KR20230004955A - Tim 단백질 결합 담체, 당해 담체를 사용한 세포외막소포 및 바이러스의 취득 방법, 제거 방법, 검출 방법 그리고 당해 담체를 포함하는 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 시료 중에 존재하는 세포외막소포 또는 바이러스를, 순도 양호하고, 인택트한 상태로 간편 또한 효율적으로 취득 또는 제거하거나, 혹은 고감도로 검출하기 위한 담체 및 방법의 제공을 과제로 한다. 본 발명은, 「1. T 세포 면역 글로불린·뮤신 도메인 함유 분자 4 (Tim4) 단백질, Tim3 단백질, 및 Tim1 단백질로부터 선택되는 단백질 (Tim 단백질) 이 결합한 담체 (Tim 담체). 2. 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 취득하는 방법. 3. 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 제거하는 방법. 4. 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 검출하는 방법. 5. Tim 담체를 포함하여 이루어지는, 세포외막소포 또는 바이러스의 포착용 키트. 6. Tim 단백질을 포함하여 이루어지는 시약과, 담체를 포함하여 이루어지는 시약을 포함하여 이루어지는 세포외막소포 또는 바이러스의 포착용 키트.」에 관한 것이다.
Description
본 발명은, Tim 단백질 결합 담체, 당해 담체를 사용한 세포외막소포 및 바이러스의 취득 방법, 제거 방법, 검출 방법 그리고 당해 담체를 포함하는 키트에 관한 것이다.
세포외막소포는, 그 입자 내부에 단백질이나 microRNA 등의 핵산이 존재하고, 세포 간의 물질 전달을 담당하고 있는 것이 알려져 있다. 세포외막소포는, 혈액 등의 체액 중에도 분비되어 있고, 세포외막소포 중의 단백질이나 microRNA 등이 질환의 진단 마커로서 주목받고 있다. 또, 핵산 의약의 딜리버리 툴로서의 응용도 주목받고 있다.
또, 바이러스에는 표면에 막상의 엔벨로프를 감은 엔벨로프 바이러스가 많이 존재하고 있다. 엔벨로프 바이러스는, 인플루엔자 바이러스나 인간 면역 부전 바이러스 등 질환을 일으키는 것이 많기 때문에, 연구 대상으로서 주목받고 있다. 또, 엔벨로프 바이러스는 무독화하여 백신이나 벡터 등에 이용되어, 질환의 예방이나 치료에 응용되고 있다.
이와 같이 세포외막소포의 진단이나 의약품에의 이용, 엔벨로프 바이러스의 백신이나 벡터로서의 이용, 세포외막소포나 엔벨로프 바이러스의 기능 해석 등의 기초 연구 등을 실시하는 데에 있어서, 세포외막소포나 엔벨로프 바이러스를 고순도로 취득하는 공정은 필요 불가결하여, 간편하게 고순도의 세포외막소포나 엔벨로프 바이러스를 취득할 수 있는 수법이 요망되고 있다. 또, 생물 유래 세포외막소포나 엔벨로프 바이러스의 콘터미네이션을 방지하기 위해, 사용하는 체액 유래 재료로부터 효율적으로 세포외막소포나 엔벨로프 바이러스를 제거하는 수법의 개발이 기대되고 있다. 또한 취득한 세포외막소포나 엔벨로프 바이러스, 또 검체 중의 세포외막소포나 엔벨로프 바이러스를 고감도로 검출하는 수법도 요망되고 있다.
세포외막소포를 취득하는 방법으로는, 샘플을 초원심분리 처리하고, 세포외막소포를 침전 획분으로서 얻는 방법이 가장 일반적인 방법으로서 알려져 있다 (비특허문헌 1). 그러나, 이 방법에서는 세포외막소포 이외에, 샘플 중에 포함되는 단백질 복합체나 응집체, HDL 등의 리포 단백질 등도 공침하여, 순도가 높은 세포외막소포를 얻는 것이 곤란하다. 상기 초원심분리 처리에 의해 얻어진 침전 획분을 자당 밀도 구배법에 의해 밀도 분획함으로써 단백질 복합체나 응집체를 분리할 수는 있지만, 밀도가 동일한 HDL 과의 분리는 곤란하다. 또, 이 방법은 초원심분리 처리가 필요한 점에서 다검체를 동시에 처리하는 것도 곤란하다. 또한, 초원심분리 처리에는, 고가의 기계가 필요하다.
또, ExoQuick (System Biosciences 사 제조) 이나 Total Exosome Isolation Reagent (서모피셔 사이언티픽사 제조) 로 대표되는 시판되는 시약을 첨가하여 원심분리 처리에 의해 침전 획분으로서 세포외막소포를 얻는 방법도 있지만 (비특허문헌 1), 상기 초원심분리 처리에 의한 방법보다 얻어지는 세포외막소포의 순도가 더욱 낮다는 문제가 있다.
이들 종래법 외에, 세포외막소포의 표면 항원 단백질에 대한 항체를 사용하여, 당해 표면 항원 단백질과 항체의 어피니티에 의해 세포외막소포를 취득하는 방법 (항CD63 항체 고정화법, Exosome-Human CD63 Isolation/Detection (서모피셔 사이언티픽사 제조) 등) 이 있다 (비특허문헌 1). 이들 방법에서는, 고순도의 세포외막소포가 얻어지지만, 항체에 대한 표면 항원 단백질을 갖는 세포외막소포밖에 얻을 수 없고, 세포외막소포의 수량이 적고, 항체로부터 세포외막소포를 용출시키기 위해서 계면활성제나 산성 버퍼 등을 사용할 필요가 있고, 인택트한 (즉, 세포외막소포의 본래의 기능을 유지한 채의 상태로) 세포외막소포를 얻는 것이 곤란하다는 등의 문제가 있다.
바이러스를 취득하는 방법으로는 샘플을 초원심분리 처리하고, 바이러스를 침전 획분으로서 얻는 방법이 가장 일반적인 방법으로서 알려져 있다 (비특허문헌 1). 그러나, 이 방법에서는 바이러스 이외에, 샘플 중에 포함되는 단백질 복합체나 응집체, HDL 등의 리포 단백질 등도 공침하여, 순도가 높은 바이러스를 얻는 것이 곤란하다. 상기 초원심분리 처리에 의해 얻어진 침전 획분을 자당 밀도 구배법에 의해 밀도 분획함으로써 단백질 복합체나 응집체를 분리할 수는 있지만, 밀도가 동일한 응집체와의 분리는 곤란하다. 또, 초원심분리 처리에 의해 바이러스의 활성이 떨어져 버린다는 문제도 있다 (비특허문헌 2). 또, 이들 방법은 초원심분리 처리가 필요하므로 다검체를 동시에 처리하는 것도 곤란하다. 또한, 초원심분리 처리에는, 고가의 기계가 필요하다.
이들 방법 외에 이온 교환 크로마토그래피로 바이러스를 정제하는 방법이 알려져 있다 (비특허문헌 3). 그러나, 이 방법에서는 각각의 바이러스에 대해 최적의 조건을 설정할 필요가 있다. 또, 조건 설정이 곤란한 경우도 있어, 모든 바이러스의 정제에 적용시키는 것은 곤란하다.
세포외막소포를 제거하는 방법으로는, 샘플을 초원심분리 처리하고, 세포외막소포를 침전 분획하고, 그 상청 획분을 제거 샘플로서 얻는 방법이 가장 일반적인 방법으로서 알려져 있다. 그러나 이 방법으로는 완전히 세포외막소포를 제거하는 것은 곤란하여, 다 제거할 수 없는 세포외막소포가 샘플에 잔존해 버린다.
또한, ExoQuick (System Biosciences 사 제조) 이나 Total Exosome Isolation Reagent (서모피셔 사이언티픽사 제조) 로 대표되는 시판되는 시약을 첨가하여 원심분리 처리에 의해 세포외막소포를 침전 분획하고, 그 상청 획분을 제거 샘플로서 얻는 방법도 있다. 그러나 이 방법에 있어서도 다 제거할 수 없어 샘플 중에 세포외막소포가 잔존하여, 완전히 세포외막소포를 제거하는 것이 곤란하였다. 또 샘플 중에 첨가한 시약이 혼입하기 때문에, 그 시약이 세포외막소포의 생물 활성 등에 문제를 일으키는 경우가 있었다.
바이러스를 제거하는 방법으로서도 동일한 방법이 알려져 있고, 세포외막소포를 제거하는 방법과 동일한 문제가 있었다.
세포외막소포를 검출하는 방법으로는, 세포외막소포의 표면 항원에 대한 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 가 일반적인 방법으로서 알려져 있다. 그러나 통상적인 발색 시그널을 검출하는 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 계의 최저 검출 감도는 정제 엑소좀에서 3 ㎍ 정도라고 보고되어 있고, 혈청 등의 체액 샘플을 측정하는 데에 있어서 충분한 감도가 얻어지고 있지 않았다 (비특허문헌 4). 바이러스를 검출하는 방법으로서도 동일한 방법이 알려져 있고, 바이러스의 검출에 대해서도 충분한 감도가 얻어지고 있지 않았다.
또 그 밖의 세포외막소포를 검출하는 방법으로는, 플로 사이토메트리법이 알려져 있다. 그러나, 세포외막소포의 표면 항원에 대한 항체를 고정화한 담체를 사용하여 세포외막소포를 포착하는 통상적인 방법에서는, 충분한 감도가 얻어지고 있지 않고, 배양 상청 또는 체액 등의 샘플로부터 직접 검출하는 것은 곤란하여, 샘플로부터 세포외막소포를 농축 또는 정제하고 나서 검출할 필요가 있었다.
Kenneth W. Witwer et al. Journal of Extracellular Vesicles 2013 May 27 ; 2. doi : 10.3402
G. Y. Chen et al. Biotechnol. Prog. 25 (2009) 1669
Petra Gerster et al. Journal of Chromatography A, 1290 (2013) 36-45
Mariantonia Logozzi et al. PLoS ONE 4 (2009) 5219
이상과 같이, 종래의 세포외막소포 또는 바이러스를 취득하는 방법은, 순도가 높은 세포외막소포 또는 바이러스를 인택트한 상태로 간편하게 또한 효율적으로 취득하는 것이 곤란하다. 또, 종래의 세포외막소포 또는 바이러스를 제거하는 방법은, 샘플 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 효율적으로 제거하는 것이 곤란하다. 또한 종래의 세포외막소포 또는 바이러스의 검출 방법은 충분한 감도가 얻어지고 있지 않다.
따라서, 본 발명의 과제는, 시료 중에 존재하는 세포외막소포 또는 바이러스를 순도 양호하게, 또 인택트한 상태로 간편 또한 효율적으로 취득 또는 제거하여, 세포외막소포 또는 바이러스를 고감도로 검출하는 것이다.
본 발명은, 상기 과제를 해결할 목적으로 이루어진 것으로, 이하의 구성으로 이루어진다.
1. T 세포 면역 글로불린·뮤신 도메인 함유 분자 4 (Tim4) 단백질, T 세포 면역 글로불린·뮤신 도메인 함유 분자 3 (Tim3) 단백질, 및 T 세포 면역 글로불린·뮤신 도메인 함유 분자 1 (Tim1) 단백질로부터 선택되는 단백질 (Tim 단백질) 이 결합한 담체 (Tim 담체).
2. 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 취득하는 방법 ;
(1) 칼슘 이온 존재하, 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시키는 공정 (복합체 형성 공정)
(2) 당해 복합체와 시료를 분리하는 공정 (복합체 분리 공정)
(3) 당해 복합체로부터 세포외막소포 또는 바이러스를 분리하여, 세포외막소포 또는 바이러스를 취득하는 공정 (취득 공정).
3. 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 제거하는 방법 ;
(1) 칼슘 이온 존재하, 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시키는 공정 (복합체 형성 공정)
(2) 당해 복합체와 시료를 분리하는 공정 (복합체 분리 공정).
4. 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 검출하는 방법 ;
(1) 칼슘 이온 존재하, 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시키는 공정 (복합체 형성 공정)
(2) 당해 복합체를 검출하는 공정 (검출 공정)
5. Tim 담체를 포함하여 이루어지는, 세포외막소포 또는 바이러스의 포착용 키트.
6. Tim 단백질을 포함하여 이루어지는 시약과, 담체를 포함하여 이루어지는 시약을 포함하여 이루어지는 세포외막소포 또는 바이러스의 포착용 키트.
상기 상황을 감안하여, 본 발명자들은, 예의 연구의 결과, Tim1 단백질, Tim3 단백질 및 Tim4 단백질로부터 선택되는 적어도 1 종의 단백질을 사용함으로써, 포스파티딜세린을 표면에 갖는 세포외막소포 또는 바이러스를 고순도로 얻을 수 있는 것, 당해 세포외막소포 또는 바이러스를 인택트한 상태로 얻을 수 있는 것, 당해 세포외막소포 또는 바이러스를 효율적으로 제거하는 것, 이들을 고감도로 검출할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 발명하기에 이르렀다.
세포외막소포의 표면에는 인지질의 포스파티딜세린이 존재 (노출) 하고 있다. 포스파티딜세린에 대해 결합능을 갖는 단백질 (이하, 「포스파티딜세린 결합 단백질」 「PS 단백질」이라고 약기하는 경우가 있다) 로는, 예를 들어 Annexin V, MFG-E8, Tim1 (T 세포 면역 글로불린·뮤신 도메인 함유 분자 1, T-cell immunoglobulin-mucin-domain 1), Tim1 (T 세포 면역 글로불린·뮤신 도메인 함유 분자 1, T-cell immunoglobulin-mucin-domain 1) 단백질, Tim3 (T 세포 면역 글로불린·뮤신 도메인 함유 분자 3, T-cell immunoglobulin-mucin-domain 3) 단백질, Tim4 (T 세포 면역 글로불린·뮤신 도메인 함유 분자 4, T-cell immunoglobulin-mucin-domain 4) 단백질 등이 알려져 있다 (The Journal of Biochemistry 265, 4923-4928 (25 March 1990), Nature 417, 182-187 (9 May 2002), Nature 450, 435-439 (15 November 2007).
그러나, 이들 PS 단백질 중, Tim1 단백질, Tim3 단백질 및 Tim4 단백질 이외의 PS 단백질을 사용한 경우에는, 세포외막소포 또는 바이러스를 취득, 제거 또는 검출하는 것은 곤란한 것을 알 수 있었다.
본 발명은, 이하의 구성으로 이루어진다.
1. T 세포 면역 글로불린·뮤신 도메인 함유 분자 4 (Tim4) 단백질, T 세포 면역 글로불린·뮤신 도메인 함유 분자 3 (Tim3) 단백질, 및 T 세포 면역 글로불린·뮤신 도메인 함유 분자 1 (Tim1) 단백질로부터 선택되는 단백질 (Tim 단백질) 이 결합한 담체 (Tim 담체).
2. 1. 에 있어서, 세포외막소포 또는 바이러스의 포착용인, Tim 담체.
3. 1. 에 있어서, Tim 단백질이 IgV 도메인을 포함하는 것인, Tim 담체.
4. 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 취득하는 방법 ;
(1) 칼슘 이온 존재하, 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시키는 공정 (복합체 형성 공정)
(2) 당해 복합체와 시료를 분리하는 공정 (복합체 분리 공정)
(3) 당해 복합체로부터 세포외막소포 또는 바이러스를 분리하고, 세포외막소포 또는 바이러스를 취득하는 공정 (취득 공정).
5. 4. 에 있어서, 복합체 형성 공정이 칼슘 이온 존재하, Tim 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시켜, 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시키는 공정인, 방법.
6. 4. 에 있어서, 복합체 형성 공정이 칼슘 이온 존재하, Tim 단백질과, 담체와, 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시켜, 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시키는 공정인, 방법.
7. 4. 에 있어서, 취득 공정이 단백질 변성제를 사용하여 실시되는, 방법.
8. 4. 에 있어서, 취득 공정이 칼슘 이온 킬레이트제를 사용하여 실시되는, 방법.
9. 4. 에 있어서, Tim 단백질이 IgV 도메인을 포함하는 것인, 방법.
10. 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 제거하는 방법 ;
(1) 칼슘 이온 존재하, 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시키는 공정 (복합체 형성 공정)
(2) 당해 복합체와 시료를 분리하는 공정 (복합체 분리 공정).
11. 10. 에 있어서, 복합체 형성 공정이 칼슘 이온 존재하, Tim 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시켜, 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시키는 공정인, 방법.
12. 10. 에 있어서, Tim 단백질이 IgV 도메인을 포함하는 것인, 방법.
13. 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 검출하는 방법 ;
(1) 칼슘 이온 존재하, 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시키는 공정 (복합체 형성 공정)
(2) 당해 복합체를 검출하는 공정 (검출 공정)
14. 13. 에 있어서, 세포외막소포 또는 바이러스를 검출하는 방법이 ELISA 법 또는 플로 사이토메트리법인 방법.
15. 13. 에 있어서, Tim 단백질이 IgV 도메인을 포함하는 것인, 방법.
16. 13. 에 있어서, 담체와 Tim 단백질이, Tim 단백질의 SH 기를 개재하여 결합한 것인, 방법.
17. Tim 담체를 포함하여 이루어지는, 세포외막소포 또는 바이러스의 포착용 키트.
18. Tim 단백질을 포함하여 이루어지는 시약과, 담체를 포함하여 이루어지는 시약을 포함하여 이루어지는 세포외막소포 또는 바이러스의 포착용 키트.
본 발명에 의하면, 시료 중에 존재하는 세포외막소포 또는 바이러스를 고순도로, 또 인택트한 상태로 간편 또한 효율적으로 취득, 제거할 수 있고, 고감도로 검출할 수 있다.
도 1 은 실시예 1-8 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 2 는 실시예 9-16 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 3 은 실시예 17-18 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 4-A 는 실시예 19-20 및 비교예 1-3 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다. 도 4-B 는 실시예 19-20 및 비교예 1-3 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 은 염색에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 5 는 실시예 21 에 있어서, 본 발명의 방법에 의해 취득한 세포외막소포를, 전자현미경에 의해 관찰한 도면이다.
도 6 은 실시예 22-25 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 7 은 실시예 26-27 및 비교예 4-9 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 은 염색에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 8 은 실시예 28-33 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를, 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 9 는 실시예 34-35 및 비교예 10-13 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 10 은 실시예 36-38 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 11 은 실시예 39-40 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 12 는 실시예 41-47 에 있어서, 세포외막소포의 취득 (제거) 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 13 은 실시예 48-55 에 있어서, 세포외막소포의 취득 (제거) 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 14 는 실시예 56-67 및 비교예 14-15 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 15 는 실시예 68-79 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 16 은 실시예 80-83 및 비교예 16-19 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 17 은 실시예 84-95 및 비교예 20-21 에 있어서, 바이러스의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 18 은 실시예 96-99 및 비교예 22-25 에 있어서, 바이러스의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 19 는 실시예 100-105 및 비교예 26-33 에 있어서, 세포외막소포를 ELISA 법에 의해 검출한 결과이다.
도 20 은 실시예 106-109 에 있어서, 세포외막소포를 ELISA 법에 의해 검출한 결과이다.
도 21 은 실시예 110-115 및 비교예 34-39 에 있어서, 바이러스를 ELISA 법에 의해 검출한 결과이다.
도 22 는 실시예 116-119 에 있어서, 바이러스의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 23 은 실시예 120-121 및 비교예 40-41 에 있어서, 세포외막소포를 플로 사이토메트리법에 의해 검출한 결과이다.
도 24 는 실시예 122-123 및 비교예 42-43 에 있어서, 바이러스의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 25 는 실시예 124-125 및 비교예 44-45 에 있어서, 바이러스의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 2 는 실시예 9-16 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 3 은 실시예 17-18 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 4-A 는 실시예 19-20 및 비교예 1-3 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다. 도 4-B 는 실시예 19-20 및 비교예 1-3 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 은 염색에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 5 는 실시예 21 에 있어서, 본 발명의 방법에 의해 취득한 세포외막소포를, 전자현미경에 의해 관찰한 도면이다.
도 6 은 실시예 22-25 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 7 은 실시예 26-27 및 비교예 4-9 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 은 염색에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 8 은 실시예 28-33 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를, 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 9 는 실시예 34-35 및 비교예 10-13 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 10 은 실시예 36-38 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 11 은 실시예 39-40 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 12 는 실시예 41-47 에 있어서, 세포외막소포의 취득 (제거) 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 13 은 실시예 48-55 에 있어서, 세포외막소포의 취득 (제거) 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 14 는 실시예 56-67 및 비교예 14-15 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 15 는 실시예 68-79 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 16 은 실시예 80-83 및 비교예 16-19 에 있어서, 세포외막소포의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 17 은 실시예 84-95 및 비교예 20-21 에 있어서, 바이러스의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 18 은 실시예 96-99 및 비교예 22-25 에 있어서, 바이러스의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 19 는 실시예 100-105 및 비교예 26-33 에 있어서, 세포외막소포를 ELISA 법에 의해 검출한 결과이다.
도 20 은 실시예 106-109 에 있어서, 세포외막소포를 ELISA 법에 의해 검출한 결과이다.
도 21 은 실시예 110-115 및 비교예 34-39 에 있어서, 바이러스를 ELISA 법에 의해 검출한 결과이다.
도 22 는 실시예 116-119 에 있어서, 바이러스의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 23 은 실시예 120-121 및 비교예 40-41 에 있어서, 세포외막소포를 플로 사이토메트리법에 의해 검출한 결과이다.
도 24 는 실시예 122-123 및 비교예 42-43 에 있어서, 바이러스의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
도 25 는 실시예 124-125 및 비교예 44-45 에 있어서, 바이러스의 취득 유무를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 전기 영동도이다.
＜1. 본 발명에 관련된 세포외막소포＞
본 발명에 관련된 세포외막소포로는, 생체 내의 세포 또는 배양 세포로부터 분비되는, 지질 이중막으로 구성되고, 그 막 표면에 포스파티딜세린을 갖는 소형 막소포이다. 당해 소포의 직경은, 통상 20 ㎚ 내지 1000 ㎚, 바람직하게는 50 ㎚ 내지 500 ㎚, 보다 바람직하게는 50 ㎚ 내지 200 ㎚ 이다.
본 발명에 관련된 세포외막소포는, Nature Reviews Immunology 9, 581-593 (August 2009), 「비만 연구」 Vol.13 No.2 2007 토픽스 아오키 나오토 등에 기재된 바와 같이, 그 발생 기원 및 소형 막소포의 크기 등에 따라 여러 가지로 분류되는 것을 들 수 있다. 구체적으로는, 엑소좀 (Exosomes), 미소포 (microvesicle), 엑토좀 (Ectosomes), 막입자 (Membrane particles), 엑소좀 유사 소포 (Exosome-like vesicles), 아포토시스성 소포 (Appototic vesicles), 아디포좀 (Adiposome) 등을 들 수 있다.
엑소좀은, 후기 엔도좀에서 유래하는, 지질 이중막으로 구성되고, 그 막표면에 포스파티딜세린을 갖는 소형 막소포이다. 당해 소포의 직경은, 통상 50 ㎚ 내지 200 ㎚, 바람직하게는 50 ㎚ 내지 150 ㎚, 보다 바람직하게는 50 ㎚ 내지 100 ㎚ 이다. 엑소좀은, CD63 이나 CD9 등의 테트라스파닌 (tetraspanins), Alix, TSG101, Lamp-1, Flotillin 등의 단백질을 포함하는 것이 알려져 있다.
미소포는, 세포막 (plasma menmbrane) 에서 유래하는, 지질 이중막으로 구성되고, 그 막표면에 포스파티딜세린을 갖는 소형 막소포이다. 미소포는, 통상 100 ㎚ 내지 1000 ㎚, 바람직하게는 100 ㎚ 내지 800 ㎚, 보다 바람직하게는 100 ㎚ 내지 500 ㎚ 이다. 미소포는, 인테그린, 셀렉틴, CD40 리간드 등의 단백질을 포함하는 것이 알려져 있다.
엑토좀은, 세포막 (plasma menmbrane) 에서 유래하는, 지질 이중막으로 구성되고, 그 막표면에 포스파티딜세린을 갖는 소형 막소포이다. 엑토좀은, 통상 50 ㎚ 내지 200 ㎚, 바람직하게는 50 ㎚ 내지 150 ㎚, 보다 바람직하게는 50 ㎚ 내지 100 ㎚ 이다. 엑토좀은, CR1, 단백질 분해 효소 (proteolytic enzyme) 를 포함하지만, CD63 은 포함하지 않는 것이 알려져 있다.
막입자는, 세포막 (plasma menmbrane) 에서 유래하는, 지질 이중막으로 구성되고, 그 막표면에 포스파티딜세린을 갖는 소형 막소포이다. 막입자는, 통상 50 ㎚ 내지 80 ㎚ 이다. 막입자는, CD133 을 포함하지만, CD63 은 포함하지 않는 것이 알려져 있다.
엑소좀 유사 소포는, 초기 엔도좀에서 유래하는, 지질 이중막으로 구성되고, 그 막표면에 포스파티딜세린을 갖는 소형 막소포이다. 엑소좀 유사 소포는, 통상 20 ㎚ 내지 50 ㎚ 이다. 엑소좀 유사 소포는, TNFRI 를 포함하는 것이 알려져 있다.
아포토시스성 소포는, 아포토시스 세포에서 유래하는, 지질 이중막으로 구성되고, 그 막표면에 포스파티딜세린을 갖는 소형 막소포이다. 아포토시스성 소포는, 통상 50 ㎚ 내지 500 ㎚, 바람직하게는 50 ㎚ 내지 300 ㎚, 보다 바람직하게는 50 ㎚ 내지 200 ㎚ 이다. 아포토시스성 소포는, 히스톤을 포함하는 것이 알려져 있다.
아디포좀은, 지방 세포에서 유래하는, 지질 이중막으로 구성되고, 그 막표면에 포스파티딜세린을 갖는 소형 막소포이다. 아디포좀은, 통상 100 ㎚ 내지 1000 ㎚, 바람직하게는 100 ㎚ 내지 800 ㎚, 보다 바람직하게는 100 ㎚ 내지 500 ㎚ 이다. 아디포좀은, MFG-E8 (milk fat globule-EGF factor 8) 을 포함하는 것이 알려져 있다.
＜2. 본 발명에 관련된 바이러스＞
본 발명에 관련된 바이러스로는, 숙주 세포의 세포막, 핵막, 골지체, 소포체 등에서 유래하는 지질 이중막으로 구성되는 엔벨로프를 바이러스의 캡시드 (외각) 에 갖고, 엔벨로프 표면에 포스파티딜세린을 갖는 바이러스 (이하, 「엔벨로프 바이러스」라고 부른다) 이다. 당해 본 발명에 관련된 바이러스의 직경은, 통상 20 ㎚ ∼ 320 ㎚ 이다. 본 발명에 관련된 엔벨로프 바이러스로는, 생화학 사전 제2판, 토쿄 화학 동인, 1990, 1503 p-1505 p 에 기재되어 있는 과에 속하는 엔벨로프를 갖는 바이러스를 들 수 있다. 구체적으로는, 폭스 바이러스과, 바큘로 바이러스과, 랩도 바이러스과, 분야 바이러스과, 토가 바이러스과, 헤르페스 바이러스과, 파라믹소 바이러스과, 오르토믹소 바이러스과, 레트로 바이러스과, 아레나 바이러스과, 코로나 바이러스과 등을 들 수 있다.
＜3. 본 발명에 관련된 Tim 단백질＞
본 발명에 관련된 Tim 단백질이란, 본 발명에 관련된 T 세포 면역 글로불린·뮤신 도메인 함유 분자 1 (Tim1) 단백질 (이하, 「본 발명에 관련된 Tim1 단백질」이라고 약기하는 경우가 있다), 본 발명에 관련된 T 세포 면역 글로불린·뮤신 도메인 함유 분자 3 (Tim3) 단백질 (이하, 「본 발명에 관련된 Tim3 단백질」이라고 약기하는 경우가 있다), 및 본 발명에 관련된 T 세포 면역 글로불린·뮤신 도메인 함유 분자 4 (Tim4) 단백질 (이하, 「본 발명에 관련된 Tim4 단백질」이라고 약기하는 경우가 있다) 로부터 선택되는 적어도 1 종의 Tim 단백질이다.
본 발명에 관련된 Tim4 (T 세포 면역 글로불린·뮤신 도메인 함유 분자 4) 단백질로는, 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스에 결합할 수 있는 것이면 되고, 동물에서 유래하는 Tim4 단백질이 바람직하다. 그 중에서도, 인간, 또는 마우스가 갖는 Tim4 단백질이 바람직하다 (이하, 인간이 갖는 Tim4 단백질을 「인간 유래 Tim4 단백질」, 마우스가 갖는 Tim4 단백질을 「마우스 유래 Tim4 단백질」이라고 약기하는 경우가 있다).
보다 구체적으로는, 적어도 포스파티딜세린에 대한 결합 도메인 (IgV 도메인) 의 아미노산 배열을 가지고 있는 것이면 되고, Tim4 단백질의 전체 길이의 아미노산 배열을 갖는 것이어도, Tim4 단백질의 일부여도 된다.
상기 포스파티딜세린에 대한 결합 도메인 (IgV 도메인) 의 아미노산 배열로는, 예를 들어 배열 번호 1 (마우스 유래 Tim4 단백질의 N 말단 22 ∼ 135 아미노산 영역 (RefSeq NP_848874.3), 배열 번호 2 (인간 유래 Tim4 단백질의 N 말단 25 ∼ 137 아미노산 영역 (RefSeq NP_612388.2) 등을 들 수 있다.
상기 Tim4 단백질의 전체 길이의 아미노산 배열로는, 배열 번호 3 (마우스 유래 Tim4 단백질의 전체 길이 배열 1 ∼ 343 아미노산 영역 (RefSeq NP_848874.3)), 배열 번호 4 (인간 유래 Tim4 단백질의 전체 길이 배열 1 ∼ 378 아미노산 영역 (RefSeq NP_612388.2)) 등을 들 수 있다.
당해 Tim4 단백질의 일부로는, 배열 번호 5 (마우스 유래 Tim4 단백질의 N 말단 22 ∼ 273 아미노산 영역 (RefSeq NP_848874.3)), 배열 번호 6 마우스 유래 Tim4 단백질의 N 말단 22 ∼ 279 아미노산 영역 (RefSeq NP_848874.3), 배열 번호 7 인간 유래 Tim4 단백질의 N 말단 25 ∼ 315 아미노산 영역 (RefSeq NP_612388.2) 등의 포스파티딜세린에 대한 결합 도메인 (IgV 도메인) 및 뮤신 도메인의 아미노산 배열을 갖는 것 등을 들 수 있다. 필요하다면, 이들 배열은 시그널 배열을 갖는 것이어도 된다.
본 발명에 관련된 Tim1 (T 세포 면역 글로불린·뮤신 도메인 함유 분자 1) 단백질로는, 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스에 결합할 수 있는 것이면 되고, 동물에서 유래하는 Tim1 단백질이 바람직하다. 그 중에서도 인간 또는 마우스가 갖는 Tim1 단백질이 바람직하다 (이하, 인간이 갖는 Tim1 단백질을 「인간 유래 Tim1 단백질」, 마우스가 갖는 Tim1 단백질을 「마우스 유래 Tim1 단백질」이라고 약기하는 경우가 있다).
보다 구체적으로는, 적어도 포스파티딜세린에 대한 결합 도메인 (IgV 도메인) 의 아미노산 배열을 가지고 있는 것이면 되고, Tim1 단백질의 전체 길이의 아미노산 배열을 갖는 것이어도, Tim1 단백질의 일부여도 된다.
상기 포스파티딜세린에 대한 결합 도메인 (IgV 도메인) 의 아미노산 배열로는, 예를 들어 배열 번호 8 (마우스 유래 Tim1 단백질의 N 말단 22 ∼ 131 아미노산 영역 (RefSeq NP_001160104.1), 배열 번호 9 (인간 유래 Tim1 단백질의 N 말단 21 ∼ 130 아미노산 영역 (RefSeq NP_036338.2) 등을 들 수 있다.
상기 Tim1 단백질의 전체 길이의 아미노산 배열로는, 배열 번호 10 (마우스 유래 Tim1 단백질의 전체 길이 배열 1 ∼ 282 아미노산 영역 (RefSeq NP_001160104.1))), 배열 번호 11 (인간 유래 Tim1 단백질의 전체 길이 배열 1 ∼ 364 아미노산 영역 (RefSeq NP_036338.2) 등을 들 수 있다.
당해 Tim1 단백질의 일부로는, 배열 번호 12 (마우스 유래 Tim1 단백질의 N말단 22 ∼ 212 아미노산 영역 (RefSeq NP_001160104.1)), 배열 번호 13 인간 유래 Tim1 단백질의 N 말단 21 ∼ 295 아미노산 영역 (RefSeq NP_612388.2) 등의 포스파티딜세린에 대한 결합 도메인 (IgV 도메인) 및 뮤신 도메인의 아미노산 배열을 갖는 것 등을 들 수 있다. 필요하다면, 이들 배열은 시그널 배열을 갖는 것이어도 된다.
본 발명에 관련된 Tim3 (T 세포 면역 글로불린·뮤신 도메인 함유 분자 3) 단백질로는, 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스에 결합할 수 있는 것이면 되고, 동물에서 유래하는 Tim3 단백질이 바람직하다. 그 중에서도, 인간 또는 마우스가 갖는 Tim3 단백질이 바람직하다 (이하, 인간이 갖는 Tim3 단백질을 「인간 유래 Tim3 단백질」, 마우스가 갖는 Tim3 단백질을 「마우스 유래 Tim3 단백질」이라고 약기하는 경우가 있다).
보다 구체적으로는, 적어도, 포스파티딜세린에 대한 결합 도메인 (IgV 도메인) 의 아미노산 배열을 가지고 있는 것이면 되고, Tim3 단백질의 전체 길이의 아미노산 배열을 갖는 것이어도, Tim3 단백질의 일부여도 된다.
상기 포스파티딜세린에 대한 결합 도메인 (IgV 도메인) 의 아미노산 배열로는, 예를 들어 배열 번호 14 (마우스 유래 Tim3 단백질의 N 말단 22 ∼ 134 아미노산 영역 (RefSeq NP_599011.2), 배열 번호 15 (인간 유래 Tim3 단백질의 N 말단 22 ∼ 135 아미노산 영역 (RefSeq NP_116171.3) 등을 들 수 있다.
상기 Tim3 단백질의 전체 길이의 아미노산 배열로는, 배열 번호 16 (마우스 유래 Tim3 단백질의 전체 길이 배열 1 ∼ 281 아미노산 영역 (RefSeq NP_599011.2))), 배열 번호 17 (인간 유래 Tim3 단백질의 전체 길이 배열 1 ∼ 301 아미노산 영역 (RefSeq NP_116171.3) 등을 들 수 있다.
당해 Tim3 단백질의 일부로는, 배열 번호 18 (마우스 유래 Tim3 단백질의 N 말단 22 ∼ 189 아미노산 영역 (RefSeq NP_599011.2)), 배열 번호 19 인간 유래 Tim3 단백질의 N 말단 22 ∼ 200 아미노산 영역 (RefSeq NP_116171.3) 등의 포스파티딜세린에 대한 결합 도메인 (IgV 도메인) 및 뮤신 도메인의 아미노산 배열을 갖는 것 등을 들 수 있다. 필요하다면, 이들 배열은 시그널 배열을 갖는 것이어도 된다.
또, 본 발명에 관련된 Tim 단백질은, 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스에 결합할 수 있는 것이면, 상기한 아미노산 배열의 1 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가한 변이체여도 된다.
본 발명에 관련된 Tim 단백질은, 상기한 성질을 갖는 것이면 되고, 마우스나 인간 등의 동물이나 식물 등의 Tim 단백질을 갖는 생물의 세포 (예를 들어 매크로파지 등의 면역 세포) 나 조직 등으로부터 추출한 것, 이것을 기초로 유전자 재조합 기술에 의해 조제한 것 등, 어떤 것도 사용할 수 있다.
본 발명에 관련된 Tim 단백질로서, 유전자 재조합 기술에 의해 조제한 것을 사용하는 경우, 정제의 간편함으로부터 1 또는 복수의 어피니티 태그를 갖는 것이 바람직하다.
당해 어피니티 태그로는, 유전자 재조합 기술에 의해 단백질을 조제할 때에 사용되는 것이면 어느 것이라도 되고, 예를 들어 Fc 태그, FLAG 태그, His 태그, GST 태그, MBP 태그, HA 태그, Myc 태그, Strep (II) 태그, PA 태그 등의 어피니티 태그를 들 수 있다.
당해 어피니티 태그는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 C 말단측에 융합된다.
따라서, 본 발명에 관련된 Tim 단백질에는, Tim 단백질의 아미노산 배열 (전체 길이 또는 일부 배열) 만으로 이루어지는 단백질뿐만 아니라, Tim 단백질의 아미노산 배열 (전체 길이 또는 일부 배열) 과 상기한 바와 같이 어피니티 태그의 아미노산 배열을 갖는 단백질도 포함된다.
또, 상기한 어피니티 태그와 Tim 단백질이란, 직접 결합하고 있어도, 「 「곤충 배양 세포 유래 무세포 단백질 합성 시약 키트 Transdirect insect cell 을 사용한 단백질 발현」에즈레 토루, 스즈키 타카시, 이토 마사아키, 시카타 마사미츠 (시마즈 제작소·분석 계측 사업부) 공개일 2008/6/9 : 단백질 과학회 아카이브, 1, e005 (2008)」 등에 기재된 스페이서를 개재하여 결합하고 있어도 된다. 따라서, 본 발명에 관련된 Tim 단백질에는, Tim 단백질의 아미노산 배열 (전체 길이 또는 일부 배열) 과 상기한 바와 같이 어피니티 태그의 아미노산 배열과 스페이서의 아미노산 배열을 갖는 단백질도 포함된다.
＜4. 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 조제 방법＞
본 발명에 관련된 Tim 단백질은, 그 아미노산 배열에 따라, 일반적인 화학적 제법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 플루오레닐메틸옥시카르보닐법 (Fmoc 법), t-부틸옥시카르보닐법 (tBoc 법) 등의 통상적인 화학적 제법 (화학 합성법) 에 의해, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 얻을 수 있다. 또, 시판되는 펩티드 합성기를 사용하여 화학 합성할 수도 있다.
또한, 본 발명에 관련된 Tim 단백질은, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 코드하는 핵산 분자를 적당한 플라스미드나 파지 등의 발현용 벡터에 편입하고, 숙주 세포를 재조합 발현 벡터를 사용하여 형질 전환 (또는 형질 도입) 시키고, 얻어진 숙주 세포를 증폭시키고, 세포 내 또는 세포 외로 분비시킨다고 하는 유전자 재조합 기술을 사용한 주지의 방법으로도 얻을 수 있다.
본 발명에 관련된 Tim 단백질의 조제 방법에 대해, 유전자 재조합 기술에 의해 조제하는 경우에 대해, 이하에 설명한다.
＜본 발명에 관련된 발현용 벡터＞
본 발명에 관련된 Tim 단백질을 발현시키기 위한 발현용 벡터 (이하, 본 발명에 관련된 발현용 벡터라고 한다) 는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 코드하는 핵산 배열 (이하, 「본 발명에 관련된 Tim 코드 배열」이라고 약기하는 경우가 있다) 을 포함하는 것이면, 어느 것이라도 된다.
본 발명에 관련된 Tim 코드 배열 중, Tim4 단백질을 코드하는 핵산 배열로는, 예를 들어 배열 번호 20 (마우스 유래 Tim4 단백질의 전체 길이 배열 1 ∼ 343 아미노산 영역을 코드하는 cDNA 의 염기 배열 (RefSeq No.NM_178759.4). 말단 3 염기에 종지 코돈 (tga) 을 포함한다), 배열 번호 21 (인간 유래 Tim4 단백질의 전체 길이 배열 1 ∼ 378 아미노산 영역을 코드하는 cDNA 의 염기 배열 (RefSeq No.NM_138379.2). 말단 3 염기에 종지 코돈 (taa) 을 포함힌다) 등을 들 수 있다.
본 발명에 관련된 Tim1 단백질을 코드하는 핵산 배열로는, 예를 들어 배열 번호 22 (마우스 유래 Tim1 단백질의 전체 길이 배열 1 ∼ 282 아미노산 영역을 코드하는 cDNA 의 염기 배열 (RefSeq No.NM_001166632.1). 말단 3 염기에 종지 코돈 (tga) 을 포함한다), 배열 번호 23 (인간 유래 Tim1 단백질의 전체 길이 배열 1 ∼ 364 아미노산 영역을 코드하는 cDNA 의 염기 배열 (RefSeq No.NM_012206.3). 말단 3 염기에 종지 코돈 (taa) 을 포함한다) 등을 들 수 있다.
본 발명에 관련된 Tim3 단백질을 코드하는 핵산 배열로는 예를 들어 배열 번호 24 (마우스 유래 Tim3 단백질의 전체 길이 배열 1 ∼ 281 아미노산 영역을 코드하는 cDNA 의 염기 배열 (RefSeq No.NM_134250.2). 말단 3 염기에 종지 코돈 (tga) 을 포함한다), 배열 번호 25 (인간 유래 Tim3 단백질의 전체 길이 배열 1 ∼ 301 아미노산 영역을 코드하는 cDNA 의 염기 배열 (RefSeq No.NM_032782.4). 말단 3 염기에 종지 코돈 (tag) 을 포함한다) 등을 들 수 있다.
본 발명에 관련된 발현용 벡터로는, 시판되고 있는 벡터에, 통상적인 방법의 클로닝 방법에 따라, 본 발명에 관련된 Tim 코드 배열을 유전자 도입하면 된다. 본 발명에 관련된 발현용 벡터로는, 예를 들어 통상적인 방법의 클로닝 기술에 따라, 배열 번호 26 (마우스 유래 Tim4 단백질의 N 말단 1 ∼ 273 아미노산 영역을 코드하는 cDNA, 말단 3 염기에 종지 코돈 (tga) 을 포함한다), 배열 번호 27 (마우스 유래 Tim4 단백질의 N 말단 1 ∼ 279 아미노산 영역을 코드하는 cDNA, 말단 3 염기에 종지 코돈 (tga) 을 포함한다), 배열 번호 28 (인간 유래 Tim4 단백질의 N 말단 1 ∼ 315 아미노산 영역을 코드하는 cDNA, 말단 3 염기에 종지 코돈 (tga) 을 포함한다), 배열 번호 29 (마우스 유래 Tim1 단백질의 N 말단 1 ∼ 212 아미노산 영역을 코드하는 cDNA, 말단 3 염기에 종지 코돈 (tga) 을 포함한다), 배열 번호 30 (인간 유래 Tim1 단백질의 N 말단 1 ∼ 295 아미노산 영역을 코드하는 cDNA, 말단 3 염기에 종지 코돈 (tga) 을 포함한다), 배열 번호 31 (마우스 유래 Tim3 단백질의 N 말단 1 ∼ 189 아미노산 영역을 코드하는 cDNA, 말단 3 염기에 종지 코돈 (tga) 을 포함한다), 또는 배열 번호 32 (인간 유래 Tim3 단백질의 N 말단 1 ∼ 200 아미노산 영역을 코드하는 cDNA, 말단 3 염기에 종지 코돈 (tga) 을 포함한다) 를 예를 들어 시판되는 pCAG-Neo 벡터 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 등의 발현 벡터에 편입한 벡터 등을 들 수 있다. Tim 코드 배열을 유전자 도입하는 벡터로는, 숙주 세포 중에서 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 발현하고, 생산하는 기능을 갖는 것이면 되고, 시판되고 있는 벡터를 이용하면 간편하다. 이 목적으로 사용되는 시판되고 있는 벡터로는, 숙주가 동물 세포인 경우에는, pCAG-Neo 벡터, pcDNA 벡터 등을 들 수 있다.
＜숙주＞
숙주로는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 발현 가능한 것이면 어떤 것이라도 되고, 예를 들어 대장균, 곤충 세포, 포유류 세포, 식물 세포, 효모 세포 등을 들 수 있고, 포유류 세포가 바람직하다. 포유류 세포로는, 예를 들어 HEK293T 세포, COS-7 세포, CHO-K1 세포, CHO-S 세포 등을 들 수 있다.
＜숙주에의 유전자 도입＞
본 발명에 관련된 발현용 벡터를, 「목적별로 선택할 수 있는 단백질 발현 프로토콜, 제3장 단백질 발현 프로토콜, ISBN978-4-7581-0175-2, 요도사」등에 기재된 벡터를 숙주에 유전자 도입하는 수법의 통상적인 방법에 따라, 숙주에 유전자 도입한다.
＜숙주의 배양＞
유전자 도입을 실시한 숙주를, 숙주를 배양하는 수법의 통상적인 방법에 따라 배양한다. 배양 조건으로는, 유전자 도입을 실시한 숙주에 따라 상이하지만, 숙주마다의 통상적인 방법에 따르면 되고, 예를 들어 동물 세포이면 통상 5 ∼ 10 ％, 바람직하게는 5 ∼ 8 ％ CO2 하, 통상 36 ℃ ∼ 38 ℃, 바람직하게는 36.5 ℃ ∼ 37.5 ℃ 에서, 1 일 ∼ 10 일간, 바람직하게는 3 일 ∼ 4 일간 배양하면 된다. 또한, 본 발명에 관련된 Tim 단백질은 막 관통 도메인과 세포 내 도메인을 포함하지 않기 때문에, 배양 상청 중에 발현, 분비된다.
＜본 발명에 관련된 Tim 단백질의 정제＞
이어서, 얻어진 유전자 도입한 숙주의 배양액을, 원심분리 처리 (통상 200 ∼ 400 × g 로 3 분간 ∼ 10 분간, 바람직하게는 300 × g 로 3 분간 ∼ 6 분간) 하여 배양 상청을 회수하고, 필요하다면 (i) 통상 1000 ∼ 2000 × g 로 20 분간 ∼ 60 분간, 바람직하게는 1200 × g 로 20 분간 ∼ 40 분간, 회수한 배양 상청을 원심분리 처리하고, 및/또는 (ii) 필터 여과 처리를 실시하고, 불순물을 분리하여, 배양 상청 여과액을 얻어도 된다.
또한 필요하다면, 얻어진 배양 상청 여과액을, 한외 여과 등의 통상적인 방법에 따라, 통상 5 배 ∼ 20 배, 바람직하게는 8 배 ∼ 12 배로 농축하여 배양 상청 여과액의 농축액을 얻어도 된다.
이어서, 본 발명에 관련된 Tim 단백질이 어피니티 태그를 갖는 경우는, 「목적별로 선택할 수 있는 단백질 발현 프로토콜, 제3장 단백질 발현 프로토콜, 제6절 단백질의 정제 태그에 의한 정제, ISBN978-4-7581-0175-2, 요도사」등에 기재된 어피니티 태그마다의 어피니티 태그를 이용한 단백질의 정제 방법의 통상적인 방법 (예를 들어, 어피니티 태그에 친화성을 갖는 물질을 고정화한 담체를 사용한 방법) 에 따라, 얻어진 배양 상청, 얻어진 배양 상청 여과액, 또는 얻어진 배양 상청 여과액의 농축액으로부터, 본 발명에 관련된 Tim 단백질 (Tim 단백질과 어피니티 태그의 융합 단백질) 을 정제하면 된다.
본 발명에 관련된 Tim 단백질이 어피니티 태그를 갖지 않는 경우에는, 「목적별로 선택할 수 있는 단백질 발현 프로토콜, 제3장 단백질 발현 프로토콜, 제6절 단백질의 정제 크로마토그래피에 의한 정제, ISBN978-4-7581-0175-2, 요도사」등에 기재된 단백질의 정제 방법의 통상적인 방법에 따라, 각종 크로마토그래피에 의해, 얻어진 배양 상청, 얻어진 배양 상청 여과액, 또는 얻어진 배양 상청 여과액의 농축액으로부터, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 정제하면 된다.
상기 정제 방법을 적절히 조합하여 정제를 실시해도 된다.
＜본 발명에 관련된 Tim 단백질의 구체적인 조제 방법＞
본 발명에 관련된 Tim 단백질의 구체적인 조제 방법으로는, 예를 들어 어피니티 태그로서 Fc 태그를 사용한 경우, 이하의 방법을 들 수 있다. 먼저, 통상적인 방법에 따라, 본 발명에 관련된 Tim 코드 배열을 pEF-Fc 벡터 또는 시판되는 벡터에 편입하고, 본 발명에 관련된 발현용 벡터를 구축한다. 이어서, 통상적인 방법에 따라, 숙주 세포에 본 발명에 관련된 발현용 벡터를 유전자 도입하고, 통상 5 ∼ 10 ％, 바람직하게는 5 ∼ 8 ％ CO2 하, 36 ℃ ∼ 38 ℃, 바람직하게는 36.5 ℃ ∼ 37.5 ℃ 에서, 1 일 ∼ 10 일간, 바람직하게는 3 일 ∼ 4 일간 배양한다. 이어서, 얻어진 유전자 도입한 숙주의 배양액을, 원심분리 처리 (통상 200 ∼ 400 × g 로 3 분간 ∼ 10 분간, 바람직하게는 300 × g 으로 3 분간 ∼ 6 분간) 하여 배양 상청을 회수하고, 필요하다면 (i) 통상 1000 ∼ 2000 × g 로 20 분간 ∼ 60 분간, 바람직하게는 1200 × g 로 20 분간 ∼ 40 분간, 회수한 배양 상청을 원심분리 처리하고, 및/또는 (ii) 필터 여과 처리를 실시하고, 불순물을 분리하여, 배양 상청 여과액을 얻어도 된다. 또한 필요하다면, 얻어진 배양 상청 여과액을, 한외 여과 등의 통상적인 방법에 따라, 통상 5 배 ∼ 20 배, 바람직하게는 8 배 ∼ 12 배로 농축하여 배양 상청 여과액의 농축액을 얻어도 된다. 그 후, 본 발명에 관련된 Tim 단백질이 어피니티 태그를 갖는 경우에는, 어피니티 태그마다의, 어피니티 태그를 이용한 정제 방법의 통상적인 방법에 따라, 얻어진 배양 상청, 얻어진 배양 상청 여과액, 또는 얻어진 배양 상청 여과액의 농축액으로부터 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 정제함으로써, 본 발명에 관련된 Tim 단백질이 얻어진다.
＜5. 본 발명의 Tim 담체＞
본 발명의 Tim 단백질이 결합한 담체 (이하, 「본 발명의 Tim 담체」라고 약기하는 경우가 있다) 는, 상기한 바와 같이 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 본 발명에 관련된 담체에 결합시킨 것이다.
구체적으로는, 본 발명의 Tim 담체로는, 본 발명에 관련된 Tim1 단백질이 결합한 담체 (이하, 「본 발명의 Tim1 담체」라고 약기하는 경우가 있다), 본 발명에 관련된 Tim3 단백질이 결합한 담체 (이하, 「본 발명의 Tim3 담체」라고 약기하는 경우가 있다), 본 발명에 관련된 Tim4 단백질이 결합한 담체 (이하, 「본 발명의 Tim4 담체」라고 약기하는 경우가 있다) 등을 들 수 있다. 또, 본 발명에 관련된 Tim1 단백질, 본 발명에 관련된 Tim3 단백질, 및 본 발명에 관련된 Tim4 단백질로부터 선택되는 2 종 이상의 단백질을 결합시킨 담체도 본 발명의 Tim 담체에 포함 된다.
본 발명의 Tim 담체로는, 본 발명의 Tim4 담체가 특히 바람직하다.
＜본 발명에 관련된 담체＞
본 발명에 관련된 담체로는, 통상적인 면역학적 측정법에서 사용되는 불용성의 담체라면 어떤 것도 사용 가능하지만, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리메타크릴산메틸, 폴리아크릴아미드, 폴리글리시딜메타크릴레이트, 폴리프로필렌, 폴리올레핀, 폴리이미드, 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리염화비닐, 폴리에틸렌, 폴리클로로카보네이트, 실리콘 수지, 실리콘 러버, 아가로스, 덱스트란, 에틸렌-무수 말레산 공중합물 등의 유기물 ; 유리, 산화규소, 규소, 다공성 유리, 불투명 유리, 알루미나, 실리카 겔, 금속 산화물 등의 무기물질 ; 철, 코발트, 니켈, 마그네타이트, 크로마이트 등의 자성체 등 ; 및 이들 자성체의 합금을 재료로 해서 조제된 것을 들 수 있다. 또, 이들 담체는, 마이크로 플레이트, 튜브, 디스크상 편 (片), 입자 (비즈) 등 다종 다양의 형태로 사용할 수 있다.
또한, 후술하는 본 발명의 취득 방법 및 본 발명의 제거 방법에 사용하는 경우에는, 입자 (비즈) 로 사용하는 것이 바람직하고, 입자의 크기는 특별히 한정되지 않지만, 목적, 용도에 맞춰 통상 10 ㎚ ∼ 100 ㎛, 바람직하게는 100 ㎚ 내지 10 ㎛ 의 것을 들 수 있다.
또, 후술하는 본 발명의 검출 방법에 사용하는 경우에는, 입자 (비즈) 또는 마이크로 플레이트가 바람직하고, 입자의 크기는 특별히 한정되지 않지만, 목적, 용도에 맞춰 통상 10 ㎚ ∼ 100 ㎛, 바람직하게는 100 ㎚ 내지 10 ㎛ 의 것을 들 수 있고, 또 마이크로 플레이트의 웰의 수, 크기는 특별히 한정되지 않지만, 목적, 용도에 맞춰 통상 12 웰 내지 1536 웰, 바람직하게는 96 웰 내지 384 웰의 것을 들 수 있다.
＜본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체의 결합 방법＞
본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체의 결합 방법으로는, 단백질을 담체에 결합시키는 자체 공지의 방법에 따르면 되고, 예를 들어 어피니티 결합에 의해 결합시키는 방법 ; 화학 결합에 의해 결합시키는 방법 (예를 들어, 일본 특허 3269554호, WO2012/039395 공보에 기재된 방법) ; 물리적 흡착에 의해 결합시키는 방법 (예를 들어, 일본 특허공보 평5-41946호에 기재된 방법) 등을 들 수 있지만, 어피니티 결합에 의해 결합시키는 방법 및 물리적 흡착에 의해 결합시키는 방법이 바람직하다.
또한, 후술하는 본 발명의 취득 방법 및 제거 방법에 사용하는 경우에는, 어피니티 결합에 의해 결합시키는 방법이 바람직하다. 또, 후술하는 본 발명의 검출 방법에 사용하는 경우에는, 어피니티 결합에 의해 결합시키는 방법 또는 물리적 흡착이 바람직하다.
＜발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체의 결합 양식＞
본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체의 결합 양식으로는, 본 발명에 관련된 담체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질이 결합하고 있으면 결합 양식은 불문이지만, 본 발명에 관련된 담체가 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 SH 기에 결합한 것이 바람직하다. 또, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체를 직접 결합시켜도, 화학적 링커, 어피니티 물질 [예를 들어, 어피니티 태그에 친화성을 갖는 물질 (후술), 본 발명의 Tim 단백질에 대한 항체, 비오틴류 (후술), 아비딘류 (후술), 항체 등] 등을 개재하여 간접적으로 결합시켜도 된다.
＜어피니티 결합에 의해 결합시키는 방법＞
상기한 어피니티 결합에 의해 결합시키는 방법으로는, 물질 간의 어피니티 결합 (친화성) 을 이용하여 결합시키는 방법이면 어떤 것이라도 되고, 예를 들어 이하의 (a) ∼ (c) 를 들 수 있다.
(a) 비오틴류와 아비딘류의 어피니티 결합에 의해 결합시키는 방법
예를 들어, 비오틴류 (비오틴, 이미노비오틴, 데스티오비오틴, 비오시틴, 비오틴술폭시드 등) 및 아비딘류 (아비딘, 타마비딘, 타마비딘 2, 스트렙트아비딘 등) 의 조합 등으로 이루어지는, 서로 어피니티 (친화성) 를 갖는 2 종 이상의 물질 (어피니티 물질) 을 사용함으로써, 당해 어피니티 물질을 개재하여 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체를 결합시킬 수 있다.
또한, 어피니티 물질은, 어느 일방을 본 발명에 관련된 Tim 단백질에 결합시키고, 나머지 일방을 본 발명에 관련된 담체에 결합시켜 두면 되지만, 예를 들어 비오틴류와 아비딘류를 사용하는 경우에는, 아비딘류를 본 발명에 관련된 담체에 결합시키고, 비오틴류를 본 발명에 관련된 Tim 단백질에 결합시켜 두는 것이 일반적이다.
(b) 어피니티 태그와 어피니티 태그에 친화성을 갖는 물질의 어피니티 결합에 의해 결합시키는 방법
예를 들어, 어피니티 태그에 친화성을 갖는 물질 (ProteinA, ProteinG 등) 등의 본 발명에 관련된 Tim 단백질에 어피니티 (친화성) 를 갖는 물질 (어피니티 물질) 을 사용함으로써, 당해 어피니티 물질을 개재하여 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체를 결합시킬 수 있다.
또한, 어피니티 물질은, 본 발명에 관련된 담체에 결합시켜 두는 것이 일반적이다.
(c) 본 발명의 Tim 단백질에 대한 항체와 본 발명의 Tim 단백질의 어피니티 결합에 의해 결합시키는 방법
예를 들어, 본 발명에 관련된 Tim 단백질에 대한 항체 (항FLAG 태그 항체, 항His 태그 항체, 항HA 태그 항체, 항Myc 태그 항체, 항MBP 태그 항체, 항GST 태그 항체, 항Strep (II) 태그 항체 등의 어피니티 태그에 대한 항체, 및 Anti-TIM4 Antibody (clone RMT4-54)(Life Span Biosciences 사 제조) 등) 등의 본 발명에 관련된 Tim 단백질에 어피니티 (친화성) 를 갖는 물질 (어피니티 물질) 을 사용함으로써, 당해 어피니티 물질을 개재하여 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체를 결합시킬 수 있다.
또한, 어피니티 물질은, 본 발명에 관련된 담체에 결합시켜 두는 것이 일반적이다.
