JP2021007400A - ノスカピノイド産生微生物ならびにその作製及び使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2014年11月17日に提出された米国特許仮出願第62/080,610号と、2015年1月23日に提出された米国特許仮出願第62/107,238号と、2015年5月4日に提出された米国特許仮出願第62/156,701号と、2015年5月8日に提出された米国特許仮出願第62/159,122号と、2015年6月11日に提出された米国特許仮出願第62/174,475号に基づく優先権を主張するものであり、これらの開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
本発明は、米国国立衛生研究所により付与された契約番号AT007886の下で、米国政府からの援助によって行われたものである。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
本開示は、遺伝子操作された宿主細胞内での、ノスカピノイドなどの様々なベンジルイソキノリンアルカロイド(BIA)の生成方法を提供する。本開示は更に、遺伝子操作された宿主細胞内で産生された様々なノスカピノイドの組成物を提供する。
本明細書で言及される全ての文献、特許及び特許出願は、個々の文献、特許及び特許出願が参照により援用されることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、参照により本明細書に援用される。
本開示は、遺伝子操作された宿主細胞内での、ノスカピノイドなどの様々なベンジルイソキノリンアルカロイド(BIA)の生成方法を提供する。本開示は更に、遺伝子操作された宿主細胞内で産生される様々なノスカピノイドの組成物を提供する。
ノスカピノイド生成物を産生する宿主細胞を提供する。ノスカピノイド生成物には、ノスカピノイド、ノスカピノイドの前駆体、ノスカピノイドの代謝物、ノスカピノイドの類縁体、ノスカピノイドの中間体及び/またはノスカピノイドの誘導体が含まれる。いくつかの例では、本発明の遺伝子操作株のような遺伝子操作された宿主細胞株は、いくつかの構造的部類にわたるノスカピノイド生成物及びその修飾物(ベンジルイソキノリンアルカロイド、プロトベルベリン、セコベルビン、フタリドイソキノリンなどが挙げられるが、これらに限らない)を生成するためのプラットフォームを提供する。これらの部類のそれぞれには、その部類のメンバーをもたらし得る遺伝子操作された宿主細胞生合成経路のいずれかの利便的なメンバーの生合成前駆体、中間体及びそれらの代謝物が含まれるように意図されている。化合物の非限定例は、これらの構造的分類のそれぞれについて、後述されている。場合によっては、所定の例の構造は、それ自体がベンジルイソキノリンアルカロイドとして特徴付けられる場合も特徴付けられない場合もある。本発明の化学物質には、単一のエナンチオマー、ラセミ混合物、光学的に純粋な形態、ジアステレオマーの混合物及び中間体混合物を含む全ての考え得る異性体が含まれるように意図されている。
上に概説したように、本発明の一態様は、ノスカピノイド生成物を産生する宿主細胞である。本明細書で使用する場合、「ノスカピノイド産生細胞」という用語は、合成経路を介して、出発化合物からノスカピノイド生成物を産生するように遺伝子操作されている細胞を含むように意図されている。本主題の宿主細胞は、いずれかの利便的なノスカピノイド生成物を産生してよく、その生成物としては、1−ヒドロキシ−N−メチルカナジン、N−メチルカナジン、ノスカピン、ナルコトリン、ナルコチンヘミアセタール、4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシン、ナルコトリンヘミアセタール、N−メチルオフィオカルピン、1−ヒドロキシ−13−Oアセチル−N−メチルカナジン、1,13−ジヒドロキシ−N−メチルカナジン、ナルコトリノゲンジアール、3−O−アセチル−パパベロキシン、ナルコトリナール及び1−ヒドロキシルカナジンが挙げられるが、これらに限らない。
本発明の宿主細胞は、ノスカピノイド生成物を産生するための1つ以上の改変(2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはそれ以上の改変など)を含むように遺伝子操作されていてよい。場合によっては、改変は、遺伝子もしくはその断片の変異、付加もしくは欠失、または遺伝子もしくはその断片の転写調節などの遺伝子改変である。本明細書で使用する場合、「変異」という用語は、基準配列または基準モチーフに対するアミノ酸残基またはヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換を指す。変異は、特異的変異として、本来の遺伝子座で天然型遺伝子に導入されていてよい。場合によっては、変異は、別の遺伝子座における遺伝子組み込みとして導入される追加の遺伝子コピーとして、または2μプラスミドもしくはセントロメアプラスミドなどのエピソーマルベクター上の追加のコピーとして導入される追加の遺伝子コピーとして導入してよい。特定の事例では、酵素の基質阻害コピーは、天然型細胞の転写調節下にある。場合によっては、酵素の基質阻害コピーは、合成プロモーターの制御下に置くことによって、タンパク質の発現の構成的または動的調節を遺伝子操作した状態で導入する。いくつかの例では、1つ以上の改変の対象は、天然型遺伝子であってよい。いくつかの例では、1つ以上の改変の対象は、非天然型遺伝子であってよい。いくつかの例では、非天然型遺伝子は、宿主細胞に挿入してよい。更なる例では、非天然型遺伝子は、宿主細胞に挿入する前に、1つ以上の改変によって改変してもよい。
場合によっては、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、その細胞の1つ以上の生合成酵素遺伝子に基質阻害緩和型変異を1つ以上(2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはそれ以上)含む細胞である。いくつかの例では、その1つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっている(例えば、非改変細胞に存在する)。いくつかの例では、その1つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっていない。本明細書で使用する場合、「基質阻害緩和型変異」という用語は、細胞の基質阻害制御機構を弱める変異を指す。
場合によっては、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、その細胞の1つ以上の生合成酵素遺伝子に、補因子回収促進機構を1つ以上(2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはそれ以上など)含む細胞である。いくつかの例では、その1つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっている(例えば、非改変細胞に存在する)。いくつかの例では、1つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっていない。本明細書で使用する場合、「補因子回収促進機構」という用語は、その細胞の補因子回収制御機構を促進する機構を指す。いくつかの例では、回収の対象となる1つ以上の補因子としては、S−アデノシルメチオニン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、テトラヒドロビオプテリン及びフラビンアデニンジヌクレオチドが挙げられるが、これらに限らない。
場合によっては、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、その細胞の1つ以上の生合成酵素遺伝子に、産生阻害緩和型変異を1個以上(2個以上、3個以上、4個以上、5個以上またはそれ以上など)含む細胞である。いくつかの例では、1つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっている(例えば、非改変細胞に存在する)。いくつかの例では、その1つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっていない。本明細書で使用する場合、「産生阻害緩和型変異」という用語は、遺伝子操作された宿主細胞の短期的及び/または長期的産生阻害制御機構を弱める変異を指す。短期的産生阻害は、補基質結合部位で競合的結合が見られる、その細胞の制御機構である。長期的な産生阻害は、所望の経路から離れた所で化合物の不可逆的結合が見られる、その細胞の制御機構である。
場合によっては、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、その細胞の1つ以上の生合成酵素遺伝子に、フィードバック阻害緩和型変異を1個以上(2個以上、3個以上、4個以上、5個以上またはそれ以上など)含む細胞である。場合によっては、その1つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっている(例えば、非改変細胞に存在する)。これに加えてまたはこの代わりに、いくつかの例では、その1つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっていない。本明細書で使用する場合、「フィードバック阻害緩和型変異」という用語は、遺伝子操作された宿主細胞のフィードバック阻害制御機構を弱める変異を指す。フィードバック阻害は、調節化合物が特定のレベルまで蓄積されたら、調節化合物の合成経路内の酵素を阻害し、それによって、その細胞におけるその化合物の量を平衡させる、その細胞の制御機構である。フィードバック阻害を緩和する変異は、コントロール細胞に比べて、遺伝子操作された宿主細胞において調節酵素の阻害を軽減する。このようにして、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、調節化合物またはその下流の生合成産物のレベルを向上させる。場合によっては、調節酵素の阻害を緩和するとは、阻害率のIC50が、2倍以上(3倍以上、5倍以上、10倍以上、30倍以上、100倍以上、300倍以上、1000倍以上またはそれ以上など)上昇することを意味する。レベルの向上とは、コントロール細胞における調節化合物またはその下流産物のレベルの110%以上(120%以上、130%以上、140%以上、150%以上、160%以上、170%以上、180%以上、190%以上または200%以上など、例えば、宿主細胞における調節化合物またはその下流産物の少なくとも3倍以上、少なくとも5倍以上、少なくとも10倍以上またはそれ以上)であるレベルを意味する。
