KR20170083568A - 노스캐피노이드-생산 미생물 그리고 이의 제조 방법 및 사용 방법 - Google Patents

노스캐피노이드-생산 미생물 그리고 이의 제조 방법 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

카나딘, 또는 카나딘의 유사체를, 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 대사 경로를 따라 카나딘의 유도체인 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물을 생산하는 조작된 비-식물 세포가 제공된다. 노스캐피노이드 생성물을 생산하는 조작된 비-식물 세포의 배양 방법 및 약학적 조성물이 또한 제공된다.

Description

노스캐피노이드-생산 미생물 그리고 이의 제조 방법 및 사용 방법{NOSCAPINOID-PRODUCING MICROBES AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME}
관련 출원에 대한 참조-문헌
본 출원은 하기 우선권을 주장한다: 미국 가출원 번호 62/080,610 (2014년 11월 17일 출원); 미국 가출원 번호 62/107,238 (2015년 1월 23일 출원); 미국 가출원 번호 62/156,701 (2015년 5월 4일 출원); 미국 가출원 번호 62/159,122 (2015년 5월 8일 출원); 및 미국 가출원 번호 62/174,475 (2015년 6월 11일 출원, 그의 개시내용은 전체적으로 본원에서 참조로 편입됨).
정부권리
본 발명은 하기 계약 번호 하에 정부 지원으로 완성되었다: 미국 국립 보건원에 의해 수여된 AT007886. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
요약
본 개시내용은 조작된 숙주 세포에서 다양한 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 (바이어스), 예컨대 노스캐피노이드의 생산 방법을 제공한다. 본 개시내용은 조작된 숙주 세포에서 생산된 다양한 노스캐피노이드의 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명의 하나의 측면은 노스캐피노이드, 노스캐피노이드의 전구체, 노스캐피노이드의 대사물질, 노스캐피노이드의 유사체, 노스캐피노이드의 중간체, 및/또는 노스캐피노이드의 유도체를 생산하는 조작된 비-식물 세포를 제공한다. 예에서, 조작된 숙주 세포는, 조작된 숙주 세포에 부가될 수 있는, 출발 화합물로서 카나딘을 이용할 수 있다. 다른 예에서, 조작된 숙주 세포는 전구체 예컨대 노르라우다노솔린 또는 티로신으로부터 세포에 의해 생산되는 카나딘을 이용할 수 있다. 추가적으로 예에서, 조작된 숙주 세포는 노스캐피노이드, 노스캐피노이드의 전구체, 노스캐피노이드의 대사물질, 노스캐피노이드의 유사체, 노스캐피노이드의 중간체, 및/또는 티로신으로부터 노스캐피노이드를 생산하도록 조작된 효모 세포로부터 신생 노스캐피노이드 유도체를 생산할 수 있고, 여기에서 티로신은 효모 세포로부터 자연적으로 생산된다. 추가 예에서, 조작된 숙주 세포는 노스캐피노이드, 노스캐피노이드의 전구체, 노스캐피노이드의 대사물질, 노스캐피노이드의 유사체, 노스캐피노이드의 중간체, 노스캐피노이드의 기능화된 유도체, 및/또는 전구체 화합물의 유사체, 예컨대 티로신을 사용하여 형성되는 노스캐피노이드의 유도체를 생산할 수 있다.
예에서, 본 발명의 하나의 측면은 카나딘, 또는 카나딘의 유사체를, 노스캐피노이드, 노스캐피노이드의 전구체, 노스캐피노이드의 대사물질, 노스캐피노이드의 유사체, 노스캐피노이드의 중간체, 및 노스캐피노이드의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 대사 경로를 따라 카나딘의 유도체인 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물을 생산하는 조작된 비-식물 세포를 제공하고, 여기에서 조작된 비-식물 세포에서 생산되는 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물의 양은 비-식물 세포에서 생산되는 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물의 양 초과이다.