또한, 상기 방법에 있어서, 본 발명에 관련된 Tim 단백질 또는/및 본 발명에 관련된 담체와 어피니티 물질을 결합시키는 방법도, 자체 공지된 물리적 흡착에 의해 결합시키는 방법이나 화학 결합에 의해 결합시키는 방법을 사용할 수 있고, 직접 결합시켜도, 링커 등을 개재하여 간접적으로 결합시켜도 된다.
＜본 발명에 관련된 담체에 결합시키는 본 발명에 관련된 Tim 단백질량＞
본 발명에 관련된 담체에 결합시키는 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 양은, 예를 들어 본 발명에 관련된 담체가 비즈인 경우, 담체 1 ㎎ 에 대해 통상 0.1 ㎍ ∼ 50 ㎍, 바람직하게는 0.5 ㎍ ∼ 30 ㎍, 보다 바람직하게는 1.0 ㎍ ∼ 20 ㎍ 이다.
또, 본 발명에 관련된 담체가 마이크로 플레이트인 경우, 1 웰에 대해 통상 0.1 ㎍ ∼ 10 ㎍, 바람직하게는 0.2 ㎍ ∼ 5 ㎍, 보다 바람직하게는 0.5 ㎍ ∼ 2 ㎍ 이다.
＜본 발명의 Tim 담체의 구체적인 조제 방법＞
이하에, 본 발명의 Tim 담체의 구체적인 조제 방법을, 상기 (a)-(c) 방법에 의해, 본 발명의 Tim 담체를 조제하는 경우를 예로 들어 설명한다.
＜(a) 비오틴류와 아비딘류의 어피니티 결합에 의해 결합시키는 방법＞
먼저, (a) 방법에서는, 상기 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 조제 방법에 따라 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 조제한다. 이어서, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 비오틴류를 결합시켜 (이하, 「비오틴 표지」 또는 「비오틴화」라고 약기하는 경우가 있다), 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체를 형성시킨다. 한편, 본 발명에 관련된 담체에 아비딘류를 결합시켜, 본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체를 형성시킨다 (이하, 「아비딘류를 결합시킨 본 발명에 관련된 담체」라고 약기하는 경우가 있다). 얻어진 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체와 본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체를 접촉시키고, 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체 중의 비오틴류와 담체-아비딘류 복합체 중의 아비딘류를 결합시켜, 본 발명의 Tim 담체를 얻는다.
-본 발명에 관련된 Tim 단백질과 비오틴류의 결합 (비오틴 표지)-
상기 (a) 방법에 있어서, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 비오틴류의 결합은, 시판되는 단백질의 비오틴 표지 키트를 사용해도, 필요한 시약류를 적절히 조정하여 단백질의 비오틴 표지의 통상적인 방법에 따라 실시해도 된다. 시판되는 단백질의 비오틴 표지 키트 (비오틴화 키트) 를 사용하는 방법으로는, 비오틴 레벨링한 Kit-SH (Biotin Labeling Kit-SH) ((주) 도진 과학 연구소) 또는 Biotin Labeling Kit-NH2 ((주) 도진 과학 연구소) 에 첨부의 프로토콜에 기재된 방법에 따르면 된다.
본 발명에 관련된 Tim 단백질 1 ㎍ 과 결합시키는 비오틴류의 양은, 통상 10 ng ∼ 1.0 ㎍, 바람직하게는 20 ng ∼ 200 ng, 보다 바람직하게는 30 ng ∼ 150 ng이다.
본 발명에 관련된 Tim 단백질에 비오틴류를 결합시키는 부위로는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 SH 기가 바람직하다.
-본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체 (아비딘류를 결합시킨 본 발명에 관련된 담체)-
상기 (a) 방법에 있어서, 본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체 (아비딘류를 결합시킨 본 발명에 관련된 담체) 는, 시판되는 것을 사용해도, 필요한 시약류를 적절히 조정하여, 통상적인 방법에 따라 조제해도 된다. 본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체로는, 예를 들어 아비딘을 결합시킨 비즈 또는 마이크로 플레이트, 타마비딘을 결합시킨 비즈 또는 마이크로 플레이트, 타마비딘 2 를 결합시킨 비즈 또는 마이크로 플레이트, 스트렙트아비딘을 결합시킨 비즈 또는 마이크로 플레이트 등을 들 수 있고, 시판되는 것으로는, Dynabeads M-270 Streptavidin C1 (서모피셔 사이언티픽사 제조), FG 비즈 스트렙트아비딘 (타마가와 정기사 제조), 아비딘 플레이트 (스미토모 베이클라이트사 제조) 등을 들 수 있다.
본 발명에 관련된 담체와 아비딘류의 결합에 있어서, 예를 들어 본 발명에 관련된 담체가 비즈인 경우, 본 발명에 관련된 담체 1 ㎎ 과 접촉시키는 아비딘류의 양은, 통상 5.0 ∼ 150 ㎍, 바람직하게는 10 ∼ 100 ㎍, 보다 바람직하게는 20 ∼ 50 ㎍ 이다. 예를 들어, 본 발명에 관련된 담체가 마이크로 플레이트일 때 1 웰에 접촉시키는 아비딘류의 양은, 통상 0.1 ㎍ ∼ 10 ㎍, 바람직하게는 0. 2 ㎍ ∼ 5 ㎍, 보다 바람직하게는 0.5 ㎍ ∼ 2 ㎍ 이다.
-본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체의 결합
상기 (a) 방법에 있어서, (본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체를 결합시켜) 본 발명의 Tim 담체를 얻으려면, 예를 들어 본 발명에 관련된 담체가 비즈인 경우, 본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체를 통상 0.1 ㎎ ∼ 10 ㎎, 바람직하게는 0.3 ㎎ ∼ 5.0 ㎎, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 3.0 ㎎ 과, 본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체 1 ㎎ 당 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체를 통상 1.0 ∼ 50 ㎍, 바람직하게는 1.0 ∼ 30 ㎍, 보다 바람직하게는 1.0 ∼ 20 ㎍ 을 접촉시키고, 또 본 발명에 관련된 담체가 마이크로 플레이트인 경우, 1 웰당의 본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체를 통상 1.0 ∼ 10 ㎍, 바람직하게는 1.0 ∼ 5.0 ㎍, 보다 바람직하게는 1.0 ∼ 2.0 ㎍ 을 접촉시키고, 통상 4.0℃ ∼ 37 ℃, 바람직하게는 11 ℃ ∼ 30 ℃, 보다 바람직하게는 20 ℃ ∼ 25 ℃ 에서, 통상 0.5 시간 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 8.0 시간, 보다 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 2.0 시간 반응시켜, 아비딘류와 비오틴류를 결합시키면 된다. 이로써, 본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체가 결합되어, 본 발명의 Tim 담체가 얻어진다.
또한, 일반적으로 본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체의 접촉은, 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체를 함유하는 용액과 본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체를 접촉시킴으로써 실시된다.
본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체를 함유시키는 용액으로는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체를 안정적인 상태로 용해시키는 것이면 되고, 예를 들어 정제수, 예를 들어 pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액 (예를 들어 PBS, TBS, HBS 등) 을 들 수 있다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로는, 통상 5.0 ∼ 50 mM, 바람직하게는 10 ∼ 30 mM 의 범위로부터 적절히 선택되고, NaCl 농도는 통상 100 ∼ 200 mM, 바람직하게는 140 ∼ 160 mM 의 범위로부터 적절히 선택된다. 또, 이 용액 중에는, 본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체를 함유하는 용액을 접촉 후, 본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체의 결합을 방해하지 않는 양이면, 예를 들어 당류, NaCl 등의 염류, 계면활성제, 방부제, 단백질 등이 포함되어 있어도 된다. 계면활성제로는, 예를 들어 트윈20 (Tween20) 등을 들 수 있고, 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체를 함유시키는 용액에 있어서의 계면활성제의 농도는, 통상 0.00001 ∼ 0.2 ％, 바람직하게는 통상 0.0005 ∼ 0.1 ％ 이다. 또한, 이들 용매에 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체를 용해한 용액을, 「본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체 함유 용액」이라고 약기하는 경우가 있다.
-상기 (a) 방법에 의한 본 발명의 Tim 담체의 구체적인 조제 방법-
상기 (a) 방법에 있어서의, 본 발명의 Tim 담체의 구체적인 조제 방법은, 예를 들어 이하의 방법으로 실시하면 된다.
먼저, 상기 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 조정 방법에 따라, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 조제한다. 이어서, Biotin Labeling Kit-SH ((주) 도진 과학 연구소), Biotin Labeling Kit-NH2 ((주) 도진 과학 연구소) 에 첨부된 프로토콜, 또는 단백질의 비오틴 표지에 있어서의 통상적인 방법에 따라, 본 발명에 관련된 Tim 단백질에 비오틴류를 결합시켜, 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체를 형성한다.
그 후, 본 발명에 관련된 담체가 비즈인 경우, 본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체를 통상 0.1 ㎎ ∼ 10 ㎎, 바람직하게는 0.3 ㎎ ∼ 5.0 ㎎, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 3.0 ㎎ 과, 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체를 본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체 1 ㎎ 당 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체를 통상 1.0 ∼ 50 ㎍, 바람직하게는 1.0 ∼ 30 ㎍, 보다 바람직하게는 1.0 ∼ 20 ㎍ 함유하는 용액 (예를 들어 정제수, 또는 pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액 등 중에, 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체를 함유하는 용액) 통상 50 ㎕ ∼ 1500 ㎕, 바람직하게는 100 ㎕ ∼ 1000 ㎕, 보다 바람직하게는 200 ㎕ ∼ 500 ㎕ 를 접촉시키고, 통상 4.0 ℃ ∼ 37 ℃, 바람직하게는 11 ℃ ∼ 30 ℃, 보다 바람직하게는 20 ℃ ∼ 25 ℃ 에서, 통상 0.5 시간 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 8.0 시간, 보다 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 2.0 시간 반응시켜, 본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체 중의 아비딘류와 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체 중의 비오틴류를 결합시킴으로써, 본 발명의 Tim 담체를 얻는다.
본 발명에 관련된 담체가 마이크로 플레이트인 경우, 1 웰당의 본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체를 통상 1.0 ∼ 10 ㎍, 바람직하게는 1.0 ∼ 5.0 ㎍, 보다 바람직하게는 1.0 ∼ 2.0 ㎍ 함유하는 용액 (예를 들어 정제수, 또는 pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6에 완충 작용을 갖는 완충액 등 중에, 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체를 함유하는 용액) 통상 50 ㎕ ∼ 300 ㎕, 바람직하게는 50 ㎕ ∼ 200 ㎕, 보다 바람직하게는 100 ㎕ ∼ 200 ㎕ 를 접촉시키고, 통상 4.0 ℃ ∼ 37 ℃, 바람직하게는 11 ℃ ∼ 30 ℃, 보다 바람직하게는 20 ℃ ∼ 25 ℃ 에서, 통상 0.5 시간 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 8.0 시간, 보다 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 2.0 시간 반응시켜, 본 발명에 관련된 담체-아비딘류 복합체 중의 아비딘류와 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체 중의 비오틴류를 결합시킴으로써, 본 발명의 Tim 담체를 얻는다.
＜(b) 어피니티 태그와 어피니티 태그에 친화성을 갖는 물질의 어피니티 결합에 의해 결합시키는 방법＞
(b) 방법에서는, 먼저 상기 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 조정 방법에 따라, 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 조제한다. 한편, 어피니티 태그에 친화성을 갖는 물질 (어피니티 물질) 을 본 발명에 관련된 담체에 결합시켜, 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체를 형성시킨다 (이하, 「어피니티 물질을 결합시킨 본 발명에 관련된 담체」라고 약기하는 경우가 있다). 얻어진 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체와 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 접촉시키고, 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체 중의 어피니티 물질과 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질 중의 어피니티 태그를 결합시키고, 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체와 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 결합시켜, 본 발명의 Tim 담체를 얻는다.
-본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체-
상기 (b) 방법에 있어서의, 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체로는, 시판되는 것을 사용해도, 필요한 시약류를 적절히 조정하고 통상적인 방법에 따라 조제해도 된다. 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체로는, 예를 들어 protein G 를 결합시킨 비즈 또는 마이크로 플레이트, protein A 를 결합시킨 비즈 또는 마이크로 플레이트 등을 들 수 있고, 시판되는 것으로서는 Dynabeads Protein G (서모피셔 사이언티픽사 제조), Dynabeads Protein A (서모피셔 사이언티픽사 제조), FG 비즈 protein G (타마가와 정기 제조), FG 비즈 Protein A (타마가와 정기 제조) 등을 들 수 있다.
본 발명에 관련된 담체와 어피니티 물질의 결합에 있어서, 본 발명에 관련된 담체 1 ㎎ 과 접촉시키는 어피니티 물질의 양으로는, 본 발명에 관련된 담체가 비즈인 경우, 통상 5.0 ∼ 50 ㎍, 바람직하게는 10 ∼ 50 ㎍, 보다 바람직하게는 20 ∼ 50 ㎍ 이다. 본 발명에 관련된 담체가 마이크로 플레이트인 경우, 1 웰에 접촉시키는 어피니티 물질의 양은, 통상 0.1 ㎍ ∼ 10 ㎍, 바람직하게는 0.2 ㎍ ∼ 5 ㎍, 보다 바람직하게는 0.5 ㎍ ∼ 2 ㎍ 이다.
-본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체와 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 결합-
상기 (b) 방법에 있어서, (본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체와 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 결합에 의해) 본 발명의 Tim 담체를 얻으려면, 예를 들어 이하의 방법으로 실시하면 된다. 본 발명에 관련된 담체가 비즈인 경우, 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체를 통상 0.1 ㎎ ∼ 10 ㎎, 바람직하게는 0.3 ㎎ ∼ 5.0 ㎎, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 3.0 ㎎ 과, 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체 1 ㎎ 당 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 통상 1.0 ∼ 50 ㎍, 바람직하게는 1.0 ∼ 30 ㎍, 보다 바람직하게는 1.0 ∼ 20 ㎍ 을 접촉시키고, 본 발명에 관련된 담체가 마이크로 플레이트인 경우, 1 웰당의 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체와 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 통상 1.0 ∼ 10 ㎍, 바람직하게는 1.0 ∼ 5.0 ㎍, 보다 바람직하게는 1.0 ∼ 2.0 ㎍ 을 접촉시키고, 통상 4.0 ℃ ∼ 37 ℃, 바람직하게는 11 ℃ ∼ 30 ℃, 보다 바람직하게는 20 ℃ ∼ 25 ℃ 에서, 통상 0.5 시간 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 8.0 시간, 보다 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 2.0 시간 반응시키고, 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체와 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 결합시켜, 본 발명의 Tim 담체를 얻는다.
또한, 일반적으로 상기 (b) 방법에 있어서의, 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체와 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 접촉은, 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체와 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액을 접촉시킴으로써 실시된다.
어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유시키는 용액으로는, 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 안정적인 상태로 용해시킨 것이면 되고, 예를 들어 정제수, 예를 들어 pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액 (예를 들어 PBS, TBS, HBS 등) 을 들 수 있다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로는, 통상 5.0 ∼ 50 mM, 바람직하게는 10 ∼ 30 mM 의 범위로부터 적절히 선택되고, NaCl 농도는 통상 100 ∼ 200 mM, 바람직하게는 140 ∼ 160 mM 의 범위로부터 적절히 선택된다.
또, 이 용액 중에는, 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액과 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체를 접촉 후, 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체의 결합을 방해하지 않는 양이면, 예를 들어 당류, NaCl 등의 염류, 계면활성제, 방부제, 단백질 등이 포함되어 있어도 된다. 계면활성제로는, 예를 들어 트윈20 (Tween20) 등을 들 수 있고, 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유시키는 용액에 있어서의 계면활성제의 농도는, 통상 0.00001 ∼ 0.2 ％, 바람직하게는 통상 0.0005 ∼ 0.1 ％ 이다. 또한, 이들 용액에 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 용해한 용액을, 「어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질 함유 용액」이라고 약기하는 경우가 있다.
-상기 (b) 방법에 의한 본 발명의 Tim 담체의 구체적인 조제 방법-
상기 (b) 방법에 있어서의, 본 발명의 Tim 담체의 구체적인 조제 방법은, 예를 들어 이하의 방법으로 실시하면 된다.
먼저, 상기 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 조제 방법에 따라, 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 조제한다.
이어서, 본 발명에 관련된 담체가 비즈인 경우, 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체를 통상 0.1 ㎎ ∼ 10 ㎎, 바람직하게는 0.3 ㎎ ∼ 5.0 ㎎, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 3.0 ㎎ 과, 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체 1 ㎎ 당 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 통상 1.0 ∼ 50 ㎍, 바람직하게는 1.0 ∼ 30 ㎍, 보다 바람직하게는 1.0 ∼ 20 ㎍ 함유하는 용액 (예를 들어 정제수, pH 7.0 ∼ 8.0 의 완충액 등 중에, 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액) 통상 50 ㎕ ∼ 1500 ㎕, 바람직하게는 100 ㎕ ∼ 1000 ㎕, 보다 바람직하게는 200 ㎕ ∼ 500 ㎕ 를 접촉시키고, 통상 4.0 ℃ ∼ 37 ℃, 바람직하게는 11 ℃ ∼ 30 ℃, 보다 바람직하게는 20 ℃ ∼ 25 ℃ 에서, 통상 0.5 시간 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 8.0 시간, 보다 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 2.0 시간, 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체 중의 어피니티 물질과 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질 중의 어피니티 태그를 결합시켜, 본 발명의 Tim 담체를 얻는다.
본 발명에 관련된 담체가 마이크로 플레이트인 경우, 1 웰당의 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체와 본 발명에 관련된 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질 1.0 ∼ 10 ㎍, 바람직하게는 1.0 ∼ 5.0 ㎍, 보다 바람직하게는 1.0 ∼ 2.0 ㎍ 함유하는 용액 (예를 들어 정제수, 또는 pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액 등 중에, 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체를 함유하는 용액) 통상 50 ㎕ ∼ 300 ㎕, 바람직하게는 50 ㎕ ∼ 200 ㎕, 보다 바람직하게는 100 ㎕ ∼ 200 ㎕ 를 접촉시키고, 통상 4.0 ℃ ∼ 37 ℃, 바람직하게는 11 ℃ ∼ 30 ℃, 보다 바람직하게는 20 ℃ ∼ 25 ℃ 에서, 통상 0.5 시간 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 8.0 시간, 보다 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 2.0 시간, 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체 중의 어피니티 물질과 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질 중의 어피니티 태그를 결합시켜, 본 발명의 Tim 담체를 얻는다.
＜(c) 본 발명의 Tim 단백질에 대한 항체와 본 발명의 Tim 단백질의 어피니티 결합에 의해 결합시키는 방법＞
먼저, 상기 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 조정 방법에 따라, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 조제한다. 한편, 본 발명에 관련된 Tim 단백질에 대한 항체 (이하, 「항Tim 항체」라고 약기하는 경우가 있다) 를 본 발명에 관련된 담체에 결합시켜, 본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체를 형성시킨다. 얻어진 본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 접촉시키고, 본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체 중의 Tim 단백질에 대한 항체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 결합시킴으로써, 본 발명의 Tim 담체를 얻는다.
또한, 상기에 있어서, 본 발명에 관련된 Tim 단백질로서, 어피니티 태그를 갖는 Tim 단백질 (Tim 단백질의 아미노산 배열과 어피니티 태그의 아미노산 배열을 갖는 단백질) 을 사용하는 경우에는, 항Tim 항체로는, Tim 단백질을 인식하는 항체 (Tim 단백질의 아미노산 배열에 근거하는 단백질 부분을 인식하는 항체) 라도, 어피니티 태그를 인식하는 항체 (어피니티 태그의 아미노산 배열에 근거하는 단백질 부분을 인식하는 항체) 라도 어느 것을 사용해도 된다. 또, 본 발명에 관련된 Tim 단백질로서, 어피니티 태그를 갖지 않는 Tim 단백질 (Tim 단백질의 아미노산 배열만으로 이루어지는 단백질) 을 사용하는 경우에는, 항Tim 항체로는, Tim 단백질을 인식하는 항체 (Tim 단백질의 아미노산 배열에 근거하는 단백질 부분을 인식하는 항체) 를 사용하면 된다.
-본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체 (항체를 결합시킨 본 발명에 관련된 담체)-
상기 (c) 방법에 있어서, 본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체로는, 시판되는 것을 사용해도, 필요한 시약류를 적절히 조정하여 통상적인 방법에 따라 조제해도 된다. 본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체로는, 예를 들어 항Fc 태그 항체를 결합시킨 비즈 또는 마이크로 플레이트, 항FLAG 태그 항체를 결합시킨 비즈 또는 마이크로 플레이트, 항His 태그 항체를 결합시킨 비즈 또는 마이크로 플레이트, 항GST 태그를 결합시킨 비즈 또는 마이크로 플레이트, 항MBP 태그를 결합시킨 비즈 또는 마이크로 플레이트, 항HA 태그를 결합시킨 비즈 또는 마이크로 플레이트, 항Myc 태그를 결합시킨 비즈 또는 마이크로 플레이트, 항Strep (II) 태그를 결합시킨 비즈 또는 마이크로 플레이트, 항Tim 단백질에 대한 항체를 결합시킨 비즈 또는 마이크로 플레이트 등을 들 수 있고, 시판되는 것으로는 항DYKDDDDK 태그 항체 자기 비즈 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 등을 들 수 있다.
상기 항Tim 항체의 유래에 대해서는 특별히 한정되지 않는다. 또, 폴리클로날 항체라도 모노클로날 항체라도 어느 것이라도 되지만, 모노클로날 항체가 바람직하다. 또, 상기 항Tim 항체는, 시판되는 것을 사용해도, 필요한 시약류를 적절히 조정하여 통상적인 방법에 따라 조제해도 된다. 항Tim 항체의 구체예는, 상기와 같다.
본 발명에 관련된 담체와 항Tim 항체의 결합에 있어서, 본 발명에 관련된 담체가 비즈인 경우, 본 발명에 관련된 담체 1 ㎎ 과 접촉시키는 본 발명에 관련된 Tim 단백질에 대한 항체의 양으로는, 본 발명의 취득 방법 및 본 발명의 제거 방법에 사용하는 경우, 통상 5.0 ∼ 50 ㎍, 바람직하게는 10 ∼ 50 ㎍, 보다 바람직하게는 20 ∼ 50 ㎍ 이다. 본 발명에 관련된 담체가 마이크로 플레이트일 때 1 웰에 통상 0.1 ㎍ ∼ 10 ㎍, 바람직하게는 0.2 ㎍ ∼ 5 ㎍, 보다 바람직하게는 0.5 ㎍ ∼ 2 ㎍ 이다.
-본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 결합-
상기 (c) 방법에 있어서, 본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 결합에 의해 본 발명의 Tim 담체를 얻는 방법으로는, 예를 들어 이하의 방법을 들 수 있다. 즉, 본 발명에 관련된 담체가 비즈인 경우, 본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체를 통상 0.1 ㎎ ∼ 10 ㎎, 바람직하게는 0.3 ㎎ ∼ 5.0 ㎎, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 3.0 ㎎ 과, 본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체 1 ㎎ 당 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 통상 1.0 ∼ 50 ㎍, 바람직하게는 1.0 ∼ 30 ㎍, 보다 바람직하게는 1.0 ∼ 20 ㎍ 을 접촉시키고, 본 발명에 관련된 담체가 마이크로 플레이트인 경우, 1 웰당의 본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 통상 1.0 ∼ 10 ㎍, 바람직하게는 1.0 ∼ 5.0 ㎍, 보다 바람직하게는 1.0 ∼ 2.0 ㎍ 을 접촉시키고, 통상 4.0 ℃ ∼ 37 ℃, 바람직하게는 11 ℃ ∼ 30 ℃, 보다 바람직하게는 20 ℃ ∼ 25 ℃ 에서, 통상 0.5 시간 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 8.0 시간, 보다 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 2.0 시간 반응시키고, 본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체 중의 항Tim 항체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 결합시켜, 본 발명의 Tim4 담체를 얻는다.
또한, 일반적으로 상기 (c) 방법에 있어서의, 본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 접촉은, 본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액을 접촉시킴으로써 실시된다.
본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유시키는 용액으로는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 안정적인 상태로 용해시키는 것이면 되고, 예를 들어 정제수, 예를 들어 pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액 (예를 들어 PBS, TBS, HBS 등) 을 들 수 있다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로는, 통상 5 ∼ 50 mM, 바람직하게는 10 ∼ 30 mM 의 범위로부터 적절히 선택되고, NaCl 농도는 통상 100 ∼ 200 mM, 바람직하게는 140 ∼ 160 mM 의 범위로부터 적절히 선택된다. 또, 이 용액 중에는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액과 본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체를 접촉 후, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체의 결합을 방해하지 않는 양이면, 예를 들어 당류, NaCl 등의 염류, 계면활성제, 방부제, 단백질 등이 포함되어 있어도 된다. 계면활성제로는, 예를 들어 트윈20 등을 들 수 있고, 당해 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액에 있어서의 계면활성제의 농도는, 통상 0.00001 ∼ 0.2 ％, 바람직하게는 통상 0.0005 ∼ 0.1 ％ 이다. 또한, 이들 용액에 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 용해한 용액을, 「본 발명에 관련된 Tim 단백질 함유 용액」이라고 약기하는 경우가 있다.
-상기 (c) 방법에 의한 본 발명의 Tim 담체의 구체적인 조제 방법-
상기 (c) 방법에 있어서의, 본 발명의 Tim 담체의 구체적인 조제 방법은, 예를 들어 이하의 방법으로 실시하면 된다.
먼저, 상기 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 조제 방법에 따라, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 조제한다. 이어서, 본 발명에 관련된 담체가 비즈인 경우, 본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체를 통상 0.1 ㎎ ∼ 10 ㎎, 바람직하게는 0.3 ㎎ ∼ 5.0 ㎎, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 3.0 ㎎ 과, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체 1 ㎎ 당 통상 1.0 ∼ 50 ㎍, 바람직하게는 1.0 ∼ 30 ㎍, 보다 바람직하게는 1.0 ∼ 20 ㎍ 함유하는 용액 (예를 들어 정제수, 예를 들어 pH 7.0 ∼ 8.0 의 완충액 등 중에 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액) 통상 100 ∼ 1000 ㎕, 바람직하게는 200 ∼ 500 ㎕ 를 접촉시키고, 통상 4 ℃ ∼ 37 ℃, 바람직하게는 11 ℃ ∼ 30 ℃, 보다 바람직하게는 20 ℃ ∼ 25 ℃ 에서, 통상 0.5 시간 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 8.0 시간, 보다 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 2.0 시간 반응시켜, 본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체 중의 본 발명에 관련된 Tim 단백질에 대한 항체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 결합시킴으로써, 본 발명의 Tim 담체를 얻는다. 본 발명에 관련된 담체가 마이크로 플레이트인 경우, 1 웰당의 본 발명에 관련된 담체-항Tim 항체 복합체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질 1.0 ∼ 10 ㎍, 바람직하게는 1.0 ∼ 5.0 ㎍, 보다 바람직하게는 1.0 ∼ 2.0 ㎍ 함유하는 용액 (예를 들어 정제수, 또는 pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액 등 중에, 본 발명에 관련된 Tim 단백질-비오틴류 복합체를 함유하는 용액) 통상 50 ㎕ ∼ 300 ㎕, 바람직하게는 50 ㎕ ∼ 200 ㎕, 보다 바람직하게는 100 ㎕ ∼ 200 ㎕ 를 접촉시키고, 통상 4.0 ℃ ∼ 37 ℃, 바람직하게는 11 ℃ ∼ 30 ℃, 보다 바람직하게는 20 ℃ ∼ 25 ℃ 에서, 통상 0.5 시간 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 8.0 시간, 보다 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 2.0 시간, 본 발명에 관련된 담체-어피니티 물질 복합체 중의 어피니티 물질과 어피니티 태그를 갖는 본 발명에 관련된 Tim 단백질 중의 어피니티 태그를 결합시켜, 본 발명의 Tim 담체를 얻는다.
＜물리적 흡착에 의해 결합시키는 방법＞
본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체를 물리적 흡착에 의해 결합시키는 방법으로는, 자체 공지된 방법에 따라, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체가 결합하는 조건하, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체를 접촉시키면 된다.
본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체의 반응 온도로는, 통상 2 ℃ ∼ 37 ℃, 바람직하게는 4 ℃ ∼ 11 ℃ 이다.
본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체의 반응 시간으로는, 통상 4 시간 ∼ 48 시간, 바람직하게는 12 시간 ∼ 24 시간이다.
본 발명에 관련된 Tim 단백질로는, 본 발명에 관련된 담체가 비즈인 경우, 본 발명에 관련된 담체 1 ㎎ 과 접촉시키는 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 양은, 통상 5.0 ∼ 50 ㎍, 바람직하게는 10 ∼ 50 ㎍, 보다 바람직하게는 20 ∼ 50 ㎍ 이다. 본 발명에 관련된 담체가 마이크로 플레이트인 경우, 1 웰에 접촉시키는 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 양은, 통상 0.1 ㎍ ∼ 10 ㎍, 바람직하게는 0.2 ㎍ ∼ 5 ㎍, 보다 바람직하게는 0.5 ㎍ ∼ 2 ㎍ 이다.
또한, 일반적으로 상기 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체의 물리적 흡착은, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액과 본 발명에 관련된 담체를 접촉시킴으로써 실시된다.
본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유시키는 용액으로는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 안정적인 상태로 용해시키는 것이면 되고, 예를 들어 정제수, 예를 들어 pH 6.0 ∼ 9.5, 바람직하게는 7.0 ∼ 8.0 에 완충 작용을 갖는 완충액 (예를 들어 MOPS 등의 굿 완충액, 탄산 완충액, PBS, TBS, HBS 등) 을 들 수 있다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로는, 통상 5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 10 ∼ 50 mM 의 범위로부터 적절히 선택되고, NaCl 을 첨가하는 경우의 농도는 통상 100 ∼ 200 mM, 바람직하게는 140 ∼ 160 mM 의 범위에서 적절히 선택된다. 또, 이 용액 중에는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액과 본 발명에 관련된 담체를 접촉 후, 본 발명의 담체와 세포외막소포 또는 바이러스와의 결합을 방해하지 않는 양이면, 예를 들어 당류, NaCl 등의 염류, 계면활성제, 방부제, 단백질 등이 포함되어 있어도 된다. 또한, 이들 용액에 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 용해한 용액을, 「본 발명에 관련된 Tim 단백질 함유 용액」이라고 약기하는 경우가 있다.
본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체의 결합 방법에 있어서의, 물리적 흡착에 의해 결합시키는 방법의 구체예로는, 예를 들어 이하의 방법을 들 수 있다.
먼저, 상기 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 조제 방법에 따라, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 조제한다. 이어서, 본 발명에 관련된 담체가 비즈인 경우, 본 발명에 관련된 담체 1 ㎎ 에, Tim 단백질을 통상 5.0 ∼ 50 ㎍, 바람직하게는 10 ∼ 50 ㎍, 보다 바람직하게는 20 ∼ 50 ㎍ 함유하는 용액 (예를 들어 정제수, 예를 들어 pH 7.0 ∼ 8.0 의 완충액 등 중에 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액) 을 통상 50 ㎕ ∼ 300 ㎕, 바람직하게는 50 ㎕ ∼ 200 ㎕, 보다 바람직하게는 50 ㎕ ∼ 100 ㎕ 접촉시키고, 또 본 발명에 관련된 담체가 마이크로 플레이트인 경우 1 웰에, Tim 단백질을 통상 0.1 ㎍ ∼ 10 ㎍, 바람직하게는 0.2 ㎍ ∼ 5 ㎍, 보다 바람직하게는 0.5 ㎍ ∼ 2 ㎍ 함유하는 용액 (예를 들어 정제수, 예를 들어 pH 7.0 ∼ 8.0 의 완충액 등 중에 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액) 을 통상 50 ㎕ ∼ 300 ㎕, 바람직하게는 50 ㎕ ∼ 200 ㎕, 보다 바람직하게는 50 ㎕ ∼ 100 ㎕ 접촉시키고, 통상 2 ℃ ∼ 37 ℃, 바람직하게는 4 ℃ ∼ 11 ℃ 에서 통상 4 시간 ∼ 48 시간, 바람직하게는 12 시간 ∼ 24 시간 반응시켜, 본 발명에 관련된 담체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 결합시킴으로써, 본 발명의 Tim 담체를 얻는다.
＜본 발명의 Tim 담체의 처리＞
상기와 같이 하여 얻어진 본 발명의 Tim 담체를, 통상 이 분야에서 실시되는 블로킹 처리에 부여해도 된다.
상기와 같이 하여 얻어진 본 발명의 Tim 담체를, 필요하다면 통상 이 분야에서 실시되는 정제 처리에 부여해도 된다. 정제 처리로는, 담체 표면에 부착되어 있는 불순물을 제거할 수 있으면 되고, 예를 들어 본 발명의 Tim 담체를 세정 용액에 의해 세정하는 방법 (이하, 「세정 조작」이라고 약기하는 경우가 있다) 을 들 수 있다.
본 발명에 관련된 담체로서, 자성 입자를 사용하는 경우를 예로 들어 설명한다.
먼저, 상기와 같이 하여 얻어진 본 발명의 Tim 담체를 함유하는 용액을 포함하는 용기를 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 본 발명의 Tim 담체를 집합시키고, 상기 용기 내의 용액을 버린다. 이어서, 용기 내에 세정 용액을 더하고, 교반한다. 그 후, 상기와 동일하게 상기 용기를, 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 본 발명의 Tim 담체를 집합시키고, 상기 용기 내의 용액을 버린다. 이들 세정 조작은, 필요에 따라 수회 반복하여 실시해도 된다. 당해 세정 조작에 있어서 사용되는 세정 용액으로는, 본 발명의 Tim 담체에 있어서의 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명의 담체의 결합에 영향을 주지 않는 용액이면 어떤 것이라도 되고, 예를 들어 정제수, 예를 들어 pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액 (예를 들어 PBS, TBS, HBS 등) 을 들 수 있다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로는, 통상 5 ∼ 50 mM, 바람직하게는 10 ∼ 30 mM 의 범위에서 적절히 선택되고, NaCl 농도는 통상 100 ∼ 200 mM, 바람직하게는 140 ∼ 160 mM 의 범위에서 적절히 선택된다. 이 용액 중에는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체의 결합을 방해하지 않는 양이면, 예를 들어 당류, NaCl 등의 염류, 계면활성제, 방부제, 단백질 등이 포함되어 있어도 된다.
계면활성제로는, 예를 들어 트윈20 등을 들 수 있고, 당해 세정 용액에 있어서의 계면활성제의 농도는, 통상 0.00001 ∼ 0.2 ％, 바람직하게는 통상 0.0005 ∼ 0.1 ％ 이다.
본 발명의 Tim 담체를 이용하면, 세포외막소포 또는 바이러스를 효율적으로 취득할 수 있고, 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 고순도로 취득할 수 있다. 또, 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 효율적으로 제거할 수도 있다. 또한 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 고감도로 검출할 수도 있다.
＜6. 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 취득 방법＞
본 발명의 세포외막소포 또는 바이러스를 취득하는 방법 (이하, 「본 발명의 취득 방법」이라고 약기하는 경우가 있다) 은, 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(1) 칼슘 이온 존재하, 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시키는 공정 (이하, 「복합체 형성 공정」이라고 약기하는 경우가 있다)
(2) 당해 복합체와 시료를 분리하는 공정 (이하, 「복합체 분리 공정」이라고 약기하는 경우가 있다)
(3) 당해 복합체로부터 세포외막소포 또는 바이러스를 분리하고, 세포외막소포 또는 바이러스를 취득하는 공정 (이하, 「취득 공정」이라고 약기하는 경우가 있다).
＜6-1. 복합체 형성 공정에 대해＞
복합체 형성 공정은, 칼슘 이온 존재하, Tim 단백질과 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시키는 공정이다.
＜본 발명에 관련된 시료＞
본 발명에 관련된 시료는, 액체 중에 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 함유하는 것 혹은 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 함유할 가능성이 있는 것의 어느 것이라도 된다. 본 발명에 관련된 시료는, 생체에서 유래하는 것이라도, 배지나 완충액 등의 용액에 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 용해 또는 현탁시킨 것의 어느 것이라도 된다. 본 발명에 관련된 시료로서, 구체적으로는 혈액, 타액, 소변, 유즙, 양수, 복수 등의 체액, 세포 배양 상청 등을 들 수 있다.
당해 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 함유 (용해 또는 현탁) 시키는 용액으로는, 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 안정적인 상태로 용해 또는 현탁시키고, 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스와의 복합체의 결합을 방해하지 않는 것이면 되고, 예를 들어 물, pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액 (예를 들어 TBS, HBS 등) 등을 들 수 있다. 또한, 인산 버퍼는 칼슘과 결합하여 침전이 생기므로 바람직하지 않다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로는, 통상 5 ∼ 50 mM, 바람직하게는 10 ∼ 30 mM 의 범위에서 적절히 선택되고, NaCl 농도는 통상 100 ∼ 200 mM, 바람직하게는 140 ∼ 160 mM 의 범위에서 적절히 선택된다.
이 용액 중에는, 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체의 결합을 방해하지 않는 양이면, 예를 들어 당류, NaCl 등의 염류, 계면활성제, 방부제, 단백질 등이 포함되어 있어도 된다. 계면활성제로는, 예를 들어 트윈20 등을 들 수 있고, 당해 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 함유시키는 용액에 있어서의 계면활성제의 농도는, 통상 0.00001 ∼ 0.2 ％, 바람직하게는 통상 0.0005 ∼ 0.1 ％ 이다.
＜칼슘 이온 농도·칼슘 이온의 유래＞
본 발명에 있어서, 칼슘 이온은, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시킬 때에 존재시킨다. 보다 구체적으로는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포를 접촉시킬 때에, 칼슘 이온을 존재시킨다.
본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킬 때의 칼슘 이온 농도는, 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 1.0 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 2.0 ∼ 5.0 mM 이다. 또한, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체가 형성되고, 취득 공정을 실시할 때까지, 즉 당해 복합체를 분리하는 공정에 부여할 때까지의 당해 복합체를 함유하는 용액 중에는, 상기한 바와 같은 농도의 칼슘 이온이 필요한 것은 말할 필요도 없다.
또, 칼슘 이온의 유래는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 염화칼슘, 수산화칼슘, 탄산수소칼슘, 요오드화칼슘, 브롬화칼슘, 아세트산칼슘 등을 들 수 있고, 바람직하게는 염화칼슘, 탄산수소칼슘, 요오드화칼슘이고, 보다 바람직하게는 염화칼슘, 탄산수소칼슘이다.
또한, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킬 때에, 칼슘 이온을 존재시키는 방법으로는, 일반적으로는 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킬 때의 칼슘 이온 농도가 상기한 범위가 되도록, 본 발명의 Tim 담체를 함유하는 용액, 시료, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액 또는/및 본 발명에 관련된 담체를 함유하는 용액에, 상기한 바와 같이 칼슘 이온을 함유시키면 된다. 또, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킬 때의 칼슘 이온 농도가 상기한 범위가 되도록 칼슘 이온을 함유시킨 용액을 사용하여, 당해 용액과 본 발명의 Tim 담체를 함유하는 용액, 시료, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액 또는/및 본 발명에 관련된 담체를 혼합시켜도 된다.
칼슘 이온을 함유시키는 용액으로는, 상기 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 함유 (용해 또는 현탁) 시키는 용액과 동일하고, 구체예 등도 동일하다.
＜시료의 양＞
복합체 형성 공정에 있어서, 본 발명의 Tim 단백질 1 ㎍ 과 접촉시키는 시료의 양으로는, 통상 0.1 ∼ 100 ㎖, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 1.0 ㎖ 이다.
＜온도＞
복합체 형성 공정에 있어서, 본 발명의 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킬 때의 온도로는, 통상 4 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 4 ∼ 25 ℃, 보다 바람직하게는 4 ∼ 11 ℃ 이다.
＜시간＞
복합체 형성 공정에 있어서, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 시료의 접촉 시간으로는, 통상 0.5 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 ∼ 8 시간, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 4 시간이다.
복합체 형성 공정은, (1-A) 미리 조제된, 본 발명의 Tim 담체를 사용하는 경우 (즉, 본 발명에 관련된 Tim 단백질이 결합한 담체를 사용하는 경우) 와, (1-B) 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체를 따로따로 사용하는 경우의 2 개의 경우로 나누어진다.
＜(1-A) 에 대해＞
(1-A) 는, 칼슘 이온 존재하, 본 발명의 Tim 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시켜, 본 발명에 관련된 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체 (이하, 「본 발명에 관련된 복합체」라고 약기하는 경우가 있다) 를 형성시키는 방법이다. (1-A) 에 있어서, 칼슘 이온은, 본 발명의 Tim 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킬 때에 존재시키면 된다. 구체적으로는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질이 결합한 담체를 함유하는 용액 또는/및 시료 중에 칼슘 이온을 함유시킨 것을 사용해도, 본 발명에 관련된 Tim 단백질이 결합한 담체를 함유하는 용액과 시료와 칼슘 이온을 함유하는 용액을 사용해도 된다.
-본 발명에 관련된 시료의 양-
(1-A) 에 있어서, 본 발명의 Tim 담체 1 ㎎ 과 접촉시키는 시료의 양으로는, 통상 0.1 ∼ 100 ㎖, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 1.0 ㎖ 이다.
-접촉 온도-
(1-A) 에 있어서, 본 발명의 Tim 담체와 시료를 접촉시킬 때의 온도로는, 통상 4.0 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 4.0 ∼ 25 ℃, 보다 바람직하게는 4.0 ∼ 11 ℃ 이다.
-접촉 시간-
(1-A) 에 있어서, 본 발명의 Tim 담체와 시료 (세포외막소포 또는 바이러스) 의 접촉 시간으로는, 통상 0.5 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 ∼ 8.0 시간, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 4.0 시간이다.
-본 발명의 Tim 담체의 양-
(1-A) 에 있어서, 본 발명의 Tim 담체의 양으로는, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 1 ㎖ 당 통상 0.1 ∼ 20 ㎎, 바람직하게는 0.3 ∼ 10 ㎎, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 6.0 ㎎ 이다.
-1-A 의 구체예-
(1-A) 는, 예를 들어 이하의 방법으로 실시하면 된다. 즉, 본 발명의 Tim 담체를, 본 발명의 Tim 담체와 시료와 칼슘 이온을 함유하는 용액을 혼합 후의 용액 (본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액) 1 ㎖ 당 통상 0.1 ∼ 20 ㎎, 바람직하게는 0.3 ∼ 10 ㎎, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 6.0 ㎎ 과, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 중의 칼슘 이온 농도가 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 1.0 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 2.0 ∼ 5.0 mM 이 되는 양의 칼슘 이온을 함유하는 용액과, 본 발명의 Tim 담체 1 ㎎ 당 통상 0.1 ∼ 100 ㎖, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 1.0 ㎖ 의 시료를, 통상 4.0 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 4.0 ∼ 25 ℃, 보다 바람직하게는 4.0 ℃ ∼ 11 ℃, 통상 0.5 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 ∼ 8.0 시간, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 4.0 시간 접촉 시켜, 본 발명에 관련된 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시킨다.
＜(1-B) 에 대해＞
(1-B) 는, 본 발명의 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체를 따로따로 사용하는 방법이다. 예를 들어, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체를 어피니티 결합을 이용하여 결합시키는 경우에는, 이하의 (1-B-i), (1-B-ii), 또는 (1-B-iii) 과 같이 하면 된다.
(1-B-i) 본 발명의 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를, 칼슘 이온의 존재하에서 동시에 접촉시켜, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킨다.
(1-B-ii) 본 발명의 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를, 칼슘 이온의 존재하에서 접촉시켜, 본 발명의 Tim 단백질과 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시킨 후, 또한 당해 복합체와 본 발명에 관련된 담체를 접촉시켜, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킨다.
(1-B-iii) 본 발명의 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킨 후, 또한 본 발명의 Tim 단백질을 칼슘 이온의 존재하에서 접촉시켜, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킨다.
-(1-B-i) 에 대해-
(1-B-i) 은, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를, 칼슘 이온의 존재하에서 동시에 접촉시켜,［세포외막소포 또는 바이러스-(본 발명에 관련된 Tim 단백질)-어피니티 물질-(본 발명에 관련된 담체)］로 이루어지는 본 발명에 관련된 복합체를 형성시키는 방법이다.
구체적으로는, 예를 들어 어피니티 물질로서 서로 친화성을 갖는 2 종 이상의 물질을 사용하는 경우에는, 일방의 어피니티 물질이 결합한 본 발명에 관련된 Tim 단백질 (어피니티 물질 결합 Tim 단백질) 과 나머지 어피니티 물질이 결합한 담체 (어피니티 물질 결합 담체) 와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를, 칼슘 이온의 존재하에서 동시에 접촉시켜, 어피니티 물질 결합 Tim 단백질 중의 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 세포외막소포 또는 바이러스를 결합시킴과 함께, 어피니티 물질 결합 Tim 단백질 중의 어피니티 물질과 어피니티 물질 결합 담체 중의 어피니티 물질을 결합시킴으로써,［시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스-(본 발명에 관련된 Tim 단백질)-어피니티 물질-(본 발명에 관련된 담체)］로 이루어지는 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킨다.
(1-B-i) 에 있어서, 칼슘 이온은, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 동시에 접촉시킬 때에 존재시키면 된다. 구체적으로는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액, 본 발명에 관련된 담체를 함유하는 용액, 및 시료 중의 적어도 일종 이상에 칼슘 이온을 함유시킨 것을 사용해도, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액, 본 발명에 관련된 담체를 함유하는 용액, 및 시료와 칼슘 이온을 함유하는 용액을 접촉시킴으로써 실시해도 된다.
-본 발명에 관련된 시료의 양-
(1-B-i) 에 있어서, 본 발명에 관련된 Tim 단백질 1 ㎍ 과 접촉시키는 시료의 양으로는, 통상 0.1 ∼ 100 ㎖, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 1.0 ㎖ 이다.
-본 발명에 관련된 Tim 단백질의 양-
(1-B-i) 에 있어서, 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 양으로는, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 1 ㎖ 당 통상 0.01 ∼ 200 ㎍, 바람직하게는 0.15 ∼ 50 ㎍, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 24 ㎍ 이다.
-본 발명에 관련된 담체의 양-
(1-B-i) 에 있어서, 본 발명에 관련된 담체의 양으로는, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 1 ㎖ 당 통상 0.1 ∼ 20 ㎎, 바람직하게는 0.3 ∼ 10 ㎎, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 6.0 ㎎ 이다.
-접촉 온도-
(1-B-i) 에 있어서, 본 발명의 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킬 때의 온도로는, 통상 4 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 4 ∼ 25 ℃, 보다 바람직하게는 4 ∼ 11 ℃ 이다.
-접촉 시간-
본 발명의 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 접촉 시간으로는, 통상 0.5 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 ∼ 8 시간, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 4 시간이다.
또한, 본 발명의 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 접촉은, 통상 본 발명의 Tim 단백질을 함유하는 용액과 본 발명에 관련된 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스와 칼슘 이온을 함유하는 용액을 접촉시킴으로써 실시된다.
본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유시키는 용액으로는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 안정적인 상태로 용해시키고, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체와 세포외막소포 또는 바이러스의 결합을 방해하지 않는 것이면 되고, 예를 들어 정제수, 예를 들어 pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액 (예를 들어 PBS, TBS, HBS 등) 을 들 수 있다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로는, 통상 5 ∼ 50 mM, 바람직하게는 10 ∼ 30 mM 의 범위에서 적절히 선택되고, NaCl 농도는 통상 100 ∼ 200 mM, 바람직하게는 140 ∼ 160 mM 의 범위에서 적절히 선택된다. 이 용액 중에는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 안정적인 상태로 용해시키고, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체와 세포외막소포 또는 바이러스의 결합을 방해하지 않는 양이면, 예를 들어 당류, NaCl 등의 염류, 계면활성제, 방부제, 단백질 등이 포함되어 있어도 된다. 계면활성제로는, 예를 들어 트윈20 등을 들 수 있고, 당해 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유시키는 용액에 있어서의 계면활성제의 농도는, 통상 0.00001 ∼ 0.2 ％, 바람직하게는 통상 0.0005 ∼ 0.1 ％ 이다.
칼슘 이온을 함유시키는 용액으로는, 상기 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 함유 (용해 또는 현탁) 시키는 용액과 동일하고, 구체예 등도 동일하다.
칼슘 이온을 함유하는 용액으로는, 칼슘 이온을 함유시키는 용액 중, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 중의 칼슘 이온의 농도가 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 2 ∼ 5 mM 이 되는 양의 칼슘 이온을 함유하는 용액이다.
-(1-B-i) 의 구체예-
(1-B-i) 은, 예를 들어 이하의 방법으로 실시하면 된다. 즉, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 1 ㎖ 당 통상 0.01 ∼ 200 ㎍, 바람직하게는 0.15 ∼ 50 ㎍, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 24 ㎍ 의 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액 (예를 들어 정제수, 예를 들어 pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액 중에 본 발명의 Tim 단백질을 함유시킨 용액) 을 통상 0.5 ㎕ ∼ 1 ㎖, 바람직하게는 0.5 ㎕ ∼ 100 ㎕, 보다 바람직하게는 0.5 ㎕ ∼ 10 ㎕ 와, 시료를 본 발명에 관련된 Tim 단백질 1 ㎍ 당 통상 0.1 ∼ 100 ㎖, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 1 ㎖ 와, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 중의 칼슘 이온 농도가 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 2 ∼ 5 mM 이 되는 양의 칼슘 이온을 함유하는 용액과, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액과 시료와 칼슘 이온을 함유하는 용액과 본 발명에 관련된 담체를 혼합 후의 용액 (본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액) 1 ㎖ 당 통상 0.1 ∼ 20 ㎎, 바람직하게는 0.3 ∼ 10 ㎎, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 6 ㎎ 의 본 발명에 관련된 담체를, 통상 0.5 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 ∼ 8 시간, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 4 시간 접촉시켜, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킨다.
-(1-B-ii) 에 대해-
(1-B-ii) 는, 본 발명의 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를, 칼슘 이온의 존재하에서 접촉시켜, 본 발명의 Tim 단백질과 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시킨 후, 또한 당해 복합체와 본 발명에 관련된 담체를 접촉시켜,［세포외막소포 또는 바이러스-(본 발명에 관련된 Tim 단백질)-어피니티 물질-(본 발명에 관련된 담체)］로 이루어지는 복합체를 형성시키는 방법이다.
구체적으로는, 예를 들어 어피니티 물질로서 서로 친화성을 갖는 2 종 이상의 물질을 사용한 경우에는, 일방의 어피니티 물질이 결합한 Tim 단백질 (어피니티 물질 결합 Tim 단백질) 과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를, 칼슘 이온의 존재하에서 접촉시키고, 어피니티 물질 결합 Tim 단백질 중의 Tim 단백질과 세포외막소포를 결합시켜,［세포외막소포 또는 바이러스-(본 발명에 관련된 Tim 단백질-어피니티 물질)］복합체를 형성시킨다. 이어서,［세포외막소포-(본 발명에 관련된 Tim 단백질-어피니티 물질)］복합체와 다른 일방의 어피니티 물질이 결합한 담체 (어피니티 물질 결합 담체) 를 접촉시키고,［세포외막소포 또는 바이러스-(본 발명에 관련된 Tim 단백질-어피니티 물질)］복합체 중의 어피니티 물질과 어피니티 물질 결합 담체 중의 어피니티 물질을 결합시킴으로써,［세포외막소포 또는 바이러스-(본 발명에 관련된 Tim 단백질-어피니티 물질)-(어피니티 물질-본 발명에 관련된 담체)］복합체를 형성시킨다.
또, 예를 들어 어피니티 물질로서 어피니티 태그에 친화성을 갖는 물질이나 항Tim 항체를 사용하는 경우에는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를, 칼슘 이온 존재하에서 접촉시키고, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 세포외막소포 또는 바이러스를 결합시켜,［세포외막소포 또는 바이러스-본 발명에 관련된 Tim 단백질］복합체를 형성시킨다. 이어서,［세포외막소포 또는 바이러스-본 발명에 관련된 Tim 단백질］복합체와 어피니티 물질이 결합한 담체 (어피니티 물질 결합 담체) 를 접촉시키고,［세포외막소포 또는 바이러스-본 발명에 관련된 Tim 단백질］복합체 중의 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 어피니티 물질 결합 담체 중의 어피니티 물질을 결합시킴으로써,［세포외막소포 또는 바이러스-본 발명에 관련된 Tim 단백질-(어피니티 물질-본 발명에 관련된 담체)］복합체를 형성시킨다.
(1-B-ii) 에 있어서, 칼슘 이온은, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킬 때에 존재시키면 된다. 구체적으로는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액 또는/및 시료 중에 칼슘 이온을 함유시킨 것을 사용해도, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액과 시료와 칼슘 이온을 함유하는 용액을 사용해도 된다.
-본 발명에 관련된 시료의 양-
(1-B-ii) 에 있어서, 본 발명에 관련된 Tim 단백질 1 ㎍ 과 접촉시키는 시료의 양으로는, 통상 0.1 ∼ 100 ㎖, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 1.0 ㎖ 이다.
-본 발명에 관련된 Tim 단백질의 양-
(1-B-ii) 에 있어서, 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 양으로는, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 1 ㎖ 당 통상 0.01 ∼ 200 ㎍, 바람직하게는 0.15 ∼ 50 ㎍, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 24 ㎍ 이다.
-본 발명에 관련된 담체의 양-
(1-B-ii) 에 있어서, 본 발명에 관련된 담체의 양으로는, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 1 ㎖ 당 통상 0.1 ∼ 20 ㎎, 바람직하게는 0.3 ∼ 10 ㎎, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 6 ㎎ 이다.
-접촉 온도-
(1-B-ii) 에 있어서, 본 발명의 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킬 때의 온도로는, 통상 4 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 4 ∼ 25 ℃, 보다 바람직하게는 4 ∼ 11 ℃ 이다.
(1-B-ii) 에 있어서, 본 발명의 Tim 단백질과 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시킨 후, 또한 당해 복합체와 본 발명에 관련된 담체를 접촉시킬 때의 온도로는, 통상 4 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 4 ∼ 25 ℃, 보다 바람직하게는 4 ∼ 11 ℃ 이다.
-접촉 시간-
(1-B-ii) 에 있어서, 본 발명의 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체와 본 발명에 관련된 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 접촉 시간으로는, 통상 0.5 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 ∼ 8 시간, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 4 시간이다.
(1-B-ii) 에 있어서, 본 발명의 Tim 단백질과 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시킨 후, 또한 당해 복합체와 본 발명에 관련된 담체를 접촉시킬 때의 시간으로는, 통상 0.5 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 ∼ 8 시간, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 4 시간이다.
또한, 통상 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 접촉은, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액과 시료와 칼슘 이온을 함유하는 용액을 접촉시킴으로써 실시된다.
본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유시키는 용액으로는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 안정적인 상태로 용해시키고, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체와 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스의 결합을 방해하지 않는 것이면 되고, 예를 들어 정제수, 예를 들어 pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액 (예를 들어, TBS, HBS 등) 을 들 수 있다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로는, 통상 5 ∼ 50 mM, 바람직하게는 10 ∼ 30 mM 의 범위에서 적절히 선택되고, NaCl 농도는 통상 100 ∼ 200 mM, 바람직하게는 140 ∼ 160 mM 의 범위에서 적절히 선택된다. 이 용액 중에는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 안정적인 상태로 용해시키고, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체와 세포외막소포 또는 바이러스의 결합을 방해하지 않는 양이면, 예를 들어 당류, NaCl 등의 염류, 계면활성제, 방부제, 단백질 등이 포함되어 있어도 된다. 계면활성제로는, 예를 들어 트윈20 등을 들 수 있고, 당해 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유시키는 용액에 있어서의 계면활성제의 농도는, 통상 0.00001 ∼ 0.2 ％, 바람직하게는 통상 0.0005 ∼ 0.1 ％ 이다.
칼슘 이온을 함유시키는 용액으로는, 상기 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 함유 (용해 또는 현탁) 시키는 용액과 동일하고, 구체예 등도 동일하다.
칼슘 이온을 함유하는 용액으로는, 칼슘 이온을 함유시키는 용액 중, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 중의 칼슘 이온의 농도가 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 2 ∼ 5 mM 이 되는 양의 칼슘 이온을 함유하는 용액이다.
-(1-B-ii) 의 구체예-
(1-B-ii) 는, 예를 들어 이하의 방법으로 실시하면 된다. 즉, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 1 ㎖ 당 통상 0.01 ∼ 200 ㎍, 바람직하게는 0.15 ∼ 50 ㎍, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 24 ㎍ 의 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액 (예를 들어 정제수, 예를 들어 pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액 중에 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액) 을 통상 0.5 ㎕ ∼ 1 ㎖, 바람직하게는 0.5 ㎕ ∼ 100 ㎕, 보다 바람직하게는 0.5 ㎕ ∼ 10 ㎕ 와, 시료를 본 발명에 관련된 Tim 단백질 1 ㎍ 당 통상 0.1 ∼ 100 ㎖, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 1 ㎖ 와, 시료와 칼슘 이온을 함유하는 용액과 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액을 혼합한 용액 중 및 또한 당해 용액과 본 발명에 관련된 담체를 접촉 후의 용액 중에 있어서의 칼슘 이온의 농도가 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 2 ∼ 5 mM 이 되는 양의 칼슘 이온을 함유하는 용액을, 통상 4 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 4 ∼ 25 ℃, 보다 바람직하게는 4 ∼ 11 ℃, 통상 0.5 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 ∼ 8 시간, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 4 시간 접촉시켜, 본 발명의 Tim 단백질과 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시킨 후, 또한 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 1 ㎖ 당 본 발명에 관련된 담체를 통상 0.1 ∼ 20 ㎎, 바람직하게는 0.3 ∼ 10 ㎎, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 6 ㎎ 더하고, 통상 4 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 4 ∼ 25 ℃, 보다 바람직하게는 4 ∼ 11 ℃, 통상 0.5 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 ∼ 8 시간, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 4 시간, 얻어진 본 발명의 Tim 단백질과 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체와 본 발명에 관련된 담체를 접촉시켜, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킨다.