本発明の宿主細胞は、その細胞の1つ以上の生合成酵素遺伝子の転写調節の改変を1個以上(改変を2個以上、3個以上、4個以上、5個以上またはそれ以上など)含んでよい。いくつかの例では、その1つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっている。いくつかの例では、その1つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっていない。その細胞のいずれかの利便的な生合成酵素遺伝子は、転写調節を標的としてよい。転写調節とは、コントロール細胞(例えば非改変細胞)と比べて、改変細胞における対象となる遺伝子の発現を調節すること、例えば、増減、促進または抑制することを意味する。場合によっては、対象となる遺伝子の転写調節には、発現の増加または促進が含まれる。発現の増加または促進とは、(例えば、いずれかの利便的な遺伝子発現アッセイを用いることによって、)対象となる遺伝子の発現レベルが、コントロール、すなわち、改変していない同じ細胞における発現と比べて、2倍以上、例えば5倍以上、場合によって、25倍、50倍または100倍以上、特定の実施形態では、300倍以上またはそれ以上上昇することを意味する。あるいは、細胞における対象となる遺伝子の発現が、検出不能なほど低い事例では、発現が、容易に検出可能なレベルまで上昇した場合に、対象となる遺伝子の発現レベルが上昇しているとみなされる。特定の事例では、対象となる遺伝子の転写調節には、発現の減少または抑制が含まれる。発現の減少または抑制とは、対象となる遺伝子の発現レベルが、コントロールと比べて、2倍以上、例えば5倍以上、場合によって、25倍、50倍または100倍以上、特定の実施形態では、300倍以上またはそれ以上低下することを意味する。場合によっては、発現は、検出不可能なレベルまで低下する。本主題の宿主細胞での使用に適合させてよい、対象となる宿主細胞プロセスの改変は、Smolkeらによる米国特許出願第20140273109(14/211,611)号に記載されており、その開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、その細胞の酵素に対する不活化変異を1個以上(2個以上、3個以上、4個以上、5個以上またはそれ以上など)含んでよい。1個以上の不活化変異を含むことで、遺伝子操作された宿主細胞の合成経路のフラックスを改変して、対象となるBIA、またはBIAを導く所望の酵素もしくは前駆体のレベルを向上できる。いくつかの例では、1つ以上の不活化変異は、その細胞に天然に備わっている酵素に対するものである。これに加えてまたはこの代わりに、1つ以上の不活化変異は、その細胞に天然に備わっていない酵素に対するものである。本明細書で使用する場合、「不活化変異」とは、細胞の遺伝子または調節DNA配列に対する1つ以上の変異であって、その変異によって、対象となるその遺伝子によって発現されるタンパク質の生物学的活性が不活化される変異を意味する。場合によっては、その遺伝子は、その細胞に天然に備わっている。場合によっては、その遺伝子は、不活化されるとともに、宿主細胞によって産生される、対象となるBIAの合成経路の一部であるか、またはその合成経路に連結している酵素をコードする。場合によっては、不活化変異は、対象となる遺伝子を制御する調節DNA配列に位置する。特定の事例では、不活化変異は、遺伝子のプロモーターに対するものである。いずれかの利便的な変異(例えば、本明細書に記載されているようなもの)を用いて、対象となる遺伝子または調節DNA配列を不活化してよい。「不活化される」または「不活化する」とは、変異遺伝子によって発現されるタンパク質の生物学的活性が、非変異のコントロール遺伝子によって発現されるコントロールタンパク質と比べて、10%以上(20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、97%以上または99%以上など)低下することを意味する。場合によっては、そのタンパク質は、酵素であり、不活化変異によって、その酵素の活性が低下する。
場合によっては、例えば本明細書に記載されているように、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、本発明の遺伝子操作された宿主細胞が所望のノスカピノイド生成物を産生できるようにする活性をコードする異種コード配列を1個以上(2個以上、3個以上、4個以上、5個以上など)有する。本明細書で使用する場合、「異種コード配列」という用語は、その宿主生物に通常存在しないとともに、その宿主細胞において、適切な条件下で発現できるペプチドもしくはタンパク質、またはその等価なアミノ酸配列、例えば酵素をコードするかまたは最終的にコードするいずれかのポリヌクレオチドを示す目的で用いる。したがって、「異種コード配列」には、宿主細胞に通常存在するコード配列が多コピー含まれ、その結果、その宿主細胞が、その細胞に通常存在しない追加のコピーのコード配列を発現している。異種コード配列は、RNAもしくはそのいずれかのタイプ、例えばmRNA、DNAもしくはそのいずれかのタイプ、例えばcDNA、またはRNA/DNAのハイブリッドであってよい。対象となるコード配列としては、コード配列、イントロン、プロモーター領域、3’UTR及びエンハンサー領域などの機構を含む完全長転写ユニットが挙げられるが、これらに限らない。
プロセス工程
上に概説したように、本発明の態様は、ノスカピノイド生成物の調製方法を含む。すなわち、本発明の態様は、宿主細胞の改変部(例えば、本明細書に記載されているようなもの)を1つ以上、機能的に発現させて、その細胞が、対象となる出発化合物をノスカピノイド生成物に変換させるようにする条件下で、遺伝子操作された宿主細胞を培養する工程を含む。また、1つ以上の異種コード配列を機能的に発現させて、対象となる出発化合物をノスカピノイド生成物に変換させるように、タンパク質の産生に適する条件下で、遺伝子操作された宿主細胞を培養する工程を含む方法も提供する。例では、この方法は、ノスカピノイド生成物の調製方法であって、遺伝子操作された宿主細胞(例えば、本明細書に記載されているようなもの)を培養する工程と、その細胞培養液に出発化合物を加える工程と、その細胞培養液からノスカピノイド生成物を回収する工程を含む方法である。
本主題の方法は、ノスカピノイド生成物を細胞培養液から回収することも含んでよい。いずれかの利便的な分離及び単離方法(例えば、クロマトグラフィー法または沈殿法)を、本主題の方法での使用に適合させて、ノスカピノイド生成物を細胞培養液から回収してよい。ろ過法を用いて、細胞培養液の不溶分から溶解分を分離してよい。場合によっては、液体クロマトグラフィー法(例えば、逆相HPLC、サイズ排除クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー)を用いて、対象となるノスカピノイド生成物を細胞培養液の他の溶解性成分から分離してよい。場合によっては、抽出法(例えば、液体抽出、pHに基づく精製、固相抽出、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換など)を用いて、ノスカピノイド生成物を細胞培養液の他の成分から分離してよい。
次の精製工程は、当該技術分野で知られている方法を用いて、ノスカピノイド生成物を豊富に含む発酵後溶液を処理して、対象となる個々の産生種を高純度で回収することを含んでよい。
清澄化酵母培地(CYCM)は、複数の不純物を含み得る。清澄化酵母培地を真空及び/または熱によって脱水して、アルカロイドを豊富に含む粉末を得てよい。この生成物は、ケシがら濃縮物(CPS)に類似しており、このCPSは、ケシ栽培国から輸出され、APIメーカーによって購入されている。本発明の目的においては、CPSは、所望のアルカロイド生成物を最終的に更に精製できるいずれかのタイプの精製植物抽出物の代表的な例である。表2と表3に、これらの2つの生成物中の不純物であって、CYCMまたはCPSのいずれかに特有であり得るか、またはこれらの両方に存在し得る不純物が明らかにされている。いくつかのノスカピノイド生成物は、色素を不純物として有し得るが、他のノスカピノイド生成物は、色素そのものとして分類されることがある。したがって、これらのノスカピノイド生成物は、色素以外の不純物に基づき、不純物について評価してよい。加えて、いくつかの例では、発酵プロセスを用いて産生されるノスカピノイド生成物は、そのノスカピノイド生成物を産生させるための発酵プロセスで用いる1つ以上の細胞の一部を含んでよい。例えば、酵母を用いてノスカピノイド生成物を産生させる場合、その酵母細胞の一部が、ノスカピノイド生成物に含まれることがある。当業者であれば、これらの不純物のサブセットについて、未知の起源の産物を解析することによって、その産物が、酵母に由来するのかまたは植物の産生宿主に由来するのか判断できる。
ノスカピノイド生成物の産生を目的とする、宿主細胞の遺伝子操作方法も含まれる。DNAの宿主細胞への挿入は、いずれかの利便的な方法を用いて行ってよい。その方法を用いて、異種コード配列を遺伝子操作された宿主細胞に挿入して、宿主細胞が酵素を機能的に発現して、対象となる出発化合物をノスカピノイド生成物に変換するようにする。
例えば上記のような、本発明の遺伝子操作された宿主細胞と方法は、様々な用途で用いられる。対象となる用途としては、研究用途と治療用途が挙げられるが、これらに限らない。本発明の方法は、ノスカピノイド生成物を産生させるいずれかの利便的な用途を含む多種多様な用途で用いられる。
本発明の態様は更に、キットとシステムを含み、そのキットとシステムは、本発明の方法で用いられる1つ以上の成分、例えば、本明細書に記載されているような遺伝子操作された宿主細胞、出発化合物、異種コード配列、ベクター、培地などを含んでよい。いくつかの実施形態では、本主題のキットは、遺伝子操作された宿主細胞(例えば、本明細書に記載されているようなもの)と、出発化合物、異種コード配列及び/または異種コード配列を含むベクター、ベクター、増殖用供給原料、発現システムでの使用に適する成分(例えば、細胞、クローニングベクター、マルチクローニングサイト(MCS)、二方向性プロモーター、内部リボソーム侵入部位(IRES)など)、ならびに培地より選択される1つ以上の成分とを含む。
ノスカピン及び合成中間体、ならびに様々なノスカピノイドの産生のための遺伝子操作された酵母Saccharomyces cerevisiae
本発明の酵母株は、トランスフォーメーションを行って、ノスカピンと誘導体を産生できる。これらの株が産生できる化合物の例は、N−メチルカナジン、1−ヒドロキシ−N−メチルカナジン、ノスカピン、ナルコトリン、ナルコチンヘミアセタール、4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシン、3−O−アセチルパパベロキシン、ナルコトリンヘミアセタール、N−メチルオフィオカルピン、1,13−ジヒドロキシ−N−メチルカナジン、1−ヒドロキシ−13−O−アセチル−N−メチルカナジン、ナルコトリノゲンジアール、1−ヒドロキシカナジン及びナルコトリナールであり、それらのうち、1−ヒドロキシルカナジン、4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシン、ナルコトリンヘミアセタール、ナルコトリンヘミアセタール、1,13−ジヒドロキシ−N−メチルカナジン、1−ヒドロキシ−13−O−アセチル−N−メチルカナジン、ナルコトリノゲンジアール、ナルコトリナールは、これまで同定されたことはない。加えて、本発明の酵母細胞は、ノスカピンの生合成経路を修正し、酵素機能を特徴付け、異種の経路の再構築を実施して、植物の天然産物の生合成に対する効率的かつ正確なアプローチを作ることによって遺伝子操作されている。
1−ヒドロキシ−N−メチルカナジン、ノスカピン、ナルコトリン、ナルコチンヘミアセタール、4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシン、3−O−アセチルパパベロキシン、ナルコトリンヘミアセタール、N−メチルオフィオカルピン、1,13−ジヒドロキシ−N−メチルカナジン、1−ヒドロキシ−13−O−アセチル−N−メチルカナジン、ナルコトリノゲンジアール、ナルコトリナール、1−ヒドロキシカナジンのようなプロトベルベリン及びフタリドイソキノリンアルカロイドを産生する酵母株を作製した。
遺伝子操作された酵母株の関連の中で、プロトベルベリンとフタリドイソキノリンアルカロイドの産生を最適化するツールと方法を開発した。3つのP450、すなわち、CYP82Y1、CYP82X1及びCYP82X2の酵素活性をノスカピンと中間体の両方に対して最適化した。遺伝子操作された酵母株内での標的ノスカピンまたはノスカピノイドの最適な産生を得るために、細胞小器官ルーティングツールキットを用いて、P450、メチルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、短鎖デヒドロゲナーゼ及びカルボキシルエステラーゼを含むタイプの酵素を再配置して、それらの酵素間の相互作用を最適化する。
酵母を遺伝子操作して、遺伝子操作された酵母株内に、6つの追加の酵素的工程、特に、酵素のPs6OMT、Ps4’OMT、PsCNMT、PsBBE、S9OMT及びCYP719Aによって触媒される酵素的工程を含めて、ノスカピンをカナジンから生成する。植物天然産物を生合成するための遺伝子操作された酵母株は、遺伝子操作して酵母株に組み込んだ異種の酵素的工程を最大で15個含む(図9)。例では、酵母における追加の8つの酵素を遺伝子操作して、ノルラウダノソリンからレチクリンを生成してよい。更なる例では、酵母における追加の6つの酵素を遺伝子操作して、ノスカピンをカナジンから生成してよい。
