰り返し行ってもよい。
−検出−
本発明の検出方法における検出工程が発色検出の場合、標識１次抗体又は標識２次抗体の標識物としてはペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等が挙げられる。これらの標識物は各標識物に応じた自体公知の方法に従って検出を行えばよい。
発色検出における発色用基質液としては、通常この分野において用いられる発色用基質液であればいずれでもよく、例えば標識物としてペルオキシダーゼを用いる場合、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）溶液又はＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン）溶液が挙げられ、好ましくはＴＭＢ溶液が挙げられる。
発色検出における発色用基質の量としては、本発明に係る担体がビーズの場合、本発明に係る担体１ｍｇに対し通常０．１ｍＬ〜１０００ｍＬ、好ましくは０．１ｍＬ〜５００ｍＬ、より好ましくは０．１ｍＬ〜１００ｍＬで、本発明に係る担体がマイクロプレートの場合、１ウェルに、通常５０μＬ〜３００μＬ、好ましくは５０μＬ〜２００μＬ、より好ましくは５０μＬ〜１００μＬである。
本発明の検出方法における検出工程が発色検出の場合、発色用基質液との反応時間は通常５分間〜６０分間、好ましくは１０分間〜４０分間である。
本発明の検出方法における検出工程が発色検出の場合、発色用基質液との反応温度は通常２℃〜３７℃、好ましくは２０℃〜３０℃である。
本発明の検出方法における検出工程が発色検出の場合、発色反応を停止させるため反応停止液として、通常、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸又は１ｍｏｌ／Ｌ硫酸などの強酸を、発色基質液と等量加え、発色反応を停止させる。
本発明の検出方法における検出工程が蛍光検出で、標識１次抗体又は標識２次抗体の標識体に蛍光物質を用いた場合、本発明に係る複合体と標識１次抗体との複合体、又は本発明に係る複合体と１次抗体及び標識２次抗体との複合体に蛍光測定液を添加して、蛍光を測定する。蛍光測定液はカルシウムイオン含有蛍光測定液を使用する以外は、通常この分野で用いることができる蛍光測定液（以下、「測定液」と略記する場合がある）が使用できる。当該蛍光測定液において用いられるカルシウムイオン含有測定液としては、カルシウムイオンを通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは通常１〜１０ｍＭ、より好ましくは通常２〜５ｍＭ含有し、当該複合体における本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスと本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明の担体との結合に影響を与えない溶液であればいずれでもよく、例えば、カルシウムイオンを通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは通常１〜１０ｍＭ、より好ましくは通常２〜５ｍＭ含有する、ｐＨ ７．０〜８．０、好ましくは７．２〜７．６に緩衝作用を有するカルシウムを沈殿させない緩衝液（例えばＴＢＳ、ＨＢＳ）が挙げられる。尚、リン酸バッファーはカルシウムと結合して沈殿が生じるので好ましくない。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常５〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲から適宜選択され、ＮａＣｌ濃度は通常１００〜２００ｍＭ、好ましくは１４０〜１６０ｍＭの範囲から適宜選択される。この溶液中には、当該複合体における本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスと本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明の担体との結合を妨げない量であれば、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤、ＢＳＡ等の蛋白質等が含まれていても良い。界面活性剤としては、例えばｔｗｅｅｎ ２０（和光純薬工業（株）製）等が挙げられ、当該洗浄溶液における界面活性剤の濃度は、通常０．００００１〜０．２％、好ましくは通常０．０００５〜０．１％である。本発明の検出方法に用いる蛍光測定液の量は、本発明の検出法がＥＬＩＳＡ法で、本発明に係る担体がマイクロプレートの場合、１ウェルに使用する測定液の量は通常５０μＬ〜３００μＬ、好ましくは５０μＬ〜２００μＬである。本発明に係る検出法がフローサイトメトリー法で、本発明に係る担体がビーズの場合、本発明に係る担体１ｍｇに対し通常０．１ｍＬ〜１０００ｍＬ、好ましくは０．１ｍＬ〜５００ｍＬ、より好ましくは０．１ｍＬ〜１００ｍＬである。
−本発明の検出方法における検出工程の具体例−
例えば本発明に係る担体としてマイクロプレートを用いてＥＬＩＳＡ法によりおこなう場合、複合体形成工程、要すれば複合体分離工程の後、さらに要すれば洗浄操作を行った後、得られた本発明に係るＴｉｍタンパク質を固定化したマイクロプレートの各ウェルに対して、ペルオキシダーゼ標識した細胞外膜小胞又はウイルスに対する１次抗体又は未標識の１次抗体を通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは通常１〜１０ｍＭ、より好ましくは通常２〜５ｍＭカルシウムイオンを含有する希釈液で通常１０倍〜１００００００倍、好ましくは１０００倍〜１０００００倍希釈した希釈溶液を、１ウェルあたり通常５０μＬ〜３００μＬ、好ましくは５０μＬ〜２００μＬ、より好ましくは５０μＬ〜１００μＬ添加し、通常２〜３７℃、好ましくは１１〜３７℃で０．５〜１２時間、好ましくは１〜４時間反応させ、次いで、カルシウムイオンを含有する洗浄用バッファー（カルシウムイオンを通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは通常１〜１０ｍＭ、より好ましくは通常２〜５ｍＭ含有し、当該複合体における本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスと本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明の担体との結合に影響を与えない溶液）を用いて各ウェルを洗浄する。未標識の１次抗体を使用する場合は、さらにペルオキシダーゼ標識した２次抗体を１次抗体と同様の方法で反応させた後、カルシウムイオンを含有する洗浄用バッファー（カルシウムイオンを通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは通常１〜１０ｍＭ、より好ましくは通常２〜５ｍＭ含有し、当該複合体における本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスと本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明の担体との結合に影響を与えない溶液）を通常１００μＬ〜３００μＬ、好ましくは２００μＬ〜３００μＬで用いて各ウェルを洗浄する。次いで、ＴＭＢ溶液又はＯＰＤ溶液などの発色用基質液を１ウェル当たり通常５０μＬ〜３００μＬ、好ましくは５０μＬ〜２００μＬ、より好ましくは５０μＬ〜１００μＬ各ウェルに添加し、通常２℃〜３７℃、好ましくは２０℃〜３０℃で５分間〜６０分間、好ましくは１０分間〜４０分間反応させる。その後、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸又は１ｍｏｌ／Ｌ硫酸などの反応停止液を発色基質液と等量加え、発色反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定する。
例えば本発明に係る担体としてビーズを用いてフローサイトメトリー法によりおこなう場合、複合体形成工程、要すれば複合体分離工程の後、さらに要すれば洗浄操作を行った後、得られた本発明に係るＴｉｍタンパク質を固定化したビーズに対して、蛍光標識した１次抗体又は未標識の１次抗体を通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは通常１〜１０ｍＭ、より好ましくは通常２〜５ｍＭカルシウムイオンを含有する希釈液で通常１０倍〜１００００００倍、好ましくは１０００倍〜１０００００倍希釈した希釈溶液を、本発明に係る担体１ｍｇに対し通常０．１ｍＬ〜１０００ｍＬ、好ましくは０．１ｍＬ〜５００ｍＬ、より好ましくは０．１ｍＬ〜１００ｍＬ添加し、通常２〜３７℃、好ましくは１１〜３７℃で０．５〜１２時間、好ましくは１〜４時間反応させ、次いで、カルシウムイオンを含有する洗浄用バッファー（カルシウムイオンを通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは通常１〜１０ｍＭ、より好ましくは通常２〜５ｍＭ含有し、当該複合体における本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスと本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明の担体との結合に影響を与えない溶液）を用いてビーズを洗浄する。未標識の１次抗体を使用した場合は、さらに蛍光標識した２次抗体を１次抗体と同様の方法で反応させた後、カルシウムイオンを含有する洗浄用バッファー（カルシウムイオンを通常０．５〜１００ｍＭ、好ましくは通常１〜１０ｍＭ、より好ましくは通常２〜５ｍＭ含有し、当該複合体における本発明に係る細胞外膜小胞又はウイルスと本発明に係るＴｉｍタンパク質と本発明の担体との結合に影響を与えない溶液）を用いてビーズを洗浄する。次いで、本発明に係る担体１ｍｇに対し通常０．１ｍＬ〜１０００ｍＬ、好ましくは０．１ｍＬ〜５００ｍＬ、より好ましくは０．１ｍＬ〜１００ｍＬの蛍光測定液を加えてビーズを懸濁した後、フローサイトメーターで蛍光強度を測定する。
抗体の抗原に対する親和性は一般に１０ｎＭ〜１００ｐＭレベルのＫｄといわれている。一方、Ｔｉｍ４タンパク質とホスファチジルセリンとの結合力はＫｄ＝約２ｎＭ（Ｎａｔｕｒｅ （Ｉｍｐａｃｔ Ｆａｃｔｏｒ： ４１．４６）． １２／２００７； ４５０（７１６８）：４３５−９． ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０６３０７）と報告されている。細胞外膜小胞またはウィルスエンベロープ膜の表面抗原に対する抗体とその表面抗原の親和性は、細胞外膜小胞またはウィルスエンベロープ膜表面のホスファチジルセリンと本発明のＴｉｍタンパク質間の親和性と同程度であるにも関わらず、抗体を用いて細胞外膜小胞またはウィルスの検出等を行う従来法に比べて、本発明に係るＴｉｍタンパク質を用いて細胞外膜小胞またはウィルスの検出等を行う本発明の検出方法が高感度であることは意外なことであった。
本発明の方法により得られた細胞外膜小胞又はウイルスは、その粒子表面や内部に有するタンパク質やｍｉｃｒｏＲＮＡ等の核酸を解析することに用いることや、細胞外膜小胞又はウイルスの機能解析等の基礎研究に用いることができる。また、診断薬や医薬品やワクチンなどに利用することもできる。
＜９．本発明の細胞外膜小胞又はウイルスの捕捉用キット＞
本発明の細胞外膜小胞又はウイルスの捕捉用キットは、
１．本発明に係るＴｉｍタンパク質を含んでなる試薬及び本発明に係る担体を含んでなる試薬、又は、２．本発明のＴｉｍ担体を含んでなる試薬、を構成要素として含んでなる。
これらのキットは、更に、前記カルシウムイオン含有洗浄溶液、タンパク質変性剤含有溶液、及びカルシウムイオンキレート剤含有溶液から選ばれる少なくとも１種を含んでいてもよい。各々の構成要素の具体例、好ましい態様等については、前記した通りである。
また、これらキットに含まれる試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、増感剤、界面活性剤、防腐剤（例えばアジ化ナトリウム、サリチル酸、安息香酸等）、安定化剤（例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、界面活性剤、糖類等）、賦活剤、共存物質の影響回避剤、その他この分野で用いられているものであって、共存する試薬との安定性を阻害したり、本発明に係るＴｉｍタンパク質と担体、本発明に係る担体に結合した本発明に係るＴｉｍタンパク質と試料中の細胞外膜小胞との反応又は結合を阻害したりしないものを有していてもよい。またこれら試薬類等の濃度範囲等も、各々の試薬類が有する効果を発揮するために通常用いられる濃度範囲等を適宜選択して用いればよい。
さらにまた、本発明のキットには、本発明の取得方法、本発明の除去方法、本発明の検出方法の説明書等を含ませておいても良い。当該「説明書」とは、当該方法における特徴・原理・操作手順、判定手順等が文章又は図表等により実質的に記載されている当該キットの取扱説明書、添付文書、あるいはパンフレット（リーフレット）等を意味する。
以下に、実験例、実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
なお、本発明に係るＴｉｍタンパク質とＴ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子２（Ｔｉｍ２）タンパク質（以下、「Ｔｉｍ２タンパク質」と略記する場合がある）とを併せて、「Ｔｉｍファミリータンパク質」と略記する場合がある。
実験例１．Ｆｃタグ融合型Ｔｉｍ４タンパク質の調製
以下の方法により、Ｆｃタグ融合型Ｔｉｍ４タンパク質を調製した。
＜（１）ベクターの構築・培養＞
先ず、Ｍｉｙａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ２００７， Ｖｏｌ． ４５０：１５に記載の方法に従い、マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のＮ末端１〜２７３アミノ酸領域をコードするｃＤＮＡ（配列番号２６）が、ｐＥＦ−ＦｃベクターのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＶサイトに組み込まれた、Ｆｃタグ融合型Ｔｉｍ４タンパク質発現用ベクター（以下、「ｐＥＦ−Ｔｉｍ４−Ｆｃ」と略記する場合がある）を構築した。
一方、２９３Ｔ細胞（理研ＢＲＣ）を、１５０ｍｍ細胞培養用ディッシュ２５枚で１０％ＦＢＳ（バイオウェスト社製）含有ＤＭＥＭ（ナカライテスク（株）製）２０ｍＬを用いてそれぞれ１日間培養した。その後、それぞれのディッシュについて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ２５ｍＬを、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ２５ｍＬに置換した。
その後、常法に従い、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ “ＭＡＸ”（ポリサイエンス社製）を用いて、ｐＥＦ−Ｔｉｍ４−Ｆｃ ２０μｇを２９３Ｔ細胞へそれぞれ遺伝子導入した。遺伝子導入後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で遺伝子導入した２９３Ｔ細胞をそれぞれ４日間培養した。
＜（２）精製＞
得られた遺伝子導入した２９３Ｔ細胞の培養液を、それぞれ遠心分離処理し（８００×ｇ、５分間）、培養上清をそれぞれ回収し、プールした。得られた培養上清を、Ｒａｐｉｄ Ｆｌｏｗ ０．２μｍフィルターユニット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いてろ過処理をすることで、不純物を分離し、培養上清濾過液を得た。
次いで、ＰＢＳ２０ｍＬで洗浄したｎＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアジャパン社製、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡはＦｃタグに親和性を有する）７００μＬを充填したポリプレップカラム（バイオラッド社製）に、得られた培養上清濾過液５００ｍＬを添加し、培養上清濾過液中のＦｃタグ融合型Ｔｉｍ４タンパク質をｎＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗへ結合させた。そして、当該ｎＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを、２０ｍＬのＰＢＳで洗浄した。その後、０．１Ｍ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）６００μＬをそれぞれ用いて、中和溶液である１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１００μＬ中に５回溶出し、６００μＬずつの５つの溶出画分を得た。
得られた５つの溶出画分について、それぞれ２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、タンパク質の有無を判断した。タンパク質が含まれる画分を一つに混合後、アミコンウルトラ−０．５ ｍＬ １０Ｋ遠心式フィルターカラム（ミリポア社製）を用いて限外濾過により濃縮後、同カラムを用いて溶媒をＰＢＳ４０μＬに置換した。そして、ＰＢＳへ置換した溶出液中のタンパク量をＢＣＡ法により定量後、ＰＢＳを用いてタンパク質の濃度を８８μｇ／ｍＬに調整し、Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質（「Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質」と略記する場合がある）を含有するＰＢＳ溶液（「Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液」と略記する場合がある）を得た。
実験例２．ＦＬＡＧタグ融合型Ｔｉｍ４タンパク質の調製
以下の方法により、ＦＬＡＧタグ融合型Ｔｉｍ４タンパク質を調製した。
＜（１）ベクターの構築・培養＞
先ず、ＦＬＡＧタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４ ｃＤＮＡ（マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のＮ末端１〜２７３アミノ酸領域のＣ末端に１×ＦＬＡＧを融合したアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ、配列番号３３（末端に終止コドン（ｔａａ）及び１×ＦＬＡＧをコードする塩基配列を含む、但し制限酵素サイトは含まない）、ファスマック社製）を、常法に従って、ｐＣＡＧ−Ｎｅｏベクター（和光純薬工業（株）製）のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩサイトに組み込み、ＦＬＡＧタグ融合型Ｔｉｍ４タンパク質発現用ベクター（以下、「ｐＣＡＧ−Ｔｉｍ４−ＦＬＡＧ」と略記する場合がある）を構築した。
一方、２９３Ｔ細胞（理研ＢＲＣ）を、２２５ｃｍ２フラスコで１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒａ社製）含有ＤＭＥＭ（和光純薬工業（株）製）５０ｍＬを用いて、遺伝子導入時に細胞が７０−９０％コンフルエントになるように播種し、１日間培養した。その後、常法に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、ｐＣＡＧ−Ｔｉｍ４−ＦＬＡＧ ６０μｇを、１日間培養した２９３Ｔ細胞へ遺伝子導入した。遺伝子導入後、３７℃、５％ＣＯ２条件下、遺伝子導入した２９３Ｔ細胞を１日間培養した。その後、培養液を全量取り除き、遺伝子導入した２９３Ｔ細胞をＰＢＳ１０ｍＬで２回洗浄し、培養液をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）５０ｍＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３日間培養した。
＜（２）精製＞
３日間培養後の遺伝子導入した２９３Ｔ細胞の培養液を、遠心分離処理し（３００×ｇ、５分間）、培養上清を回収した。回収した培養上清を、さらに３回遠心分離処理（１回目：３００×ｇ、３分間、２回目：１２００×ｇ、２０分間、３回目：１００００×ｇ、２０分間）し、不純物を分離した上清を得た。得られた上清を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（分画分子量３００００、ＧＥ社製）を用いて限外濾過をして１０倍に濃縮し、培養上清濃縮液を得た。ＰＢＳで洗浄したＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌ（シグマ社製）５００μＬ（培養上清濃縮液の１／１０量）を、得られた培養上清濃縮液５ｍＬに加えて３時間転倒混和し、培養上清濃縮液中のＦＬＡＧタグ融合型Ｔｉｍ４タンパク質とＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌを反応させて、ＦＬＡＧタグ融合型Ｔｉｍ４タンパク質をＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌへ結合させた。次いで、当該ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌをＰＢＳ５μＬで３回洗浄した。
その後、２００μｇ／ｍＬ ＦＬＡＧペプチド溶液（ＤＹＫＤＤＤＤＫペプチド（和光純薬工業（株）製）をＰＢＳで希釈した溶液） ２５０μＬ（使用したＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌの半分量）を、当該ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌに加えて４℃で３０分間転倒混和し、遠心分離処理（４℃、８０００×ｇ、１分間）の後、上清（溶出液）を回収した。回収した上清（溶出液）中のＦＬＡＧペプチドを除去するために、当該上清（溶出液）にＰＢＳ２０ｍＬを加えて限外濾過し、濃縮液を得た。得られた濃縮液に、ＰＢＳを添加して、液量を５００μＬに合わせ、ＦＬＡＧタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質（「ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質」と略記する場合がある）を含有するＰＢＳ溶液（「ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液」と略記する場合がある）（実験例２）を得た。
実験例３．Ｈｉｓタグ融合型Ｔｉｍ４タンパク質の調製
以下の方法により、Ｈｉｓタグ融合型Ｔｉｍ４タンパク質を調製した。
＜（１）ベクターの構築・培養＞
Ｈｉｓタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４ ｃＤＮＡ（マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のＮ末端１〜２７３アミノ酸領域のＣ末端に６×Ｈｉｓタグを融合したアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ、配列番号３４（末端に終止コドン（ｔｇａ）及び６×ＨｉｓタグをコードするｃＤＮＡを含む））を常法に従って、ｐＣＡＧ−Ｎｅｏベクター（和光純薬工業（株）製）のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩサイトに組み込み、Ｈｉｓタグ融合型Ｔｉｍ４タンパク質発現用ベクター（以下、「ｐＣＡＧ−Ｔｉｍ４−Ｈｉｓ」と略記する場合がある）を構築した。
一方、２９３Ｔ細胞（理研ＢＲＣ）を、２２５ｃｍ２フラスコで１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒａ社製）含有ＤＭＥＭ（和光純薬工業（株）製）５０ｍＬを用いて１日間培養した。その後、常法に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、ｐＣＡＧ−Ｔｉｍ４−Ｈｉｓ ６０μｇを、２９３Ｔ細胞へ遺伝子導入した。遺伝子導入後、３７℃、５％ＣＯ２条件下、遺伝子導入した２９３Ｔ細胞を１日間培養した。その後、培養液を全量取り除き、遺伝子導入した２９３Ｔ細胞をＰＢＳ１０ｍＬで２回洗浄し、培養液をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）５０ｍＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３日間培養した。
＜（２）精製＞
３日間培養後の遺伝子導入した２９３Ｔ細胞の培養液を、遠心分離処理し（３００×ｇ、５分間）、培養上清を回収した。回収した培養上清を、さらに３回遠心分離処理（１回目：３００×ｇ、３分間、２回目：１２００×ｇ、２０分間、３回目：１００００×ｇ、２０分間）し、不純物を分離した上清を得た。得られた上清を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（分画分子量３００００、ＧＥ社製）を用いて限外濾過をして１０倍に濃縮し、培養上清濃縮液を得た。
Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ社製）２．７ｍＬをＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに添付のプロトコールに従って調製し、カラムに移した。流速約１ｍＬ／ｍｉｎでＯＤ２８０ｎｍを測定しながら、カラムに結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）をＯＤ２８０ｎｍの吸光度が安定するまで添加した。得られた培養上清濃縮液５ｍＬをカラムに添加した後、結合バッファーを吸光度が安定するまで十分に添加し洗浄した。次いで、溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）をカラムに添加し、１ｍＬずつ溶出画分を１０画分回収した。
＜（３）電気泳動・銀染色＞
各溶出画分を１５μＬずつ分取し、４×試料用緩衝液（和光純薬工業（株）製）５μＬとそれぞれ混合し、９８℃で５分間加熱して電気泳動用の試料２０μＬをそれぞれ得た。スーパーセップエース ５−２０％ゲル（和光純薬工業（株）製）に当該電気泳動用の試料１５μＬをそれぞれ乗せて、２５ｍＡで６５分間電気泳動した。
銀染色ＩＩキットワコー（和光純薬工業（株）製）でゲルを染色して、目的タンパク質が含まれていた５つの画分を選んでプールした（一つに纏めた）後、溶出液中に含まれるｉｍｉｄａｚｏｌｅを除去する為に、ＰＢＳを２０ｍＬ加えてＶｉｖａｓｐｉｎ（分画分子量３００００、ＧＥ社製）を用いて限外濾過し、濃縮液を得た。得られた濃縮液にＰＢＳを添加して、液量を５００μＬに合わせ、Ｈｉｓタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質（「Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質」と略記する場合がある）を含有するＰＢＳ溶液（「Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液」と略記する場合がある）を得た。
実施例１−８．本発明のＴｉｍ４担体を用いた細胞外膜小胞の取得（本発明の取得方法）
以下のように本発明のＴｉｍ４担体を調製し、これを用いて本発明に係る細胞外膜小胞の取得を行った。
＜（１）カルシウムイオン含有培養上清サンプルの調製＞
細胞外膜小胞を分泌するヒト慢性骨髄性白血病株Ｋ５６２細胞１×１０７細胞を８０ｍＬのＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２条件下で３日間培養した後、遠心分離処理（３００×ｇ、５分間）して細胞を沈殿させ、上清を除去した。沈殿した細胞を、１０μＭモネンシンナトリウム（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）含有Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地６０ｍＬで懸濁後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。
その後、培養液を遠心分離処理（３００×ｇ、５分間）し、培養上清を回収した。回収した培養上清６０ｍＬをさらに３回遠心分離処理（１回目：３００×ｇ、３分間、２回目：１２００×ｇ、２０分間、３回目：１００００×ｇ、２０分間）して不純物を分離し、上清を得た。得られた上清に対して、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（分画分子量３００００、ＧＥ社製）を用いて６ｍＬ以下になるまで限外濾過を行い、濃縮液を得た。得られた濃縮液に１０μＭモネンシンナトリウム（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）含有Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地を添加して液量を６ｍＬに合わせ、１０倍に濃縮したＫ５６２細胞培養濃縮液サンプル（以下、「培養上清サンプル」と略記する場合がある）を得た。
また、得られた培養上清サンプルに終濃度が２ｍＭとなるようにＣａＣｌ２を添加し、２ｍＭＣａＣｌ２含有Ｋ５６２細胞培養上清濃縮液サンプル（以下、「カルシウムイオン含有培養上清サンプル」と略記する場合がある）を得た。
＜（２）Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のビオチン標識＞
実験例１と同様の方法により調製したＦｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液１１４μＬ（Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１０μｇ含有）を、ビオチン標識用キット−ＮＨ２（同仁化学研究所製）を用いて、当該キットに添付されているプロトコールに従ってＦｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質のＮＨ２基をビオチン標識し、ＮＨ２基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質（「ＮＨ２基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質」と略記する場合がある）３．８μｇを含有するＰＢＳ溶液１００μＬ（「ＮＨ２基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液」と略記する場合がある）を得た。
また、実験例１と同様の方法により調製したＦｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液１１４μＬ（Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質１０μｇ含有）を、ビオチン標識用キット−ＳＨ（同仁化学研究所製）を用いて、当該キットに添付されているプロトコールに従ってＦｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のＳＨ基をビオチン標識し、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質（「ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質」と略記する場合がある）５．９μｇを含有するＰＢＳ溶液１００μＬ（「ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液」と略記する場合がある）を得た。
＜（３）Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液の希釈＞
実験例１と同様の方法により調製したＦｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液１１．４μＬを、ＰＢＳ１８８．６μＬと混合し、ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
前記で調製したＮＨ２基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液２６．３μＬ（ＮＨ２基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有）とＰＢＳ１７３．７μＬとを混合し、ＮＨ２基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
また、前記で調製したＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液１６．９μＬ（ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有）とＰＢＳ１８３．１μＬとを混合し、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
＜（４）ビーズの洗浄＞
３０μｇ／μＬ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ 含有ＰＢＳ−Ｔ溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）２０μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ０．６ｍｇ含有）を、３本の１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）にそれぞれ分注した。次いで、ＰＢＳ５００μＬを１．５ｍＬチューブにそれぞれ加え、攪拌した後、１．５ｍＬチューブをそれぞれマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇを集合させ、１．５ｍＬチューブ内の溶液をピペットで捨てた（以下、「洗浄操作」と略記する場合がある）。
また、１０μｇ／μＬＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）含有ＰＢＳ溶液６０μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ ０．６ｍｇ含有）を、１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）に分注し、ＰＢＳ５００μＬを用いて前記と同様に洗浄操作を行った。
＜（５）Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のビーズへの固定＞
３本のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（０．６ｍｇ）含有１．５ｍＬチューブのうち、１本については、前記で調製したビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを全量添加して、８℃で１時間反応させ、ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質が結合した担体（ｍＴｉｍ４担体）を含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
残りの２本のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（０．６ｍｇ）含有１．５ｍＬチューブのうち、１本については、前記で調製したＮＨ２基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを全量添加して、８℃で１時間反応させ、ＮＨ２基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質が結合した担体（ｍＴｉｍ４担体）を含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
また、１本については、前記で調製したＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１μｇを含有するＰＢＳ溶液２００μＬを全量添加して、８℃で１時間反応させ、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質が結合した担体（ｍＴｉｍ４担体）を含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
１本のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１含有１．５ｍＬチューブついては、前記と同様の方法により調製したＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１μｇを含有するＰＢＳ溶液２００μＬを添加して、８℃で１時間反応させ、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質が結合した担体（ｍＴｉｍ４担体）を含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