-(1-B-iii) 에 대해-
(1-B-iii) 은, 본 발명의 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킨 후, 또한 본 발명의 Tim 단백질을 칼슘 이온의 존재하에서 접촉시켜,［세포외막소포 또는 바이러스-(본 발명에 관련된 Tim 단백질)-어피니티 물질-(본 발명에 관련된 담체)］로 이루어지는 본 발명에 관련된 복합체를 형성시키는 방법이다.
구체적으로는, 예를 들어 어피니티 물질로서 서로 친화성을 갖는 2 종 이상의 물질을 사용하는 경우는, 일방의 어피니티 물질이 결합한 담체 (어피니티 물질 결합 담체) 와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시키고, 이어서 이것과 다른 일방의 어피니티 물질이 결합한 Tim 단백질 (어피니티 물질 결합 Tim 단백질) 을, 칼슘 이온의 존재하에서 동시에 접촉시켜, 어피니티 물질 결합 Tim 단백질 중의 Tim 단백질과 세포외막소포 또는 바이러스를 결합시킴과 함께, 어피니티 물질 결합 Tim 단백질 중의 어피니티 물질과 어피니티 물질 결합 담체 중의 어피니티 물질을 결합시킴으로써,［세포외막소포 또는 바이러스-(본 발명에 관련된 Tim 단백질-어피니티 물질)-(어피니티 물질-본 발명에 관련된 담체)］복합체를 형성시킨다.
또, 예를 들어 어피니티 물질로서 어피니티 태그에 친화성을 갖는 물질이나 항Tim 항체를 사용하는 경우에는, 어피니티 물질이 결합한 담체 (어피니티 물질 결합 담체) 와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시키고, 이어서 이것과, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을, 칼슘 이온 존재하에서 동시에 접촉시켜, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 세포외막소포 또는 바이러스를 결합시킴과 함께, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 어피니티 물질 결합 담체 중의 어피니티 물질을 결합시킴으로써,［세포외막소포 또는 바이러스-본 발명에 관련된 Tim 단백질-(어피니티 물질-본 발명에 관련된 담체)］복합체를 형성시킨다.
(1-B-iii) 에 있어서, 칼슘 이온은, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킬 때에 존재시키면 된다. 구체적으로는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액, 또는/및 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스에 칼슘 이온을 함유시킨 것을 사용해도, 본 발명에 관련된 Tim4 단백질을 함유하는 용액과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스와 칼슘 이온을 함유하는 용액을 사용해도 된다.
-본 발명에 관련된 시료의 양-
(1-B-iii) 에 있어서, 본 발명에 관련된 Tim 단백질 1 ㎍ 과 접촉시키는 시료의 양은, 통상 0.1 ∼ 100 ㎖, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 1 ㎖ 이다.
-본 발명에 관련된 Tim 단백질의 양-
(1-B-iii) 에 있어서, 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 양으로는, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 1 ㎖ 당 통상 0.01 ∼ 200 ㎍, 바람직하게는 0.15 ∼ 50 ㎍, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 24 ㎍ 이다.
-본 발명에 관련된 담체의 양-
(1-B-iii) 에 있어서, 본 발명에 관련된 담체의 양으로는, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 1 ㎖ 당 통상 0.1 ∼ 20 ㎎, 바람직하게는 0.3 ∼ 10 ㎎, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 6 ㎎ 이다.
-접촉 온도-
(1-B-iii) 에 있어서, 본 발명에 관련된 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킬 때의 온도로는, 통상 4 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 4 ∼ 25 ℃, 보다 바람직하게는 4 ∼ 11 ℃ 이다.
(1-B-iii) 에 있어서, 본 발명의 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킨 후, 또한 본 발명의 Tim 단백질을 접촉시킬 때의 온도로는, 통상 4 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 4 ∼ 25 ℃, 보다 바람직하게는 4 ∼ 11 ℃ 이다.
-접촉 시간-
(1-B-iii) 에 있어서, 본 발명에 관련된 담체와 시료를 접촉시킬 때의 접촉 시간으로는, 통상 0.5 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 ∼ 8 시간, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 4 시간이다.
(1-B-iii) 에 있어서, 본 발명의 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킨 후, 또한 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 접촉시킬 때의 접촉 시간으로는, 통상 0.5 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 ∼ 8 시간, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 4 시간이다.
또한, 일반적으로는 본 발명의 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킨 후, 또한 본 발명에 관련된 Tim 단백질과의 접촉은, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액과 칼슘 이온을 함유하는 용액을 사용하여 실시된다.
본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유시키는 용액으로는, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 안정적인 상태로 용해시키고, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체와 세포외막소포 또는 바이러스의 결합을 방해하지 않는 것이면 되고, 예를 들어 정제수, 예를 들어 pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액 (예를 들어 PBS, TBS, HBS 등) 을 들 수 있다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로는, 통상 5 ∼ 50 mM, 바람직하게는 10 ∼ 30 mM 의 범위에서 적절히 선택되고, NaCl 농도는 통상 100 ∼ 200 mM, 바람직하게는 140 ∼ 160 mM 의 범위에서 적절히 선택된다. 이 용액 중에는, 본 발명에 관련된 Tim4 단백질을 안정적인 상태로 용해시키고, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체와 세포외막소포 또는 바이러스의 결합을 방해하지 않는 양이면, 예를 들어 당류, NaCl 등의 염류, 계면활성제, 방부제, 단백질 등이 포함되어 있어도 된다. 계면활성제로는, 예를 들어 트윈20 등을 들 수 있고, 당해 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유시키는 용액에 있어서의 계면활성제의 농도는, 통상 0.00001 ∼ 0.2 ％, 바람직하게는 통상 0.0005 ∼ 0.1 ％ 이다.
칼슘 이온을 함유시키는 용액으로는, 상기 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 함유 (용해 또는 현탁) 시키는 용액과 동일하고, 구체예 등도 동일하다.
칼슘 이온을 함유하는 용액으로는, 칼슘 이온을 함유시키는 용액 중, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 중의 칼슘 이온의 농도가 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 2 ∼ 5 mM 이 되는 양의 칼슘 이온을 함유하는 용액이다.
-(1-B-iii) 의 구체예-
(1-B-iii) 은, 예를 들어 이하의 방법으로 실시하면 된다. 즉, 본 발명에 관련된 시료를 본 발명에 관련된 Tim 단백질 1 ㎍ 당 통상 0.1 ∼ 100 ㎖, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 1 ㎖ 와, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 1 ㎖ 당 본 발명에 관련된 담체를 통상 0.1 ∼ 20 ㎎, 바람직하게는 0.3 ∼ 10 ㎎, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 6 ㎎ 을, 통상 4 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 4 ∼ 25 ℃, 보다 바람직하게는 4 ∼ 11 ℃, 통상 0.5 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 ∼ 8 시간, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 4 시간 접촉시킨 후, 칼슘 이온을, 본 발명에 관련된 시료와 칼슘 이온을 함유하는 용액과 본 발명에 관련된 담체를 접촉시키고 또한 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액을 접촉시킨 용액 중에 있어서의 칼슘 이온의 농도가 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 1.0 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 2 ∼ 5 mM 이 되는 양 함유하는 칼슘 이온 함유 용액과 통상 0.01 ∼ 200 ㎍, 바람직하게는 0.15 ∼ 50 ㎍, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 24 ㎍ 의 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액 (예를 들어 정제수, 예를 들어 pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액 중에 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 함유하는 용액) 을 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 1 ㎖ 당 통상 0.5 ㎕ ∼ 1 ㎖, 바람직하게는 0.5 ㎕ ∼ 100 ㎕, 보다 바람직하게는 0.5 ㎕ ∼ 10 ㎕ 더하고, 통상 4 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 4 ∼ 25 ℃, 보다 바람직하게는 4 ∼ 11 ℃, 통상 0.5 ∼ 24 시간, 바람직하게는 0.5 ∼ 8 시간, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 4 시간 접촉시켜, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킨다.
＜6-2. 복합체 분리 공정＞
본 발명의 취득 방법에 있어서의 복합체 분리 공정은, 복합체 형성 공정 후, 얻어진 본 발명에 관련된 담체에 결합한 Tim 단백질 (본 발명의 Tim 담체) 과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체 (본 발명에 관련된 복합체) 와 시료를 분리하고, 분리된 본 발명에 관련된 복합체를 취득하는 공정이다.
본 발명의 취득 방법에 있어서의 복합체 분리 공정은, 본 발명에 관련된 복합체와 시료를 분리하여 본 발명에 관련된 복합체를 취득할 수 있으면 어떠한 방법이어도 되지만, 예를 들어 이하와 같은 방법을 들 수 있다.
(1) 자기 담체를 본 발명에 관련된 담체로서 사용하는 경우, 복합체 형성 공정을 실시한 용기를 필요하다면 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 본 발명에 관련된 복합체를 집합시키고, 상청의 시료를 제거함으로써 이들을 분리하는 방법.
(2) 본 발명의 담체가 비즈상인 경우, 복합체 형성 공정을 실시한 용기를 원심분리 처리하고, 본 발명에 관련된 복합체를 침전으로서 집합시킨 후, 상청의 시료를 제거함으로써 이들을 분리하는 방법.
(3) 본 발명의 담체가 비즈상이 아닌 플레이트 등을 사용한 경우, 시료만을 제거함으로써 이들을 분리하는 방법.
(4) 여과에 의해 본 발명에 관련된 복합체와 시료를 분리하는 방법.
이와 같이 하여 본 발명의 복합체와 시료를 분리한 후, 분리된 본 발명의 복합체를 자체 공지된 방법에 의해 취득 (회수) 하면 된다.
-복합체 분리 공정의 구체예-
자기 담체를 본 발명에 관련된 담체로서 사용하는 경우, 복합체 형성 공정을 실시한 용기를 필요하다면 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 본 발명에 관련된 복합체를 집합시키고, 상청의 시료를 제거한다.
＜6-3. 세정 조작＞
복합체 형성 공정, 복합체 분리 공정 후, 필요하다면 얻어진 본 발명에 관련된 복합체를 칼슘 이온 함유 세정 용액을 사용하여 세정해도 된다 (이하, 「세정 조작」이라고 약기하는 경우가 있다). 세정 조작에 의해, 본 발명에 관련된 담체 표면에 부착한 세포 유래 성분 등의 본 발명에 관련된 시료 중의 협잡물을 제거할 수 있다. 세정 방법으로는, 상기한 바와 같은 칼슘 이온 함유 세정액을 사용하는 이외는, 통상 이 분야에서 실시되고 있는 세정 방법을 사용할 수 있다. 당해 세정 조작에 있어서 사용되는 칼슘 이온 함유 세정 용액으로는, 칼슘 이온을 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 통상 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 통상 2 ∼ 5 mM 함유하고, 당해 복합체에 있어서의 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스와 본 발명에 관련된 Tim4 단백질과 본 발명의 담체의 결합에 영향을 주지 않는 용액이면 어떤 것이라도 되고, 예를 들어 칼슘 이온을 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 통상 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 통상 2 ∼ 5 mM 함유하는, pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 칼슘을 침전시키지 않는 완충액 (예를 들어 TBS, HBS) 을 들 수 있다. 또한, 인산 버퍼는 칼슘과 결합하여 침전이 생기므로 바람직하지 않다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로는, 통상 5 ∼ 50 mM, 바람직하게는 10 ∼ 30 mM 의 범위에서 적절히 선택되고, NaCl 농도는 통상 100 ∼ 200 mM, 바람직하게는 140 ∼ 160 mM 의 범위에서 적절히 선택된다. 이 용액 중에는, 당해 복합체에 있어서의 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스와 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명의 담체의 결합을 방해하지 않는 양이면, 예를 들어 당류, NaCl 등의 염류, 계면활성제, 방부제, 단백질 등이 포함되어 있어도 된다. 계면활성제로는, 예를 들어 트윈 20 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 등을 들 수 있고, 당해 세정 용액에 있어서의 계면활성제의 농도는, 통상 0.00001 ∼ 0.2 ％, 바람직하게는 통상 0.0005 ∼ 0.1 ％ 이다.
예를 들어, 본 발명에 관련된 담체로서, 자성 입자를 사용하는 경우를 예로 들어 설명한다. 먼저, 복합체 분리 공정에 의해 얻어진 본 발명에 관련된 복합체를 포함하는 용기 내에 칼슘 이온 함유 세정 용액을 더하고, 교반한다. 그 후, 상기 용기를, 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 당해 복합체를 집합시키고, 상기 용기 내의 용액을 버린다. 이들 세정 조작은, 필요에 따라 수회 반복하여 실시해도 된다.
-세정 조작의 구체예-
먼저, 복합체 분리 공정에 의해 얻어진 본 발명에 관련된 복합체를 포함하는 용기 내에 칼슘 이온 함유 세정 용액 (예를 들어, 칼슘 이온을 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 통상 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 통상 2 ∼ 5 mM 함유하는, pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 칼슘을 침전시키지 않는 완충액. 단, 인산 버퍼는 칼슘과 결합하여 침전하므로 바람직하지 않다.) 을 더하고, 교반한다. 그 후, 상기 용기를, 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 당해 복합체를 집합시키고, 상기 용기 내의 용액을 버린다. 이들 세정 조작은, 필요에 따라 수회 반복하여 실시해도 된다.
＜6-4. 취득 공정에 대해＞
취득 공정은, 복합체 형성 공정, 복합체 분리 공정을 실시하고, 필요하다면 세정 공정 (세정 조작) 을 실시한 후, 얻어진 본 발명에 관련된 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체로부터 세포외막소포 또는 바이러스를 분리하여, 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 취득하는 공정이다.
이로써, 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 고순도로 취득할 수 있다.
취득 공정의 구체예로는, 예를 들어 이하의 (2-A) 및 (2-B) 를 들 수 있다.
(2-A) 단백질 변성제를 사용하는 방법
(2-B) 칼슘 이온 농도를 저하시키는 방법
＜(2-A) : 단백질 변성제를 사용하는 방법＞
(2-A) 는, 복합체 형성 공정, 복합체 분리 공정을 실시한 후, 필요하다면 세정 조작을 실시한 후, 얻어진 본 발명에 관련된 복합체에, 단백질 변성제를 작용시키고, 본 발명에 관련된 복합체 중의 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 변성시켜, 본 발명에 관련된 복합체로부터, 세포외막소포 또는 바이러스를 분리하는 방법이다. 이로써, 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 고순도로 취득할 수 있다.
-단백질 변성제-
(2-A) 에서 사용되는 단백질 변성제로는, 이 분야에 있어서 일반적으로 단백질을 변성시키는 화합물로서 사용되는 것이면 어떤 것이라도 되고, 예를 들어 SDS (도데실황산나트륨), N-라우로일사르코신 등의 음이온성 계면활성제 ; CHAPS (3-(3-콜라미도프로필)시에틀아미노-1-프로판술폰산염), Zwittergent 3-12(N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트) 등의 양쪽 이온성 계면활성제 ; Brij 35 (다카라 바이오 (주) 제조), Dodecyl-β-D-maltoside (n-도데실-β-D-말토사이드), 노니데트 P-40, Octyl-β-D-glucoside (옥틸-β-D-글루코사이드), Triton X-100 (폴리옥시에틸렌 (10) 옥틸페닐에테르), 트윈 20 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄모노라우레이트) 등의 비이온성 계면활성제 ; 우레아, 포름아미드, 구아니딘 등의 카오트로픽제 등을 들 수 있고, 음이온성 계면활성제가 바람직하고, SDS 가 특히 바람직하다.
(2-A) 에 있어서, 이들 단백질 변성제를 본 발명에 관련된 복합체에 작용시키려면, 일반적으로는 단백질 변성제를 함유시킨 용액 (이하, 「단백질 변성제 함유 용액」이라고 약기하는 경우가 있다) 과, 본 발명에 관련된 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 접촉시켜, 단백질 변성제 함유 용액을 본 발명에 관련된 복합체에 작용시킴으로써 실시된다.
또한, 단백질 변성제 함유 용액과 본 발명에 관련된 복합체의 접촉은, 예를 들어 당해 용액에 당해 복합체를 현탁시키는 방법 (담체가 비즈인 경우 등), 당해 용액에 당해 복합체를 침지시키는 방법 (담체가 디스크상 편, 튜브인 경우 등), 당해 용액을 당해 복합체 (담체) 에 첨가하는 방법 (담체가 마이크로 플레이트, 튜브인 경우 등) 등에 의해 실시할 수 있다.
-단백질 변성제를 함유시키는 용액-
(2-A) 에 있어서, 단백질 변성제를 함유시키는 용액으로는, 정제수, 단백질 변성제를 용해시킬 수 있는 완충액 등을 들 수 있다. 당해 완충액으로는, 통상 pH 가 6 ∼ 9, 바람직하게는 7 ∼ 8 에 완충 작용을 갖는 완충액 (예를 들어 Tris, HEPES 등) 을 들 수 있다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로는, 통상 5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 10 ∼ 50 mM 의 범위에서 적절히 선택된다.
-단백질 변성제 함유 용액-
(2-A) 에 있어서, 단백질 변성제 함유 용액의 pH 는 통상 6.0 ∼ 9.0, 바람직하게는 7.0 ∼ 8.0 이다. 단백질 변성제 함유 용액 중의 단백질 변성제의 농도로는, 단백질 변성제의 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 이 분야에 있어서 사용되는 농도 범위이면 되고, 예를 들어 SDS 의 경우 통상 0.1 ∼ 10 ％, 바람직하게는 0.3 ∼ 4 ％, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 2 ％ 이다. 또, 단백질 변성제 함유 용액은, 예를 들어 당류, NaCl 등의 염류, 방부제, 단백질 등을 포함하고 있어도 된다. (2-A) 에 있어서, 단백질 변성제 함유 용액은, 본 발명의 Tim 담체 1 ㎎ 에 대해 통상 10 ㎕ ∼ 500 ㎕, 바람직하게는 20 ㎕ ∼ 200 ㎕, 보다 바람직하게는 50 ㎕ ∼ 100 ㎕ 사용된다.
-작용 (접촉) 조건-
(2-A) 에 있어서, 복합체에 단백질 변성제를 작용 (접촉) 시키는 온도나 시간으로는, 통상 4.0 ∼ 3 7 ℃, 바람직하게는 10 ∼ 30 ℃, 보다 바람직하게는 20 ∼ 30 ℃ 에서, 통상 5.0 ∼ 60 초간, 바람직하게는 10 ∼ 30 초간, 보다 바람직하게는 10 ∼ 20 초간이다.
-Tim 단백질-
단백질 변성제를 작용 (접촉) 시키는 (즉 (2-A) 의) 경우, 세포외막소포를 취득하는 경우에 있어서의 본 발명에 관련된 Tim 단백질로는, 상기 본 발명에 관련된 Tim 단백질이면 어느 것이라도 사용할 수 있지만, 본 발명에 관련된 Tim4 단백질 및 본 발명에 관련된 Tim1 단백질이 바람직하고, 본 발명에 관련된 Tim4 단백질이 특히 바람직하며, 또 바이러스를 취득하는 경우에는, 본 발명에 관련된 Tim4 단백질 및 본 발명에 관련된 Tim3 단백질이 특히 바람직하다.
-(2-A) 의 구체예-
(2-A) 는, 예를 들어 이하의 방법으로 실시하면 된다. 즉, 복합체 형성 공정, 복합체 분리 공정을 실시하고, 필요하다면 세정 조작을 실시한 후, 얻어진 본 발명에 관련된 복합체에, 단백질 변성제를 통상 0.1 ∼ 10 ％, 바람직하게는 0.3 ∼ 4.0 ％, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 2.0 ％ 함유하는 용액 (정제수, 또는 통상 pH 가 6 ∼ 9, 바람직하게는 7 ∼ 8 에 완충 작용을 갖는 완충액 중에 단백질 변성제를 함유하는 용액) 을, 본 발명의 Tim 담체 1 ㎎ 에 대해 통상 10 ㎕ ∼ 500 ㎕, 바람직하게는 20 ㎕ ∼ 200 ㎕, 보다 바람직하게는 50 ㎕ ∼ 100 ㎕ 첨가하고, 볼텍스 믹서 등을 사용하여 교반하면서 통상 4 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 10 ∼ 30 ℃, 보다 바람직하게는 20 ∼ 30 ℃ 에서, 통상 5 ∼ 60 초간, 바람직하게는 10 ∼ 30 초간, 보다 바람직하게는 10 ∼ 20 초간 반응시키고, 본 발명에 관련된 복합체 중의 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 단백질 변성제를 접촉시킴으로써 작용시켜, 본 발명에 관련된 복합체로부터 세포외막소포 또는 바이러스를 분리시킨다.
＜(2-B) : 칼슘 이온 농도를 저하시키는 방법＞
(2-B) 는, 복합체 형성 공정, 복합체 분리 공정을 실시하고, 필요하다면 세정 조작을 실시한 후, 얻어진 본 발명에 관련된 복합체와 결합하고 있는 칼슘 이온 및 복합체를 함유하는 용액 중의 칼슘 이온의 농도를 저하시킴으로써, 본 발명에 관련된 복합체로부터, 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 분리시키는 방법이다.
이로써, 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 고순도로, 또한 인택트한 상태로 취득할 수 있다.
그런데, Tim 단백질과 포스파티딜세린의 결합에 있어서는, 칼슘 이온이 개재하고 있는 것이 알려져 있다 (Immunity 2007 December ; 27(6) : 941-951). 복합체 형성 공정, 복합체 분리 공정을 실시하고, 필요하다면 세정 조작을 실시한 후, 얻어진 본 발명에 관련된 복합체도, 본 발명에 관련된 복합체 중의 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 결합을 유지하기 위해서, 칼슘 이온을 공존시켜 둘 필요가 있다. 예를 들어 본 발명에 관련된 복합체를 용액 중에 공존시키는 경우에는, 본 발명에 관련된 복합체의 용액 중에 0.5 mM 이상의 칼슘 이온이 필요하다. 여기서, 본 발명에 관련된 복합체를 용액 중에 공존시키는 경우에는, 복합체 형성 공정, 복합체 분리 공정, 필요하다면 세정 조작을 실시한 후의 펠릿 상태의 담체도 포함된다.
또한, 복합체 형성 공정, 복합체 분리 공정, 필요하다면 세정 조작을 실시한 후의 본 발명에 관련된 복합체가 건조되었다고 해도, 취득 공정을 실시하지 않는 한 당해 복합체로부터 칼슘 이온이 용출되는 일은 없고, 본 발명의 담체와 세포외막소포 또는 바이러스의 결합은 유지된다.
(2-B) 는, 본 발명에 관련된 복합체와 결합하고 있는 칼슘 이온으로부터 반입된 칼슘 이온의 농도를 상기한 바와 같은 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 세포외막소포 또는 바이러스의 결합을 유지하기 위해서 필요한 농도 (유효 농도) 보다 저하시킴으로써, 본 발명에 관련된 복합체로부터, 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 분리시키는 것이 가능해진다.
구체적으로는, 본 발명에 관련된 복합체를 함유되는 용액 중의 칼슘 이온의 농도를 통상 0.5 mM 미만, 바람직하게는 0.4 mM 미만, 보다 바람직하게는 0.2 mM 미만으로 하면 된다.
칼슘 이온의 (유효) 농도를 저하시키는 방법으로는, 예를 들어 이하의 (2-B-i), (2-B-ii) 등을 들 수 있다.
(2-B-i) 칼슘 이온 킬레이트제를 사용하는 방법
(2-B-ii) 칼슘 이온을 포함하지 않는 용액을 사용하는 방법
-(2-B-i) : 칼슘 이온 킬레이트제를 사용하는 방법-
(2-B-i) 은, 복합체 형성 공정, 복합체 분리 공정을 실시하고, 필요하다면 세정 조작을 실시한 후, 얻어진 본 발명에 관련된 복합체와 결합하고 있는 칼슘 이온 및 복합체를 함유하는 용액으로부터 반입된 칼슘 이온에 칼슘 이온 킬레이트제를 작용시킨 후, 본 발명에 관련된 복합체와 결합하고 있는 칼슘 이온 및 복합체를 함유하는 용액으로부터 반입된 칼슘 이온의 (유효) 농도를 저하시키는 (칼슘 이온을 킬레이트시킨다) 것에 의해, 본 발명에 관련된 복합체로부터 세포외막소포 또는 바이러스를 분리시키는 방법이다.
이로써, 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 고순도로, 또한 인택트한 상태로 취득할 수 있다.
-칼슘 이온 킬레이트제-
칼슘 이온 킬레이트제로는, 칼슘 이온을 킬레이트할 수 있는 화합물이면 어떤 것이라도 되고, 예를 들어 EDTA (에틸렌디아민 4 아세트산), NTA (니트릴로 3 아세트산), DTPA (디에틸렌트리아민 5 아세트산), GLDA (L-글루탐산 2 아세트산), HEDTA (하이드록시에틸에틸렌디아민 3 아세트산), GEDTA (에틸렌글리콜비스(β-아미노에틸에테르)-N,N,N,N-4 아세트산), TTHA (트리에틸렌테트라민-N,N,N',N'',N''',N'''-6 아세트산), HIDA (2-하이드록시에틸이미노 2 (아세트산)), DHEG(N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신), CyDTA (trans-1,2-Diaminocyclohexane-N,N,N',N'-tetraacetic acid, monohydrate) 등을 들 수 있고, EDTA, GEDTA, CyDTA 가 바람직하다. 이들 칼슘 이온 킬레이트제를 본 발명에 관련된 복합체와 결합하고 있는 칼슘 이온에 작용시키려면, 일반적으로는 칼슘 이온 킬레이트제를 함유시킨 용액 (이하, 「칼슘 이온 킬레이트제 함유 용액」이라고 약기하는 경우가 있다) 을 펠릿상의 본 발명에 관련된 복합체와 접촉시키고, 본 발명에 관련된 복합체와 결합하고 있는 칼슘 이온과 칼슘 이온 킬레이트제 함유 용액 중의 칼슘 이온 킬레이트제를 반응시킴으로써 실시된다.
또한, 칼슘 이온 킬레이트제 함유 용액과 본 발명에 관련된 복합체의 접촉은, 예를 들어 당해 용액에 당해 복합체를 현탁시키는 방법 (담체가 비즈인 경우 등), 당해 용액에 당해 복합체를 침지시키는 방법 (담체가 디스크상 편, 튜브인 경우 등), 당해 용액을 당해 복합체 (담체) 에 첨가하는 방법 (담체가 마이크로 플레이트, 튜브인 경우 등) 등에 의해 실시할 수 있다.
-칼슘 이온 킬레이트제 함유 용액-
(2-B-i) 에 있어서, 칼슘 이온 킬레이트제를 함유시키는 용액으로는, 칼슘 이온 킬레이트제를 용해시키는 것이면 되고, 예를 들어 정제수, 완충액 등을 들 수 있다. 완충액으로는, 통상 pH 가 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액 (예를 들어 PBS, TBS, HBS 등) 이 바람직하다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로는, 통상 5 ∼ 50 mM, 바람직하게는 10 ∼ 30 mM 의 범위로부터 적절히 선택되고, NaCl 농도는 통상 100 ∼ 200 mM, 바람직하게는 140 ∼ 160 mM 의 범위로부터 적절히 선택된다. 칼슘 이온 킬레이트제 함유 용액은, 예를 들어 당류, NaCl 등의 염류, 방부제, 단백질 등이 포함되어 있어도 된다.
(2-B-i) 에 있어서, 칼슘 이온 킬레이트제 함유 용액 중의 칼슘 이온 킬레이트제의 농도로는, 통상 0.5 ∼ 500 mM, 바람직하게는 0.5 ∼ 100 mM, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 50 mM 이다.
(2-B-i) 에 있어서, 칼슘 이온 킬레이트제 함유 용액의 pH 는, 통상 6.0 ∼ 9.0, 바람직하게는 7.0 ∼ 8.0, 보다 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 이다.
(2-B-i) 에 있어서, 반응 용액에 혼합하는 칼슘 이온 킬레이트제 함유 용액의 양으로는, 반응 용액 중의 칼슘 이온의 농도를 유효 농도 미만으로 하고, 본 발명에 관련된 복합체로부터 세포외막소포 또는 바이러스가 분리되는 양이면 된다.
-작용 (접촉) 조건-
(2-B-i) 에 있어서, 복합체에 칼슘 이온 킬레이트제를 작용 (접촉) 시키는 온도나 시간으로는, 통상 4.0 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 10 ∼ 30 ℃, 보다 바람직하게는 20 ∼ 30 ℃ 에서 통상 5 ∼ 60 초간, 바람직하게는 10 ∼ 30 초간, 보다 바람직하게는 10 ∼ 20 초간 실시한다.
-Tim 담체-
(2-B-i) 에 있어서, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체의 결합 양식으로는, 본 발명에 관련된 담체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질이 결합하고 있으면 결합 양식은 불문이다. 칼슘 이온 킬레이트제를 사용하여 세포외막소포 또는 바이러스를 용출시키는 경우 (즉 (2-B-i) 의 경우) 에는, 많은 세포외막소포 또는 바이러스를 취득 가능한 점에서 본 발명에 관련된 담체가 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 SH 기에 결합한 것이 바람직하고, 본 발명에 관련된 담체가 본 발명에 관련된 Tim4 단백질의 SH 기에 결합한 것이 특히 바람직하다.
-(2-B-i) 의 구체예-
(2-B-i) 은, 예를 들어 이하의 방법으로 실시하면 된다. 즉, 복합체 형성 공정, 복합체 분리 공정을 실시하고, 필요하다면 세정 조작을 실시한 후, 얻어진 본 발명에 관련된 복합체에, 통상 0.5 ∼ 500 mM, 바람직하게는 0.5 ∼ 100 mM, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 50 mM 칼슘 이온 킬레이트제를 함유하는 용액 (정제수, 또는 통상 pH 가 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액 중에 칼슘 이온 킬레이트제를 함유하는 용액) 을 본 발명의 Tim 담체 1 ㎎ 당 통상 10 ∼ 500 ㎕, 바람직하게는 20 ∼ 200 ㎕, 보다 바람직하게는 50 ∼ 100 ㎕ 첨가하고, 볼텍스 믹서 등을 사용하여 교반하면서 통상 4.0 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 10 ∼ 30 ℃, 보다 바람직하게는 20 ∼ 30 ℃ 에서 통상 5 ∼ 60 초간, 바람직하게는 10 ∼ 30 초간, 보다 바람직하게는 10 ∼ 20 초간 반응시켜, 본 발명에 관련된 복합체로부터 세포외막소포 또는 바이러스를 분리시킨다.
-(2-B-ii) : 칼슘 이온을 포함하지 않는 용액을 사용하는 방법-
(2-B-ii) 는, 복합체 형성 공정을 실시하고, 복합체 분리 공정을 실시하고, 필요하다면 세정 조작을 실시한 후, 얻어진 본 발명에 관련된 복합체를, 칼슘 이온을 포함하지 않는 용액과 접촉시킴으로써, 본 발명에 관련된 복합체와 결합하고 있는 칼슘 이온의 (유효) 농도를 저하시키는 (희석한다) 것에 의해, 본 발명에 관련된 복합체로부터 세포외막소포 또는 바이러스를 분리시키는 방법이다.
즉, 본 발명에 관련된 복합체에, 칼슘 이온을 포함하지 않는 용액을 접촉시킴으로써, 본 발명에 관련된 복합체 중의 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 결합을 유지하기 위해 필요한 칼슘 이온의 (유효) 농도를 저하시키고 (희석하고), 본 발명에 관련된 복합체로부터 세포외막소포를 분리시키는 것이 가능해진다.
또한, 칼슘 이온을 포함하지 않는 용액과 본 발명에 관련된 복합체의 접촉은, 예를 들어 당해 용액에 당해 복합체를 현탁시키는 방법 (담체가 비즈인 경우 등), 당해 용액에 당해 복합체를 침지시키는 방법 (담체가 디스크상 편, 튜브인 경우 등), 당해 용액을 당해 복합체 (담체) 에 첨가하는 방법 (담체가 마이크로 플레이트, 튜브인 경우 등) 등에 의해 실시할 수 있다.
-칼슘 이온을 포함하지 않는 용액-
(2-B-ii) 에 있어서, 얻어진 본 발명에 관련된 복합체에 첨가하는 칼슘 이온을 포함하지 않는 용액으로는, 세포외막소포 또는 바이러스를 변성시키지 않는 용액이면 되고, 예를 들어 정제수, 완충액 등을 들 수 있다. 완충액으로는, 통상 pH 가 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액 (예를 들어 PBS, TBS, HBS 등) 이 바람직하다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로는, 통상 5 ∼ 50 mM, 바람직하게는 10 ∼ 30 mM 의 범위로부터 적절히 선택되고, NaCl 농도는 통상 100 ∼ 200 mM, 바람직하게는 140 ∼ 160 mM 의 범위로부터 적절히 선택된다. 칼슘 이온을 포함하지 않는 용매는, 예를 들어 당류, NaCl 등의 염류, 방부제, 단백질 등을 포함하고 있어도 된다.
(2-B-ii) 에 있어서, 얻어진 본 발명에 관련된 복합체에 첨가하는 칼슘 이온을 포함하지 않는 용액의 양으로는, 칼슘 이온의 농도를 유효 농도 미만으로 할 수 있는 양이면 된다.
-(2-B-ii) 의 구체예-
복합체 형성 공정, 복합체 분리 공정을 실시하고, 필요하다면 세정 조작을 실시한 후, 얻어진 본 발명에 관련된 복합체에, 칼슘 이온을 포함하지 않는 용액을, 본 발명에 관련된 복합체를 포함하는 용액 중의 칼슘 이온의 농도를 통상 0.5 mM 미만, 바람직하게는 0.1 mM 미만, 보다 바람직하게는 0.01 mM 미만이 되도록 첨가함으로써 실시된다.
또한, 복합체 형성 공정, 복합체 분리 공정을 실시하고, 필요하다면 세정 조작을 실시한 후, 얻어진 본 발명에 관련된 복합체가 칼슘 이온을 함유하는 용액 중 (예를 들어, 복합체 형성 공정을 실시한 후의 반응액, 칼슘 이온 함유 세정액) 에 존재하는 경우는, 최종적인 칼슘 이온의 농도가 상기한 유효 농도 미만이 되도록, 당해 칼슘 이온을 함유하는 용액을, 칼슘 이온을 포함하지 않는 용액으로 치환 또는/및 칼슘 이온을 포함하지 않는 용액에 의해 희석하면 된다.
취득 공정에 의해 얻어진 세포외막소포를 함유하는 용액의 (체적 증가) 양이, (2-B-ii) 가 (2-B-i) 보다 많은 점에서, (2-B-i) 이 바람직하다.
상기에 있어서, 복합체와 접촉·작용시킨 용액 (단백질 변성제 함유 용액, 칼슘 이온 킬레이트제 함유 용액, 칼슘 이온을 포함하지 않는 용액) 중에는, 담체와, 담체 (복합체) 로부터 분리 (유리) 한 세포외막소포 또는 바이러스가 함유되게 된다. 따라서, 당해 용액으로부터 담체를 제거하고, 용액만을 회수하면, 세포외막소포 또는 바이러스를 함유하는 용액을 얻을 수 있다.
본 발명의 Tim 담체를 이용하면, 시료로부터 세포외막소포 또는 바이러스를 효율적으로 제거할 수 있어, 협잡물이 적은 시료를 얻을 수 있다.
본 발명의 제거 방법은, 초원심분리법이나 폴리머 침전 처리 등의 종래법으로는 다 제거할 수 없는 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 정밀도 양호하고 효율적으로 제거할 수 있다.
＜7. 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 제거 방법＞
본 발명의 세포외막소포 또는 바이러스를 취득하는 방법 (이하, 「본 발명의 제거 방법」이라고 약기하는 경우가 있다) 은, 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(1) 칼슘 이온 존재하, 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시키는 공정 (이하, 「복합체 형성 공정」이라고 약기하는 경우가 있다)
(2) 당해 복합체와 시료를 분리하는 공정 (이하, 「복합체 분리 공정」이라고 약기하는 경우가 있다).
＜7-1. 복합체 형성 공정＞
본 발명의 제거 방법에 있어서의 복합체 형성 공정은, 본 발명의 취득 방법에 있어서의 복합체 형성 공정과 동일하고, 각종 바람직한 조건도 동일하다.
＜7-2. 복합체 분리 공정＞
본 발명의 제거 방법에 있어서의 복합체 분리 공정은, 복합체 형성 공정을 실시한 후, 얻어진 본 발명에 관련된 담체에 결합한 Tim 단백질 (본 발명의 Tim 담체) 과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체 (본 발명에 관련된 복합체) 와 시료를 분리하고, 분리된 시료를 취득하는 공정이다.
이로써, 세포외막소포 또는 바이러스가 제거된 시료를 얻을 수 있다.
본 발명의 제거 방법에 있어서의 복합체 분리 공정은, 본 발명에 관련된 복합체를 시료로부터 제거할 수 있다면 어떠한 방법이라도 되고, 상기 본 발명의 취득 방법에 있어서의 복합체 분리 공정과 동일한 방법을 들 수 있다. 이와 같이 하여 본 발명의 복합체와 시료를 분리한 후, 분리된 시료를 자체 공지된 방법에 의해 취득 (회수) 하면 된다.
이로써, 초원심분리법이나 폴리머 침전 처리 등의 종래법에서는 다 제거할 수 없는 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 정밀도 양호하고 효율적으로 제거할 수 있다.
또, 상기 복합체 형성 공정 및 복합체 분리 공정을 복수회 반복하여 실시함으로써, 시료로부터의 세포외막소포 또는 바이러스의 제거를 보다 효율적으로 실시할 수 있다. 상기 복합체 형성 공정 및 복합체 분리 공정을 반복하여 실시하려면, 새로운 담체를 사용해도 사용이 끝난 담체를 재이용할 수도 있다. 담체의 재이용은, 본 발명의 제거 방법에 있어서의 복합체 분리 공정에서 제거한 본 발명에 관련된 복합체를, 칼슘 이온 킬레이트제 함유 용액 또는 칼슘 이온을 포함하지 않는 용액을 사용하여 본 발명의 취득 방법의 취득 공정 ((2-B) 칼슘 이온 농도를 저하시키는 방법) 과 동일한 처리에 부여하면 된다. 이로써, 본 발명에 관련된 복합체로부터 본 발명의 Tim 담체와 세포외막소포 또는 바이러스를 분리시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 Tim 담체는, 재차 본 발명의 제거 방법에 사용할 수 있으므로, 당해 본 발명의 Tim 담체를 재이용함으로써 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 제거를 정밀도 양호하고 효율적으로 실시할 수 있다.
본 발명의 Tim 담체를 이용하면, 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 정밀도 양호하고 고감도로 검출할 수 있다.
＜8. 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 검출하는 방법＞
본 발명의 세포외막소포 또는 바이러스를 검출하는 방법 (이하, 「본 발명의 검출 방법」이라고 약기하는 경우가 있다) 은, 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(1) 칼슘 이온 존재하, 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시키는 공정 (복합체 형성 공정)
(2) 당해 복합체를 검출하는 공정 (검출 공정)
＜8-1. 복합체 형성 공정＞
본 발명의 검출 방법에 있어서의 복합체 형성 공정은, 칼슘 이온 존재하, 본 발명의 Tim 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시키는 공정이다.
-본 발명에 관련된 시료-
본 발명에 관련된 시료는, 본 발명의 취득 방법에 있어서의 시료와 동일하다.
-칼슘 이온 농도·칼슘 이온의 유래-
본 발명의 검출 방법에 있어서, 칼슘 이온은 본 발명에 관련된 Tim 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체 (본 발명에 관련된 복합체) 를 형성시킬 때에 존재시킨다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 본 발명에 관련된 Tim 담체와 본 발명에 관련된 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킬 때의 칼슘 이온 농도는, 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 2 ∼ 5 mM 이다. 또한, 본 발명에 관련된 Tim 담체와 본 발명에 관련된 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체가 형성되고, 검출 공정을 실시할 때까지, 즉 당해 복합체를 검출하는 공정에 부여할 때까지의 당해 복합체를 함유하는 용액 중에는, 상기한 바와 같은 농도의 칼슘 이온이 필요한 것은 말할 필요도 없다.
또, 칼슘 이온의 유래는 특별히 한정되지 않고, 본 발명의 취득 방법에 있어서의 칼슘 이온의 유래와 동일한 구체예를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 Tim 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킬 때에 칼슘 이온을 존재시키는 방법으로는, 일반적으로는 본 발명의 Tim 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킬 때의 칼슘 이온 농도가 상기한 범위가 되도록 시료에 상기한 바와 같은 칼슘 이온을 함유시키면 된다.
칼슘 이온을 함유시키는 용액으로는, 상기 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 함유 (용해 또는 현탁) 시키는 용액과 동일하고, 구체예 등도 동일하다.
-시료의 양-
본 발명의 검출 방법의 복합체 형성 공정에 있어서 시료의 양으로는, 본 발명에 관련된 담체로서 비즈를 사용하는 경우, 본 발명의 Tim 담체 1 ㎎ 당 통상 0.1 ∼ 1000 ㎖, 바람직하게는 0.1 ∼ 500 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 100 ㎖, 본 발명에 관련된 담체로서 마이크로 플레이트를 사용하는 경우, 1 웰당 통상 50 ㎕ ∼ 300 ㎕, 바람직하게는 100 ㎕ ∼ 200 ㎕ 이다.
-온도-
본 발명의 검출 방법의 복합체 형성 공정에 있어서, 본 발명의 Tim 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스를 접촉시킬 때의 온도로는, 통상 2 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 2 ∼ 30 ℃ 이다.
-시간-
본 발명의 검출 방법의 복합체 형성 공정에 있어서, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 시료의 접촉 시간으로는, 통상 0.5 ∼ 24 시간, 바람직하게는 1 ∼ 20 시간, 보다 바람직하게는 1 ∼ 12 시간이다.
-Tim 단백질-
본 발명의 검출 방법에 있어서의 본 발명에 관련된 Tim 단백질로는, 상기 본 발명에 관련된 Tim 단백질이라면 어떤 것이라도 사용할 수 있지만, 본 발명에 관련된 Tim4 단백질이 특히 바람직하다.
-Tim 담체-
본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명에 관련된 담체의 결합 양식으로는, 본 발명에 관련된 담체와 본 발명에 관련된 Tim 단백질이 결합하고 있으면 결합 양식은 불문이지만, 고감도로 세포외막소포 또는 바이러스를 검출 가능한 점에서 본 발명에 관련된 담체가 본 발명에 관련된 Tim 단백질의 SH 기에 결합한 것이 바람직하고, 본 발명에 관련된 담체가 본 발명에 관련된 Tim4 단백질의 SH 기에 결합한 것이 특히 바람직하다.
-본 발명의 검출 방법에 있어서의 복합체 형성 공정의 구체예-
본 발명의 검출 방법에 있어서의 복합체 형성 공정은, 예를 들어 이하의 방법으로 실시하면 된다.
즉, 본 발명에 관련된 담체로서 비즈를 사용하는 경우, 본 발명의 Tim 담체를, 본 발명의 Tim 담체와 시료와 칼슘 이온을 함유하는 용액을 혼합 후의 용액 (본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액) 1 ㎖ 당 통상 0.001 ∼ 20 ㎎, 바람직하게는 0.005 ∼ 10 ㎎, 보다 바람직하게는 0.01 ∼ 6.0 ㎎ 과, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 중의 칼슘 이온 농도가 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 1.0 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 2.0 ∼ 5.0 mM 이 되는 양의 칼슘 이온을 함유하는 용액과, 본 발명의 Tim 담체 1 ㎎ 당 통상 0.1 ∼ 1000 ㎖, 바람직하게는 0.1 ∼ 500 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 100 ㎖ 의 시료를, 통상 2 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 2 ∼ 30 ℃, 통상 0.5 ∼ 24 시간, 바람직하게는 1 ∼ 20 시간, 보다 바람직하게는 1 ∼ 12 시간 접촉시켜, 본 발명에 관련된 담체에 결합한 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체를 형성시킨다.
본 발명에 관련된 담체로서 마이크로 플레이트를 사용하는 경우, Tim 단백질을 고정화한 마이크로 플레이트의 각 웰 (본 발명의 Tim 담체) 에, 본 발명에 관련된 복합체를 형성시킬 때의 용액 중의 칼슘 이온 농도가 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 1.0 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 2.0 ∼ 5.0 mM 이 되는 양의 칼슘 이온을 함유하는 용액과, 본 발명에 관련된 시료를 1 웰당 통상 50 ㎕ ∼ 300 ㎕, 바람직하게는 100 ㎕ ∼ 200 ㎕ 첨가하고, 통상 2 ℃ ∼ 37 ℃, 바람직하게는 2 ℃ ∼ 30 ℃ 에서 통상 0.5 시간 ∼ 24 시간, 바람직하게는 1 시간 ∼ 20 시간, 보다 바람직하게는 1 ∼ 12 시간 반응시킴으로써, 본 발명의 Tim 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체 (본 발명에 관련된 복합체) 를 형성시킨다.
＜8-2. 본 발명의 검출 방법에 있어서의 검출 공정＞
본 발명의 검출 방법에 있어서의 검출 공정은, 복합체 형성 공정을 실시한 후, 필요하다면 시료의 복합체 분리 공정을 실시하고, 필요하다면 또한 세정 조작을 실시한 후, 본 발명의 Tim 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체 (본 발명에 관련된 복합체) 를 검출하는 공정이다.
-복합체 분리 공정-
본 발명의 검출 방법에 있어서의 복합체 분리 공정은, 복합체 형성 공정 후, 필요하다면 얻어진 본 발명에 관련된 담체에 결합한 Tim 단백질 (본 발명의 Tim 담체) 과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체 (본 발명에 관련된 복합체) 로부터 시료를 제거하는 공정이다.
본 발명의 검출 방법에 있어서의 복합체 분리 공정은, 본 발명에 관련된 복합체와 시료를 분리하는, 바꿔 말하면 이른바 B/F 분리할 수 있으면 어떠한 방법이어도 되고, 이 분야에서 사용되는 B/F 분리법을 사용할 수 있다. 이와 같은 방법으로는, 본 발명의 취득 방법에 있어서의 복합체 분리 공정과 동일하다.
-복합체 분리 공정의 구체예-
본 발명의 검출 방법에 있어서의 복합체 분리 공정은, 이 분야에 있어서의 통상적인 방법에 따르면 되지만, 본 발명에 관련된 담체로서 자기 비즈를 사용하는 경우, 예를 들어 복합체 형성 공정을 실시한 용기를 필요하다면 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 본 발명에 관련된 복합체를 집합시키고, 상청의 시료를 제거한다.
본 발명에 관련된 담체로서 마이크로 플레이트를 사용하는 경우, 예를 들어 복합체 형성 공정을 실시한 마이크로 플레이트로부터, 필요하다면 마이크로 피펫 또는 플레이트 워셔를 사용하여 시료를 제거한다.
＜8-3. 세정 조작＞
복합체 형성 공정 후, 필요하다면 복합체 분리 공정을 실시하고, 필요하다면, 또한 얻어진 본 발명에 관련된 복합체를, 칼슘 이온 함유 세정 용액을 사용하여 세정해도 된다 (이하, 「세정 조작」이라고 약기하는 경우가 있다). 세정 조작에 의해, 본 발명에 관련된 담체 표면에 부착된 세포 유래 성분 등의 본 발명에 관련된 시료 중의 협잡물을 제거할 수 있다. 세정 방법 등의 각종 조건은, 본 발명의 취득 방법에 있어서의 세정 조작과 동일하다.
-세정 조작의 구체예-
본 발명에 관련된 담체로서 자기 비즈를 이용하여 1.5 ㎖ 용적 튜브로 실시하는 경우, 먼저 복합체 분리 공정에 의해 얻어진 본 발명에 관련된 복합체를 포함하는 용기 내에 칼슘 이온 함유 세정 용액 (예를 들어, 칼슘 이온을 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 통상 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 통상 2 ∼ 5 mM 함유하는, pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 칼슘을 침전시키지 않는 완충액. 단, 인산 버퍼는 칼슘과 결합하여 침전하므로 바람직하지 않다.) 을 통상 100 ㎕ ∼ 1500 ㎕, 바람직하게는 200 ㎕ ∼ 1000 ㎕ 첨가하고, 교반한다. 그 후, 상기 용기를, 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 당해 복합체를 집합시키고, 상기 용기 내의 용액을 버린다. 이들 세정 조작은, 필요에 따라 수회 반복하여 실시해도 된다.
본 발명에 관련된 담체로서 마이크로 플레이트를 사용하는 경우, 먼저 복합체 분리 공정에 의해 얻어진 본 발명에 관련된 복합체를 포함하는 웰에 칼슘 이온 함유 세정 용액 (예를 들어, 칼슘 이온을 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 통상 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 통상 2.0 ∼ 5.0 mM 함유하는, pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 칼슘을 침지시키지 않는 완충액. 단, 인산 버퍼는 칼슘과 결합하여 침전하므로 바람직하지 않다.) 을 통상 100 ㎕ ∼ 300 ㎕, 바람직하게는 200 ㎕ ∼ 300 ㎕ 첨가하여 더하고, 이어서 더한 세정액을 제거한다. 이들 세정 조작은, 필요에 따라 복수회 반복하여 실시해도 된다.
＜8-4. 검출 공정＞
본 발명의 검출 방법에 있어서의 검출 공정은, 본 발명에 관련된 복합체의 유무 및/또는 양을 검출 가능한 방법이면 어떤 것이라도 되고, 자체 공지된 면역학적 측정에 사용되는 방법은 어느 것이나 이용할 수 있다.
본 발명의 검출 공정은, 상기한 바와 같은 방법에 의해 조제된 본 발명의 Tim 담체를 사용하는 것 이외에는 특별히 한정되지 않는다. 이와 같은 면역학적 측정법으로는, 예를 들어 역수신 응집 반응법 (토쿄 화학 동인 속생 화학 실험 강좌 5 면역 생화학 연구법 p.36-37, 카네하라 출판 주식회사 임상 검사법 제요 제30판 p.844-845 등) 등의 응집 반응을 이용한 측정법, 예를 들어 비탁법 (카네하라 출판 주식회사 임상 검사법 제요 제30판 p.851-853 등), 면역 비탁법 (카네하라 출판 주식회사 임상 검사법 제요 제30판 p.853-854 등) 등의 응집 반응을 응용한 광학적 측정법, 라디오이뮤노어세이법 (RIA)(토쿄 화학 동인 속생 화학 실험 강좌 5 면역 생화학 연구법 p.57-61, 카네하라 출판 주식회사 임상 검사법 제요 제30판 p.856-862등), 이뮤노라디오메트릭어세이법 (IRMA)(카네하라 출판 주식회사 임상 검사법 제요 제30판 p.856-862 등), 엔자임이뮤노어세이법 (EIA)(토쿄 10 화학 동인 속생 화학 실험 강좌 5 면역 생화학 연구법 p.62-65, 카네하라 출판 주식회사 임상 검사법 제요 제30판 p.862-865, 일본 공개특허공보 소56-106154호, 일본 공개특허공보 소58-23796호 등), 고상 효소 면역 측정법 (ELISA)(카네하라 출판 주식회사 임상 검사법 제요 제30판 p.1145-1149 등), 형광·발광 면역 측정법 (카네하라 출판 주식회사 임상 검사법 제요 제30판 p.865-867 등), 플로 사이토메트리법 등의 자체 공지된 면역학적 측정 방법은 모두 들 수 있고, 고상 효소 면역 측정법 (ELISA) 또는 플로 사이토메트리법이 바람직하다.
본 발명의 검출 공정을 고상 효소 면역 측정법 (ELISA 법) 또는 플로 사이토메트리법에 의해 실시하는 경우, 본 발명에 관련된 복합체를 검출 대상으로 하는 한에 있어서, 자체 공지된 방법에 따라 실시하면 된다. 예를 들어, 세포외막소포 또는 바이러스에 대해 결합하는 항세포외막소포 항체, 항바이러스 항체 등의 표지물을 사용하여 1 차 항체를 표지한 표지 1 차 항체, 또는 당해 1 차 항체와 당해 1 차 항체에 대해 결합하는 표지 2 차 항체를 사용하는 방법을 들 수 있다. 당해 표지 1 차 항체 및 표지 2 차 항체로는, ELISA 법 또는 플로 사이토메트리법의 표지 항체에 사용되는 것이면 어느 것이라도 되고, 예를 들어 Cy3, Cy5, FITC, 로다민, PE 등의 형광 물질로 표지한 형광 표지 항체, 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제 등의 효소로 표지한 효소 표지 항체, 자기 비즈 표지 항체, 적외 표지 항체 등을 들 수 있다. 이들 표지 항체에 관련된 형광 등은, 당해 표지 항체의 표지 방법 (표지물) 에 대응하는 자체 공지된 방법에 의해 측정하면 된다.
-표지 항체의 희석액-
본 발명의 검출 방법에 있어서, 본 발명에 관련된 복합체와 반응시키는 표지 1 차 항체, 또는 1 차 항체 및 표지 2 차 항체의 희석액으로는, 칼슘 이온을 함유하는 것 이외에는, Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체와 당해 항체의 결합을 방해하지 않는 것이면 되고, 예를 들어 물, pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액 (예를 들어 TBS, HBS 등) 등을 들 수 있다. 또한, 인산 버퍼는 칼슘과 결합하여 침전이 생기므로 바람직하지 않다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로는, 통상 5 ∼ 50 mM, 바람직하게는 10 ∼ 30 mM 의 범위에서 적절히 선택되고, NaCl 농도는 통상 100 ∼ 200 mM, 바람직하게는 140 ∼ 160 mM 의 범위에서 적절히 선택된다. 이 용액 중에는, 본 발명에 관련된 Tim 담체와 시료 중의 세포외막소포 또는 바이러스의 복합체의 결합을 방해하지 않는 양이면, 예를 들어 당류, NaCl 등의 염류, 계면활성제, 방부제, 단백질 등이 포함되어 있어도 된다. 계면활성제로는, 예를 들어 트윈20 등을 들 수 있고, 당해 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스를 함유시키는 용액에 있어서의 계면활성제의 농도는, 통상 0.00001 ∼ 0.2 ％, 바람직하게는 통상 0.0005 ∼ 0.1 ％ 이다. 또 당해 희석액의 칼슘 이온 함유 농도는 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 통상 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 통상 2 ∼ 5 mM 이다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 본 발명에 관련된 복합체와 반응시키는 표지 1 차 항체, 또는 1 차 항체 및 표지 2 차 항체의 희석 배율은, 항체의 활성이나 농도에 따라 상이하지만, 통상 10 배 ∼ 1000000 배, 바람직하게는 1000 배 ∼ 100000 배이다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 본 발명에 관련된 복합체와 반응시키는 표지 1 차 항체, 또는 1 차 항체 및 표지 2 차 항체 용액의 희석 용액의 양은, 본 발명에 관련된 담체가 비즈인 경우, 본 발명에 관련된 담체 1 ㎎ 에 대해 통상 0.1 ㎖ ∼ 1000 ㎖, 바람직하게는 0.1 ㎖ ∼ 500 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ㎖ ∼ 100 ㎖ 이고, 본 발명에 관련된 담체가 마이크로 플레이트인 경우, 1 웰에, 통상 50 ㎕ ∼ 300 ㎕, 바람직하게는 50 ㎕ ∼ 200 ㎕, 보다 바람직하게는 50 ㎕ ∼ 100 ㎕ 이다.
-반응 (접촉) 온도-
본 발명의 검출 방법에 있어서, 본 발명에 관련된 복합체와 표지 1 차 항체, 또는 1 차 항체 및 표지 2 차 항체의 반응 온도는, 통상 2 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 11 ∼ 337 ℃, 보다 바람직하게는 20 ∼ 30 ℃ 이다.
-반응 (접촉) 시간-
본 발명의 검출 방법에 있어서, 본 발명에 관련된 복합체와 표지 1 차 항체, 또는 1 차 항체 및 표지 2 차 항체의 반응 시간은, 통상 0.5 ∼ 12 시간, 바람직하게는 1 ∼ 4 시간, 보다 바람직하게는 1 ∼ 2 시간이다.
본 발명의 검출 방법에 있어서의 검출 공정의 검출 조작에 있어서, 표지 1 차 항체를 사용하는 경우, 본 발명에 관련된 복합체와 표지 1 차 항체를 반응시킨 후, 세정 조작에 의해 미반응의 표지 1 차 항체를 제거할 수 있다. 또, 1 차 항체와 표지 2 차 항체를 사용하는 경우, 본 발명에 관련된 복합체와 1 차 항체를 반응시킨 후나 본 발명에 관련된 복합체와 1 차 항체의 복합체와 표지 2 차 항체를 반응시킨 후에, 세정 조작에 의해 미반응의 1 차 항체 및 표지 2 차 항체를 제거할 수 있다. 세정 방법으로는, 상기한 바와 같은 칼슘 이온 함유 세정액을 사용하는 것 이외에는, 통상 이 분야에서 실시되고 있는 세정 방법을 사용할 수 있다. 당해 세정 조작에 있어서 사용되는 칼슘 이온 함유 세정 용액으로는, 칼슘 이온을 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 통상 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 통상 2 ∼ 5 mM 함유하고, 당해 복합체에 있어서의 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스와 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명의 담체의 결합에 영향을 주지 않는 용액이면 어떤 것이라도 되고, 예를 들어 칼슘 이온을 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 통상 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 통상 2 ∼ 5 mM 함유하는, pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 칼슘을 침전시키지 않는 완충액 (예를 들어 TBS, HBS) 을 들 수 있다. 또한, 인산 버퍼는 칼슘과 결합하여 침전이 생기므로 바람직하지 않다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로는, 통상 5 ∼ 50 mM, 바람직하게는 10 ∼ 30 mM 의 범위에서 적절히 선택되고, NaCl 농도는 통상 100 ∼ 200 mM, 바람직하게는 140 ∼ 160 mM 의 범위에서 적절히 선택된다. 이 용액 중에는, 당해 복합체에 있어서의 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스와 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명의 담체의 결합을 방해하지 않는 양이면, 예를 들어 당류, NaCl 등의 염류, 계면활성제, 방부제, 단백질 등이 포함되어 있어도 된다. 계면활성제로는, 예를 들어 트윈 20 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 등을 들 수 있고, 당해 세정 용액에 있어서의 계면활성제의 농도는, 통상 0.00001 ∼ 0.2 ％, 바람직하게는 통상 0.0005 ∼ 0.1 ％ 이다. 본 발명에 관련된 담체가 비즈인 경우, 본 발명에 관련된 담체 1 ㎎ 에 대해 통상 0.1 ㎖ ∼ 1000 ㎖, 바람직하게는 0.1 ㎖ ∼ 500 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ㎖ ∼ 100 ㎖ 이고, 본 발명에 관련된 담체가 마이크로 플레이트인 경우, 1 웰에 사용하는 세정액의 양은 통상 100 ㎕ ∼ 300 ㎕, 바람직하게는 200 ㎕ ∼ 300 ㎕ 이고, 첨가한 후에 세정액을 제거한다. 이들 세정 조작은, 필요에 따라 복수회 반복하여 실시해도 된다.