酵母を遺伝子操作して、遺伝子操作された酵母株内に13個の追加の酵素的工程、特に、酵素のRnPTPS、RnSepR、RnPCD、RnQDHPR、RnDHFR、RnTyrH、CjNCS、PpDODC、EcCYP80B1、ARO4(Q166K)、ARO7(T226I)、ARO10及びTKL1によって触媒される酵素的工程を含めて、ノスカピンをノルラウダノソリンから生成する。植物天然産物を生合成するための遺伝子操作された酵母株は、遺伝子操作して酵母株に組み込んだ異種の酵素的工程を最大で28個含む(図9)。
ベンジルイソキノリン、プロトベルベリン、セコベルベリン及びフタリドイソキノリンアルカロイドの官能化誘導体を合成するために、チロシンを1つのチロシン類縁体または1つのチロシン類縁体セットに置き換えた合成培地で、ノスカピン産生酵母を培養する。官能化誘導体とは、本明細書で使用する場合、対照化合物と区別される構造的特徴を有する化合物であって、その区別される特徴が、その化合物の合成に用いた出発物質に存在していた化合物を指す。例えば、3−クロロ−レチクリンは、α−クロロ−L−チロシンから生成でき、これらの2つの化合物を区別する塩化物が、合成で使用されたとともに、合成の際の一工程によって組み込まれなかった出発物質の特徴であったため、本明細書では、レチクリンの官能化誘導体とみなす。更なる例としては、6−ヒドロキシ−カナジン(宿主細胞によって、α−ヒドロキシ−L−チロシンから産生させることができる、カナジンの官能化誘導体)と、7−ニトロ−ナルコトリン(3−ニトロ−L−チロシンから生成される、ナルコトリンの官能化誘導体)が挙げられる。同様に、ベンジルイソキノリン、プロトベルベリン、セコベルベリン及びフタリドイソキノリンアルカロイドの官能化誘導体を、チロシンの類縁体などの出発物質から生成してよい。更なる例では、1つ以上の遺伝子セットを取り出して、特定の官能化誘導体群を蓄積する。
図1は、本発明の実施形態に従って、植物における生化学的同定に基づき、カナジンをノスカピンに変換する生合成スキームを示している。破線の矢印は、立証されていない酵素的工程を示している。実線の矢印は、酵母における異種発現を通じて(PsMT1、CYP82Y1、PsSDR1)、またはP. somniferumにおけるウイルス誘導ジーンサイレンシング(VIGS)を通じて(PsMT1、CYP719A21、CYP82X2、PsMT2、PsCXE1、PsSDR1)のいずれかで立証されている酵素的工程を示している。P. somniferumにおいて、PsMT1、CYP719A21、CYP82X2、PsCXE1、PsSDR1及びPsMT2を不活化すると、それに従って、(S)−カナジン、(S)−N−メチルカナジン、ナルコトリナール、パパベロキシン、ナルコチンヘミアセタール及びナルコトリンが蓄積される。
宿主細胞は、対象となるBIA及び/または対象となる酵素を産生するための1つ以上の改変(2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはそれ以上の改変など)を含むように遺伝子操作されていてよい。表1には、遺伝子操作された宿主細胞において、対象となるBIA及び/または対象となる酵素を産生させるように、1つ以上の改変によって影響を受け得る例示的な遺伝子のリストが示されている。
本明細書で言及される全ての文献、特許及び特許出願は、個々の文献、特許及び特許出願が参照により援用されることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、参照により本明細書に援用される。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
[1]
カナジンまたはカナジンの類縁体を、ノスカピノイド、ノスカピノイドの前駆体、ノスカピノイドの代謝物、ノスカピノイドの類縁体、ノスカピノイドの中間体、及びノスカピノイドの誘導体からなる群より選択される少なくとも1つの化合物を含むノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に沿って、カナジンの誘導体であるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を産生する、遺伝子操作された非植物細胞であって、前記遺伝子操作された非植物細胞内で産生される前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物の量が、その非植物細胞内で産生されるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物の量よりも多い、前記遺伝子操作された非植物細胞。
[2]
カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する少なくとも1つの酵素をコードする1つ以上の異種コード配列を含む、[1]の遺伝子操作された非植物細胞。
[3]
カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する2つ以上の酵素をコードする異種コード配列を含む、[2]の遺伝子操作された非植物細胞。
[4]
カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する2つの異なる酵素をコードする異種コード配列を含む、[3]の遺伝子操作された非植物細胞。
[5]
カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する4つ以上の異なる酵素をコードする異種コード配列を含む、[3]の遺伝子操作された非植物細胞。
[6]
前記少なくとも1つの酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の化合物を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物に変換する、[2]の遺伝子操作された非植物細胞。
[7]
前記化合物が、前記遺伝子操作された非植物細胞内で産生される、[6]の遺伝子操作された非植物細胞。
[8]
カナジンをノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素が、TNMT、CYP82X2、CYP82Y1、CPY82X1、AT1、6OMT、CXE1、CXE2、SDR1、MT2、及びMT3からなる群より選択される、[2]の遺伝子操作された非植物細胞。
[9]
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、フタリドイソキノリンアルカロイドである、[8]の遺伝子操作された非植物細胞。
[10]
前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコトリンヘミアセタールである、[9]の遺伝子操作された非植物細胞。
[11]
前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がCXE1を含み、前記CXE1が4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシンをナルコトリンヘミアセタールに変換する、[10]の遺伝子操作された非植物細胞。
[12]
前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコチンヘミアセタールである、[11]の遺伝子操作された非植物細胞。
[13]
前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がMT2及びMT3を含み、前記MT2及びMT3がナルコトリンヘミアセタールをナルコチンヘミアセタールに変換する、[12]の遺伝子操作された非植物細胞。
[14]
前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がMT2及び6OMTを含み、前記MT2及び6OMTがナルコトリンヘミアセタールをナルコチンヘミアセタールに変換する、[12]の遺伝子操作された非植物細胞。
[15]
前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素が4’OMTを含み、前記4’OMTがナルコトリンヘミアセタールをナルコチンヘミアセタールに変換する、[12]の遺伝子操作された非植物細胞。
[16]
前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物がナルコトリンである、[9]の遺伝子操作された非植物細胞。
[17]
前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がSDR1を含み、前記SDR1がナルコトリンヘミアセタールをナルコトリンに変換する、[16]の遺伝子操作された非植物細胞。
[18]
前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物がノスカピンである、[9]の遺伝子操作された非植物細胞。
[19]
前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がMT2及びMT3を含み、前記MT2及びMT3がナルコトリンをノスカピンに変換する、[18]の遺伝子操作された非植物細胞。
[20]
前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がMT2及び6OMTを含み、前記MT2及び6OMTがナルコトリンをノスカピンに変換する、[18]の遺伝子操作された非植物細胞。
[21]
前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素が4’OMTを含み、前記4’OMTがナルコトリンをノスカピンに変換する、[18]の遺伝子操作された非植物細胞。
[22]
前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がSDR1を含み、前記SDR1がナルコチンヘミアセタールをノスカピンに変換する、[18]の遺伝子操作された非植物細胞。
[23]
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物がプロトベルベリン生成物である、[8]の遺伝子操作された非植物細胞。
[24]
前記プロトベルベリン生成物が、1−ヒドロキシカナジン、N−メチルカナジン、N−メチル−オフィオカルピン、1−ヒドロキシ−N−メチル−カナジン、ナルコトリナール、1,13−ジヒドロキシ−N−メチルカナジン、及び1−ヒドロキシ−13−O−アセチル−N−メチルカナジンからなる群より選択される、[23]の遺伝子操作された非植物細胞。
[25]
前記プロトベルベリン生成物が1−ヒドロキシカナジンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がCYP82Y1を含み、前記CYP82Y1がカナジンを1−ヒドロキシカナジンに変換する、[24]の遺伝子操作された非植物細胞。
[26]
前記プロトベルベリン生成物がN−メチルカナジンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がTNMTを含み、前記TNMTがカナジンをN−メチルカナジンに変換する、[24]の遺伝子操作された非植物細胞。
[27]
前記プロトベルベリン生成物がN−メチル−オフィオカルピンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がCYP82X2を含み、前記CYP82X2がN−メチルカナジンをN−メチル−オフィオカルピンに変換する、[24]の遺伝子操作された非植物細胞。
[28]
前記プロトベルベリン生成物が1−ヒドロキシ−N−メチル−カナジンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がCYP82Y1を含み、前記CYP82Y1がN−メチルカナジンを1−ヒドロキシ−N−メチル−カナジンに変換する、[24]の遺伝子操作された非植物細胞。
[29]
前記プロトベルベリン生成物がナルコトリナールであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がCYP82X1を含み、前記CYP82X1が1−ヒドロキシ−N−メチル−カナジンをナルコトリナールに変換する、[24]の遺伝子操作された非植物細胞。
[30]