以上により、下記表１に示す４種類のｍＴｉｍ４担体をそれぞれ０．６ｍｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
Figure 2021012200
＜（６）本発明の取得方法による細胞外膜小胞の取得＞
前記で得られた表１に記載の４種類のｍＴｉｍ４担体０．６ｍｇをＰＢＳ５００μＬでそれぞれ３回洗浄操作した後、ペレット状態のそれぞれのｍＴｉｍ４担体に、前記（１）で調製したカルシウムイオン含有培養上清サンプル２００μＬを加え、８℃で３時間反応させた。
反応後のｍＴｉｍ４担体を、２ｍＭ ＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ， ０．０５％ ｔｗｅｅｎ２０， ２ｍＭ ＣａＣｌ２）５００μＬでそれぞれ３回洗浄操作した。３回目の洗浄操作の時に、４種類のｍＴｉｍ４担体をそれぞれ２５０μＬずつ１．５ｍＬチューブ２本に分注した。
ペレット状態の４種類のｍＴｉｍ４担体各０．３ｍｇに溶出液として１％ ＳＤＳ水溶液又は１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を２０μＬ添加した後、ボルテックスミキサーにより室温で１０秒間混合し、スピンダウンした。１．５ｍＬチューブをそれぞれマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にｍＴｉｍ４担体を集合させ、上清（溶出液）を回収した。
尚、各実施例で用いたｍＴｉｍ４タンパク質及び担体の種類、ｍＴｉｍ４担体から細胞外膜小胞を取得するために用いた溶出液の種類、並びに後述するウエスタンブロッティングにおけるレーン番号を下記表２に示す。
Figure 2021012200
＜（７）ウエスタンブロッティング＞
実施例１−８で得られた各上清（溶出液）７．５μＬに４×試料用緩衝液（和光純薬工業（株）製）２．５μＬを加えて９８℃で５分間加熱し、ウエスタンブロッティング用の各試料を得た。スーパーセップエース ５−２０％ゲル（和光純薬工業（株）製）に当該ウエスタンブロッティング用の各試料１０μＬを乗せて、２５ｍＡで６５分間電気泳動した。得られた泳動ゲルを、セミドライブロッターと不連続バッファー（Ａｎｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ １：０．３Ｍ Ｔｒｉｓ／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、Ａｎｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ ２：０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、Ｃａｔｈｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ：０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ／０．０４Ｍ アミノカプロン酸／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ）を用いて、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に１ｍＡ／ｃｍ２で６０分間転写した。
ＰＶＤＦ膜にＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ， ０．１％ ｔｗｅｅｎ２０）で希釈した３％スキムミルクを加えて１時間室温で反応させてブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔで２５０倍希釈した抗ヒトＬａｍｐ−１マウスモノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、以下「抗ヒトＬａｍｐ−１抗体」と略記する場合がある）２ｍＬを８℃で一晩反応させた。
その後、反応後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔで１００００倍希釈した２次抗体｛抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ウサギ、ＩｇＧ分画、ペルオキシダーゼ結合抗体｝（和光純薬工業（株）製）を室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄後、イムノスターゼータ（和光純薬工業（株）製）を添加し、ＬＡＳ−４０００（ＧＥ社製）を用いて発光シグナルを検出した。尚、抗ヒトＬａｍｐ−１抗体は、エクソソームのマーカータンパク質の１つであるＬａｍｐ−１に対する抗体である。
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図１に示す。図１において、各レーンは以下の通りである。
レーン１：実施例１の結果（ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン２：実施例２の結果（ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン３：実施例３の結果（ＮＨ２基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン４：実施例４の結果（ＮＨ２基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン５：実施例５の結果（ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン６：実施例６の結果（ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン７：実施例７の結果（ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をストレプトアビジンビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン８：実施例８の結果（ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質をストレプトアビジンビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を溶出液として用いた場合の結果）。
図１より、実施例１−８の何れの場合においても、１００ｋＤａ付近にエクソソームマーカーであるＬａｍｐ−１のバンドが得られたことから、本発明の取得方法によれば、エクソソームを含む細胞外膜小胞を取得可能であることが判った（実施例１−８：レーン１−８）。
特に、実施例２、４、６、８の比較から、溶出液としてカルシウムイオンキレート剤を用いた場合には、Ｔｉｍ４タンパク質と担体が、Ｔｉｍ４タンパク質のＳＨ基を介して結合しているものが（実施例８：レーン８）、ＮＨ２基を介して結合しているもの（実施例４：レーン４）やアフィニティータグを介して結合しているもの（実施例２：レーン２、実施例６：レーン６）に比べ、多くの細胞外膜小胞を取得可能なことが判った（実施例２：レーン２、実施例４：レーン４、実施例６：レーン６、実施例８：レーン８）。
実施例９−１６．本発明のＴｉｍ４担体を用いた細胞外膜小胞の取得（本発明の取得方法）
以下のように本発明のＴｉｍ４担体を調製し、これを用いて本発明に係る細胞外膜小胞の取得を行った。
＜（１）培養上清サンプルの調製＞
実施例１−８の「（１）培養上清サンプルの調製」と同様の方法により行った。
＜（２）Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のビオチン標識＞
実験例１「（２）Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のビオチン標識」と同様の方法により調製したＦｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液１１４μＬ（Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１０μｇ含有）について、実施例１と同様の方法により、Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質のＳＨ基をビオチン標識し、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質３．９μｇを含有するＰＢＳ溶液１００μＬ（以下、「ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液」と略記する場合がある）を得た。
＜（３）ＦＬＡＧタグ融合マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のビオチン標識＞
実験例２と同様の方法により調製したＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液９９μＬ（ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１０μｇ含有）を、ビオチン標識用キット−ＳＨ（（株）同仁化学研究所製）を用いて、当該キットに添付されているプロトコールに従ってＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質のＳＨ基をビオチン標識し、ＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質４．６μｇを含有するＰＢＳ溶液（以下、「ＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有するＰＢＳ溶液」と略記する場合がある）１００μＬを得た。
＜（４）Ｈｉｓタグ融合マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のビオチン標識＞
実験例３と同様の方法により調製したＨｉｓタグ融合ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液５４μＬ（Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１０μｇ含有）を、ビオチン標識用キット−ＳＨ（（株）同仁化学研究所製）を用いて、当該キットに添付されているプロトコールに従ってＨｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質のＳＨ基をビオチン標識し、ＳＨ基ビオチン標識Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質７．２μｇを含有するＰＢＳ溶液（以下、「ＳＨ基ビオチン標識Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有するＰＢＳ溶液」と略記する場合がある）１００μＬを得た。
＜（５）タグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質の希釈＞
実験例１と同様の方法により調製したＦｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液１１．４μＬ（Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質１μｇ含有）を、ＰＢＳ１８８．６μＬと混合し、ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質を１μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
前記（２）で調製したＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液１６．９μＬ（ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１μｇを含有する）とＰＢＳ１８３．１μＬとを混合し、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
また、前記（３）で調製したＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液２１．６μＬ（ＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１μｇ含有）とＰＢＳ１７８．４μＬとを混合し、ＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
前記（４）で調製したＳＨ基ビオチン標識Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液１３．９μＬ（ＳＨ基ビオチン標識Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１μｇ含有）とＰＢＳ１８６．１μＬとを混合し、ＳＨ基ビオチン標識Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
＜（６）ビーズの洗浄＞
３０μｇ／μＬ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ 含有ＰＢＳ−Ｔ溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）２０μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ０．６ｍｇ含有）を、１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）１本に分注し、ＰＢＳ５００μＬを用いて、実施例１−８の「（４）ビーズの洗浄」と同様の方法により洗浄操作を行った。
また、１０μｇ／μＬ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ （サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）含有ＰＢＳ溶液６０μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ０．６ｍｇ含有）を、３本の１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）にそれぞれ分注し、ＰＢＳ５００μＬを用いて実施例１−８の「（４）ビーズの洗浄」と同様の方法によりそれぞれ洗浄操作を行った。
＜（７）タグ融合マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のビーズへの固定＞
次いで、洗浄操作後のペレット状態のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ０．６ｍｇを含有する１．５ｍＬチューブに、ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを全量添加して、８℃で１時間反応させ、ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質が結合した担体（ｍＴｉｍ４担体）を含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
さらに、洗浄操作後のペレット状態のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ０．６ｍｇを含有する１．５ｍＬチューブ３本のうち、１本については、前記で調製したＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを全量添加して、８℃で１時間反応させ、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質が結合した担体（ｍＴｉｍ４担体）を含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
残りの２本の洗浄操作後のペレット状態のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ０．６ｍｇを含有する１．５ｍＬチューブのうち、１本については、前記で調製したＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを全量添加して、８℃で１時間反応させ、ＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質が結合した担体（ｍＴｉｍ４担体）を含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
また、１本については、前記で調製したＳＨ基ビオチン標識Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１μｇを含有するＰＢＳ溶液２００μＬを全量添加して、８℃で１時間反応させ、ＳＨ基ビオチン標識Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質が結合した担体（ｍＴｉｍ４担体）を含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
以上により、下記表３に示す４種類のｍＴｉｍ４担体をそれぞれ０．６ｍｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
Figure 2021012200
＜（８）本発明の取得方法による細胞外膜小胞の取得＞
「表１に記載の４種類のｍＴｉｍ４担体０．６ｍｇ」の代わりに「表３に記載の４種類のｍＴｉｍ４担体０．６ｍｇ」を用いた以外は、実施例１−８の「（６）本発明の取得方法による細胞外膜小胞の取得」と同様の方法により行い各上清（溶出液）を得た。尚、各実施例で用いたｍＴｉｍ４タンパク質及び担体の種類、ｍＴｉｍ４担体から細胞外膜小胞を取得するために用いた溶出液の種類、並びに後述のウエスタンブロッティングにおけるレーン番号を下記表４に示す。
Figure 2021012200
＜（７）ウエスタンブロッティング＞
「実施例１−８で得られた各上清（溶出液）７．５μＬ」の代わりに「実施例９−１６（前記（８））で得られた各上清（溶出液）７．５μＬ」を用いた以外は、実施例１−８の「（７）ウエスタンブロッティング」と同様の方法により行った。
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図２に示す。図２において、各レーンは以下の通りである。
レーン１：実施例９の結果（ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン２：実施例１０の結果（ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン３：実施例１１の結果（ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をストレプトアビジンビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン４：実施例１２の結果（ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をストレプトアビジンビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン５：実施例１３の結果（ＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をストレプトアビジンビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン６：実施例１４の結果（ＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をストレプトアビジンビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン７：実施例１５の結果（ＳＨ基ビオチン標識Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をストレプトアビジンビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン８：実施例１６の結果（ＳＨ基ビオチン標識Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をストレプトアビジンビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を溶出液として用いた場合の結果）を、それぞれ示す。
図２より、実施例９−１６の何れの場合においても、１００ｋＤａ付近にエクソソームのマーカータンパク質であるＬａｍｐ−１のバンドが得られたことから、本発明の取得方法によれば、エクソソームを含む細胞外膜小胞を取得可能であることが判った（実施例９−１６：レーン１−８）。
また、本発明のＴｉｍ４担体を用いれば、タグの種類や長さ、有無に関わらず細胞外膜小胞を取得可能であることが判った（実施例９−１６：レーン１−８）。
実施例１０、１２、１４、１６の比較から、溶出液としてカルシウムイオンキレート剤であるＥＤＴＡを用いる場合には、Ｔｉｍ４タンパク質と担体が、Ｔｉｍ４タンパク質のＳＨ基を介して結合しているものが（実施例１２：レーン４、実施例１４：レーン６、実施例１６：レーン８）、アフィニティータグを介して結合しているもの（実施例１０：レーン２）に比べ、多くの細胞外膜小胞を取得可能なことが判った。
実施例１７−１８．本発明のＴｉｍ４担体を用いた細胞外膜小胞の取得（本発明の取得方法）
以下のように本発明のＴｉｍ４担体を調製し、これを用いて本発明に係る細胞外膜小胞の取得を行った。
＜（１）培養上清サンプルの調製＞
実施例１−８の「（１）培養上清サンプルの調製」と同様の方法により行った。
＜（２）ビオチン非標識ＦＬＡＧタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質の希釈＞
実験例２と同様の方法により調製したビオチン非標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質５μｇを含有するＰＢＳ溶液４７μＬ（ビオチン非標識ＦＬＡＧタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液）を、ＰＢＳ１５３μＬと混合し、ビオチン非標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を５μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
＜（３）ビーズの洗浄＞
１０μｇ／μＬ抗ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ抗体磁気ビーズ含有５０％グリセロールＴＢＳ溶液（和光純薬工業（株）製）５０μＬ（抗ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ抗体磁気ビーズ ０．５ｍｇ含有）を、１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）に分注し、ＰＢＳ５００μＬを用いて洗浄操作を行った。
＜（４）ＦＬＡＧタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質の担体への固定＞
次いで、洗浄操作後のペレット状態の抗ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ抗体磁気ビーズに、ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を５μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬの全量を添加して、８℃で１時間反応させ、ｍＴｉｍ４担体を含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
以上により、下記表５に示すｍＴｉｍ４担体を０．５ｍｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
Figure 2021012200
＜（５）本発明の取得方法による細胞外膜小胞の取得＞
「表１に記載の４種類のｍＴｉｍ４担体０．６ｍｇ」の代わりに「表５に記載のｍＴｉｍ４担体０．５ｍｇ」を用いた以外は、実施例１−８の「（６）本発明の取得方法による細胞外膜小胞の取得」と同様の方法を行い、各上清（溶出液）を得た。
尚、各実施例で用いたｍＴｉｍ４タンパク質及び担体の種類、ｍＴｉｍ４担体から細胞外膜小胞を取得するために用いた溶出液の種類、並びに後述のウエスタンブロッティングにおけるレーン番号を下記表６に示す。
Figure 2021012200
＜（６）ウエスタンブロッティング＞
「実施例１−８で得られた各上清（溶出液）７．５μＬ」の代わりに「実施例１７−１８（前記（５））で得られた各上清（溶出液）７．５μＬ」を用いた以外は、実施例１−８の「（７）ウエスタンブロッティング」と同様の方法で行った。
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図３に示す。図３において、各レーンは以下の通りである。
レーン１：実施例１７の結果（ビオチン非標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を抗ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ抗体ビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン２：実施例１８の結果（ビオチン非標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を抗ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ抗体ビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
図３より、実施例１７−１８の何れの場合においても、１００ｋＤａ付近にエクソソームマーカーであるＬａｍｐ−１のバンドが認められたことから、本発明の取得方法によれば、抗タグ抗体を介してＴｉｍ４タンパク質を固定化した担体を用いてもエクソソームを含む細胞外膜小胞を取得可能であることが判った（実施例１７−１８：レーン１−２）。
実施例１９−２０・比較例１−３ 本発明の取得方法と従来法により得られる細胞外膜小胞の純度の比較
以下のように、ＳＤＳ溶出による本発明の取得方法（実施例１９）、ＥＤＴＡ溶出による本発明の取得方法（実施例２０）、超遠心分離法（比較例１）、Ｅｘｏ Ｑｕｉｃｋ（比較例２）、及びＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（比較例３）によりそれぞれ得られる細胞外膜小胞の純度の比較を行った。
＜本発明の取得方法による細胞外膜小胞の取得（実施例１９−２０）＞
「カルシウムイオン含有培養上清サンプル ２００μＬ」の代わりに、「カルシウムイオン含有培養上清サンプル ５００μＬ」を使用し、また、溶出液として「１％ ＳＤＳ水溶液 ２０μＬ」の代わりに「１％ ＳＤＳ水溶液 ５０μＬ」、「１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液 ２０μＬ」の代わりに「１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液 ５０μＬ」を使用した以外は、実施例１３−１４と同様の方法により、ＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に結合させたｍＴｉｍ４タンパク質とカルシウムイオン含有培養上清サンプル中の細胞外膜小胞とを反応させ、溶出液として１％ ＳＤＳ水溶液及び１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液で細胞外膜小胞をそれぞれ溶出させ、上清（溶出液）をそれぞれ得た。
得られた上清（溶出液）を、それぞれサンプル１（１％ ＳＤＳ水溶液で溶出させた場合）、サンプル２（１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液で溶出させた場合）とした。
尚、実施例１９−２０で用いたｍＴｉｍ４タンパク質及び担体の種類、並びにｍＴｉｍ４担体から細胞外膜小胞を取得するために用いた溶出液の種類を下記表７に示す。
Figure 2021012200
＜超遠心分離法による細胞外膜小胞の取得（比較例１）＞
実施例１と同様の方法により調製した培養上清サンプル１ｍＬを遠心分離処理（２００００×ｇ、３０分間）して不純物を分離し、上清を得た。次いで、得られた上清１ｍＬを超遠心分離処理（１１００００×ｇ、７０分間）し、沈殿画分を得た。その後、得られた沈殿画分を１ｍＬ ＰＢＳで懸濁した。沈殿画分の懸濁液を、再度超遠心分離処理（１１００００×ｇ、７０分間）を行った後、得られた沈殿画分をＰＢＳ ５０μＬに懸濁した。得られた懸濁液をサンプル３とした（比較例１）。
＜市販の試薬を用いた遠心分離法による細胞外膜小胞の取得（ＥｘｏＱｕｉｃｋによる細胞外膜小胞の取得）（比較例２）＞
実施例１と同様の方法により調製した培養上清サンプル１ｍＬを遠心分離処理（２００００×ｇ、３０分間）して不純物を分離し、上清を得た。次いで、得られた上清１ｍＬをＥｘｏＱｕｉｃｋ−ＴＣ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）０．２ｍＬと混合し、８℃で当該混合液を終夜静置した。その後、終夜静置した当該混合液を遠心分離処理（１５００×ｇ、３０分間）することで得られた沈殿画分をＰＢＳ １００μＬに懸濁した。得られた懸濁液をサンプル４とした（比較例２）。
＜市販の試薬を用いた遠心分離法による細胞外膜小胞の取得（Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎによる細胞外膜小胞の取得）（比較例３）＞
実施例１と同様の方法により調製したＫ５６２細胞培養上清濃縮液サンプル１ｍＬを遠心分離処理（２００００×ｇ、３０分間）して不純物を分離し、上清を得た。次いで、得られた上清１ｍＬをＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製） ０．５ｍＬと混合し、８℃で１日間静置した。当該混合液を遠心分離処理（１００００×ｇ、１時間）することで得られた沈殿画分をＰＢＳ １００μＬに懸濁した。得られた懸濁液をサンプル５とした（比較例３）。
尚、各実施例及び比較例で用いた方法、得られたサンプル並びに後述のウエスタンブロッティング及び銀染色におけるレーン番号について下記表８に示す。
Figure 2021012200
＜ウエスタンブロッティング＞
各方法により得られたサンプル１−５中のタンパク質量をＢＣＡ法で測定し、測定結果を基に、タンパク質量をそれぞれ電気泳動の基準量として、ウエスタンブロッティングを行った。即ち、サンプル１−５中の各タンパク質０．２５μｇを含むＰＢＳ溶液３７．５μＬと４×試料用緩衝液（和光純薬工業（株）製）１２．５μＬとをそれぞれ混合後、９８℃で５分間加熱し、ウエスタンブロッティング用の各試料５０μＬをそれぞれ得た。
次いで、スーパーセップエース ５−２０％ゲル（和光純薬工業（株）製）に、得られたウエスタンブロッティング用の各試料各２０μＬずつを２枚のゲルに乗せて、２５ｍＡで６０分間電気泳動した。得られた２枚のゲルのうち１枚を、セミドライブロッターと不連続バッファー（Ａｎｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ １：０．３Ｍ Ｔｒｉｓ／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、Ａｎｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ ２：０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、Ｃａｔｈｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ：０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ／０．０４Ｍ アミノカプロン酸／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ）を用いて、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に１ｍＡ／ｃｍ２で６０分間転写した。ＰＶＤＦ膜にＰＢＳ−Ｔで希釈した３％スキムミルクを加えて１時間室温で反応させてブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔで２５０倍希釈した抗ヒトＬａｍｐ−１マウスモノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）２ｍＬを室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ＰＢＳ−Ｔで１００００倍希釈した２次抗体｛抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ウサギ、ＩｇＧ分画、ペルオキシダーゼ結合抗体（和光純薬工業（株）製）｝を室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄後、ＥＣＬ ｐｒｉｍｅ（ＧＥ社製）を添加し、ＬＡＳ−４０００（ＧＥ社製）を用いて発光シグナルをそれぞれ検出した。
また、もう１枚のゲルを、銀染色ＩＩキットワコー（和光純薬工業（株）製）を用いて銀染色した。
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図４−Ａ、銀染色の結果を図４−Ｂにそれぞれ示す。図４−Ａ及び図４−Ｂにおいて、各レーンは以下の通りである。
レーン１：実施例１９の結果（ＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をストレプトアビジンビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いて本発明の取得方法を行った場合の結果）
レーン２：実施例２０の結果（ＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をストレプトアビジンビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を溶出液として用いて本発明の取得方法を行った場合の結果）
レーン３：比較例１の結果（超遠心分離法により細胞外膜小胞の取得を行った場合の結果）
レーン４：比較例２の結果（ＥｘｏＱｕｉｃｋにより細胞外膜小胞の取得を行った場合の結果）
レーン５：は比較例３の結果（Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎにより細胞外膜小胞の取得を行った場合の結果）
図４−Ａより、本発明の取得方法である実施例１９−２０のいずれにおいても、１００ｋＤａ付近にエクソソームマーカーであるＬａｍｐ−１のバンドが認められており、本発明の取得方法によれば、エクソソームを含む細胞外膜小胞を取得可能であることが判った（実施例１９−２０：レーン１−２）。
一方、図４−Ａより、いずれの従来法（超遠心分離法（比較例１）、Ｅｘｏ Ｑｕｉｃｋ（比較例２）、及びＴｏｔａｌ Ｅｘｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（比較例３））でも、１００ｋＤａ付近にエクソソームマーカーのＬａｍｐ−１のバンドは、薄くわずかにしか認められなかった（比較例１−３：レーン３−５）。
また、図４−Ｂより、本発明の取得方法（実施例１９−２０）は、いずれの従来法（超遠心分離法（比較例１）、Ｅｘｏ Ｑｕｉｃｋ（比較例２）、及びＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（比較例３））よりも、夾雑タンパク質等に由来するバンドが少なかった（実施例１９−２０：レーン１−２、比較例１−３：レーン３−５）。
以上の結果から、本発明の取得方法（実施例１９及び２０）は、いずれの従来法（（超遠心分離法（比較例１）、Ｅｘｏ Ｑｕｉｃｋ（比較例２）、及びＴｏｔａｌ Ｅｘｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（比較例３））と比較しても、純度よく細胞外膜小胞を取得できることが判った（レーン１−５）。
実施例２１．本発明の取得方法により得られた細胞外膜小胞の電子顕微鏡による観察
本発明の取得方法により取得された細胞外膜小胞の状態を調べるために、電子顕微鏡による観察をおこなった。
＜（１）マウスマクロファージ培養上清サンプルの調製＞