-검출-
본 발명의 검출 방법에 있어서의 검출 공정이 발색 검출인 경우, 표지 1 차 항체 또는 표지 2 차 항체의 표지물로는 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제 등을 들 수 있다. 이들 표지물은 각 표지물에 따른 자체 공지된 방법에 따라 검출을 실시하면 된다.
발색 검출에 있어서의 발색용 기질액으로는, 통상 이 분야에 있어서 사용되는 발색용 기질액이면 어느 것이라도 되고, 예를 들어 표지물로서 퍼옥시다아제를 사용하는 경우, TMB (테트라메틸벤지딘) 용액 또는 OPD (오르토페닐렌디아민) 용액을 들 수 있고, 바람직하게는 TMB 용액을 들 수 있다.
발색 검출에 있어서의 발색용 기질의 양으로는, 본 발명에 관련된 담체가 비즈인 경우, 본 발명에 관련된 담체 1 ㎎ 에 대해 통상 0.1 ㎖ ∼ 1000 ㎖, 바람직하게는 0.1 ㎖ ∼ 500 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ㎖ ∼ 100 ㎖ 이고, 본 발명에 관련된 담체가 마이크로 플레이트인 경우, 1 웰에, 통상 50 ㎕ ∼ 300 ㎕, 바람직하게는 50 ㎕ ∼ 200 ㎕, 보다 바람직하게는 50 ㎕ ∼ 100 ㎕ 이다.
본 발명의 검출 방법에 있어서의 검출 공정이 발색 검출인 경우, 발색용 기질액과의 반응 시간은 통상 5 분간 ∼ 60 분간, 바람직하게는 10 분간 ∼ 40 분간이다.
본 발명의 검출 방법에 있어서의 검출 공정이 발색 검출인 경우, 발색용 기질액과의 반응 온도는 통상 2 ℃ ∼ 37 ℃, 바람직하게는 20 ℃ ∼ 30 ℃ 이다.
본 발명의 검출 방법에 있어서의 검출 공정이 발색 검출인 경우, 발색 반응을 정지시키기 위해 반응 정지액으로서 통상 1 ㏖/ℓ 염산 또는 1 ㏖/ℓ 황산 등의 강산을, 발색 기질액과 등량 더하여, 발색 반응을 정지시킨다.
본 발명의 검출 방법에 있어서의 검출 공정이 형광 검출이고, 표지 1 차 항체 또는 표지 2 차 항체의 표지체에 형광 물질을 사용한 경우, 본 발명에 관련된 복합체와 표지 1 차 항체의 복합체, 또는 본 발명에 관련된 복합체와 1 차 항체 및 표지 2 차 항체의 복합체에 형광 측정액을 첨가하여, 형광을 측정한다. 형광 측정액은 칼슘 이온 함유 형광 측정액을 사용하는 것 이외에는, 통상 이 분야에서 사용할 수 있는 형광 측정액 (이하, 「측정액」이라고 약기하는 경우가 있다) 을 사용할 수 있다. 당해 형광 측정액에 있어서 사용되는 칼슘 이온 함유 측정액으로는, 칼슘 이온을 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 통상 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 통상 2 ∼ 5 mM 함유하고, 당해 복합체에 있어서의 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스와 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명의 담체의 결합에 영향을 주지 않는 용액이면 어떤 것이라도 되고, 예를 들어 칼슘 이온을 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 통상 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 통상 2 ∼ 5 mM 함유하는, pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 칼슘을 침전시키지 않는 완충액 (예를 들어 TBS, HBS) 을 들 수 있다. 또한, 인산 버퍼는 칼슘과 결합하여 침전이 생기므로 바람직하지 않다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로는, 통상 5 ∼ 50 mM, 바람직하게는 10 ∼ 30 mM 의 범위에서 적절히 선택되고, NaCl 농도는 통상 100 ∼ 200 mM, 바람직하게는 140 ∼ 160 mM 의 범위에서 적절히 선택된다. 이 용액 중에는, 당해 복합체에 있어서의 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스와 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명의 담체의 결합을 방해하지 않는 양이면, 예를 들어 당류, NaCl 등의 염류, 계면활성제, 방부제, BSA 등의 단백질 등이 포함되어 있어도 된다. 계면활성제로는, 예를 들어 트윈 20 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 등을 들 수 있고, 당해 세정 용액에 있어서의 계면활성제의 농도는, 통상 0.00001 ∼ 0.2 ％, 바람직하게는 통상 0.0005 ∼ 0.1 ％ 이다. 본 발명의 검출 방법에 사용하는 형광 측정액의 양은, 본 발명의 검출법이 ELISA 법으로, 본 발명에 관련된 담체가 마이크로 플레이트인 경우, 1 웰에 사용하는 측정액의 양은 통상 50 ㎕ ∼ 300 ㎕, 바람직하게는 50 ㎕ ∼ 200 ㎕ 이다. 본 발명에 관련된 검출법이 플로 사이토메트리법이고, 본 발명에 관련된 담체가 비즈인 경우, 본 발명에 관련된 담체 1 ㎎ 에 대해 통상 0.1 ㎖ ∼ 1000 ㎖, 바람직하게는 0.1 ㎖ ∼ 500 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ㎖ ∼ 100 ㎖ 이다.
-본 발명의 검출 방법에 있어서의 검출 공정의 구체예-
예를 들어 본 발명에 관련된 담체로서 마이크로 플레이트를 사용하여 ELISA 법에 의해 실시하는 경우, 복합체 형성 공정, 필요하다면 복합체 분리 공정 후, 또한 필요하다면 세정 조작을 실시한 후, 얻어진 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 고정화한 마이크로 플레이트의 각 웰에 대해, 퍼옥시다아제 표지한 세포외막소포 또는 바이러스에 대한 1 차 항체 또는 미표지의 1 차 항체를 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 통상 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 통상 2 ∼ 5 mM 칼슘 이온을 함유하는 희석액으로 통상 10 배 ∼ 1000000 배, 바람직하게는 1000 배 ∼ 100000 배 희석한 희석 용액을, 1 웰당 통상 50 ㎕ ∼ 300 ㎕, 바람직하게는 50 ㎕ ∼ 200 ㎕, 보다 바람직하게는 50 ㎕ ∼ 100 ㎕ 첨가하고, 통상 2 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 11 ∼ 37 ℃ 에서 0.5 ∼ 12 시간, 바람직하게는 1 ∼ 4 시간 반응시키고, 이어서 칼슘 이온을 함유하는 세정용 버퍼 (칼슘 이온을 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 통상 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 통상 2 ∼ 5 mM 함유하고, 당해 복합체에 있어서의 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스와 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명의 담체의 결합에 영향을 주지 않는 용액) 를 사용하여 각 웰을 세정한다. 미표지의 1 차 항체를 사용하는 경우에는, 또한 퍼옥시다아제 표지한 2 차 항체를 1 차 항체와 동일한 방법으로 반응시킨 후, 칼슘 이온을 함유하는 세정용 버퍼 (칼슘 이온을 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 통상 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 통상 2 ∼ 5 mM 함유하고, 당해 복합체에 있어서의 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스와 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명의 담체의 결합에 영향을 주지 않는 용액) 를 통상 100 ㎕ ∼ 300 ㎕, 바람직하게는 200 ㎕ ∼ 300 ㎕ 로 사용하여 각 웰을 세정한다. 이어서, TMB 용액 또는 OPD 용액 등의 발색용 기질액을 1 웰당 통상 50 ㎕ ∼ 300 ㎕, 바람직하게는 50 ㎕ ∼ 200 ㎕, 보다 바람직하게는 50 ㎕ ∼ 100 ㎕ 각 웰에 첨가하고, 통상 2 ℃ ∼ 37 ℃, 바람직하게는 20 ℃ ∼ 30 ℃ 에서 5 분간 ∼ 60 분간, 바람직하게는 10 분간 ∼ 40 분간 반응시킨다. 그 후, 1 ㏖/ℓ 염산 또는 1 ㏖/ℓ 황산 등의 반응 정지액을 발색 기질액과 등량 더하여, 발색 반응을 정지시키고, 마이크로 플레이트 리더로 흡광도를 측정한다.
예를 들어 본 발명에 관련된 담체로서 비즈를 사용하여 플로 사이토메트리법에 의해 실시하는 경우, 복합체 형성 공정, 필요하다면 복합체 분리 공정 후, 또 필요하다면 세정 조작을 실시한 후, 얻어진 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 고정화한 비즈에 대해, 형광 표지한 1 차 항체 또는 미표지의 1 차 항체를 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 통상 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 통상 2 ∼ 5 mM 칼슘 이온을 함유하는 희석액으로 통상 10 배 ∼ 1000000 배, 바람직하게는 1000 배 ∼ 100000 배 희석한 희석 용액을, 본 발명에 관련된 담체 1 ㎎ 에 대해 통상 0.1 ㎖ ∼ 1000 ㎖, 바람직하게는 0.1 ㎖ ∼ 500 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ㎖ ∼ 100 ㎖ 첨가하고, 통상 2 ∼ 37 ℃, 바람직하게는 11 ∼ 37 ℃ 에서 0.5 ∼ 12 시간, 바람직하게는 1 ∼ 4 시간 반응시키고, 이어서 칼슘 이온을 함유하는 세정용 버퍼 (칼슘 이온을 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 통상 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 통상 2 ∼ 5 mM 함유하고, 당해 복합체에 있어서의 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스와 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명의 담체의 결합에 영향을 주지 않는 용액) 를 사용하여 비즈를 세정한다. 미표지의 1 차 항체를 사용한 경우는, 또한 형광 표지한 2 차 항체를 1 차 항체와 동일한 방법으로 반응시킨 후, 칼슘 이온을 함유하는 세정용 버퍼 (칼슘 이온을 통상 0.5 ∼ 100 mM, 바람직하게는 통상 1 ∼ 10 mM, 보다 바람직하게는 통상 2 ∼ 5 mM 함유하고, 당해 복합체에 있어서의 본 발명에 관련된 세포외막소포 또는 바이러스와 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 본 발명의 담체의 결합에 영향을 주지 않는 용액) 를 사용하여 비즈를 세정한다. 이어서, 본 발명에 관련된 담체 1 ㎎ 에 대해 통상 0.1 ㎖ ∼ 1000 ㎖, 바람직하게는 0.1 ㎖ ∼ 500 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ㎖ ∼ 100 ㎖ 의 형광 측정액을 더하여 비즈를 현탁한 후, 플로 사이토미터로 형광 강도를 측정한다.
항체의 항원에 대한 친화성은 일반적으로 10 nM ∼ 100 pM 레벨의 Kd 로 말해지고 있다ㄴ. 한편, Tim4 단백질과 포스파티딜세린의 결합력은 Kd = 약 2 nM (Nature (Impact Factor : 41.46). 12/2007 ; 450 (7168) : 435-9. DOI : 10.1038/nature06307) 이라고 보고되어 있다. 세포외막소포 또는 바이러스 엔벨로프막의 표면 항원에 대한 항체와 그 표면 항원의 친화성은, 세포외막소포 또는 바이러스 엔벨로프막 표면의 포스파티딜세린과 본 발명의 Tim 단백질 간의 친화성과 동일 정도임에도 불구하고, 항체를 사용하여 세포외막소포 또는 바이러스의 검출 등을 실시하는 종래법에 비해, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 사용하여 세포외막소포 또는 바이러스의 검출 등을 실시하는 본 발명의 검출 방법이 고감도인 것은 뜻밖의 것이었다.
본 발명의 방법에 의해 얻어진 세포외막소포 또는 바이러스는, 그 입자 표면이나 내부에 갖는 단백질이나 microRNA 등의 핵산을 해석하는 것에 사용하는 것이나, 세포외막소포 또는 바이러스의 기능 해석 등의 기초 연구에 사용할 수 있다. 또, 진단약이나 의약품이나 백신 등에 이용할 수도 있다.
＜9. 본 발명의 세포외막소포 또는 바이러스의 포착용 키트＞
본 발명의 세포외막소포 또는 바이러스의 포착용 키트는,
1. 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 포함하여 이루어지는 시약 및 본 발명에 관련된 담체를 포함하여 이루어지는 시약, 또는 2. 본 발명의 Tim 담체를 포함하여 이루어지는 시약을 구성 요소로서 포함하여 이루어진다.
이들 키트는, 또한 상기 칼슘 이온 함유 세정 용액, 단백질 변성제 함유 용액, 및 칼슘 이온 킬레이트제 함유 용액으로부터 선택되는 적어도 1 종을 포함하고 있어도 된다. 각각의 구성 요소의 구체예, 바람직한 양태 등에 대해서는, 상기한 바와 같다.
또, 이들 키트에 포함되는 시약 중에는, 통상 이 분야에서 사용되는 시약 류, 예를 들어 완충제, 증감제, 계면활성제, 방부제 (예를 들어 아지화나트륨, 살리실산, 벤조산 등), 안정화제 (예를 들어 알부민, 글로불린, 수용성 젤라틴, 계면활성제, 당류 등), 부활제, 공존 물질의 영향 회피제, 그 외 이 분야에서 이용되고 있는 것으로, 공존하는 시약과의 안정성을 저해하거나, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 담체, 본 발명에 관련된 담체에 결합한 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 시료 중의 세포외막소포의 반응 또는 결합을 저해하거나 하지 않는 것을 가지고 있어도 된다. 또 이들 시약류 등의 농도 범위 등도, 각각의 시약류가 갖는 효과를 발휘하기 위해서 통상 사용되는 농도 범위 등을 적절히 선택하여 이용하면 된다.
또, 본 발명의 키트에는, 본 발명의 취득 방법, 본 발명의 제거 방법, 본 발명의 검출 방법의 설명서 등을 포함시켜 두어도 된다. 당해 「설명서」란, 당해 방법에 있어서의 특징·원리·조작 순서, 판정 순서 등이 문장 또는 도표 등에 의해 실질적으로 기재되어 있는 당해 키트의 취급 설명서, 첨부 문서, 혹은 팜플렛 (리플릿) 등을 의미한다.
이하에, 실험예, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 전혀 한정되지 않는다.
또한, 본 발명에 관련된 Tim 단백질과 T 세포 면역 글로불린·뮤신 도메인 함유 분자 2 (Tim2) 단백질 (이하, 「Tim2 단백질」이라고 약기하는 경우가 있다) 을 합쳐 「Tim 패밀리 단백질」이라고 약기하는 경우가 있다.
실시예
실험예 1. Fc 태그 융합형 Tim4 단백질의 조제
이하의 방법에 따라, Fc 태그 융합형 Tim4 단백질을 조제하였다.
＜(1) 벡터의 구축·배양＞
먼저, Miyanishi et al. Nature 2007, Vol.450 : 15 에 기재된 방법에 따라, 마우스 유래 Tim4 단백질의 N 말단 1 ∼ 273 아미노산 영역을 코드하는 cDNA (배열 번호 26) 가, pEF-Fc 벡터의 SalI-EcoRV 사이트에 편입된, Fc 태그 융합형 Tim4 단백질 발현용 벡터 (이하, 「pEF-Tim4-Fc」라고 약기하는 경우가 있다) 를 구축하였다.
한편, 293T 세포 (리켄 BRC) 를, 150 ㎜ 세포 배양용 디쉬 25 장으로 10 ％ FBS (바이오 웨스트사 제조) 함유 DMEM (나카라이 테스크 (주) 제조) 20 ㎖ 를 사용하여 각각 1 일간 배양하였다. 그 후, 각각의 디쉬에 대해 10 ％ FBS 함유 DMEM 25 ㎖ 를, FBS 를 포함하지 않는 DMEM 25 ㎖ 로 치환하였다.
그 후, 통상적인 방법에 따라 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine) "MAX" (폴리사이언스사 제조) 를 사용하여, pEF-Tim4-Fc 20 ㎍ 을 293T 세포에 각각 유전자 도입하였다. 유전자 도입 후, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 유전자 도입한 293T 세포를 각각 4 일간 배양하였다.
＜(2) 정제＞
얻어진 유전자 도입한 293T 세포의 배양액을, 각각 원심분리 처리하고 (800 × g, 5 분간), 배양 상청을 각각 회수하고, 풀하였다. 얻어진 배양 상청을, Rapid Flow 0.2 ㎛ 필터 유닛 (서모피셔 사이언티픽사 제조) 을 사용하여 여과 처리를 함으로써, 불순물을 분리하여, 배양 상청 여과액을 얻었다.
이어서, PBS 20 ㎖ 로 세정한 nProtein A Sepharose 4 Fast Flow (GE 헬스케어 재팬사 제조, Protein A 는 Fc 태그에 친화성을 갖는다) 700 ㎕ 를 충전한 폴리프레프 칼럼 (바이오라드사 제조) 에, 얻어진 배양 상청 여과액 500 ㎖ 를 첨가하고, 배양 상청 여과액 중의 Fc 태그 융합형 Tim4 단백질을 nProtein A Sepharose 4 Fast Flow 에 결합시켰다. 그리고, 당해 nProtein A Sepharose 4 Fast Flow 를, 20 ㎖ 의 PBS 로 세정하였다. 그 후, 0.1 M 글리신 염산 완충액 (pH 3.0) 600 ㎕ 를 각각 사용하고, 중화 용액인 1 M 트리스 완충액 (pH 8.0) 100 ㎕ 중에 5 회 용출하여, 600 ㎕ 씩의 5 개의 용출 획분을 얻었다.
얻어진 5 개의 용출 획분에 대해, 각각 280 ㎚ 에 있어서의 흡광도를 측정하고, 단백질의 유무를 판단하였다. 단백질이 포함되는 획분을 하나로 혼합 후, 아미콘 울트라-0.5 ㎖ 10 K 원심식 필터 칼럼 (밀리포어사 제조) 을 사용하여 한외 여과에 의해 농축 후, 동일 칼럼을 사용하여 용매를 PBS 40 ㎕ 로 치환하였다. 그리고, PBS 로 치환한 용출액 중의 단백량을 BCA 법에 의해 정량 후, PBS 를 사용하여 단백질의 농도를 88 ㎍/㎖ 로 조정하고, Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 (「Fc 태그 융합형 mTim4 단백질」이라고 약기하는 경우가 있다) 을 함유하는 PBS 용액 (「Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액」이라고 약기하는 경우가 있다) 을 얻었다.
실험예 2. FLAG 태그 융합형 Tim4 단백질의 조제
이하의 방법에 따라, FLAG 태그 융합형 Tim4 단백질을 조제하였다.
＜(1) 벡터의 구축·배양＞
먼저, FLAG 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 cDNA (마우스 유래 Tim4 단백질의 N 말단 1 ∼ 273 아미노산 영역의 C 말단에 1 × FLAG 를 융합한 아미노산 배열을 코드하는 cDNA, 배열 번호 33 (말단에 종지 코돈 (taa) 및 1 × FLAG 를 코드하는 염기 배열을 포함한다, 단 제한 효소 사이트는 포함하지 않는다), 파스막사 제조) 을, 통상적인 방법에 따라, pCAG-Neo 벡터 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 의 XhoI/BamHI 사이트에 편입하여, FLAG 태그 융합형 Tim4 단백질 발현용 벡터 (이하, 「pCAG-Tim4-FLAG」라고 약기하는 경우가 있다) 를 구축하였다.
한편, 293T 세포 (리켄 BRC) 를, 225 ㎠ 플라스크로 10 ％ FBS (Biosera 사 제조) 함유 DMEM (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 50 ㎖ 를 사용하여, 유전자 도입 시에 세포가 70-90 ％ 컨플루엔트가 되도록 파종하고, 1 일간 배양하였다. 그 후, 통상적인 방법에 따라 리포펙타민2000 (Lipofectamine2000, 서모피셔 사이언티픽사 제조) 을 사용하여, pCAG-Tim4-FLAG 60 ㎍ 을, 1 일간 배양한 293T 세포에 유전자 도입하였다. 유전자 도입 후, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하, 유전자 도입한 293T 세포를 1 일간 배양하였다. 그 후, 배양액을 전체량 제거하고, 유전자 도입한 293T 세포를 PBS 10 ㎖ 로 2 회 세정하고, 배양액을 Opti-MEM (서모피셔 사이언티픽사 제조) 50 ㎖ 로 교환하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 3 일간 배양하였다.
＜(2) 정제＞
3 일간 배양 후의 유전자 도입한 293T 세포의 배양액을, 원심분리 처리하고 (300 × g, 5 분간), 배양 상청을 회수하였다. 회수한 배양 상청을, 추가로 3 회 원심분리 처리 (1 회째 : 300 × g, 3 분간, 2 회째 : 1200 × g, 20 분간, 3 회째 : 10000 × g, 20 분간) 하여, 불순물을 분리한 상청을 얻었다. 얻어진 상청을, 비바스핀 (Vivaspin, 분획 분자량 30000, GE 사 제조) 을 사용하여 한외 여과를 하고 10 배로 농축하여, 배양 상청 농축액을 얻었다. PBS 로 세정한 ANTI-FLAG M2 어피니티 겔 (affinity gel, 시그마사 제조) 500 ㎕ (배양 상청 농축액의 1/10 량) 를, 얻어진 배양 상청 농축액 5 ㎖ 에 더하여 3 시간 전도 혼화하고, 배양 상청 농축액 중의 FLAG 태그 융합형 Tim4 단백질과 ANTI-FLAG M2 어피니티 겔 (affinity gel) 을 반응시켜, FLAG 태그 융합형 Tim4 단백질을 ANTI-FLAG M2 어피니티 겔에 결합시켰다. 이어서, 당해 ANTI-FLAG M2 어피니티 겔 을 PBS 5 ㎕ 로 3 회 세정하였다.
그 후, 200 ㎍/㎖ FLAG 펩티드 용액 (DYKDDDDK 펩티드 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 을 PBS 로 희석한 용액) 250 ㎕ (사용한 ANTI-FLAG M2 affinity gel 의 절반량) 를, 당해 ANTI-FLAG M2 어피니티 겔에 더하여 4 ℃ 에서 30 분간 전도 혼화하고, 원심분리 처리 (4 ℃, 8000 × g, 1 분간) 후, 상청 (용출액) 을 회수하였다. 회수한 상청 (용출액) 중의 FLAG 펩티드를 제거하기 위해서, 당해 상청 (용출액) 에 PBS 20 ㎖ 를 첨가하여 한외 여과하여, 농축액을 얻었다. 얻어진 농축액에 PBS 를 첨가하여, 액량을 500 ㎕ 에 맞춰, FLAG 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 (「FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질」이라고 약기하는 경우가 있다) 을 함유하는 PBS 용액 (「FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액」이라고 약기하는 경우가 있다)(실험예 2) 을 얻었다.
실험예 3. His 태그 융합형 Tim4 단백질의 조제
이하의 방법에 따라, His 태그 융합형 Tim4 단백질을 조제하였다.
＜(1) 벡터의 구축·배양＞
His 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 cDNA (마우스 유래 Tim4 단백질의 N 말단 1 ∼ 273 아미노산 영역의 C 말단에 6 × His 태그를 융합한 아미노산 배열을 코드하는 cDNA, 배열 번호 34 (말단에 종지 코돈 (tga) 및 6 × His 태그를 코드하는 cDNA 를 포함한다)) 를 통상적인 방법에 따라, pCAG-Neo 벡터 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 의 XhoI/BamHI 사이트에 편입하여, His 태그 융합형 Tim4 단백질 발현용 벡터 (이하, 「pCAG-Tim4-His」라고 약기하는 경우가 있다) 를 구축하였다.
한편, 293T 세포 (리켄 BRC) 를, 225 ㎠ 플라스크로 10 ％ FBS (Biosera 사 제조) 함유 DMEM (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 50 ㎖ 를 사용하여 1 일간 배양하였다. 그 후, 통상적인 방법에 따라, 리포펙타민2000 (Lipofectamine2000, 서모피셔 사이언티픽사 제조) 을 사용하여, pCAG-Tim4-His 60 ㎍ 을, 293T 세포에 유전자 도입하였다. 유전자 도입 후, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하, 유전자 도입한 293T 세포를 1 일간 배양하였다. 그 후, 배양액을 전체량 제거하고, 유전자 도입한 293T 세포를 PBS 10 ㎖ 로 2 회 세정하고, 배양액을 Opti-MEM (서모피셔 사이언티픽사 제조) 50 ㎖ 로 교환하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 3 일간 배양하였다.
＜(2) 정제＞
3 일간 배양 후의 유전자 도입한 293T 세포의 배양액을, 원심분리 처리하고 (300 × g, 5 분간), 배양 상청을 회수하였다. 회수한 배양 상청을, 추가로 3 회 원심분리 처리 (1 회째 : 300 × g, 3 분간, 2 회째 : 1200 × g, 20 분간, 3 회째 : 10000 × g, 20 분간) 하여, 불순물을 분리한 상청을 얻었다. 얻어진 상청을, Vivaspin (분획 분자량 30000, GE 사 제조) 을 사용하여 한외 여과를 하고 10 배로 농축하여, 배양 상청 농축액을 얻었다.
Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE 사 제조) 2.7 ㎖ 를 Ni Sepharose 6 Fast Flow 에 첨부의 프로토콜에 따라 조제하고, 칼럼으로 옮겼다. 유속 약 1 ㎖/min 으로 OD 280 ㎚ 를 측정하면서, 칼럼에 결합 버퍼 (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 20 mM 이미다졸) 를 OD 280 ㎚ 의 흡광도가 안정될 때까지 첨가하였다. 얻어진 배양 상청 농축액 5 ㎖ 를 칼럼에 첨가한 후, 결합 버퍼를 흡광도가 안정될 때까지 충분히 첨가하고 세정하였다. 이어서, 용출 버퍼 (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 300 mM 이미다졸) 를 칼럼에 첨가하고, 1 ㎖ 씩 용출 획분을 10 획분 회수하였다.
＜(3) 전기 영동·은 염색＞
각 용출 획분을 15 ㎕ 씩 분취하고, 4 × 시료용 완충액 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 5 ㎕ 와 각각 혼합하고, 98 ℃ 에서 5 분간 가열하여 전기 영동용의 시료 20 ㎕ 를 각각 얻었다. 슈퍼 셉 에이스 5-20 ％ 겔 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 에 당해 전기 영동용의 시료 15 ㎕ 를 각각 얹고, 25 mA 로 65 분간 전기 영동하였다.
은 염색 II 키트 와코 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 로 겔을 염색하고, 목적 단백질이 포함되어 있던 5 개의 획분을 선택하여 풀한 (하나에 모은) 후, 용출액 중에 포함되는 이미다졸을 제거하기 위해, PBS 를 20 ㎖ 더하여 비바스핀 (Vivaspin, 분획 분자량 30000, GE 사 제조) 을 사용하여 한외 여과하여, 농축액을 얻었다. 얻어진 농축액에 PBS 를 첨가하여, 액량을 500 ㎕ 에 맞춰, His 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 (「His 태그 융합형 mTim4 단백질」이라고 약기하는 경우가 있다) 을 함유하는 PBS 용액 (「His 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액」이라고 약기하는 경우가 있다) 을 얻었다.
실시예 1-8. 본 발명의 Tim4 담체를 사용한 세포외막소포의 취득 (본 발명의 취득 방법)
이하와 같이 본 발명의 Tim4 담체를 조제하고, 이것을 사용하여 본 발명에 관련된 세포외막소포의 취득을 실시하였다.
＜(1) 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플의 조제＞
세포외막소포를 분비하는 인간 만성 골수성 백혈병주 K562 세포 1 × 107 세포를 80 ㎖ 의 X-VIVO15 배지 (Lonza 사 제조) 를 사용하여 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 3 일간 배양한 후, 원심분리 처리 (300 × g, 5 분간) 하여 세포를 침전시키고, 상청을 제거하였다. 침전한 세포를, 10 μM 모넨신 나트륨 (MP Biomedicals 사 제조) 함유 X-VIVO15 배지 60 ㎖ 로 현탁 후, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 24 시간 배양하였다.
그 후, 배양액을 원심분리 처리 (300 × g, 5 분간) 하고, 배양 상청을 회수하였다. 회수한 배양 상청 60 ㎖ 를 추가로 3 회 원심분리 처리 (1 회째 : 300 × g, 3 분간, 2 회째 : 1200 × g, 20 분간, 3 회째 : 10000 × g, 20 분간) 하여 불순물을 분리하고, 상청을 얻었다. 얻어진 상청에 대해, 비바스핀 (Vivaspin, 분획 분자량 30000, GE 사 제조) 을 사용하여 6 ㎖ 이하가 될 때까지 한외 여과를 실시하여, 농축액을 얻었다. 얻어진 농축액에 10 μM 모넨신 나트륨 (MP Biomedicals 사 제조) 함유 X-VIVO15 배지를 첨가하여 액량을 6 ㎖ 에 맞추고, 10 배로 농축한 K562 세포 배양 농축액 샘플 (이하, 「배양 상청 샘플」이라고 약기하는 경우가 있다) 을 얻었다.
또, 얻어진 배양 상청 샘플에 종농도가 2 mM 이 되도록 CaCl2 를 첨가하여, 2 mM CaCl2 함유 K562 세포 배양 상청 농축액 샘플 (이하, 「칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플」이라고 약기하는 경우가 있다) 을 얻었다.
＜(2) Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질의 비오틴 표지＞
실험예 1 과 동일한 방법에 의해 조제한 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 114 ㎕ (Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 10 ㎍ 함유) 를, 비오틴 표지용 키트-NH2 (도진 화학 연구소 제조) 를 사용하여, 당해 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질의 NH2 기를 비오틴 표지하여, NH2 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 (「NH2 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질」이라고 약기하는 경우가 있다) 3.8 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 100 ㎕ (「NH2 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액」이라고 약기하는 경우가 있다) 를 얻었다.
또, 실험예 1 과 동일한 방법에 의해 조제한 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 114 ㎕ (Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 10 ㎍ 함유) 를, 비오틴 표지용 키트-SH (도진 화학 연구소 제조) 를 사용하여, 당해 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질의 SH 기를 비오틴 표지하여, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 (「SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질」이라고 약기하는 경우가 있다) 5.9 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 100 ㎕ (「SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액」이라고 약기하는 경우가 있다) 를 얻었다.
＜(3) Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 함유 PBS 용액의 희석＞
실험예 1 과 동일한 방법에 의해 조제한 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 11.4 ㎕ 를, PBS 188.6 ㎕ 와 혼합하여, 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
상기에서 조제한 NH2 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 26.3 ㎕ (NH2 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유) 와 PBS 173.7 ㎕ 를 혼합하여, NH2 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
또, 상기에서 조제한 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 16.9 ㎕ (SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유) 와 PBS 183.1 ㎕ 를 혼합하여, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
＜(4) 비즈의 세정＞
30 ㎍/ℓ Dynabeads Protein G 함유 PBS-T 용액 (서모피셔 사이언티픽사 제조) 20 ㎕ (Dynabeads Protein G 0.6 ㎎ 함유) 를, 3 개의 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 에 각각 분주하였다. 이어서, PBS 500 ㎕ 를 1.5 ㎖ 튜브에 각각 더하고, 교반한 후, 1.5 ㎖ 튜브를 각각 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 Dynabeads Protein G 를 집합시키고, 1.5 ㎖ 튜브 내의 용액을 피펫으로 버렸다 (이하, 「세정 조작」이라고 약기하는 경우가 있다).
또, 10 ㎍/㎕ Dynabeads M-270 스트렙타아비딘 (Streptavidin) C1 (서모피셔 사이언티픽사 제조) 함유 PBS 용액 60 ㎕ (Dynabeads M-270 스트렙타아비딘 C1 0.6 ㎎ 함유) 를, 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 에 분주하고, PBS 500 ㎕ 를 사용하여 상기와 동일하게 세정 조작을 실시하였다.
＜(5) Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질의 비즈에의 고정＞
3 개의 Dynabeads Protein G (0.6 ㎎) 함유 1.5 ㎖ 튜브 중, 1 개에 대해서는, 상기에서 조제한 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 전체량 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켜, 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질이 결합한 담체 (mTim4 담체) 를 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
나머지 2 개의 Dynabeads Protein G (0.6 ㎎) 함유 1.5 ㎖ 튜브 중, 1 개에 대해서는, 상기에서 조제한 NH2 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 전체량 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켜, NH2 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질이 결합한 담체 (mTim4 담체) 를 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
또, 1 개에 대해서는, 상기에서 조제한 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 1 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 전체량 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켜, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질이 결합한 담체 (mTim4 담체) 를 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
1 개의 Dynabeads M-270 스트렙타아비딘 C1 함유 1.5 ㎖ 튜브에 대해서는, 상기와 동일한 방법에 의해 조제한 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 1 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켜, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질이 결합한 담체 (mTim4 담체) 를 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
이상에 의해, 하기 표 1 에 나타내는 4 종류의 mTim4 담체를 각각 0.6 ㎎ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
＜(6) 본 발명의 취득 방법에 의한 세포외막소포의 취득＞
상기에서 얻어진 표 1 에 기재된 4 종류의 mTim4 담체 0.6 ㎎ 을 PBS 500 ㎕ 로 각각 3 회 세정 조작한 후, 펠릿 상태의 각각의 mTim4 담체에, 상기 (1) 에서 조제한 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플 200 ㎕ 를 첨가하고, 8 ℃ 에서 3 시간 반응시켰다.
반응 후의 mTim4 담체를, 2 mM CaCl2 함유 TBS-T (Tris 버퍼, 0.05 ％ 트윈20, 2 mM CaCl2) 500 ㎕ 로 각각 3 회 세정 조작하였다. 3 회째의 세정 조작 시에, 4 종류의 mTim4 담체를 각각 250 ㎕ 씩 1.5 ㎖ 튜브 2 개에 분주하였다.
펠릿 상태의 4 종류의 mTim4 담체 각 0.3 ㎎ 에 용출액으로서 1 ％ SDS 수용액 또는 1 mM EDTA 수용액을 20 ㎕ 첨가한 후, 볼텍스 믹서에 의해 실온에서 10 초간 혼합하고, 스핀 다운하였다. 1.5 ㎖ 튜브를 각각 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 mTim4 담체를 집합시키고, 상청 (용출액) 을 회수하였다.
또한, 각 실시예에서 사용한 mTim4 단백질 및 담체의 종류, mTim4 담체로부터 세포외막소포를 취득하기 위해서 사용한 용출액의 종류, 그리고 후술하는 웨스턴 블롯팅에 있어서의 레인 번호를 하기 표 2 에 나타낸다.
＜(7) 웨스턴 블롯팅＞
실시예 1-8 에서 얻어진 각 상청 (용출액) 7.5 ㎕ 에 4 × 시료용 완충액 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 2.5 ㎕ 를 더하여 98 ℃ 에서 5 분간 가열하여, 웨스턴 블롯팅용의 각 시료를 얻었다. 슈퍼 셉 에이스 5-20 ％ 겔 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 에 당해 웨스턴 블롯팅용의 각 시료 10 ㎕ 를 얹고, 25 mA 로 65 분간 전기 영동하였다. 얻어진 영동겔을, 세미드라이 블로터와 불연속 버퍼 (애노드 버퍼 (Anode Buffer) 1 : 0.3 M Tris/20 ％ 메탄올, 애노드 버퍼 2 : 0.025 M Tris/20 ％ 메탄올, 캐소드 버퍼 (Cathode buffer) : 0.025 M Tris/0.04 M 아미노카프로산/20 ％ 메탄올) 를 사용하여, PVDF 막 (Millipore 사 제조) 에 1 mA/㎠ 로 60 분간 전사하였다.
PVDF 막에 PBS-T (PBS 버퍼, 0.1 ％ 트윈20) 로 희석한 3 ％ 스킴 밀크를 더하여 1 시간 실온에서 반응시켜 블로킹하고, PBS-T 로 250 배 희석한 항인간 Lamp-1 마우스 모노클로날 항체 (BD Biosciences 사 제조, 이하 「항인간 Lamp-1 항체」라고 약기하는 경우가 있다) 2 ㎖ 를 8 ℃ 에서 하룻밤 반응시켰다.
그 후, 반응 후의 PVDF 막을 PBS-T 로 3 회 세정하고, PBS-T 로 10000 배 희석한 2 차 항체 {항마우스 IgG (H ＋ L), 토끼, IgG 분획, 퍼옥시다아제 결합 항체}(와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 를 실온에서 1 시간 반응시켰다. PBS-T 로 5 회 세정 후, 이뮤노스타제타 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 를 첨가하고, LAS-4000 (GE 사 제조) 을 사용하여 발광 시그널을 검출하였다. 또한, 항인간 Lamp-1 항체는, 엑소좀의 마커 단백질의 하나인 Lamp-1 에 대한 항체이다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 1 에 나타낸다. 도 1 에 있어서, 각 레인은 이하와 같다.
레인 1 : 실시예 1 의 결과 (비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 Protein G 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 2 : 실시예 2 의 결과 (비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 Protein G 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 3 : 실시예 3 의 결과 (NH2 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 Protein G 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 4 : 실시예 4 의 결과 (NH2 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 Protein G 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 5 : 실시예 5 의 결과 (SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 ProteinG 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 6 : 실시예 6 의 결과 (SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 Protein G 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 7 : 실시예 7 의 결과 (SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 스트렙트아비딘 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 8 : 실시예 8 의 결과 (SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질을 스트렙트아비딘 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과).
도 1 로부터, 실시예 1-8 의 어느 경우에 있어서도, 100 kDa 부근에 엑소좀 마커인 Lamp-1 의 밴드가 얻어졌던 점에서, 본 발명의 취득 방법에 의하면, 엑소좀을 포함하는 세포외막소포를 취득 가능한 것을 알 수 있었다 (실시예 1-8 : 레인 1-8).
특히, 실시예 2, 4, 6, 8 의 비교로부터, 용출액으로서 칼슘 이온 킬레이트제를 사용한 경우에는, Tim4 단백질과 담체가, Tim4 단백질의 SH 기를 개재하여 결합하고 있는 것이 (실시예 8 : 레인 8), NH2 기를 개재하여 결합하고 있는 것 (실시예 4 : 레인 4) 이나 어피니티 태그를 개재하여 결합하고 있는 것 (실시예 2 : 레인 2, 실시예 6 : 레인 6) 에 비해, 많은 세포외막소포를 취득 가능한 것을 알 수 있었다 (실시예 2 : 레인 2, 실시예 4 : 레인 4, 실시예 6 : 레인 6, 실시예 8 : 레인 8).
실시예 9-16. 본 발명의 Tim4 담체를 사용한 세포외막소포의 취득 (본 발명의 취득 방법)
이하와 같이 본 발명의 Tim4 담체를 조제하고, 이것을 사용하여 본 발명에 관련된 세포외막소포의 취득을 실시하였다.
＜(1) 배양 상청 샘플의 조제＞
실시예 1-8 의 「(1) 배양 상청 샘플의 조제」와 동일한 방법에 의해 실시하였다.
＜(2) Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질의 비오틴 표지＞
실험예 1 「(2) Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질의 비오틴 표지」와 동일한 방법에 의해 조제한 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 114 ㎕ (Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 10 ㎍ 함유) 에 대해, 실시예 1 과 동일한 방법에 의해, Fc 태그 융합형 mTim4 단백질의 SH 기를 비오틴 표지하고, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 3.9 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 100 ㎕ (이하, 「SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액」이라고 약기하는 경우가 있다) 를 얻었다.
＜(3) FLAG 태그 융합 마우스 유래 Tim4 단백질의 비오틴 표지＞
실험예 2 와 동일한 방법에 의해 조제한 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 99 ㎕ (FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질 10 ㎍ 함유) 를, 비오틴 표지용 키트-SH ((주) 도진 화학 연구소 제조) 를 사용하여, 당해 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질의 SH 기를 비오틴 표지하여, SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질 4.6 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 (이하, 「SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질 함유하는 PBS 용액」이라고 약기하는 경우가 있다) 100 ㎕ 를 얻었다.
＜(4) His 태그 융합 마우스 유래 Tim4 단백질의 비오틴 표지＞
실험예 3 과 동일한 방법에 의해 조제한 His 태그 융합 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 54 ㎕ (His 태그 융합형 mTim4 단백질 10 ㎍ 함유) 를, 비오틴 표지용 키트-SH ((주) 도진 화학 연구소 제조) 를 사용하여, 당해 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 His 태그 융합형 mTim4 단백질의 SH 기를 비오틴 표지하여, SH 기 비오틴 표지 His 태그 융합형 mTim4 단백질 7.2 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 (이하, 「SH 기 비오틴 표지 His 태그 융합형 mTim4 단백질 함유하는 PBS 용액」이라고 약기하는 경우가 있다) 100 ㎕ 를 얻었다.
＜(5) 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질의 희석＞
실험예 1 과 동일한 방법에 의해 조제한 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 11.4 ㎕ (Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 1 ㎍ 함유) 를, PBS 188.6 ㎕ 와 혼합하여, 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
상기 (2) 에서 조제한 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 16.9 ㎕ (SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 1 ㎍ 을 함유한다) 와 PBS 183.1 ㎕ 를 혼합하여, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 1 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
또, 상기 (3) 에서 조제한 SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 21.6 ㎕ (SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질 1 ㎍ 함유) 와 PBS 178.4 ㎕ 를 혼합하여, SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
상기 (4) 에서 조제한 SH 기 비오틴 표지 His 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 13.9 ㎕ (SH 기 비오틴 표지 His 태그 융합형 mTim4 단백질 1 ㎍ 함유) 와 PBS 186.1 ㎕ 를 혼합하여, SH 기 비오틴 표지 His 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
＜(6) 비즈의 세정＞
30 ㎍/㎕ Dynabeads Protein G 함유 PBS-T 용액 (서모피셔 사이언티픽사 제조) 20 ㎕ (Dynabeads Protein G 0.6 ㎎ 함유) 를, 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 1 개에 분주하고, PBS 500 ㎕ 를 사용하여, 실시예 1-8 의 「(4) 비즈의 세정」과 동일한 방법에 의해 세정 조작을 실시하였다.
또, 10 ㎍/㎕ Dynabeads M-270 Streptavidin (서모피셔 사이언티픽사 제조) 함유 PBS 용액 60 ㎕ (Dynabeads M-270 Streptavidin 0.6 ㎎ 함유) 를, 3 개의 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 에 각각 분주하고, PBS 500 ㎕ 를 사용하여 실시예 1-8 의 「(4) 비즈의 세정」과 동일한 방법에 의해 각각 세정 조작을 실시하였다.
＜(7) 태그 융합 마우스 유래 Tim4 단백질의 비즈에의 고정＞
이어서, 세정 조작 후의 펠릿 상태의 Dynabeads Protein G 0.6 ㎎ 을 함유하는 1.5 ㎖ 튜브에, 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 전체량 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켜, 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질이 결합한 담체 (mTim4 담체) 를 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
또한, 세정 조작 후의 펠릿 상태의 Dynabeads M-270 Streptavidin 0.6 ㎎ 을 함유하는 1.5 ㎖ 튜브 3 개 중, 1 개에 대해서는, 상기에서 조제한 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 전체량 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켜, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질이 결합한 담체 (mTim4 담체) 를 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
나머지 2 개의 세정 조작 후의 펠릿 상태의 Dynabeads M-270 Streptavidin 0.6 ㎎ 을 함유하는 1.5 ㎖ 튜브 중, 1 개에 대해서는, 상기에서 조제한 SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 전체량 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켜, SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질이 결합한 담체 (mTim4 담체) 를 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
또, 1 개에 대해서는, 상기에서 조제한 SH 기 비오틴 표지 His 태그 융합형 mTim4 단백질 1 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 전체량 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켜, SH 기 비오틴 표지 His 태그 융합형 mTim4 단백질이 결합한 담체 (mTim4 담체) 를 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
이상에 의해, 하기 표 3 에 나타내는 4 종류의 mTim4 담체를 각각 0.6 ㎎ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
＜(8) 본 발명의 취득 방법에 따른 세포외막소포의 취득＞
「표 1 에 기재된 4 종류의 mTim4 담체 0.6 ㎎」 대신에 「표 3 에 기재된 4 종류의 mTim4 담체 0.6 ㎎」를 사용한 것 이외에는, 실시예 1-8 의 「(6) 본 발명의 취득 방법에 의한 세포외막소포의 취득」과 동일한 방법에 의해 실시하여 각 상청 (용출액) 을 얻었다. 또한, 각 실시예에서 사용한 mTim4 단백질 및 담체의 종류, mTim4 담체로부터 세포외막소포를 취득하기 위해서 사용한 용출액의 종류, 그리고 후술하는 웨스턴 블롯팅에 있어서의 레인 번호를 하기 표 4 에 나타낸다.
＜(7) 웨스턴 블롯팅＞
「실시예 1-8 에서 얻어진 각 상청 (용출액) 7.5 ㎕」 대신에 「실시예 9-16 (상기 (8)) 에서 얻어진 각 상청 (용출액) 7.5 ㎕」를 사용한 것 이외에는, 실시예 1-8 의 「(7) 웨스턴 블롯팅」과 동일한 방법에 의해 실시하였다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 2 에 나타낸다. 도 2 에 있어서, 각 레인은 이하와 같다.
레인 1 : 실시예 9 의 결과 (비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 Protein G 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 2 : 실시예 10 의 결과 (비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 Protein G 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 3 : 실시예 11 의 결과 (SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 스트렙트아비딘 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 4 : 실시예 12 의 결과 (SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 스트렙트아비딘 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 5 : 실시예 13 의 결과 (SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질을 스트렙트아비딘 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 6 : 실시예 14 의 결과 (SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질을 스트렙트아비딘 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 7 : 실시예 15 의 결과 (SH 기 비오틴 표지 His 태그 융합형 mTim4 단백질을 스트렙트아비딘 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 8 : 실시예 16 의 결과 (SH 기 비오틴 표지 His 태그 융합형 mTim4 단백질을 스트렙트아비딘 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과) 를 각각 나타낸다.
도 2 로부터, 실시예 9-16 의 어느 경우에 있어서도, 100 kDa 부근에 엑소좀의 마커 단백질인 Lamp-1 의 밴드가 얻어진 점에서, 본 발명의 취득 방법에 의하면, 엑소좀을 포함하는 세포외막소포를 취득 가능하다는 것을 알 수 있었다 (실시예 9-16 : 레인 1-8).
또, 본 발명의 Tim4 담체를 사용하면, 태그의 종류나 길이, 유무에 관계없이 세포외막소포를 취득 가능하다는 것을 알 수 있었다 (실시예 9-16 : 레인 1-8).
실시예 10, 12, 14, 16 의 비교로부터, 용출액으로서 칼슘 이온 킬레이트제인 EDTA 를 사용하는 경우에는, Tim4 단백질과 담체가, Tim4 단백질의 SH 기를 개재하여 결합하고 있는 것이 (실시예 12 : 레인 4, 실시예 14 : 레인 6, 실시예 16 : 레인 8), 어피니티 태그를 개재하여 결합하고 있는 것 (실시예 10 : 레인 2) 에 비해, 많은 세포외막소포를 취득 가능한 것을 알 수 있었다.
실시예 17-18. 본 발명의 Tim4 담체를 사용한 세포외막소포의 취득 (본 발명의 취득 방법)
이하와 같이 본 발명의 Tim4 담체를 조제하고, 이것을 사용하여 본 발명에 관련된 세포외막소포의 취득을 실시하였다.
＜(1) 배양 상청 샘플의 조제＞
실시예 1-8 의 「(1) 배양 상청 샘플의 조제」와 동일한 방법에 의해 실시하였다.
＜(2) 비오틴 비표지 FLAG 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질의 희석＞
실험예 2 와 동일한 방법에 의해 조제한 비오틴 비표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질 5 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 47 ㎕ (비오틴 비표지 FLAG 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 함유 PBS 용액) 를, PBS 153 ㎕ 와 혼합하여, 비오틴 비표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질을 5 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
＜(3) 비즈의 세정＞
10 ㎍/㎕ 항DYKDDDDK 태그 항체 자기 비즈 함유 50 ％ 글리세롤 TBS 용액 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 50 ㎕ (항DYKDDDDK 태그 항체 자기 비즈 0.5 ㎎ 함유) 를, 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 에 분주하고, PBS 500 ㎕ 를 사용하여 세정 조작을 실시하였다.
＜(4) FLAG 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질의 담체에의 고정＞
이어서, 세정 조작 후의 펠릿 상태의 항DYKDDDDK 태그 항체 자기 비즈에, FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질을 5 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 의 전체량을 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켜, mTim4 담체를 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
이상에 의해, 하기 표 5 에 나타내는 mTim4 담체를 0.5 ㎎ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
＜(5) 본 발명의 취득 방법에 의한 세포외막소포의 취득＞
「표 1 에 기재된 4 종류의 mTim4 담체 0.6 ㎎」 대신에 「표 5 에 기재된 mTim4 담체 0.5 ㎎」을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-8 의 「(6) 본 발명의 취득 방법에 의한 세포외막소포의 취득」과 동일한 방법을 실시하여, 각 상청 (용출액) 을 얻었다.
또한, 각 실시예에서 사용한 mTim4 단백질 및 담체의 종류, mTim4 담체로부터 세포외막소포를 취득하기 위해서 사용한 용출액의 종류, 그리고 후술하는 웨스턴 블롯팅에 있어서의 레인 번호를 하기 표 6 에 나타낸다.
＜(6) 웨스턴 블롯팅＞
「실시예 1-8 에서 얻어진 각 상청 (용출액) 7.5 ㎕」 대신에 「실시예 17-18 (상기 (5)) 에서 얻어진 각 상청 (용출액) 7.5 ㎕」를 사용한 것 이외에는, 실시예 1-8 의 「(7) 웨스턴 블롯팅」과 동일한 방법으로 실시하였다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 3 에 나타낸다. 도 3 에 있어서, 각 레인은 이하와 같다.
레인 1 : 실시예 17 의 결과 (비오틴 비표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질을 항DYKDDDDK 태그 항체 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 2 : 실시예 18 의 결과 (비오틴 비표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질을 항DYKDDDDK 태그 항체 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
도 3 으로부터, 실시예 17-18 의 어느 경우에 있어서도, 100 kDa 부근에 엑소좀 마커인 Lamp-1 의 밴드가 보인 점에서, 본 발명의 취득 방법에 의하면, 항태그 항체를 개재하여 Tim4 단백질을 고정화한 담체를 사용해도 엑소좀을 포함하는 세포외막소포를 취득 가능하다는 것을 알 수 있었다 (실시예 17-18 : 레인 1-2).
실시예 19-20·비교예 1-3 본 발명의 취득 방법과 종래법에 의해 얻어지는 세포외막소포의 순도의 비교
이하와 같이, SDS 용출에 의한 본 발명의 취득 방법 (실시예 19), EDTA 용출에 의한 본 발명의 취득 방법 (실시예 20), 초원심분리법 (비교예 1), Exo Quick (비교예 2), 및 Total Exosome Isolation (비교예 3) 에 의해 각각 얻어지는 세포외막소포의 순도의 비교를 실시하였다.
＜본 발명의 취득 방법에 의한 세포외막소포의 취득 (실시예 19-20)＞
「칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플 200 ㎕」 대신에, 「칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플 500 ㎕」를 사용하고, 또 용출액으로서 「1 ％ SDS 수용액 20 ㎕」 대신에 「1 ％ SDS 수용액 50 ㎕」, 「1 mM EDTA 수용액 20 ㎕」 대신에 「1 mM EDTA 수용액 50 ㎕」를 사용한 것 이외에는, 실시예 13-14 와 동일한 방법에 의해, SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질을 Dynabeads M-270 Streptavidin C1 (서모피셔 사이언티픽사 제조) 에 결합시킨 mTim4 단백질과 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플 중의 세포외막소포를 반응시키고, 용출액으로서 1 ％ SDS 수용액 및 1 mM EDTA 수용액으로 세포외막소포를 각각 용출시켜, 상청 (용출액) 을 각각 얻었다.
얻어진 상청 (용출액) 을, 각각 샘플 1 (1 ％ SDS 수용액으로 용출시킨 경우), 샘플 2 (1 mM EDTA 수용액으로 용출시킨 경우) 로 하였다.
또한, 실시예 19-20 에서 사용한 mTim4 단백질 및 담체의 종류, 그리고 mTim4 담체로부터 세포외막소포를 취득하기 위해서 사용한 용출액의 종류를 하기 표 7 에 나타낸다.
＜초원심분리법에 의한 세포외막소포의 취득 (비교예 1)＞
실시예 1 과 동일한 방법에 의해 조제한 배양 상청 샘플 1 ㎖ 를 원심분리 처리 (20000 × g, 30 분간) 하여 불순물을 분리하고, 상청을 얻었다. 이어서, 얻어진 상청 1 ㎖ 를 초원심분리 처리 (110000 × g, 70 분간) 하고, 침전 획분을 얻었다. 그 후, 얻어진 침전 획분을 1 ㎖ PBS 로 현탁하였다. 침전 획분의 현탁액을, 재차 초원심분리 처리 (110000 × g, 70 분간) 를 실시한 후, 얻어진 침전 획분을 PBS 50 ㎕ 에 현탁하였다. 얻어진 현탁액을 샘플 3 으로 하였다 (비교예 1).
＜시판되는 시약을 사용한 원심분리법에 의한 세포외막소포의 취득 (ExoQuick 에 의한 세포외막소포의 취득)(비교예 2)＞
실시예 1 과 동일한 방법에 의해 조제한 배양 상청 샘플 1 ㎖ 를 원심분리 처리 (20000 × g, 30 분간) 하여 불순물을 분리하고, 상청을 얻었다. 이어서, 얻어진 상청 1 ㎖ 를 ExoQuick-TC Reagent (System Biosciences 사) 0.2 ㎖ 와 혼합하고, 8 ℃ 에서 당해 혼합액을 종야 정치하였다. 그 후, 종야 정치한 당해 혼합 액을 원심분리 처리 (1500 × g, 30 분간) 함으로써 얻어진 침전 획분을 PBS 100 ㎕ 에 현탁하였다. 얻어진 현탁액을 샘플 4 로 하였다 (비교예 2).
＜시판되는 시약을 사용한 원심분리법에 의한 세포외막소포의 취득 (Total Exosome Isolation 에 의한 세포외막소포의 취득)(비교예 3)＞
실시예 1 과 동일한 방법에 의해 조제한 K562 세포 배양 상청 농축액 샘플 1 ㎖ 를 원심분리 처리 (20000 × g, 30 분간) 하여 불순물을 분리하고, 상청을 얻었다. 이어서, 얻어진 상청 1 ㎖ 를 Total Exosome Isolation Reagent (서모피셔 사이언티픽사 제조) 0.5 ㎖ 와 혼합하고, 8 ℃ 에서 1 일간 정치하였다. 당해 혼합액을 원심분리 처리 (10000 × g, 1 시간) 함으로써 얻어진 침전 획분을 PBS 100 ㎕ 에 현탁하였다. 얻어진 현탁액을 샘플 5 로 하였다 (비교예 3).
또한, 각 실시예 및 비교예에서 사용한 방법, 얻어진 샘플 그리고 후술하는 웨스턴 블롯팅 및 은 염색에 있어서의 레인 번호에 대해 하기 표 8 에 나타낸다.
＜웨스턴 블롯팅＞
각 방법에 의해 얻어진 샘플 1-5 중의 단백질량을 BCA 법으로 측정하고, 측정 결과를 기초로, 단백질량을 각각 전기 영동의 기준량으로 하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 즉, 샘플 1-5 중의 각 단백질 0.25 ㎍ 을 포함하는 PBS 용액 37.5 ㎕ 와 4 × 시료용 완충액 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 12.5 ㎕ 를 각각 혼합 후, 98 ℃ 에서 5 분간 가열하여, 웨스턴 블롯팅용의 각 시료 50 ㎕ 를 각각 얻었다.
이어서, 슈퍼 셉 에이스 5-20 ％ 겔 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 에, 얻어진 웨스턴 블롯팅용의 각 시료 각 20 ㎕ 씩을 2 장의 겔에 얹고, 25 mA 로 60 분간 전기 영동하였다. 얻어진 2 장의 겔 중 1 장을, 세미드라이 블로터와 불연속 버퍼 (애노드 버퍼 1 : 0.3 M Tris/20 ％ 메탄올, 애노드 버퍼 2 : 0.025 M Tris/20 ％ 메탄올, 캐소드 버퍼 : 0.025 M Tris/0.04 M 아미노카프로산/20 ％ 메탄올) 를 사용하여, PVDF 막 (Millipore 사 제조) 에 1 mA/㎠ 로 60 분간 전사하였다. PVDF 막에 PBS-T 로 희석한 3 ％ 스킴 밀크를 더하여 1 시간 실온에서 반응시켜 블로킹하고, PBS-T 로 250 배 희석한 항인간 Lamp-1 마우스 모노클로날 항체 (BD Biosciences 사 제조) 2 ㎖ 를 실온에서 1 시간 반응시켰다. PBS-T 로 3 회 세정 후, PBS-T 로 10000 배 희석한 2 차 항체 {항마우스 IgG (H ＋ L), 토끼, IgG 분획, 퍼옥시다아제 결합 항체 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조)} 를 실온에서 1 시간 반응시켰다. PBS-T 로 5 회 세정 후, ECL prime (GE 사 제조) 을 첨가하고, LAS-4000 (GE 사 제조) 을 사용하여 발광 시그널을 각각 검출하였다.
또, 다른 1 장의 겔을, 은 염색 II 키트 와코 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 를 사용하여 은 염색하였다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 4-A, 은 염색의 결과를 도 4-B 에 각각 나타낸다. 도 4-A 및 도 4-B 에 있어서, 각 레인은 이하와 같다.