前記プロトベルベリン生成物が1,13−ジヒドロキシ−N−メチルカナジンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がCYP82X2を含み、前記CYP82X2が1−ヒドロキシ−N−メチル−カナジンを1,13−ジヒドロキシ−N−メチルカナジンに変換する、[24]の遺伝子操作された非植物細胞。
[31]
前記プロトベルベリン生成物が1−ヒドロキシ−13−O−アセチル−N−メチルカナジンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がAT1を含み、前記AT1が1,13−ジヒドロキシ−N−メチルカナジンを1−ヒドロキシ−13−O−アセチル−N−メチルカナジンに変換する、[24]の遺伝子操作された非植物細胞。
[32]
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコトリノゲンジアール、4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシン、及び3−O−アセチルパパベロキシンからなる群より選択される、[1]の遺伝子操作された非植物細胞。
[33]
前記プロトベルベリン生成物がナルコトリノゲンジアールであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がCYP82X1を含み、前記CYP82X1が1,13−ジヒドロキシ−N−メチルカナジンをナルコトリノゲンジアールに変換する、[32]の遺伝子操作された非植物細胞。
[34]
前記プロトベルベリン生成物が4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がCYP82X1を含み、前記CYP82X1が1−ヒドロキシ−13−O−アセチル−N−メチルカナジンを4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシンに変換する、[32]の遺伝子操作された非植物細胞。
[35]
前記プロトベルベリン生成物が3−O−アセチルパパベロキシンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がMT2及びMT3を含み、前記MT2及びMT3が4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシンを3−O−アセチルパパベロキシンに変換する、[32]の遺伝子操作された非植物細胞。
[36]
前記プロトベルベリン生成物が3−O−アセチルパパベロキシンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がMT2及び6OMTを含み、前記MT2及び6OMTが4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシンを3−O−アセチルパパベロキシンに変換する、[32]の遺伝子操作された非植物細胞。
[37]
前記プロトベルベリン生成物が3−O−アセチルパパベロキシンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素が4’OMTを含み、前記4’OMTが4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシンを3−O−アセチルパパベロキシンに変換する、[32]の遺伝子操作された非植物細胞。
[38]
微生物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、及び酵母細胞からなる群より選択される、[1]の遺伝子操作された非植物細胞。
[39]
酵母細胞である、[38]の遺伝子操作された非植物細胞。
[40]
レチクリン産生細胞である、[1]の遺伝子操作された非植物細胞。
[41]
前記レチクリン産生細胞が、PTPS、SepR、PCD、QDHPR、DHFR、TyrH、NCS、DODC、CYP80B1、CPR、6OMT、4’OMT、CNMT、ARO4、ARO7、ARO10、及びTKL1を産生するためのコード配列を含み、各コード配列が、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれている、[40]の遺伝子操作された非植物細胞。
[42]
TyrH、4’OMT、及びNCSのうちの少なくとも1つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも1つ、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、前記レチクリン産生細胞内でのレチクリンの産生が増大する、[41]の遺伝子操作された非植物細胞。
[43]
前記レチクリン産生細胞が、BBE、S90MT、MT1、CAS、TNMT、CYP82Y1、CYP82X2、AT1、CYP82X1、CXE1、SDR1、MT2、及びMT3のうちの少なくとも1つを産生するための少なくとも1つの異種コード配列を含み、各コード配列が、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれている、[40]の遺伝子操作された非植物細胞。
[44]
TyrH、4’OMT、及びNCSのうちの少なくとも1つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも1つ、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、前記レチクリン産生細胞内でのレチクリンの産生が増大する、[40]の遺伝子操作された非植物細胞。
[45]
CYP82X2及びMT1のうちの少なくとも1つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも1つ、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、前記レチクリン産生細胞内でのノスカピンの産生が増大する、[40]の遺伝子操作された非植物細胞。
[46]
少なくとも1つの変異酵素をコードする少なくとも1つの異種配列を含む、[1]の遺伝子操作された非植物細胞。
[47]
前記少なくとも1つの変異酵素が、CYP82Y1のN末端変異体、CYP82X2変異体、CYP82X1変異体からなる群より選択される、[46]の遺伝子操作された非植物細胞。
[48]
少なくとも1つのプロモーターをコードする少なくとも1つの異種配列を含む、[1]の遺伝子操作された非植物細胞。
[49]
前記少なくとも1つのプロモーターが、HXT7、ADH1、PGK1、TPI1、PYK1、TEF1、GAL1、CYC1、PUT1、CIT2、及びGPDからなる群より選択される、[48]の遺伝子操作された非植物細胞。
[50]
免疫グロブリン結合タンパク質(BiP)、DnaJタンパク質、グルコース調節タンパク質(GRP)94、結合タンパク質(BiP)、プロテインジスルフィドイソメラーゼ(PDI)、サイクロフィリン、及びカルネキシンからなる群より選択される1つ以上の植物シャペロンを含む、[1]の遺伝子操作された非植物細胞。
[51]
前記酵素の1つ以上が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の一区画に空間的に局在化し、前記区画が、ミトコンドリア、小胞体(ER)、ゴルジ体、液胞、核、細胞膜、ペルオキシソーム、及びペリプラズムからなる群より選択される、[1]の遺伝子操作された非植物細胞。
[52]
前記1つ以上の酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の前記区画の外側に空間的に局在化する、[51]の遺伝子操作された非植物細胞。
[53]
前記1つ以上の酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の前記区画の内側に空間的に局在化する、[51]の遺伝子操作された非植物細胞。
[54]
少なくとも1つの修飾酵素をコードする少なくとも1つの異種コード配列を含む、[1]の遺伝子操作された非植物細胞。
[55]
前記少なくとも1つの修飾酵素が、ハロゲナーゼ、プレニルトランスフェラーゼ、グリコシラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、及びオキシドレダクターゼからなる群より選択される、[54]の遺伝子操作された非植物細胞。
[56]
以下の工程を含む、カナジンの下流にあるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を有する生成物流の形成方法:
a.カナジンまたはカナジンの類縁体を、ノスカピノイド、ノスカピノイドの前駆体、ノスカピノイドの代謝物、ノスカピノイドの類縁体、ノスカピノイドの中間体、及びノスカピノイドの誘導体からなる群より選択される少なくとも1つの化合物を含むノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に沿って、カナジンの誘導体であるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を産生する遺伝子操作された非植物細胞を培養する工程であって、前記遺伝子操作された非植物細胞が、カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの異種配列を含む、工程;ならびに
b.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を細胞物質から分離する工程であって、それによって前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を有する生成物流がもたらされる、工程。
[57]
前記遺伝子操作された非植物細胞内の前記少なくとも1つの酵素の量が、その遺伝子操作されていない非植物細胞内の前記少なくとも1つの酵素の量よりも多い、[56]の方法。
[58]
カナジンをノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素が、TNMT、CYP82X2、CYP82Y1、CPY82X1、AT1、6OMT、CXE1、CXE1、SDR1、MT2、及びMT3からなる群より選択される、[56]の方法。
[59]
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、フタリドイソキノリンアルカロイドである、[56]の方法。
[60]
前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコトリンヘミアセタール、ナルコチンヘミアセタール、ナルコトリン、及びノスカピンからなる群より選択される、[59]の方法。
[61]
前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物がナルコトリンヘミアセタールであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、CYP82X1及びCXE1のうちの少なくとも1つを含む、[60]の方法。
[62]
前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物がナルコチンヘミアセタールであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、MT2、MT3、6OMT、及びCXE1のうちの少なくとも1つを含む、[60]の方法。
[63]
前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物がナルコトリンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、CXE1及びSDR1のうちの少なくとも1つを含む、[60]の方法。
[64]
前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物がノスカピンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、MT3、6OMT、CXE1、及びSDR1のうちの少なくとも1つを含む、[60]の方法。
[65]
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物がプロトベルベリン生成物である、[56]の方法。