腹腔マクロファージを得るため、３％チオグリコレート溶液（フルカ試薬社製）２ｍＬを８週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本エスエルシー（株）より購入）６匹の腹腔に注射した。３日後、腹腔からマクロファージを回収し、回収したマクロファージを１５０ｍｍ細胞培養用ディッシュ４枚で１０％ＦＢＳ（バイオウェスト社製）含有ＤＭＥＭ（ナカライテスク（株）製）８０ｍＬを用いて２日間培養し、培養上清を回収し、マウスマクロファージ培養上清サンプルを得た。
＜（２）Ｔｉｍ４担体の調製＞
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）０．６ｍｇの代わりに Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１ｍｇ使用し、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合ｍＴｉｍ４タンパク質１μｇを含有するＰＢＳ溶液２００μＬの代わりにＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合ｍＴｉｍ４タンパク質１００μｇを含有するＰＢＳ溶液１００μＬを使用し、ＤｙｎａｂｅａｄｓとＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合ｍＴｉｍ４タンパク質を含有するＰＢＳ溶液との反応時間を１時間の代わりに２時間とした以外は、実施例１１−１２と同様の方法により、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１に結合させたｍＴｉｍ４担体を調製した。
＜（３）Ｔｉｍ４担体を用いた細胞外膜小胞の取得＞
マウスマクロファージ培養上清サンプル３２ｍＬを遠心分離処理（１回目：８００×ｇ、１０分間、２回目：１２０００×ｇ、３０分間）し、上清を得た。得られた上清に、終濃度２ｍＭ となるようにＣａＣｌ２を添加した後、前記で調製したｍＴｉｍ４担体１ｍｇを加え、室温で１時間撹拌混合した。次いで、室温で１時間撹拌混合したｍＴｉｍ４担体を回収し、終濃度２ｍＭ ＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔ５ｍＬで３回洗浄操作した後、さらに１ｍＬで２回洗浄操作した後、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ１００μＬで３回溶出し、細胞外膜小胞画分３００μＬを得た。
次いで、マウスマクロファージ培養上清サンプル中の細胞外膜小胞を確実に回収するため、再度以下の方法により、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ１００μＬで３回溶出した後のマウスマクロファージ培養上清サンプルから細胞外膜小胞を回収し、細胞外膜小胞画分３００μＬを得た。即ち、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ１００μＬで３回溶出した後のマウスマクロファージ培養上清サンプルに、終濃度２ｍＭ となるようにＣａＣｌ２を添加した後、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ１００μＬで３回溶出した後のｍＴｉｍ４担体１ｍｇを加え、室温で１時間撹拌混合した。次いで、室温で１時間撹拌混合したｍＴｉｍ４担体を回収し、終濃度２ｍＭ ＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔ５ｍＬで３回洗浄操作した後、さらに１ｍＬで２回洗浄操作した後、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ１００μＬで３回溶出し、細胞外膜小胞画分３００μＬを得た。
その後、マウスマクロファージ培養上清サンプル中の細胞外膜小胞をより確実に回収するため、以上の操作を再度行い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ１００μＬで計６回溶出した後のマウスマクロファージ培養上清サンプルから細胞外膜小胞を回収し、細胞外膜小胞画分３００μＬを得た。
前記９回の溶出操作により得られた細胞外膜小胞画分計９００μＬをアミコンウルトラ−０．５ｍＬ １０Ｋ遠心式フィルターカラムを用いて６０μＬに濃縮し、電子顕微鏡による観察用の試料を得た。
＜（４）電子顕微鏡による本発明の取得方法により取得された細胞外膜小胞の観察＞
電子顕微鏡による観察用の試料１０μＬをグリッドに吸着させ、余剰の電子顕微鏡による観察用の試料を濾紙で吸い取った。次いで、グリッドを水洗し、酢酸ウラニウム水溶液による染色を２回行った後、透過型電子顕微鏡を用いてネガティブ染色法による観察を行った。
尚、実施例２１で用いたｍＴｉｍ４タンパク質及び担体の種類、並びにｍＴｉｍ４担体から細胞外膜小胞を取得するために用いた溶出液の種類を下記表９に示す。
Figure 2021012200
＜結果＞
得られた電気顕微鏡の観察画像を図５に示す。図５より、本発明の取得方法によれば、球形の形状を保ったまま、直径５０〜１５０ｎｍ程度の細胞外膜小胞を取得できた。
以上のことから、本発明の取得方法によれば、インタクトな状態で細胞外膜小胞を取得できることが判った。
実施例２２−２５．本発明のＴｉｍ４担体による細胞外膜小胞の取得（本発明の取得方法）
ヒト由来Ｔｉｍ４タンパク質をビーズへ固定化した担体（以下、「ｈＴｉｍ４担体」と略記する場合がある）とｍＴｉｍ４担体とを用いて、本発明に係る細胞外膜小胞の取得を行った。
＜（１）培養上清サンプルの調製＞
実施例１−８の「（１）培養上清サンプルの調製」と同様の方法により行った。
＜（２）Ｆｃタグ融合型Ｔｉｍ４タンパク質の希釈＞
ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ヒト由来Ｔｉｍ４タンパク質（和光純薬工業（株）製、配列番号７（ヒト由来Ｔｉｍ４タンパク質のＮ末端２５〜３１５アミノ酸領域（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿６１２３８８．２）にＦｃタグが融合されたヒト由来Ｔｉｍ４タンパク質））凍結乾燥品１００μｇをＰＢＳ１ｍＬに溶かし、１００μｇ／ｍＬビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｈＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液を作製した。ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｈＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液１０μＬとＰＢＳ１９０μＬと混合し、ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｈＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
また、ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質（和光純薬工業（株）製、配列番号６（マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のＮ末端２２〜２７９アミノ酸領域（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿８４８８７４．３））にＦｃタグが融合されたｍＴｉｍ４タンパク質） 凍結乾燥品１００μｇをＰＢＳ１ｍＬに溶かし、１００μｇ／ｍＬビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液を作製した。ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液１０μＬとＰＢＳ１９０μＬと混合し、ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
＜（３）ビーズの洗浄＞
３０μｇ／μＬ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ 含有ＰＢＳ−Ｔ溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）２０μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ０．６ｍｇ含有）を、２本の１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）にそれぞれ分注し、ＰＢＳ５００μＬを用いて洗浄操作を行った。
＜（４）ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型Ｔｉｍ４タンパク質のビーズへの固定＞
２本のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（０．６ｍｇ）含有１．５ｍＬチューブのうち、１本については、前記で調製したビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｈＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを全量添加して、８℃で１時間反応させ、ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｈＴｉｍ４タンパク質が結合した担体（ｈＴｉｍ４担体）を含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
残りの１本のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（０．６ｍｇ）含有１．５ｍＬチューブについては、前記で調製したビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを全量添加して、８℃で１時間反応させ、ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質が結合した担体（ｍＴｉｍ４担体）を含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
＜（５）本発明の取得方法による細胞外膜小胞の取得＞
前記で得られたｈＴｉｍ４担体及びｍＴｉｍ４担体 ０．６ｍｇをＰＢＳ５００μＬでそれぞれ３回洗浄操作した後、ペレット状態のｈＴｉｍ４担体及びｍＴｉｍ４担体に、カルシウムイオン含有培養上清サンプル２００μＬをそれぞれ加え、８℃で３時間それぞれ反応させた。その後、反応後のｈＴｉｍ４担体及びｍＴｉｍ４担体を、２ｍＭ ＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔ ５００μＬでそれぞれ３回洗浄操作した。
３回目の洗浄のときにｈＴｉｍ４担体及びｍＴｉｍ４担体をそれぞれ２５０μＬ（担体０．３ｍｇ）ずつ１．５ｍＬチューブ２本に分注した。ペレット状態のｍＴｉｍ４担体及びｈＴｉｍ４担体各０．３ｍｇに溶出液として１％ ＳＤＳ水溶液又は１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を２０μＬ添加した後、ボルテックスミキサーにより室温で１０秒間混合し、スピンダウンした。１．５ｍＬチューブをそれぞれマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にｈＴｉｍ４担体及びｍＴｉｍ４担体を集合させ、それぞれ上清（溶出液）を回収した。
尚、実施例２２−２５で用いたＴｉｍ４タンパク質及び担体の種類、Ｔｉｍ４担体から細胞外膜小胞を取得するために用いた溶出液の種類、並びに後述するウエスタンブロッティングにおけるレーン番号を下記表１０に示す。
Figure 2021012200
＜（６）ウエスタンブロッティング＞
「実施例１−８で得られた各上清（溶出液）７．５μＬ」の代わりに「実施例２２−２５（前記（５））で得られた各上清（溶出液）７．５μＬ」を用いた以外は、実施例１−８の「（７）ウエスタンブロッティング」と同様の方法により行った。
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図６に示す。図６において、各レーンは以下の通りである。
レーン１：実施例２２の結果（ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｈＴｉｍ４タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズに結合させたｈＴｉｍ４担体を用い、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン２：実施例２３の結果（ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｈＴｉｍ４タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズに結合させたｈＴｉｍ４担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）、
レーン３：実施例２４の結果（ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン４：実施例２５の結果（ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズに結合させたｍＴｉｍ４担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
図６より、実施例２２−２５のいずれの場合においても、１００ｋＤａ付近にエクソソームマーカーであるＬａｍｐ−１のバンドが認められたことから、本発明の取得方法によれば、エクソソームを含む細胞外膜小胞を取得可能であることが判った（実施例２２−２５：レーン１−４）。
また、Ｔｉｍ４タンパク質は由来の生物種によらず本発明のＴｉｍ４担体及び本発明の取得方法に用いることができることが判った。
実施例２６−２７・比較例４−９．Ｔｉｍ４担体及びＰＳタンパク質を固定化した担体による細胞外膜小胞の取得量の比較
Ｔｉｍ４担体とＰＳタンパク質（ヒト由来Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ、ヒト由来ＭＦＧ−Ｅ８、及びマウス由来ＭＦＧ−Ｅ８）をそれぞれビーズへ固定化した担体を用いて、本発明に係る細胞外膜小胞の取得を行った。
＜（１）ＰＳタンパク質含有ＰＢＳ溶液の希釈＞
Ｈｉｓタグ融合型ヒト由来Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭａｒｔ社製、「Ｈｉｓタグ融合型ｈＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ」と略記する場合がある）２０μｇを２００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ１００μＬに溶かし、Ｈｉｓタグ融合型ｈＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ含有ＰＢＳ溶液を作製した。Ｈｉｓタグ融合型ｈＡｎｎｅｘｉｎ Ｖタンパク質１μｇ含有ＰＢＳ溶液５μＬとＰＢＳ１９５μＬを混合して希釈した。
Ｈｉｓタグ融合型ヒト由来ＭＦＧ−Ｅ８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、「Ｈｉｓタグ融合型ｈＭＦＧ−Ｅ８」と略記する場合がある）５０μｇを１００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ５００μＬに溶かし、Ｈｉｓタグ融合型ｈＭＦＧ−Ｅ８含有ＰＢＳ溶液を作製した。Ｈｉｓタグ融合型ｈＭＦＧ−Ｅ８タンパク質１μｇ含有ＰＢＳ溶液１０μＬとＰＢＳ１９０μＬを混合して希釈した。 Ｈｉｓタグ融合型マウス由来ＭＦＧ−Ｅ８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、「Ｈｉｓタグ融合型ｍＭＦＧ−Ｅ８」と略記する場合がある）５０μｇを１００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ５００μＬに溶かし、Ｈｉｓタグ融合型ｍＭＦＧ−Ｅ８含有ＰＢＳ溶液を作製した。Ｈｉｓタグ融合型マウス由来ＭＦＧ−Ｅ８タンパク質１μｇ含有ＰＢＳ溶液１０μＬとＰＢＳ１９０μＬを混合して希釈した。
＜（２）抗Ｈｉｓタグ抗体固定化ビーズの調製＞
３０μｇ／μＬ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）含有溶液 １００μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ ３ｍｇ含有）を１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）に分注し、反応バッファー（０．１Ｍ ＭＥＳ、ｐＨ５．０）を用いて洗浄操作を行った。
次いで、反応バッファー４９０μＬで希釈した６ｘＨｉｓ抗体（和光純薬工業（株）製）溶液６０μＬ（６ｘＨｉｓ抗体 ６０μｇ含有）を加えて室温で３０分間転倒混和し、その後６ｍｇ／ｍＬ ＷＳＣ（同仁化学研究所製）を５０μＬ加えて室温で４時間転倒混和した。転倒混和後のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ＡｃｉｄをＴＢＳ−Ｔで洗浄操作した後、１００μＬ ＰＢＳで希釈して抗Ｈｉｓタグ抗体固定化ビーズ３ｍｇを得た。
＜（３）Ｔｉｍ４担体及び各種ＰＳタンパク質を固定化した担体の調製＞
次いで、得られた抗Ｈｉｓタグ抗体固定化ビーズを含有するＰＢＳ溶液１００μＬ（抗Ｈｉｓタグ抗体固定化ビーズ３ｍｇ含有）を、４本の１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）にそれぞれ２０μＬ（抗Ｈｉｓタグ抗体固定化ビーズ０．６ｍｇ含有）ずつ分注し、５００μＬ ＰＢＳで洗浄操作をそれぞれ行った。
次いで、４本の洗浄操作後のペレット状態の抗Ｈｉｓタグ抗体固定化ビーズ０．６ｍｇを含有する１．５ｍＬチューブのうち、１本については、前記で調製したＨｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液２００μＬ（Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質 １μｇ含有）を添加して、８℃で１時間反応させた。
さらに、１本については、前記で調製したＨｉｓタグ融合型ｈＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ質含有ＰＢＳ溶液２００μＬ（Ｈｉｓタグ融合型ｈＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ １μｇ含有）を添加して、８℃で１時間反応させた。
１本については、前記で調製したＨｉｓタグ融合型ｈＭＦＧ−Ｅ８含有ＰＢＳ溶液２００μＬ（Ｈｉｓタグ融合型ｈＭＦＧ−Ｅ８ １μｇ含有）を添加して、８℃で１時間反応させた。
１本については、前記で調製したＨｉｓタグ融合型ｍＭＦＧ−Ｅ８含有ＰＢＳ溶液２００μＬ（Ｈｉｓタグ融合型ｍＭＦＧ−Ｅ８ １μｇ含有）を添加して、８℃で１時間反応させた。
以上により、下記表１１に示す４種類の担体をそれぞれ０．６ｍｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
Figure 2021012200
＜（４）細胞外膜小胞の取得＞
前記で得られた４種類の担体 ０．６ｍｇを含有するＰＢＳ溶液２００μＬをＰＢＳ５００μｌでそれぞれ３回洗浄操作した後、ペレット状態の５種類の担体に、実施例１−８と同様の方法により調製したカルシウムイオン含有培養上清サンプル２００μＬをそれぞれ加え、８℃で３時間それぞれ反応させた。
その後、カルシウムイオン含有培養上清サンプルを反応させた４種類の担体を、２ｍＭ ＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔ ５００μＬでそれぞれ３回洗浄操作した。
３回目の洗浄の時に、４種類の担体をそれぞれ２５０μＬずつ１．５ｍＬチューブ２本に分注した。ペレット状態の４種類の担体各０．３ｍｇに溶出液として１％ ＳＤＳ水溶液又は１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を２０μＬ添加した後、ボルテックスミキサーにより室温で１０秒間スピンダウンした。１．５ｍＬチューブをそれぞれマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁に得られた４種類の担体を集合させ、それぞれ上清（溶出液）を回収した。
尚、各実施例で用いたＰＳタンパク質及び担体の種類、担体から細胞外膜小胞を取得するために用いた溶出液の種類、並びに後述するウエスタンブロッティングにおけるレーン番号を下記表１２に示す。
Figure 2021012200
＜（５）ウエスタンブロッティング＞
「実施例１−８で得られた各上清（溶出液）７．５μＬ」の代わりに「実施例２６−２７、比較例４−９（前記（４））で得られた各上清（溶出液）７．５μＬ」を用いた以外は、実施例１−８の「（７）ウエスタンブロッティング」と同様の方法により行った。
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図７に示す。図７において、各レーンは以下の通りである。
レーン１：実施例２６の結果（Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を抗Ｈｉｓタグ抗体固定化ビーズに結合させた担体を用い、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン２：実施例２７の結果（Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を抗Ｈｉｓタグ抗体固定化ビーズに結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン３：比較例４の結果（Ｈｉｓタグ融合型ｈＡｎｎｅｘｉｎ Ｖを抗Ｈｉｓタグ抗体固定化ビーズに結合させた担体を用い、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン４：比較例５の結果（Ｈｉｓタグ融合型ｈＡｎｎｅｘｉｎ Ｖを抗Ｈｉｓタグ抗体固定化ビーズに結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン５：比較例６の結果（Ｈｉｓタグ融合型ｈＭＦＧ−Ｅ８を抗Ｈｉｓタグ抗体固定化ビーズに結合させた担体を用い、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン６：比較例７の結果（Ｈｉｓタグ融合型ｈＭＦＧ−Ｅ８を抗Ｈｉｓタグ抗体固定化ビーズに結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン７：比較例８の結果（Ｈｉｓタグ融合型ｍＭＦＧ−Ｅ８を抗Ｈｉｓタグ抗体固定化ビーズに結合させた担体を用い、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン８：比較例９の結果（Ｈｉｓタグ融合型ｍＭＦＧ−Ｅ８を抗Ｈｉｓタグ抗体固定化ビーズに結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
図７より、実施例２６−２７の何れの場合においても、１００ｋＤａ付近にエクソソームマーカーであるＬａｍｐ−１のバンドが得られたことから、本発明の取得方法によれば、エクソソームを含む細胞外膜小胞を取得可能であることが判った（実施例２６−２７：レーン１−２）。
一方、図７より、比較例４−９の何れの場合においても、１００ｋＤａ付近にＬａｍｐ−１のバンドが認められなかったことから、Ｔｉｍ４タンパク質以外のＰＳタンパク質（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ、ＭＦＧ−Ｅ８）を固定化した担体では、エクソソームを含む細胞外膜小胞を取得不可能であることが判った（比較例４−９：レーン３−８）。
実施例２８−３３．本発明の取得方法による細胞外膜小胞の取得（複合体形成工程の検討）
下記のようにそれぞれ本発明の取得方法により細胞外膜小胞の取得を行った。
実施例２８−２９は、実施例１３−１４と同様の方法により調製したＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質と本発明に係る担体とを反応後、さらに試料を加えて、本発明に係る細胞外膜小胞の取得を行った。
実施例３０−３１は、実施例１３−１４と同様の方法により調製したＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質と試料とを反応後、さらに本発明に係る担体を加えて、本発明に係る細胞外膜小胞の取得を行った。
実施例３２−３３は、実施例１３−１４と同様の方法により調製したＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質と、試料と、本発明に係る担体とを同時に加えて、本発明に係る細胞外膜小胞の取得を行った。
＜ビーズの洗浄＞
１０μｇ／μＬＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）含有ＰＢＳ溶液６０μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ ０．６ｍｇ含有）を、３つの１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）にそれぞれ分注し、ＰＢＳ５００μＬを用いてそれぞれ洗浄操作を行った。
実施例１３−１４と同様の方法により、Ｈｉｓタグ融合ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液２７０μＬ（Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質５０μｇ含有）をビオチン標識し、ＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質３９．２μｇを含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。得られたＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１μｇを含有するＰＢＳ溶液５．１μＬにＰＢＳ溶液１９４．９μＬを加え、ＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１μｇを含有するＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
＜ＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質と本発明に係る担体とを反応後、さらに本発明に係る試料中の細胞外膜小胞を反応させる場合（実施例２８−２９）＞
洗浄操作を行ったペレット状のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ ０．６ｍｇを含有する１．５ｍＬチューブに、ＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１μｇを含有するＰＢＳ溶液２００μＬを加えて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１とＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質とを接触させて、８℃で１時間反応させ、ｍＴｉｍ４担体を得た。次いで、得られたｍＴｉｍ４担体をＰＢＳ５００μＬで３回洗浄操作し、当該洗浄後のｍＴｉｍ４担体０．６ｍｇを含有する１．５ｍＬチューブに、実施例１と同様の方法により調製したカルシウムイオン含有培養上清サンプル２００μＬを加えて８℃で３時間反応させた。その後、カルシウムイオン含有培養上清サンプルを反応させたｍＴｉｍ４担体を、終濃度２ｍＭ ＣａＣｌ２添加ＴＢＳ−Ｔ５００μＬで３回洗浄操作した。３回目の洗浄の時に、ｍＴｉｍ４担体をそれぞれ２５０μＬずつ１．５ｍＬチューブ２本に分注した。ペレット状態のｍＴｉｍ４担体各０．３ｍｇに溶出液として１％ ＳＤＳ水溶液又は１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を２０μＬ添加した後、ボルテックスミキサーにより室温で１０秒間混合し、スピンダウンした。１．５ｍＬチューブをそれぞれマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にｍＴｉｍ４担体を集合させ、上清（溶出液）をそれぞれ回収した。
＜ＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質と本発明に係る試料とを反応後、さらに本発明に係る担体を反応させる場合（実施例３０−３１）＞
１．５ｍＬチューブに、実施例１と同様の方法により調製したカルシウムイオン含有培養上清サンプル２００μＬを分注し、ＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１μｇを含有するＰＢＳ溶液５．１μＬを加えて、カルシウムイオン含有培養上清サンプル中の細胞外膜小胞とＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質とを接触させ、８℃で３時間反応させた。
洗浄操作を行ったペレット状のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ ０．６ｍｇを含有する１．５ｍＬチューブに、カルシウムイオン含有培養上清サンプル中の細胞外膜小胞とＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質とを８℃で３時間反応させた溶液を添加し、８℃で１時間反応させ、細胞外膜小胞とｍＴｉｍ４担体との複合体を得た。その後、得られた細胞外膜小胞とｍＴｉｍ４担体との複合体を、終濃度２ｍＭ ＣａＣｌ２添加ＴＢＳ−Ｔ５００μＬで３回洗浄操作した。３回目の洗浄の時に、ｍＴｉｍ４担体との複合体をそれぞれ２５０μＬずつ１．５ｍＬチューブ２本に分注した。ペレット状態のｍＴｉｍ４担体との複合体各０．３ｍｇに溶出液として１％ ＳＤＳ水溶液又は１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を２０μＬ添加した後、ボルテックスミキサーにより室温で１０秒間混合し、スピンダウンした。１．５ｍＬチューブをそれぞれマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にｍＴｉｍ４担体を集合させ、上清（溶出液）をそれぞれ回収した。
＜ＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質と、本発明に係る試料と、本発明に係る担体とを同時に反応させる場合（実施例３２−３３）＞
洗浄操作を行ったペレット状のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ ０．６ｍｇを含有する１．５ｍＬチューブに、実施例１と同様の方法により調製したカルシウムイオン含有培養上清サンプル２００μＬとＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１μｇを含有するＰＢＳ溶液５．１μＬとを加えて、８℃で４時間反応させた。反応後のペレット状のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１を、終濃度２ｍＭ ＣａＣｌ２添加ＴＢＳ−Ｔ ５００μＬで３回洗浄操作した。３回目の洗浄の時に、ｍＴｉｍ４担体をそれぞれ２５０μＬずつ１．５ｍＬチューブ２本に分注し、ｍＴｉｍ４担体各０．３ｍｇに溶出液として１％ ＳＤＳ水溶液又は１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を２０μＬ添加した後、ボルテックスミキサーにより室温で１０秒間混合し、スピンダウンした。１．５ｍＬチューブをそれぞれマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１を集合させ、上清（溶出液）をそれぞれ回収した。
尚、各実施例における担体、ｍＴｉｍ４タンパク質、カルシウムイオン含有培養上清サンプルを接触させる順番、及び担体から細胞外膜小胞を取得するために用いた溶出液の種類を下記表１３に示す。
Figure 2021012200
＜ウエスタンブロッティング＞
「実施例１−８で得られた各上清（溶出液）７．５μＬ」の代わりに「実施例２８−３３で得られた各上清（溶出液）７．５μＬ」を用いた以外は、実施例１−８の「（７）ウエスタンブロッティング」と同様の方法により行った。
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図８にそれぞれ示す。図８において、各レーンは以下の通りである。
レーン１：実施例２８の結果（担体とｍＴｉｍ４タンパク質を接触後、さらにカルシウムイオン細胞培養上清サンプルと接触させる方法により細胞外膜小胞を取得し、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン２：実施例２９の結果（担体とｍＴｉｍ４タンパク質を接触後、さらにカルシウムイオン細胞培養上清サンプルと接触させる方法により細胞外膜小胞を取得し、１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン３：実施例３０の結果（ｍＴｉｍ４タンパク質とカルシウムイオン細胞培養上清サンプルを接触後、さらに担体と接触させる方法により細胞外膜小胞を取得し、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）を、
レーン４：実施例３１の結果（ｍＴｉｍ４タンパク質とカルシウムイオン細胞培養上清サンプルを接触後、さらに担体と接触させる方法により細胞外膜小胞を取得し、１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）を、
レーン５：実施例３２の結果（担体とカルシウムイオン細胞培養上清サンプルとｍＴｉｍ４タンパク質とを同時に接触させる方法により細胞外膜小胞を取得し、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）を、
レーン６：実施例３３の結果（担体とカルシウムイオン細胞培養上清サンプルとｍＴｉｍ４タンパク質とを同時に接触させる方法により細胞外膜小胞を取得し、１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
図８より、実施例２８−３３の何れにおいても、１００ｋＤａ付近にエクソソームマーカーであるＬａｍｐ−１のバンドが得られた（実施例２８−３３：レーン１−６）。
また、実施例２８−３３の結果より、担体に結合したＴｉｍ４タンパク質と試料中の細胞外膜小胞の複合体を形成させる工程（複合体形成工程）は、本発明に係るＴｉｍ４タンパク質と、本発明に係る担体と、試料中の細胞外膜小胞との接触する順序によらず、結果として、担体に結合したｍＴｉｍ４タンパク質と試料中の細胞外膜小胞の複合体が形成されればよいことが判った。
実施例３４−３５・比較例１０−１３ 本発明の取得方法と従来法の比較
以下のように、ＳＤＳ溶出による本発明の取得方法（実施例３４）、ＥＤＴＡ溶出による本発明の取得方法（実施例３５）、抗ＣＤ６３抗体固定化法（比較例１０−１１）、Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ６３ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（比較例１２−１３）により得られる細胞外膜小胞の取得を行った。
＜Ｔｉｍ４タンパク質の担体への固定＞
１０μｇ／μＬ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）含有溶液 １５μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ １×１０７個含有する）を１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）に分注し、ＰＢＳを用いて洗浄操作を行った。
次いで、洗浄操作後のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを含有する１．５ｍＬチューブに、実施例１１−１２と同様の方法により調製したＳＨ基ビオチン標識ＦＬＡＧタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質を０．２５μｇ含有するＰＢＳ溶液２００μＬの全量を加えて、冷蔵で１時間反応させて、ｍＴｉｍ４担体含有ＰＢＳ溶液を得た。
＜抗ＣＤ６３抗体（Ｈ５Ｃ６）固定化担体の調製＞