일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 카나딘, 또는 카나딘의 유사체를, 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소를 인코딩한 하나 이상의 이종 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 카나딘, 또는 카나딘의 유사체를, 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 대사 경로에서 관여된 1 초과 효소를 인코딩한 이종 코딩 서열을 포함한다. 추가적으로, 일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 카나딘, 또는 카나딘의 유사체를, 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 대사 경로에서 관여된 2개의 상이한 효소를 인코딩한 이종 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 카나딘, 또는 카나딘의 유사체를, 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 대사 경로에서 관여된 3개 초과의 상이한 효소를 인코딩하는 이종 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 효소는 조작된 비-식물 세포내의 화합물을 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 화합물은 조작된 비-식물 세포내에서 생산된다. 일부 구현예에서, 카나딘을 노스캐피노이드로 전환시키는 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 TNMT, CYP82X2, CYP82Y1, CPY82X1, AT1, 6OMT, CXE1, CXE2, SDR1, MT2, 및 MT3으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드이다. 일부 구현예에서, 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 나르코톨린헤미아세탈이고, 추가 구현예에서, 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 CXE1을 포함하고, 여기에서 CXE1은 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신을 나르코톨린헤미아세탈로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 나르코틴헤미아세탈이고, 추가 구현예에서, 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 MT2 및 MT3을 포함하고, 여기에서 MT2 및 MT3은 나르코톨린헤미아세탈을 나르코틴헤미아세탈로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 MT2 및 6OMT를 포함하고, 여기에서 MT2 및 6OMT는 나르코톨린헤미아세탈을 나르코틴헤미아세탈로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 4'OMT를 포함하고, 여기에서 4'OMT는 나르코톨린헤미아세탈을 나르코틴헤미아세탈로 전환시킨다.
일부 구현예에서, 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 나르코톨린이고, 추가 구현예에서, 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 SDR1을 포함하고, 여기에서 SDR1은 나르코톨린헤미아세탈을 나르코톨린으로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 노스카핀이고, 추가 구현예에서, 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 MT2 및 MT3을 포함하고, 여기에서 MT2 및 MT3은 나르코톨린을 노스카핀으로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 MT2 및 6OMT를 포함하고, 여기에서 MT2 및 6OMT는 나르코톨린을 노스카핀으로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 4'OMT를 포함하고, 여기에서 4'OMT는 나르코톨린을 노스카핀으로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 SDR1을 포함하고, 여기에서 SDR1은 나르코틴헤미아세탈을 노스카핀으로 전환시킨다.
일부 구현예에서, 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 프로토베르베린 생성물이다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 1-하이드록시카나딘, N-메틸카나딘, N-메틸-오피오카르핀, 1-하이드록시-N-메틸-카나딘, 나르코톨리날, 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘, 및 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 1-하이드록시카나딘이고, 여기에서 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 CYP82Y1을 포함하고, 여기에서 CYP82Y1은 카나딘을 1-하이드록시카나딘으로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 N-메틸카나딘이고, 여기에서 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 TNMT를 포함하고, 여기에서 TNMT는 카나딘을 N-메틸카나딘으로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 N-메틸-오피오카르핀이고, 여기에서 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 CYP82X2를 포함하고, 여기에서 CYP82X2는 N-메틸카나딘을 N-메틸-오피오카르핀으로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 1-하이드록시-N-메틸-카나딘이고, 여기에서 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 CYP82Y1을 포함하고, 여기에서 CYP82Y1은 N-메틸카나딘을 1-하이드록시-N-메틸-카나딘으로 전환시킨다.
일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 나르코톨리날이고, 여기에서 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 CYP82X1을 포함하고, 여기에서 CYP82X1은 1-하이드록시-N-메틸-카나딘을 나르코톨리날로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘이고, 여기에서 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 CYP82X2를 포함하고, 여기에서 CYP82X2는 1-하이드록시-N-메틸-카나딘을 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘으로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘이고, 여기에서 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 AT1을 포함하고, 여기에서 AT1은 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘을 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘으로 전환시킨다.