[66]
前記プロトベルベリン生成物が、1−ヒドロキシカナジン、N−メチルカナジン、N−メチル−オフィオカルピン、1−ヒドロキシ−N−メチルカナジン、ナルコトリナール、1,13−ジヒドロキシ−N−メチルカナジン、及び1−ヒドロキシ−13−O−アセチル−N−メチルカナジンからなる群より選択される、[65]の方法。
[67]
前記プロトベルベリン生成物が1−ヒドロキシカナジンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞がCYP82Y1を含む、[66]の方法。
[68]
前記プロトベルベリン生成物がN−メチルカナジンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞がTNMTを含む、[65]の方法。
[69]
前記プロトベルベリン生成物がN−メチル−オフィオカルピンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、TNMT及びCYP82X2のうちの少なくとも1つを含む、[65]の方法。
[70]
前記プロトベルベリン生成物が1−ヒドロキシ−N−メチル−カナジンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、TNMT及びCYP82Y1のうちの少なくとも1つを含む、[65]の方法。
[71]
前記プロトベルベリン生成物がナルコトリナールであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、TNMT、CYP82Y1、及びCYP82X1のうちの少なくとも1つを含む、[65]の方法。
[72]
前記プロトベルベリン生成物が1,13−ジヒドロキシ−N−メチルカナジンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、TNMT、CYP82Y1、及びCYP82X2のうちの少なくとも1つを含む、[65]の方法。
[73]
前記プロトベルベリン生成物が1−ヒドロキシ−13−O−アセチル−N−メチルカナジンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、CYP82Y1、CYP82X2、及びAT1のうちの少なくとも1つを含む、[65]の方法。
[74]
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、ノルコトリノゲンジアール、4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシン、及び3−O−アセチルパパベロキシンからなる群より選択される、[56]の方法。
[75]
前記プロトベルベリン生成物がノルコトリノゲンジアールであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、CYP82Y1、CYP82X2、及びCYP82X1のうちの少なくとも1つを含む、[74]の方法。
[76]
前記プロトベルベリン生成物が4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、CYP82X2、AT1、及びCYP82X1のうちの少なくとも1つを含む、[74]の方法。
[77]
前記プロトベルベリン生成物が3−O−アセチルパパベロキシンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、AT1、CYP82X1、MT3、及び6OMTのうちの少なくとも1つを含む、[74]の方法。
[78]
前記遺伝子操作された非植物細胞がレチクリン産生細胞である、[56]の方法。
[79]
前記レチクリン産生細胞が、PTPS、SepR、PCD、QDHPR、DHFR、TyrH、NCS、DODC、CYP80B1、CPR、6OMT、4’OMT、CNMT、ARO4、ARO7、ARO10、及びTKL1を産生するためのコード配列を含み、各コード配列が前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれている、[78]の方法。
[80]
TyrH、4’OMT、及びNCSのうちの少なくとも1つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも1つ、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、前記レチクリン産生細胞内でのレチクリンの産生が増大する、[79]の方法。
[81]
前記レチクリン産生細胞が、BBE、S90MT、MT1、CAS、TNMT、CYP82Y1、CYP82X2、AT、CYP82X1、CXE1、SDR1、MT2、及びMT3のうちの少なくとも1つを産生するための少なくとも1つの異種コード配列を含み、各コード配列が前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれている、[78]の方法。
[82]
TyrH、4’OMT、及びNCSのうちの少なくとも1つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも1つ、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、前記レチクリン産生細胞内でのレチクリンの産生が増大する、[78]の方法。
[83]
前記遺伝子操作された非植物細胞が、少なくとも1つの変異酵素をコードする少なくとも1つの異種配列を含む、[56]の方法。
[84]
前記少なくとも1つの変異酵素が、CYP82Y1のN末端変異体、CYP82X2変異体、CYP82X1変異体からなる群より選択される、[83]の方法。
[85]
前記遺伝子操作された非植物細胞が、少なくとも1つのプロモーターをコードする少なくとも1つの異種配列を含む、[56]の方法。
[86]
前記少なくとも1つのプロモーターが、HXT7、ADH1、PGK1、TPI1、PYK1、TEF1、GAL1、CYC1、PUT1、CIT2、及びGPDからなる群より選択される、[85]の方法。
[87]
前記遺伝子操作された非植物細胞が、免疫グロブリン結合タンパク質(BiP)、DnaJタンパク質、グルコース調節タンパク質(GRP)94、結合タンパク質(BiP)、プロテインジスルフィドイソメラーゼ(PDI)、サイクロフィリン、及びカルネキシンからなる群より選択される1つ以上の植物シャペロンを含む、[56]の方法。
[88]
前記酵素の1つ以上が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の一区画に空間的に局在化し、前記区画が、ミトコンドリア、小胞体(ER)、ゴルジ体、液胞、核、細胞膜、ペルオキシソーム、及びペリプラズムからなる群より選択される、[56]の方法。
[89]
前記1つ以上の酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の前記区画の外側に空間的に局在化する、[88]の方法。
[90]
前記1つ以上の酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の前記区画の内側に空間的に局在化する、[88]の方法。
[91]
前記遺伝子操作された非植物細胞が、少なくとも1つの修飾酵素をコードする少なくとも1つの異種コード配列を含む、[56]の方法。
[92]
前記少なくとも1つの修飾酵素が、ハロゲナーゼ、プレニルトランスフェラーゼ、グリコシラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、及びオキシドレダクターゼからなる群より選択される、[91]の方法。
[93]
前記遺伝子操作された非植物細胞が、微生物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、及び酵母細胞の群から選択される、[56]の方法。
[94]
前記遺伝子操作された非植物細胞が酵母細胞である、[93]の方法。
[95]
前記遺伝子操作された非植物細胞をインビトロ条件下で培養する、[56]の方法。
[96]
前記遺伝子操作された非植物細胞をインビボ条件下で培養する、[56]の方法。
[97]
前記生成物流が、リグニン、フラボノイド、フェナントレノイド、ラテックス、ルビスコ、メコン酸、プソイドモルフィン、ナルセイン、テバオール、及び花粉の群より選択される5ppm超の分子を含まない、[56]の方法。
[98]
前記生成物流が、検出可能な量の農薬を含まない、[56]の方法。
[99]
前記生成物流が、非植物細胞の少なくとも一部分を含む、[56]の方法。
[100]
前記非植物細胞が、遺伝子操作された非植物細胞である、[99]の方法。
[101]
前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、検出可能な量で前記生成物流中に存在する、[99]の方法。
[102]
前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、液体クロマトグラフィー−質量分析法を用いて検出可能である、[101]の方法。
[103]
前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、質量分析法を用いて検出可能である、[101]の方法。
[104]
前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、分光法を用いて検出可能である、[101]の方法。
[105]
少なくとも液液抽出を用いて、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を前記生成物流から回収する、[56]の方法。
[106]
発酵プロセスが完了した直後に、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を回収する、[56]の方法。
[107]
以下を含む医薬組成物:
カナジンまたはカナジンの類縁体を、ノスカピノイド、ノスカピノイドの前駆体、ノスカピノイドの代謝物、ノスカピノイドの類縁体、ノスカピノイドの中間体、及びノスカピノイドの誘導体からなる群より選択される少なくとも1つの化合物を含むノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に沿ったカナジンの誘導体である、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物;ならびに
非植物細胞の少なくとも一部分。
[108]
前記非植物細胞が、遺伝子操作された非植物細胞である、[107]の医薬組成物。
[109]
前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、検出可能な量で前記生成物流中に存在する、[107]の医薬組成物。
[110]
前記非植物細胞の前記部分が、液体クロマトグラフィー−質量分析法を用いて検出可能である、[109]の医薬組成物。
[111]
前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、質量分析法を用いて検出可能である、[109]の医薬組成物。
[112]
前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、分光法を用いて検出可能である、[109]の医薬組成物。
[113]
リグニン、フラボノイド、フェナントレノイド、ラテックス、ルビスコ、メコン酸、プソイドモルフィン、ナルセイン、テバオール、及び花粉の群より選択される5ppm超の分子を含まない、[107]の医薬組成物。
[114]
検出可能な量の農薬を含まない、[107]の医薬組成物。
[115]
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、ノスカピンを含む、[107]の医薬組成物。
[116]
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコトリンを含む、[107]の医薬組成物。
[117]
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコチンヘミアセタールを含む、[105]の医薬組成物。