３０μｇ／μＬ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）含有溶液 ５０μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ １×１０８個含有する）を１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）に分注し、反応バッファー（０．１Ｍ ＭＥＳ、ｐＨ５．０）を用いて洗浄操作を行った。
一方、抗ＣＤ６３抗体（Ｈ５Ｃ６）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）３０ｇ（６０μＬ）を、反応バッファー（０．１Ｍ ＭＥＳ、ｐＨ５．０）４９０μＬで希釈し、反応バッファー希釈抗ＣＤ６３抗体溶液を得た。
次いで、洗浄操作後のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄを含有する１．５ｍＬチューブに、前記反応バッファー希釈抗ＣＤ６３抗体溶液を５５０μＬ加えて室温で３０分間転倒混和した。その後、さらに３ｍｇ／ｍＬ ＷＳＣ（同仁化学研究所社製）を５０μＬ加えて室温で４時間転倒混和し、ＴＢＳ−Ｔで洗浄操作後、５０μＬ ＰＢＳで希釈し、抗ＣＤ６３抗体（Ｈ５Ｃ６）担体含有ＰＢＳ溶液を得た。
以上により、下記表１４に示す２種類の担体を得た。
Figure 2021012200
 ＜本発明の取得方法による細胞外膜小胞の取得＞
前記で得られたｍＴｉｍ４担体含有ＰＢＳ溶液２００μＬ（ｍＴｉｍ４担体１×１０７個含有）をＰＢＳ５００μＬで３回洗浄操作した後、ペレット状態のｍＴｉｍ４担体に、実施例１−８と同様の方法により調製したカルシウムイオン含有培養上清サンプル５０μＬを加え、８℃で３時間反応させた。
その後、反応後のｍＴｉｍ４担体を、２ｍＭ ＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔ５００μＬで３回洗浄操作した。３回目の洗浄の時に、ｍＴｉｍ４担体をそれぞれ２５０μＬずつ１．５ｍＬチューブ２本に分注した。ペレット状態のｍＴｉｍ４担体０．３ｍｇずつに、溶出液として１％ ＳＤＳ水溶液及び１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液をそれぞれ２０μＬ添加した後、ボルテックスミキサーにより室温で１０秒間それぞれ混合し、スピンダウンした。１．５ｍＬチューブをそれぞれマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にｍＴｉｍ４担体を集合させ、上清（溶出液）を回収した。
＜抗ＣＤ６３抗体固定化法による細胞外膜小胞の取得＞
「ｍＴｉｍ４担体含有ＰＢＳ溶液２００μＬ」の代わりに、「抗ＣＤ６３抗体（Ｈ５Ｃ６）担体含有ＰＢＳ溶液５μＬ（担体１×１０７個含有）」を用いた以外は、前記＜本発明の取得方法による細胞外膜小胞の取得＞と同様の方法により、カルシウムイオン含有培養上清サンプル中の細胞外膜小胞を取得し、１％ ＳＤＳ水溶液又は１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液により細胞外膜小胞を溶出させ、上清（溶出液）を回収した。
＜Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ６３ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎによる細胞外膜小胞の取得＞
「ｍＴｉｍ４担体含有ＰＢＳ溶液２００μＬ」の代わりに、「Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ６３ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）１ｍＬ（担体１×１０７個含有）」を用いた以外は、前記＜本発明の取得方法による細胞外膜小胞の取得＞と同様の方法により、カルシウムイオン含有培養上清サンプル中の細胞外膜小胞を取得し、１％ ＳＤＳ水溶液又は１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液により細胞外膜小胞を溶出させ、上清（溶出液）を回収した。
尚、各実施例、比較例で用いた担体の種類、担体から細胞外膜小胞を取得するために用いた溶出液の種類、並びに後述するウエスタンブロッティングにおけるレーン番号を下記表１５に示す。
Figure 2021012200
＜ウエスタンブロッティング＞
「実施例１−８で得られた各上清（溶出液）７．５μＬ」の代わりに「実施例３４−３５、比較例１０−１３で得られた各上清（溶出液）７．５μＬ」を用いた以外は、実施例１−８の「（７）ウエスタンブロッティング」と同様の方法により行った。
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図９に示す。図９において、各レーンは以下の通りである。
レーン１：実施例３４の結果（本発明の取得方法により細胞外膜小胞を取得し、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン２：実施例３５の結果（本発明の取得方法により細胞外膜小胞を取得し、１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン３：比較例１０の結果（抗ＣＤ６３抗体法により細胞外膜小胞を取得し、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン４：比較例１１の結果（抗ＣＤ６３抗体法により細胞外膜小胞を取得し、１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン５：比較例１２の結果（Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ６３ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎにより細胞外膜小胞を取得し、１％ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン６：比較例１３の結果（Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ６３ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎにより細胞外膜小胞を取得し、１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
図９より、本発明の取得方法により細胞外膜小胞の取得を行った実施例３４−３５では、２５−６０ｋＤａ付近にエクソソームマーカーの一つであるＣＤ６３のバンドが得られた（実施例３４−３５：レーン１−２）。
一方、図９より、抗ＣＤ６３抗体法により細胞外膜小胞の取得を行った比較例１０−１１及びＥｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ６３ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎにより細胞外膜小胞の取得を行った比較例１２−１３では、２５−６０ｋＤａ付近にＣＤ６３のバンドは薄くしか得られなかった（比較例１０−１３：レーン３−６）。
以上から、本発明の取得方法によれば、抗ＣＤ６３抗体法やＥｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ６３ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ等の細胞外膜小胞の表面抗原タンパク質に対する抗体を用いて当該表面抗原タンパク質と抗体のアフィニティーによって細胞外膜小胞を取得する方法よりも多くの細胞外膜小胞を回収可能であることが判った。
実施例３６−３８．超遠心分離処理済試料からの本発明の取得方法による残存細胞外膜小胞の取得
以下のように、従来法である超遠心分離法（以下、超遠心分離処理と略記する場合がある）により細胞外膜小胞を除去・取得した試料に対して、本発明の取得方法を実施した。
＜（１）超遠心分離法による細胞外膜小胞の除去＞
ＦＢＳ（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）１５ｍＬを遠心分離処理（１００００×ｇ、２０分間）して不純物を分離し、上清を新しいチューブに移して遠心分離処理済みＦＢＳを得た。次いで、得られた遠心分離処理済みＦＢＳを５ｍＬずつ超遠心分離処理（１１００００×ｇ、一晩）又は超遠心分離処理（４５００００×ｇ、一晩）し、上清を新しいチューブに移して超遠心分離処理（１１００００×ｇ）済みＦＢＳ及び超遠心分離処理（４５００００×ｇ）済みＦＢＳを各５ｍＬ得た。
＜（２）ビーズの洗浄＞
１０μｇ／μＬ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）含有ＰＢＳ溶液１８０μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ １．８ｍｇ含有）を、３つのチューブにそれぞれ分注した。次いで、ＰＢＳ１５００μＬをチューブにそれぞれ加え、攪拌した後、チューブをそれぞれマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１を集合させ、チューブ内の溶液をピペットで捨てた（以下、洗浄操作と略記する場合がある）。
＜（３）Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のビーズへの固定＞
洗浄操作後のペレット状態のＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ １．８ｍｇに、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質３μｇを含有するＰＢＳ溶液１５００μＬをそれぞれ添加して、８℃で１０分間反応させ、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質が結合した担体（ｍＴｉｍ４担体）を含有するＰＢＳ溶液１５００μＬをそれぞれ得た。
＜（４）本発明の取得方法による細胞外膜小胞の取得＞
得られたｍＴｉｍ４担体１．８ｍｇをＰＢＳ１５００μＬでそれぞれ３回洗浄操作し、ペレット状態のｍＴｉｍ４担体を得た。その後、３本の１５ｍＬ遠沈管（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）に遠心分離処理済みＦＢＳ、超遠心分離処理（１１００００×ｇ）済みＦＢＳ、及び超遠心分離処理（４５００００×ｇ）済みＦＢＳ各５ｍＬをそれぞれ分注し、ペレット状態のｍＴｉｍ４担体を１．８ｍｇ添加し、８℃で２時間反応させた。反応後、１５ｍＬ遠沈管をそれぞれマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にｍＴｉｍ４担体を集合させ、各上清（各ＦＢＳ）を新しい１５ｍＬ遠沈管にそれぞれ回収した。遠沈管に残ったペレット状態のｍＴｉｍ４担体を、２ｍＭ ＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ， ０．０００５％ ｔｗｅｅｎ２０， ２ｍＭ ＣａＣｌ２）３ｍＬでそれぞれ洗浄操作後、ペレット状態のｍＴｉｍ４担体に２ｍＭ ＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔをそれぞれ１ｍＬ添加して懸濁し、１．５ｍＬチューブに懸濁液を全量移した後、それぞれ２回洗浄操作した。
ペレット状態のｍＴｉｍ４担体１．８ｍｇに溶出液として１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を５０μＬそれぞれ添加した後、ボルテックスミキサーにより室温で１０秒間混合し、スピンダウンした。１．５ｍＬチューブをそれぞれマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にｍＴｉｍ４担体を集合させ、溶出液を回収した。再度１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を５０μＬ添加し、前記で使用したｍＴｉｍ４担体を用いて同様の方法で溶出液を回収した。
その後、溶出液を２度回収した際に使用したビーズを、１５ｍＬ遠沈管に回収した各上清（各ＦＢＳ）に再度添加し、前記したのと同様の方法により、各上清（各ＦＢＳ）中の細胞外膜小胞を回収する操作をさらに２回繰り返し各溶出液をそれぞれ得た。
＜（５）ウエスタンブロッティング＞
得られた各溶出液１００μＬを３０μＬになるように、ＶＩＶＡＳＰＩＮ５００（ＭＶＣＯ１０，０００）（ザルトリウス社製）を用いて限外ろ過した。限外ろ過した各溶出液１５μＬに４×試料用緩衝液（和光純薬工業（株）製）５μＬを加えて９８℃で５分間加熱し、ウエスタンブロッティング用の各試料を得た。スーパーセップエース ５−２０％ゲル（和光純薬工業（株）製）に当該ウエスタンブロッティング用の各試料２０μＬを乗せて、２５ｍＡで６５分間電気泳動した。得られた泳動ゲルを、セミドライブロッターと不連続バッファー（Ａｎｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ １：０．３Ｍ Ｔｒｉｓ／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、Ａｎｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ ２：０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、Ｃａｔｈｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ：０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ／０．０４Ｍ アミノカプロン酸／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ）を用いて、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に１ｍＡ／ｃｍ２で６０分間転写した。転写後のＰＶＤＦ膜にＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ， ０．１％ ｔｗｅｅｎ２０）で希釈した３％スキムミルクを加えて１時間室温で反応させてブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔで１０００倍希釈した抗ウシＣＤ９抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製、以下「抗ウシＣＤ９抗体」と略記する場合がある）２ｍＬを室温で１時間反応させた。反応後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔで１００００倍希釈した２次抗体｛抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ウサギ、ＩｇＧ分画、ペルオキシダーゼ結合抗体｝（和光純薬工業（株）製）を室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄後、抗ウシＣＤ９抗体を反応させたメンブレンにイムノスターベーシック（和光純薬工業（株）製）を、抗Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ−２抗体を反応させたメンブレンにイムノスターゼータ（和光純薬工業（株）製）をそれぞれ添加し、ＬＡＳ−４０００（ＧＥ社製）を用いて発光シグナルを検出した。尚、抗ウシＣＤ９抗体と抗Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ−２抗体は、エクソソームのマーカータンパク質であるＣＤ９とＦｌｏｔｉｌｌｉｎ−２をそれぞれ認識する抗体である。
＜（６）平均粒子数及び平均粒子サイズの測定＞
得られた各溶出液１００μＬを遠心式フィルター（０．４５μｍ、ＰＶＤＦ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理後、水で５倍希釈し、ナノサイトＬＭ１０（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ社製）を用いて希釈液中に含まれる粒子についてＮａｎｏＳｉｇｈｔ社のマニュアルに従い各３回測定し、平均粒子数（Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）と平均粒子サイズ（Ｍｅａｎ Ｓｉｚｅ）を調べた。
尚、各実施例で用いた試料の処理方法、試料中に残存する細胞外膜小胞の取得方法等について下記表１６に示す。
Figure 2021012200
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図１０、ナノサイトによる平均粒子数及び平均粒子サイズの測定結果を表１７にそれぞれ示す。図１０において、各レーンは以下の結果である。
レーン１：実施例３６の結果（試料を遠心分離処理し、本発明の取得方法により細胞外膜小胞の取得をおこなった場合の結果）
レーン２：実施例３７の結果（試料を遠心分離処理し、１１００００×ｇで超遠心処理した後、本発明の取得方法により細胞外膜小胞の取得をおこなった場合の結果）
レーン３：実施例３８の結果（試料を遠心分離処理し、４５００００×ｇで超遠心処理した後、本発明の取得方法により細胞外膜小胞の取得をおこなった場合の結果）
図１０より、試料を遠心分離処理し、１１００００×ｇ又は４５００００×ｇで超遠心処理した後、本発明の取得方法により細胞外膜小胞の取得をおこなった場合（実施例３７−３８）にもエクソソームマーカーのＣＤ９とＦｌｏｔｉｌｌｉｎ−２のバンドが確認され、超遠心分離処理では試料中に含まれる細胞外膜小胞を除去（取得）しきれず、試料中には多量の細胞外膜小胞が残存することが判った（実施例３７−３８：レーン２−３）。さらに、これらの超遠心分離法では除去（取得）しきれず試料中に残存する細胞外膜小胞を、本発明の取得方法によって取得（除去）可能であることが判った（実施例３７−３８：レーン２−３）。
表１７より、試料を遠心分離処理し、１１００００×ｇ又は４５００００×ｇで超遠心処理した後、本発明の取得方法により細胞外膜小胞の取得をおこなった場合（実施例３７−３８）と試料を遠心分離処理した後、本発明の取得方法により細胞外膜小胞の取得をおこなった場合（実施例３６）とで、取得した細胞外膜小胞の大きさ（粒子径）はほぼ同じであった。よって、超遠心分離法では除去しきれない試料中に残存する細胞外膜小胞は断片化されておらず、粒子として存在していることが判った。
Figure 2021012200
実施例３９−４０．Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ポリマー沈殿）処理済試料からの本発明の取得方法による残存細胞外膜小胞の取得
以下のように、試料に含まれる細胞外膜小胞を従来法であるＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ポリマー沈殿）で除去（以下、「ポリマー沈殿処理」と略記する場合がある）により細胞外膜小胞を除去（取得）した試料に対して、本発明の取得方法を実施した。
＜（１）Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ポリマー沈殿）法による細胞外膜小胞の除去＞
ＦＢＳ（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）１０ｍＬを遠心分離処理（１００００×ｇ、２０分間）して不純物を分離し、遠心分離処理済みＦＢＳを得た。次いで、得られた遠心分離処理済みＦＢＳ５ｍＬにＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ｆｒｏｍ ｓｅｒｕｍ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１ｍＬ添加し、冷蔵で３０分間静置し、遠心分離処理（１００００×ｇ、２０分間）して上清を回収し、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ処理済みＦＢＳ６ｍＬを得た。
＜（２）ビーズの洗浄＞
１０μｇ／μＬ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）含有ＰＢＳ溶液１８０μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ １．８ｍｇ含有）を、２つのチューブにそれぞれ分注した。次いで、ＰＢＳ１５００μＬをチューブにそれぞれ加え、攪拌した後、チューブをそれぞれマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１を集合させ、チューブ内の溶液をピペットで捨てた（以下、洗浄操作と略記する場合がある）。
＜（３）Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のビーズへの固定＞
洗浄操作後のペレット状態のＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ １．８ｍｇに、実施例５−８と同様の方法により調製したＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質３μｇを含有するＰＢＳ溶液１５００μＬを添加して、８℃で１０分間反応させ、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質が結合した担体（ｍＴｉｍ４担体）を含有するＰＢＳ溶液１５００μＬをそれぞれ得た。
＜（４）本発明の取得方法による細胞外膜小胞の取得＞
得られたｍＴｉｍ４担体１．８ｍｇをＰＢＳ１５００μＬでそれぞれ３回洗浄操作し、ペレット状態のｍＴｉｍ４担体を得た。その後、ペレット状態のｍＴｉｍ４担体を１．８ｍｇずつ、１５ｍＬ遠沈管（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）に分注した遠心分離処理済みＦＢＳ５ｍＬ又はＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ処理済みＦＢＳ６ｍＬにそれぞれ添加し、８℃で２時間反応させた。
反応後、１５ｍＬ遠沈管をそれぞれマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にマウス由来Ｔｉｍ４担体を集合させ、各上清（各ＦＢＳ）を新しい１５ｍＬ遠沈管にそれぞれ回収した。遠沈管に残ったペレット状態のｍＴｉｍ４担体を、２ｍＭ ＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ， ０．０００５％ ｔｗｅｅｎ２０， ２ｍＭ ＣａＣｌ２）３ｍＬでそれぞれ洗浄操作後、ペレット状態のｍＴｉｍ４担体に２ｍＭ ＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔをそれぞれ１ｍＬ添加して懸濁し、１．５ｍＬチューブに懸濁液を全量移した後、それぞれ２回洗浄操作した。
ペレット状態の各ｍＴｉｍ４担体１．８ｍｇに溶出液として１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を５０μＬそれぞれ添加した後、ボルテックスミキサーにより室温で１０秒間混合し、スピンダウンした。１．５ｍＬチューブをそれぞれマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にｍＴｉｍ４担体を集合させ、溶出液を回収した。再度１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を５０μＬ添加し、前記で使用したｍＴｉｍ４担体を用いて同様の方法で溶出液を回収した。
その後、溶出液を２度回収した際に使用したｍＴｉｍ４担体（ビーズ）を、１５ｍＬ遠沈管に回収した
各上清（各ＦＢＳ）に再度添加し、前記したのと同様の方法により、各上清（各ＦＢＳ）中の細胞外膜小胞を回収する操作をさらに２回繰り返し各溶出液をそれぞれ得た。
＜（５）ウエスタンブロッティング＞
得られた各溶出液３００μＬを３０μＬになるように、ＶＩＶＡＳＰＩＮ５００（ＭＶＣＯ１０，０００）（ザルトリウス社製）を用いて限外ろ過した。限外ろ過した各溶出液３０μＬに４×試料用緩衝液（和光純薬工業（株）製）１０μＬを加えて９８℃で５分間加熱し、ウエスタンブロッティング用の各試料を得た。スーパーセップエース ５−２０％ゲル（和光純薬工業（株）製）に当該ウエスタンブロッティング用の各試料２０μＬを２ヶ所ずつ乗せて、２５ｍＡで６５分間電気泳動した。得られた泳動ゲルを、セミドライブロッターと不連続バッファー（Ａｎｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ １：０．３Ｍ Ｔｒｉｓ／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、Ａｎｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ ２：０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、Ｃａｔｈｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ：０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ／０．０４Ｍ アミノカプロン酸／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ）を用いて、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に１ｍＡ／ｃｍ２で６０分間転写した。転写後のＰＶＤＦ膜にＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ， ０．１％ ｔｗｅｅｎ２０）で希釈した３％スキムミルクを加えて１時間室温で反応させてブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔで１０００倍希釈した抗ウシＣＤ９抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製、以下「抗ウシＣＤ９抗体」と略記する場合がある）２ｍＬ又はＰＢＳ−Ｔで２５０倍希釈した抗ヒトＦｌｏｔｉｌｌｉｎ−２抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、以下「抗ヒトＦｌｏｔｉｌｌｉｎ−２抗体」と略記する場合がある）を室温で１時間反応させた。反応後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔで１００００倍希釈した２次抗体｛抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ウサギ、ＩｇＧ分画、ペルオキシダーゼ結合抗体｝（和光純薬工業（株）製）を室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄後、 抗ウシＣＤ９抗体を反応させたメンブレンにイムノスターベーシック（和光純薬工業（株）製）を、抗Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ−２抗体を反応させたメンブレンにイムノスターゼータ（和光純薬工業（株）製）をそれぞれ添加し、ＬＡＳ−４０００（ＧＥ社製）を用いて発光シグナルを検出した。尚、抗ウシＣＤ９抗体は、エクソソームのマーカータンパク質の１つであるＣＤ９に対する抗体であり、抗ヒトＦｌｏｔｉｌｌｉｎ−２抗体は、エクソソームのマーカータンパク質の１つであるＦｌｏｔｉｌｌｉｎ−２に対する抗体である。
尚、各実施例で用いた試料の処理方法、試料中に残存する細胞外膜小胞の取得方法並びにウエスタンブロッティングにおけるレーン番号について下記表１８に示す。
Figure 2021012200
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図１１に示す。図１１において、各レーンは以下の結果を表す。
レーン１：実施例３９の結果（試料を遠心分離処理した後、本発明の取得方法により細胞外膜小胞の取得をおこなった場合の結果）
レーン２：実施例４０の結果（試料を遠心分離処理し、ポリマー沈殿処理した後、本発明の取得方法により細胞外膜小胞の取得をおこなった場合の結果）
図１１より、試料を遠心分離処理し、ポリマー沈殿した後、本発明の取得方法により細胞外膜小胞の取得をおこなった場合（実施例４０）にもエクソソームマーカーのＣＤ９とＦｌｏｔｉｌｌｉｎ−２のバンドが確認されたことから、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ポリマー沈殿）法では試料中に含まれる細胞外膜小胞を除去（取得）しきれず、試料中には多量の細胞外膜小胞が残存することが判った（実施例４０：レーン２）。
さらに、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ポリマー沈殿）法では除去（取得）しきれず試料中に残存する細胞外膜小胞を、本発明の取得方法によっては取得可能であることが判った（実施例４０：レーン２）。
実施例４１−４７．本発明の除去方法及び／又は従来法（超遠心法、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ポリマー沈殿）法）による試料からの細胞外膜小胞の取得（除去）
以下のように、本発明の除去方法及び／又は従来法（超遠心法、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ポリマー沈殿）法）により試料から細胞外膜小胞を取得（除去）した。
＜（１）超遠心分離法による細胞外膜小胞の除去＞
ＦＢＳ（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）２８ｍＬを遠心分離処理（１００００×ｇ、２０分間）して不純物を分離し、遠心分離処理済みＦＢＳ（以下、「除去試料１」と略記する場合がある）を得た。次いで、得られた遠心分離処理済みＦＢＳ（「除去試料１」）１２ｍＬを超遠心分離処理（１１００００×ｇ、一晩）し、超遠心分離処理（１１００００×ｇ）済みＦＢＳ（以下、「除去試料２」と略記する場合がある）を得た。
＜（２）Ｔｏｔａｌ Ｅｘｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ポリマー沈殿）法による細胞外膜小胞の除去＞
次に、遠心分離処理済みＦＢＳ（「除去試料１」）８ｍＬにＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ｆｒｏｍ ｓｅｒｕｍ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１．６ｍＬ添加し、冷蔵で３０分間それぞれ静置し、遠心分離処理（１００００×ｇ、２０分間）してそれぞれ上清を回収し、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ処理済みＦＢＳ（以下、「除去試料３」と略記する場合がある）９．６ｍＬを得た。
また、超遠心分離処理（１１００００×ｇ）済みＦＢＳ（「除去試料２」）４ｍＬにＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎを０．８ｍＬ添加し、冷蔵で３０分間それぞれ静置し、遠心分離処理（１００００×ｇ、２０分間）してそれぞれ上清を回収し、超遠心分離処理（１１００００×ｇ）／Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ処理済みＦＢＳ（以下、「除去試料４」と略記する場合がある）４．８ｍＬを得た。
＜（３）ビーズの洗浄＞
１０μｇ／μＬ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）含有ＰＢＳ溶液２４０μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ ２．４ｍｇ含有）を、３本のチューブにそれぞれ分注した。次いで、ＰＢＳ２０００μＬをチューブにそれぞれ加え、攪拌した後、チューブをそれぞれマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１を集合させ、チューブ内の溶液をピペットで捨てた（以下、「洗浄操作」と略記する場合がある）。
＜（４）Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のビーズへの固定＞
洗浄操作後のペレット状態のＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ ２．４ｍｇに、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質４μｇを含有するＰＢＳ溶液２０００μＬをそれぞれ添加して、８℃で１０分間反応させ、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質が結合した担体（ｍＴｉｍ４担体）を含有するＰＢＳ溶液２０００μＬをそれぞれ得た。
＜（５）細胞外膜小胞の除去＞
得られたｍＴｉｍ４担体２．４ｍｇをＰＢＳ２０００μＬでそれぞれ３回洗浄操作し、ペレット状のｍＴｉｍ４担体をそれぞれ得た。
その後、遠心分離処理済みＦＢＳ（「除去試料１」）又は超遠心分離処理（１１００００×ｇ）済みＦＢＳ（「除去試料２」）４ｍＬ、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ処理済みＦＢＳ（「除去試料３」）４．８ｍＬをチューブにそれぞれ分注し、８℃で１時間それぞれ反応させた。反応後、チューブをそれぞれマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にｍＴｉｍ４担体を集合させ、各上清（各ＦＢＳ）を新しいチューブにそれぞれ回収した。
チューブに残ったペレット状態のｍＴｉｍ４担体を、ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ， ０．０００５％ ｔｗｅｅｎ２０）４ｍＬでそれぞれ３回洗浄操作後、各上清（各ＦＢＳ）をそれぞれ再度添加し、反応から洗浄までの操作をそれぞれ合計５回繰り返した。５回目の反応後、各上清（各ＦＢＳ）を新しいチューブに移して遠心分離処理（１００００×ｇ、２０分間）し、上清を回収し、超遠心分離処理（１１００００×ｇ）／Ｔｉｍ４処理済みＦＢＳ（以下、「除去試料５」と略記する場合がある）４ｍＬ、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ処理／Ｔｉｍ４処理済みＦＢＳ（以下、「除去試料６」と略記する場合がある）４．８ｍＬ、Ｔｉｍ４処理済みＦＢＳ（以下、「除去試料７）と略記する場合がある）４ｍＬを得た。
＜（６）本発明の取得方法による細胞外膜小胞の取得＞
前記方法と同様の方法により、新たにｍＴｉｍ４担体０．６ｍｇを７本分準備し、それぞれ洗浄操作を行った。下記表１９に記載の所定の除去試料を除去試料のマウス由来Ｔｉｍ４担体への添加量ずつそれぞれペレット状態のｍＴｉｍ４担体０．６ｍｇに添加し、８℃で３時間それぞれ反応させた。
Figure 2021012200
反応後、１．５ｍＬチューブをそれぞれマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にｍＴｉｍ４担体を集合させ、各上清（各ＦＢＳ）を回収し、ペレット状態のｍＴｉｍ４担体を得た。
得られたペレット状態のｍＴｉｍ４担体を２ｍＭ ＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ， ０．０００５％ ｔｗｅｅｎ２０， ２ｍＭ ＣａＣｌ２）１ｍＬでそれぞれ３回洗浄操作後、ペレット状態の各ｍＴｉｍ４担体０．６ｍｇに溶出液として１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を５０μＬそれぞれ添加し、ボルテックスミキサーにより室温で１０秒間混合し、スピンダウンした。１．５ｍＬチューブをそれぞれマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にｍＴｉｍ４担体を集合させ、溶出液をそれぞれ回収した。再度１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を５０μＬ添加し、同様の方法で溶出液をそれぞれ回収した。
＜（７）ウエスタンブロッティング＞