레인 1 : 실시예 19 의 결과 (SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질을 스트렙트아비딘 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용하여 본 발명의 취득 방법을 실시한 경우의 결과)
레인 2 : 실시예 20 의 결과 (SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질을 스트렙트아비딘 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 용액을 용출액으로서 사용하여 본 발명의 취득 방법을 실시한 경우의 결과)
레인 3 : 비교예 1 의 결과 (초원심분리법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우의 결과)
레인 4 : 비교예 2 의 결과 (ExoQuick 에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우의 결과)
레인 5 : 는 비교예 3 의 결과 (Total Exosome Isolation 에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우의 결과)
도 4-A 로부터, 본 발명의 취득 방법인 실시예 19-20 의 어느 것에 있어서도, 100 kDa 부근에 엑소좀 마커인 Lamp-1 의 밴드가 보이고 있어, 본 발명의 취득 방법에 의하면, 엑소좀을 포함하는 세포외막소포를 취득 가능하다는 것을 알 수 있었다 (실시예 19-20 : 레인 1-2).
한편, 도 4-A 로부터, 어느 종래법 (초원심분리법 (비교예 1), Exo Quick (비교예 2), 및 Total Exsome Isolation (비교예 3)) 에서도, 100 kDa 부근에 엑소좀 마커의 Lamp-1 의 밴드는, 엷게 조금 밖에 보이지 않았다 (비교예 1-3 : 레인 3-5).
또, 도 4-B 로부터, 본 발명의 취득 방법 (실시예 19-20) 은, 어느 종래법 (초원심분리법 (비교예 1), Exo Quick (비교예 2), 및 Total Exosome Isolation (비교예 3)) 으로부터도, 협잡 단백질 등에서 유래하는 밴드가 적었다 (실시예 19-20 : 레인 1-2, 비교예 1-3 : 레인 3-5).
이상의 결과로부터, 본 발명의 취득 방법 (실시예 19 및 20) 은, 어느 종래법 ((초원심분리법 (비교예 1), Exo Quick (비교예 2), 및 Total Exsome Isolation (비교예 3)) 과 비교해도, 순도 양호하게 세포외막소포를 취득할 수 있는 것을 알 수 있었다 (레인 1-5).
실시예 21. 본 발명의 취득 방법에 의해 얻어진 세포외막소포의 전자현미경에 의한 관찰
본 발명의 취득 방법에 의해 취득된 세포외막소포 상태를 조사하기 위해서, 전자현미경에 의한 관찰을 실시하였다.
＜(1) 마우스 매크로파지 배양 상청 샘플의 조제＞
복강 매크로파지를 얻기 위해, 3 ％ 티오글리콜레이트 용액 (플루카 시약사 제조) 2 ㎖ 를 8 주령의 암컷의 C57BL/6J 마우스 (닛폰 에스엘시 (주) 로부터 구입) 6 마리의 복강에 주사하였다. 3 일 후, 복강으로부터 매크로파지를 회수하고, 회수한 매크로파지를 150 ㎜ 세포 배양용 디쉬 4 장으로 10 ％ FBS (바이오 웨스트사 제조) 함유 DMEM (나카라이 테스크 (주) 제조) 80 ㎖ 를 사용하여 2 일간 배양하고, 배양 상청을 회수하여, 마우스 매크로파지 배양 상청 샘플을 얻었다.
＜(2) Tim4 담체의 조제＞
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (서모피셔 사이언티픽사 제조) 0.6 ㎎ 대신에 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (서모피셔 사이언티픽사 제조) 을 1 ㎎ 사용하고, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합 mTim4 단백질 1 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 대신에 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합 mTim4 단백질 100 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 100 ㎕ 를 사용하고, Dynabeads 와 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합 mTim4 단백질을 함유하는 PBS 용액의 반응 시간을 1 시간 대신에 2 시간으로 한 것 이외에는, 실시예 11-12 와 동일한 방법에 의해, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 에 결합시킨 mTim4 담체를 조제하였다.
＜(3) Tim4 담체를 사용한 세포외막소포의 취득＞
마우스 매크로파지 배양 상청 샘플 32 ㎖ 를 원심분리 처리 (1 회째 : 800 × g, 10 분간, 2 회째 : 12000 × g, 30 분간) 하고, 상청을 얻었다. 얻어진 상청에, 종농도 2 mM 이 되도록 CaCl2 를 첨가한 후, 상기에서 조제한 mTim4 담체 1 ㎎ 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반 혼합하였다. 이어서, 실온에서 1 시간 교반 혼합한 mTim4 담체를 회수하고, 종농도 2 mM CaCl2 함유 TBS-T 5 ㎖ 로 3 회 세정 조작한 후, 추가로 1 ㎖ 로 2 회 세정 조작한 후, 1 mM EDTA 함유 TBS 100 ㎕ 로 3 회 용출하여, 세포외막소포 획분 300 ㎕ 를 얻었다.
이어서, 마우스 매크로파지 배양 상청 샘플 중의 세포외막소포를 확실하게 회수하기 위해, 재차 이하의 방법에 의해, 1 mM EDTA 함유 TBS 100 ㎕ 로 3 회 용출한 후의 마우스 매크로파지 배양 상청 샘플로부터 세포외막소포를 회수하여, 세포외막소포 획분 300 ㎕ 를 얻었다. 즉, 1 mM EDTA 함유 TBS 100 ㎕ 로 3 회 용출한 후의 마우스 매크로파지 배양 상청 샘플에, 종농도 2 mM 이 되도록 CaCl2 를 첨가한 후, 1 mM EDTA 함유 TBS 100 ㎕ 로 3 회 용출한 후의 mTim4 담체 1 ㎎ 을 더하고, 실온에서 1 시간 교반 혼합하였다. 이어서, 실온에서 1 시간 교반 혼합한 mTim4 담체를 회수하고, 종농도 2 mM CaCl2 함유 TBS-T 5 ㎖ 로 3 회 세정 조작한 후, 추가로 1 ㎖ 로 2 회 세정 조작한 후, 1 mM EDTA 함유 TBS 100 ㎕ 로 3 회 용출하여, 세포외막소포 획분 300 ㎕ 를 얻었다.
그 후, 마우스 매크로파지 배양 상청 샘플 중의 세포외막소포를 보다 확실하게 회수하기 위해, 이상의 조작을 재차 실시하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 100 ㎕ 로 합계 6 회 용출한 후의 마우스 매크로파지 배양 상청 샘플로부터 세포외막소포를 회수하여, 세포외막소포 획분 300 ㎕ 를 얻었다.
상기 9 회의 용출 조작에 의해 얻어진 세포외막소포 획분 합계 900 ㎕ 를 아미콘울트라-0.5 ㎖ 10 K 원심식 필터 칼럼을 사용하여 60 ㎕ 로 농축하여, 전자현미경에 의한 관찰용의 시료를 얻었다.
＜(4) 전자현미경에 의한 본 발명의 취득 방법에 의해 취득된 세포외막소포의 관찰＞
전자현미경에 의한 관찰용 시료 10 ㎕ 를 그리드에 흡착시키고, 잉여의 전자현미경에 의한 관찰용 시료를 여과지로 흡수하였다. 이어서, 그리드를 수세하고, 아세트산우라늄 수용액에 의한 염색을 2 회 실시한 후, 투과형 전자현미경을 사용하여 네거티브 염색법에 의한 관찰을 실시하였다.
또한, 실시예 21 에서 사용한 mTim4 단백질 및 담체의 종류, 그리고 mTim4 담체로부터 세포외막소포를 취득하기 위해서 사용한 용출액의 종류를 하기 표 9 에 나타낸다.
＜결과＞
얻어진 전자현미경의 관찰 화상을 도 5 에 나타낸다. 도 5 로부터, 본 발명의 취득 방법에 의하면, 구형의 형상을 유지한 채로, 직경 50 ∼ 150 ㎚ 정도의 세포외막소포를 취득할 수 있었다.
이상의 점으로부터, 본 발명의 취득 방법에 의하면, 인택트한 상태로 세포외막소포를 취득할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 22-25. 본 발명의 Tim4 담체에 의한 세포외막소포의 취득 (본 발명의 취득 방법)
인간 유래 Tim4 단백질을 비즈에 고정화한 담체 (이하, 「hTim4 담체」라고 약기하는 경우가 있다) 와 mTim4 담체를 사용하여, 본 발명에 관련된 세포외막소포의 취득을 실시하였다.
＜(1) 배양 상청 샘플의 조제＞
실시예 1-8 의 「(1) 배양 상청 샘플의 조제」와 동일한 방법에 의해 실시하였다.
＜(2) Fc 태그 융합형 Tim4 단백질의 희석＞
비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 인간 유래 Tim4 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조, 배열 번호 7 (인간 유래 Tim4 단백질의 N 말단 25 ∼ 315 아미노산 영역 (GenBank NP_612388.2) 에 Fc 태그가 융합된 인간 유래 Tim4 단백질)) 동결 건조품 100 ㎍ 을 PBS 1 ㎖ 에 녹여, 100 ㎍/㎖ 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 hTim4 단백질 함유 PBS 용액을 제조하였다. 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 hTim4 단백질 함유 PBS 용액 10 ㎕ 와 PBS 190 ㎕ 를 혼합하여, 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 hTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
또, 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조, 배열 번호 6 (마우스 유래 Tim4 단백질의 N 말단 22 ∼ 279 아미노산 영역 (GenBank NP_848874.3)) 에 Fc 태그가 융합된 mTim4 단백질) 동결 건조품 100 ㎍ 을 PBS 1 ㎖ 에 녹여, 100 ㎍/㎖ 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액을 제조하였다. 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 10 ㎕ 와 PBS 190 ㎕ 를 혼합하여, 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
＜(3) 비즈의 세정＞
30 ㎍/㎕ Dynabeads Protein G 함유 PBS-T 용액 (서모피셔 사이언티픽사 제조) 20 ㎕ (Dynabeads Protein G 0.6 ㎎ 함유) 를, 2 개의 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 에 각각 분주하고, PBS 500 ㎕ 를 사용하여 세정 조작을 실시하였다.
＜(4) 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 Tim4 단백질의 비즈에의 고정＞
2 개의 Dynabeads Protein G (0.6 ㎎) 함유 1.5 ㎖ 튜브 중, 1 개에 대해서는, 상기에서 조제한 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 hTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 전체량 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켜, 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 hTim4 단백질이 결합한 담체 (hTim4 담체) 를 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
나머지 1 개의 Dynabeads Protein G (0.6 ㎎) 함유 1.5 ㎖ 튜브에 대해서는, 상기에서 조제한 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 전체량 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켜, 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질이 결합한 담체 (mTim4 담체) 를 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
＜(5) 본 발명의 취득 방법에 의한 세포외막소포의 취득＞
상기에서 얻어진 hTim4 담체 및 mTim4 담체 0.6 ㎎ 을 PBS 500 ㎕ 로 각각 3 회 세정 조작한 후, 펠릿 상태의 hTim4 담체 및 mTim4 담체에, 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플 200 ㎕ 를 각각 첨가하고, 8 ℃ 에서 3 시간 각각 반응시켰다. 그 후, 반응 후의 hTim4 담체 및 mTim4 담체를, 2 mM CaCl2 함유 TBS-T 500 ㎕ 로 각각 3 회 세정 조작하였다.
3 회째의 세정 시에 hTim4 담체 및 mTim4 담체를 각각 250 ㎕ (담체 0.3 ㎎) 씩 1.5 ㎖ 튜브 2 개에 분주하였다. 펠릿 상태의 mTim4 담체 및 hTim4 담체 각 0.3 ㎎ 에 용출액으로서 1 ％ SDS 수용액 또는 1 mM EDTA 수용액을 20 ㎕ 첨가한 후, 볼텍스 믹서에 의해 실온에서 10 초간 혼합하고, 스핀 다운하였다. 1.5 ㎖ 튜브를 각각 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 hTim4 담체 및 mTim4 담체를 집합시키고, 각각 상청 (용출액) 을 회수하였다.
또한, 실시예 22-25 에서 사용한 Tim4 단백질 및 담체의 종류, Tim4 담체로부터 세포외막소포를 취득하기 위해서 사용한 용출액의 종류, 그리고 후술하는 웨스턴 블롯팅에 있어서의 레인 번호를 하기 표 10 에 나타낸다.
＜(6) 웨스턴 블롯팅＞
「실시예 1-8 에서 얻어진 각 상청 (용출액) 7.5 ㎕」 대신에 「실시예 22-25 (상기 (5)) 에서 얻어진 각 상청 (용출액) 7.5 ㎕」를 사용한 것 이외에는, 실시예 1-8 의 「(7) 웨스턴 블롯팅」과 동일한 방법에 의해 실시하였다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 6 에 나타낸다. 도 6 에 있어서, 각 레인은 이하와 같다.
레인 1 : 실시예 22 의 결과 (비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 hTim4 단백질을 Protein G 비즈에 결합시킨 hTim4 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 2 : 실시예 23 의 결과 (비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 hTim4 단백질을 Protein G 비즈에 결합시킨 hTim4 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과),
레인 3 : 실시예 24 의 결과 (비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 Protein G 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 4 : 실시예 25 의 결과 (비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 Protein G 비즈에 결합시킨 mTim4 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
도 6 으로부터, 실시예 22-25 의 어느 경우에 있어서도, 100 kDa 부근에 엑소좀 마커인 Lamp-1 의 밴드가 보인 점에서, 본 발명의 취득 방법에 의하면, 엑소좀을 포함하는 세포외막소포를 취득 가능한ㄴ 것을 알 수 있었다 (실시예 22-25 : 레인 1-4).
또, Tim4 단백질은 유래의 생물종에 의하지 않고 본 발명의 Tim4 담체 및 본 발명의 취득 방법에 사용할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 26-27·비교예 4-9. Tim4 담체 및 PS 단백질을 고정화한 담체에 의한 세포외막소포의 취득량의 비교
Tim4 담체와 PS 단백질 (인간 유래 Annexin V, 인간 유래 MFG-E8, 및 마우스 유래 MFG-E8) 을 각각 비즈에 고정화한 담체를 사용하여, 본 발명에 관련된 세포외막소포의 취득을 실시하였다.
＜(1) PS 단백질 함유 PBS 용액의 희석＞
His 태그 융합형 인간 유래 Annexin V (Creative Bio Mart 사 제조, 「His 태그 융합형 hAnnexin V」라고 약기하는 경우가 있다) 20 ㎍ 을 200 ㎍/㎖ 가 되도록 PBS 100 ㎕ 에 녹여, His 태그 융합형 hAnnexin V 함유 PBS 용액을 제조하였다. His 태그 융합형 hAnnexin V 단백질 1 ㎍ 함유 PBS 용액 5 ㎕ 와 PBS 195 ㎕ 를 혼합하여 희석하였다.
His 태그 융합형 인간 유래 MFG-E8 (R & D Systems 사 제조, 「His 태그 융합형 hMFG-E8」이라고 약기하는 경우가 있다) 50 ㎍ 을 100 ㎍/㎖ 가 되도록 PBS 500 ㎕ 에 녹여, His 태그 융합형 hMFG-E8 함유 PBS 용액을 제조하였다. His 태그 융합형 hMFG-E8 단백질 1 ㎍ 함유 PBS 용액 10 ㎕ 와 PBS 190 ㎕ 를 혼합하여 희석하였다. His 태그 융합형 마우스 유래 MFG-E8 (R & D Systems 사 제조, 「His 태그 융합형 mMFG-E8」이라고 약기하는 경우가 있다) 50 ㎍ 을 100 ㎍/㎖ 가 되도록 PBS 500 ㎕ 에 녹여, His 태그 융합형 mMFG-E8 함유 PBS 용액을 제조하였다. His 태그 융합형 마우스 유래 MFG-E8 단백질 1 ㎍ 함유 PBS 용액 10 ㎕ 와 PBS 190 ㎕ 를 혼합하여 희석하였다.
＜(2) 항His 태그 항체 고정화 비즈의 조제＞
30 ㎍/㎕ Dynabeads M-270 카복실산 (서모피셔 사이언티픽사 제조) 함유 용액 100 ㎕ (Dynabeads M-270 카복실산 3 ㎎ 함유) 를 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 에 분주하고, 반응 버퍼 (0.1 M MES, pH 5.0) 를 사용하여 세정 조작을 실시하였다.
이어서, 반응 버퍼 490 ㎕ 로 희석한 6xHis 항체 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 용액 60 ㎕ (6xHis 항체 60 ㎍ 함유) 를 더하여 실온에서 30 분간 전도 혼화하고, 그 후 6 ㎎/㎖ WSC (도진 화학 연구소 제조) 를 50 ㎕ 더하여 실온에서 4 시간 전도 혼화하였다. 전도 혼화 후의 Dynabeads M-270 카복실산을 TBS-T 로 세정 조작한 후, 100 ㎕ PBS 로 희석하여 항His 태그 항체 고정화 비즈 3 ㎎ 을 얻었다.
＜(3) Tim4 담체 및 각종 PS 단백질을 고정화한 담체의 조제＞
이어서, 얻어진 항His 태그 항체 고정화 비즈를 함유하는 PBS 용액 100 ㎕ (항His 태그 항체 고정화 비즈 3 ㎎ 함유) 를, 4 개의 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 에 각각 20 ㎕ (항His 태그 항체 고정화 비즈 0.6 ㎎ 함유) 씩 분주하고, 500 ㎕ PBS 로 세정 조작을 각각 실시하였다.
이어서, 4 개의 세정 조작 후의 펠릿 상태의 항His 태그 항체 고정화 비즈 0.6 ㎎ 을 함유하는 1.5 ㎖ 튜브 중, 1 개에 대해서는, 상기에서 조제한 His 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 200 ㎕ (His 태그 융합형 mTim4 단백질 1 ㎍ 함유) 를 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다.
또한, 1 개에 대해서는, 상기에서 조제한 His 태그 융합형 hAnnexin V 질 함유 PBS 용액 200 ㎕ (His 태그 융합형 hAnnexin V 1 ㎍ 함유) 를 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다.
1 개에 대해서는, 상기에서 조제한 His 태그 융합형 hMFG-E8 함유 PBS 용액 200 ㎕ (His 태그 융합형 hMFG-E8 1 ㎍ 함유) 를 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다.
1 개에 대해서는, 상기에서 조제한 His 태그 융합형 mMFG-E8 함유 PBS 용액 200 ㎕ (His 태그 융합형 mMFG-E8 1 ㎍ 함유) 를 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다.
이상에 의해, 하기 표 11 에 나타내는 4 종류의 담체를 각각 0.6 ㎎ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
＜(4) 세포외막소포의 취득＞
상기에서 얻어진 4 종류의 담체 0.6 ㎎ 을 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 PBS 500 ㎕ 로 각각 3 회 세정 조작한 후, 펠릿 상태의 5 종류의 담체에, 실시예 1-8 과 동일한 방법에 의해 조제한 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플 200 ㎕ 를 각각 첨가하고, 8 ℃ 에서 3 시간 각각 반응시켰다.
그 후, 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플을 반응시킨 4 종류의 담체를, 2 mM CaCl2 함유 TBS-T 500 ㎕ 로 각각 3 회 세정 조작하였다.
3 회째의 세정 시에, 4 종류의 담체를 각각 250 ㎕ 씩 1.5 ㎖ 튜브 2 개에 분주하였다. 펠릿 상태의 4 종류의 담체 각 0.3 ㎎ 에 용출액으로서 1 ％ SDS 수용액 또는 1 mM EDTA 수용액을 20 ㎕ 첨가한 후, 볼텍스 믹서에 의해 실온에서 10 초간 스핀 다운하였다. 1.5 ㎖ 튜브를 각각 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 얻어진 4 종류의 담체를 집합시키고, 각각 상청 (용출액) 을 회수하였다.
또한, 각 실시예에서 사용한 PS 단백질 및 담체의 종류, 담체로부터 세포외막소포를 취득하기 위해서 사용한 용출액의 종류, 그리고 후술하는 웨스턴 블롯팅에 있어서의 레인 번호를 하기 표 12 에 나타낸다.
＜(5) 웨스턴 블롯팅＞
「실시예 1-8 에서 얻어진 각 상청 (용출액) 7.5 ㎕」 대신에 「실시예 26-27, 비교예 4-9 (상기 (4)) 에서 얻어진 각 상청 (용출액) 7.5 ㎕」를 사용한 것 이외에는, 실시예 1-8 의 「(7) 웨스턴 블롯팅」과 동일한 방법에 의해 실시하였다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 7 에 나타낸다. 도 7 에 있어서, 각 레인은 이하와 같다.
레인 1 : 실시예 26 의 결과 (His 태그 융합형 mTim4 단백질을 항His 태그 항체 고정화 비즈에 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 2 : 실시예 27 의 결과 (His 태그 융합형 mTim4 단백질을 항His 태그 항체 고정화 비즈에 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 3 : 비교예 4 의 결과 (His 태그 융합형 hAnnexin V 를 항His 태그 항체 고정화 비즈에 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 4 : 비교예 5 의 결과 (His 태그 융합형 hAnnexin V 를 항His 태그 항체 고정화 비즈에 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 5 : 비교예 6 의 결과 (His 태그 융합형 hMFG-E8 을 항His 태그 항체 고정화 비즈에 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 6 : 비교예 7 의 결과 (His 태그 융합형 hMFG-E8 을 항His 태그 항체 고정화 비즈에 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 7 : 비교예 8 의 결과 (His 태그 융합형 mMFG-E8 을 항His 태그 항체 고정화 비즈에 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 8 : 비교예 9 의 결과 (His 태그 융합형 mMFG-E8 을 항His 태그 항체 고정화 비즈에 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
도 7 로부터, 실시예 26-27 의 어느 경우에 있어서도, 100 kDa 부근에 엑소좀 마커인 Lamp-1 의 밴드가 얻어진 점에서, 본 발명의 취득 방법에 의하면, 엑소좀을 포함하는 세포외막소포를 취득 가능한 것을 알 수 있었다 (실시예 26-27 : 레인 1-2).
한편, 도 7 로부터, 비교예 4-9 의 어느 경우에 있어서도, 100 kDa 부근에 Lamp-1 의 밴드가 보이지 않은 점에서, Tim4 단백질 이외의 PS 단백질 (Annexin V, MFG-E8) 을 고정화한 담체에서는, 엑소좀을 포함하는 세포외막소포를 취득 불가능한 것을 알 수 있었다 (비교예 4-9 : 레인 3-8).
실시예 28-33. 본 발명의 취득 방법에 의한 세포외막소포의 취득 (복합체 형성 공정의 검토)
하기와 같이 각각 본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시하였다.
실시예 28-29 는, 실시예 13-14 와 동일한 방법에 의해 조제한 SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질과 본 발명에 관련된 담체를 반응 후, 추가로 시료를 더하고, 본 발명에 관련된 세포외막소포의 취득을 실시하였다.
실시예 30-31 은, 실시예 13-14 와 동일한 방법에 의해 조제한 SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질과 시료를 반응 후, 추가로 본 발명에 관련된 담체를 더하고, 본 발명에 관련된 세포외막소포의 취득을 실시하였다.
실시예 32-33 은, 실시예 13-14 와 동일한 방법에 의해 조제한 SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질과, 시료와, 본 발명에 관련된 담체를 동시에 더하고, 본 발명에 관련된 세포외막소포의 취득을 실시하였다.
＜비즈의 세정＞
10 ㎍/㎕ Dynabeads M-270 Streptavidin C1 (서모피셔 사이언티픽사 제조) 함유 PBS 용액 60 ㎕ (Dynabeads M-270 Streptavidin C1 0.6 ㎎ 함유) 를, 3 개의 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 에 각각 분주하고, PBS 500 ㎕ 를 사용하여 각각 세정 조작을 실시하였다.
실시예 13-14 와 동일한 방법에 의해, His 태그 융합 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 270 ㎕ (His 태그 융합형 mTim4 단백질 50 ㎍ 함유) 를 비오틴 표지하여, SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질 39.2 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다. 얻어진 SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질 1 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 5.1 ㎕ 에 PBS 용액 194.9 ㎕ 를 더하여, SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질 1 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
＜SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질과 본 발명에 관련된 담체를 반응 후, 추가로 본 발명에 관련된 시료 중의 세포외막소포를 반응시키는 경우 (실시예 28-29)＞
세정 조작을 실시한 펠릿상의 Dynabeads M-270 Streptavidin C1 0.6 ㎎ 을 함유하는 1.5 ㎖ 튜브에, SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질 1 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 를 더하고, Dynabeads M-270 Streptavidin C1 과 SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질을 접촉시키고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켜, mTim4 담체를 얻었다. 이어서, 얻어진 mTim4 담체를 PBS 500 ㎕ 로 3 회 세정 조작하고, 당해 세정 후의 mTim4 담체 0.6 ㎎ 을 함유하는 1.5 ㎖ 튜브에, 실시예 1 과 동일한 방법에 의해 조제한 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플 200 ㎕ 를 더하여 8 ℃ 에서 3 시간 반응시켰다. 그 후, 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플을 반응시킨 mTim4 담체를, 종농도 2 mM CaCl2 첨가 TBS-T 500 ㎕ 로 3 회 세정 조작하였다. 3 회째의 세정 시에, mTim4 담체를 각각 250 ㎕ 씩 1.5 ㎖ 튜브 2 개에 분주하였다. 펠릿 상태의 mTim4 담체 각 0.3 ㎎ 에 용출액으로서 1 ％ SDS 수용액 또는 1 mM EDTA 수용액을 20 ㎕ 첨가한 후, 볼텍스 믹서에 의해 실온에서 10 초간 혼합하고, 스핀 다운하였다. 1.5 ㎖ 튜브를 각각 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 mTim4 담체를 집합시키고, 상청 (용출액) 을 각각 회수하였다.
＜SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질과 본 발명에 관련된 시료를 반응 후, 추가로 본 발명에 관련된 담체를 반응시키는 경우 (실시예 30-31)＞
1.5 ㎖ 튜브에, 실시예 1 과 동일한 방법에 의해 조제한 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플 200 ㎕ 를 분주하고, SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질 1 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 5.1 ㎕ 를 더하고, 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플 중의 세포외막소포와 SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질을 접촉시켜, 8 ℃ 에서 3 시간 반응시켰다.
세정 조작을 실시한 펠릿상의 Dynabeads M-270 Streptavidin C1 0.6 ㎎ 을 함유하는 1.5 ㎖ 튜브에, 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플 중의 세포외막소포와 SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질을 8 ℃ 에서 3 시간 반응시킨 용액을 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켜, 세포외막소포와 mTim4 담체의 복합체를 얻었다. 그 후, 얻어진 세포외막소포와 mTim4 담체의 복합체를, 종농도 2 mM CaCl2 첨가 TBS-T 500 ㎕ 로 3 회 세정 조작하였다. 3 회째의 세정 시에, mTim4 담체와의 복합체를 각각 250 ㎕ 씩 1.5 ㎖ 튜브 2 개에 분주하였다. 펠릿 상태의 mTim4 담체와의 복합체 각 0.3 ㎎ 에 용출액으로서 1 ％ SDS 수용액 또는 1 mM EDTA 수용액을 20 ㎕ 첨가한 후, 볼텍스 믹서에 의해 실온에서 10 초간 혼합하고, 스핀 다운하였다. 1.5 ㎖ 튜브를 각각 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 mTim4 담체를 집합시키고, 상청 (용출액) 을 각각 회수하였다.
＜SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질과, 본 발명에 관련된 시료와, 본 발명에 관련된 담체를 동시에 반응시키는 경우 (실시예 32-33)＞
세정 조작을 실시한 펠릿상의 Dynabeads M-270 Streptavidin C1 0.6 ㎎ 을 함유하는 1.5 ㎖ 튜브에, 실시예 1 과 동일한 방법에 의해 조제한 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플 200 ㎕ 와 SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 mTim4 단백질 1 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 5.1 ㎕ 를 더하고, 8 ℃ 에서 4 시간 반응시켰다. 반응 후의 펠릿상의 Dynabeads M-270 Streptavidin C1 을, 종농도 2 mM CaCl2 첨가 TBS-T 500 ㎕ 로 3 회 세정 조작하였다. 3 회째의 세정 시에, mTim4 담체를 각각 250 ㎕ 씩 1.5 ㎖ 튜브 2 개에 분주하고, mTim4 담체 각 0.3 ㎎ 에 용출액으로서 1 ％ SDS 수용액 또는 1 mM EDTA 수용액을 20 ㎕ 첨가한 후, 볼텍스 믹서에 의해 실온에서 10 초간 혼합하고, 스핀 다운하였다. 1.5 ㎖ 튜브를 각각 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 Dynabeads M-270 Streptavidin C1 을 집합시키고, 상청 (용출액) 을 각각 회수하였다.
또한, 각 실시예에 있어서의 담체, mTim4 단백질, 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플을 접촉시키는 순서, 및 담체로부터 세포외막소포를 취득하기 위해서 사용한 용출액의 종류를 하기 표 13 에 나타낸다.
＜웨스턴 블롯팅＞
「실시예 1-8 에서 얻어진 각 상청 (용출액) 7.5 ㎕」 대신에 「실시예 28-33 에서 얻어진 각 상청 (용출액) 7.5 ㎕」를 사용한 것 이외에는, 실시예 1-8 의 「(7) 웨스턴 블롯팅」과 동일한 방법에 의해 실시하였다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 8 에 각각 나타낸다. 도 8 에 있어서, 각 레인은 이하와 같다.
레인 1 : 실시예 28 의 결과 (담체와 mTim4 단백질을 접촉 후, 추가로 칼슘 이온 세포 배양 상청 샘플과 접촉시키는 방법에 의해 세포외막소포를 취득하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 2 : 실시예 29 의 결과 (담체와 mTim4 단백질을 접촉 후, 추가로 칼슘 이온 세포 배양 상청 샘플과 접촉시키는 방법에 의해 세포외막소포를 취득하고, 1 mM EDTA 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 3 : 실시예 30 의 결과 (mTim4 단백질과 칼슘 이온 세포 배양 상청 샘플을 접촉 후, 추가로 담체와 접촉시키는 방법에 의해 세포외막소포를 취득하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과) 를,
레인 4 : 실시예 31 의 결과 (mTim4 단백질과 칼슘 이온 세포 배양 상청 샘플을 접촉 후, 추가로 담체와 접촉시키는 방법에 의해 세포외막소포를 취득하고, 1 mM EDTA 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과) 를,
레인 5 : 실시예 32 의 결과 (담체와 칼슘 이온 세포 배양 상청 샘플과 mTim4 단백질을 동시에 접촉시키는 방법에 의해 세포외막소포를 취득하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과) 를,
레인 6 : 실시예 33 의 결과 (담체와 칼슘 이온 세포 배양 상청 샘플과 mTim4 단백질을 동시에 접촉시키는 방법에 의해 세포외막소포를 취득하고, 1 mM EDTA 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
도 8 로부터, 실시예 28-33 의 어느 것에 있어서도, 100 kDa 부근에 엑소좀 마커인 Lamp-1 의 밴드가 얻어졌다 (실시예 28-33 : 레인 1-6).
또, 실시예 28-33 의 결과로부터, 담체에 결합한 Tim4 단백질과 시료 중의 세포외막소포의 복합체를 형성시키는 공정 (복합체 형성 공정) 은, 본 발명에 관련된 Tim4 단백질과, 본 발명에 관련된 담체와, 시료 중의 세포외막소포의 접촉하는 순서에 의하지 않고, 결과적으로 담체에 결합한 mTim4 단백질과 시료 중의 세포외막소포의 복합체가 형성되면 되는 것을 알 수 있었다.
실시예 34-35·비교예 10-13 본 발명의 취득 방법과 종래법의 비교
이하와 같이, SDS 용출에 의한 본 발명의 취득 방법 (실시예 34), EDTA 용출에 의한 본 발명의 취득 방법 (실시예 35), 항CD63 항체 고정화법 (비교예 10-11), Exosome-Human CD63 Isolation/Detection (비교예 12-13) 에 의해 얻어지는 세포외막소포의 취득을 실시하였다.
＜Tim4 단백질의 담체에의 고정＞
10 ㎍/㎕ Dynabeads M-270 Streptavidin (서모피셔 사이언티픽사 제조) 함유 용액 15 ㎕ (Dynabeads M-270 Streptavidin 1 × 107 개 함유한다) 를 1.5 ㎖ 튜브(비엠 기기사 제조) 에 분주하고, PBS 를 사용하여 세정 조작을 실시하였다.
이어서, 세정 조작 후의 Dynabeads M-270 Streptavidin 을 함유하는 1.5 ㎖ 튜브에, 실시예 11-12 와 동일한 방법에 의해 조제한 SH 기 비오틴 표지 FLAG 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질을 0.25 ㎍ 함유하는 PBS 용액 200 ㎕ 의 전체량을 더하고, 냉장으로 1 시간 반응시켜, mTim4 담체 함유 PBS 용액을 얻었다.
＜항CD63 항체 (H5C6) 고정화 담체의 조제＞
30 ㎍/㎕ Dynabeads M-270 카복실산 (서모피셔 사이언티픽사 제조) 함유 용액 50 ㎕ (Dynabeads M-270 카복실산 1 × 108 개 함유한다) 를 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 에 분주하고, 반응 버퍼 (0.1 M MES, pH 5.0) 를 사용하여 세정 조작을 실시하였다.
한편, 항CD63 항체 (H5C6)(BD Pharmingen 사 제조) 30 g (60 ㎕) 을, 반응 버퍼 (0.1 M MES, pH 5.0) 490 ㎕ 로 희석하여, 반응 버퍼 희석 항CD63 항체 용액을 얻었다.
이어서, 세정 조작 후의 Dynabeads M-270 카복실산을 함유하는 1.5 ㎖ 튜브에, 상기 반응 버퍼 희석 항CD63 항체 용액을 550 ㎕ 더하여 실온에서 30 분간 전도 혼화하였다. 그 후, 추가로 3 ㎎/㎖ WSC (도진 화학 연구소사 제조) 를 50 ㎕ 더해 실온에서 4 시간 전도 혼화하고, TBS-T 로 세정 조작 후, 50 ㎕ PBS 로 희석하여, 항CD63 항체 (H5C6) 담체 함유 PBS 용액을 얻었다.
이상에 의해, 하기 표 14 에 나타내는 2 종류의 담체를 얻었다.
＜본 발명의 취득 방법에 의한 세포외막소포의 취득＞
상기에서 얻어진 mTim4 담체 함유 PBS 용액 200 ㎕ (mTim4 담체 1 × 107 개 함유) 를 PBS 500 ㎕ 로 3 회 세정 조작한 후, 펠릿 상태의 mTim4 담체에, 실시예 1-8 과 동일한 방법에 의해 조제한 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플 50 ㎕ 를 첨가하고, 8 ℃ 에서 3 시간 반응시켰다.
그 후, 반응 후의 mTim4 담체를, 2 mM CaCl2 함유 TBS-T 500 ㎕ 로 3 회 세정 조작하였다. 3 회째의 세정 시에, mTim4 담체를 각각 250 ㎕ 씩 1.5 ㎖ 튜브 2 개에 분주하였다. 펠릿 상태의 mTim4 담체 0.3 ㎎ 씩에, 용출액으로서 1 ％ SDS 수용액 및 1 mM EDTA 수용액을 각각 20 ㎕ 첨가한 후, 볼텍스 믹서에 의해 실온에서 10 초간 각각 혼합하고, 스핀 다운하였다. 1.5 ㎖ 튜브를 각각 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 mTim4 담체를 집합시키고, 상청 (용출액) 을 회수하였다.
＜항CD63 항체 고정화법에 의한 세포외막소포의 취득＞
「mTim4 담체 함유 PBS 용액 200 ㎕」 대신에, 「항CD63 항체 (H5C6) 담체 함유 PBS 용액 5 ㎕ (담체 1 × 107 개 함유)」를 사용한 것 이외에는, 상기 ＜본 발명의 취득 방법에 의한 세포외막소포의 취득＞ 과 동일한 방법에 의해, 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플 중의 세포외막소포를 취득하고, 1 ％ SDS 수용액 또는 1 mM EDTA 수용액에 의해 세포외막소포를 용출시키고, 상청 (용출액) 을 회수하였다.
＜Exosome-Human CD63 Isolation/Detection 에 의한 세포외막소포의 취득＞
「mTim4 담체 함유 PBS 용액 200 ㎕」 대신에, 「Exosome-Human CD63 Isolation/Detection (서모피셔 사이언티픽사 제조) 1 ㎖ (담체 1 × 107 개 함유)」를 사용한 것 이외에는, 상기 ＜본 발명의 취득 방법에 의한 세포외막소포의 취득＞ 과 동일한 방법에 의해, 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플 중의 세포외막소포를 취득하고, 1 ％ SDS 수용액 또는 1 mM EDTA 수용액에 의해 세포외막소포를 용출시키고, 상청 (용출액) 을 회수하였다.
또한, 각 실시예, 비교예에서 사용한 담체의 종류, 담체로부터 세포외막소포를 취득하기 위해서 사용한 용출액의 종류, 그리고 후술하는 웨스턴 블롯팅에 있어서의 레인 번호를 하기 표 15 에 나타낸다.
＜웨스턴 블롯팅＞
「실시예 1-8 에서 얻어진 각 상청 (용출액) 7.5 ㎕」 대신에 「실시예 34-35, 비교예 10-13 에서 얻어진 각 상청 (용출액) 7.5 ㎕」를 사용한 것 이외에는, 실시예 1-8 의 「(7) 웨스턴 블롯팅」과 동일한 방법에 의해 실시하였다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 9 에 나타낸다. 도 9 에 있어서, 각 레인은 이하와 같다.
레인 1 : 실시예 34 의 결과 (본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포를 취득하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 2 : 실시예 35 의 결과 (본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포를 취득하고, 1 mM EDTA 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 3 : 비교예 10 의 결과 (항CD63 항체법에 의해 세포외막소포를 취득하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 4 : 비교예 11 의 결과 (항CD63 항체법에 의해 세포외막소포를 취득하고, 1 mM EDTA 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 5 : 비교예 12 의 결과 (Exosome-Human CD63 Isolation/Detection 에 의해 세포외막소포를 취득하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 6 : 비교예 13 의 결과 (Exosome-Human CD63 Isolation/Detection 에 의해 세포외막소포를 취득하고, 1 mM EDTA 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
도 9 로부터, 본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 실시예 34-35 에서는, 25-60 kDa 부근에 엑소좀 마커의 하나인 CD63 의 밴드가 얻어졌다 (실시예 34-35 : 레인 1-2).
한편, 도 9 로부터, 항CD63 항체법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 비교예 10-11 및 Exosome-Human CD63 Isolation/Detection 에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 비교예 12-13 에서는, 25-60 kDa 부근에 CD63 의 밴드는 엷게 밖에 얻어지지 않았다 (비교예 10-13 : 레인 3-6).
이상으로부터, 본 발명의 취득 방법에 의하면, 항CD63 항체법이나 Exosome-Human CD63 Isolation/Detection 등의 세포외막소포의 표면 항원 단백질에 대한 항체를 사용하여 당해 표면 항원 단백질과 항체의 어피니티에 의해 세포외막소포를 취득하는 방법보다 많은 세포외막소포를 회수 가능한 것을 알 수 있었다.
실시예 36-38. 초원심분리 처리 완료 시료로부터의 본 발명의 취득 방법에 의한 잔존 세포외막소포의 취득
이하와 같이, 종래법인 초원심분리법 (이하, 초원심분리 처리라고 약기하는 경우가 있다) 에 의해 세포외막소포를 제거·취득한 시료에 대해, 본 발명의 취득 방법을 실시하였다.
＜(1) 초원심분리법에 의한 세포외막소포의 제거＞
FBS (CORNING 사 제조) 15 ㎖ 를 원심분리 처리 (10000 × g, 20 분간) 하여 불순물을 분리하고, 상청을 새로운 튜브로 옮겨 원심분리 처리가 완료된 FBS 를 얻었다. 이어서, 얻어진 원심분리 처리가 완료된 FBS 를 5 ㎖ 씩 초원심분리 처리 (110000 × g, 하룻밤) 또는 초원심분리 처리 (450000 × g, 하룻밤) 하고, 상청을 새로운 튜브로 옮겨 초원심분리 처리 (110000 × g) 가 완료된 FBS 및 초원심분리 처리 (450000 × g) 가 완료된 FBS 를 각 5 ㎖ 얻었다.
＜(2) 비즈의 세정＞
10 ㎍/㎕ Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (서모피셔 사이언티픽사 제조) 함유 PBS 용액 180 ㎕ (Dynabeads MyOne Streptavidin C1 1.8 ㎎ 함유) 를, 3 개의 튜브에 각각 분주하였다. 이어서, PBS 1500 ㎕ 를 튜브에 각각 더하고, 교반한 후, 튜브를 각각 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 을 집합시키고, 튜브 내의 용액을 피펫으로 버렸다 (이하, 세정 조작이라고 약기하는 경우가 있다).
＜(3) Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질의 비즈에의 고정＞
세정 조작 후의 펠릿 상태의 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 1.8 ㎎ 에, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 3 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 1500 ㎕ 를 각각 첨가하고, 8 ℃ 에서 10 분간 반응시켜, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질이 결합한 담체 (mTim4 담체) 를 함유하는 PBS 용액 1500 ㎕ 를 각각 얻었다.
＜(4) 본 발명의 취득 방법에 의한 세포외막소포의 취득＞
얻어진 mTim4 담체 1.8 ㎎ 을 PBS 1500 ㎕ 로 각각 3 회 세정 조작하여, 펠릿 상태의 mTim4 담체를 얻었다. 그 후, 3 개의 15 ㎖ 원심관 (CORNING 사 제조) 에 원심분리 처리가 완료된 FBS, 초원심분리 처리 (110000×g) 가 완료된 FBS, 및 초원심분리 처리 (450000×g) 가 완료된 FBS 각 5 ㎖ 를 각각 분주하고, 펠릿 상태의 mTim4 담체를 1.8 ㎎ 첨가하고, 8 ℃ 에서 2 시간 반응시켰다. 반응 후, 15 ㎖ 원심관을 각각 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 mTim4 담체를 집합시키고, 각 상청 (각 FBS) 을 새로운 15 ㎖ 원심관에 각각 회수하였다. 원심관에 남은 펠릿 상태의 mTim4 담체를, 2 mM CaCl2 함유 TBS-T (Tris 버퍼, 0.0005 ％ 트윈20, 2 mM CaCl2) 3 ㎖ 로 각각 세정 조작 후, 펠릿 상태의 mTim4 담체에 2 mM CaCl2 함유 TBS-T 를 각각 1 ㎖ 첨가하여 현탁하고, 1.5 ㎖ 튜브에 현탁액을 전체량 옮긴 후, 각각 2 회 세정 조작하였다.
펠릿 상태의 mTim4 담체 1.8 ㎎ 에 용출액으로서 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 50 ㎕ 각각 첨가한 후, 볼텍스 믹서에 의해 실온에서 10 초간 혼합하고, 스핀 다운하였다. 1.5 ㎖ 튜브를 각각 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 mTim4 담체를 집합시키고, 용출액을 회수하였다. 재차 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 50 ㎕ 첨가하고, 상기에서 사용한 mTim4 담체를 사용하여 동일한 방법으로 용출액을 회수하였다.
그 후, 용출액을 2 번 회수했을 때에 사용한 비즈를, 15 ㎖ 원심관에 회수한 각 상청 (각 FBS) 에 재차 첨가하고, 상기한 것과 동일한 방법에 의해, 각 상청 (각 FBS) 중의 세포외막소포를 회수하는 조작을 추가로 2 회 반복하여 각 용출액을 각각 얻었다.
＜(5) 웨스턴 블롯팅＞
얻어진 각 용출액 100 ㎕ 를 30 ㎕ 가 되도록, VIVASPIN500 (MVCO10, 000)(자르토리우스사 제조) 을 사용하여 한외 여과하였다. 한외 여과한 각 용출액 15 ㎕ 에 4 × 시료용 완충액 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 5 ㎕ 를 더하여 98 ℃ 에서 5 분간 가열하여, 웨스턴 블롯팅용의 각 시료를 얻었다. 슈퍼 셉 에이스 5-20 ％ 겔 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 에 당해 웨스턴 블롯팅용의 각 시료 20 ㎕ 를 얹고, 25 mA 로 65 분간 전기 영동하였다. 얻어진 영동 겔을, 세미드라이 블로터와 불연속 버퍼 (애노드 버퍼 1 : 0.3 M Tris/20 ％ 메탄올, 애노드 버퍼 2 : 0.025 M Tris/20 ％ 메탄올, 캐소드 버퍼 : 0.025 M Tris/0.04 M 아미노카프로산/20 ％ 메탄올) 를 사용하여, PVDF 막 (Millipore 사 제조) 에 1 mA/㎠ 로 60 분간 전사하였다. 전사 후의 PVDF 막에 PBS-T (PBS 버퍼, 0.1 ％ 트윈20) 로 희석한 3 ％ 스킴 밀크를 더하여 1 시간 실온에서 반응시켜 블로킹하고, PBS-T 로 1000 배 희석한 항소 CD9 항체 (Novus Biologicals 사 제조, 이하 「항소 CD9 항체」라고 약기하는 경우가 있다) 2 ㎖ 를 실온에서 1 시간 반응시켰다. 반응 후의 PVDF 막을 PBS-T 로 3 회 세정하고, PBS-T 로 10000 배 희석한 2 차 항체 {항마우스 IgG(H ＋ L), 토끼, IgG 분획, 퍼옥시다아제 결합 항체](와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 를 실온에서 1 시간 반응시켰다. PBS-T 로 5 회 세정 후, 항소 CD9 항체를 반응시킨 멤브레인에 이뮤노스타베이직 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 을, 항Flotillin-2 항체를 반응시킨 멤브레인에 이뮤노스타제타 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 를 각각 첨가하고, LAS-4000 (GE 사 제조) 을 사용하여 발광 시그널을 검출하였다. 또한, 항소 CD9 항체와 항Flotillin-2 항체는, 엑소좀의 마커 단백질인 CD9 와 Flotillin-2 를 각각 인식하는 항체이다.
＜(6) 평균 입자수 및 평균 입자 사이즈의 측정＞
얻어진 각 용출액 100 ㎕ 를 원심식 필터 (0.45 ㎛, PVDF)(Millipore 사 제조) 로 처리 후, 물로 5 배 희석하고, 나노사이트 LM10 (NanoSight 사 제조) 을 사용하여 희석액 중에 포함되는 입자에 대해 NanoSight 사의 매뉴얼에 따라 각 3 회 측정하고, 평균 입자수 (Particles) 와 평균 입자 사이즈 (Mean Size) 를 조사하였다.
또한, 각 실시예에서 사용한 시료의 처리 방법, 시료 중에 잔존하는 세포외막소포의 취득 방법 등에 대해 하기 표 16 에 나타낸다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 10, 나노 사이트에 의한 평균 입자수 및 평균 입자 사이즈의 측정 결과를 표 17 에 각각 나타낸다. 도 10 에 있어서, 각 레인은 이하의 결과이다.
레인 1 : 실시예 36 의 결과 (시료를 원심분리 처리하고, 본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우의 결과)
레인 2 : 실시예 37 의 결과 (시료를 원심분리 처리하고, 110000 × g 로 초원심 처리한 후, 본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우의 결과)
레인 3 : 실시예 38 의 결과 (시료를 원심분리 처리하고, 450000 × g 로 초원심 처리한 후, 본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우의 결과)
도 10 으로부터, 시료를 원심분리 처리하고, 110000 × g 또는 450000 × g 로 초원심 처리한 후, 본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우 (실시예 37-38) 에도 엑소좀마카의 CD9 와 Flotillin-2 의 밴드가 확인되고, 초원심분리 처리에서는 시료 중에 포함되는 세포외막소포를 다 제거 (취득) 할 수 없고, 시료 중에는 다량의 세포외막소포가 잔존하는 것을 알 수 있었다 (실시예 37-38 : 레인 2-3). 또한, 이들 초원심분리법으로는 다 제거 (취득) 할 수 없어 시료 중에 잔존하는 세포외막소포를, 본 발명의 취득 방법에 의해 취득 (제거) 가능한 것을 알 수 있었다 (실시예 37-38 : 레인 2-3).
표 17 로부터, 시료를 원심분리 처리하고, 110000 × g 또는 450000 × g 로 초원심 처리한 후, 본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우 (실시예 37-38) 와 시료를 원심분리 처리한 후, 본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우 (실시예 36) 에, 취득한 세포외막소포의 크기 (입자경) 는 대략 동일하였다. 따라서, 초원심분리법으로는 다 제거할 수 없는 시료 중에 잔존하는 세포외막소포는 단편화되지 않고, 입자로서 존재하고 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 39-40. Total Exosome Isolation (폴리머 침전) 처리가 완료된 시료로부터의 본 발명의 취득 방법에 의한 잔존 세포외막소포의 취득
이하와 같이, 시료에 포함되는 세포외막소포를 종래법인 Total Exosome Isolation (폴리머 침전) 으로 제거 (이하, 「폴리머 침전 처리」라고 약기하는 경우가 있다) 에 의해 세포외막소포를 제거 (취득) 한 시료에 대해, 본 발명의 취득 방법을 실시하였다.
＜(1) Total Exosome Isolation (폴리머 침전) 법에 의한 세포외막소포의 제거＞
FBS (CORNING 사 제조) 10 ㎖ 를 원심분리 처리 (10000 × g, 20 분간) 하여 불순물을 분리하여, 원심분리 처리가 완료된 FBS 를 얻었다. 이어서, 얻어진 원심분리 처리가 완료된 FBS 5 ㎖ 에 Total Exosome Isolation (from serum)(서모피셔 사이언티픽사 제조) 을 1 ㎖ 첨가하고, 냉장으로 30 분간 정치하고, 원심분리 처리 (10000 × g, 20 분간) 하여 상청을 회수하여, Total Exosome Isolation 처리가 완료된 FBS 6 ㎖ 를 얻었다.
＜(2) 비즈의 세정＞
10 ㎍/㎕ Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (서모피셔 사이언티픽사 제조) 함유 PBS 용액 180 ㎕ (Dynabeads MyOne Streptavidin C1 1.8 ㎎ 함유) 를, 2 개의 튜브에 각각 분주하였다. 이어서, PBS 1500 ㎕ 를 튜브에 각각 더하고, 교반한 후, 튜브를 각각 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 을 집합시키고, 튜브 내의 용액을 피펫으로 버렸다 (이하, 세정 조작이라고 약기하는 경우가 있다).
＜(3) Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질의 비즈에의 고정＞
세정 조작 후의 펠릿 상태의 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 1.8 ㎎ 에, 실시예 5-8 과 동일한 방법에 의해 조제한 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 3 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 1500 ㎕ 를 첨가하고, 8 ℃ 에서 10 분간 반응시켜, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질이 결합한 담체 (mTim4 담체) 를 함유하는 PBS 용액 1500 ㎕ 를 각각 얻었다.
＜(4) 본 발명의 취득 방법에 의한 세포외막소포의 취득＞
얻어진 mTim4 담체 1.8 ㎎ 을 PBS 1500 ㎕ 로 각각 3 회 세정 조작하여, 펠릿 상태의 mTim4 담체를 얻었다. 그 후, 펠릿 상태의 mTim4 담체를 1.8 ㎎ 씩, 15 ㎖ 원심관 (CORNING 사 제조) 에 분주한 원심분리 처리가 완료된 FBS 5 ㎖ 또는 Total Exosome Isolation 처리가 완료된 FBS 6 ㎖ 에 각각 첨가하고, 8 ℃ 에서 2 시간 반응시켰다.
반응 후, 15 ㎖ 원심관을 각각 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 마우스 유래 Tim4 담체를 집합시키고, 각 상청 (각 FBS) 을 새로운 15 ㎖ 원심관에 각각 회수하였다. 원심관에 남은 펠릿 상태의 mTim4 담체를, 2 mM CaCl2 함유 TBS-T (Tris 버퍼, 0.0005 ％ 트윈20, 2 mM CaCl2) 3 ㎖ 로 각각 세정 조작 후, 펠릿 상태의 mTim4 담체에 2 mM CaCl2 함유 TBS-T 를 각각 1 ㎖ 첨가하여 현탁하고, 1.5 ㎖ 튜브에 현탁액을 전체량 옮긴 후, 각각 2 회 세정 조작하였다.
펠릿 상태의 각 mTim4 담체 1.8 ㎎ 에 용출액으로서 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 50 ㎕ 각각 첨가한 후, 볼텍스 믹서에 의해 실온에서 10 초간 혼합하고, 스핀 다운하였다. 1.5 ㎖ 튜브를 각각 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 mTim4 담체를 집합시키고, 용출액을 회수하였다. 재차 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 50 ㎕ 첨가하고, 상기에서 사용한 mTim4 담체를 사용하여 동일한 방법으로 용출액을 회수하였다.
그 후, 용출액을 2 번 회수했을 때에 사용한 mTim4 담체 (비즈) 를, 15 ㎖ 원심관에 회수하였다.
각 상청 (각 FBS) 에 재차 첨가하고, 상기한 것과 동일한 방법에 의해, 각 상청 (각 FBS) 중의 세포외막소포를 회수하는 조작을 추가로 2 회 반복하여 각 용출액을 각각 얻었다.
＜(5) 웨스턴 블롯팅＞
얻어진 각 용출액 300 ㎕ 를 30 ㎕ 가 되도록, VIVASPIN500 (MVCO10, 000)(자르토리우스사 제조) 을 사용하여 한외 여과하였다. 한외 여과한 각 용출액 30 ㎕ 에 4 × 시료용 완충액 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 10 ㎕ 를 더하여 98 ℃ 에서 5 분간 가열하여, 웨스턴 블롯팅용의 각 시료를 얻었다. 슈퍼 셉 에이스 5-20 ％ 겔 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 에 당해 웨스턴 블롯팅용 각 시료 20 ㎕ 를 2 지점씩 얹고, 25 mA 로 65 분간 전기 영동하였다. 얻어진 영동 겔을, 세미드라이 블로터와 불연속 버퍼 (애노드 버퍼 1 : 0.3 M Tris/20 ％ 메탄올, 애노드 버퍼 2 : 0.025 M Tris/20 ％ 메탄올, 캐소드 버퍼 : 0.025 M Tris/0.04 M 아미노카프로산/20 ％ 메탄올) 를 사용하여, PVDF 막 (Millipore 사 제조) 에 1 mA/㎠ 로 60 분간 전사하였다. 전사 후의 PVDF 막에 PBS-T (PBS 버퍼, 0.1 ％ 트윈20) 로 희석한 3 ％ 스킴 밀크를 더하여 1 시간 실온에서 반응시켜 블로킹하고, PBS-T 로 1000 배 희석한 항소 CD9 항체 (Novus Biologicals 사 제조, 이하 「항소 CD9 항체」라고 약기하는 경우가 있다) 2 ㎖ 또는 PBS-T 로 250 배 희석한 항인간 Flotillin-2 항체 (BD Biosciences 사 제조, 이하 「항인간 Flotillin-2 항체」라고 약기하는 경우가 있다) 를 실온에서 1 시간 반응시켰다. 반응 후의 PVDF 막을 PBS-T 로 3 회 세정하고, PBS-T 로 10000 배 희석한 2 차 항체 {항마우스 IgG(H ＋ L), 토끼, IgG 분획, 퍼옥시다아제 결합 항체](와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 를 실온에서 1 시간 반응시켰다. PBS-T 로 5 회 세정 후, 항소 CD9 항체를 반응시킨 멤브레인에 이뮤노스타베이직 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 을, 항Flotillin-2 항체를 반응시킨 멤브레인에 이뮤노스타제타 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 를 각각 첨가하고, LAS-4000 (GE 사 제조) 을 사용하여 발광 시그널을 검출하였다. 또한, 항소 CD9 항체는, 엑소좀의 마커 단백질의 하나인 CD9 에 대한 항체이고, 항인간 Flotillin-2 항체는, 엑소좀의 마커 단백질의 하나인 Flotillin-2 에 대한 항체이다.
또한, 각 실시예에서 사용한 시료의 처리 방법, 시료 중에 잔존하는 세포외막소포의 취득 방법 그리고 웨스턴 블롯팅에 있어서의 레인 번호에 대해 하기 표 18 에 나타낸다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 11 에 나타낸다. 도 11 에 있어서, 각 레인은 이하의 결과를 나타낸다.
레인 1 : 실시예 39 의 결과 (시료를 원심분리 처리한 후, 본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우의 결과)
레인 2 : 실시예 40 의 결과 (시료를 원심분리 처리하고, 폴리머 침전 처리한 후, 본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우의 결과)
도 11 로부터, 시료를 원심분리 처리하고, 폴리머 침전한 후, 본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우 (실시예 40) 에도 엑소좀 마커의 CD9 와 Flotillin-2 의 밴드가 확인된 것으로부터, Total Exsome Isolation (폴리머 침전) 법으로는 시료 중에 포함되는 세포외막소포를 다 제거 (취득) 할 수 없고, 시료 중에는 다량의 세포외막소포가 잔존하는 것을 알 수 있었다 (실시예 40 : 레인 2).
또한, Total Exsome Isolation (폴리머 침전) 법으로는 다 제거 (취득) 할 수 없어 시료 중에 잔존하는 세포외막소포를, 본 발명의 취득 방법에 의해서는 취득 가능한 것을 알 수 있었다 (실시예 40 : 레인 2).
실시예 41-47. 본 발명의 제거 방법 및/또는 종래법 (초원심법, Total Exsome Isolation (폴리머 침전) 법) 에 의한 시료로부터의 세포외막소포의 취득
(제거)
이하와 같이, 본 발명의 제거 방법 및/또는 종래법 (초원심법, Total Exsome Isolation (폴리머 침전) 법) 에 의해 시료로부터 세포외막소포를 취득 (제거) 하였다.
＜(1) 초원심분리법에 의한 세포외막소포의 제거＞
FBS (CORNING 사 제조) 28 ㎖ 를 원심분리 처리 (10000 × g, 20 분간) 하여 불순물을 분리하고, 원심분리 처리가 완료된 FBS (이하, 「제거 시료 1」이라고 약기하는 경우가 있다) 를 얻었다. 이어서, 얻어진 원심분리 처리가 완료된 FBS (「제거 시료 1」) 12 ㎖ 를 초원심분리 처리 (110000 × g, 하룻밤) 하여, 초원심분리 처리 (110000 × g) 가 완료된 FBS (이하, 「제거 시료 2」 라고 약기하는 경우가 있다) 를 얻었다.