[118]
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコトリンヘミアセタールを含む、[105]の医薬組成物。
[119]
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、3−O−アセチルパパベロキシンを含む、[107]の医薬組成物。
[120]
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシンを含む、[107]の医薬組成物。
Claims (120)
- カナジンまたはカナジンの類縁体を、ノスカピノイド、ノスカピノイドの前駆体、ノスカピノイドの代謝物、ノスカピノイドの類縁体、ノスカピノイドの中間体、及びノスカピノイドの誘導体からなる群より選択される少なくとも1つの化合物を含むノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に沿って、カナジンの誘導体であるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を産生する、遺伝子操作された非植物細胞であって、前記遺伝子操作された非植物細胞内で産生される前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物の量が、その非植物細胞内で産生されるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物の量よりも多い、前記遺伝子操作された非植物細胞。
- カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する少なくとも1つの酵素をコードする1つ以上の異種コード配列を含む、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する2つ以上の酵素をコードする異種コード配列を含む、請求項2に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する2つの異なる酵素をコードする異種コード配列を含む、請求項3に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する4つ以上の異なる酵素をコードする異種コード配列を含む、請求項3に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記少なくとも1つの酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の化合物を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物に変換する、請求項2に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記化合物が、前記遺伝子操作された非植物細胞内で産生される、請求項6に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- カナジンをノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素が、TNMT、CYP82X2、CYP82Y1、CPY82X1、AT1、6OMT、CXE1、CXE2、SDR1、MT2、及びMT3からなる群より選択される、請求項2に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、フタリドイソキノリンアルカロイドである、請求項8に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコトリンヘミアセタールである、請求項9に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がCXE1を含み、前記CXE1が4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシンをナルコトリンヘミアセタールに変換する、請求項10に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコチンヘミアセタールである、請求項11に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がMT2及びMT3を含み、前記MT2及びMT3がナルコトリンヘミアセタールをナルコチンヘミアセタールに変換する、請求項12に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がMT2及び6OMTを含み、前記MT2及び6OMTがナルコトリンヘミアセタールをナルコチンヘミアセタールに変換する、請求項12に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素が4’OMTを含み、前記4’OMTがナルコトリンヘミアセタールをナルコチンヘミアセタールに変換する、請求項12に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物がナルコトリンである、請求項9に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がSDR1を含み、前記SDR1がナルコトリンヘミアセタールをナルコトリンに変換する、請求項16に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物がノスカピンである、請求項9に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がMT2及びMT3を含み、前記MT2及びMT3がナルコトリンをノスカピンに変換する、請求項18に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がMT2及び6OMTを含み、前記MT2及び6OMTがナルコトリンをノスカピンに変換する、請求項18に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素が4’OMTを含み、前記4’OMTがナルコトリンをノスカピンに変換する、請求項18に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がSDR1を含み、前記SDR1がナルコチンヘミアセタールをノスカピンに変換する、請求項18に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物がプロトベルベリン生成物である、請求項8に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記プロトベルベリン生成物が、1−ヒドロキシカナジン、N−メチルカナジン、N−メチル−オフィオカルピン、1−ヒドロキシ−N−メチル−カナジン、ナルコトリナール、1,13−ジヒドロキシ−N−メチルカナジン、及び1−ヒドロキシ−13−O−アセチル−N−メチルカナジンからなる群より選択される、請求項23に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記プロトベルベリン生成物が1−ヒドロキシカナジンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がCYP82Y1を含み、前記CYP82Y1がカナジンを1−ヒドロキシカナジンに変換する、請求項24に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記プロトベルベリン生成物がN−メチルカナジンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がTNMTを含み、前記TNMTがカナジンをN−メチルカナジンに変換する、請求項24に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記プロトベルベリン生成物がN−メチル−オフィオカルピンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がCYP82X2を含み、前記CYP82X2がN−メチルカナジンをN−メチル−オフィオカルピンに変換する、請求項24に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記プロトベルベリン生成物が1−ヒドロキシ−N−メチル−カナジンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がCYP82Y1を含み、前記CYP82Y1がN−メチルカナジンを1−ヒドロキシ−N−メチル−カナジンに変換する、請求項24に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記プロトベルベリン生成物がナルコトリナールであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がCYP82X1を含み、前記CYP82X1が1−ヒドロキシ−N−メチル−カナジンをナルコトリナールに変換する、請求項24に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記プロトベルベリン生成物が1,13−ジヒドロキシ−N−メチルカナジンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がCYP82X2を含み、前記CYP82X2が1−ヒドロキシ−N−メチル−カナジンを1,13−ジヒドロキシ−N−メチルカナジンに変換する、請求項24に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記プロトベルベリン生成物が1−ヒドロキシ−13−O−アセチル−N−メチルカナジンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がAT1を含み、前記AT1が1,13−ジヒドロキシ−N−メチルカナジンを1−ヒドロキシ−13−O−アセチル−N−メチルカナジンに変換する、請求項24に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコトリノゲンジアール、4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシン、及び3−O−アセチルパパベロキシンからなる群より選択される、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記プロトベルベリン生成物がナルコトリノゲンジアールであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がCYP82X1を含み、前記CYP82X1が1,13−ジヒドロキシ−N−メチルカナジンをナルコトリノゲンジアールに変換する、請求項32に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記プロトベルベリン生成物が4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がCYP82X1を含み、前記CYP82X1が1−ヒドロキシ−13−O−アセチル−N−メチルカナジンを4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシンに変換する、請求項32に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記プロトベルベリン生成物が3−O−アセチルパパベロキシンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がMT2及びMT3を含み、前記MT2及びMT3が4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシンを3−O−アセチルパパベロキシンに変換する、請求項32に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記プロトベルベリン生成物が3−O−アセチルパパベロキシンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素がMT2及び6OMTを含み、前記MT2及び6OMTが4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシンを3−O−アセチルパパベロキシンに変換する、請求項32に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記プロトベルベリン生成物が3−O−アセチルパパベロキシンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素が4’OMTを含み、前記4’OMTが4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシンを3−O−アセチルパパベロキシンに変換する、請求項32に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 