得られた各溶出液のうち１００μＬを３０μＬになるように、ＶＩＶＡＳＰＩＮ５００（ＭＶＣＯ１０，０００）（ザルトリウス社製）を用いて限外ろ過した。限外ろ過した各溶出液３０μＬに４×試料用緩衝液（和光純薬工業（株）製）１０μＬを加えて９８℃で５分間加熱し、ウエスタンブロッティング用の各試料を得た。スーパーセップエース ５−２０％ゲル（和光純薬工業（株）製）に当該ウエスタンブロッティング用の各試料２０μＬを２ヶ所ずつ乗せて、２５ｍＡで６５分間電気泳動した。得られた泳動ゲルを、セミドライブロッターと不連続バッファー（Ａｎｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ １：０．３Ｍ Ｔｒｉｓ／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、Ａｎｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ ２：０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、Ｃａｔｈｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ：０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ／０．０４Ｍ アミノカプロン酸／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ）を用いて、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に１ｍＡ／ｃｍ２で６０分間転写した。転写後のＰＶＤＦ膜にＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ， ０．１％ ｔｗｅｅｎ２０）で希釈した３％スキムミルクを加えて１時間室温で反応させてブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔで１０００倍希釈した抗ウシＣＤ９抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製、以下「抗ウシＣＤ９抗体」と略記する場合がある）２ｍＬ又はＰＢＳ−Ｔで２５０倍希釈した抗ヒトＦｌｏｔｉｌｌｉｎ−２抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、以下「抗ヒトＦｌｏｔｉｌｌｉｎ−２抗体」と略記する場合がある）を室温で１時間反応させた。反応後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔで１００００倍希釈した２次抗体｛抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ウサギ、ＩｇＧ分画、ペルオキシダーゼ結合抗体｝（和光純薬工業（株）製）を室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄後、抗ウシＣＤ９抗体を反応させたメンブレンにイムノスターベーシック（和光純薬工業（株）製）を、抗Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ−２抗体を反応させたメンブレンにイムノスターゼータ（和光純薬工業（株）製）をそれぞれ添加し、ＬＡＳ−４０００（ＧＥ社製）を用いて発光シグナルを検出した。尚、抗ウシＣＤ９抗体は、エクソソームのマーカータンパク質の１つであるＣＤ９に対する抗体であり、抗ヒトＦｌｏｔｉｌｌｉｎ−２抗体は、エクソソームのマーカータンパク質の１つであるＦｌｏｔｉｌｌｉｎ−２に対する抗体である。
尚、各実施例で用いた試料の処理方法、試料中に残存する細胞外膜小胞の取得（除去）方法、及び後述するウエスタンブロッティングにおけるレーン番号等について下記表２０に示す。
Figure 2021012200
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図１２に示す。図１２において、各レーンは以下の結果を表す。
レーン１：実施例４１の結果（試料を遠心分離処理し、超遠心分離処理し、さらに本発明の除去方法で処理した後、本発明の取得方法により細胞外膜小胞の取得をおこなった場合の結果）
レーン２：実施例４２の結果（試料を遠心分離処理し、ポリマー沈殿処理し、さらに本発明の除去方法で処理した後、本発明の取得方法により細胞外膜小胞の取得をおこなった場合の結果）
レーン３：実施例４３の結果（試料を遠心分離処理し、超遠心分離処理し、さらにポリマー沈殿処理した後、本発明の取得方法により細胞外膜小胞の取得をおこなった場合の結果）
レーン４：実施例４４の結果（試料を遠心分離処理し、超遠心分離処理し、本発明の取得方法により細胞外膜小胞の取得をおこなった場合の結果）
レーン５：実施例４５の結果（試料を遠心分離処理し、ポリマー沈殿処理し、本発明の取得方法により細胞外膜小胞の取得をおこなった場合の結果）
レーン６実施例４６の結果（試料を遠心分離処理し、本発明の除去方法で処理した後、本発明の取得方法により細胞外膜小胞の取得をおこなった場合の結果）
レーン７実施例４７の結果（試料を遠心分離処理した後、本発明の取得方法により細胞外膜小胞の取得をおこなった場合の結果）
図１２より、従来法である超遠心法、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ポリマー沈殿）法ではエクソソームマーカーであるＣＤ９とＦｌｏｔｉｌｌｉｎ−２のバンドが確認され、試料中に含まれる細胞外膜小胞を除去しきれず、試料中には多量の細胞外膜小胞が残存することが判った（実施例４４−４５：レーン４−５）。また、例えこれらの従来法を組み合わせたとしても、ＣＤ９とＦｌｏｔｉｌｌｉｎ−２のバンドが確認され、細胞外膜小胞を十分に除去することができずに残存してしまうことが判る（実施例４３：レーン３）。これに対して、従来法である超遠心法又はＴｏｔａｌ Ｅｘｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ポリマー沈殿）法と本発明の除去方法を組み合わせることにより、ＣＤ９とＦｌｏｔｉｌｌｉｎ−２のバンドは確認されず、従来法のみでは除去しきれない試料中の細胞外膜小胞を、除去（取得）可能であることが判った（実施例４１−４２：レーン１−２）。さらには、本発明の方法のみでも、ＣＤ９とＦｌｏｔｉｌｌｉｎ−２のバンドは確認されず、十分に細胞外膜小胞を除去（取得）可能であることが判った（実施例４６：レーン６）。また、本発明の除去（取得）方法によれば、ウイルスについても細胞外膜小胞と同様に除去可能であることが示唆された。
実施例４８−５５．本発明の除去方法における本発明のＴｉｍ担体の再利用
以下のように、本発明のＴｉｍ担体を用いて本発明の除去方法を繰り返した。
＜（１）試料の準備＞
ＦＢＳ（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）１ｍＬを遠心分離処理（１００００×ｇ、２０分間）して不純物を分離し、遠心分離処理済みＦＢＳ１ｍＬを得た。
＜（２）ビーズの洗浄＞
１０μｇ／μＬ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）含有ＰＢＳ溶液６０μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ ０．６ｍｇ含有）を、１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）に分注した。次いで、ＰＢＳ５００μＬを１．５ｍＬチューブにそれぞれ加え、攪拌した後、１．５ｍＬチューブをマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１を集合させ、１．５ｍＬチューブ内の溶液をピペットで捨てた（以下、洗浄操作と略記する場合がある）。
＜（３）Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のビーズへの固定＞
洗浄操作後のペレット状態のＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ ０．６ｍｇに、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質１μｇを含有するＰＢＳ溶液５００μＬを添加して、８℃で１０分間反応させ、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質が結合した担体（ｍＴｉｍ４担体）を含有するＰＢＳ溶液５００μＬを得た。
＜（４）本発明の除去方法による細胞外膜小胞の除去＞
１．５ｍＬチューブをマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にｍＴｉｍ４担体を集合させ、 １．５ｍＬチューブ内の溶液をピペットで捨てた後、ｍＴｉｍ４担体をＰＢＳ５００μＬでそれぞれ３回洗浄操作しペレット状態のｍＴｉｍ４担体を得た。その後、ペレット状態のｍＴｉｍ４担体に、遠心分離処理済みＦＢＳを１ｍＬ加え、８℃で１時間反応させた。
反応後、１．５ｍＬチューブをマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にｍＴｉｍ４担体を集合させ、上清（ＦＢＳ）を新しい１．５ｍＬチューブに回収した（上清１とする）。ペレット状態のｍＴｉｍ４担体を、２ｍＭ ＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ， ０．０００５％ ｔｗｅｅｎ２０， ２ｍＭ ＣａＣｌ２）５００μＬで３回洗浄操作した。
ペレット状態の各ｍＴｉｍ４担体０．６ｍｇに溶出液として１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を５０μＬ添加した後、ボルテックスミキサーにより室温で１０秒間混合し、スピンダウンした。１．５ｍＬチューブをマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にｍＴｉｍ４担体を集合させ、溶出液を回収した（溶出液１とする）。当該ｍＴｉｍ４担体に再度１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を５０μＬ添加し、同様の方法で溶出液を回収した（溶出液２とする）。得られた溶出液１と溶出液２を混合し、除去試料８を得た。
前記上清１を溶出操作後（溶出液２を得る溶出操作後）のｍＴｉｍ４担体に再度添加し、上清１中の細胞外膜小胞を回収する操作を合計で８回繰り返し各溶出液をそれぞれ得た。
得られた除去試料及び後述するウエスタンブロッティングにおけるレーン番号は下記表２１に記載の通り。
Figure 2021012200
＜（５）ウエスタンブロッティング＞
得られた各溶出液１００μＬを３０μＬになるように、ＶＩＶＡＳＰＩＮ５００（ＭＶＣＯ１０，０００）（ザルトリウス社製）を用いて限外ろ過した。限外ろ過した各溶出液１５μＬに４×試料用緩衝液（和光純薬工業（株）製）５μＬを加えて９８℃で５分間加熱し、ウエスタンブロッティング用の各試料を得た。スーパーセップエース ５−２０％ゲル（和光純薬工業（株）製）に当該ウエスタンブロッティング用の各試料２０μＬを乗せて、２５ｍＡで６５分間電気泳動した。得られた泳動ゲルを、セミドライブロッターと不連続バッファー（Ａｎｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ １：０．３Ｍ Ｔｒｉｓ／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、Ａｎｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ ２：０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、Ｃａｔｈｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ：０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ／０．０４Ｍ アミノカプロン酸／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ）を用いて、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に１ｍＡ／ｃｍ２で６０分間転写した。転写後のＰＶＤＦ膜にＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ， ０．１％ ｔｗｅｅｎ２０）で希釈した３％スキムミルクを加えて１時間室温で反応させてブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔで１０００倍希釈した抗ウシＣＤ９抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製、以下「抗ウシＣＤ９抗体」と略記する場合がある）２ｍＬを室温で１時間反応させた。反応後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔで１００００倍希釈した２次抗体｛抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ウサギ、ＩｇＧ分画、ペルオキシダーゼ結合抗体｝（和光純薬工業（株）製）を室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄後、イムノスターゼータ（和光純薬工業（株）製）を添加し、ＬＡＳ−４０００（ＧＥ社製）を用いて発光シグナルを検出した。尚、抗ウシＣＤ９抗体は、エクソソームのマーカータンパク質の１つであるＣＤ９に対する抗体である。
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図１３に示す。図１３において、各レーンは以下の結果を表す。
レーン１：実施例４８の結果（試料中の細胞外膜小胞を未使用の本発明のＴｉｍ４担体を用いて本発明の取得除去により除去した場合の結果）
レーン２：実施例４９の結果（１度使用した試料中の細胞外膜小胞を１度使用した本発明のＴｉｍ４担体を用いて本発明の取得除去により除去した場合の結果）
レーン３：実施例５０の結果（２度使用した試料中の細胞外膜小胞を２度使用した本発明のＴｉｍ４担体を用いて本発明の取得除去により除去した場合の結果）
レーン４：実施例５１の結果（３度使用した試料中の細胞外膜小胞を３度使用した本発明のＴｉｍ４担体を用いて本発明の取得除去により除去した場合の結果）
レーン５：実施例５２の結果（４度使用した試料中の細胞外膜小胞を４度使用した本発明のＴｉｍ４担体を用いて本発明の取得除去により除去した場合の結果）
レーン６：実施例５３の結果（５度使用した試料中の細胞外膜小胞を５度使用した本発明のＴｉｍ４担体を用いて本発明の取得除去により除去した場合の結果）
レーン７：実施例５４の結果（６度使用した試料中の細胞外膜小胞を６度使用した本発明のＴｉｍ４担体を用いて本発明の取得除去により除去した場合の結果）
レーン８：実施例５５の結果（７度使用した試料中の細胞外膜小胞を７度使用した本発明のＴｉｍ４担体を用いて本発明の取得除去により除去した場合の結果）
図１３より、本発明のＴｉｍ４担体を繰り返し使用して除去操作を行った場合、試料から回収されるエクソソームの量が少なくなることが確認され、本発明のＴｉｍ４担体を繰り返し利用することで、細胞外膜小胞の除去をより確実に行うことができることが判った。また、カルシウムイオンキレート剤であるＥＤＴＡを用いて担体に結合したＴｉｍ４タンパク質と試料中の細胞外膜小胞との複合体から細胞外膜小胞を分離することにより、本発明のＴｉｍ４担体は再利用可能であることが判った。
実施例５６−６７．比較例１４−１５．Ｔｉｍファミリータンパク質を固定化した担体による細胞外膜小胞の取得
以下のように、ＴｉｍファミリーであるＴｉｍ１タンパク質、Ｔｉｍ３タンパク質、又はＴｉｍ４タンパク質をそれぞれビーズへ固定化した担体を用いて、本発明に係る細胞外膜小胞の取得を行った。
＜（１）カルシウムイオン含有培養上清（原液）の調製＞
細胞外膜小胞を分泌するヒト慢性骨髄性白血病株Ｋ５６２細胞１×１０７細胞を８０ｍＬのＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２条件下で３日間培養した後、遠心分離処理（３００×ｇ、５分間）して細胞を沈殿させ、上清を除去した。沈殿した細胞を、１０μＭモネンシンナトリウム（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）含有Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地６０ｍＬで懸濁後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。
その後、培養液を遠心分離処理（３００×ｇ、５分間）し、培養上清を回収した。回収した培養上清６０ｍＬをさらに３回遠心分離処理（１回目：３００×ｇ、３分間、２回目：１２００×ｇ、２０分間、３回目：１００００×ｇ、２０分間）して不純物を分離し、上清を得た（以下、「培養上清（原液）」と略記する場合がある）を得た。
また、得られた培養上清原液に終濃度が２ｍＭとなるようにＣａＣｌ２を添加し、２ｍＭＣａＣｌ２含有Ｋ５６２細胞培養上清濃縮液サンプル（以下、「カルシウムイオン含有培養上清（原液）」と略記する場合がある）を得た。
＜（２）ビーズの洗浄＞
３０μｇ／μＬ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）含有ＰＢＳ−Ｔ溶液２０μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧ ０．６ｍｇ含有）を、１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）７本にそれぞれ移し、それぞれ洗浄操作をした。
＜（３）Ｆｃタグ融合型Ｔｉｍタンパク質のビーズへの固定＞
洗浄操作後のペレット状態のＤｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉＧ ０．６ｍｇを含有する１．５ｍＬチューブに、Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ１タンパク質、Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ３タンパク質、Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質、Ｆｃタグ融合型ヒト由来Ｔｉｍ１タンパク質、Ｆｃタグ融合型ヒト由来Ｔｉｍ３タンパク質、又はＦｃタグ融合型ヒト由来Ｔｉｍ４タンパク質（すべて和光純薬工業（株）製）を１μｇ含有するＴＢＳ溶液２００μＬをそれぞれ添加して、８℃で１時間反応させ、Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質結合担体、Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ３タンパク質結合担体、Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質結合担体、Ｆｃタグ融合型ｈＴｉｍ１タンパク質結合担体、Ｆｃタグ融合型ｈＴｉｍ３タンパク質結合担体、及びＦｃタグ融合型ｈＴｉｍ４タンパク質結合担体をそれぞれ得た。尚、これらの得られた６種類の担体を下記表２２に示す。これらをまとめて「Ｔｉｍタンパク質結合担体」と略記する場合がある。
Figure 2021012200
＜（４）本発明の方法による細胞外膜小胞の取得＞
前記で得られた６種類のＴｉｍタンパク質結合担体をそれぞれＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）５００μＬで３回、ＴＢＳ５００μＬで２回洗浄操作し、ペレット状態のＴｉｍタンパク質結合担体を得た。次いで、ペレット状態のＴｉｍタンパク質結合担体及び洗浄操作のみを行ったＤｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧ（以下、「Ｔｉｍタンパク質非結合担体」と略記する場合がある）に、前記（１）で調製したカルシウムイオン含有培養上清（原液）１ｍＬをそれぞれ加え、８℃で３時間それぞれ反応させた。
その後、反応後のＴｉｍタンパク質結合担体又はＴｉｍタンパク質非結合担体を、カルシウムイオン含有ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、０．０００５％ Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ ＣａＣｌ２）５００μＬでそれぞれ３回洗浄操作した。３回目の洗浄操作の時に、Ｔｉｍタンパク質結合担体又はＴｉｍタンパク質非結合担体を含むＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔ溶液５００μＬを、２５０μＬずつ１．５ｍＬチューブ２本にそれぞれ分注し、チューブを磁気スタンドにセットした後、洗浄液を除いた。。
ペレット状態のＴｉｍタンパク質結合担体又はＴｉｍタンパク質非結合担体０．３ｍｇにそれぞれ溶出液として１％ＳＤＳ水溶液を５０μＬ、又は１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を２５μＬ添加した後、ボルテックスミキサーにより室温で１０秒間混合し、スピンダウンした。ＥＤＴＡを添加したチューブには再度１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を２５μＬ添加し、同様の操作を行い、各上清（溶出液）を得た。
＜（５）ウエスタンブロッティング＞
前記（４）で得られた各上清（各溶出液）１１．２５μＬに４×試料用緩衝液（和光純薬工業（株）製）３．７５μＬを加えて９５℃で３分間加熱し、ウエスタンブロッティング用の各試料を得た。スーパーセップエース ５−２０％ゲル（和光純薬工業（株）製）に当該ウエスタンブロッティング用の各試料１５μＬを載せて、３０ｍＡで６０分間電気泳動した。得られた泳動ゲルを、セミドライブロッターと不連続バッファー（Ａｎｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ １：０．３Ｍ Ｔｒｉｓ／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、Ａｎｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ ２：０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、Ｃａｔｈｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ：０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ／０．０４Ｍ アミノカプロン酸／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ）を用いて、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に１ｍＡ／ｃｍ２で６０分間転写した。転写後のＰＶＤＦ膜にＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒ， ０．１％ ｔｗｅｅｎ２０）で希釈した５％スキムミルクを加えて１時間室温で反応させてブロッキングし、ＴＢＳ−Ｔで２５０倍希釈した抗ヒトＬａｍｐ−１抗体（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、２５０倍希釈した抗ヒトＦｌｏｔｉｌｌｉｎ−２抗体（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）２ｍＬを室温で１時間反応させた。反応後のＰＶＤＦ膜をＴＢＳ―Ｔで３回洗浄し、ＴＢＳ―Ｔで５０００倍希釈した２次抗体｛抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）， ウサギ，ＩｇＧ画分、ペルオキシダーゼ結合抗体｝（和光純薬工業（株）製）を室温で１時間反応させた。ＴＢＳ―Ｔで５回洗浄後、各抗体を反応させたＰＶＤＦ膜にイムノスターゼータ（和光純薬工業（株）製）を添加し、ＬＡＳ−４０００（ＧＥ社製）を用いて発光シグナルを検出した。
尚、各実施例、比較例で用いたＴｉｍタンパク質及び担体の種類、並びにＴｉｍタンパク質（非）結合担体から細胞外膜小胞を取得するために用いた溶出液の種類を下記表２３に示す。
Figure 2021012200
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図１４に示す。図１４において、各レーンは以下の通りである。
レーン１：比較例１４の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇの磁性ビーズのみの担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン２：比較例１５の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇの磁性ビーズのみの担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン３：実施例５６の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇにヒト由来Ｔｉｍ１タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン４：実施例５７の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇにヒト由来Ｔｉｍ１タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン５：実施例５８の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇにマウス由来Ｔｉｍ１タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン６：実施例５９の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇにマウス由来Ｔｉｍ１タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン７：実施例６０の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇにヒト由来Ｔｉｍ３タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン８：実施例６１の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇにヒト由来Ｔｉｍ３タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン９：実施例６２の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇにマウス由来Ｔｉｍ３タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン１０：実施例６３の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇにマウス由来Ｔｉｍ３タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン１１：実施例６４の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇにヒト由来Ｔｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン１２：実施例６５の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇにヒト由来Ｔｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン１３：実施例６６の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇにマウス由来Ｔｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン１４：実施例６７の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇにマウス由来Ｔｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
図１４より、レーン３−１４において、エクソソームのマーカータンパク質であるＬａｍｐ−１又はＦｌｏｔｉｌｌｉｎ−２のバンドが認められていることから、Ｔｉｍ１タンパク質、Ｔｉｍ３タンパク質又はＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体（本発明のＴｉｍタンパク質結合担体）を用いることで、タンパク質の由来や溶出方法に関わらず、細胞外膜小胞を取得可能であることが判った。
また、ＳＤＳにより溶出させる場合、Ｔｉｍ４タンパク質を結合させた担体＞Ｔｉｍ１タンパク質を結合させた担体＞Ｔｉｍ３タンパク質を結合させた担体の順でより多くの細胞外膜小胞を取得できることが判った。
実施例６８−７９．Ｔｉｍタンパク質を固定化した担体による細胞外膜小胞の取得
ビオチン標識したＴｉｍ１タンパク質、ビオチン標識したＴｉｍ３タンパク質又はビオチン標識したＴｉｍ４タンパク質をそれぞれ固定化した担体を用いて、本発明に係る細胞外膜小胞の取得を行った。
＜（１）培養上清サンプルの調製＞
実施例５０−６７、比較例１４−１５の「（１）カルシウムイオン含有培養上清（原液）の調製」と同様の方法により行い、カルシウムイオン含有培養上清（原液）を得た。
＜（２）Ｆｃタグ融合型Ｔｉｍ１タンパク質のＳＨ基ビオチン標識＞
Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ１タンパク質（和光純薬工業（株）製）含有ＰＢＳ溶液２００μＬ（Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ１タンパク質２０μｇ含有）を、ビオチン化標識用キット−ＳＨ（同仁化学研究所製）を用いて、当該キットに添付されているプロトコールにしたがってＦｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ１タンパク質のＳＨ基をビオチン標識し、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質含有ＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
＜（３）Ｆｃタグ融合型Ｔｉｍ３タンパク質のＳＨ基ビオチン標識＞
Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ３タンパク質（和光純薬工業（株）製）含有ＰＢＳ溶液２００μＬ（Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ３タンパク質２０μｇ含有）を、ビオチン化標識用キット−ＳＨ（同仁化学研究所製）を用いて、当該キットに添付されているプロトコールにしたがってＦｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ３タンパク質のＳＨ基をビオチン標識し、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ３タンパク質含有ＰＢＳ溶液２００μＬを得た。
＜（４）Ｆｃタグ融合型Ｔｉｍ４タンパク質のＳＨ基ビオチン標識＞
Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質（和光純薬工業（株）製）含有ＰＢＳ溶液１００μＬ（Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質１０μｇ含有）を、ビオチン化標識用キット−ＳＨ（同仁化学研究所製）を用いて、当該キットに添付されているプロトコールにしたがってＦｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のＳＨ基をビオチン標識し、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液１００μＬを得た。
＜（５）タグ融合Ｔｉｍタンパク質の希釈＞
Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質（和光純薬工業（株）製）含有ＰＢＳ溶液１０μＬ（Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質１μｇ含有）を、ＴＢＳ１９０μＬと混合し、ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質を１μｇ含有する溶液２００μＬを得た。
前記（２）で調製したＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質含有ＴＢＳ溶液１１．５μＬ（ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質１μｇ含有）をＴＢＳ１８８．５μＬと混合し、ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質を１μｇ含有する溶液２００μＬを得た。
Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ３タンパク質（和光純薬工業（株）製）含有ＰＢＳ溶液１０μＬ（Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ３タンパク質１μｇ含有）を、ＴＢＳ１９０μＬと混合し、ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ３タンパク質を１μｇ含有する溶液２００μＬを得た。
前記（３）で調製したＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ３タンパク質含有ＴＢＳ溶液９．０μＬ（ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ３タンパク質１μｇ含有）をＴＢＳ１９１．０μＬと混合し、ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ３タンパク質を１μｇ含有する溶液２００μＬを得た。
Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質（和光純薬工業（株）製）含有ＰＢＳ溶液１０μＬ（Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１μｇ含有）を、ＴＢＳ１９０μＬと混合し、ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有する溶液２００μＬを得た。
前記（４）で調製したＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＴＢＳ溶液１０μＬ（ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１μｇ含有）をＴＢＳ１９０μＬと混合し、ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有する溶液２００μＬを得た。
＜（６）ビーズの洗浄＞
３０μｇ／μＬ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）含有ＰＢＳ−Ｔ溶液２０μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧ ０．６ｍｇ含有）を、１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）６本にそれぞれ移し、それぞれ洗浄操作をした。
また、１０μｇ／μＬ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｂｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）含有ＰＢＳ溶液６０μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｂｉｄｉｎ Ｃ１ ０．６ｍｇ含有）を、１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）にそれぞれ分注し、ＴＢＳ５００μＬを用いて前記と同様に洗浄操作を行った。
＜（７）Ｆｃタグ融合型Ｔｉｍタンパク質のビーズへの固定＞
洗浄操作後のペレット状態のＤｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉＧ ０．６ｍｇを含有する１．５ｍＬチューブ６本に、ＳＨ基ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質を１μｇ含有する溶液２００μＬ、ＳＨ基ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ３タンパク質を１μｇ含有する溶液２００μＬ、又はＳＨ基ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有する溶液２００μＬをそれぞれ添加して、８℃で１時間反応させ、ＳＨ基ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１が結合した担体（「ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１担体」と略記する場合がある）、ＳＨ基ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ３が結合した担体（「ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ３担体」と略記する場合がある）、ＳＨ基ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４が結合した担体（「ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４担体」と略記する場合がある）をそれぞれ得た。