＜(2) Total Exsome Isolation (폴리머 침전) 법에 의한 세포외막소포의 제거＞
다음으로, 원심분리 처리가 완료된 FBS (「제거 시료 1」) 8 ㎖ 에 Total Exosome Isolation (from serum)(서모피셔 사이언티픽사 제조) 을 1.6 ㎖ 첨가하고, 냉장으로 30 분간 각각 정치하고, 원심분리 처리 (10000 × g, 20 분간) 하여 각각 상청을 회수하고, Total Exosome Isolation 처리가 완료된 FBS (이하, 「제거 시료 3」이라고 약기하는 경우가 있다) 9.6 ㎖ 를 얻었다.
또, 초원심분리 처리 (110000 × g) 가 완료된 FBS (「제거 시료 2」) 4 ㎖ 에 Total Exosome Isolation 을 0.8 ㎖ 첨가하고, 냉장으로 30 분간 각각 가만히 정지시키고, 원심분리 처리 (10000 × g, 20 분간) 하여 각각 상청을 회수하여, 초원심분리 처리 (110000 × g)/Total Exosome Isolation 처리가 완료된 FBS (이하, 「제거 시료 4」라고 약기하는 경우가 있다) 4.8 ㎖ 를 얻었다.
＜(3) 비즈의 세정＞
10 ㎍/㎕ Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (서모피셔 사이언티픽사 제조) 함유 PBS 용액 240 ㎕ (Dynabeads MyOne Streptavidin C1 2.4 ㎎ 함유) 를, 3 개의 튜브에 각각 분주하였다. 이어서, PBS 2000 ㎕ 를 튜브에 각각 더하고, 교반한 후, 튜브를 각각 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 을 집합시키고, 튜브 내의 용액을 피펫으로 버렸다 (이하, 「세정 조작」이라고 약기하는 경우가 있다).
＜(4) Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질의 비즈에의 고정＞
세정 조작 후의 펠릿 상태의 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 2.4 ㎎ 에, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 4 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 2000 ㎕ 를 각각 첨가하고, 8 ℃ 에서 10 분간 반응시켜, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질이 결합한 담체 (mTim4 담체) 를 함유하는 PBS 용액 2000 ㎕ 를 각각 얻었다.
＜(5) 세포외막소포의 제거＞
얻어진 mTim4 담체 2.4 ㎎ 을 PBS 2000 ㎕ 로 각각 3 회 세정 조작하여, 펠릿상의 mTim4 담체를 각각 얻었다.
그 후, 원심분리 처리가 완료된 FBS (「제거 시료 1」) 또는 초원심분리 처리 (110000 × g) 가 완료된 FBS (「제거 시료 2」) 4 ㎖, Total Exosome Isolation 처리가 완료된 FBS (「제거 시료 3」) 4.8 ㎖ 를 튜브에 각각 분주하고, 8 ℃ 에서 1 시간 각각 반응시켰다. 반응 후, 튜브를 각각 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 mTim4 담체를 집합시키고, 각 상청 (각 FBS) 을 새로운 튜브에 각각 회수하였다.
튜브에 남은 펠릿 상태의 mTim4 담체를, TBS-T (Tris 버퍼, 0.0005 ％ 트윈20) 4 ㎖ 로 각각 3 회 세정 조작 후, 각 상청 (각 FBS) 을 각각 재차 첨가하고, 반응으로부터 세정까지의 조작을 각각 합계 5 회 반복하였다. 5 회째의 반응 후, 각 상청 (각 FBS) 을 새로운 튜브로 옮겨 원심분리 처리 (10000 × g, 20 분간) 하고, 상청을 회수하고, 초원심분리 처리 (110000 × g)/Tim4 처리가 완료된 FBS (이하, 「제거 시료 5」라고 약기하는 경우가 있다) 4 ㎖, Total Exosome Isolation 처리/Tim4 처리가 완료된 FBS (이하, 「제거 시료 6」이라고 약기하는 경우가 있다) 4.8 ㎖, Tim4 처리가 완료된 FBS (이하, 「제거 시료 7) 이라고 약기하는 경우가 있다) 4 ㎖ 를 얻었다.
＜(6) 본 발명의 취득 방법에 의한 세포외막소포의 취득＞
상기 방법과 동일한 방법에 의해, 새롭게 mTim4 담체 0.6 ㎎ 을 7 개분 준비하고, 각각 세정 조작을 실시하였다. 하기 표 19 에 기재된 소정의 제거 시료를 제거 시료의 마우스 유래 Tim4 담체에의 첨가량씩 각각 펠릿 상태의 mTim4 담체 0.6 ㎎ 에 첨가하고, 8 ℃ 에서 3 시간 각각 반응시켰다.
반응 후, 1.5 ㎖ 튜브를 각각 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 mTim4 담체를 집합시키고, 각 상청 (각 FBS) 을 회수하여, 펠릿 상태의 mTim4 담체를 얻었다.
얻어진 펠릿 상태의 mTim4 담체를 2 mM CaCl2 함유 TBS-T (Tris 버퍼, 0.0005 ％ 트윈20, 2 mM CaCl2) 1 ㎖ 로 각각 3 회 세정 조작 후, 펠릿 상태의 각 mTim4 담체 0.6 ㎎ 에 용출액으로서 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 50 ㎕ 각각 첨가하고, 볼텍스 믹서에 의해 실온에서 10 초간 혼합하고, 스핀 다운하였다. 1.5 ㎖ 튜브를 각각 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 mTim4 담체를 집합시키고, 용출액을 각각 회수하였다. 재차 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 50 ㎕ 첨가하고, 동일한 방법으로 용출액을 각각 회수하였다.
＜(7) 웨스턴 블롯팅＞
얻어진 각 용출액 중 100 ㎕ 를 30 ㎕ 가 되도록, VIVASPIN500 (MVCO10, 000)(자르토리우스사 제조) 을 사용하여 한외 여과하였다. 한외 여과한 각 용출액 30 ㎕ 에 4 × 시료용 완충액 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 10 ㎕ 를 더하여 98 ℃ 에서 5 분간 가열하여, 웨스턴 블롯팅용의 각 시료를 얻었다. 슈퍼 셉 에이스 5-20 ％ 겔 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 에 당해 웨스턴 블롯팅용의 각 시료 20 ㎕ 를 2 지점씩 얹고, 25 mA 로 65 분간 전기 영동하였다. 얻어진 영동 겔을, 세미드라이 블로터와 불연속 버퍼 (애노드 버퍼 1 : 0.3 M Tris/20 ％ 메탄올, 애노드 버퍼 2 : 0.025 M Tris/20 ％ 메탄올, 캐소드 버퍼 : 0.025 M Tris/0.04 M 아미노카프로산/20 ％ 메탄올) 를 사용하여, PVDF 막 (Millipore 사 제조) 에 1 mA/㎠ 로 60 분간 전사하였다. 전사 후의 PVDF 막에 PBS-T (PBS 버퍼, 0.1 ％ 트윈20) 로 희석한 3 ％ 스킴 밀크를 더하여 1 시간 실온에서 반응시켜 블로킹하고, PBS-T 로 1000 배 희석한 항소 CD9 항체 (Novus Biologicals 사 제조, 이하 「항소 CD9 항체」라고 약기하는 경우가 있다) 2 ㎖ 또는 PBS-T 로 250 배 희석한 항인간 Flotillin-2 항체 (BD Biosciences 사 제조, 이하 「항인간 Flotillin-2 항체」라고 약기하는 경우가 있다) 를 실온에서 1 시간 반응시켰다. 반응 후의 PVDF 막을 PBS-T 로 3 회 세정하고, PBS-T 로 10000 배 희석한 2 차 항체 {항마우스 IgG(H ＋L), 토끼, IgG 분획, 퍼옥시다아제 결합 항체](와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 를 실온에서 1 시간 반응시켰다. PBS-T 로 5 회 세정 후, 항소 CD9 항체를 반응시킨 멤브레인에 이뮤노스타베이직 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 을, 항Flotillin-2 항체를 반응시킨 멤브레인에 이뮤노스타제타 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 를 각각 첨가하고, LAS-4000 (GE 사 제조) 을 사용하여 발광 시그널을 검출하였다. 또한, 항소 CD9 항체는, 엑소좀의 마커 단백질의 하나인 CD9 에 대한 항체이고, 항인간 Flotillin-2 항체는, 엑소좀의 마커 단백질의 하나인 Flotillin-2 에 대한 항체이다.
또한, 각 실시예에서 사용한 시료의 처리 방법, 시료 중에 잔존하는 세포외막소포의 취득 (제거) 방법, 및 후술하는 웨스턴 블롯팅에 있어서의 레인 번호 등에 대해 하기 표 20 에 나타낸다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 12 에 나타낸다. 도 12 에 있어서, 각 레인은 이하의 결과를 나타낸다.
레인 1 : 실시예 41 의 결과 (시료를 원심분리 처리하고, 초원심분리 처리하고, 추가로 본 발명의 제거 방법으로 처리한 후, 본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우의 결과)
레인 2 : 실시예 42 의 결과 (시료를 원심분리 처리하고, 폴리머 침전 처리하고, 추가로 발명의 제거 방법으로 처리한 후, 본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우의 결과)
레인 3 : 실시예 43 의 결과 (시료를 원심분리 처리하고, 초원심분리 처리하고, 추가로 폴리머 침전 처리한 후, 본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우의 결과)
레인 4 : 실시예 44 의 결과 (시료를 원심분리 처리하고, 초원심분리 처리하고, 본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우의 결과)
레인 5 : 실시예 45 의 결과 (시료를 원심분리 처리하고, 폴리머 침전 처리하고, 본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우의 결과)
레인 6 : 실시예 46 의 결과 (시료를 원심분리 처리하고, 본 발명의 제거 방법으로 처리한 후, 본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우의 결과)
레인 7 : 실시예 47 의 결과 (시료를 원심분리 처리한 후, 본 발명의 취득 방법에 의해 세포외막소포의 취득을 실시한 경우의 결과)
도 12 로부터, 종래법인 초원심법, Total Exsome Isolation (폴리머 침전) 법에서는 엑소좀 마커인 CD9 와 Flotillin-2 의 밴드가 확인되고, 시료 중에 포함되는 세포외막소포를 다 제거할 수 없어, 시료 중에는 다량의 세포외막소포가 잔존하는 것을 알 수 있었다 (실시예 44-45 : 레인 4-5). 또, 예를 들어 이들 종래법을 조합했다고 해도, CD9 와 Flotillin-2 의 밴드가 확인되고, 세포외막소포를 충분히 제거할 수 없어 잔존해 버리는 것을 알 수 있다 (실시예 43 : 레인 3). 이에 대하여, 종래법인 초원심법 또는 Total Exsome Isolation (폴리머 침전) 법과 본 발명의 제거 방법을 조합함으로써, CD9 와 Flotillin-2 의 밴드는 확인되지 않고, 종래법만으로는 다 제거할 수 없는 시료 중의 세포외막소포를, 제거 (취득) 가능한 것을 알 수 있었다 (실시예 41-42 : 레인 1-2). 나아가서는, 본 발명 방법만으로도, CD9 와 Flotillin-2 의 밴드는 확인되지 않고, 충분히 세포외막소포를 제거 (취득) 가능한 것을 알 수 있었다 (실시예 46 : 레인 6). 또, 본 발명의 제거 (취득) 방법에 의하면, 바이러스에 대해서도 세포외막소포와 동일하게 제거 가능한 것이 시사되었다.
실시예 48-55. 본 발명의 제거 방법에 있어서의 본 발명의 Tim 담체의 재이용
이하와 같이, 본 발명의 Tim 담체를 사용하여 본 발명의 제거 방법을 반복하였다.
＜(1) 시료의 준비＞
FBS (CORNING 사 제조) 1 ㎖ 를 원심분리 처리 (10000 × g, 20 분간) 하여 불순물을 분리하고, 원심분리 처리가 완료된 FBS 1 ㎖ 를 얻었다.
＜(2) 비즈의 세정＞
10 ㎍/㎕ Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (서모피셔 사이언티픽사 제조) 함유 PBS 용액 60 ㎕ (Dynabeads MyOne Streptavidin C1 0.6 ㎎ 함유) 를, 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 에 분주하였다. 이어서, PBS 500 ㎕ 를 1.5 ㎖ 튜브에 각각 첨가하고, 교반한 후, 1.5 ㎖ 튜브를 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 을 집합시키고, 1.5 ㎖ 튜브 내의 용액을 피펫으로 버렸다 (이하, 세정 조작이라고 약기하는 경우가 있다).
＜(3) Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질의 비즈에의 고정＞
세정 조작 후의 펠릿 상태의 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 0.6 ㎎ 에, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 1 ㎍ 을 함유하는 PBS 용액 500 ㎕ 를 첨가하고, 8 ℃ 에서 10 분간 반응시켜, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질이 결합한 담체 (mTim4 담체) 를 함유하는 PBS 용액 500 ㎕ 를 얻었다.
＜(4) 본 발명의 제거 방법에 의한 세포외막소포의 제거＞
1.5 ㎖ 튜브를 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 mTim4 담체를 집합시키고, 1.5 ㎖ 튜브 내의 용액을 피펫으로 버린 후, mTim4 담체를 PBS 500 ㎕ 로 각각 3 회 세정 조작하여 펠릿 상태의 mTim4 담체를 얻었다. 그 후, 펠릿 상태의 mTim4 담체에, 원심분리 처리가 완료된 FBS 를 1 ㎖ 더하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다.
반응 후, 1.5 ㎖ 튜브를 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 mTim4 담체를 집합시키고, 상청 (FBS) 을 새로운 1.5 ㎖ 튜브에 회수하였다 (상청 1 로 한다). 펠릿 상태의 mTim4 담체를, 2 mM CaCl2 함유 TBS-T (Tris 버퍼, 0.0005 ％ 트윈20, 2 mM CaCl2) 500 ㎕ 로 3 회 세정 조작하였다.
펠릿 상태의 각 mTim4 담체 0.6 ㎎ 에 용출액으로서 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 50 ㎕ 첨가한 후, 볼텍스 믹서에 의해 실온에서 10 초간 혼합하고, 스핀 다운하였다. 1.5 ㎖ 튜브를 마그넷 스탠드에 설치하고, 자력을 이용하여 관벽에 mTim4 담체를 집합시키고, 용출액을 회수하였다 (용출액 1 로 한다). 당해 mTim4 담체에 재차 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 50 ㎕ 첨가하고, 동일한 방법으로 용출액을 회수하였다 (용출액 2 로 한다). 얻어진 용출액 1 과 용출액 2 를 혼합하여, 제거 시료 8 을 얻었다.
상기 상청 1 을 용출 조작 후 (용출액 2 를 얻는 용출 조작 후) 의 mTim4 담체에 재차 첨가하고, 상청 1 중의 세포외막소포를 회수하는 조작을 합계로 8 회 반복하여 각 용출액을 각각 얻었다.
얻어진 제거 시료 및 후술하는 웨스턴 블롯팅에 있어서의 레인 번호는 하기 표 21 에 기재된 바와 같다.
＜(5) 웨스턴 블롯팅＞
얻어진 각 용출액 100 ㎕ 를 30 ㎕ 가 되도록, VIVASPIN500 (MVCO10, 000)(자르토리우스사 제조) 을 사용하여 한외 여과하였다. 한외 여과한 각 용출액 15 ㎕ 에 4 × 시료용 완충액 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 5 ㎕ 를 더하고 98 ℃ 에서 5 분간 가열하여, 웨스턴 블롯팅용의 각 시료를 얻었다. 슈퍼 셉 에이스 5-20 ％ 겔 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 에 당해 웨스턴 블롯팅용의 각 시료 20 ㎕ 를 얹고, 25 mA 로 65 분간 전기 영동하였다. 얻어진 영동 겔을, 세미드라이 블로터와 불연속 버퍼 (애노드 버퍼 1 : 0.3 M Tris/20 ％ 메탄올, 애노드 버퍼 2 : 0.025 M Tris/20 ％ 메탄올, 캐소드 버퍼 : 0.025 M Tris/0.04 M 아미노카프로산/20 ％ 메탄올) 를 사용하여, PVDF 막 (Millipore 사 제조) 에 1 mA/㎠ 로 60 분간 전사하였다. 전사 후의 PVDF 막에 PBS-T (PBS 버퍼, 0.1 ％ 트윈20) 로 희석한 3 ％ 스킴 밀크를 더하여 1 시간 실온에서 반응시켜 블로킹하고, PBS-T 로 1000 배 희석한 항소 CD9 항체 (Novus Biologicals 사 제조, 이하 「항소 CD9 항체」라고 약기하는 경우가 있다) 2 ㎖ 를 실온에서 1 시간 반응시켰다. 반응 후의 PVDF 막을 PBS-T 로 3 회 세정하고, PBS-T 로 10000 배 희석한 2 차 항체 {항마우스 IgG(H ＋ L), 토끼, IgG 분획, 퍼옥시다아제 결합 항체](와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 를 실온에서 1 시간 반응시켰다. PBS-T 로 5 회 세정 후, 이뮤노스타제타 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 를 첨가하고, LAS-4000 (GE 사 제조) 을 사용하여 발광 시그널을 검출하였다. 또한, 항소 CD9 항체는, 엑소좀의 마커 단백질의 하나인 CD9 에 대한 항체이다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 13 에 나타낸다. 도 13 에 있어서, 각 레인은 이하의 결과를 나타낸다.
레인 1 : 실시예 48 의 결과 (시료 중의 세포외막소포를 미사용의 본 발명의 Tim4 담체를 사용하여 본 발명의 취득 제거에 의해 제거한 경우의 결과)
레인 2 : 실시예 49 의 결과 (1 번 사용한 시료 중의 세포외막소포를 1 번 사용한 본 발명의 Tim4 담체를 사용하여 본 발명의 취득 제거에 의해 제거한 경우의 결과)
레인 3 : 실시예 50 의 결과 (2 번 사용한 시료 중의 세포외막소포를 2 번 사용한 본 발명의 Tim4 담체를 사용하여 본 발명의 취득 제거에 의해 제거한 경우의 결과)
레인 4 : 실시예 51 의 결과 (3 번 사용한 시료 중의 세포외막소포를 3 번 사용한 본 발명의 Tim4 담체를 사용하여 본 발명의 취득 제거에 의해 제거한 경우의 결과)
레인 5 : 실시예 52 의 결과 (4 번 사용한 시료 중의 세포외막소포를 4 번 사용한 본 발명의 Tim4 담체를 사용하여 본 발명의 취득 제거에 의해 제거한 경우의 결과)
레인 6 : 실시예 53 의 결과 (5 번 사용한 시료 중의 세포외막소포를 5 번 사용한 본 발명의 Tim4 담체를 사용하여 본 발명의 취득 제거에 의해 제거한 경우의 결과)
레인 7 : 실시예 54 의 결과 (6 번 사용한 시료 중의 세포외막소포를 6 번 사용한 본 발명의 Tim4 담체를 사용하여 본 발명의 취득 제거에 의해 제거한 경우의 결과)
레인 8 : 실시예 55 의 결과 (7 번 사용한 시료 중의 세포외막소포를 7 번 사용한 본 발명의 Tim4 담체를 사용하여 본 발명의 취득 제거에 의해 제거한 경우의 결과)
도 13 으로부터, 본 발명의 Tim4 담체를 반복하여 사용해 제거 조작을 실시한 경우, 시료로부터 회수되는 엑소좀의 양이 적어지는 것이 확인되고, 본 발명의 Tim4 담체를 반복하여 이용함으로써, 세포외막소포의 제거를 보다 확실하게 실시할 수 있는 것을 알 수 있었다. 또, 칼슘 이온 킬레이트제인 EDTA 를 사용하여 담체에 결합한 Tim4 단백질과 시료 중의 세포외막소포의 복합체로부터 세포외막소포를 분리함으로써, 본 발명의 Tim4 담체는 재이용 가능하다는 것을 알 수 있었다.
실시예 56-67. 비교예 14-15. Tim 패밀리 단백질을 고정화한 담체에 의한 세포외막소포의 취득
이하와 같이, Tim 패밀리인 Tim1 단백질, Tim3 단백질, 또는 Tim4 단백질을 각각 비즈에 고정화한 담체를 사용하여, 본 발명에 관련된 세포외막소포의 취득을 실시하였다.
＜(1) 칼슘 이온 함유 배양 상청 (원액) 의 조제＞
세포외막소포를 분비하는 인간 만성 골수성 백혈병주 K562 세포 1 × 107 세포를 80 ㎖ 의 X-VIVO15 배지 (Lonza 사 제조) 를 사용하여 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 3 일간 배양한 후, 원심분리 처리 (300 × g, 5 분간) 하여 세포를 침전시키고, 상청을 제거하였다. 침전한 세포를, 10 μM 모넨신 나트륨 (MP Biomedicals 사 제조) 함유 X-VIVO15 배지 60 ㎖ 로 현탁 후, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 24 시간 배양하였다.
그 후, 배양액을 원심분리 처리 (300 × g, 5 분간) 하고, 배양 상청을 회수하였다. 회수한 배양 상청 60 ㎖ 를 추가로 3 회 원심분리 처리 (1 회째 : 300 × g, 3 분간, 2 회째 : 1200 × g, 20 분간, 3 회째 : 10000 × g, 20 분간) 하여 불순물을 분리하고, 상청을 얻었다 (이하, 「배양 상청 (원액)」이라고 약기하는 경우가 있다) 을 얻었다.
또, 얻어진 배양 상청 원액에 종농도가 2 mM 이 되도록 CaCl2 를 첨가하고, 2 mM CaCl2 함유 K562 세포 배양 상청 농축액 샘플 (이하, 「칼슘 이온 함유 배양 상청 (원액)」이라고 약기하는 경우가 있다) 을 얻었다.
＜(2) 비즈의 세정＞
30 ㎍/㎕ Dynabeads ProteinG (서모피셔 사이언티픽사 제조) 함유 PBS-T 용액 20 ㎕ (Dynabeads ProteinG 0.6 ㎎ 함유) 를, 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 7 개에 각각 옮기고, 각각 세정 조작을 하였다.
＜(3) Fc 태그 융합형 Tim 단백질의 비즈에의 고정＞
세정 조작 후의 펠릿 상태의 Dynabeads ProteiG 0.6 ㎎ 을 함유하는 1.5 ㎖ 튜브에, Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim1 단백질, Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim3 단백질, Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질, Fc 태그 융합형 인간 유래 Tim1 단백질, Fc 태그 융합형 인간 유래 Tim3 단백질, 또는 Fc 태그 융합형 인간 유래 Tim4 단백질 (모두 와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 을 1 ㎍ 함유하는 TBS 용액 200 ㎕ 를 각각 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켜, Fc 태그 융합형 mTim1 단백질 결합 담체, Fc 태그 융합형 mTim3 단백질 결합 담체, Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 결합 담체, Fc 태그 융합형 hTim1 단백질 결합 담체, Fc 태그 융합형 hTim3 단백질 결합 담체, 및 Fc 태그 융합형 hTim4 단백질 결합 담체를 각각 얻었다. 또한, 이들 얻어진 6 종류의 담체를 하기 표 22 에 나타낸다. 이들을 합쳐서 「Tim 단백질 결합 담체」라고 약기하는 경우가 있다.
＜(4) 본 발명의 방법에 의한 세포외막소포의 취득＞
상기에서 얻어진 6 종류의 Tim 단백질 결합 담체를 각각 TBS-T (Tris 버퍼, 0.1 ％ 트윈20) 500 ㎕ 로 3 회, TBS 500 ㎕ 로 2 회 세정 조작하여, 펠릿 상태의 Tim 단백질 결합 담체를 얻었다. 이어서, 펠릿 상태의 Tim 단백질 결합 담체 및 세정 조작만을 실시한 Dynabeads ProteinG (이하, 「Tim 단백질 비결합 담체」라고 약기하는 경우가 있다) 에, 상기 (1) 에서 조제한 칼슘 이온 함유 배양 상청 (원액) 1 ㎖ 를 각각 첨가하고, 8 ℃ 에서 3 시간 각각 반응시켰다.
그 후, 반응 후의 Tim 단백질 결합 담체 또는 Tim 단백질 비결합 담체를, 칼슘 이온 함유 TBS-T (Tris 버퍼, 0.0005 ％ 트윈20, 2 mM CaCl2) 500 ㎕ 로 각각 3 회 세정 조작하였다. 3 회째의 세정 조작 시에, Tim 단백질 결합 담체 또는 Tim 단백질 비결합 담체를 포함하는 CaCl2 함유 TBS-T 용액 500 ㎕ 를, 250 ㎕ 씩 1.5 ㎖ 튜브 2 개에 각각 분주하고, 튜브를 자기 스탠드에 세트한 후, 세정액을 제거하였다.
펠릿 상태의 Tim 단백질 결합 담체 또는 Tim 단백질 비결합 담체 0.3 ㎎ 에 각각 용출액으로서 1 ％ SDS 수용액을 50 ㎕, 또는 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 25 ㎕ 첨가한 후, 볼텍스 믹서에 의해 실온에서 10 초간 혼합하고, 스핀 다운하였다. EDTA 를 첨가한 튜브에는 재차 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 25 ㎕ 첨가하고, 동일한 조작을 실시하여, 각 상청 (용출액) 을 얻었다.
＜(5) 웨스턴 블롯팅＞
상기 (4) 에서 얻어진 각 상청 (각 용출액) 11.25 ㎕ 에 4 × 시료용 완충액 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 3.75 ㎕ 를 더하고 95 ℃ 에서 3 분간 가열하여, 웨스턴 블롯팅용의 각 시료를 얻었다. 슈퍼 셉 에이스 5-20 ％ 겔 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 에 당해 웨스턴 블롯팅용의 각 시료 15 ㎕ 를 얹고, 30 mA 로 60 분간 전기 영동하였다. 얻어진 영동 겔을, 세미드라이 블로터와 불연속 버퍼 (애노드 버퍼 1 : 0.3 M Tris/20 ％ 메탄올, 애노드 버퍼 2 : 0.025 M Tris/20 ％ 메탄올, 캐소드 버퍼 : 0.025 M Tris/0.04 M 아미노카프로산/20 ％ 메탄올) 를 사용하여, PVDF 막 (Millipore 사 제조) 에 1 mA/㎠ 로 60 분간 전사하였다. 전사 후의 PVDF 막에 TBS-T (TBS 버퍼, 0.1 ％ 트윈20) 로 희석한 5 ％ 스킴 밀크를 더하여 1 시간 실온에서 반응시켜 블로킹하고, TBS-T 로 250 배 희석한 항인간 Lamp-1 항체 (BD biosciences 사 제조), 250 배 희석한 항인간 Flotillin-2 항체 (BD biosciences 사 제조) 2 ㎖ 를 실온에서 1 시간 반응시켰다. 반응 후의 PVDF 막을 TBS-T 로 3 회 세정하고, TBS-T 로 5000 배 희석한 2 차 항체 {항마우스 IgG(H ＋ L), 토끼, IgG 획분, 퍼옥시다아제 결합 항체](와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 를 실온에서 1 시간 반응시켰다. TBS-T 로 5 회 세정 후, 각 항체를 반응시킨 PVDF 막에 이뮤노스타제타 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 를 첨가하고, LAS-4000 (GE 사 제조) 을 사용하여 발광 시그널을 검출하였다.
또한, 각 실시예, 비교예에서 사용한 Tim 단백질 및 담체의 종류, 그리고 Tim 단백질 (비)결합 담체로부터 세포외막소포를 취득하기 위해서 사용한 용출액의 종류를 하기 표 23 에 나타낸다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 14 에 나타낸다. 도 14 에 있어서, 각 레인은 이하와 같다.
레인 1 : 비교예 14 의 결과 (Dynabeads protein G 의 자성 비즈만의 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 2 : 비교예 15 의 결과 (Dynabeads protein G 의 자성 비즈만의 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 3 : 실시예 56 의 결과 (Dynabeads protein G 에 인간 유래 Tim1 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 4 : 실시예 57 의 결과 (Dynabeads protein G 에 인간 유래 Tim1 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 5 : 실시예 58 의 결과 (Dynabeads protein G 에 마우스 유래 Tim1 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 6 : 실시예 59 의 결과 (Dynabeads protein G 에 마우스 유래 Tim1 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 7 : 실시예 60 의 결과 (Dynabeads protein G 에 인간 유래 Tim3 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 8 : 실시예 61 의 결과 (Dynabeads protein G 에 인간 유래 Tim3 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 9 : 실시예 62 의 결과 (Dynabeads protein G 에 마우스 유래 Tim3 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 10 : 실시예 63 의 결과 (Dynabeads protein G 에 마우스 유래 Tim3 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 11 : 실시예 64 의 결과 (Dynabeads protein G 에 인간 유래 Tim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 12 : 실시예 65 의 결과 (Dynabeads protein G 에 인간 유래 Tim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 13 : 실시예 66 의 결과 (Dynabeads protein G 에 마우스 유래 Tim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 14 : 실시예 67 의 결과 (Dynabeads protein G 에 마우스 유래 Tim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
도 14 로부터, 레인 3-14 에 있어서, 엑소좀의 마커 단백질인 Lamp-1 또는 Flotillin-2 의 밴드가 보이고 있는 것으로부터, Tim1 단백질, Tim3 단백질 또는 Tim4 단백질을 결합시킨 담체 (본 발명의 Tim 단백질 결합 담체) 를 사용함으로써, 단백질의 유래나 용출 방법에 관계없이, 세포외막소포를 취득 가능한 것을 알 수 있었다.
또, SDS 에 의해 용출시키는 경우, Tim4 단백질을 결합시킨 담체 ＞ Tim1 단백질을 결합시킨 담체 ＞ Tim3 단백질을 결합시킨 담체의 순서로 보다 많은 세포외막소포를 취득할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 68-79. Tim 단백질을 고정화한 담체에 의한 세포외막소포의 취득
비오틴 표지한 Tim1 단백질, 비오틴 표지한 Tim3 단백질 또는 비오틴 표지한 Tim4 단백질을 각각 고정화한 담체를 사용하여, 본 발명에 관련된 세포외막소포의 취득을 실시하였다.
＜(1) 배양 상청 샘플의 조제＞
실시예 50-67, 비교예 14-15 의 「(1) 칼슘 이온 함유 배양 상청 (원액) 의 조제」와 동일한 방법에 의해 실시하여, 칼슘 이온 함유 배양 상청 (원액) 을 얻었다.
＜(2) Fc 태그 융합형 Tim1 단백질의 SH 기 비오틴 표지＞
Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim1 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 함유 PBS 용액 200 ㎕ (Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim1 단백질 20 ㎍ 함유) 를, 비오틴화 표지용 키트-SH (도진 화학 연구소 제조) 를 사용하고, 당해 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim1 단백질의 SH 기를 비오틴 표지하여, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim1 단백질 함유 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
＜(3) Fc 태그 융합형 Tim3 단백질의 SH 기 비오틴 표지＞
Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim3 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 함유 PBS 용액 200 ㎕ (Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim3 단백질 20 ㎍ 함유) 를, 비오틴화 표지용 키트-SH (도진 화학 연구소 제조) 를 사용하고, 당해 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim3 단백질의 SH 기를 비오틴 표지하여, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim3 단백질 함유 PBS 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
＜(4) Fc 태그 융합형 Tim4 단백질의 SH 기 비오틴 표지＞
Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 함유 PBS 용액 100 ㎕ (Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 10 ㎍ 함유) 를, 비오틴화 표지용 키트-SH (도진 화학 연구소 제조) 를 사용하고, 당해 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질의 SH 기를 비오틴 표지하여, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 100 ㎕ 를 얻었다.
＜(5) 태그 융합 Tim 단백질의 희석＞
Fc 태그 융합형 mTim1 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 함유 PBS 용액 10 ㎕ (Fc 태그 융합형 mTim1 단백질 1 ㎍ 함유) 를, TBS 190 ㎕ 와 혼합하여, 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim1 단백질을 1 ㎍ 함유하는 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
상기 (2) 에서 조제한 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim1 단백질 함유 TBS 용액 11.5 ㎕ (SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim1 단백질 1 ㎍ 함유) 를 TBS 188.5 ㎕ 와 혼합하여, 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim1 단백질을 1 ㎍ 함유하는 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
Fc 태그 융합형 mTim3 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 함유 PBS 용액 10 ㎕ (Fc 태그 융합형 mTim3 단백질 1 ㎍ 함유) 를, TBS 190 ㎕ 와 혼합하여, 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim3 단백질을 1 ㎍ 함유하는 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
상기 (3) 에서 조제한 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim3 단백질 함유 TBS 용액 9.0 ㎕ (SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim3 단백질 1 ㎍ 함유) 를 TBS 191.0 ㎕ 와 혼합하여, 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim3 단백질을 1 ㎍ 함유하는 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 함유 PBS 용액 10 ㎕ (Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 1 ㎍ 함유) 를, TBS 190 ㎕ 와 혼합하여, 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
상기 (4) 에서 조제한 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 TBS 용액 10 ㎕ (SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 1 ㎍ 함유) 를 TBS 190 ㎕ 와 혼합하여, 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
＜(6) 비즈의 세정＞
30 ㎍/㎕ Dynabeads ProteinG (서모피셔 사이언티픽사 제조) 함유 PBS-T 용액 20 ㎕ (Dynabeads ProteinG 0.6 ㎎ 함유) 를, 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 6 개에 각각 옮기고, 각각 세정 조작을 하였다.
또, 10 ㎍/㎕ Dynabeads M270 Streptabidin C1 (서모피셔 사이언티픽사 제조) 함유 PBS 용액 60 ㎕ (Dynabeads M270 Streptabidin C1 0.6 ㎎ 함유) 를, 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 에 각각 분주하고, TBS 500 ㎕ 를 사용하여 상기와 동일하게 세정 조작을 실시하였다.
＜(7) Fc 태그 융합형 Tim 단백질의 비즈에의 고정＞
세정 조작 후의 펠릿 상태의 Dynabeads ProteiG 0.6 ㎎ 을 함유하는 1.5 ㎖ 튜브 6 개에, SH 기 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim1 단백질을 1 ㎍ 함유하는 용액 200 ㎕, SH 기 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim3 단백질을 1 ㎍ 함유하는 용액 200 ㎕, 또는 SH 기 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 용액 200 ㎕ 를 각각 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 반응시켜, SH 기 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim1 이 결합한 담체 (「비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim1 담체」라고 약기하는 경우가 있다), SH 기 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim3 이 결합한 담체 (「비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim3 담체」라고 약기하는 경우가 있다), SH 기 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 가 결합한 담체 (「비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 담체」라고 약기하는 경우가 있다) 를 각각 얻었다.
또, 세정 조작 후의 Dynabeads M270 Streptabidin C1 0.6 ㎎ 을 함유하는 1.5 ㎖ 튜브에, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim1 단백질을 1 ㎍ 함유하는 용액 200 ㎕, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim3 단백질을 1 ㎍ 함유하는 용액 200 ㎕, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 용액 200 ㎕ 를 더하고, 상기와 동일하게 비즈에 결합시켜, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim1 이 결합한 담체 (「비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim1 담체」라고 약기하는 경우가 있다), SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 Tim3 이 결합한 담체 (「비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim3 담체」라고 약기하는 경우가 있다), SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 Tim4 가 결합한 담체 (「비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 담체」라고 약기하는 경우가 있다) 를 각각 얻었다.
또한, 이들 얻어진 6 종류의 담체를 합쳐서 「Tim 단백질 결합 담체」라고 약기하는 경우가 있다.
＜(8) 본 발명의 취득 방법에 의한 세포외막소포의 취득＞
상기에서 얻어진 이들 Tim 단백질 결합 담체를 TBS-T (Tris 버퍼, 0.1 ％ 트윈20) 500 ㎕ 로 3 회, TBS 500 ㎕ 로 2 회 각각 세정 조작하여, 펠릿 상태의 Tim 단백질 결합 담체를 얻었다. 이어서, 얻어진 6 종류의 펠릿 상태의 Tim 단백질 결합 담체에, 칼슘 이온 함유 배양 상청 (원액) 1 ㎖ 를 각각 더하고, 8 ℃ 에서 3 시간 각각 반응시켰다. 그 후, 반응 후의 Tim 단백질 결합 담체를, 칼슘 이온 함유 TBS-T (Tris 버퍼, 0.0005 ％ 트윈20, 2 mM CaCl2) 500 ㎕ 로 각각 3 회 세정 조작하였다. 3 회째의 세정 조작 시에, Tim 단백질 결합 담체를 포함하는 CaCl2 함유 TBS-T 용액 500 ㎕ 를 250 ㎕ 씩 1.5 ㎖ 튜브 2 개에 각각 분주하고, 튜브를 자기 스탠드에 세트한 후, 세정액을 제거하였다.
펠릿 상태의 6 종류의 Tim 단백질 결합 담체 0.3 ㎎ 에 각각 용출액으로서 1 ％ SDS 수용액을 50 ㎕, 또는 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 25 ㎕ 첨가한 후, 볼텍스 믹서에 의해 실온에서 10 초간 혼합하고, 스핀 다운하였다. EDTA 를 첨가한 튜브에는 재차 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 25 ㎕ 첨가하고, 동일한 조작을 실시하여, 용출액을 얻었다.
또한, 각 실시예에서 사용한 Tim 단백질 및 담체의 종류, 그리고 Tim 단백질 (비)결합 담체의 종류를 하기 표 24 에 나타낸다.
＜(9) 웨스턴 블롯팅＞
실시예 56-67 의 ＜(5) 웨스턴 블롯팅＞ 에 있어서 「상기 (4) 에서 얻어진 각 용출액 11.25 ㎕」대신에 상기 (6) 에서 얻어진 각 용출액 11.25 ㎕ 를 사용하고, 2 차 항체로서 「2 차 항체 {항마우스 IgG(H ＋ L), 토끼, IgG 획분, 퍼옥시다아제 결합 항체](와코 준야쿠 공업 (주) 제조)」대신에 TBS-T 로 30000 배 희석한 「2 차 항체 {항마우스 IgG(H ＋ L), 당나귀, IgG 획분, 퍼옥시다아제 결합 항체] (Jackson ImmunoResearch 사 제조)」를 사용한 것 이외에는, 실시예 56-67 의 「(5) 웨스턴 블롯팅」과 동일한 방법에 의해 실시하였다.
또한, 각 실시예에서 사용한 Tim 단백질 및 담체의 종류, Tim 단백질 (비)결합 담체로부터 세포외막소포를 취득하기 위해서 사용한 용출액의 종류, 그리고 웨스턴 블롯팅에 있어서의 레인 번호를 하기 표 25 에 나타낸다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 15 에 나타낸다. 도 15 에 있어서, 각 레인은 이하의 결과이다.
레인 1 : 실시예 68 의 결과 (Dynabeads protein G 에 SH 기 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim1 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 2 : 실시예 69 의 결과 (Dynabeads protein G 에 SH 기 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim1 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 3 : 실시예 70 의 결과 (Dynabeads M270 Streptavidin 에 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim1 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 4 : 실시예 71 의 결과 (Dynabeads M270 Streptavidin 에 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim1 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 5 : 실시예 72 의 결과 (Dynabeads protein G 에 SH 기 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim3 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 6 : 실시예 73 의 결과 (Dynabeads protein G 에 SH 기 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim3 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 7 : 실시예 74 의 결과 (Dynabeads M270 Streptavidin 에 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim3 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 8 : 실시예 75 의 결과 (Dynabeads M270 Streptavidin 에 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim3 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 9 : 실시예 76 의 결과 (Dynabeads protein G 에 SH 기 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 10 : 실시예 77 의 결과 (Dynabeads protein G 에 SH 기 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 11 : 실시예 78 의 결과 (Dynabeads M270 Streptavidin 에 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 12 : 실시예 79 의 결과 (Dynabeads M270 Streptavidin 에 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
도 15 로부터, 레인 1-12 에 있어서, 어느 경우에서도 엑소좀의 마커 단백질인 Lamp-1 의 밴드가 보인 점에서, Tim1, Tim3, 또는 Tim4 를 결합시킨 담체 (Tim 단백질 결합 담체) 를 사용함으로써, 세포외막소포를 취득 가능한 것을 알 수 있었다.
또, Tim4 단백질이 결합한 담체 ＞ Tim1 단백질이 결합한 담체 ＞ Tim3 단백질이 결합한 담체의 순서로 보다 많은 세포외막소포를 취득할 수 있는 것을 알 수 있었다. 칼슘 킬레이트제에 의해 용출시키는 경우에는, Tim4 단백질의 SH 기를 개재하여 비즈 (담체) 에 고정화시킴으로써, 태그를 개재하여 고정화시키는 것보다 많은 세포외막소포를 취득할 수 있는 것을 알 수 있었다 (레인 9-12).
실시예 80-83. 비교예 16-19. Tim 패밀리 단백질을 고정화한 담체에 의한 세포외막소포의 취득
Tim 패밀리 단백질로서 Tim1 단백질, Tim2 단백질, 또는 Tim4 단백질을 각각 비즈에 고정화한 담체를 사용하여, 본 발명에 관련된 세포외막소포의 취득을 실시하였다.
＜(1) 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플의 조제＞
실시예 1-8 의 「(1) 배양 상청 샘플의 조제」와 동일한 방법으로 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플을 얻었다.
＜(2) 비즈의 세정＞
30 ㎍/㎕ Dynabeads ProteinG (서모피셔 사이언티픽사 제조) 함유 PBS-T 용액 20 ㎕ (Dynabeads ProteinG 4.8 ㎎ 함유) 를, 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 4 개에 각각 분주하고, 각각 세정 조작을 하였다.
＜(3) 6 × His 태그 융합형 Tim 패밀리 단백질의 비즈에의 고정＞
세정 조작 후의 펠릿 상태의 Dynabeads ProteiG 0.6 ㎎ 을 함유하는 1.5 ㎖ 튜브 4 개에, 항6 × His 항체 (클론 No.28-75, 와코 준야쿠 공업사 제조) 를 4 ㎍ 함유하는 TBS 용액 100 ㎕ 를 각각 첨가하고, 8 ℃ 에서 30 분간 각각 반응시켜, 항6 × His 항체가 결합한 담체를 함유하는 TBS 용액 100 ㎕ 를 얻었다. 이들 항6 × His 항체가 결합한 담체를 TBS-T (Tris 버퍼, 0.1 ％ 트윈20) 250 ㎕ 로 각각 3 회 세정 조작하고, 그 후 TBS 250 ㎕ 로 각각 2 회 세정 조작하였다.
이어서, 세정 조작 후의 항6 × His 항체 결합 Dynabeads ProteinG 담체에, 6 × His 태그 융합형 마우스 유래 Tim1 단백질 (R & D 시스템즈사 제조) 을 1 ㎍ 함유하는 TBS 용액 100 ㎕, 6 × His 태그 융합형 마우스 유래 Tim2 단백질 (R & D 시스템즈사 제조) 을 1 ㎍ 함유하는 TBS 용액 100 ㎕, 또는 6 × His 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 (R & D 시스템즈사 제조) 을 1 ㎍ 함유하는 TBS 용액 100 ㎕ 를 각각 첨가하고, 8 ℃ 에서 1 시간 각각 반응시켜, 항6 × His 항체를 개재하여 Tim1 단백질이 결합한 담체 (「6 × His 태그 융합형 mTim1 단백질 결합 담체」라고 약기하는 경우가 있다), Tim2 단백질이 결합한 담체 (「6 × His 태그 융합형 mTim2 단백질 결합 담체」라고 약기하는 경우가 있다), Tim4 단백질이 결합한 담체 (「6 × His 태그 융합형 mTim4 단백질 결합 담체」라고 약기하는 경우가 있다) 를 각각 얻었다.
또한, 얻어진 6 × His 융합형 mTim1 단백질 결합 담체 및 6 × His 융합형 mTim4 단백질 결합 담체를 합쳐서 「Tim 단백질 결합 담체」라고 약기하는 경우가 있다.
각 실시예에서 사용한 Tim 단백질 및 담체의 종류, 그리고 Tim 패밀리 단백질 (비)결합 담체의 종류를 하기 표 26 에 나타낸다.
＜(4) 본 발명의 취득 방법에 의한 세포외막소포의 취득＞
상기 (3) 에서 얻어진 항6 × His 항체 결합 Dynabeads ProteinG 담체, 6 × His 태그 융합형 mTim1 단백질 결합 담체, 6 × His 태그 융합형 mTim2 단백질 결합 담체, 6 × His 태그 융합형 mTim2 단백질 결합 담체를 TBS-T (Tris 버퍼, 0.1 ％ 트윈20) 250 ㎕ 로 3 회, TBS 250 ㎕ 로 2 회 각각 세정 조작하여, 펠릿 상태의 각 담체를 얻었다. 그 후, 펠릿 상태의 각 담체에, 칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플 200 ㎕ 를 각각 첨가하고, 8 ℃ 에서 3 시간 각각 반응시켰다. 반응 후의 각 담체를, 칼슘 이온 함유 TBS-T (Tris 버퍼, 0.0005 ％ 트윈20, 2 mM CaCl2) 500 ㎕ 로 3 회 세정 조작하였다. 3 회째의 세정 조작 시에, 각 담체를 포함하는 CaCl2 함유 TBS-T 용액 500 ㎕ 를, 250 ㎕ 씩 1.5 ㎖ 튜브 2 개에 각각 분주하고, 튜브를 자기 스탠드에 세트한 후, 세정액을 제거하였다.
펠릿 상태의 각 담체 0.3 ㎎ 씩에 각각 용출액으로서 1 ％ SDS 수용액을 50 ㎕, 또는 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 25 ㎕ 첨가한 후, 볼텍스 믹서에 의해 실온에서 10 초간 혼합하고, 스핀 다운하였다. EDTA 를 첨가한 튜브에는 재차 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 25 ㎕ 첨가하고, 동일한 조작을 실시하여, 용출액을 얻었다.
＜(5) 웨스턴 블롯팅＞
상기 (4) 에서 얻어진 각 용출액 11.25 ㎕ 를 사용한 것 이외에는, 실시예 68-79 의 「(7) 웨스턴 블롯팅」과 동일한 방법에 의해 실시하였다.
또한, 각 실시예에서 사용한 Tim 패밀리 단백질 및 담체의 종류, Tim 단백질 (비)결합 담체로부터 세포외막소포를 취득하기 위해서 사용한 용출액의 종류, 그리고 웨스턴 블롯팅에 있어서의 레인 번호를 하기 표 27 에 나타낸다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 16 에 나타낸다. 도 16 에 있어서, 각 레인은 이하의 결과를 나타낸다.
레인 1 : 비교예 16 의 결과 (Dynabeads protein G 에 항6 × His 항체를 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 2 : 비교예 17 의 결과 (Dynabeads protein G 에 항6 × His 항체를 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 3 : 실시예 80 의 결과 (Dynabeads protein G 에 항 6 × His 항체를 개재하여 6 × His 태그 융합형 mTim1 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 4 : 실시예 81 의 결과 (Dynabeads protein G 에 항6×His 항체를 개재하여 6 × His 태그 융합형 mTim1 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 5 : 비교예 18 의 결과 (Dynabeads protein G 에 항6 × His 항체를 개재하여 6 × His 태그 융합형 mTim2 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 6 : 비교예 19 의 결과 (Dynabeads protein G 에 항6 × His 항체를 개재하여 6 × His 태그 융합형 mTim2 단백질을 결합시킨 담체를 이용하여 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 7 : 실시예 82 의 결과 (Dynabeads proteinG 에 항6×His 항체를 개재하여 6 × His 태그 융합형 mTim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 8 : 실시예 83 의 결과 (Dynabeads protein G 에 항 6 × His 항체를 개재하여 6 × His 태그 융합형 mTim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
도 16 으로부터, 6 × His 태그 융합형 Tim2 단백질을 결합시킨 경우는, 어느 용출법에서도 엑소좀 마커 단백질의 Lamp-1 의 밴드가 보이지 않았다 (레인 5-6). 한편, 6 × His 태그 융합형 mTim1 단백질, 또는 6 × His 태그 융합형 mTim4 단백질을 결합시킨 담체는, 어느 용출법에서도 엑소좀의 마커 단백질인 항Lamp-1 의 밴드가 보였다 (레인 3-4, 레인 7-8). 이 결과로부터, Tim2 단백질을 고정화한 담체에서는, 세포외막소포를 취득 불가능한 것을 알 수 있었다.
또, SDS 에 의해 용출시키는 경우에는, Tim4 단백질을 결합시킨 담체 ＞ Tim1 단백질을 결합시킨 담체의 순서로 보다 많은 세포외막소포를 취득할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 84-95. 비교예 20-21. Tim 단백질을 고정화한 담체에 의한 바이러스의 취득
이하와 같이, Tim 단백질로서 Tim1 단백질, Tim3 단백질 또는 Tim4 단백질을 각각 비즈에 고정화한 담체를 사용하여, 본 발명에 관련된 바이러스의 취득을 실시하였다.
＜(1) 코트랜스펙션 세포 배양 상청의 조제＞
25 ㎠ 플라스크에 파종한 1.0 × 106 cells 의 Sf9 세포에, 마우스 IL23 발현 벡터 DNA 약 2 ㎍, Linear AcNPV DNA 90 ng, 및 TransIT-Insect (Mirus 사) 3 ㎕ 를 포함하는 PSFM-J1 배지 (와코 준야쿠 공업사 제조) 100 ㎕ 를 첨가하였다. 28 ℃ 에서 7 일간 배양 후, 배양 상청 (코트랜스펙션 용액) 을 회수하였다.
＜(2) 바큘로 바이러스 함유 곤충 세포 배양 상청 샘플의 조제＞
1.5 × 106 cells/㎖ 가 되도록 PSFM-J1 배지로 희석한 Sf9 세포를 50 ㎖ 준비하였다. 이것에 상기 코트랜스펙션 용액을 배양액의 1/200 량 더하고, 130 rpm, 27 ℃ 에서 진탕 배양하였다. 72 시간 후에 세포 배양액을 회수하고, 3,000 × g, 4 ℃ 에서 30 분간 원심분리 후, 침전과 상청으로 분획하였다. 얻어진 상청을 mouse IL23 을 발현하는 재조합 바큘로 바이러스 용액 (이하, 「바큘로 바이러스 용액」이라고 약기하는 경우가 있다) 으로 하였다.
또, 얻어진 바큘로 바이러스 용액에 종농도가 2 mM 이 되도록 CaCl2 를 첨가하여, 2 mM CaCl2 함유 바큘로 바이러스 용액 (이하, 「칼슘 이온 함유 바큘로 바이러스 용액」이라고 약기하는 경우가 있다) 을 얻었다.
＜(3) 비즈의 세정＞
실시예 56-67 및 비교예 14-15 의 「(2) 비즈의 세정」과 동일한 방법으로 실시하였다.
＜(4) Fc 태그 융합형 Tim 단백질의 비즈에의 고정＞
실시예 56-67 및 비교예 14-15 의 「(3) Fc 태그 융합형 Tim 단백질의 비즈에의 고정」과 동일한 방법으로 실시하여, 하기 표 28 에 나타내는 바와 같이 6 종의 Tim 단백질 결합 담체를 얻었다.
＜(5) 본 발명 방법에 의한 바큘로 바이러스의 취득＞
「칼슘 이온 함유의 배양 상청 샘플 1 ㎖」 대신에 「상기 (2) 에서 조제한 칼슘 이온 함유 바큘로 바이러스 용액 1 ㎖」를 사용한 것 이외에는, 실시예 56-67 및 비교예 14-15 의 「(4) 본 발명의 방법에 의한 세포외막소포의 취득」과 동일하게 실시하여, 각 용출액을 얻었다.
＜(6) 웨스턴 블롯팅＞
「TBS-T 로 250 배 희석한 항인간 Lamp-1 항체 (BD biosciences 사 제조), 250 배 희석한 항인간 Flotillin-2 항체 (BD biosciences 사 제조) 2 ㎖」 대신에 「TBS-T 로 500 배 희석한 항바큘로 바이러스 gp64 항체 (Novus Biologicals 사 제조)」를 사용한 것 이외에는, 실시예 56-67 및 비교예 14-15 의 「(5) 웨스턴 블롯팅」과 동일한 방법으로 실시하였다.
또한, 각 실시예, 비교예에서 사용한 Tim 단백질 및 담체의 종류, Tim 단백질 (비)결합 담체로부터 세포외막소포를 취득하기 위해서 사용한 용출액의 종류, 그리고 웨스턴 블롯팅에 있어서의 레인 번호를 하기 표 29 에 나타낸다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 17 에 나타낸다. 도 17 에 있어서, 각 레인은 이하의 결과를 나타낸다.
레인 1 : 비교예 20 의 결과 (Dynabeads protein G 의 자성 비즈만의 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 2 : 비교예 21 의 결과 (Dynabeads protein G 의 자성 비즈만의 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 3 : 실시예 84 의 결과 (Dynabeads protein G 에 hTim1 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 4 : 실시예 85 의 결과 (Dynabeads protein G 에 hTim1 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 5 : 실시예 86 의 결과 (Dynabeads protein G 에 mTim1 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 6 : 실시예 87 의 결과 (Dynabeads protein G 에 mTim1 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 7 : 실시예 88 의 결과 (Dynabeads protein G 에 hTim3 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 8 : 실시예 89 의 결과 (Dynabeads protein G 에 hTim3 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 9 : 실시예 90 의 결과 (Dynabeads protein G 에 mTim3 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 10 : 실시예 91 의 결과 (Dynabeads protein G 에 mTim3 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 11 : 실시예 92 의 결과 (Dynabeads protein G 에 hTim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 12 : 실시예 93 의 결과 (Dynabeads protein G 에 hTim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 13 : 실시예 94 의 결과 (Dynabeads protein G 에 mTim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 14 : 실시예 95 의 결과 (Dynabeads protein G 에 mTim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
도 17 로부터, 레인 3-14 에 있어서, 바큘로 바이러스의 마커 단백질 gp64 의 밴드가 보이고 있는 점에서, Tim1 단백질, Tim3 단백질, 또는 Tim4 단백질을 결합시킨 담체 (Tim 단백질 결합 담체) 를 사용함으로써, Tim 단백질의 유래나 용출 방법에 관계없이 바큘로 바이러스를 취득 가능한 것을 알 수 있었다.
또, SDS 에 의해 용출시키는 경우에는, Tim3 단백질을 결합시킨 담체와 Tim4 단백질을 결합시킨 담체가 동일 정도이고, 이어서 Tim1 단백질을 결합시킨 담체의 순서로 보다 많은 바이러스를 취득할 수 있는 것을 알 수 있었다.
칼슘 이온 킬레이트제를 사용하여 용출시키는 경우에는, Tim3 단백질을 결합시킨 담체가 가장 많고, 이어서 Tim1 단백질을 결합시킨 담체와 Tim4 단백질을 결합시킨 담체의 순서로 보다 많은 바이러스를 취득할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 96-99. 비교예 22-25. Tim 패밀리 단백질을 고정화한 담체에 의한 바이러스의 취득
이하와 같이, Tim 패밀리 단백질로서, Tim1 단백질, Tim2 단백질, 또는 Tim4 단백질을 각각 비즈에 고정화한 담체를 사용하여, 본 발명에 관련된 바이러스의 취득을 실시하였다.
＜(1) 코트랜스펙션 세포 배양 상청의 조제＞
실시예 84-95, 비교예 20-21 의 「(1) 코트랜스펙션 세포 배양 상청의 조제」와 동일하게 실시하였다.
＜(2) 칼슘 이온 함유 바큘로 바이러스 함유 곤충 세포 배양 상청 샘플의 조제＞
실시예 84-95, 비교예 20-21 의 「(2) 바큘로 바이러스 함유 곤충 세포 배양 상청 샘플의 조제」와 동일한 방법으로 칼슘 이온 함유 바큘로 바이러스 용액 얻었다.
＜(3) 비즈의 세정＞
30 ㎍/㎕ Dynabeads ProteinG (서모피셔 사이언티픽사 제조) 함유 PBS-T 용액 20 ㎕ (Dynabeads ProteinG 4.8 ㎎ 함유) 를, 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 4 개에 각각 분주하고, 각각 세정 조작을 하였다.
＜(4) 6 × His 태그 융합형 Tim 패밀리 단백질의 비즈에의 고정＞
실시예 80-83 및 비교예 16-19 의 「(3) 6 × His 태그 융합형 Tim 패밀리 단백질의 비즈에의 고정」과 동일하게 실시하여, 6 × His 태그 융합형 mTim1 단백질 결합 담체, 6 × His 태그 융합형 mTim2 단백질 결합 담체, 6 × His 태그 융합형 mTim4 단백질 결합 담체를 각각 얻었다.
각 실시예에서 사용한 Tim 패밀리 단백질 및 담체의 종류, 그리고 Tim 패밀리 단백질 (비)결합 담체의 종류를 하기 표 30 에 나타낸다.
＜(5) 본 발명의 취득 방법에 의한 바큘로 바이러스의 취득＞
「칼슘 이온 함유 배양 상청 샘플 200 ㎕」대신에 상기 (2) 에서 조제한 「칼슘 이온 함유 바큘로 바이러스 용액 200 ㎕」를 사용한 것 이외에는, 실시예 80-83 및 비교예 16-19 의 「(4) 본 발명의 취득 방법에 의한 세포외막소포의 취득」과 동일한 방법으로 실시하여, 용출액을 얻었다.
＜(6) 웨스턴 블롯팅＞
「얻어진 각 용출액 11.25 ㎕ 에 4 × 시료용 완충액 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 3.75 ㎕ 를 더하고」 대신에 「상기 (5) 본 발명의 취득 방법에 의한 바큘로 바이러스의 취득에서 얻어진 각 용출액 3 ㎕ 에 4 × 시료용 완충액 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 1 ㎕ 를 더하고」, 「웨스턴 블롯팅용의 각 시료 15 ㎕」 대신에 「웨스턴 블롯팅용의 각 시료 4 ㎕」를 사용하고, 「항Lamp-1 항체」 대신에 「항바큘로 바이러스 gp64 항체」를 사용한 것 이외에는, 실시예 80-83 및 비교예 16-19 의 「(5) 웨스턴 블롯팅」과 동일한 방법으로 실시하였다.