微生物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、及び酵母細胞からなる群より選択される、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 酵母細胞である、請求項38に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- レチクリン産生細胞である、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記レチクリン産生細胞が、PTPS、SepR、PCD、QDHPR、DHFR、TyrH、NCS、DODC、CYP80B1、CPR、6OMT、4’OMT、CNMT、ARO4、ARO7、ARO10、及びTKL1を産生するためのコード配列を含み、各コード配列が、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれている、請求項40に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- TyrH、4’OMT、及びNCSのうちの少なくとも1つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも1つ、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、前記レチクリン産生細胞内でのレチクリンの産生が増大する、請求項41に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記レチクリン産生細胞が、BBE、S90MT、MT1、CAS、TNMT、CYP82Y1、CYP82X2、AT1、CYP82X1、CXE1、SDR1、MT2、及びMT3のうちの少なくとも1つを産生するための少なくとも1つの異種コード配列を含み、各コード配列が、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれている、請求項40に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- TyrH、4’OMT、及びNCSのうちの少なくとも1つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも1つ、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、前記レチクリン産生細胞内でのレチクリンの産生が増大する、請求項40に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- CYP82X2及びMT1のうちの少なくとも1つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも1つ、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、前記レチクリン産生細胞内でのノスカピンの産生が増大する、請求項40に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 少なくとも1つの変異酵素をコードする少なくとも1つの異種配列を含む、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記少なくとも1つの変異酵素が、CYP82Y1のN末端変異体、CYP82X2変異体、CYP82X1変異体からなる群より選択される、請求項46に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 少なくとも1つのプロモーターをコードする少なくとも1つの異種配列を含む、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記少なくとも1つのプロモーターが、HXT7、ADH1、PGK1、TPI1、PYK1、TEF1、GAL1、CYC1、PUT1、CIT2、及びGPDからなる群より選択される、請求項48に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 免疫グロブリン結合タンパク質(BiP)、DnaJタンパク質、グルコース調節タンパク質(GRP)94、結合タンパク質(BiP)、プロテインジスルフィドイソメラーゼ(PDI)、サイクロフィリン、及びカルネキシンからなる群より選択される1つ以上の植物シャペロンを含む、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記酵素の1つ以上が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の一区画に空間的に局在化し、前記区画が、ミトコンドリア、小胞体(ER)、ゴルジ体、液胞、核、細胞膜、ペルオキシソーム、及びペリプラズムからなる群より選択される、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記1つ以上の酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の前記区画の外側に空間的に局在化する、請求項51に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記1つ以上の酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の前記区画の内側に空間的に局在化する、請求項51に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 少なくとも1つの修飾酵素をコードする少なくとも1つの異種コード配列を含む、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 前記少なくとも1つの修飾酵素が、ハロゲナーゼ、プレニルトランスフェラーゼ、グリコシラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、及びオキシドレダクターゼからなる群より選択される、請求項54に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
- 以下の工程を含む、カナジンの下流にあるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を有する生成物流の形成方法:
a.カナジンまたはカナジンの類縁体を、ノスカピノイド、ノスカピノイドの前駆体、ノスカピノイドの代謝物、ノスカピノイドの類縁体、ノスカピノイドの中間体、及びノスカピノイドの誘導体からなる群より選択される少なくとも1つの化合物を含むノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に沿って、カナジンの誘導体であるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を産生する遺伝子操作された非植物細胞を培養する工程であって、前記遺伝子操作された非植物細胞が、カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの異種配列を含む、工程;ならびに
b.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を細胞物質から分離する工程であって、それによって前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を有する生成物流がもたらされる、工程。 - 前記遺伝子操作された非植物細胞内の前記少なくとも1つの酵素の量が、その遺伝子操作されていない非植物細胞内の前記少なくとも1つの酵素の量よりも多い、請求項56に記載の方法。
- カナジンをノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する前記少なくとも1つの酵素が、TNMT、CYP82X2、CYP82Y1、CPY82X1、AT1、6OMT、CXE1、CXE1、SDR1、MT2、及びMT3からなる群より選択される、請求項56に記載の方法。
- 前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、フタリドイソキノリンアルカロイドである、請求項56に記載の方法。
- 前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコトリンヘミアセタール、ナルコチンヘミアセタール、ナルコトリン、及びノスカピンからなる群より選択される、請求項59に記載の方法。
- 前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物がナルコトリンヘミアセタールであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、CYP82X1及びCXE1のうちの少なくとも1つを含む、請求項60に記載の方法。
- 前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物がナルコチンヘミアセタールであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、MT2、MT3、6OMT、及びCXE1のうちの少なくとも1つを含む、請求項60に記載の方法。
- 前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物がナルコトリンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、CXE1及びSDR1のうちの少なくとも1つを含む、請求項60に記載の方法。
- 前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物がノスカピンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、MT3、6OMT、CXE1、及びSDR1のうちの少なくとも1つを含む、請求項60に記載の方法。
- 前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物がプロトベルベリン生成物である、請求項56に記載の方法。
- 前記プロトベルベリン生成物が、1−ヒドロキシカナジン、N−メチルカナジン、N−メチル−オフィオカルピン、1−ヒドロキシ−N−メチルカナジン、ナルコトリナール、1,13−ジヒドロキシ−N−メチルカナジン、及び1−ヒドロキシ−13−O−アセチル−N−メチルカナジンからなる群より選択される、請求項65に記載の方法。
- 前記プロトベルベリン生成物が1−ヒドロキシカナジンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞がCYP82Y1を含む、請求項66に記載の方法。
- 前記プロトベルベリン生成物がN−メチルカナジンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞がTNMTを含む、請求項65に記載の方法。
- 前記プロトベルベリン生成物がN−メチル−オフィオカルピンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、TNMT及びCYP82X2のうちの少なくとも1つを含む、請求項65に記載の方法。