また、洗浄操作後のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｂｉｄｉｎ Ｃ１ ０．６ｍｇを含有する１．５ｍＬチューブに、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質を１μｇ含有する溶液２００μＬ、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ３タンパク質を１μｇ含有する溶液２００μＬ、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有する溶液２００μＬを加え、前記と同様にビーズに結合させ、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１が結合した担体（「ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１担体」と略記する場合がある）、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型Ｔｉｍ３が結合した担体（「ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ３担体」と略記する場合がある）、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型Ｔｉｍ４が結合した担体（「ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４担体」と略記する場合がある）をそれぞれ得た。
尚、これらの得られた６種類の担体をまとめて「Ｔｉｍタンパク質結合担体」と略記する場合がある。
＜（８）本発明の取得方法による細胞外膜小胞の取得＞
前記で得られたこれらのＴｉｍタンパク質結合担体をＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）５００μＬで３回、ＴＢＳ５００μＬで２回それぞれ洗浄操作し、ペレット状態のＴｉｍタンパク質結合担体を得た。次いで、得られた６種類のペレット状態のＴｉｍタンパク質結合担体に、カルシウムイオン含有培養上清（原液）１ｍＬをそれぞれ加え、８℃で３時間それぞれ反応させた。その後、反応後のＴｉｍタンパク質結合担体を、カルシウムイオン含有ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、０．０００５％ Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ ＣａＣｌ２）５００μＬでそれぞれ３回洗浄操作した。３回目の洗浄操作の時に、Ｔｉｍタンパク質結合担体を含むＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔ溶液５００μＬを２５０μＬずつ１．５ｍＬチューブ２本にそれぞれ分注し、チューブを磁気スタンドにセットした後、洗浄液を除いた。
ペレット状態の６種類のＴｉｍタンパク質結合担体０．３ｍｇにそれぞれ溶出液として１％ＳＤＳ水溶液を５０μＬ、又は１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を２５μＬ添加した後、ボルテックスミキサーにより室温で１０秒間混合し、スピンダウンした。ＥＤＴＡを添加したチューブには再度１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を２５μＬ添加し、同様の操作を行い、溶出液を得た。
尚、各実施例で用いたＴｉｍタンパク質及び担体の種類、並びにＴｉｍタンパク質（非）結合担体の種類を下記表２４に示す。
Figure 2021012200
＜（９）ウエスタンブロッティング＞
実施例５６−６７の＜（５）ウエスタンブロッティング＞において「前記（４）で得られた各溶出液１１．２５μＬ」の代わりに前記（６）で得られた各溶出液１１．２５μＬを使用し、２次抗体として「２次抗体｛抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）， ウサギ，ＩｇＧ画分、ペルオキシダーゼ結合抗体｝（和光純薬工業（株）製）」の代わりにＴＢＳ―Ｔで３００００倍希釈した「２次抗体｛抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）， ロバ，ＩｇＧ画分、ペルオキシダーゼ結合抗体｝（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）」を用いた以外は、実施例５６−６７の「（５）ウエスタンブロッティング」と同様の方法により行った。
尚、各実施例で用いたＴｉｍタンパク質及び担体の種類、Ｔｉｍタンパク質（非）結合担体から細胞外膜小胞を取得するために用いた溶出液の種類、並びにウエスタンブロッティングにおけるレーン番号を下記表２５に示す。
Figure 2021012200
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図１５に示す。図１５において、各レーンは以下の結果である。
レーン１：実施例６８の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにＳＨ基ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン２：実施例６９の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにＳＨ基ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン３：実施例７０の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２７０ ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎにＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン４：実施例７１の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２７０ ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎにＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン５：実施例７２の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにＳＨ基ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ３タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン６：実施例７３の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにＳＨ基ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ３タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン７：実施例７４の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２７０ ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎにＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ３タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン８：実施例７５の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２７０ ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎにＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ３タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン９：実施例７６の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにＳＨ基ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン１０：実施例７７の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにＳＨ基ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１％ １ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン１１：実施例７８の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２７０ ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎにＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン１２：実施例７９の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２７０ ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎにＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
図１５より、レーン１−１２において、いずれの場合でもエクソソームのマーカータンパク質であるＬａｍｐ−１のバンドが認められたことから、Ｔｉｍ１、Ｔｉｍ３、又はＴｉｍ４を結合させた担体（Ｔｉｍタンパク質結合担体）を用いることで、細胞外膜小胞を取得可能であることが判った。
また、Ｔｉｍ４タンパク質が結合した担体＞Ｔｉｍ１タンパク質が結合した担体＞Ｔｉｍ３タンパク質が結合した担体の順でより多くの細胞外膜小胞を取得できることが判った。カルシウムキレート剤により溶出させる場合には、Ｔｉｍ４タンパク質のＳＨ基を介してビーズ（担体）に固定化させることで、タグを介して固定化させるよりも多くの細胞外膜小胞を取得できることが判った（レーン９−１２）。
実施例８０−８３．比較例１６−１９．Ｔｉｍファミリータンパク質を固定化した担体による細胞外膜小胞の取得
Ｔｉｍファミリータンパク質としてＴｉｍ１タンパク質、Ｔｉｍ２タンパク質、又はＴｉｍ４タンパク質をそれぞれビーズへ固定化した担体を用いて、本発明に係る細胞外膜小胞の取得を行った。
＜（１）カルシウムイオン含有培養上清サンプルの調製＞
実施例１−８の「（１）培養上清サンプルの調製」と同様の方法でカルシウムイオン含有培養上清サンプルを得た。
＜（２）ビーズの洗浄＞
３０μｇ／μＬ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）含有ＰＢＳ−Ｔ溶液２０μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧ ４．８ｍｇ含有）を、１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）４本にそれぞれ分注し、それぞれ洗浄操作をした。
＜（３）６×Ｈｉｓタグ融合型Ｔｉｍファミリータンパク質のビーズへの固定＞
洗浄操作後のペレット状態のＤｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉＧ ０．６ｍｇを含有する１．５ｍＬチューブ４本に、抗６×Ｈｉｓ抗体（クローンＮｏ．２８−７５、和光純薬工業社製）を４μｇ含有するＴＢＳ溶液１００μＬをそれぞれ添加して、８℃で３０分間それぞれ反応させ、抗６×Ｈｉｓ抗体が結合した担体を含有するＴＢＳ溶液１００μＬを得た。これらの抗６×Ｈｉｓ抗体が結合した担体をＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）２５０μＬでそれぞれ３回洗浄操作し、その後ＴＢＳ ２５０μＬでそれぞれ２回洗浄操作した。
次いで、洗浄操作後の抗６×Ｈｉｓ抗体結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧ担体に、６×Ｈｉｓタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ１タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を１μｇ含有するＴＢＳ溶液１００μＬ、６×Ｈｉｓタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ２タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を１μｇ含有するＴＢＳ溶液１００μＬ、又は６×Ｈｉｓタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を１μｇ含有するＴＢＳ溶液１００μＬをそれぞれ添加して、８℃で１時間それぞれ反応させ、抗６×Ｈｉｓ抗体を介してＴｉｍ１タンパク質が結合した担体（「６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質結合担体」と略記する場合がある）、Ｔｉｍ２タンパク質が結合した担体（「６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ２タンパク質結合担体」と略記する場合がある）、Ｔｉｍ４タンパク質が結合した担体（「６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質結合担体」と略記する場合がある）をそれぞれ得た。
尚、得られた６×Ｈｉｓ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質結合担体及び６×Ｈｉｓ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質結合担体を纏めて「Ｔｉｍタンパク質結合担体」と略記する場合がある。
各実施例で用いたＴｉｍタンパク質及び担体の種類、並びにＴｉｍファミリータンパク質（非）結合担体の種類を下記表２６に示す。
Figure 2021012200
＜（４）本発明の取得方法による細胞外膜小胞の取得＞
前記（３）で得られた抗６×Ｈｉｓ抗体結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧ担体、６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質結合担体、６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ２タンパク質結合担体、６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ２タンパク質結合担体をＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）２５０μＬで３回、ＴＢＳ ２５０μＬで２回それぞれ洗浄操作し、ペレット状態の各担体を得た。その後、ペレット状態の各担体に、カルシウムイオン含有培養上清サンプル２００μＬをそれぞれ加え、８℃で３時間それぞれ反応させた。反応後の各担体を、カルシウムイオン含有ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、０．０００５％ Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ ＣａＣｌ２）５００μＬで３回洗浄操作した。３回目の洗浄操作の時に、各担体を含むＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔ溶液５００μＬを、２５０μＬずつ１．５ｍＬチューブ２本にそれぞれ分注し、チューブを磁気スタンドにセットした後、洗浄液を除いた。
ペレット状態の各担体０．３ｍｇずつにそれぞれ溶出液として１％ＳＤＳ水溶液を５０μＬ、又は１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を２５μＬ添加した後、ボルテックスミキサーにより室温で１０秒間混合し、スピンダウンした。ＥＤＴＡを添加したチューブには再度１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を２５μＬ添加し、同様の操作を行い、溶出液を得た。
＜（５）ウエスタンブロッティング＞
前記（４）で得られた各溶出液１１．２５μＬを用いた以外は、実施例６８−７９の「（７）ウエスタンブロッティング」と同様の方法により行った。
尚、各実施例で用いたＴｉｍファミリータンパク質及び担体の種類、Ｔｉｍタンパク質（非）結合担体から細胞外膜小胞を取得するために用いた溶出液の種類、並びにウエスタンブロッティングにおけるレーン番号を下記表２７に示す。
Figure 2021012200
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図１６に示す。図１６において、各レーンは以下の結果を表す。
レーン１：比較例１６の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇに抗６×Ｈｉｓ抗体を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果） レーン２：比較例１７の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇに抗６×Ｈｉｓ抗体を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン３：実施例８０の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇに抗６×Ｈｉｓ抗体を介して６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン４：実施例８１の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇに抗６×Ｈｉｓ抗体を介して６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン５：比較例１８の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇに抗６×Ｈｉｓ抗体を介して６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ２タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン６：比較例１９の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇに抗６×Ｈｉｓ抗体を介して６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ２タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン７：実施例８２の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇに抗６×Ｈｉｓ抗体を介して６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン８：実施例８３の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇに抗６×Ｈｉｓ抗体を介して６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
図１６より、６×Ｈｉｓタグ融合型Ｔｉｍ２タンパク質を結合させた場合は、いずれの溶出法でもエクソソームマーカータンパク質のＬａｍｐ−１のバンドが認められなかった（レーン５−６）。一方、６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質、又は６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体は、いずれの溶出法でもエクソソームのマーカータンパク質である抗Ｌａｍｐ−１のバンドが認められた（レーン３−４、レーン７−８）。この結果から、Ｔｉｍ２タンパク質を固定化した担体では、細胞外膜小胞を取得不可能であることが判った。
また、ＳＤＳにより溶出させる場合には、Ｔｉｍ４タンパク質を結合させた担体＞Ｔｉｍ１タンパク質を結合させた担体の順でより多くの細胞外膜小胞を取得できることが判った。
実施例８４−９５．比較例２０−２１．Ｔｉｍタンパク質を固定化した担体によるウイルスの取得
以下のように、Ｔｉｍタンパク質としてＴｉｍ１タンパク質、Ｔｉｍ３タンパク質又はＴｉｍ４タンパク質をそれぞれビーズへ固定化した担体を用いて、本発明に係るウイルスの取得を行った。
＜（１）コトランスフェクション細胞培養上清の調製＞
２５ｃｍ２フラスコに播いた１．０×１０６ｃｅｌｌｓのＳｆ９細胞に、マウスＩＬ２３発現ベクターＤＮＡ 約２μｇ、Ｌｉｎｅａｒ ＡｃＮＰＶ ＤＮＡ ９０ｎｇ、及びＴｒａｎｓＩＴ−Ｉｎｓｅｃｔ（Ｍｉｒｕｓ社）３μＬを含むＰＳＦＭ−Ｊ１培地（和光純薬工業社製）１００μＬを加えた。２８℃で７日間培養後、培養上清（コトランスフェクション溶液）を回収した。
＜（２）バキュロウイルス含有昆虫細胞培養上清サンプルの調製＞
１．５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＰＳＦＭ−Ｊ１培地で希釈したＳｆ９細胞を５０ｍＬ用意した。これに前記コトランスフェクション溶液を培養液の１／２００量加え、１３０ｒｐｍ、２７℃で振盪培養した。７２時間後に細胞培養液を回収し、３，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離後、沈殿と上清に分画した。得られた上清をｍｏｕｓｅ ＩＬ２３を発現する組換えバキュロウイルス溶液（以下、「バキュロウイルス溶液」と略記する場合がある）とした。
また、得られたバキュロウイルス溶液に終濃度が２ｍＭとなるようにＣａＣｌ２を添加し、２ｍＭＣａＣｌ２含有バキュロウイルス溶液（以下、「カルシウムイオン含有バキュロウイルス溶液」と略記する場合がある）を得た。
＜（３）ビーズの洗浄＞
実施例５６−６７及び比較例１４−１５の「（２）ビーズの洗浄」と同様の方法で行った。
＜（４）Ｆｃタグ融合型Ｔｉｍタンパク質のビーズへの固定＞
実施例５６−６７及び比較例１４−１５の「（３）Ｆｃタグ融合型Ｔｉｍタンパク質のビーズへの固定」と同様の方法で行い、下記表２８に示す通り６種のＴｉｍタンパク質結合担体を得た。
Figure 2021012200
＜（５）本発明の方法によるバキュロウイルスの取得＞
「カルシウムイオン含有の培養上清サンプル１ｍＬ」の代わりに「前記（２）で調製したカルシウムイオン含有バキュロウイルス溶液１ｍＬ」を用いた以外は、実施例５６−６７及び比較例１４−１５の「（４）本発明の方法による細胞外膜小胞の取得」と同様に行い、各溶出液を得た。
＜（６）ウエスタンブロッティング＞
「ＴＢＳ−Ｔで２５０倍希釈した抗ヒトＬａｍｐ−１抗体（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、２５０倍希釈した抗ヒトＦｌｏｔｉｌｌｉｎ−２抗体（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）２ｍＬ」の代わりに「ＴＢＳ−Ｔで５００倍希釈した抗バキュロウイルスｇｐ６４抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）」を用いた以外は、実施例５６−６７及び比較例１４−１５の「（５）ウエスタンブロッティング」と同様の方法で行った。
尚、各実施例、比較例で用いたＴｉｍタンパク質及び担体の種類、Ｔｉｍタンパク質（非）結合担体から細胞外膜小胞を取得するために用いた溶出液の種類、並びにウエスタンブロッティングにおけるレーン番号を下記表２９に示す。
Figure 2021012200
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図１７に示す。図１７において、各レーンは以下の結果を表す。
レーン１：比較例２０の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇの磁性ビーズのみの担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン２：比較例２１の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇの磁性ビーズのみの担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン３：実施例８４の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにｈＴｉｍ１タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン４：実施例８５の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにｈＴｉｍ１タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン５：実施例８６の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにｍＴｉｍ１タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン６：実施例８７の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにｍＴｉｍ１タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン７：実施例８８の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにｈＴｉｍ３タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン８：実施例８９の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにｈＴｉｍ３タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン９：実施例９０の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにｍＴｉｍ３タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン１０：実施例９１の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにｍＴｉｍ３タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン１１：実施例９２の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにｈＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン１２：実施例９３の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにｈＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン１３：実施例９４の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにｍＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン１４：実施例９５の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにｍＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
図１７より、レーン３−１４において、バキュロウイルスのマーカータンパク質ｇｐ６４のバンドが認められていることから、Ｔｉｍ１タンパク質、Ｔｉｍ３タンパク質、又はＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体（Ｔｉｍタンパク質結合担体）を用いることで、Ｔｉｍタンパク質の由来や溶出方法にかかわらずバキュロウイルスを取得可能であることが判った。
また、ＳＤＳにより溶出させる場合には、Ｔｉｍ３タンパク質を結合させた担体とＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体が同程度であり、次いでＴｉｍ１タンパク質を結合させた担体の順でより多くのウイルスを取得できることが判った。
カルシウムイオンキレート剤を用いて溶出させる場合には、Ｔｉｍ３タンパク質を結合させた担体が最も多く、次いでＴｉｍ１タンパク質を結合させた担体とＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体の順でより多くのウイルスを取得できることが判った。
実施例９６−９９．比較例２２−２５．Ｔｉｍファミリータンパク質を固定化した担体によるウイルスの取得
以下のように、Ｔｉｍファミリータンパク質として、Ｔｉｍ１タンパク質、Ｔｉｍ２タンパク質、又はＴｉｍ４タンパク質をそれぞれビーズへ固定化した担体を用いて、本発明に係るウイルスの取得を行った。
＜（１）コトランスフェクション細胞培養上清の調製＞
実施例８４−９５、比較例２０−２１の「（１）コトランスフェクション細胞培養上清の調製」と同様に行った。
＜（２）カルシウムイオン含有バキュロウイルス含有昆虫細胞培養上清サンプルの調製＞
実施例８４−９５、比較例２０−２１の「（２）バキュロウイルス含有昆虫細胞培養上清サンプルの調製」と同様の方法でカルシウムイオン含有バキュロウイルス溶液得た。
＜（３）ビーズの洗浄＞
３０μｇ／μＬ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）含有ＰＢＳ−Ｔ溶液２０μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧ ４．８ｍｇ含有）を、１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）４本にそれぞれ分注し、それぞれ洗浄操作をした。
＜（４）６×Ｈｉｓタグ融合型Ｔｉｍファミリータンパク質のビーズへの固定＞
実施例８０−８３及び比較例１６−１９の「（３）６×Ｈｉｓタグ融合型Ｔｉｍファミリータンパク質のビーズへの固定」と同様に行い、６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質結合担体、６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ２タンパク質結合担体、６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質結合担体をそれぞれ得た。
各実施例で用いたＴｉｍファミリータンパク質及び担体の種類、並びにＴｉｍファミリータンパク質（非）結合担体の種類を下記表３０に示す。
Figure 2021012200
＜（５）本発明の取得方法によるバキュロウイルスの取得＞
「カルシウムイオン含有培養上清サンプル２００μＬ」の代わりに前記（２）で調製した
「カルシウムイオン含有バキュロウイルス溶液２００μＬ」を用いた以外は、実施例８０−８３及び比較例１６−１９の「（４）本発明の取得方法による細胞外膜小胞の取得」と同様の方法で行い、溶出液を得た。
＜（６）ウエスタンブロッティング＞
「得られた各溶出液１１．２５μＬに４×試料用緩衝液（和光純薬工業（株）製）３．７５μＬを加え」た代わりに「前記（５）本発明の取得方法によるバキュロウイルスの取得で得られた各溶出液３μＬに４×試料用緩衝液（和光純薬工業（株）製）１μＬを加え」、「ウエスタンブロッティング用の各試料１５μＬ」の代わりに「ウエスタンブロッティング用の各試料４μＬ」を使用し、「抗Ｌａｍｐ−１抗体」の代わりに「抗バキュロウイルスｇｐ６４抗体」を用いた以外は、実施例８０−８３及び比較例１６−１９の「（５）ウエスタンブロッティング」と同様の方法で行った。
尚、各実施例で用いたＴｉｍファミリータンパク質及び担体の種類、Ｔｉｍファミリータンパク質（非）結合担体から細胞外膜小胞を取得するために用いた溶出液の種類、並びにウエスタンブロッティングにおけるレーン番号を下記表３１に示す。
Figure 2021012200
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図１８に示す。図１８において、各レーンは以下の結果を示す。
レーン１：比較例２２の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇに抗６×Ｈｉｓタグ抗体を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン２：比較例２３の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇに抗６×Ｈｉｓタグ抗体を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン３：実施例９６の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇに抗６×Ｈｉｓタグ抗体を介して６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン４：実施例９７の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇに抗６×Ｈｉｓタグ抗体を介して６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン５：比較例２４の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇに抗６×Ｈｉｓタグ抗体を介して６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ２タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン６：比較例２５の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇに抗６×Ｈｉｓタグ抗体を介して６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ２タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン７：実施例９８の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇに抗６×Ｈｉｓタグ抗体を介して６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン８実施例９９の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇに抗６×Ｈｉｓタグ抗体を介して６×Ｈｉｓタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
図１８より、Ｔｉｍ２タンパク質を結合させた場合は、いずれの溶出法でもバキュロウイルスのマーカータンパク質ｇｐ６４のバンドは認められなかった（レーン５−６）。一方、Ｔｉｍ１タンパク質、又はＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体は、いずれの溶出法でもｇｐ６４のバンドが認められた（レーン３−４、レーン７−８）。
この結果から、Ｔｉｍ２タンパク質を固定化した担体では、バキュロウイルスを取得不可能であることが判った。
実施例１００−１０５．比較例２６−３３．ＰＳタンパク質を用いたＥＬＩＳＡによる細胞外膜小胞の検出における感度比較
以下のように、ＰＳタンパク質又はエクソソームの表面マーカータンパク質（以下、「マーカータンパク質」と略記する場合がある）に対する抗体を固定化したプレート（ウェル）及びＨＲＰ標識抗ＣＤ６３抗体を検出抗体に用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、Ｋ５６２細胞培養上清由来の細胞外膜小胞を検出した。
＜（１）培養上清（原液）の調製＞