또한, 각 실시예에서 사용한 Tim 패밀리 단백질 및 담체의 종류, Tim 패밀리 단백질 (비)결합 담체로부터 세포외막소포를 취득하기 위해서 사용한 용출액의 종류, 그리고 웨스턴 블롯팅에 있어서의 레인 번호를 하기 표 31 에 나타낸다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 18 에 나타낸다. 도 18 에 있어서, 각 레인은 이하의 결과를 나타낸다.
레인 1 : 비교예 22 의 결과 (Dynabeads protein G 에 항6 × His 태그 항체를 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 2 : 비교예 23 의 결과 (Dynabeads protein G 에 항6 × His 태그 항체를 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 3 : 실시예 96 의 결과 (Dynabeads protein G 에 항6 × His 태그 항체를 개재하여 6 × His 태그 융합형 mTim1 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 4 : 실시예 97 의 결과 (Dynabeads protein G 에 항 6 × His 태그 항체를 개재하여 6 × His 태그 융합형 mTim1 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 5 : 비교예 24 의 결과 (Dynabeads protein G 에 항 6 × His 태그 항체를 개재하여 6 × His 태그 융합형 mTim2 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 6 : 비교예 25 의 결과 (Dynabeads protein G 에 항 6 × His 태그 항체를 개재하여 6 × His 태그 융합형 mTim2 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 7 : 실시예 98 의 결과 (Dynabeads protein G 에 항6 × His 태그 항체를 개재하여 6 × His 태그 융합형 mTim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 8 실시예 99 의 결과 (Dynabeads protein G 에 항 6 × His 태그 항체를 개재하여 6 × His 태그 융합형 mTim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
도 18 로부터, Tim2 단백질을 결합시킨 경우는, 어느 용출법에서도 바큘로 바이러스의 마커 단백질 gp64 의 밴드는 보이지 않았다 (레인 5-6). 한편, Tim1 단백질, 또는 Tim4 단백질을 결합시킨 담체는, 어느 용출법에서도 gp64 의 밴드가 보였다 (레인 3-4, 레인 7-8).
이 결과로부터, Tim2 단백질을 고정화한 담체에서는, 바큘로 바이러스를 취득 불가능한 것을 알 수 있었다.
실시예 100-105. 비교예 26-33. PS 단백질을 사용한 ELISA 에 의한 세포외막소포의 검출에 있어서의 감도 비교
이하와 같이, PS 단백질 또는 엑소좀의 표면 마커 단백질 (이하, 「마커 단백질」이라고 약기하는 경우가 있다) 에 대한 항체를 고정화한 플레이트 (웰) 및 HRP 표지 항CD63 항체를 검출 항체에 사용한 샌드위치 ELISA 를 실시하여, K562 세포 배양 상청 유래의 세포외막소포를 검출하였다.
＜(1) 배양 상청 (원액) 의 조제＞
세포외막소포를 분비하는 인간 만성 골수성 백혈병주 K562 세포 1 × 107 세포를 80 ㎖ 의 X-VIVO15 배지 (Lonza 사 제조) 를 사용하여 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 3 일간 배양한 후, 원심분리 처리 (300 × g, 5 분간) 하여 세포를 침전시키고, 상청을 제거하였다. 침전한 세포를, 10 μM 모넨신 나트륨 (MP Biomedicals 사 제조) 함유 X-VIVO15 배지 60 ㎖ 로 현탁 후, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 24 시간 배양하였다.
그 후, 배양액을 원심분리 처리 (300 × g, 5 분간) 하고, 배양 상청을 회수하였다. 회수한 배양 상청 60 ㎖ 를 추가로 3 회 원심분리 처리 (1 회째 : 300 × g, 3 분간, 2 회째 : 1200 × g, 20 분간, 3 회째 : 10000 × g, 20 분간) 하여 불순물을 분리하고, 상청을 얻었다 (이하, 「배양 상청 (원액)」이라고 약기하는 경우가 있다).
＜(2) 칼슘 이온 함유 K562 세포 배양 상청 초원심 침전 획분 희석 계열의 조제＞
상기 (1) 에서 얻어진 배양 상청 원액 10 ㎖ 를 원심분리 처리 (10000 × g, 20 분간) 하여 불순물을 분리하고, 상청을 새로운 튜브로 옮겨 원심분리 처리가 완료된 K562 세포 배양 상청 10 ㎖ 를 얻었다. 이어서, 얻어진 원심분리 처리가 완료된 K562 세포 배양 상청 10 ㎖ 를 초원심분리 처리 (110000 × g, 70 분간) 하고, 상청을 제거한 후, 침전에 TBS 를 10 ㎖ 더하고 현탁하였다. 현탁액을 초원심분리 처리 (110000 × g, 70 분간) 하고, 상청을 제거한 후, 침전에 TBS 를 200 ㎕ 더하고 현탁하여, K562 세포 배양 상청 초원심 침전 획분을 얻었다. K562 세포 배양 상청 초원심 침전 획분의 단백질 농도를, 프로틴 어세이 BCA 키트 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 를 사용하여 당해 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 측정하였다. 단백질 농도가 125, 250, 500, 1000, 2000 ng/㎖ 가 되도록 각각 2 mM CaCl2 함유 TBS 로 희석하여, 칼슘 이온 함유 K562 세포 배양 상청 초원심 침전 획분 희석 계열을 조제하였다.
＜(3) HRP 표지 항CD63 마우스 모노클로날 항체의 조제＞
항CD63 마우스 모노클로날 항체 H5C6 (BD bioscience 사 제조) 100 ㎕ (50 ㎍) 를, Peroxidase Labeling Kit-NH2 ((주) 도진 화학 연구소 제조) 를 사용하여, 당해 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 HRP 표지하여, HRP 표지 항CD63 마우스 모노클로날 항체 200 ㎕ 를 얻었다. 얻어진 표지체에 글리세롤 200 ㎕ 를 첨가 혼합하고, HRP 표지 항CD63 마우스 모노클로날 항체 보존액으로 하여 -20 ℃ 에서 보존하였다. HRP 표지 항CD63 마우스 모노클로날 항체 보존액을 2 mM CaCl2 함유 TBS 로 2000 배 희석하여, HRP 표지 항CD63 마우스 모노클로날 항체 희석액을 조제하였다.
＜(4) PS 단백질 및 항마커 단백질 항체의 고정화 용액의 조제＞
이하와 같이, 각종 PS 단백질 및 항마커 단백질 항체의 고정화 용액을 조제하였다. 항CD9 마우스 모노클로날 항체 M-L13 (BD bioscience 사 제조) 16 ㎕ (8 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 784 ㎕ 를 혼합하여, 항CD9 항체 고정화 용액 800 ㎕ 를 조제하였다. 항CD63 마우스 모노클로날 항체 H5C6 (BD bioscience 사 제조) 16 ㎕ (8 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 784 ㎕ 를 혼합하여, 항CD63 항체 고정화 용액 800 ㎕ 를 조제하였다. 항CD81 마우스 모노클로날 항체 JS-81 (BD bioscience 사 제조) 16 ㎕ (8 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 784 ㎕ 를 혼합하여, 항CD81 항체 고정화 용액 800 ㎕ 를 조제하였다. His 태그 융합형 마우스 MFG-E8 단백질 (R & D 시스템즈사 제조) 80 ㎕ (8 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 720 ㎕ 를 혼합하여, mMFG-E8 고정화 용액 800 ㎕ 를 조제하였다. His 태그 융합형 인간 MFG-E8 단백질 (R & D 시스템즈사 제조) 80 ㎕ (8 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 720 ㎕ 를 혼합하여, hMFG-E8 고정화 용액 800 ㎕ 를 조제하였다. His 태그 융합형 인간 AnnexinV 단백질 (Creative BioMart 사 제조) 40 ㎕ (8 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 760 ㎕ 를 혼합하여, hAnnexinV 고정화 용액 800 ㎕ 를 조제하였다. Fc 태그 융합형 마우스 Tim1 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 32 ㎕ (8 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 768 ㎕ 를 혼합하여, mTim1 고정화 용액 800 ㎕ 를 조제하였다. His 태그 융합형 마우스 Tim2 단백질 (R & D 시스템즈사 제조) 80 ㎕ (8 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 720 ㎕ 를 혼합하여, mTim2 고정화 용액 800 ㎕ 를 조제하였다. Fc 태그 융합형 마우스 Tim3 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 32 ㎕ (8 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 768 ㎕ 를 혼합하여, mTim3 고정화 용액 800 ㎕ 를 조제하였다. Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 32 ㎕ (8 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 768 ㎕ 를 혼합하여, mTim4 고정화 용액 800 ㎕ 를 조제하였다. Fc 태그 융합형 인간 Tim1 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 32 ㎕ (8 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 768 ㎕ 를 혼합하여, hTim1 고정화 용액 800 ㎕ 를 조제하였다. Fc 태그 융합형 인간 Tim3 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 32 ㎕ (8 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 768 ㎕ 를 혼합하여, hTim3 고정화 용액 800 ㎕ 를 조제하였다. Fc 태그 융합형 인간 Tim4 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 32 ㎕ (8 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 768 ㎕ 를 혼합하여, hTim4 고정화 용액 800 ㎕ 를 조제하였다.
＜(5) ELISA 측정＞
Immuno-plate Maxisorp C96 (Nunc 사 제조) 에 PS 단백질의 고정화 용액 또는 항마커 단백질 항체의 고정화 용액을 1 웰당 100 ㎕ 씩 단백질 1 종에 대해 6 웰에 분주하고, 8 ℃ 에서 하룻밤 정치하였다. 분주액을 제거한 후, 블로킹 용액 (25 ％ 블록 에이스 함유 TBS) 을 각 웰에 300 ㎕ 씩 첨가하고, 플레이트 믹서를 사용하여 500 rpm 으로 혼합하면서 실온에서 1 시간 반응하였다. 블로킹 용액을 제거한 후, 얻어진 각 PS 단백질 또는 항마커 단백질 항체를 고정화한 웰에 대해 단백질 농도가 각각 125, 250, 500, 1000, 2000 ng/㎖ 인 칼슘 이온 함유 K562 세포 배양 상청 초원심 침전 획분 희석 계열 각 100 ㎕ 를 각각 1 웰씩 5 웰에, 블랭크로서 2 mM CaCl2 함유 TBS 100 ㎕ 를 1 웰에 각각 첨가하고, 플레이트 믹서를 사용하여 500 rpm 으로 혼합하면서 실온에서 1 시간 반응하였다. 2 mM CaCl2 함유 TBS-T 300 ㎕ 로 3 회 세정한 후, HRP 표지 항CD63 마우스 모노클로날 항체 희석액 100 ㎕ 를 각 웰에 첨가하고, 플레이트 믹서를 사용하여 500 rpm 으로 혼합하면서 실온에서 1 시간 반응하였다. 2 mM CaCl2 함유 TBS-T 300 ㎕ 로 5 회 세정한 후, TMB 용액 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 100 ㎕ 를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 30 분간 정치 반응하였다. 1 M HCl 100 ㎕ 를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 마이크로 플레이트 리더 Tecan Ultra (Tecan 사 제조) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다.
또한, 각 실시예, 비교예에서 플레이트에 고정화한 단백질 및 검출의 가부 (결과) 를 하기 표 32 에 나타낸다.
＜결과＞
얻어진 ELISA 측정의 결과를 도 19 에 나타낸다. 도 19 는 PS 단백질 또는 항마커 단백질 항체를 고정화한 웰에 있어서의, 칼슘 이온 함유 K562 세포 배양 상청 초원심 침전 획분의 각 단백질 농도 희석 계열에 포함되는 엑소좀에 대해 결합한 HRP 표지 항CD63 마우스 모노클로날 항체 유래의 검출 시그널 (450 ㎚ 의 흡광도) 을 각각 나타낸다. 가로축은 웰에 고정화한 PS 단백질 또는 항마커 단백질 항체의 종류를 나타내고, 동일한 PS 단백질 등을 고정화한 웰에 대한 검출 결과에 있어서는 사용한 칼슘 이온 함유 K562 세포 배양 상청 초원심 침전 획분 중의 단백질 농도가 좌측으로부터 순서대로 0, 125, 250, 500, 1000, 2000 ng/㎖ 이다. 또, 세로축은 K562 세포 배양 상청 초원심 침전 획분의 각 단백질 농도 희석 계열에 포함되는 엑소좀에 대해 결합한 HRP 표지 항CD63 마우스 모노클로날 항체 유래의 검출 시그널을 나타낸다.
Tim1 단백질, Tim3 단백질, 또는 Tim4 단백질을 각각 고정화한 웰에서는, 항마커 단백질 항체인 항CD9 항체, 항CD63 항체 또는 항CD81 항체를 각각 고정화한 웰, PS 단백질인 MFG-E8, Annexin V 를 고정화한 웰, Tim 패밀리 단백질인 Tim2 단백질을 고정화한 웰에 비해 (비교예 27-33) 고감도로 세포외막소포를 검출할 수 있었다 (실시예 100-105). 즉, 종래법에 비해 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 사용하는 본 발명의 검출 방법은 고감도로 세포외막소포를 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다. 특히, Tim 단백질 중, Tim4 단백질을 사용하면 특히 고감도로 세포외막소포를 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 106-109. Tim 단백질의 고정화 방법의 차에 의한 ELISA 에 의한 세포외막소포의 검출에 있어서의 감도 비교
이하와 같이, Tim1 단백질 또는 Tim4 단백질을 각각 직접 플레이트에 고정화한 경우와, SH 기를 비오틴 표지한 Tim1 단백질 또는 SH 기를 비오틴 표지한 Tim4 단백질을, 스트렙트아비딘을 개재하여 플레이트에 각각 고정화한 경우의 세포외막소포의 검출 감도를 비교하였다.
＜(1) K562 세포 배양 상청 초원심 침전 획분의 조제＞
「단백질 농도가 125, 250, 500, 1000, 2000 ng/㎖ 가 되도록 각각 2 mM CaCl2 함유 TBS 로 희석하였다」 대신에 「단백질 농도가 500, 1000 ng/㎖ 가 되도록 2 mM CaCl2 함유 TBS 로 각각 희석」한 것 이외에는, 실시예 100-105 및 비교예 26-33 의 「(2) 칼슘 이온 함유 K562 세포 배양 상청 초원심 침전 획분의 조제」와 동일한 방법에 의해, 칼슘 이온 함유 K562 세포 배양 상청 초원심 침전 획분 희석 계열을 조제하였다.
＜(2) HRP 표지 항CD63 마우스 모노클로날 항체의 조제＞
실시예 100-105 및 비교예 26-33 의 「(3) HRP 표지 항CD63 마우스 모노클로날 항체의 조제」와 동일한 방법에 의해, HRP 표지 항CD63 마우스 모노클로날 항체 희석액을 조제하였다.
＜(3) Tim1 단백질 및 Tim4 단백질의 비오틴 표지·고정화 용액의 조제＞
Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim1 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 40 ㎕ (10 ㎍) 및 Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 40 ㎕ (10 ㎍) 를, Biotin Labeling Kit-SH ((주) 도진 화학 연구소 제조) 를 사용하여, 당해 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 각각 비오틴 표지하여, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim1 단백질 및 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 얻었다. SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim1 단백질 및 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질의 단백질 농도를, 프로틴 어세이 BCA 키트 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 를 사용하여 당해 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 각각 측정하였다. 단백질 농도가 5 ㎍/㎖ 가 되도록 TBS 로 희석하여, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim1 단백질 및 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 용액을 각각 조제하였다.
Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim1 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 또는 Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 8 ㎕ (2 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 392 ㎕ 를 혼합하여, mTim1 단백질 고정화 용액 또는 mTim4 단백질 고정화 용액 400 ㎕ 를 각각 조제하였다.
또, 스트렙트아비딘 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 2 ㎕ (10 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 998 ㎕ 를 혼합하여, 스트렙트아비딘 고정화 용액 1000 ㎕ 를 조제하였다.
＜(4) 고정화＞
Immuno-plate Maxisorp C96 (Nunc 사 제조) 에 각 단백질 고정화 용액을 1 웰당 100 ㎕ (0.5 ㎍) 씩 3 웰에 첨가하고, 8 ℃ 에서 하룻밤 정치하였다. 첨가액을 제거한 후, 블로킹 용액 (25 ％ 블록 에이스 함유 TBS) 을 각 웰에 300 ㎕ 씩 첨가하고, 플레이트 믹서를 사용하여 500 rpm 으로 혼합하면서 실온에서 1 시간 반응시켰다.
또, Immuno-plate Maxisorp C96 (Nunc 사 제조) 에 스트렙트아비딘 고정화 용액을 1 웰당 100 ㎕ 씩 6 웰에 첨가하고, 8 ℃ 에서 하룻밤 정치하였다. 첨가액을 제거한 후, 블로킹 용액 (25 ％ 블록 에이스 함유 TBS) 을 각 웰에 300 ㎕ 씩 첨가하고, 플레이트 믹서를 사용하여 500 rpm 으로 혼합하면서 실온에서 1 시간 반응하였다. 블로킹 용액을 제거한 후, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim1 단백질 및 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 용액을 1 웰당 100 ㎕ (0.5 ㎍) 씩 3 웰에 첨가하고, 플레이트 믹서를 사용하여 500 rpm 으로 혼합하면서 실온에서 1 시간 반응시켰다.
＜(5) ELISA 측정＞
「각 PS 단백질 또는 마커 단백질을 고정화한 웰에 대해 단백질 농도가 각각 125, 250, 500, 1000, 2000 ng/㎖ 인 칼슘 이온 함유 K562 세포 배양 상청 초원심 침전 획분 희석 계열 각 100 ㎕ 를 각각 1 웰씩 5 웰에」각각 첨가한 대신에 「각 단백질 고정화 웰에 대해 단백질 농도가 500 또는 1000 ng/㎖ 인 칼슘 이온 함유 K562 세포 배양 상청 초원심 침전 획분 희석 계열 각 100 ㎕ 를 각각 1 웰씩 2 웰에」각각 첨가한 것 이외에는, 실시예 100-105 및 비교예 26-33 과 동일한 방법에 의해, ELISA 측정을 실시하였다.
또한, 각 실시예, 비교예에서 플레이트에 고정화한 단백질, 플레이트에의 단백질의 고정화 방법, 및 검출의 가부 (결과) 를 하기 표 33 에 나타낸다. 표 33 중의 검출의 가부는, 각각 실시예 106 과 107, 실시예 108 과 109 의 비교이다.
얻어진 ELISA 측정의 결과를 도 20 에 나타낸다. 도 20 은 mTim1 단백질을 직접 플레이트에 고정화한 웰, mTim4 단백질을 직접 플레이트에 고정화한 웰, mTim1 단백질을 비오틴-스트렙트아비딘 결합에 의해 고정화한 웰, 및 mTim4 단백질을 비오틴-스트렙트아비딘 결합에 의해 고정화한 웰에 있어서의, 칼슘 이온 함유 K562 세포 배양 상청 초원심 침전 획분의 각 단백질 농도 희석 계열에 포함되는 엑소좀에 결합하는 HRP 표지 항CD63 마우스 모노클로날 항체 유래의 검출 시그널 (450 ㎚ 의 흡광도) 을 나타낸다.
가로축은 웰에 고정화한 Tim 단백질의 종류를 나타낸다. 또, 세로축은 칼슘 이온 함유 K562 세포 배양 상청 초원심 침전 획분의 각 단백질 농도 희석 계열에 포함되는 엑소좀에 대해 결합한 HRP 표지 항CD63 마우스 모노클로날 항체 유래의 검출 시그널을 나타낸다.
도 20 으로부터, Tim1 단백질 또는 Tim4 단백질을 사용한 ELISA 에 의하면, 플레이트에 대한 Tim 단백질의 고정화 방법에 관계없이, 시료 중의 세포외막소포를 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다 (실시예 106-109). 특히, Tim 단백질을 직접 고정화한 웰 (mTim1 을 플레이트에 직접 고정화한 실시예 106) 및 mTim4 를 플레이트에 직접 고정화한 고정화한 실시예 108) 에 비해, Tim 단백질을, 스트렙트아비딘을 개재하여 고정화한 웰 (mTim1 의 SH 기의 비오틴과 스트렙트아비딘의 결합에 의해 플레이트와 Tim 단백질을 결합시킨 실시예 107 및 mTim4 의 SH 기의 비오틴과 스트렙트아비딘의 결합에 의해 플레이트와 Tim 단백질을 결합시킨 실시예 109) 에서는 고감도로 세포외막소포를 검출할 수 있었다.
따라서, Tim 단백질과 고상의 결합 양식으로는, Tim 단백질의 SH 기의 비오틴과 스트렙트아비딘의 결합에 의해 플레이트와 Tim 단백질을 결합시키는 경우가 보다 바람직한 것을 알 수 있었다.
실시예 110-115. 비교예 34-39. PS 단백질을 사용한 ELISA 에 의한 바이러스의 검출에 있어서의 감도 비교
이하와 같이, 각종 PS 단백질 또는 바큘로 바이러스의 표면 마커 단백질 gp64 에 대한 항체를 고정화한 플레이트 및 HRP 표지 항gp64 항체를 검출 항체에 사용한 샌드위치 ELISA 를 실시하여, 바큘로 바이러스 함유 곤충 세포 배양 상청 샘플 중의 바큘로 바이러스를 검출하였다.
＜(1) 코트랜스펙션 세포 배양 상청의 조제＞
실시예 84-95, 비교예 20-21 의 「(1) 코트랜스펙션 세포 배양 상청의 조제」와 동일하게 실시하였다.
＜(2) 칼슘 이온 함유 바큘로 바이러스 함유 곤충 세포 배양 상청 샘플의 조제＞
실시예 84-95, 비교예 20-21 의 「(2) 바큘로 바이러스 함유 곤충 세포 배양 상청 샘플의 조제」와 동일하게 실시하여 칼슘 이온 함유 바큘로 바이러스 용액을 얻었다.
＜(3) 바큘로 바이러스 함유 곤충 세포 배양 상청 샘플 희석 계열의 조제＞
바큘로 바이러스 함유 곤충 세포 배양 상청 샘플 50 ㎕ 와 PSFM-J1 배지 4950 ㎕ 를 혼합하여 100 배 희석액을 조제하고, 100 배 희석액 2.0 ㎖ 와 PSFM-J1 배지 2.0 ㎖ 를 혼합하여 200 배 희석액 4.0 ㎖ 를 조제하고, 200 배 희석액 2.0 ㎖ 와 PSFM-J1 배지 2.0 ㎖ 를 혼합하여 400 배 희석액을 4.0 ㎖ 조제하고, 400 배 희석액 2.0 ㎖ 와 PSFM-J1 배지 2.0 ㎖ 를 혼합하여 800 배 희석액 4.0 ㎖ 를 조제하였다.
＜(4) HRP 표지 항gp64 마우스 모노클로날 항체의 조제＞
항gp64 마우스 모노클로날 항체 AcV1 (Novus Biologacals 사 제조) 200 ㎕ (100 ㎍) 를, Peroxidase Labeling Kit-NH2 ((주) 도진 화학 연구소 제조) 를 사용하여, 당해 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 HRP 표지하여, HRP 표지 항gp64 마우스 모노클로날 항체 용액 200 ㎕ 를 얻었다. HRP 표지 항gp64 마우스 모노클로날 항체 용액을 2 mM CaCl2 함유 TBS 로 1000 배 희석하여, HRP 표지 항gp64 마우스 모노클로날 항체 희석액을 조제하였다.
＜(5) PS 단백질 및 항gp64 항체의 고정화 용액의 조제＞
이하와 같이, 각종 PS 단백질 및 마커 단백질의 고정화 용액을 각각 조제하였다. 항gp64 마우스 모노클로날 항체 AcV1 (Novus Biologicals 사 제조) 12 ㎕ (6 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 588 ㎕ 를 혼합하여, 항gp64 항체 고정화 용액 600 ㎕ 를 조제하였다. His 태그 융합형 마우스 유래 MFG-E8 단백질 (R & D 시스템즈사 제조) 60 ㎕ (6 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 540 ㎕ 를 혼합하여, mMFG-E8 고정화 용액 600 ㎕ 를 조제하였다. His 태그 융합형 인간 유래 MFG-E8 단백질 (R & D 시스템즈사 제조) 60 ㎕ (6 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 540 ㎕ 를 혼합하여, hMFG-E8 고정화 용액 600 ㎕ 를 조제하였다. His 태그 융합형 인간 유래 AnnexinV 단백질 (Creative BioMart 사 제조) 30 ㎕ (6 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 570 ㎕ 를 혼합하여, hAnnexinV 고정화 용액 600 ㎕ 를 조제하였다. Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim1 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 24 ㎕ (6㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 576 ㎕ 를 혼합하여, mTim1 고정화 용액 600 ㎕ 를 조제하였다. His 태그 융합형 마우스 유래 Tim2 단백질 (R & D 시스템즈사 제조) 60 ㎕ (6 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 540 ㎕ 를 혼합하여, mTim2 고정화 용액 600 ㎕ 를 조제하였다. Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim3 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 24 ㎕ (6 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 576 ㎕ 를 혼합하여, mTim3 고정화 용액 600 ㎕ 를 조제하였다. Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 24 ㎕ (6 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 576 ㎕ 를 혼합하여, mTim4 고정화 용액 600 ㎕ 를 조제하였다. Fc 태그 융합형 인간 유래 Tim1 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 24 ㎕ (6 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 576 ㎕ 를 혼합하여, hTim1 고정화 용액 600 ㎕ 를 조제하였다. Fc 태그 융합형 인간 유래 Tim3 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 24 ㎕ (6 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 576 ㎕ 를 혼합하여, hTim3 고정화 용액 600 ㎕ 를 조제하였다. Fc 태그 융합형 인간 유래 Tim4 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 24 ㎕ (6 ㎍) 와 50 mM MOPS (pH 7.5) 용액 576 ㎕ 를 혼합하여, hTim4 고정화 용액 600 ㎕ 를 조제하였다.
＜(6) ELISA 측정＞
Immuno-plate Maxisorp C96 (Nunc 사 제조) 에 PS 단백질 또는 항gp64 항체의 고정화 용액을 1 웰당 100 ㎕ 씩 단백질 1 종에 대해 5 웰에 분주하고, 8 ℃ 에서 하룻밤 정치하였다. 분주액을 제거한 후, 블로킹 용액 (25 ％ 블록 에이스 함유 TBS) 을 각 웰에 300 ㎕ 씩 첨가하고, 플레이트 믹서를 사용하여 500 rpm 으로 혼합하면서 실온에서 1 시간 반응하였다. 블로킹 용액을 제거한 후, 얻어진 각 PS 단백질 또는 항gp64 항체를 고정화한 웰에 대해, 상기 (3) 에서 조제한 칼슘 이온 함유 바큘로 바이러스 함유 곤충 세포 배양 상청 샘플 희석 계열 (100 배 희석, 200 배 희석, 400 배 희석, 800 배 희석) 각 100 ㎕ 를 각각 1 웰씩 4 웰에, 블랭크로서 PMSF-J1 배지 100 ㎕ 를 1 웰에 각각 첨가하고, 플레이트 믹서를 사용하여 500 rpm 으로 혼합하면서 실온에서 1 시간 반응하였다. 2 mM CaCl2 함유 TBS-T 300 ㎕ 로 3 회 세정한 후, HRP 표지 항gp64 마우스 모노클로날 항체 희석액 100 ㎕ 를 각 웰에 첨가하고, 플레이트 믹서를 사용하여 500 rpm 으로 혼합하면서 실온에서 1 시간 반응하였다. 2 mM CaCl2 함유 TBS-T 300 ㎕ 로 5 회 세정한 후, TMB 용액 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 100 ㎕ 를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 30 분간 가만히정지시키고 반응하였다. 1 M HCl 100 ㎕ 를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 마이크로 플레이트 리더 Tecan Ultra (Tecan 사 제조) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다.
또한, 각 실시예, 비교예에서 플레이트에 고정화한 단백질 및 검출의 가부 (결과) 를 하기 표 34 에 나타낸다.
＜결과＞
얻어진 ELISA 측정의 결과를 도 21 에 나타낸다. 도 21 은 각종 PS 단백질 및 항gp64 항체를 고정화한 웰에 있어서의, 칼슘 이온 함유 바큘로 바이러스 함유 곤충 세포 배양 상청의 각 희석 계열에 포함되는 엑소좀에 대해 결합한 HRP 표지 항gp64 마우스 모노클로날 항체 유래의 검출 시그널 (450 ㎚ 의 흡광도) 을 각각 나타낸다. 가로축은 웰에 고정화한 PS 단백질 또는 항마커 단백질 항체의 종류를 나타내고, 동일한 PS 단백질 등을 고정화한 웰에 대한 검출 결과에 있어서는 좌측으로부터 순서대로 블랭크, 사용한 칼슘 이온 함유 바큘로 바이러스 함유 곤충 세포 배양 상청 샘플 희석 계열이 각각 800 배 희석, 400 배 희석, 200 배 희석, 100 배 희석을 나타낸다. 또, 세로축은 HRP 표지 항gp64 마우스 모노클로날 항체 유래의 검출 시그널 (450 ㎚ 의 흡광도) 을 나타낸다.
Tim1 단백질, Tim3 단백질, 또는 Tim4 단백질을 각각 고정화한 웰에서는, 바큘로 바이러스의 표면 마커 단백질인 항gp64 항체를 고정화한 웰, PS 단백질인 MFG-E8, Annexin V 를 고정화한 웰, Tim 패밀리 단백질인 Tim2 단백질을 고정화한 웰에 비해 (비교예 34-39) 고감도로 바이러스를 검출할 수 있었다 (실시예 110-115). 즉, 종래법에 비해 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 사용하는 본 발명의 검출 방법은 고감도로 바이러스를 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다. 특히, Tim 단백질 중, Tim4 단백질을 사용하면 특히 고감도로 바이러스를 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 116-119. Tim 단백질을 고정화한 담체에 의한 바이러스의 취득
비오틴 표지한 Tim4 단백질을 고정화한 담체를 사용하여, 본 발명에 관련된 바이러스의 취득을 실시하였다.
＜(1) 코트랜스펙션 세포 배양 상청의 조제＞
실시예 84-95, 비교예 20-21 의 「(1) 코트랜스펙션 세포 배양 상청의 조제」와 동일하게 실시하였다.
＜(2) 칼슘 이온 함유 바큘로 바이러스 함유 곤충 세포 배양 상청 샘플의 조제＞
실시예 84-95, 비교예 20-21 의 「(2) 바큘로 바이러스 함유 곤충 세포 배양 상청 샘플의 조제」와 동일하게 실시하여, 칼슘 이온 함유 바큘로 바이러스 함유 곤충 세포 배양 상청 샘플을 얻었다.
＜(3) 바큘로 바이러스 함유 곤충 세포 배양 상청 샘플 희석액의 조제＞
칼슘 이온 함유 바큘로 바이러스 함유 곤충 세포 배양 상청 샘플 100 ㎕ 와 PSFM-J1 배지 800 ㎕ 를 혼합하여 9 배 희석액 900 ㎕ 를 조제하였다.
＜(4) Tim4 단백질의 SH 기 비오틴 표지＞
Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 함유 PBS 용액 100 ㎕ (Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 10 ㎍ 함유) 를, 비오틴화 표지용 키트-SH (도진 화학 연구소 제조) 를 사용하여, 당해 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질의 SH 기를 비오틴 표지하여, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 100 ㎕ 를 얻었다.
＜(5) 태그 융합 Tim 단백질의 희석＞
Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 함유 PBS 용액 5 ㎕ (Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 0.5 ㎍ 함유) 를, TBS 95 ㎕ 와 혼합하여, 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 0.5 ㎍ 함유하는 용액 100 ㎕ 를 얻었다.
상기 (4) 에서 조제한 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 TBS 용액 5 ㎕ (SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 0.5 ㎍ 함유) 를 TBS 95 ㎕ 와 혼합하여, 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 용액 100 ㎕ 를 얻었다.
＜(6) 비즈의 세정＞
30 ㎍/㎕ Dynabeads ProteinG (서모피셔 사이언티픽사 제조) 함유 PBS-T 용액 5 ㎕ (Dynabeads ProteinG 0.3 ㎎ 함유) 를, 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 로 옮기고, TBS-T (TBS, 0.0005 ％ 트윈20) 500 ㎕ 를 사용하여 2 회 세정한 후, 튜브를 자기 스탠드에 세트하고, 세정액을 제거하였다.
또, MagCapture Tamavidin2-REV (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 함유 PBS 용액 30 ㎕ (비즈 0.3 ㎎ 함유) 를, 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 로 옮기고, TBS-T (TBS, 0.0005 ％ 트윈20) 500 ㎕ 를 사용하여 2 회 세정한 후, 튜브를 자기 스탠드에 세트하고, 세정액을 제거하였다.
＜(7) Tim 단백질의 비즈에의 고정＞
세정 조작 후의 펠릿 상태의 Dynabeads ProteiG 0.3 ㎎ 을 함유하는 1.5 ㎖ 튜브에, SH 기 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 0.5 ㎍ 함유하는 용액 100 ㎕ 를 첨가하고, 서모 믹서를 사용하여 8 ℃ 에서 1200 rpm 1 시간 반응시켜, SH 기 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 가 결합한 담체 (「비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 담체」라고 약기하는 경우가 있다) 를 얻었다.
또, 세정 조작 후의 MagCapture Tamavidin2-REV 0.3 ㎎ 을 함유하는 1.5 ㎖ 튜브에, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 0.5 ㎍ 함유하는 용액 100 ㎕ 를 더하고, 상기와 동일하게 비즈에 결합시켜, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 가 결합한 담체 (「비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 담체」라고 약기하는 경우가 있다) 를 얻었다.
또한, 이들 얻어진 2 종류의 담체를 합쳐서 「Tim 단백질 결합 담체」라고 약기하는 경우가 있다.
＜(8) 본 발명의 취득 방법에 의한 바큘로 바이러스의 취득＞
상기에서 얻어진 이들 Tim 단백질 결합 담체를 TBS-T (TBS, 0.0005 ％ 트윈20) 250 ㎕ 로 3 회 세정 조작하여, 펠릿 상태의 Tim 단백질 결합 담체를 얻었다. 이어서, 얻어진 2 종류의 펠릿 상태의 Tim 단백질 결합 담체에, 상기 (3) 에서 조제한 칼슘 이온 함유 바큘로 바이러스 함유 곤충 세포 배양 상청 샘플 희석액 100 ㎕ 를 각각 더히고, 서모 믹서를 사용하여 8 ℃ 에서 1200 rpm 12 시간 반응시켰다. 그 후, 반응 후의 Tim 단백질 결합 담체를, 칼슘 이온 함유 TBS-T (Tris 버퍼, 0.0005 ％ 트윈20, 2 mM CaCl2) 250 ㎕ 로 각각 3 회 세정 조작하였다. 3 회째의 세정 조작 시에, Tim 단백질 결합 담체를 포함하는 CaCl2 함유 TBS-T 용액 250 ㎕ 를 125 ㎕ 씩 1.5 ㎖ 튜브 2 개에 각각 분주하고, 튜브를 자기 스탠드에 세트한 후, 세정액을 제거하였다.
펠릿 상태의 2 종류의 Tim 단백질 결합 담체 0.15 ㎎ 에 각각 용출액으로서 1 ％ SDS 수용액을 50 ㎕, 또는 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 25 ㎕ 첨가한 후, 볼텍스 믹서에 의해 실온에서 10 초간 혼합하고, 스핀 다운하였다. EDTA 를 첨가한 튜브에는 재차 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 25 ㎕ 첨가하고, 동일한 조작을 실시하여, 용출액을 얻었다.
또한, 각 실시예에서 사용한 Tim 단백질 및 담체의 종류, 그리고 Tim 단백질 (비)결합 담체의 종류를 하기 표 35 에 나타낸다.
＜(9) 웨스턴 블롯팅＞
「얻어진 각 용출액 11.25 ㎕ 에 4 × 시료용 완충액 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 3.75 ㎕ 를 더하고」 대신에 「상기 (8) 본 발명의 취득 방법에 의한 바큘로 바이러스의 취득에서 얻어진 각 용출액 15 ㎕ 에 4 × 시료용 완충액 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 15 ㎕ 를 더하고」, 「항Lamp-1 항체」 대신에 「항바큘로 바이러스 gp64 항체」를 사용한 것 이외에는, 실시예 80-83 및 비교예 16-19 의 「(5) 웨스턴 블롯팅」과 동일한 방법으로 실시하였다.
또한, 각 실시예에서 사용한 Tim 단백질 및 담체의 종류, Tim 단백질 결합 담체로부터 바이러스를 취득하기 위해서 사용한 용출액의 종류, 그리고 웨스턴 블롯팅에 있어서의 레인 번호를 하기 표 36 에 나타낸다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 22 에 나타낸다. 도 22 에 있어서, 각 레인은 이하의 결과이다.
레인 1 : 실시예 116 의 결과 (Dynabeads protein G 에 SH 기 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 2 : 실시예 117 의 결과 (Dynabeads protein G 에 SH 기 비오틴 비표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 3 : 실시예 118 의 결과 (MagCapture Tamavidin REV-2 에 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 수용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 4 : 실시예 119 의 결과 (MagCapture Tamavidin REV-2 에 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 결합시킨 담체를 사용하고, 1 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
도 22 로부터, 레인 1-4 에 있어서, 어느 경우에서도 바큘로 바이러스의 마커 단백질인 gp64 의 밴드가 보인 점에서, SH 기 비오틴 비표지 또는 표지 Tim4 를 결합시킨 담체를 사용함으로써, 바이러스를 취득 가능하다는 것을 알 수 있었다.
또, 레인 2 와 레인 4 의 비교로부터, 칼슘 킬레이트제에 의해 용출시키는 경우에는, Tim 단백질의 SH 기를 개재하여 비즈 (담체) 에 고정화시킴으로써, 태그를 개재하여 고정화시키는 것보다 많은 바이러스를 취득할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 120-121. 비교예 40-41. 플로 사이토미터에 의한 세포외막소포의 검출 감도 비교
이하와 같이, Tim4 단백질 또는 엑소좀의 표면 마커 단백질의 CD63 에 대한 항체를 고정화한 담체 및 검출 항체로서 PE 표지 항CD63 항체를 사용하여, K562 세포 배양 상청 유래의 세포외막소포를 플로 사이토미터에 의해 검출하였다.
＜(1) 칼슘 이온 함유 배양 상청 (원액) 의 조제＞
세포외막소포를 분비하는 인간 만성 골수성 백혈병주 K562 세포 1 × 107 세포를 80 ㎖ 의 X-VIVO15 배지 (Lonza 사 제조) 를 사용하여 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 3 일간 배양한 후, 원심분리 처리 (300 × g, 5 분간) 하여 세포를 침전시키고, 상청을 제거하였다. 침전한 세포를, 10 μM 모넨신 나트륨 (MP Biomedicals 사 제조) 함유 X-VIVO15 배지 60 ㎖ 로 현탁 후, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 24 시간 배양하였다.
그 후, 배양액을 원심분리 처리 (300 × g, 5 분간) 하고, 배양 상청을 회수하였다. 회수한 배양 상청 60 ㎖ 를 추가로 3 회 원심분리 처리 (1 회째 : 300 × g, 3 분간, 2 회째 : 1200 × g, 20 분간, 3 회째 : 10000 × g, 20 분간) 하여 불순물을 분리하고, 상청을 얻었다 (이하, 「배양 상청 (원액)」이라고 약기하는 경우가 있다).
또, 얻어진 배양 상청 원액에 종농도가 2 mM 이 되도록 CaCl2 를 첨가하고, 2 mM CaCl2 함유 K562 세포 배양 상청 농축액 샘플 (이하, 「칼슘 이온 함유 배양 상청 (원액)」이라고 약기하는 경우가 있다) 을 얻었다.
＜(2) 배양 상청 샘플 희석액의 조제＞
상기에서 얻어진 칼슘 이온 함유 배양 상청 (원액) 500 ㎕ 와 X-VIVO15 배지 500 ㎕ 를 혼합하여 2 배 희석액을 1.0 ㎖ 조제하고, 2 배 희석액 200 ㎕ 와 X-VIVO15 배지 800 ㎕ 를 혼합하여 10 배 희석액 1.0 ㎖ 를 조제하여, 칼슘 이온 함유 배양 상청 2 배 희석액 (원액) 과 칼슘 이온 함유 배양 상청 10 배 희석액 (원액) 을 각각 얻었다.
＜(3) Tim4 단백질의 SH 기 비오틴 표지＞
Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 함유 PBS 용액 100 ㎕ (Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 10 ㎍ 함유) 를, 비오틴화 표지용 키트-SH (도진 화학 연구소 제조) 를 사용하여, 당해 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질의 SH 기를 비오틴 표지하여, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 100 ㎕ 를 얻었다.
＜(5) 비즈의 세정＞
Exosome-Streptavidin Isolation/Detection Reagent (서모피셔 사이언티픽사 제조)(Dynabeads Streptabidin 4.5 ㎛ 1 × 107/㎖ 함유) 20 ㎕ 를, 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 2 개에 각각 분주하고, TBS 200 ㎕ 를 사용하여 세정 조작을 실시하였다.
Exosome-Human CD63 Isolation/Detection Reagent (서모피셔 사이언티픽사 제조)(Dynabeads Anti-CD63 항체 고정화가 완료된 4.5 ㎛ 1 × 107/㎖ 함유) 20 ㎕ 를, 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 2 개에 각각 분주하고, TBS 200 ㎕ 를 사용하여 세정 조작을 실시하였다.
＜(6) Tim4 단백질의 비즈에의 고정＞
세정 조작 후의 펠릿 상태의 Dynabeads Streptavidin 을 함유하는 1.5 ㎖ 튜브 2 개에, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 0.1 ㎍ 함유하는 용액 100 ㎕ 를 첨가하고, 서모 믹서를 사용하여 8 ℃ 에서 1200 rpm 30 분간 반응시켜, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 가 결합한 담체 (「비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 담체」라고 약기하는 경우가 있다) 를 함유하는 용액 (「비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 담체 함유 용액」이라고 약기하는 경우가 있다) 을 얻었다.
＜(7) 세포외막소포와의 반응＞
상기에서 얻어진 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 담체 함유 용액 100 ㎕ 를 자기 스탠드에 세트한 후, 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 담체 함유 용액 중의 용액을 제거하였다. 펠릿 상태의 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 담체 및 세정 조작 후의 펠릿 상태의 Exosome-Human CD63 Isolation/Detection Reagent 를 0.1 ％ BSA 함유 TBS 200 ㎕ 로 2 회 세정하여, 펠릿 상태의 담체를 얻었다. 이어서, 얻어진 펠릿 상태의 각 담체에, 상기 (2) 에서 조제한 칼슘 이온 함유 배양 상청 2 배 희석액 (원액) 과 배양 상청 10 배 희석액 (원액) 100 ㎕ 를 각각 더하여, 서모 믹서를 사용하여 8 ℃ 에서 1200 rpm 12 시간 각각 반응시켰다. 그 후, 반응 후의 담체를, 칼슘 이온-0.1 ％ BSA 함유 TBS (TBS, 0.1 ％ BSA, 2 mM CaCl2) 300 ㎕ 로 1 회, 칼슘 이온-0.1 ％ BSA 함유 TBS 400 ㎕ 로 각각 1 회 세정 조작하고, 세정 조작 후의 펠릿 상태의 각 담체를 칼슘 이온-0.1 ％ BSA 함유 TBS (TBS, 0.1 ％ BSA, 2 mM CaCl2) 300 ㎕ 로 각각 현탁하여, 하기 표 37 에 기재된 2 종류의 담체의 현탁액을 각각 얻었다.
＜(8) PE 표지 항CD63 항체에 의한 검출＞
상기 (7) 에서 얻어진 2 종류의 담체의 현탁액을 100 ㎕ 씩 각각 2 개의 1.5 ㎖ 튜브에 분주하고, 자기 분리에 의해 담체를 펠릿 상태로 한 후, PE 표지 항CD63 마우스 모노클로날 항체 H5C6 (BD 바이오사이언스사 제조) 또는 PE 표지 컨트롤 마우스 IgG (BD 바이오사이언스사 제조) 를 20 ㎕ 각각 첨가하고, 서모 믹서를 사용하여 25 ℃ 에서 1000 rpm 1 시간 각각 반응시켰다. 그 후, 칼슘 이온과 0.1 ％ BSA 함유 TBS (TBS, 0.1 ％ BSA, 2 mM CaCl2) 300 ㎕ 로 각각 2 회 세정 조작한 후, 칼슘 이온과 0.1 ％ BSA 함유 TBS (TBS, 0.1 ％ BSA, 2 mM CaCl2) 500 ㎕ 로 담체를 현탁하였다. 그 후 팔콘 셀 스트레이너 (코닝사 제조) 로 여과한 여과액을 회수하고, 플로 사이토미터 Gallios (벡크만쿨터사 제조) 로 측정 및 해석을 실시하였다. 또한, 측정 시의 레이저 파장은 488 ㎚ 이고, 검출 파장은 575 ㎚ 이다.
또한, 각 실시예에서 사용한 Tim 단백질, 담체의 종류, 및 시료를 하기 표 38 에 나타낸다.
＜결과＞
얻어진 플로 사이토미터 측정의 결과를 도 23 에 나타낸다. 도 23 은 각 배율로 희석한 칼슘 이온 함유 배양 상청 (원액) 으로부터 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 담체와 항CD63 항체 담체를 사용하여 포착한 엑소좀을, PE 표지 항CD63 마우스 모노클로날 항체로 검출한 시그널과 PE 표지 컨트롤 마우스 IgG 로 검출한 노이즈의 비 (Sinal/Noise 비) 를 각각 나타낸다. 가로축은 사용한 칼슘 이온 함유 배양 상청 (원액) 의 희석 배율, 세로축은 PE 표지 항CD63 마우스 모노클로날 항체로 검출한 시그널과 PE 표지 컨트롤 마우스 IgG 로 검출한 노이즈의 비를 각각 나타낸다.
도 23 으로부터, 본 발명에 관련된 Tim 단백질을 결합시킨 담체를 사용함으로써, 세포외막소포를 검출 가능한 것을 알 수 있었다. 또, 항CD63 항체를 고정화한 담체를 사용하는 것보다 Tim4 를 고정화한 담체를 사용하는 편이 높은 Sinal/Noise 비 (검출 감도) 와 플로 사이토미터 측정을 할 수 있는 것이 나타났다. 즉, 본 발명에 관련된 Tim 담체를 사용한 플로 사이토미터 해석에 의하면 종래법에 비해 고감도로 세포외막소포를 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 122-123. 비교예 42-43. Tim 단백질을 고정화한 담체에 의한 바이러스의 취득
Tim 단백질을 고정화한 담체를 사용하여, 본 발명에 관련된 바이러스의 취득을 실시하였다.
＜(1) Fc 태그 융합형 mTim4 단백질의 SH 기 비오틴 표지＞
Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 함유 PBS 용액 100 ㎕ (Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질 10 ㎍ 함유) 중의 Fc 태그 융합형 마우스 유래 Tim4 단백질의 SH 기를, 비오틴화 표지용 키트-SH (도진 화학 연구소 제조) 를 사용하여, 당해 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 비오틴 표지하여, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 100 ㎕ 를 얻었다.
＜(2) SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질의 희석＞
상기 (1) 에서 조제한 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 TBS 용액 10 ㎕ (SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 1 ㎍ 함유) 를 TBS 190 ㎕ 와 혼합하여, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
＜(3) 비즈의 세정＞
MagCapture Tamavidin2-REV (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 함유 PBS 용액 60 ㎕ (MagCapture Tamavidin2-REV 0.6 ㎎ 함유) 를, 2 개의 1.5 ㎖ 튜브 (비엠 기기사 제조) 에 각각 옮기고, TBS-T (Tris버퍼, 0.0005 ％ 트윈20) 500 ㎕ 를 사용하여 각각 2 회 세정한 후, 튜브를 자기 스탠드에 세트하고, 세정액을 제거하였다.
＜(4) SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질의 비즈에의 고정＞
세정 조작 후의 MagCapture Tamavidin2-REV 0.6 ㎎ 을 함유하는 2 개의 1.5 ㎖ 튜브에, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 용액 200 ㎕ 또는 TBS 200 ㎕ 를 더하고, 서모 믹서를 사용하여 8 ℃ 에서 1200 rpm 1 시간 각각 반응시켜, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 가 결합한 담체 (「비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 결합 담체」라고 약기하는 경우가 있다) 와 SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 가 결합하고 있지 않는 담체 (「비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 비결합 담체」라고 약기하는 경우가 있다) 를 얻었다. 또한, 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 결합 담체와 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 비결합 담체를 합쳐 「Tim 단백질 (비)결합 담체」라고 약기하는 경우가 있다.
＜(5) 본 발명의 취득 방법에 의한 인플루엔자 바이러스의 취득＞
상기에서 얻어진 2 종류의 Tim 단백질 (비)결합 담체를 TBS-T (Tris버퍼, 0.0005 ％ 트윈20) 500 ㎕ 로 각각 3 회 세정 조작하였다. 세정 조작 후의 2 종류의 Tim 단백질 (비)결합 담체에, 종농도 2 mM 의 염화칼슘을 첨가한 칼슘 이온 함유의 인플루엔자 A 바이러스 용액 (H1N1 A/WS/33 strain)(ATCC Code : VR-825) 60 ㎕ 를 각각 더하고, 서모 믹서를 사용하여 8 ℃ 에서 1200 rpm 2 시간 각각 반응시켰다. 반응 후의 2 종류의 Tim 단백질 (비)결합 담체를, 칼슘 이온 함유 TBS-T (Tris 버퍼, 0.0005 ％ 트윈20, 2 mM CaCl2) 500 ㎕ 로 각각 3 회 세정 조작하였다. 3 회째의 세정 조작 후, 2 종류의 Tim 단백질 (비)결합 담체에 칼슘 이온 함유 TBS-T (Tris 버퍼, 0.0005 ％ 트윈20, 2 mM CaCl2) 500 ㎕ 를 각각 더하고 현탁하여, 현탁액 500 ㎕ 를 각각 얻었다. 당해 현탁액을 250 ㎕ 씩 1.5 ㎖ 튜브 2 개에 각각 분주하고, 튜브를 자기 스탠드에 세트한 후, 각각 세정액을 제거하여, 펠릿 상태의 Tim 단백질 (비)결합 담체를 각각 얻었다.
또한, 각 실시예 및 비교예에서 사용한 담체의 종류, 및 Tim 단백질의 종류를 하기 표 39 에 나타낸다.
얻어진 펠릿 상태의 Tim 단백질 (비)결합 담체 0.3 ㎎ 을 함유하는 4 개의 1.5 ㎖ 튜브 중, Tim 단백질 결합 담체를 함유하는 1.5 ㎖ 튜브 1 개 및 Tim 단백질 비결합 담체를 함유하는 1.5 ㎖ 튜브 1 개에 대해서는, 용출액으로서 1 ％ SDS 수용액을 각각 20 ㎕ 첨가한 후, 볼텍스 믹서에 의해 실온에서 10 초간 혼합하고, 스핀 다운하여 용출액을 각각 얻었다.
또, 당해 펠릿 상태의 Tim 단백질 (비)결합 담체 0.3 ㎎ 을 함유하는 4 개의 1.5 ㎖ 튜브 중, Tim 단백질 결합 담체를 함유하는 1.5 ㎖ 튜브 1 개 및 Tim 단백질 비결합 담체를 함유하는 1.5 ㎖ 튜브 1 개에 대해서는, 용출액으로서 50 mM EDTA 함유 TBS 용액을 각각 10 ㎕ 첨가한 후, 볼텍스 믹서에 의해 실온에서 10 초간 혼합하고, 스핀 다운하였다. 스핀 다운 후의 튜브에 각각 재차 50 mM EDTA 함유 TBS 용액을 10 ㎕ 첨가한 후, 볼텍스 믹서에 의해 실온에서 10 초간 혼합하고, 스핀 다운하여 용출액을 각각 얻었다.
얻어진 4 종류의 용출액 20 ㎕ 에 각각 10 ％ β-프로피오락톤 함유 TBS 용액 2.2 ㎕ 를 첨가하고, 볼텍스 믹서로 혼합 후, 빙상에서 3 시간 가만히 정지시켜, 4 종류의 β-프로피오락톤 처리가 완료된 용출액 22.2 ㎕ 를 각각 얻었다.
＜(6) 웨스턴 블롯팅＞
상기 칼슘 이온 함유의 인플루엔자 A 바이러스 용액 (H1N1 A/WS/33 strain)(ATCC Code : VR-825) 30 ㎕ 에 10 ％ β-프로피오락톤 함유 TBS 용액 3.3 ㎕ 를 첨가하고, 볼텍스 믹서로 혼합 후, 빙상에서 3 시간 가만히 정지시킨 용액에 4 × 시료용 완충액 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 11.1 ㎕ 를 더하고, 95 ℃ 에서 3 분간 가열하여, 웨스턴 블롯팅용의 인풋 시료 (합계 44.4 ㎕) 를 얻었다. 또, 상기 4 종류의 β-프로피오락톤 처리가 완료된 용출액 22.2 ㎕ 에 4 × 시료용 완충액 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 7.4 ㎕ 를 각각 더하고, 95 ℃ 에서 3 분간 가열하여, 웨스턴 블롯팅용의 각 용출액 시료 ((합계 29.6 ㎕) 를 각각 얻었다. 슈퍼 셉 에이스 5-20 ％ 겔 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 에 당해 웨스턴 블롯팅용의 인풋 시료 20 ㎕ 및 웨스턴 블롯팅용의 각 용출액 시료 20 ㎕ 를 각각 얹고, 30 mA 로 60 분간 전기 영동하였다. 얻어진 영동 겔을, 세미드라이 블로터와 불연속 버퍼 (애노드 버퍼 1 : 0.3 M Tris/20 ％ 메탄올, 애노드 버퍼 2 : 0.025 M Tris/20 ％ 메탄올, 캐소드 버퍼 : 0.025 M Tris/0.04 M 아미노카프로산/20 ％ 메탄올) 를 사용하여, PVDF 막 (Millipore 사 제조) 에 1.2 mA/㎠ 로 60 분간 전사하였다. 전사 후의 PVDF 막에 TBS-T (TBS 버퍼, 0.1 ％ 트윈20) 로 희석한 5 ％ 스킴 밀크를 더하여 1 시간 실온에서 반응시켜 블로킹하고, TBS-T 로 300 배 희석한 항인플루엔자 A 바이러스 Nucleoprotein 항체 C43 (Abcam 사 제조) 2 ㎖ 를 실온에서 1 시간 반응시켰다. 반응 후의 PVDF 막을 TBS-T 로 3 회 세정하고, TBS-T 로 30000 배 희석한 2 차 항체 항{마우스 IgG(H ＋ L), 당나귀, IgG 획분, 퍼옥시다아제 결합 항체](Jackson ImmunoResearch 사 제조) 를 실온에서 1 시간 반응시켰다. TBS-T 로 5 회 세정 후, 각 항체를 반응시킨 PVDF 막에 이뮤노스타제타 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 를 첨가하고, LAS-4000 (GE 사 제조) 을 사용하여 발광 시그널을 검출하였다.
또한, 각 실시예에서 사용한 담체의 종류, Tim 단백질의 종류 및 담체로부터의 용출액의 종류를 하기 표 40 에 나타낸다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 24 에 나타낸다. 도 24 에 있어서, 각 레인은 이하의 결과이다.
레인 1 : 인플루엔자 A 바이러스를 전기 영동한 결과
레인 2 : 비교예 42 의 결과 (비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 비결합 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 3 : 비교예 43 의 결과 (비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 비결합 담체를 사용하고, 50 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 4 : 실시예 122 의 결과 (비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 결합 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 5 : 실시예 123 의 결과 (비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 결합 담체를 사용하고, 50 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
도 24 로부터, 레인 2-3 (비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 비결합 담체를 사용한 경우) 에 있어서, 어느 경우에서도 인플루엔자 A 바이러스의 마커 단백질인 Nucleoprotein 의 밴드는 보이지 않았던 것에 대해, 레인 4-5 (비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 결합 담체를 사용한 경우) 에 있어서, 어느 경우에서도 인플루엔자 A 바이러스의 마커 단백질인 Nucleoprotein 의 밴드가 보인 점에서, Tim 단백질을 결합시킨 담체는, 인플루엔자 바이러스를 취득 가능한 것을 알 수 있었다.
또, 레인 1 (인플루엔자 A 바이러스를 전기 영동한 결과) 과 레인 4-5 (비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 결합 담체를 사용한 경우의 결과) 의 비교로부터, Tim 단백질을 결합시킨 담체를 사용하는 것에 의해 효율적으로 인플루엔자 바이러스를 취득할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 124-125. 비교예 44-45. Tim 단백질을 고정화한 담체에 의한 바이러스의 취득
Tim 단백질을 고정화한 담체를 사용하여, 본 발명에 관련된 바이러스의 취득을 실시하였다.
＜(1) RS 바이러스 함유 HEp-2 세포 배양 상청 샘플의 조제＞
1.5 × 106 세포의 HEp-2 세포를 포함하는 10 ％ FBS 함유 D-MEM 고글루코오스 배지 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조) 20 ㎖ 를 75 ㎠ 플라스크에 더하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 로 4 일간 배양하였다. 배양 후의 배양액으로부터 상청을 제거하고, 5.3 × 105 TCID50/㎖ 의 RS 바이러스액 (ATCC, Code : VR-26) 을 포함하는 2 ％ FBS 함유 E-MEM 배지 5 ㎖ 를 첨가하고, 36 ℃, 5 ％ CO2 로 1 시간 정치하였다. 2 ％ FBS 함유 E-MEM 배지를 추가로 20 ㎖ 첨가하고, 36 ℃, 5 ％ CO2 에서 3 일간 배양하였다. 당해 배양 후의 배양액으로부터 상청을 제거하고, 2 ％ FBS 함유 E-MEM 배지를 20 ㎖ 첨가하고, 36 ℃, 5 ％ CO2 에서 2 일간 배양하였다. 그 후, 세포를 피펫팅에 의해 플라스크로부터 떼어 내고, 배양 상청과 함께 50 ㎖ 원심관에 회수하고, 1500 rpm 으로 10 분간 원심하여 배양 상청만을 회수하였다. 얻어진 배양 상청에 종농도 2 mM 이 되도록 염화칼슘을 첨가하여, 「칼슘 함유 RS 바이러스 용액」으로 하였다.