- 前記プロトベルベリン生成物が1−ヒドロキシ−N−メチル−カナジンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、TNMT及びCYP82Y1のうちの少なくとも1つを含む、請求項65に記載の方法。
- 前記プロトベルベリン生成物がナルコトリナールであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、TNMT、CYP82Y1、及びCYP82X1のうちの少なくとも1つを含む、請求項65に記載の方法。
- 前記プロトベルベリン生成物が1,13−ジヒドロキシ−N−メチルカナジンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、TNMT、CYP82Y1、及びCYP82X2のうちの少なくとも1つを含む、請求項65に記載の方法。
- 前記プロトベルベリン生成物が1−ヒドロキシ−13−O−アセチル−N−メチルカナジンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、CYP82Y1、CYP82X2、及びAT1のうちの少なくとも1つを含む、請求項65に記載の方法。
- 前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、ノルコトリノゲンジアール、4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシン、及び3−O−アセチルパパベロキシンからなる群より選択される、請求項56に記載の方法。
- 前記プロトベルベリン生成物がノルコトリノゲンジアールであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、CYP82Y1、CYP82X2、及びCYP82X1のうちの少なくとも1つを含む、請求項74に記載の方法。
- 前記プロトベルベリン生成物が4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、CYP82X2、AT1、及びCYP82X1のうちの少なくとも1つを含む、請求項74に記載の方法。
- 前記プロトベルベリン生成物が3−O−アセチルパパベロキシンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、AT1、CYP82X1、MT3、及び6OMTのうちの少なくとも1つを含む、請求項74に記載の方法。
- 前記遺伝子操作された非植物細胞がレチクリン産生細胞である、請求項56に記載の方法。
- 前記レチクリン産生細胞が、PTPS、SepR、PCD、QDHPR、DHFR、TyrH、NCS、DODC、CYP80B1、CPR、6OMT、4’OMT、CNMT、ARO4、ARO7、ARO10、及びTKL1を産生するためのコード配列を含み、各コード配列が前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれている、請求項78に記載の方法。
- TyrH、4’OMT、及びNCSのうちの少なくとも1つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも1つ、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、前記レチクリン産生細胞内でのレチクリンの産生が増大する、請求項79に記載の方法。
- 前記レチクリン産生細胞が、BBE、S90MT、MT1、CAS、TNMT、CYP82Y1、CYP82X2、AT、CYP82X1、CXE1、SDR1、MT2、及びMT3のうちの少なくとも1つを産生するための少なくとも1つの異種コード配列を含み、各コード配列が前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれている、請求項78に記載の方法。
- TyrH、4’OMT、及びNCSのうちの少なくとも1つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも1つ、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、前記レチクリン産生細胞内でのレチクリンの産生が増大する、請求項78に記載の方法。
- 前記遺伝子操作された非植物細胞が、少なくとも1つの変異酵素をコードする少なくとも1つの異種配列を含む、請求項56に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの変異酵素が、CYP82Y1のN末端変異体、CYP82X2変異体、CYP82X1変異体からなる群より選択される、請求項83に記載の方法。
- 前記遺伝子操作された非植物細胞が、少なくとも1つのプロモーターをコードする少なくとも1つの異種配列を含む、請求項56に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのプロモーターが、HXT7、ADH1、PGK1、TPI1、PYK1、TEF1、GAL1、CYC1、PUT1、CIT2、及びGPDからなる群より選択される、請求項85に記載の方法。
- 前記遺伝子操作された非植物細胞が、免疫グロブリン結合タンパク質(BiP)、DnaJタンパク質、グルコース調節タンパク質(GRP)94、結合タンパク質(BiP)、プロテインジスルフィドイソメラーゼ(PDI)、サイクロフィリン、及びカルネキシンからなる群より選択される1つ以上の植物シャペロンを含む、請求項56に記載の方法。
- 前記酵素の1つ以上が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の一区画に空間的に局在化し、前記区画が、ミトコンドリア、小胞体(ER)、ゴルジ体、液胞、核、細胞膜、ペルオキシソーム、及びペリプラズムからなる群より選択される、請求項56に記載の方法。
- 前記1つ以上の酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の前記区画の外側に空間的に局在化する、請求項88に記載の方法。
- 前記1つ以上の酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の前記区画の内側に空間的に局在化する、請求項88に記載の方法。
- 前記遺伝子操作された非植物細胞が、少なくとも1つの修飾酵素をコードする少なくとも1つの異種コード配列を含む、請求項56に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの修飾酵素が、ハロゲナーゼ、プレニルトランスフェラーゼ、グリコシラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、及びオキシドレダクターゼからなる群より選択される、請求項91に記載の方法。
- 前記遺伝子操作された非植物細胞が、微生物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、及び酵母細胞の群から選択される、請求項56に記載の方法。
- 前記遺伝子操作された非植物細胞が酵母細胞である、請求項93に記載の方法。
- 前記遺伝子操作された非植物細胞をインビトロ条件下で培養する、請求項56に記載の方法。
- 前記遺伝子操作された非植物細胞をインビボ条件下で培養する、請求項56に記載の方法。
- 前記生成物流が、リグニン、フラボノイド、フェナントレノイド、ラテックス、ルビスコ、メコン酸、プソイドモルフィン、ナルセイン、テバオール、及び花粉の群より選択される5ppm超の分子を含まない、請求項56に記載の方法。
- 前記生成物流が、検出可能な量の農薬を含まない、請求項56に記載の方法。
- 前記生成物流が、非植物細胞の少なくとも一部分を含む、請求項56に記載の方法。
- 前記非植物細胞が、遺伝子操作された非植物細胞である、請求項99に記載の方法。
- 前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、検出可能な量で前記生成物流中に存在する、請求項99に記載の方法。
- 前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、液体クロマトグラフィー−質量分析法を用いて検出可能である、請求項101に記載の方法。
- 前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、質量分析法を用いて検出可能である、請求項101に記載の方法。
- 前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、分光法を用いて検出可能である、請求項101に記載の方法。
- 少なくとも液液抽出を用いて、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を前記生成物流から回収する、請求項56に記載の方法。
- 発酵プロセスが完了した直後に、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を回収する、請求項56に記載の方法。
- 以下を含む医薬組成物:
カナジンまたはカナジンの類縁体を、ノスカピノイド、ノスカピノイドの前駆体、ノスカピノイドの代謝物、ノスカピノイドの類縁体、ノスカピノイドの中間体、及びノスカピノイドの誘導体からなる群より選択される少なくとも1つの化合物を含むノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に沿ったカナジンの誘導体である、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物;ならびに
非植物細胞の少なくとも一部分。 - 前記非植物細胞が、遺伝子操作された非植物細胞である、請求項107に記載の医薬組成物。
- 前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、検出可能な量で前記生成物流中に存在する、請求項107に記載の医薬組成物。
- 前記非植物細胞の前記部分が、液体クロマトグラフィー−質量分析法を用いて検出可能である、請求項109に記載の医薬組成物。
- 前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、質量分析法を用いて検出可能である、請求項109に記載の医薬組成物。
- 前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、分光法を用いて検出可能である、請求項109に記載の医薬組成物。
- リグニン、フラボノイド、フェナントレノイド、ラテックス、ルビスコ、メコン酸、プソイドモルフィン、ナルセイン、テバオール、及び花粉の群より選択される5ppm超の分子を含まない、請求項107に記載の医薬組成物。
- 検出可能な量の農薬を含まない、請求項107に記載の医薬組成物。
- 前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、ノスカピンを含む、請求項107に記載の医薬組成物。
- 前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコトリンを含む、請求項107に記載の医薬組成物。
- 前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコチンヘミアセタールを含む、請求項105に記載の医薬組成物。
- 前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコトリンヘミアセタールを含む、請求項105に記載の医薬組成物。
- 前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、3−O−アセチルパパベロキシンを含む、請求項107に記載の医薬組成物。
- 前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、4’−O−デスメチル−3−O−アセチルパパベロキシンを含む、請求項107に記載の医薬組成物。
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