細胞外膜小胞を分泌するヒト慢性骨髄性白血病株Ｋ５６２細胞１×１０７細胞を８０ｍＬのＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２条件下で３日間培養した後、遠心分離処理（３００×ｇ、５分間）して細胞を沈殿させ、上清を除去した。沈殿した細胞を、１０μＭモネンシンナトリウム（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）含有Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地６０ｍＬで懸濁後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。
その後、培養液を遠心分離処理（３００×ｇ、５分間）し、培養上清を回収した。回収した培養上清６０ｍＬをさらに３回遠心分離処理（１回目：３００×ｇ、３分間、２回目：１２００×ｇ、２０分間、３回目：１００００×ｇ、２０分間）して不純物を分離し、上清を得た（以下、「培養上清（原液）」と略記する場合がある）を得た。
＜（２）カルシウムイオン含有Ｋ５６２細胞培養上清超遠心沈殿画分希釈系列の調製＞
前記（１）で得られた培養上清原液１０ｍＬを遠心分離処理（１００００×ｇ、２０分間）して不純物を分離し、上清を新しいチューブに移して遠心分離処理済みＫ５６２細胞培養上清１０ｍＬを得た。次いで、得られた遠心分離処理済みＫ５６２細胞培養上清１０ｍＬを超遠心分離処理（１１００００×ｇ、７０分間）し、上清を除いた後、沈殿にＴＢＳを１０ｍＬ加え懸濁した。懸濁液を超遠心分離処理（１１００００×ｇ、７０分間）し、上清を除いた後、沈殿にＴＢＳを２００μＬ加え懸濁し、Ｋ５６２細胞培養上清超遠心沈殿画分を得た。Ｋ５６２細胞培養上清超遠心沈殿画分のタンパク質濃度を、プロテインアッセイＢＣＡキット（和光純薬工業（株）製）を用いて当該キットに添付されているプロトコールに従って測定した。タンパク質濃度が１２５、２５０、５００、１０００、２０００ｎｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ２ｍＭＣａＣｌ２含有ＴＢＳで希釈し、カルシウムイオン含有Ｋ５６２細胞培養上清超遠心沈殿画分希釈系列を調製した。
＜（３）ＨＲＰ標識抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体の調製＞
抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体Ｈ５Ｃ６（ＢＤバイオサイエンス社製）１００μＬ（５０μｇ）を、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（（株）同仁化学研究所製）を用いて、当該キットに添付されているプロトコールに従ってＨＲＰ標識し、ＨＲＰ標識抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体２００μＬを得た。得られた標識体にグリセロール２００μＬを添加混合し、ＨＲＰ標識抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体保存液とし−２０℃で保存した。ＨＲＰ標識抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体保存液を２ｍＭＣａＣｌ２含有ＴＢＳで２０００倍希釈し、ＨＲＰ標識抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体希釈液を調製した。
＜（４）ＰＳタンパク質及び抗マーカータンパク質抗体の固定化溶液の調製＞
以下の通りに、各種ＰＳタンパク質及び抗マーカータンパク質抗体の固定化溶液を調製した。抗ＣＤ９マウスモノクローナル抗体Ｍ−Ｌ１３（ＢＤバイオサイエンス社製）１６μＬ（８μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液７８４μＬを混合し、抗ＣＤ９抗体固定化溶液８００μＬを調製した。抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体Ｈ５Ｃ６（ＢＤバイオサイエンス社製）１６μＬ（８μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液７８４μＬを混合し、抗ＣＤ６３抗体固定化溶液８００μＬを調製した。抗ＣＤ８１マウスモノクローナル抗体ＪＳ−８１（ＢＤバイオサイエンス社製）１６μＬ（８μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液７８４μＬを混合し、抗ＣＤ８１抗体固定化溶液８００μＬを調製した。Ｈｉｓタグ融合型マウスＭＦＧ−Ｅ８タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）８０μＬ（８μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液７２０μＬを混合し、ｍＭＦＧ−Ｅ８固定化溶液８００μＬを調製した。Ｈｉｓタグ融合型ヒトＭＦＧ−Ｅ８タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）８０μＬ（８μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液７２０μＬを混合し、ｈＭＦＧ−Ｅ８固定化溶液８００μＬを調製した。Ｈｉｓタグ融合型ヒトＡｎｎｅｘｉｎＶタンパク質（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭａｒｔ社製）４０μＬ（８μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液７６０μＬを混合し、ｈＡｎｎｅｘｉｎＶ固定化溶液８００μＬを調製した。Ｆｃタグ融合型マウスＴｉｍ１タンパク質（和光純薬工業（株）製）３２μＬ（８μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液７６８μＬを混合し、ｍＴｉｍ１固定化溶液８００μＬを調製した。Ｈｉｓタグ融合型マウスＴｉｍ２タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）８０μＬ（８μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液７２０μＬを混合し、ｍＴｉｍ２固定化溶液８００μＬを調製した。Ｆｃタグ融合型マウスＴｉｍ３タンパク質（和光純薬工業（株）製）３２μＬ（８μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液７６８μＬを混合し、ｍＴｉｍ３固定化溶液８００μＬを調製した。Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質（和光純薬工業（株）製）３２μＬ（８μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液７６８μＬを混合し、ｍＴｉｍ４固定化溶液８００μＬを調製した。Ｆｃタグ融合型ヒトＴｉｍ１タンパク質（和光純薬工業（株）製）３２μＬ（８μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液７６８μＬを混合し、ｈＴｉｍ１固定化溶液８００μＬを調製した。Ｆｃタグ融合型ヒトＴｉｍ３タンパク質（和光純薬工業（株）製）３２μＬ（８μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液７６８μＬを混合し、ｈＴｉｍ３固定化溶液８００μＬを調製した。Ｆｃタグ融合型ヒトＴｉｍ４タンパク質（和光純薬工業（株）製）３２μＬ（８μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液７６８μＬを混合し、ｈＴｉｍ４固定化溶液８００μＬを調製した。
＜（５）ＥＬＩＳＡ測定＞
Ｉｍｍｕｎｏ−ｐｌａｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｃ９６（Ｎｕｎｃ社製）にＰＳタンパク質の固定化溶液又は抗マーカータンパク質抗体の固定化溶液を１ウェルあたり１００μＬずつタンパク質１種について６ウェルに分注し、８℃で一晩静置した。分注液を除去した後、ブロッキング溶液（２５％ブロックエース含有ＴＢＳ）を各ウェルに３００μＬずつ添加し、プレートミキサーを用いて５００ｒｐｍで混合しながら室温で１時間反応した。ブロッキング溶液を除去した後、得られた各ＰＳタンパク質又は抗マーカータンパク質抗体を固定化したウェルに対してタンパク質濃度がそれぞれ１２５、２５０、５００、１０００、２０００ｎｇ／ｍＬであるカルシウムイオン含有Ｋ５６２細胞培養上清超遠心沈殿画分希釈系列各１００μＬをそれぞれ１ウェルずつ５ウェルに、ブランクとして２ｍＭＣａＣｌ２含有ＴＢＳ １００μＬを１ウェルにそれぞれ添加し、プレートミキサーを用いて５００ｒｐｍで混合しながら室温で１時間反応した。２ｍＭＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔ ３００μＬで３回洗浄した後、ＨＲＰ標識抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体希釈液１００μＬを各ウェルに添加し、プレートミキサーを用いて５００ｒｐｍで混合しながら室温で１時間反応した。２ｍＭＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔ ３００μＬで５回洗浄した後、ＴＭＢ溶液（和光純薬工業（株）製）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で３０分間静置反応した。１Ｍ ＨＣｌ １００μＬを添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダーＴｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ（Ｔｅｃａｎ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
尚、各実施例、比較例でプレートに固定化したタンパク質及び検出の可否（結果）を下記表３２に示す。
Figure 2021012200
＜結果＞
得られたＥＬＩＳＡ測定の結果を図１９に示す。図１９はＰＳタンパク質又は抗マーカータンパク質抗体を固定化したウェルにおける、カルシウムイオン含有Ｋ５６２細胞培養上清超遠心沈殿画分の各タンパク質濃度希釈系列に含まれるエクソソームに対し結合したＨＲＰ標識抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体由来の検出シグナル（４５０ｎｍの吸光度）をそれぞれあらわす。横軸はウェルに固定化したＰＳタンパク質又は抗マーカータンパク質抗体の種類を表し、同じＰＳタンパク質等を固定化したウェルについての検出結果においては用いたカルシウムイオン含有Ｋ５６２細胞培養上清超遠心沈殿画分中のタンパク質濃度が左から順に０、１２５、２５０、５００、１０００、２０００ｎｇ／ｍＬである。また、縦軸はＫ５６２細胞培養上清超遠心沈殿画分の各タンパク質濃度希釈系列に含まれるエクソソームに対し結合したＨＲＰ標識抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体由来の検出シグナルを表す。
Ｔｉｍ１タンパク質、Ｔｉｍ３タンパク質、又はＴｉｍ４タンパク質をそれぞれ固定化したウェルでは、抗マーカータンパク質抗体である抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体又は抗ＣＤ８１抗体をそれぞれ固定化したウェル、ＰＳタンパク質であるＭＦＧ−Ｅ８、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖを固定化したウェル、Ｔｉｍファミリータンパク質であるＴｉｍ２タンパク質を固定化したウェルに比べ（比較例２７−３３）高感度に細胞外膜小胞を検出できた（実施例１００−１０５）。即ち、従来法に比べ本発明に係るＴｉｍタンパク質を用いる本発明の検出方法は高感度に細胞外膜小胞を検出できることが判った。とりわけ、Ｔｉｍタンパク質のうち、Ｔｉｍ４タンパク質を用いると特に高感度に細胞外膜小胞を検出できることが判った。
実施例１０６−１０９．Ｔｉｍタンパク質の固定化方法の違いによるＥＬＩＳＡによる細胞外膜小胞の検出における感度比較
以下のように、Ｔｉｍ１タンパク質又はＴｉｍ４タンパク質をそれぞれ直接プレートに固定化した場合と、ＳＨ基をビオチン標識したＴｉｍ１タンパク質又はＳＨ基をビオチン標識したＴｉｍ４タンパク質を、ストレプトアビジンを介してプレートにそれぞれ固定化した場合との細胞外膜小胞の検出感度を比較した。
＜（１）Ｋ５６２細胞培養上清超遠心沈殿画分の調製＞
「タンパク質濃度が１２５、２５０、５００、１０００、２０００ｎｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ２ｍＭＣａＣｌ２含有ＴＢＳで希釈した」代わりに「タンパク質濃度が５００、１０００ｎｇ／ｍＬとなるように２ｍＭＣａＣｌ２含有ＴＢＳでそれぞれ希釈」した以外は、実施例１００−１０５及び比較例２６−３３の「（２）カルシウムイオン含有Ｋ５６２細胞培養上清超遠心沈殿画分の調製」と同様の方法により、カルシウムイオン含有Ｋ５６２細胞培養上清超遠心沈殿画分希釈系列を調製した。
＜（２）ＨＲＰ標識抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体の調製＞
実施例１００−１０５及び比較例２６−３３の「（３）ＨＲＰ標識抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体の調製」と同様の方法により、ＨＲＰ標識抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体希釈液を調製した。
＜（３）Ｔｉｍ１タンパク質及びＴｉｍ４タンパク質のビオチン標識・固定化溶液の調製＞
Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ１タンパク質（和光純薬工業（株）製）４０μＬ（１０μｇ）及びＦｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質（和光純薬工業（株）製）４０μＬ（１０μｇ）を、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ（（株）同仁化学研究所製）を用いて、当該キットに添付されているプロトコールに従ってそれぞれビオチン標識し、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質及びＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を得た。ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質及びＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質のタンパク質濃度を、プロテインアッセイＢＣＡキット（和光純薬工業（株）製）を用いて当該キットに添付されているプロトコールに従ってそれぞれ測定した。タンパク質濃度が５μｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳで希釈し、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質及びＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質溶液をそれぞれ調製した。
Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ１タンパク質（和光純薬工業（株）製）又はＦｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質（和光純薬工業（株）製）８μＬ（２μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液３９２μＬを混合し、ｍＴｉｍ１タンパク質固定化溶液又はｍＴｉｍ４タンパク質固定化溶液４００μＬをそれぞれ調製した。
また、ストレプトアビジン（和光純薬工業（株）製）２μＬ（１０μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液９９８μＬを混合し、ストレプトアビジン固定化溶液１０００μＬを調製した。
＜（４）固定化＞
Ｉｍｍｕｎｏ−ｐｌａｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｃ９６（Ｎｕｎｃ社製）に各タンパク質固定化溶液を１ウェルあたり１００μＬ（０．５μｇ）ずつ３ウェルに添加し、８℃で一晩静置した。添加液を除去した後、ブロッキング溶液（２５％ブロックエース含有ＴＢＳ）を各ウェルに３００μＬずつ添加し、プレートミキサーを用いて５００ｒｐｍで混合しながら室温で１時間反応させた。
また、Ｉｍｍｕｎｏ−ｐｌａｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｃ９６（Ｎｕｎｃ社製）にストレプトアビジン固定化溶液を１ウェルあたり１００μＬずつ６ウェルに添加し、８℃で一晩静置した。添加液を除去した後、ブロッキング溶液（２５％ブロックエース含有ＴＢＳ）を各ウェルに３００μＬずつ添加し、プレートミキサーを用いて５００ｒｐｍで混合しながら室温で１時間反応した。ブロッキング溶液を除去した後、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ１タンパク質及びＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質溶液を１ウェルあたり１００μＬ（０．５μｇ）ずつ３ウェルに添加し、プレートミキサーを用いて５００ｒｐｍで混合しながら室温で１時間反応させた。
＜（５）ＥＬＩＳＡ測定＞
「各ＰＳタンパク質又はマーカータンパク質を固定化したウェルに対してタンパク質濃度がそれぞれ１２５、２５０、５００、１０００、２０００ｎｇ／ｍＬであるカルシウムイオン含有Ｋ５６２細胞培養上清超遠心沈殿画分希釈系列各１００μＬをそれぞれ１ウェルずつ５ウェルに」それぞれ添加した代わりに「各タンパク質固定化ウェルに対してタンパク質濃度が５００又は１０００ｎｇ／ｍＬであるカルシウムイオン含有Ｋ５６２細胞培養上清超遠心沈殿画分希釈系列各１００μＬをそれぞれ１ウェルずつ２ウェルに」それぞれ添加した以外は、実施例１００−１０５及び比較例２６−３３と同様の方法により、ＥＬＩＳＡ測定を行った。
尚、各実施例、比較例でプレートに固定化したタンパク質、プレートへのタンパク質の固定化方法、及び検出の可否（結果）を下記表３３に示す。表３３中の検出の可否は、それぞれ実施例１０６と１０７、実施例１０８と１０９との比較である。
Figure 2021012200
得られたＥＬＩＳＡ測定の結果を図２０に示す。図２０はｍＴｉｍ１タンパク質を直接プレートに固定化したウェル、ｍＴｉｍ４タンパク質を直接プレートに固定化したウェル、ｍＴｉｍ１タンパク質をビオチン−ストレプトアビジン結合により固定化したウェル、及びｍＴｉｍ４タンパク質をビオチン−ストレプトアビジン結合により固定化したウェルにおける、カルシウムイオン含有Ｋ５６２細胞培養上清超遠心沈殿画分の各タンパク質濃度希釈系列に含まれるエクソソームに結合するＨＲＰ標識抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体由来の検出シグナル（４５０ｎｍの吸光度）をあらわす。
横軸はウェルに固定化したＴｉｍタンパク質の種類を表す。また、縦軸はカルシウムイオン含有Ｋ５６２細胞培養上清超遠心沈殿画分の各タンパク質濃度希釈系列に含まれるエクソソームに対し結合したＨＲＰ標識抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体由来の検出シグナルを表す。
図２０より、Ｔｉｍ１タンパク質又はＴｉｍ４タンパク質を用いたＥＬＩＳＡによれば、プレートに対するＴｉｍタンパク質の固定化方法にかかわらず、試料中の細胞外膜小胞を検出できることが判った（実施例１０６−１０９）。とりわけ、Ｔｉｍタンパク質を直接固定化したウェル（ｍＴｉｍ１をプレートに直接固定化した実施例１０６）及びｍＴｉｍ４をプレートに直接固定化した固定化した実施例１０８）に比べ、Ｔｉｍタンパク質を、ストレプトアビジンを介して固定化したウェル（ｍＴｉｍ１のＳＨ基のビオチンとストレプトアビジンとの結合によってプレートとＴｉｍタンパク質とを結合させた実施例１０７及びｍＴｉｍ４のＳＨ基のビオチンとストレプトアビジンとの結合によってプレートとＴｉｍタンパク質とを結合させた実施例１０９）では高感度に細胞外膜小胞を検出できた。
よって、Ｔｉｍタンパク質と固相との結合様式としては、Ｔｉｍタンパク質のＳＨ基のビオチンとストレプトアビジンとの結合によってプレートとＴｉｍタンパク質とを結合させる場合がより好ましいことが判った。
実施例１１０−１１５．比較例３４−３９．ＰＳタンパク質を用いたＥＬＩＳＡによるウィルスの検出における感度比較
以下のように、各種ＰＳタンパク質又はバキュロウィルスの表面マーカータンパク質ｇｐ６４に対する抗体を固定化したプレート及びＨＲＰ標識抗ｇｐ６４抗体を検出抗体に用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、バキュロウィルス含有昆虫細胞培養上清サンプル中のバキュロウィルスを検出した。
＜（１）コトランスフェクション細胞培養上清の調製＞
実施例８４−９５、比較例２０−２１の「（１）コトランスフェクション細胞培養上清の調製」と同様に行った。
＜（２）カルシウムイオン含有バキュロウイルス含有昆虫細胞培養上清サンプルの調製＞
実施例８４−９５、比較例２０−２１の「（２）バキュロウイルス含有昆虫細胞培養上清サンプルの調製」と同様に行いカルシウムイオン含有バキュロウイルス溶液を得た。
＜（３）バキュロウイルス含有昆虫細胞培養上清サンプル希釈系列の調製＞
バキュロウィルス含有昆虫細胞培養上清サンプル５０μＬとＰＳＦＭ−Ｊ１培地４９５０μＬを混合し１００倍希釈液を調製し、１００倍希釈液２．０ｍＬとＰＳＦＭ−Ｊ１培地２．０ｍＬを混合し２００倍希釈液４．０ｍＬを調製し、２００倍希釈液２．０ｍＬとＰＳＦＭ−Ｊ１培地２．０ｍＬを混合し４００倍希釈液を４．０ｍＬ調製し、４００倍希釈液２．０ｍＬとＰＳＦＭ−Ｊ１培地２．０ｍＬを混合し８００倍希釈液４．０ｍＬを調製した。
＜（４）ＨＲＰ標識抗ｇｐ６４マウスモノクローナル抗体の調製＞
抗ｇｐ６４マウスモノクローナル抗体ＡｃＶ１（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇａｃａｌｓ社製）２００μＬ（１００μｇ）を、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（（株）同仁化学研究所製）を用いて、当該キットに添付されているプロトコールに従ってＨＲＰ標識し、ＨＲＰ標識抗ｇｐ６４マウスモノクローナル抗体溶液２００μＬを得た。ＨＲＰ標識抗ｇｐ６４マウスモノクローナル抗体溶液を２ｍＭＣａＣｌ２含有ＴＢＳで１０００倍希釈し、ＨＲＰ標識抗ｇｐ６４マウスモノクローナル抗体希釈液を調製した。
＜（５）ＰＳタンパク質及び抗ｇｐ６４抗体の固定化溶液の調製＞
以下の通りに、各種ＰＳタンパク質及びマーカータンパク質の固定化溶液をそれぞれ調製した。抗ｇｐ６４マウスモノクローナル抗体ＡｃＶ１（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）１２μＬ（６μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液５８８μＬを混合し、抗ｇｐ６４抗体固定化溶液６００μＬを調製した。Ｈｉｓタグ融合型マウス由来ＭＦＧ−Ｅ８タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）６０μＬ（６μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液５４０μＬを混合し、ｍＭＦＧ−Ｅ８固定化溶液６００μＬを調製した。Ｈｉｓタグ融合型ヒト由来ＭＦＧ−Ｅ８タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）６０μＬ（６μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液５４０μＬを混合し、ｈＭＦＧ−Ｅ８固定化溶液６００μＬを調製した。Ｈｉｓタグ融合型ヒト由来ＡｎｎｅｘｉｎＶタンパク質（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭａｒｔ社製）３０μＬ（６μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液５７０μＬを混合し、ｈＡｎｎｅｘｉｎＶ固定化溶液６００μＬを調製した。Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ１タンパク質（和光純薬工業（株）製）２４μＬ（６μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液５７６μＬを混合し、ｍＴｉｍ１固定化溶液６００μＬを調製した。Ｈｉｓタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ２タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）６０μＬ（６μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液５４０μＬを混合し、ｍＴｉｍ２固定化溶液６００μＬを調製した。Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ３タンパク質（和光純薬工業（株）製）２４μＬ（６μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液５７６μＬを混合し、ｍＴｉｍ３固定化溶液６００μＬを調製した。Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質（和光純薬工業（株）製）２４μＬ（６μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液５７６μＬを混合し、ｍＴｉｍ４固定化溶液６００μＬを調製した。Ｆｃタグ融合型ヒト由来Ｔｉｍ１タンパク質（和光純薬工業（株）製）２４μＬ（６μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液５７６μＬを混合し、ｈＴｉｍ１固定化溶液６００μＬを調製した。Ｆｃタグ融合型ヒト由来Ｔｉｍ３タンパク質（和光純薬工業（株）製）２４μＬ（６μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液５７６μＬを混合し、ｈＴｉｍ３固定化溶液６００μＬを調製した。Ｆｃタグ融合型ヒト由来Ｔｉｍ４タンパク質（和光純薬工業（株）製）２４μＬ（６μｇ）と５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）溶液５７６μＬを混合し、ｈＴｉｍ４固定化溶液６００μＬを調製した。
＜（６）ＥＬＩＳＡ測定＞
Ｉｍｍｕｎｏ−ｐｌａｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｃ９６（Ｎｕｎｃ社製）にＰＳタンパク質又は抗ｇｐ６４抗体の固定化溶液を１ウェルあたり１００μＬずつタンパク質１種について５ウェルに分注し、８℃で一晩静置した。分注液を除去した後、ブロッキング溶液（２５％ブロックエース含有ＴＢＳ）を各ウェルに３００μＬずつ添加し、プレートミキサーを用いて５００ｒｐｍで混合しながら室温で１時間反応した。ブロッキング溶液を除去した後、得られた各ＰＳタンパク質又は抗ｇｐ６４抗体を固定化したウェルに対して、前記（３）で調製したカルシウムイオン含有バキュロウィルス含有昆虫細胞培養上清サンプル希釈系列（１００倍希釈、２００倍希釈、４００倍希釈、８００倍希釈）各１００μＬをそれぞれ１ウェルずつ４ウェルに、ブランクとしてＰＭＳＦ−Ｊ１培地 １００μＬを１ウェルにそれぞれ添加し、プレートミキサーを用いて５００ｒｐｍで混合しながら室温で１時間反応した。２ｍＭＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔ ３００μＬで３回洗浄した後、ＨＲＰ標識抗ｇｐ６４マウスモノクローナル抗体希釈液１００μＬを各ウェルに添加し、プレートミキサーを用いて５００ｒｐｍで混合しながら室温で１時間反応した。２ｍＭＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔ ３００μＬで５回洗浄した後、ＴＭＢ溶液（和光純薬工業（株）製）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で３０分間静置反応した。１Ｍ ＨＣｌ １００μＬを添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダーＴｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ（Ｔｅｃａｎ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
尚、各実施例、比較例でプレートに固定化したタンパク質及び検出の可否（結果）を下記表３４に示す。
Figure 2021012200
＜結果＞
得られたＥＬＩＳＡ測定の結果を図２１に示す。図２１は各種ＰＳタンパク質及び抗ｇｐ６４抗体を固定化したウェルにおける、カルシウムイオン含有バキュロウィルス含有昆虫細胞培養上清の各希釈系列に含まれるエクソソームに対し結合したＨＲＰ標識抗ｇｐ６４マウスモノクローナル抗体由来の検出シグナル（４５０ｎｍの吸光度）をそれぞれあらわす。横軸はウェルに固定化したＰＳタンパク質又は抗マーカータンパク質抗体の種類を表し、同じＰＳタンパク質等を固定化したウェルについての検出結果においては左から順にブランク、用いたカルシウムイオン含有バキュロウイルス含有昆虫細胞培養上清サンプル希釈系列がそれぞれ８００倍希釈、４００倍希釈、２００倍希釈、１００倍希釈を表す。また、縦軸はＨＲＰ標識抗ｇｐ６４マウスモノクローナル抗体由来の検出シグナル（４５０ｎｍの吸光度）を表す。
Ｔｉｍ１タンパク質、Ｔｉｍ３タンパク質、又はＴｉｍ４タンパク質をそれぞれ固定化したウェルでは、バキュロウィルスの表面マーカータンパク質である抗ｇｐ６４抗体を固定化したウェル、ＰＳタンパク質であるＭＦＧ−Ｅ８、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖを固定化したウェル、Ｔｉｍファミリータンパク質であるＴｉｍ２タンパク質を固定化したウェルに比べ（比較例３４−３９）高感度にウィルスを検出できた（実施例１１０−１１５）。即ち、従来法に比べ本発明に係るＴｉｍタンパク質を用いる本発明の検出方法は高感度にウィルスを検出できることが判った。とりわけ、Ｔｉｍタンパク質のうち、Ｔｉｍ４タンパク質を用いると特に高感度にウィルスを検出できることが判った。
実施例１１６−１１９．Ｔｉｍタンパク質を固定化した担体によるウィルスの取得
ビオチン標識したＴｉｍ４タンパク質を固定化した担体を用いて、本発明に係るウィルスの取得を行った。
＜（１）コトランスフェクション細胞培養上清の調製＞
実施例８４−９５、比較例２０−２１の「（１）コトランスフェクション細胞培養上清の調製」と同様に行った。
＜（２）カルシウムイオン含有バキュロウイルス含有昆虫細胞培養上清サンプルの調製＞
実施例８４−９５、比較例２０−２１の「（２）バキュロウイルス含有昆虫細胞培養上清サンプルの調製」と同様に行い、カルシウムイオン含有バキュロウイルス含有昆虫細胞培養上清サンプルを得た。
＜（３）バキュロウイルス含有昆虫細胞培養上清サンプル希釈液の調製＞
カルシウムイオン含有バキュロウィルス含有昆虫細胞培養上清サンプル１００μＬとＰＳＦＭ−Ｊ１培地８００μＬを混合し９倍希釈液９００μＬを調製した。
＜（４）Ｔｉｍ４タンパク質のＳＨ基ビオチン標識＞
Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質（和光純薬工業（株）製）含有ＰＢＳ溶液１００μＬ（Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質１０μｇ含有）を、ビオチン化標識用キット−ＳＨ（同仁化学研究所製）を用いて、当該キットに添付されているプロトコールにしたがってＦｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のＳＨ基をビオチン標識し、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液１００μＬを得た。
＜（５）タグ融合Ｔｉｍタンパク質の希釈＞
Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質（和光純薬工業（株）製）含有ＰＢＳ溶液５μＬ（Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質０．５μｇ含有）を、ＴＢＳ９５μＬと混合し、ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を０．５μｇ含有する溶液１００μＬを得た。
前記（４）で調製したＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＴＢＳ溶液５μＬ（ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質０．５μｇ含有）をＴＢＳ９５μＬと混合し、ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有する溶液１００μＬを得た。
＜（６）ビーズの洗浄＞
３０μｇ／μＬ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）含有ＰＢＳ−Ｔ溶液５μＬ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧ ０．３ｍｇ含有）を、１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）に移し、ＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ、０．０００５％ Ｔｗｅｅｎ２０）５００μＬを用いて２回洗浄した後、チューブを磁気スタンドにセットし、洗浄液を除いた。
また、ＭａｇＣａｐｔｕｒｅ Ｔａｍａｖｉｄｉｎ２−ＲＥＶ（和光純薬工業（株）製）含有ＰＢＳ溶液３０μＬ（ビーズ ０．３ｍｇ含有）を、１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）に移し、ＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ、０．０００５％ Ｔｗｅｅｎ２０）５００μＬを用いて２回洗浄した後、チューブを磁気スタンドにセットし、洗浄液を除いた。
＜（７）Ｔｉｍタンパク質のビーズへの固定＞
洗浄操作後のペレット状態のＤｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉＧ ０．３ｍｇを含有する１．５ｍＬチューブに、ＳＨ基ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を０．５μｇ含有する溶液１００μＬを添加して、サーモミキサーを用いて８℃で１２００ｒｐｍ １時間反応させ、ＳＨ基ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４が結合した担体（「ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４担体」と略記する場合がある）を得た。
また、洗浄操作後のＭａｇＣａｐｔｕｒｅ Ｔａｍａｖｉｄｉｎ２−ＲＥＶ ０．３ｍｇを含有する１．５ｍＬチューブに、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を０．５μｇ含有する溶液１００μＬを加え、前記と同様にビーズに結合させ、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４が結合した担体（「ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４担体」と略記する場合がある）を得た。
尚、これらの得られた２種類の担体をまとめて「Ｔｉｍタンパク質結合担体」と略記する場合がある。
＜（８）本発明の取得方法によるバキュロウィルスの取得＞