＜(2) Fc 태그 융합형 mTim4 단백질의 SH 기 비오틴 표지＞
실시예 122-123 및 비교예 42-43 의 ＜(1) Fc 태그 융합형 mTim4 단백질의 SH 기 비오틴 표지＞ 와 동일한 방법을 실시하여, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질 함유 PBS 용액 100 ㎕ 를 얻었다.
＜(3) SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질의 희석＞
실시예 122-123 및 비교예 42-43 의 ＜(2) SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질의 희석＞ 과 동일한 방법을 실시하여, SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질을 1 ㎍ 함유하는 용액 200 ㎕ 를 얻었다.
＜(4) 비즈의 세정＞
실시예 122-123 및 비교예 42-43 의 ＜(3) 비즈의 세정＞ 과 동일한 방법을 실시하여, 세정 조작을 실시한 MagCapture Tamavidin2-REV 를 얻었다.
＜(5) SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질의 비즈에의 고정＞
실시예 122-123 및 비교예 42-43 의 ＜(4) SH 기 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 단백질의 비즈에의 고정＞ 과 동일한 방법을 실시하여, 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 결합 담체 및 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 (비)결합 담체를 각각 얻었다.
또한, 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 결합 담체와 비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 비결합 담체를 합쳐 「Tim 단백질 (비)결합 담체」라고 약기하는 경우가 있다.
＜(6) 본 발명의 취득 방법에 의한 RS 바이러스의 취득＞
「종농도 2 mM 의 염화칼슘을 첨가한 칼슘 이온 함유의 인플루엔자 A 바이러스 용액 ((H1N1 A/WS/33 strain)(ATCC Code : VR-825) 60 ㎕」 대신에 「상기 (1) 에서 조제한 칼슘 이온 함유 RS 바이러스 용액 120 ㎕」를 사용한 것 이외에는, 실시예 122-123 및 비교예 42-43 의 ＜(5) 본 발명의 취득 방법에 의한 인플루엔자 바이러스의 취득＞ 과 동일한 방법을 실시하여, β-프로피오락톤 처리가 완료된 용출액 22.2 ㎕ 를 각각 얻었다.
또한, 각 실시예에서 사용한 담체의 종류, 및 Tim 단백질의 종류를 하기 표 41 에 나타낸다.
＜(7) 웨스턴 블롯팅＞
「칼슘 이온 함유의 인플루엔자 A 바이러스 용액 (H1N1 A/WS/33 strain)(ATCC Code : VR-825) 30 ㎕」 대신에 「상기 칼슘 이온 함유 RS 바이러스 용액 30 ㎕」를 사용하고, 「TBS-T 로 300 배 희석한 항인플루엔자 A 바이러스 Nucleoprotein 항체 C43 (Abcam 사 제조) 2 ㎖」 대신에 「TBS-T 로 500 배 희석한 항RS 바이러스 F 단백질 항체 2F7 (Abcam 사 제조) 2 ㎖」를 사용한 것 이외에는, 실시예 122-123 및 비교예 42-43 의 ＜(6) 웨스턴 블롯팅＞ 과 동일한 방법에 의해 실시하여, 발광 시그널을 검출하였다.
또한, 각 실시예에서 사용한 담체의 종류, Tim 단백질의 종류, 및 담체로부터의 용출액의 종류를 하기 표 42 에 나타낸다.
＜결과＞
얻어진 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 25 에 나타낸다. 도 25 에 있어서, 각 레인은 이하의 결과이다.
레인 1 : RS 바이러스를 전기 영동한 결과
레인 2 : 비교예 44 의 결과 (비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 비결합 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 3 : 비교예 45 의 결과 (비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 비결합 담체를 사용하고, 50 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 4 : 실시예 124 의 결과 (비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 결합 담체를 사용하고, 1 ％ SDS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
레인 5 : 실시예 125 의 결과 (비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 결합 담체를 사용하고, 50 mM EDTA 함유 TBS 용액을 용출액으로서 사용한 경우의 결과)
도 25 로부터, 레인 2-3 (비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 비결합 담체를 사용한 경우) 에 있어서, 어느 경우에서도 RS 바이러스의 마커 단백질인 F 단백질의 밴드는 보이지 않았던 것에 대해, 레인 4-5 (비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 결합 담체를 사용한 경우) 에 있어서, 어느 경우에서도 RS 바이러스의 마커 단백질인 F 단백질의 밴드가 보인 점에서, Tim 단백질을 결합시킨 담체는, RS 바이러스를 취득 가능한 것을 알 수 있었다.
또, 레인 1 (RS 바이러스를 전기 영동한 결과) 과 레인 4-5 (비오틴 표지 Fc 태그 융합형 mTim4 결합 담체를 사용한 경우의 결과) 의 비교로부터, Tim 단백질을 결합시킨 담체를 사용하는 것에 의해 효율적으로 RS 바이러스를 취득할 수 있는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 Tim 단백질 결합 담체, 당해 담체를 사용한 세포외막소포 및 바이러스의 취득 방법, 제거 방법 그리고 당해 담체를 포함하는 키트는, 종래의 세포외막소포 및 바이러스의 취득 방법 그리고 당해 취득 방법에 사용되는 항체 등을 포함하는 키트에 비해, 시료 중에 존재하는 세포외막소포 또는 바이러스를 고순도로, 또 인택트한 상태로 간편 또한 효율적으로 취득 또는 제거할 수 있다.
본 발명의 취득 방법에 의해 취득한 세포외막소포는 의약품 등으로서 이용되고, 또 취득한 바이러스는 백신이나 벡터 등으로서 이용되는 점에서, 본 발명의 Tim 단백질 결합 담체 및 본 발명의 취득 방법은 유용한 것이다.
본 발명의 제거 방법에 의해 세포외막소포 또는 바이러스를 제거한 시료는 생물 유래 세포외막소포나 엔벨로프 바이러스의 콘터미네이션을 방지한 것이 되고, 당해 시료를 사용한 연구 등에 이용되는 점에서, 본 발명의 Tim 단백질 결합 담체 및 본 발명의 제거 방법은 유용한 것이다.
본 발명의 Tim 단백질 결합 담체, 당해 담체를 사용한 세포외막소포 및 바이러스의 검출 방법은, 종래의 세포외막소포 및 바이러스의 검출 방법에 비해 시료 중의 세포외막소포 및 바이러스를 고감도로 검출할 수 있다.
본 발명의 검출 방법에 의하면 검체 중의 미량의 세포외막소포 및 바이러스를 검출하는 경우라도, 검체를 농축이나 정제 등 하지 않고 그대로 측정을 하는 것이 가능하므로, 본 발명의 Tim 단백질 결합 담체 및 본 발명의 검출 방법은 유용한 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
<120> Tim Protein Carrier, method for obtaining, removing or detecting
extracelluar vesicles and Virus particles using the carrier, and
the kit comprising the carrier
<130> 2001PCT
<150> JP 2014-246876
<151> 2014-12-05
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> mouse Tim4
<400> 1
Ala Ala Ser Glu Asp Thr Ile Ile Gly Phe Leu Gly Gln Pro Val Thr
1 5 10 15
Leu Pro Cys His Tyr Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Asn Ser Met Cys
20 25 30
Trp Gly Lys Gly Ser Cys Pro Asn Ser Lys Cys Asn Ala Glu Leu Leu
35 40 45
Arg Thr Asp Gly Thr Arg Ile Ile Ser Arg Lys Ser Thr Lys Tyr Thr
50 55 60
Leu Leu Gly Lys Val Gln Phe Gly Glu Val Ser Leu Thr Ile Ser Asn
65 70 75 80
Thr Asn Arg Gly Asp Ser Gly Val Tyr Cys Cys Arg Ile Glu Val Pro
85 90 95
Gly Trp Phe Asn Asp Val Lys Lys Asn Val Arg Leu Glu Leu Arg Arg
100 105 110
Ala Thr
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> human Tim4
<400> 2
Glu Thr Val Val Thr Glu Val Leu Gly His Arg Val Thr Leu Pro Cys
1 5 10 15
Leu Tyr Ser Ser Trp Ser His Asn Ser Asn Ser Met Cys Trp Gly Lys
20 25 30
Asp Gln Cys Pro Tyr Ser Gly Cys Lys Glu Ala Leu Ile Arg Thr Asp
35 40 45
Gly Met Arg Val Thr Ser Arg Lys Ser Ala Lys Tyr Arg Leu Gln Gly
50 55 60
Thr Ile Pro Arg Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Leu Asn Pro Ser Glu
65 70 75 80
Ser Asp Ser Gly Val Tyr Cys Cys Arg Ile Glu Val Pro Gly Trp Phe
85 90 95
Asn Asp Val Lys Ile Asn Val Arg Leu Asn Leu Gln Arg Ala Ser Thr
100 105 110
Thr
<210> 3
<211> 343
<212> PRT
<213> mouse Tim4
<400> 3
Met Ser Lys Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Val Thr Glu Leu Trp Trp
1 5 10 15
Leu Tyr Leu Thr Pro Ala Ala Ser Glu Asp Thr Ile Ile Gly Phe Leu
20 25 30
Gly Gln Pro Val Thr Leu Pro Cys His Tyr Leu Ser Trp Ser Gln Ser
35 40 45
Arg Asn Ser Met Cys Trp Gly Lys Gly Ser Cys Pro Asn Ser Lys Cys
50 55 60
Asn Ala Glu Leu Leu Arg Thr Asp Gly Thr Arg Ile Ile Ser Arg Lys
65 70 75 80
Ser Thr Lys Tyr Thr Leu Leu Gly Lys Val Gln Phe Gly Glu Val Ser
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Asn Thr Asn Arg Gly Asp Ser Gly Val Tyr Cys Cys
100 105 110
Arg Ile Glu Val Pro Gly Trp Phe Asn Asp Val Lys Lys Asn Val Arg
115 120 125
Leu Glu Leu Arg Arg Ala Thr Thr Thr Lys Lys Pro Thr Thr Thr Thr
130 135 140
Arg Pro Thr Thr Thr Pro Tyr Val Thr Thr Thr Thr Pro Glu Leu Leu
145 150 155 160
Pro Thr Thr Val Met Thr Thr Ser Val Leu Pro Thr Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Gln Thr Leu Ala Thr Thr Ala Phe Ser Thr Ala Val Thr Thr Cys Pro
180 185 190
Ser Thr Thr Pro Gly Ser Phe Ser Gln Glu Thr Thr Lys Gly Ser Ala
195 200 205
Phe Thr Thr Glu Ser Glu Thr Leu Pro Ala Ser Asn His Ser Gln Arg
210 215 220
Ser Met Met Thr Ile Ser Thr Asp Ile Ala Val Leu Arg Pro Thr Gly
225 230 235 240
Ser Asn Pro Gly Ile Leu Pro Ser Thr Ser Gln Leu Thr Thr Gln Lys
245 250 255
Thr Thr Leu Thr Thr Ser Glu Ser Leu Gln Lys Thr Thr Lys Ser His
260 265 270
Gln Ile Asn Ser Arg Gln Thr Ile Leu Ile Ile Ala Cys Cys Val Gly
275 280 285
Phe Val Leu Met Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Leu Leu Arg Gly Lys
290 295 300
Val Thr Gly Ala Asn Cys Leu Gln Arg His Lys Arg Pro Asp Asn Thr
305 310 315 320
Glu Asp Ser Asp Ser Val Leu Asn Asp Met Ser His Gly Arg Asp Asp
325 330 335
Glu Asp Gly Ile Phe Thr Leu
340
<210> 4
<211> 378
<212> PRT
<213> human Tim4
<400> 4
Met Ser Lys Glu Pro Leu Ile Leu Trp Leu Met Ile Glu Phe Trp Trp
1 5 10 15
Leu Tyr Leu Thr Pro Val Thr Ser Glu Thr Val Val Thr Glu Val Leu
20 25 30
Gly His Arg Val Thr Leu Pro Cys Leu Tyr Ser Ser Trp Ser His Asn
35 40 45
Ser Asn Ser Met Cys Trp Gly Lys Asp Gln Cys Pro Tyr Ser Gly Cys
50 55 60
Lys Glu Ala Leu Ile Arg Thr Asp Gly Met Arg Val Thr Ser Arg Lys
65 70 75 80
Ser Ala Lys Tyr Arg Leu Gln Gly Thr Ile Pro Arg Gly Asp Val Ser
85 90 95
Leu Thr Ile Leu Asn Pro Ser Glu Ser Asp Ser Gly Val Tyr Cys Cys
100 105 110
Arg Ile Glu Val Pro Gly Trp Phe Asn Asp Val Lys Ile Asn Val Arg
115 120 125
Leu Asn Leu Gln Arg Ala Ser Thr Thr Thr His Arg Thr Ala Thr Thr
130 135 140
Thr Thr Arg Arg Thr Thr Thr Thr Ser Pro Thr Thr Thr Arg Gln Met
145 150 155 160
Thr Thr Thr Pro Ala Ala Leu Pro Thr Thr Val Val Thr Thr Pro Asp
165 170 175
Leu Thr Thr Gly Thr Pro Leu Gln Met Thr Thr Ile Ala Val Phe Thr
180 185 190
Thr Ala Asn Thr Cys Leu Ser Leu Thr Pro Ser Thr Leu Pro Glu Glu
195 200 205
Ala Thr Gly Leu Leu Thr Pro Glu Pro Ser Lys Glu Gly Pro Ile Leu
210 215 220
Thr Ala Glu Ser Glu Thr Val Leu Pro Ser Asp Ser Trp Ser Ser Val
225 230 235 240
Glu Ser Thr Ser Ala Asp Thr Val Leu Leu Thr Ser Lys Glu Ser Lys
245 250 255
Val Trp Asp Leu Pro Ser Thr Ser His Val Ser Met Trp Lys Thr Ser
260 265 270
Asp Ser Val Ser Ser Pro Gln Pro Gly Ala Ser Asp Thr Ala Val Pro
275 280 285
Glu Gln Asn Lys Thr Thr Lys Thr Gly Gln Met Asp Gly Ile Pro Met
290 295 300
Ser Met Lys Asn Glu Met Pro Ile Ser Gln Leu Leu Met Ile Ile Ala
305 310 315 320
Pro Ser Leu Gly Phe Val Leu Phe Ala Leu Phe Val Ala Phe Leu Leu
325 330 335
Arg Gly Lys Leu Met Glu Thr Tyr Cys Ser Gln Lys His Thr Arg Leu
340 345 350
Asp Tyr Ile Gly Asp Ser Lys Asn Val Leu Asn Asp Val Gln His Gly
355 360 365
Arg Glu Asp Glu Asp Gly Leu Phe Thr Leu
370 375
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<211> 252
<212> PRT
<213> mouse Tim4
<400> 5
Ala Ala Ser Glu Asp Thr Ile Ile Gly Phe Leu Gly Gln Pro Val Thr
1 5 10 15
Leu Pro Cys His Tyr Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Asn Ser Met Cys
20 25 30
Trp Gly Lys Gly Ser Cys Pro Asn Ser Lys Cys Asn Ala Glu Leu Leu
35 40 45
Arg Thr Asp Gly Thr Arg Ile Ile Ser Arg Lys Ser Thr Lys Tyr Thr
50 55 60
Leu Leu Gly Lys Val Gln Phe Gly Glu Val Ser Leu Thr Ile Ser Asn
65 70 75 80
Thr Asn Arg Gly Asp Ser Gly Val Tyr Cys Cys Arg Ile Glu Val Pro
85 90 95
Gly Trp Phe Asn Asp Val Lys Lys Asn Val Arg Leu Glu Leu Arg Arg
100 105 110
Ala Thr Thr Thr Lys Lys Pro Thr Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr Thr
115 120 125
Pro Tyr Val Thr Thr Thr Thr Pro Glu Leu Leu Pro Thr Thr Val Met
130 135 140
Thr Thr Ser Val Leu Pro Thr Thr Thr Pro Pro Gln Thr Leu Ala Thr
145 150 155 160
Thr Ala Phe Ser Thr Ala Val Thr Thr Cys Pro Ser Thr Thr Pro Gly
165 170 175
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Glu Thr Leu Pro Ala Ser Asn His Ser Gln Arg Ser Met Met Thr Ile
195 200 205
Ser Thr Asp Ile Ala Val Leu Arg Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gly Ile
210 215 220
Leu Pro Ser Thr Ser Gln Leu Thr Thr Gln Lys Thr Thr Leu Thr Thr
225 230 235 240
Ser Glu Ser Leu Gln Lys Thr Thr Lys Ser His Gln
245 250
<210> 6
<211> 258
<212> PRT
<213> mouse Tim4
<400> 6
Ala Ala Ser Glu Asp Thr Ile Ile Gly Phe Leu Gly Gln Pro Val Thr
1 5 10 15
Leu Pro Cys His Tyr Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Asn Ser Met Cys
20 25 30
Trp Gly Lys Gly Ser Cys Pro Asn Ser Lys Cys Asn Ala Glu Leu Leu
35 40 45
Arg Thr Asp Gly Thr Arg Ile Ile Ser Arg Lys Ser Thr Lys Tyr Thr
50 55 60
Leu Leu Gly Lys Val Gln Phe Gly Glu Val Ser Leu Thr Ile Ser Asn
65 70 75 80
Thr Asn Arg Gly Asp Ser Gly Val Tyr Cys Cys Arg Ile Glu Val Pro
85 90 95
Gly Trp Phe Asn Asp Val Lys Lys Asn Val Arg Leu Glu Leu Arg Arg
100 105 110
Ala Thr Thr Thr Lys Lys Pro Thr Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr Thr
115 120 125
Pro Tyr Val Thr Thr Thr Thr Pro Glu Leu Leu Pro Thr Thr Val Met
130 135 140
Thr Thr Ser Val Leu Pro Thr Thr Thr Pro Pro Gln Thr Leu Ala Thr
145 150 155 160
Thr Ala Phe Ser Thr Ala Val Thr Thr Cys Pro Ser Thr Thr Pro Gly
165 170 175
Ser Phe Ser Gln Glu Thr Thr Lys Gly Ser Ala Phe Thr Thr Glu Ser
180 185 190
Glu Thr Leu Pro Ala Ser Asn His Ser Gln Arg Ser Met Met Thr Ile
195 200 205
Ser Thr Asp Ile Ala Val Leu Arg Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gly Ile
210 215 220
Leu Pro Ser Thr Ser Gln Leu Thr Thr Gln Lys Thr Thr Leu Thr Thr
225 230 235 240
Ser Glu Ser Leu Gln Lys Thr Thr Lys Ser His Gln Ile Asn Ser Arg
245 250 255
Gln Thr
<210> 7
<211> 291
<212> PRT
<213> human Tim4
<400> 7
Glu Thr Val Val Thr Glu Val Leu Gly His Arg Val Thr Leu Pro Cys
1 5 10 15
Leu Tyr Ser Ser Trp Ser His Asn Ser Asn Ser Met Cys Trp Gly Lys
20 25 30
Asp Gln Cys Pro Tyr Ser Gly Cys Lys Glu Ala Leu Ile Arg Thr Asp
35 40 45
Gly Met Arg Val Thr Ser Arg Lys Ser Ala Lys Tyr Arg Leu Gln Gly
50 55 60
Thr Ile Pro Arg Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Leu Asn Pro Ser Glu
65 70 75 80
Ser Asp Ser Gly Val Tyr Cys Cys Arg Ile Glu Val Pro Gly Trp Phe
85 90 95
Asn Asp Val Lys Ile Asn Val Arg Leu Asn Leu Gln Arg Ala Ser Thr
100 105 110
Thr Thr His Arg Thr Ala Thr Thr Thr Thr Arg Arg Thr Thr Thr Thr
115 120 125
Ser Pro Thr Thr Thr Arg Gln Met Thr Thr Thr Pro Ala Ala Leu Pro
130 135 140
Thr Thr Val Val Thr Thr Pro Asp Leu Thr Thr Gly Thr Pro Leu Gln
145 150 155 160
Met Thr Thr Ile Ala Val Phe Thr Thr Ala Asn Thr Cys Leu Ser Leu
165 170 175
Thr Pro Ser Thr Leu Pro Glu Glu Ala Thr Gly Leu Leu Thr Pro Glu
180 185 190
Pro Ser Lys Glu Gly Pro Ile Leu Thr Ala Glu Ser Glu Thr Val Leu
195 200 205
Pro Ser Asp Ser Trp Ser Ser Val Glu Ser Thr Ser Ala Asp Thr Val
210 215 220
Leu Leu Thr Ser Lys Glu Ser Lys Val Trp Asp Leu Pro Ser Thr Ser
225 230 235 240
His Val Ser Met Trp Lys Thr Ser Asp Ser Val Ser Ser Pro Gln Pro
245 250 255
Gly Ala Ser Asp Thr Ala Val Pro Glu Gln Asn Lys Thr Thr Lys Thr
260 265 270
Gly Gln Met Asp Gly Ile Pro Met Ser Met Lys Asn Glu Met Pro Ile
275 280 285
Ser Gln Leu
290
<210> 8
<211> 110
<212> PRT
<213> mouse Tim1
<400> 8
Tyr Val Glu Val Lys Gly Val Val Gly His Pro Val Thr Leu Pro Cys
1 5 10 15
Thr Tyr Ser Thr Tyr Arg Gly Ile Thr Thr Thr Cys Trp Gly Arg Gly
20 25 30
Gln Cys Pro Ser Ser Ala Cys Gln Asn Thr Leu Ile Trp Thr Asn Gly
35 40 45
His Arg Val Thr Tyr Gln Lys Ser Ser Arg Tyr Asn Leu Lys Gly His
50 55 60
Ile Ser Glu Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Asp Ser Gly Leu Tyr Cys Cys Arg Val Glu Ile Pro Gly Trp Phe Asn
85 90 95
Asp Gln Lys Val Thr Phe Ser Leu Gln Val Lys Pro Glu Ile
100 105 110
<210> 9
<211> 110
<212> PRT
<213> human Tim1
<400> 9
Ser Val Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Val Thr Leu Pro Cys
1 5 10 15
His Tyr Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cys Trp Asn Arg Gly Ser Cys
20 25 30
Ser Leu Phe Thr Cys Gln Asn Gly Ile Val Trp Thr Asn Gly Thr His
35 40 45
Val Thr Tyr Arg Lys Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu Gly Asp Leu Ser
50 55 60
Arg Arg Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Thr Ala Val Ser Asp Ser
65 70 75 80
Gly Val Tyr Cys Cys Arg Val Glu His Arg Gly Trp Phe Asn Asp Met
85 90 95
Lys Ile Thr Val Ser Leu Glu Ile Val Pro Pro Lys Val Thr
100 105 110
<210> 10
<211> 282
<212> PRT
<213> mouse Tim1
<400> 10
Met Asn Gln Ile Gln Val Phe Ile Ser Gly Leu Ile Leu Leu Leu Pro
1 5 10 15
Gly Ala Val Asp Ser Tyr Val Glu Val Lys Gly Val Val Gly His Pro
20 25 30
Val Thr Leu Pro Cys Thr Tyr Ser Thr Tyr Arg Gly Ile Thr Thr Thr
35 40 45
Cys Trp Gly Arg Gly Gln Cys Pro Ser Ser Ala Cys Gln Asn Thr Leu
50 55 60
Ile Trp Thr Asn Gly His Arg Val Thr Tyr Gln Lys Ser Ser Arg Tyr
65 70 75 80
Asn Leu Lys Gly His Ile Ser Glu Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu
85 90 95
Asn Ser Val Glu Ser Asp Ser Gly Leu Tyr Cys Cys Arg Val Glu Ile
100 105 110
Pro Gly Trp Phe Asn Asp Gln Lys Val Thr Phe Ser Leu Gln Val Lys
115 120 125
Pro Glu Ile Pro Thr Arg Pro Pro Arg Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro
130 135 140
Thr Ala Thr Gly Arg Pro Thr Thr Ile Ser Thr Arg Ser Thr His Val
145 150 155 160
Pro Thr Ser Thr Arg Val Ser Thr Ser Thr Pro Pro Thr Ser Thr His
165 170 175
Thr Trp Thr His Lys Pro Asp Trp Asn Gly Thr Val Thr Ser Ser Gly
180 185 190
Asp Thr Trp Ser Asn His Thr Glu Ala Ile Pro Pro Gly Lys Pro Gln
195 200 205
Lys Asn Pro Thr Lys Gly Phe Tyr Val Gly Ile Cys Ile Ala Ala Leu
210 215 220
Leu Leu Leu Leu Leu Val Ser Thr Val Ala Ile Thr Arg Tyr Ile Leu
225 230 235 240
Met Lys Arg Lys Ser Ala Ser Leu Ser Val Val Ala Phe Arg Val Ser
245 250 255
Lys Ile Glu Ala Leu Gln Asn Ala Ala Val Val His Ser Arg Ala Glu
260 265 270
Asp Asn Ile Tyr Ile Val Glu Asp Arg Pro
275 280
<210> 11
<211> 364
<212> PRT
<213> human Tim1
<400> 11
Met His Pro Gln Val Val Ile Leu Ser Leu Ile Leu His Leu Ala Asp
1 5 10 15
Ser Val Ala Gly Ser Val Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Val
20 25 30
Thr Leu Pro Cys His Tyr Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cys Trp Asn
35 40 45
Arg Gly Ser Cys Ser Leu Phe Thr Cys Gln Asn Gly Ile Val Trp Thr
50 55 60
Asn Gly Thr His Val Thr Tyr Arg Lys Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu
65 70 75 80
Gly Asp Leu Ser Arg Arg Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Thr Ala
85 90 95
Val Ser Asp Ser Gly Val Tyr Cys Cys Arg Val Glu His Arg Gly Trp
100 105 110
Phe Asn Asp Met Lys Ile Thr Val Ser Leu Glu Ile Val Pro Pro Lys
115 120 125
Val Thr Thr Thr Pro Ile Val Thr Thr Val Pro Thr Val Thr Thr Val
130 135 140
Arg Thr Ser Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Met Thr Thr
145 150 155 160
Val Pro Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Met Ser Ile Pro Thr Thr Thr
165 170 175
Thr Val Leu Thr Thr Met Thr Val Ser Thr Thr Thr Ser Val Pro Thr
180 185 190
Thr Thr Ser Ile Pro Thr Thr Thr Ser Val Pro Val Thr Thr Thr Val
195 200 205
Ser Thr Phe Val Pro Pro Met Pro Leu Pro Arg Gln Asn His Glu Pro
210 215 220
Val Ala Thr Ser Pro Ser Ser Pro Gln Pro Ala Glu Thr His Pro Thr
225 230 235 240
Thr Leu Gln Gly Ala Ile Arg Arg Glu Pro Thr Ser Ser Pro Leu Tyr
245 250 255
Ser Tyr Thr Thr Asp Gly Asn Asp Thr Val Thr Glu Ser Ser Asp Gly
260 265 270
Leu Trp Asn Asn Asn Gln Thr Gln Leu Phe Leu Glu His Ser Leu Leu
275 280 285
Thr Ala Asn Thr Thr Lys Gly Ile Tyr Ala Gly Val Cys Ile Ser Val
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Leu Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Val Ile Ile Ala Lys Lys Tyr Phe
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Phe Lys Lys Glu Val Gln Gln Leu Ser Val Ser Phe Ser Ser Leu Gln
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Ile Lys Ala Leu Gln Asn Ala Val Glu Lys Glu Val Gln Ala Glu Asp
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Asn Ile Tyr Ile Glu Asn Ser Leu Tyr Ala Thr Asp
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<211> 191
<212> PRT
<213> mouse Tim1
<400> 12
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1 5 10 15
Thr Tyr Ser Thr Tyr Arg Gly Ile Thr Thr Thr Cys Trp Gly Arg Gly
20 25 30
Gln Cys Pro Ser Ser Ala Cys Gln Asn Thr Leu Ile Trp Thr Asn Gly
35 40 45
His Arg Val Thr Tyr Gln Lys Ser Ser Arg Tyr Asn Leu Lys Gly His
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Ser Gly Leu Tyr Cys Cys Arg Val Glu Ile Pro Gly Trp Phe Asn
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Arg Pro Pro Arg Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro Thr Ala Thr Gly Arg
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Pro Asp Trp Asn Gly Thr Val Thr Ser Ser Gly Asp Thr Trp Ser Asn
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His Thr Glu Ala Ile Pro Pro Gly Lys Pro Gln Lys Asn Pro Thr
180 185 190
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<211> 275
<212> PRT
<213> human Tim1
<400> 13
Ser Val Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Val Thr Leu Pro Cys
1 5 10 15
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Ser Leu Phe Thr Cys Gln Asn Gly Ile Val Trp Thr Asn Gly Thr His
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Gly Val Tyr Cys Cys Arg Val Glu His Arg Gly Trp Phe Asn Asp Met
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Ala Ile Arg Arg Glu Pro Thr Ser Ser Pro Leu Tyr Ser Tyr Thr Thr
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Asp Gly Asn Asp Thr Val Thr Glu Ser Ser Asp Gly Leu Trp Asn Asn
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Asn Gln Thr Gln Leu Phe Leu Glu His Ser Leu Leu Thr Ala Asn Thr
260 265 270
Thr Lys Gly
275
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<211> 113
<212> PRT
<213> mouse Tim3
<400> 14
Leu Glu Asn Ala Tyr Val Phe Glu Val Gly Lys Asn Ala Tyr Leu Pro
1 5 10 15
Cys Ser Tyr Thr Leu Ser Thr Pro Gly Ala Leu Val Pro Met Cys Trp
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Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr Asn Glu Leu Leu Arg
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Thr Leu Asp Asp His Gly Thr Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Phe Pro Gly
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Leu Met Asn Asp Lys Lys Leu Glu Leu Lys Leu Asp Ile Lys Ala Ala
100 105 110
Lys
<210> 15
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<212> PRT
<213> human Tim3
<400> 15
Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro
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Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp
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Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg
35 40 45
Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn
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Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr
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Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile
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Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys
100 105 110
Val Thr
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<211> 281
<212> PRT
<213> mouse Tim3
<400> 16
Met Phe Ser Gly Leu Thr Leu Asn Cys Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ala Arg Ser Leu Glu Asn Ala Tyr Val Phe Glu Val Gly Lys
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Ser Thr Pro Gly Ala Leu
35 40 45
Val Pro Met Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Arg Tyr Gln Leu Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu
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100 105 110
Ile Gln Phe Pro Gly Leu Met Asn Asp Lys Lys Leu Glu Leu Lys Leu
115 120 125
Asp Ile Lys Ala Ala Lys Val Thr Pro Ala Gln Thr Ala His Gly Asp
130 135 140
Ser Thr Thr Ala Ser Pro Arg Thr Leu Thr Thr Glu Arg Asn Gly Ser
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Glu Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu His Asn Asn Asn Gly Thr Lys Ile
165 170 175
Ser Thr Trp Ala Asp Glu Ile Lys Asp Ser Gly Glu Thr Ile Arg Thr
180 185 190
Ala Ile His Ile Gly Val Gly Val Ser Ala Gly Leu Thr Leu Ala Leu
195 200 205
Ile Ile Gly Val Leu Ile Leu Lys Trp Tyr Ser Cys Lys Lys Lys Lys
210 215 220
Leu Ser Ser Leu Ser Leu Ile Thr Leu Ala Asn Leu Pro Pro Gly Gly
225 230 235 240
Leu Ala Asn Ala Gly Ala Val Arg Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr
245 250 255
Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr Glu Val Glu Asn Ser Asn Glu Tyr Tyr
260 265 270
Cys Tyr Val Asn Ser Gln Gln Pro Ser
275 280
<210> 17
<211> 301
<212> PRT
<213> human Tim3
<400> 17
Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu
35 40 45
Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly
50 55 60
Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser
65 70 75 80
Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile
100 105 110
Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val
115 120 125
Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe
130 135 140
Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu
180 185 190
Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly
195 200 205
Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe
210 215 220
Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile
225 230 235 240
Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu
245 250 255
Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr
260 265 270
Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln
275 280 285
Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro
290 295 300
<210> 18
<211> 168
<212> PRT
<213> mouse Tim3
<400> 18
Leu Glu Asn Ala Tyr Val Phe Glu Val Gly Lys Asn Ala Tyr Leu Pro
1 5 10 15
Cys Ser Tyr Thr Leu Ser Thr Pro Gly Ala Leu Val Pro Met Cys Trp
20 25 30
Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr Asn Glu Leu Leu Arg
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Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser Ser Arg Tyr Gln Leu
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Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu Ile Ile Lys Asn Val
65 70 75 80
Thr Leu Asp Asp His Gly Thr Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Phe Pro Gly
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100 105 110
Lys Val Thr Pro Ala Gln Thr Ala His Gly Asp Ser Thr Thr Ala Ser
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130 135 140
Val Thr Leu His Asn Asn Asn Gly Thr Lys Ile Ser Thr Trp Ala Asp
145 150 155 160
Glu Ile Lys Asp Ser Gly Glu Thr
165
<210> 19
<211> 179
<212> PRT
<213> human Tim3
<400> 19
Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro
1 5 10 15
Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp
20 25 30
Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg
35 40 45
Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn
50 55 60
Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr
65 70 75 80
Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile
85 90 95
Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys
100 105 110
Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro
115 120 125
Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu
130 135 140
Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn
145 150 155 160
Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala
165 170 175
Thr Ile Arg
<210> 20
<211> 1032
<212> DNA
<213> mouse Tim4
<400> 20
atgtccaagg ggcttctcct cctctggctg gtgacggagc tctggtggct ttatctgaca 60
ccagctgcct cagaggatac aataataggg tttttgggcc agccggtgac tttgccttgt 120
cattacctct cgtggtccca gagccgcaac agtatgtgct ggggcaaagg ttcatgtccc 180
aattccaagt gcaatgcaga gcttctccgt acagatggaa caagaatcat ctccaggaag 240
tcaacaaaat atacactttt ggggaaggtc cagtttggtg aagtgtcctt gaccatctca 300
aacaccaatc gaggtgacag tggggtgtac tgctgccgta tagaggtgcc tggctggttc 360
aatgatgtca agaagaatgt gcgcttggag ctgaggagag ccacaacaac caaaaaacca 420
acaacaacca cccggccaac caccacccct tatgtgacca ccaccacccc agagctgctt 480
ccaacaacag tcatgaccac atctgttctc ccaaccacca caccacccca gacactagcc 540
accactgcct tcagtacagc agtgaccacg tgcccctcaa caacacctgg ctccttctca 600
caagaaacca caaaagggtc cgccttcact acagaatcag aaactctgcc tgcatccaat 660
cactctcaaa gaagcatgat gaccatatct acagacatag ccgtactcag gcccacaggc 720
tctaaccctg ggattctccc atccacttca cagctgacga cacagaaaac aacattaaca 780
acaagtgagt ctttgcagaa gacaactaaa tcacatcaga tcaacagcag acagaccatc 840
ttgatcattg cctgctgtgt gggatttgtg ctaatggtgt tattgtttct ggcgtttctc 900
cttcgaggga aagtcacagg agccaactgt ttgcagagac acaagaggcc agacaacact 960
gaagatagtg acagcgtcct caatgacatg tcacacggga gggatgatga agacgggatc 1020
ttcactctct ga 1032
<210> 21
<211> 1137
<212> DNA
<213> human Tim4
<400> 21
atgtccaaag aacctctcat tctctggctg atgattgagt tttggtggct ttacctgaca 60
ccagtcactt cagagactgt tgtgacggag gttttgggtc accgggtgac tttgccctgt 120
ctgtactcat cctggtctca caacagcaac agcatgtgct gggggaaaga ccagtgcccc 180
tactccggtt gcaaggaggc gctcatccgc actgatggaa tgagggtgac ctcaagaaag 240
tcagcaaaat atagacttca ggggactatc ccgagaggtg atgtctcctt gaccatctta 300
aaccccagtg aaagtgacag cggtgtgtac tgctgccgca tagaagtgcc tggctggttc 360
aacgatgtaa agataaacgt gcgcctgaat ctacagagag cctcaacaac cacgcacaga 420
acagcaacca ccaccacacg cagaacaaca acaacaagcc ccaccaccac ccgacaaatg 480
acaacaaccc cagctgcact tccaacaaca gtcgtgacca cacccgatct cacaaccgga 540
acaccactcc agatgacaac cattgccgtc ttcacaacag caaacacgtg cctttcacta 600
accccaagca cccttccgga ggaagccaca ggtcttctga ctcccgagcc ttctaaggaa 660
gggcccatcc tcactgcaga atcagaaact gtcctcccca gtgattcctg gagtagtgtt 720
gagtctactt ctgctgacac tgtcctgctg acatccaaag agtccaaagt ttgggatctc 780
ccatcaacat cccacgtgtc aatgtggaaa acgagtgatt ctgtgtcttc tcctcagcct 840
ggagcatctg atacagcagt tcctgagcag aacaaaacaa caaaaacagg acagatggat 900
ggaataccca tgtcaatgaa gaatgaaatg cccatctccc aactactgat gatcatcgcc 960
ccctccttgg gatttgtgct cttcgcattg tttgtggcgt ttctcctgag agggaaactc 1020
atggaaacct attgttcgca gaaacacaca aggctagact acattggaga tagtaaaaat 1080
gtcctcaatg acgtgcagca tggaagggaa gacgaagacg gcctttttac cctctaa 1137
<210> 22
<211> 849
<212> DNA
<213> mouse Tim1
<400> 22
atgaatcaga ttcaagtctt catttcaggc ctcatactgc ttctcccagg cgctgtggat 60
tcttatgtgg aagtaaaggg ggtggtgggt caccctgtca cacttccatg tacttactca 120
acatatcgtg gaatcacaac gacatgttgg ggccgagggc aatgcccatc ttctgcttgt 180
caaaatacac ttatttggac caatggacat cgtgtcacct atcagaagag cagtcggtac 240
aacttaaagg ggcatatttc agaaggagat gtgtccttga cgatagagaa ctctgttgag 300
agtgacagtg gtctgtattg ttgtcgagtg gagattcctg gatggtttaa tgatcagaaa 360
gtgacctttt cattgcaagt taaaccagag attcccacac gtcctccaag aagacccaca 420
actacaaggc ccacagctac aggaagaccc acgactattt caacaagatc cacacatgta 480
ccaacatcaa ccagagtctc tacctccact cctccaacat ctacacacac atggactcac 540
aaaccagact ggaatggcac tgtgacatcc tcaggagata cctggagtaa tcacactgaa 600
gcaatccctc cagggaagcc gcagaaaaac cctactaagg gcttctatgt tggcatctgc 660
atcgcagccc tgctgctact gctccttgtg agcaccgtgg ctatcaccag gtacatactt 720
atgaaaagga agtcagcatc tctaagcgtg gttgccttcc gtgtctctaa gattgaagct 780
ttgcagaacg cagcggttgt gcattcccga gctgaagaca acatctacat tgttgaagat 840
agaccttga 849
<210> 23
<211> 1095
<212> DNA
<213> human Tim1
<400> 23
atgcatcctc aagtggtcat cttaagcctc atcctacatc tggcagattc tgtagctggt 60
tctgtaaagg ttggtggaga ggcaggtcca tctgtcacac taccctgcca ctacagtgga 120
gctgtcacat ccatgtgctg gaatagaggc tcatgttctc tattcacatg ccaaaatggc 180
attgtctgga ccaatggaac ccacgtcacc tatcggaagg acacacgcta taagctattg 240
ggggaccttt caagaaggga tgtctctttg accatagaaa atacagctgt gtctgacagt 300
ggcgtatatt gttgccgtgt tgagcaccgt gggtggttca atgacatgaa aatcaccgta 360
tcattggaga ttgtgccacc caaggtcacg actactccaa ttgtcacaac tgttccaacc 420
gtcacgactg ttcgaacgag caccactgtt ccaacgacaa cgactgttcc aatgacgact 480
gttccaacga caactgttcc aacaacaatg agcattccaa cgacaacgac tgttctgacg 540
acaatgactg tttcaacgac aacgagcgtt ccaacgacaa cgagcattcc aacaacaaca 600
agtgttccag tgacaacaac tgtctctacc tttgttcctc caatgccttt gcccaggcag 660
aaccatgaac cagtagccac ttcaccatct tcacctcagc cagcagaaac ccaccctacg 720
acactgcagg gagcaataag gagagaaccc accagctcac cattgtactc ttacacaaca 780
gatgggaatg acaccgtgac agagtcttca gatggccttt ggaataacaa tcaaactcaa 840
ctgttcctag aacatagtct actgacggcc aataccacta aaggaatcta tgctggagtc 900
tgtatttctg tcttggtgct tcttgctctt ttgggtgtca tcattgccaa aaagtatttc 960
ttcaaaaagg aggttcaaca actaagtgtt tcatttagca gccttcaaat taaagctttg 1020
caaaatgcag ttgaaaagga agtccaagca gaagacaata tctacattga gaatagtctt 1080
tatgccacgg actaa 1095
<210> 24
<211> 846
<212> DNA
<213> mouse Tim3
<400> 24
atgttttcag gtcttaccct caactgtgtc ctgctgctgc tgcaactact acttgcaagg 60
tcattggaaa atgcttatgt gtttgaggtt ggtaagaatg cctatctgcc ctgcagttac 120
actctatcta cacctggggc acttgtgcct atgtgctggg gcaagggatt ctgtccttgg 180
tcacagtgta ccaacgagtt gctcagaact gatgaaagaa atgtgacata tcagaaatcc 240
agcagatacc agctaaaggg cgatctcaac aaaggagacg tgtctctgat cataaagaat 300
gtgactctgg atgaccatgg gacctactgc tgcaggatac agttccctgg tcttatgaat 360
gataaaaaat tagaactgaa attagacatc aaagcagcca aggtcactcc agctcagact 420
gcccatgggg actctactac agcttctcca agaaccctaa ccacggagag aaatggttca 480
gagacacaga cactggtgac cctccataat aacaatggaa caaaaatttc cacatgggct 540
gatgaaatta aggactctgg agaaacgatc agaactgcta tccacattgg agtgggagtc 600
tctgctgggt tgaccctggc acttatcatt ggtgtcttaa tccttaaatg gtattcctgt 660
aagaaaaaga agttatcgag tttgagcctt attacactgg ccaacttgcc tccaggaggg 720
ttggcaaatg caggagcagt caggattcgc tctgaggaaa atatctacac catcgaggag 780
aacgtatatg aagtggagaa ttcaaatgag tactactgct acgtcaacag ccagcagcca 840
tcctga 846
<210> 25
<211> 906
<212> DNA
<213> human Tim3
<400> 25
atgttttcac atcttccctt tgactgtgtc ctgctgctgc tgctgctact acttacaagg 60
tcctcagaag tggaatacag agcggaggtc ggtcagaatg cctatctgcc ctgcttctac 120
accccagccg ccccagggaa cctcgtgccc gtctgctggg gcaaaggagc ctgtcctgtg 180
tttgaatgtg gcaacgtggt gctcaggact gatgaaaggg atgtgaatta ttggacatcc 240
agatactggc taaatgggga tttccgcaaa ggagatgtgt ccctgaccat agagaatgtg 300
actctagcag acagtgggat ctactgctgc cggatccaaa tcccaggcat aatgaatgat 360
gaaaaattta acctgaagtt ggtcatcaaa ccagccaagg tcacccctgc accgactcgg 420
cagagagact tcactgcagc ctttccaagg atgcttacca ccaggggaca tggcccagca 480
gagacacaga cactggggag cctccctgat ataaatctaa cacaaatatc cacattggcc 540
aatgagttac gggactctag attggccaat gacttacggg actctggagc aaccatcaga 600
ataggcatct acatcggagc agggatctgt gctgggctgg ctctggctct tatcttcggc 660
gctttaattt tcaaatggta ttctcatagc aaagagaaga tacagaattt aagcctcatc 720
tctttggcca acctccctcc ctcaggattg gcaaatgcag tagcagaggg aattcgctca 780
gaagaaaaca tctataccat tgaagagaac gtatatgaag tggaggagcc caatgagtat 840
tattgctatg tcagcagcag gcagcaaccc tcacaacctt tgggttgtcg ctttgcaatg 900
ccatag 906
<210> 26
<211> 822
<212> DNA
<213> mouse Tim4
<400> 26
atgtccaagg ggcttctcct cctctggctg gtgacggagc tctggtggct ttatctgaca 60
ccagctgcct cagaggatac aataataggg tttttgggcc agccggtgac tttgccttgt 120
cattacctct cgtggtccca gagccgcaac agtatgtgct ggggcaaagg ttcatgtccc 180
aattccaagt gcaatgcaga gcttctccgt acagatggaa caagaatcat ctccaggaag 240
tcaacaaaat atacactttt ggggaaggtc cagtttggtg aagtgtcctt gaccatctca 300
aacaccaatc gaggtgacag tggggtgtac tgctgccgta tagaggtgcc tggctggttc 360
aatgatgtca agaagaatgt gcgcttggag ctgaggagag ccacaacaac caaaaaacca 420
acaacaacca cccggccaac caccacccct tatgtgacca ccaccacccc agagctgctt 480
ccaacaacag tcatgaccac atctgttctc ccaaccacca caccacccca gacactagcc 540
accactgcct tcagtacagc agtgaccacg tgcccctcaa caacacctgg ctccttctca 600
caagaaacca caaaagggtc cgccttcact acagaatcag aaactctgcc tgcatccaat 660
cactctcaaa gaagcatgat gaccatatct acagacatag ccgtactcag gcccacaggc 720
tctaaccctg ggattctccc atccacttca cagctgacga cacagaaaac aacattaaca 780
acaagtgagt ctttgcagaa gacaactaaa tcacatcagt ga 822
<210> 27
<211> 840
<212> DNA
<213> mouse Tim4
<400> 27
atgtccaagg ggcttctcct cctctggctg gtgacggagc tctggtggct ttatctgaca 60
ccagctgcct cagaggatac aataataggg tttttgggcc agccggtgac tttgccttgt 120
cattacctct cgtggtccca gagccgcaac agtatgtgct ggggcaaagg ttcatgtccc 180
aattccaagt gcaatgcaga gcttctccgt acagatggaa caagaatcat ctccaggaag 240
tcaacaaaat atacactttt ggggaaggtc cagtttggtg aagtgtcctt gaccatctca 300
aacaccaatc gaggtgacag tggggtgtac tgctgccgta tagaggtgcc tggctggttc 360
aatgatgtca agaagaatgt gcgcttggag ctgaggagag ccacaacaac caaaaaacca 420
acaacaacca cccggccaac caccacccct tatgtgacca ccaccacccc agagctgctt 480
ccaacaacag tcatgaccac atctgttctc ccaaccacca caccacccca gacactagcc 540
accactgcct tcagtacagc agtgaccacg tgcccctcaa caacacctgg ctccttctca 600
caagaaacca caaaagggtc cgccttcact acagaatcag aaactctgcc tgcatccaat 660
cactctcaaa gaagcatgat gaccatatct acagacatag ccgtactcag gcccacaggc 720
tctaaccctg ggattctccc atccacttca cagctgacga cacagaaaac aacattaaca 780
acaagtgagt ctttgcagaa gacaactaaa tcacatcaga tcaacagcag acagacctga 840
<210> 28
<211> 948
<212> DNA
<213> human Tim4
<400> 28
atgtccaaag aacctctcat tctctggctg atgattgagt tttggtggct ttacctgaca 60
ccagtcactt cagagactgt tgtgacggag gttttgggtc accgggtgac tttgccctgt 120
ctgtactcat cctggtctca caacagcaac agcatgtgct gggggaaaga ccagtgcccc 180
tactccggtt gcaaggaggc gctcatccgc actgatggaa tgagggtgac ctcaagaaag 240
tcagcaaaat atagacttca ggggactatc ccgagaggtg atgtctcctt gaccatctta 300
aaccccagtg aaagtgacag cggtgtgtac tgctgccgca tagaagtgcc tggctggttc 360
aacgatgtaa agataaacgt gcgcctgaat ctacagagag cctcaacaac cacgcacaga 420
acagcaacca ccaccacacg cagaacaaca acaacaagcc ccaccaccac ccgacaaatg 480
acaacaaccc cagctgcact tccaacaaca gtcgtgacca cacccgatct cacaaccgga 540
acaccactcc agatgacaac cattgccgtc ttcacaacag caaacacgtg cctttcacta 600
accccaagca cccttccgga ggaagccaca ggtcttctga ctcccgagcc ttctaaggaa 660
gggcccatcc tcactgcaga atcagaaact gtcctcccca gtgattcctg gagtagtgtt 720
gagtctactt ctgctgacac tgtcctgctg acatccaaag agtccaaagt ttgggatctc 780
ccatcaacat cccacgtgtc aatgtggaaa acgagtgatt ctgtgtcttc tcctcagcct 840
ggagcatctg atacagcagt tcctgagcag aacaaaacaa caaaaacagg acagatggat 900
ggaataccca tgtcaatgaa gaatgaaatg cccatctccc aactatga 948
<210> 29
<211> 639
<212> DNA
<213> mouse Tim1
<400> 29
atgaatcaga ttcaagtctt catttcaggc ctcatactgc ttctcccagg cgctgtggat 60
tcttatgtgg aagtaaaggg ggtggtgggt caccctgtca cacttccatg tacttactca 120
acatatcgtg gaatcacaac gacatgttgg ggccgagggc aatgcccatc ttctgcttgt 180
caaaatacac ttatttggac caatggacat cgtgtcacct atcagaagag cagtcggtac 240
aacttaaagg ggcatatttc agaaggagat gtgtccttga cgatagagaa ctctgttgag 300
agtgacagtg gtctgtattg ttgtcgagtg gagattcctg gatggtttaa tgatcagaaa 360
gtgacctttt cattgcaagt taaaccagag attcccacac gtcctccaag aagacccaca 420
actacaaggc ccacagctac aggaagaccc acgactattt caacaagatc cacacatgta 480
ccaacatcaa ccagagtctc tacctccact cctccaacat ctacacacac atggactcac 540
aaaccagact ggaatggcac tgtgacatcc tcaggagata cctggagtaa tcacactgaa 600
gcaatccctc cagggaagcc gcagaaaaac cctacttga 639
<210> 30
<211> 888
<212> DNA
<213> human Tim1
<400> 30
atgcatcctc aagtggtcat cttaagcctc atcctacatc tggcagattc tgtagctggt 60
tctgtaaagg ttggtggaga ggcaggtcca tctgtcacac taccctgcca ctacagtgga 120
gctgtcacat ccatgtgctg gaatagaggc tcatgttctc tattcacatg ccaaaatggc 180
attgtctgga ccaatggaac ccacgtcacc tatcggaagg acacacgcta taagctattg 240
ggggaccttt caagaaggga tgtctctttg accatagaaa atacagctgt gtctgacagt 300
ggcgtatatt gttgccgtgt tgagcaccgt gggtggttca atgacatgaa aatcaccgta 360
tcattggaga ttgtgccacc caaggtcacg actactccaa ttgtcacaac tgttccaacc 420
gtcacgactg ttcgaacgag caccactgtt ccaacgacaa cgactgttcc aatgacgact 480
gttccaacga caactgttcc aacaacaatg agcattccaa cgacaacgac tgttctgacg 540
acaatgactg tttcaacgac aacgagcgtt ccaacgacaa cgagcattcc aacaacaaca 600
agtgttccag tgacaacaac tgtctctacc tttgttcctc caatgccttt gcccaggcag 660
aaccatgaac cagtagccac ttcaccatct tcacctcagc cagcagaaac ccaccctacg 720
acactgcagg gagcaataag gagagaaccc accagctcac cattgtactc ttacacaaca 780
gatgggaatg acaccgtgac agagtcttca gatggccttt ggaataacaa tcaaactcaa 840
ctgttcctag aacatagtct actgacggcc aataccacta aaggatga 888
<210> 31
<211> 570
<212> DNA
<213> mouse Tim3
<400> 31
atgttttcag gtcttaccct caactgtgtc ctgctgctgc tgcaactact acttgcaagg 60
tcattggaaa atgcttatgt gtttgaggtt ggtaagaatg cctatctgcc ctgcagttac 120
actctatcta cacctggggc acttgtgcct atgtgctggg gcaagggatt ctgtccttgg 180
tcacagtgta ccaacgagtt gctcagaact gatgaaagaa atgtgacata tcagaaatcc 240
agcagatacc agctaaaggg cgatctcaac aaaggagacg tgtctctgat cataaagaat 300
gtgactctgg atgaccatgg gacctactgc tgcaggatac agttccctgg tcttatgaat 360
gataaaaaat tagaactgaa attagacatc aaagcagcca aggtcactcc agctcagact 420
gcccatgggg actctactac agcttctcca agaaccctaa ccacggagag aaatggttca 480
gagacacaga cactggtgac cctccataat aacaatggaa caaaaatttc cacatgggct 540
gatgaaatta aggactctgg agaaacgtga 570
<210> 32
<211> 603
<212> DNA
<213> human Tim3
<400> 32
atgttttcac atcttccctt tgactgtgtc ctgctgctgc tgctgctact acttacaagg 60
tcctcagaag tggaatacag agcggaggtc ggtcagaatg cctatctgcc ctgcttctac 120
accccagccg ccccagggaa cctcgtgccc gtctgctggg gcaaaggagc ctgtcctgtg 180
tttgaatgtg gcaacgtggt gctcaggact gatgaaaggg atgtgaatta ttggacatcc 240
agatactggc taaatgggga tttccgcaaa ggagatgtgt ccctgaccat agagaatgtg 300
actctagcag acagtgggat ctactgctgc cggatccaaa tcccaggcat aatgaatgat 360
gaaaaattta acctgaagtt ggtcatcaaa ccagccaagg tcacccctgc accgactcgg 420
cagagagact tcactgcagc ctttccaagg atgcttacca ccaggggaca tggcccagca 480
gagacacaga cactggggag cctccctgat ataaatctaa cacaaatatc cacattggcc 540
aatgagttac gggactctag attggccaat gacttacggg actctggagc aaccatcaga 600
tga 603
<210> 33
<211> 846
<212> DNA
<213> mouse Tim4
<220>
<221> FLAG tag
<222> (820)..(843)
<400> 33
atgtccaagg ggcttctcct cctctggctg gtgacggagc tctggtggct ttatctgaca 60
ccagctgcct cagaggatac aataataggg tttttgggcc agccggtgac tttgccttgt 120
cattacctct cgtggtccca gagccgcaac agtatgtgct ggggcaaagg ttcatgtccc 180
aattccaagt gcaatgcaga gcttctccgt acagatggaa caagaatcat ctccaggaag 240
tcaacaaaat atacactttt ggggaaggtc cagtttggtg aagtgtcctt gaccatctca 300
aacaccaatc gaggtgacag tggggtgtac tgctgccgta tagaggtgcc tggctggttc 360
aatgatgtca agaagaatgt gcgcttggag ctgaggagag ccacaacaac caaaaaacca 420
acaacaacca cccggccaac caccacccct tatgtgacca ccaccacccc agagctgctt 480
ccaacaacag tcatgaccac atctgttctc ccaaccacca caccacccca gacactagcc 540
accactgcct tcagtacagc agtgaccacg tgcccctcaa caacacctgg ctccttctca 600
caagaaacca caaaagggtc cgccttcact acagaatcag aaactctgcc tgcatccaat 660
cactctcaaa gaagcatgat gaccatatct acagacatag ccgtactcag gcccacaggc 720
tctaaccctg ggattctccc atccacttca cagctgacga cacagaaaac aacattaaca 780
acaagtgagt ctttgcagaa gacaactaaa tcacatcagg attacaagga tgacgacgat 840
aagtaa 846
<210> 34
<211> 840
<212> DNA
<213> mouse Tim4
<220>
<221> His tag
<222> (820)..(837)
<400> 34
atgtccaagg ggcttctcct cctctggctg gtgacggagc tctggtggct ttatctgaca 60
ccagctgcct cagaggatac aataataggg tttttgggcc agccggtgac tttgccttgt 120
cattacctct cgtggtccca gagccgcaac agtatgtgct ggggcaaagg ttcatgtccc 180
aattccaagt gcaatgcaga gcttctccgt acagatggaa caagaatcat ctccaggaag 240
tcaacaaaat atacactttt ggggaaggtc cagtttggtg aagtgtcctt gaccatctca 300
aacaccaatc gaggtgacag tggggtgtac tgctgccgta tagaggtgcc tggctggttc 360
aatgatgtca agaagaatgt gcgcttggag ctgaggagag ccacaacaac caaaaaacca 420
acaacaacca cccggccaac caccacccct tatgtgacca ccaccacccc agagctgctt 480
ccaacaacag tcatgaccac atctgttctc ccaaccacca caccacccca gacactagcc 540
accactgcct tcagtacagc agtgaccacg tgcccctcaa caacacctgg ctccttctca 600
caagaaacca caaaagggtc cgccttcact acagaatcag aaactctgcc tgcatccaat 660
cactctcaaa gaagcatgat gaccatatct acagacatag ccgtactcag gcccacaggc 720
tctaaccctg ggattctccc atccacttca cagctgacga cacagaaaac aacattaaca 780
acaagtgagt ctttgcagaa gacaactaaa tcacatcagc atcatcatca tcatcattga 840
Claims (6)
- 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 세포외막소포를 검출하는 방법 ;
(1) 칼슘 이온 존재하, 담체에 결합한 Tim4 단백질과 시료 중의 세포외막소포의 복합체를 형성시키는 공정 (복합체 형성 공정)
(2) 당해 복합체를 세포외막소포에 대해 결합하는 항체를 사용하여 검출하는 공정 (검출 공정). - 제 1 항에 있어서,
세포외막소포를 검출하는 방법이 ELISA 법 또는 플로 사이토메트리법인 시료 중의 세포외막소포를 검출하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
Tim4 단백질이 IgV 도메인을 포함하는 것인, 시료 중의 세포외막소포를 검출하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
담체와 Tim4 단백질이, Tim4 단백질의 SH 기를 개재하여 결합한 것인, 시료 중의 세포외막소포를 검출하는 방법. - Tim4 단백질이 결합한 담체, 및 세포외막소포에 대해 결합하는 항체를 포함하는, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용되는 세포외막소포의 검출용 키트.
- Tim4 단백질, 담체, 및 세포외막소포에 대해 결합하는 항체를 포함하는, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용되는 세포외막소포의 검출용 키트.
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