前記で得られたこれらのＴｉｍタンパク質結合担体をＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ、０．０００５％ Ｔｗｅｅｎ２０）２５０μＬで３回洗浄操作し、ペレット状態のＴｉｍタンパク質結合担体を得た。次いで、得られた２種類のペレット状態のＴｉｍタンパク質結合担体に、前記（３）で調製したカルシウムイオン含有バキュロウイルス含有昆虫細胞培養上清サンプル希釈液１００μＬをそれぞれ加え、サーモミキサーを用いて８℃で１２００ｒｐｍ １２時間反応させた。その後、反応後のＴｉｍタンパク質結合担体を、カルシウムイオン含有ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、０．０００５％ Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ ＣａＣｌ２）２５０μＬでそれぞれ３回洗浄操作した。３回目の洗浄操作の時に、Ｔｉｍタンパク質結合担体を含むＣａＣｌ２含有ＴＢＳ−Ｔ溶液２５０μＬを１２５μＬずつ１．５ｍＬチューブ２本にそれぞれ分注し、チューブを磁気スタンドにセットした後、洗浄液を除いた。
ペレット状態の２種類のＴｉｍタンパク質結合担体０．１５ｍｇにそれぞれ溶出液として１％ＳＤＳ水溶液を５０μＬ、又は１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を２５μＬ添加した後、ボルテックスミキサーにより室温で１０秒間混合し、スピンダウンした。ＥＤＴＡを添加したチューブには再度１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を２５μＬ添加し、同様の操作を行い、溶出液を得た。
尚、各実施例で用いたＴｉｍタンパク質及び担体の種類、並びにＴｉｍタンパク質（非）結合担体の種類を下記表３５に示す。
Figure 2021012200
＜（９）ウエスタンブロッティング＞
「得られた各溶出液１１．２５μＬに４×試料用緩衝液（和光純薬工業（株）製）３．７５μＬを加え」た代わりに「前記（８）本発明の取得方法によるバキュロウイルスの取得で得られた各溶出液１５μＬに４×試料用緩衝液（和光純薬工業（株）製）１５μＬを加え」、「抗Ｌａｍｐ−１抗体」の代わりに「抗バキュロウイルスｇｐ６４抗体」を用いた以外は、実施例８０−８３及び比較例１６−１９の「（５）ウエスタンブロッティング」と同様の方法で行った。
尚、各実施例で用いたＴｉｍタンパク質及び担体の種類、Ｔｉｍタンパク質結合担体からウイルスを取得するために用いた溶出液の種類、並びにウエスタンブロッティングにおけるレーン番号を下記表３６に示す。
Figure 2021012200
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図２２に示す。図２２において、各レーンは以下の結果である。
レーン１：実施例１１６の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにＳＨ基ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン２：実施例１１７の結果（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧにＳＨ基ビオチン非標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン３：実施例１１８の結果（ＭａｇＣａｐｔｕｒｅ Ｔａｍａｖｉｄｉｎ ＲＥＶ−２にＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１％ ＳＤＳ水溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン４：実施例１１９の結果（ＭａｇＣａｐｔｕｒｅ Ｔａｍａｖｉｄｉｎ ＲＥＶ−２にＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を結合させた担体を用い、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
図２２より、レーン１−４において、いずれの場合でもバキュロウィルスのマーカータンパク質であるｇｐ６４のバンドが認められたことから、ＳＨ基ビオチン非標識又は標識Ｔｉｍ４を結合させた担体を用いることで、ウィルスを取得可能であることが判った。
また、レーン２とレーン４の比較から、カルシウムキレート剤により溶出させる場合には、Ｔｉｍタンパク質のＳＨ基を介してビーズ（担体）に固定化させることで、タグを介して固定化させるよりも多くのウィルスを取得できることが判った。
実施例１２０−１２１．比較例４０−４１．フローサイトメーターによる細胞外膜小胞の検出感度比較
以下のように、Ｔｉｍ４タンパク質又はエクソソームの表面マーカータンパク質のＣＤ６３に対する抗体を固定化した担体及び検出抗体としてＰＥ標識抗ＣＤ６３抗体を用いて、Ｋ５６２細胞培養上清由来の細胞外膜小胞をフローサイトメーターにより検出した。
＜（１）カルシウムイオン含有培養上清（原液）の調製＞
細胞外膜小胞を分泌するヒト慢性骨髄性白血病株Ｋ５６２細胞１×１０７細胞を８０ｍＬのＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２条件下で３日間培養した後、遠心分離処理（３００×ｇ、５分間）して細胞を沈殿させ、上清を除去した。沈殿した細胞を、１０μＭモネンシンナトリウム（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）含有Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地６０ｍＬで懸濁後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。
その後、培養液を遠心分離処理（３００×ｇ、５分間）し、培養上清を回収した。回収した培養上清６０ｍＬをさらに３回遠心分離処理（１回目：３００×ｇ、３分間、２回目：１２００×ｇ、２０分間、３回目：１００００×ｇ、２０分間）して不純物を分離し、上清を得た（以下、「培養上清（原液）」と略記する場合がある）を得た。
また、得られた培養上清原液に終濃度が２ｍＭとなるようにＣａＣｌ２を添加し、２ｍＭＣａＣｌ２含有Ｋ５６２細胞培養上清濃縮液サンプル（以下、「カルシウムイオン含有培養上清（原液）」と略記する場合がある）を得た。
＜（２）培養上清サンプル希釈液の調製＞
前記で得られたカルシウムイオン含有培養上清（原液）５００μＬとＸ−ＶＩＶＯ１５培地５００μＬを混合し２倍希釈液を１．０ｍＬ調製し、２倍希釈液２００μＬとＸ−ＶＩＶＯ１５培地８００μＬを混合し１０倍希釈液１．０ｍＬを調製し、カルシウムイオン含有培養上清２倍希釈液（原液）とカルシウムイオン含有培養上清１０倍希釈液（原液）をそれぞれ得た。
＜（３）Ｔｉｍ４タンパク質のＳＨ基ビオチン標識＞
Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質（和光純薬工業（株）製）含有ＰＢＳ溶液１００μＬ（Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質１０μｇ含有）を、ビオチン化標識用キット−ＳＨ（同仁化学研究所製）を用いて、当該キットに添付されているプロトコールにしたがってＦｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のＳＨ基をビオチン標識し、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液１００μＬを得た。
＜（５）ビーズの洗浄＞
Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｓｔｒｅｐｔａｂｉｄｉｎ ４．５μｍ １×１０７／ｍＬ含有）２０μＬを、１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）２本にそれぞれ分注し、ＴＢＳ２００μＬを用いて洗浄操作を行った。
Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ６３ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ａｎｔｉ−ＣＤ６３抗体固定化済み ４．５μｍ １×１０７／ｍＬ含有）２０μＬを、１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）２本にそれぞれ分注し、ＴＢＳ２００μＬを用いて洗浄操作を行った。
＜（６）Ｔｉｍ４タンパク質のビーズへの固定＞
洗浄操作後のペレット状態のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを含有する１．５ｍＬチューブ２本に、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を０．１μｇ含有する溶液１００μＬを添加して、サーモミキサーを用いて８℃で１２００ｒｐｍ ３０分間反応させ、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４が結合した担体（「ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４担体」と略記する場合がある）を含有する溶液（「ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４担体含有溶液」と略記する場合がある）を得た。
＜（７）細胞外膜小胞との反応＞
前記で得られたビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４担体含有溶液１００μＬを磁気スタンドにセットした後、ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４担体含有溶液中の溶液を除いた。ペレット状態のビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４担体及び洗浄操作後のペレット状態のＥｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ６３ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを０．１％ＢＳＡ含有ＴＢＳ２００μＬで２回洗浄し、ペレット状態の担体を得た。次いで、得られたペレット状態の各担体に、前記（２）で調製したカルシウムイオン含有培養上清２倍希釈液（原液）と培養上清１０倍希釈液（原液）１００μＬをそれぞれ加え、サーモミキサーを用いて８℃で１２００ｒｐｍ １２時間それぞれ反応させた。その後、反応後の担体を、カルシウムイオン−０．１％ＢＳＡ含有ＴＢＳ（ＴＢＳ、０．１％ ＢＳＡ、２ｍＭ ＣａＣｌ２）３００μＬで１回、カルシウムイオン−０．１％ＢＳＡ含有ＴＢＳ４００μＬでそれぞれ１回洗浄操作し、洗浄操作後のペレット状態の各担体をカルシウムイオン−０．１％ＢＳＡ含有ＴＢＳ（ＴＢＳ、０．１％ ＢＳＡ、２ｍＭ ＣａＣｌ２）３００μＬでそれぞれ懸濁し、下記表３７に記載の２種類の担体の懸濁液をそれぞれ得た。
Figure 2021012200
＜（８）ＰＥ標識抗ＣＤ６３抗体による検出＞
前記（７）で得られた２種類の担体の懸濁液を１００μＬずつそれぞれ２本の１．５ｍＬチューブに分注し、磁気分離により担体をペレット状態にした後、ＰＥ標識抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体Ｈ５Ｃ６（ＢＤバイオサイエンス社製）又はＰＥ標識コントロールマウスＩｇＧ（ＢＤバイオサイエンス社製）を２０μＬそれぞれ添加し、サーモミキサーを用いて２５℃で１０００ｒｐｍ １時間それぞれ反応させた。その後、カルシウムイオンと０．１％ＢＳＡ含有ＴＢＳ（ＴＢＳ、０．１％ ＢＳＡ、２ｍＭ ＣａＣｌ２）３００μＬでそれぞれ２回洗浄操作した後、カルシウムイオンと０．１％ＢＳＡ含有ＴＢＳ（ＴＢＳ、０．１％ ＢＳＡ、２ｍＭ ＣａＣｌ２）５００μＬで担体を懸濁した。その後ファルコンセルストレーナー（コーニング社製）で濾過した濾液を回収し、フローサイトメーターＧａｌｌｉｏｓ（ベックマンコールター社製）で測定及び解析を行った。なお、測定時のレーザー波長は４８８ｎｍであり、検出波長は５７５ｎｍである。
尚、各実施例で用いたＴｉｍタンパク質、担体の種類、及び試料を下記表３８に示す。
Figure 2021012200
＜結果＞
得られたフローサイトメーター測定の結果を図２３に示す。図２３は各倍率で希釈したカルシウムイオン含有培養上清（原液）からビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４担体と抗ＣＤ６３抗体担体を用いて捕捉したエクソソームを、ＰＥ標識抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体で検出したシグナルとＰＥ標識コントロールマウスＩｇＧで検出したノイズの比（Ｓｉｎａｌ／Ｎｏｉｓｅ比）をそれぞれあらわす。横軸は使用したカルシウムイオン含有培養上清（原液）の希釈倍率、縦軸はＰＥ標識抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体で検出したシグナルとＰＥ標識コントロールマウスＩｇＧで検出したノイズの比をそれぞれ表す。
図２３より、本発明に係るＴｉｍタンパク質を結合させた担体を用いることで、細胞外膜小胞を検出可能であることが判った。また、抗ＣＤ６３抗体を固定化した担体を用いるよりもＴｉｍ４を固定化した担体を用いる方が高いＳｉｎａｌ／Ｎｏｉｓｅ比（検出感度）でフローサイトメーター測定ができることが示された。即ち、本発明に係るＴｉｍ担体を用たフローサイトメーター解析によれば従来法に比べ高感度に細胞外膜小胞を検出できることが判った。
実施例１２２−１２３．比較例４２−４３．Ｔｉｍタンパク質を固定化した担体によるウィルスの取得
Ｔｉｍタンパク質を固定化した担体を用いて、本発明に係るウィルスの取得を行った。
＜（１）Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質のＳＨ基ビオチン標識＞
Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質（和光純薬工業（株）製）含有ＰＢＳ溶液１００μＬ（Ｆｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質１０μｇ含有）中のＦｃタグ融合型マウス由来Ｔｉｍ４タンパク質のＳＨ基を、ビオチン化標識用キット−ＳＨ（同仁化学研究所製）を用いて、当該キットに添付されているプロトコールにしたがってビオチン標識し、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液１００μＬを得た。
＜（２）ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質の希釈＞
前記（１）で調製したＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＴＢＳ溶液１０μＬ（ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質１μｇ含有）をＴＢＳ１９０μＬと混合し、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有する溶液２００μＬを得た。
＜（３）ビーズの洗浄＞
ＭａｇＣａｐｔｕｒｅ Ｔａｍａｖｉｄｉｎ２−ＲＥＶ（和光純薬工業（株）製）含有ＰＢＳ溶液６０μＬ（ＭａｇＣａｐｔｕｒｅ Ｔａｍａｖｉｄｉｎ２−ＲＥＶ ０．６ｍｇ含有）を、２本の１．５ｍＬチューブ（ビーエム機器社製）にそれぞれ移し、ＴＢＳ−Ｔ（ＴｒｉｓＢｕｆｆｅｒ、０．０００５％ Ｔｗｅｅｎ２０）５００μＬを用いてそれぞれ２回洗浄した後、チューブを磁気スタンドにセットし、洗浄液を除いた。
＜（４）ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質のビーズへの固定＞
洗浄操作後のＭａｇＣａｐｔｕｒｅ Ｔａｍａｖｉｄｉｎ２−ＲＥＶ ０．６ｍｇを含有する２本の１．５ｍＬチューブに、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有する溶液２００μＬ又はＴＢＳ２００μＬを加え、サーモミキサーを用いて８℃で１２００ｒｐｍ １時間それぞれ反応させ、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４が結合した担体（「ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４結合担体」と略記する場合がある）とＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４が結合していない担体（「ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４非結合担体」と略記する場合がある）を得た。尚、ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４結合担体とビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４非結合担体を合わせて「Ｔｉｍタンパク質（非）結合担体」と略記する場合がある。
＜（５）本発明の取得方法によるインフルエンザウィルスの取得＞
前記で得られた２種類のＴｉｍタンパク質（非）結合担体をＴＢＳ−Ｔ（ＴｒｉｓＢｕｆｆｅｒ、０．０００５％ Ｔｗｅｅｎ２０）５００μＬでそれぞれ３回洗浄操作した。洗浄操作後の２種類のＴｉｍタンパク質（非）結合担体に、終濃度２ｍＭの塩化カルシウムを添加したカルシウムイオン含有のインフルエンザＡウィルス溶液（Ｈ１Ｎ１ Ａ／ＷＳ／３３ ｓｔｒａｉｎ）（ＡＴＣＣ Ｃｏｄｅ：ＶＲ−８２５）６０μＬをそれぞれ加え、サーモミキサーを用いて８℃で１２００ｒｐｍ ２時間それぞれ反応させた。反応後の２種類のＴｉｍタンパク質（非）結合担体を、カルシウムイオン含有ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、０．０００５％ Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ ＣａＣｌ２）５００μＬでそれぞれ３回洗浄操作した。３回目の洗浄操作の後、２種類のＴｉｍタンパク質（非）結合担体にカルシウムイオン含有ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、０．０００５％ Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ ＣａＣｌ２）５００μＬをそれぞれ加えて懸濁し、懸濁液５００μＬをそれぞれ得た。当該懸濁液を２５０μＬずつ１．５ｍＬチューブ２本にそれぞれ分注し、チューブを磁気スタンドにセットした後、それぞれ洗浄液を除き、ペレット状態のＴｉｍタンパク質（非）結合担体をそれぞれ得た。
尚、各実施例及び比較例で用いた担体の種類、及びＴｉｍタンパク質の種類を下記表３９に示す。
Figure 2021012200
得られたペレット状態のＴｉｍタンパク質（非）結合担体０．３ｍｇを含有する４本の１．５ｍＬチューブのうち、Ｔｉｍタンパク質結合担体を含有する１．５ｍＬチューブ１本及びＴｉｍタンパク質非結合担体を含有する１．５ｍＬチューブ１本については、溶出液として１％ＳＤＳ水溶液をそれぞれ２０μＬ添加した後、ボルテックスミキサーにより室温で１０秒間混合し、スピンダウンし溶出液をそれぞれ得た。
また、当該ペレット状態のＴｉｍタンパク質（非）結合担体０．３ｍｇを含有する４本の１．５ｍＬチューブのうち、Ｔｉｍタンパク質結合担体を含有する１．５ｍＬチューブ１本及びＴｉｍタンパク質非結合担体を含有する１．５ｍＬチューブ１本については、溶出液として５０ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液をそれぞれ１０μＬ添加した後、ボルテックスミキサーにより室温で１０秒間混合し、スピンダウンした。スピンダウン後のチューブにそれぞれ再度５０ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を１０μＬ添加した後、ボルテックスミキサーにより室温で１０秒間混合し、スピンダウンし溶出液をそれぞれ得た。
得られた４種類の溶出液２０μＬにそれぞれ１０％ β−プロピオラクトン含有ＴＢＳ溶液 ２．２μＬを添加して、ボルテックスミキサーで混合後、氷上で３時間静置し、４種類のβ−プロピオラクトン処理済溶出液２２．２μＬをそれぞれ得た。
＜（６）ウエスタンブロッティング＞
前記カルシウムイオン含有のインフルエンザＡウィルス溶液（Ｈ１Ｎ１ Ａ／ＷＳ／３３ ｓｔｒａｉｎ）（ＡＴＣＣ Ｃｏｄｅ：ＶＲ−８２５）３０μＬに１０％ β−プロピオラクトン含有ＴＢＳ溶液 ３．３μＬを添加して、ボルテックスミキサーで混合後、氷上で３時間静置した溶液に４×試料用緩衝液（和光純薬工業（株）製）１１．１μＬを加え、９５℃で３分間加熱し、ウエスタンブロッティング用のインプット試料（計４４．４μＬ）を得た。また、前記４種類のβ−プロピオラクトン処理済溶出液２２．２μＬに４×試料用緩衝液（和光純薬工業（株）製）７．４μＬをそれぞれ加え、９５℃で３分間加熱し、ウエスタンブロッティング用の各溶出液試料（（計２９．６μＬ）をそれぞれ得た。スーパーセップエース ５−２０％ゲル（和光純薬工業（株）製）に当該ウエスタンブロッティング用のインプット試料２０μＬ及びウエスタンブロッティング用の各溶出液試料２０μＬをそれぞれ載せて、３０ｍＡで６０分間電気泳動した。得られた泳動ゲルを、セミドライブロッターと不連続バッファー（Ａｎｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ １：０．３Ｍ Ｔｒｉｓ／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、Ａｎｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ ２：０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、Ｃａｔｈｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ：０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ／０．０４Ｍ アミノカプロン酸／２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ）を用いて、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に１．２ｍＡ／ｃｍ２で６０分間転写した。転写後のＰＶＤＦ膜にＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒ， ０．１％ ｔｗｅｅｎ２０）で希釈した５％スキムミルクを加えて１時間室温で反応させてブロッキングし、ＴＢＳ−Ｔで３００倍希釈した抗インフルエンザＡウィルスＮｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体Ｃ４３（Ａｂｃａｍ社製）２ｍＬを室温で１時間反応させた。反応後のＰＶＤＦ膜をＴＢＳ―Ｔで３回洗浄し、ＴＢＳ―Ｔで３００００倍希釈した２次抗体抗｛マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）， ロバ，ＩｇＧ画分、ペルオキシダーゼ結合抗体｝（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を室温で１時間反応させた。ＴＢＳ―Ｔで５回洗浄後、各抗体を反応させたＰＶＤＦ膜にイムノスターゼータ（和光純薬工業（株）製）を添加し、ＬＡＳ−４０００（ＧＥ社製）を用いて発光シグナルを検出した。
尚、各実施例で用いた担体の種類、Ｔｉｍタンパク質の種類及び担体からの溶出液の種類を下記表４０に示す。
Figure 2021012200
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図２４に示す。図２４において、各レーンは以下の結果である。
レーン１：インフルエンザＡウィルスを電気泳動した結果
レーン２：比較例４２の結果（ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４非結合担体を用い、１％ＳＤＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン３：比較例４３の結果（ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４非結合担体を用い、５０ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン４：実施例１２２の結果（ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４結合担体を用い、１％ＳＤＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン５：実施例１２３の結果（ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４結合担体を用い、５０ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
図２４より、レーン２−３（ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４非結合担体を用いた場合）において、いずれの場合でもインフルエンザＡウィルスのマーカータンパク質であるＮｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎのバンドは認められなかったのに対し、レーン４−５（ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４結合担体を用いた場合）において、いずれの場合でもインフルエンザＡウィルスのマーカータンパク質であるＮｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎのバンドが認められたことから、Ｔｉｍタンパク質を結合させた担体は、インフルエンザウィルスを取得可能であることが判った。
また、レーン１（インフルエンザＡウィルスを電気泳動した結果）とレーン４−５（ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４結合担体を用いた場合の結果）との比較から、Ｔｉｍタンパク質を結合させた担体を用いることにより効率よくインフルエンザウィルスを取得できることが判った。
実施例１２４−１２５．比較例４４−４５．Ｔｉｍタンパク質を固定化した担体によるウィルスの取得
Ｔｉｍタンパク質を固定化した担体を用いて、本発明に係るウイルスの取得を行った。
＜（１）ＲＳウイルス含有ＨＥｐ−２細胞培養上清サンプルの調製＞
１．５×１０６細胞のＨＥｐ−２細胞を含む１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ高グルコース培地（和光純薬工業（株）製）２０ｍＬを７５ｃｍ２フラスコに加え、３７℃、５％ ＣＯ２で４日間培養した。培養後の培養液から上清を除去し、５．３×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＲＳウイルス液（ＡＴＣＣ、Ｃｏｄｅ：ＶＲ−２６）を含む２％ＦＢＳ含有Ｅ−ＭＥＭ培地５ｍＬを添加して、３６℃、５％ＣＯ２で１時間静置した。２％ＦＢＳ含有Ｅ−ＭＥＭ培地をさらに２０ｍＬ添加して、３６℃、５％ＣＯ２で３日間培養した。当該培養後の培養液から上清を除去し、２％ＦＢＳ含有Ｅ−ＭＥＭ培地を２０ｍＬ添加して、３６℃、５％ＣＯ２で２日間培養した。その後、細胞をピペッティングによりフラスコから剥がし、培養上清と共に５０ｍＬ遠沈管に回収し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心して培養上清のみを回収した。得られた培養上清に終濃度２ｍＭとなるように塩化カルシウムを添加し、「カルシウム含有ＲＳウイルス溶液」とした。
＜（２）Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質のＳＨ基ビオチン標識＞
実施例１２２−１２３及び比較例４２−４３の＜（１）Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質のＳＨ基ビオチン標識＞と同様の方法を行い、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質含有ＰＢＳ溶液１００μＬを得た。
＜（３）ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質の希釈＞
実施例１２２−１２３及び比較例４２−４３の＜（２）ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質の希釈＞と同様の方法を行い、ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質を１μｇ含有する溶液２００μＬを得た。
＜（４）ビーズの洗浄＞
実施例１２２−１２３及び比較例４２−４３の＜（３）ビーズの洗浄＞と同様の方法を行い、洗浄操作を行ったＭａｇＣａｐｔｕｒｅ Ｔａｍａｖｉｄｉｎ２−ＲＥＶを得た。
＜（５）ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質のビーズへの固定＞
実施例１２２−１２３及び比較例４２−４３の＜（４）ＳＨ基ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４タンパク質のビーズへの固定＞と同様の方法を行い、ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４結合担体及びビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４（非）結合担体をそれぞれ得た。
尚、ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４結合担体とビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４非結合担体を合わせて「Ｔｉｍタンパク質（非）結合担体」と略記する場合がある。
＜（６）本発明の取得方法によるＲＳウィルスの取得＞
「終濃度２ｍＭの塩化カルシウムを添加したカルシウムイオン含有のインフルエンザＡウィルス溶液（（Ｈ１Ｎ１ Ａ／ＷＳ／３３ ｓｔｒａｉｎ）（ＡＴＣＣ Ｃｏｄｅ：ＶＲ−８２５）６０μＬ」の代わりに「前記（１）で調製したカルシウムイオン含有ＲＳウィルス溶液１２０μＬ」を用いた以外は、実施例１２２−１２３及び比較例４２−４３の＜（５）本発明の取得方法によるインフルエンザウィルスの取得＞と同様の方法を行い、β−プロピオラクトン処理済溶出液２２．２μＬをそれぞれ得た。
尚、各実施例で用いた担体の種類、及びＴｉｍタンパク質の種類を下記表４１に示す。
Figure 2021012200
＜（７）ウエスタンブロッティング＞
「カルシウムイオン含有のインフルエンザＡウィルス溶液（Ｈ１Ｎ１ Ａ／ＷＳ／３３ ｓｔｒａｉｎ）（ＡＴＣＣ Ｃｏｄｅ：ＶＲ−８２５）３０μＬ」の代わりに「前記カルシウムイオン含有ＲＳウィルス溶液３０μＬ」を使用し、「ＴＢＳ−Ｔで３００倍希釈した抗インフルエンザＡウィルスＮｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体Ｃ４３（Ａｂｃａｍ社製）２ｍＬ」の代わりに「ＴＢＳ−Ｔで５００倍希釈した抗ＲＳウィルスＦタンパク質抗体２Ｆ７（Ａｂｃａｍ社製）２ｍＬ」を用いた以外は、実施例１２２−１２３及び比較例４２−４３の＜（６）ウエスタンブロッティング＞と同様の方法により行い、発光シグナルを検出した。
尚、各実施例で用いた担体の種類、Ｔｉｍタンパク質の種類、及び担体からの溶出液の種類を下記表４２に示す
Figure 2021012200
＜結果＞
得られたウエスタンブロッティングの結果を図２５に示す。図２５において、各レーンは以下の結果である。
レーン１：ＲＳウィルスを電気泳動した結果
レーン２：比較例４４の結果（ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４非結合担体を用い、１％ＳＤＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン３：比較例４５の結果（ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４非結合担体を用い、５０ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン４：実施例１２４の結果（ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４結合担体を用い、１％ＳＤＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
レーン５：実施例１２５の結果（ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４結合担体を用い、５０ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ溶液を溶出液として用いた場合の結果）
図２５より、レーン２−３（ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４非結合担体を用いた場合）において、いずれの場合でもＲＳウィルスのマーカータンパク質であるＦタンパク質のバンドは認められなかったのに対し、レーン４−５（ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４結合担体を用いた場合）において、いずれの場合でもＲＳウィルスのマーカータンパク質であるＦタンパク質のバンドが認められたことから、Ｔｉｍタンパク質を結合させた担体は、ＲＳウィルスを取得可能であることが判った。
また、レーン１（ＲＳウィルスを電気泳動した結果）とレーン４−５（ビオチン標識Ｆｃタグ融合型ｍＴｉｍ４結合担体を用いた場合の結果）との比較から、Ｔｉｍタンパク質を結合させた担体を用いることにより効率よくＲＳウィルスを取得できることが判った。
本発明のＴｉｍタンパク質結合担体、当該担体を用いた細胞外膜小胞及びウイルスの取得方法、除去方法並びに当該担体を含むキットは、従来の細胞外膜小胞及びウイルスの取得方法並びに当該取得方法に用いられる抗体等を含むキットに比べて、試料中に存在する細胞外膜小胞又はウイルスを高純度で、またインタクトな状態で簡便且つ効率的に取得又は除去することができる。
本発明の取得方法により取得した細胞外膜小胞は医薬品等として利用され、また取得したウィルスはワクチンやベクター等として利用されることから、本発明のＴｉｍタンパク質結合担体及び本発明の取得方法は有用なものである。
本発明の除去方法により細胞外膜小胞又はウイルスを除去した試料は生物由来細胞外膜小胞やエンベロープウィルスのコンタミネーションを防いだものとなり、当該試料を用いた研究等に利用されることから、本発明のＴｉｍタンパク質結合担体及び本発明の除去方法は有用なものである。
本発明のＴｉｍタンパク質結合担体、当該担体を用いた細胞外膜小胞及びウイルスの検出方法は、従来の細胞外膜小胞及びウイルスの検出方法に比べて試料中の細胞外膜小胞及びウイルスを高感度に検出することができる。
本発明の検出方法によれば検体中の微量な細胞外膜小胞及びウイルスを検出する場合であっても、検体を濃縮や精製等せずにそのまま測定をすることが可能となるため、本発明のＴｉｍタンパク質結合担体及び本発明の検出方法は有用なものである。

Claims (6)

  1. 以下の工程を含むことを特徴とする試料中の細胞外膜小胞を検出する方法；
    （１）カルシウムイオン存在下、担体に結合したＴ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子４（Ｔｉｍ４）タンパク質と試料中の細胞外膜小胞との複合体を形成させる工程（複合体形成工程）
    （２）当該複合体を細胞外膜小胞に対して結合する抗体を用いて検出する工程（検出工程）。
  2. 前記細胞外膜小胞を検出する方法が、ＥＬＩＳＡ法又はフローサイトメトリー法である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ｔｉｍ４タンパク質が、ＩｇＶドメインを含むものである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記担体と前記Ｔｉｍ４タンパク質とが、Ｔｉｍ４タンパク質のＳＨ基を介して結合したものである、請求項１に記載の方法。
  5. Ｔｉｍ４タンパク質が結合した担体、及び細胞外膜小胞に対して結合する抗体を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法に用いられる細胞外膜小胞の検出用キット。
  6. Ｔｉｍ４タンパク質、担体、及び細胞膜外小胞に対して結合する抗体を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法に用いられる細胞外膜小胞の検出用キット。
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