일부 구현예에서, 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 나르코톨리노젠디알, 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신, 및 3-O-아세틸파파베록신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 나르코톨리노젠디알이고, 여기에서 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 CYP82X1을 포함하고, 여기에서 CYP82X1은 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘을 나르코톨리노젠디알로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신이고, 여기에서 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 CYP82X1을 포함하고, 여기에서 CYP82X1은 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘을 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신으로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 3-O-아세틸파파베록신이고, 여기에서 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 MT2 및 MT3을 포함하고, 여기에서 MT2 및 MT3은 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신을 3-O-아세틸파파베록신으로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 3-O-아세틸파파베록신이고, 여기에서 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 MT2 및 6OMT, 여기에서 MT2 및 6OMT는 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신을 3-O-아세틸파파베록신으로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 3-O-아세틸파파베록신이고, 여기에서 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 4'OMT를 포함하고, 여기에서 4'OMT는 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신을 3-O-아세틸파파베록신으로 전환시킨다.
일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 미생물 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 박테리아 세포, 및 효모 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 효모 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 레티쿨린-생산 세포이다. 일부 구현예에서, 레티쿨린-생산 세포는 PTPS, SepR, PCD, QDHPR, DHFR, TyrH, NCS, DODC, CYP80B1, CPR, 6OMT, 4'OMT, CNMT, ARO4, ARO7, ARO10, 및 TKL1 생산용 코딩 서열을 포함하고, 여기에서 각 코딩 서열은 레티쿨린-생산 세포로 염색체에 의해 통합된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 TyrH, 4'OMT, 및 NCS를 생산하는 코딩 서열의 적어도 하나의 추가의 복사본은 레티쿨린-생산 세포로 염색체에 의해 통합되고, 그렇게 함으로써 레티쿨린-생산 세포 내에서 레티쿨린의 생산을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 레티쿨린-생산 세포는 적어도 하나의 BBE, S90MT, MT1, CAS, TNMT, CYP82Y1, CYP82X2, AT1, CYP82X1, CXE1, SDR1, MT2, 및 MT3 생산용 적어도 하나의 이종 코딩 서열을 포함하고, 여기에서 각 코딩 서열은 레티쿨린-생산 세포로 염색체에 의해 통합된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 TyrH, 4'OMT, 및 NCS를 생산하는 코딩 서열의 적어도 하나의 추가의 복사본은 레티쿨린-생산 세포로 염색체에 의해 통합되고, 그렇게 함으로써 레티쿨린-생산 세포 내에서 레티쿨린의 생산을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 CYP82X2 및 MT1을 생산하는 코딩 서열의 적어도 하나의 추가의 복사본은 레티쿨린-생산 세포로 염색체에 의해 통합되고, 그렇게 함으로써 레티쿨린-생산 세포 내에서 노스카핀의 생산을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 적어도 하나의 돌연변이체 효소를 인코딩한 적어도 하나의 이종 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 돌연변이체 효소는 CYP82Y1 N-말단 돌연변이체, CYP82X2 돌연변이체, CYP82X1 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 적어도 하나의 프로모터를 인코딩한 적어도 하나의 이종 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 HXT7, ADH1, PGK1, TPI1, PYK1, TEF1, GAL1, CYC1, PUT1, CIT2, 및 GPD로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 결합 면역글로불린 단백질 (BiP), DnaJ 단백질, 글루코오스 조절된 단백질 (GRP) 94, 결합 단백질 (BiP), 단백질 디설파이드 이소머라제 (PDI), 사이클로필린, 및 칼넥신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물 샤페론을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 효소는 조작된 비-식물 세포에서 한 구획에 공간적으로 국재화되고, 여기에서 상기 구획은 미토콘드리아, 내형질 망 (ER), 골지, 액포, 핵, 원형질막, 페록시솜, 및 주변세포질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 효소는 조작된 비-식물 세포에서 구획의 외부에 공간적으로 국재화된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 효소는 조작된 비-식물 세포에서 구획의 내부에 공간적으로 국재화된다. 일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 적어도 하나의 테일러링 효소 인코딩용 적어도 하나의 이종 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 테일러링 효소는 할로게나제, 프레날트랜스퍼라제, 글리코실라제, 메틸라제, 디메틸라제, 및 옥시도리덕타제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 측면은 카나딘의 다운스트림인 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물을 갖는 생성물 스트림의 형성 방법을 제공한다. 상기 방법은, 카나딘, 또는 카나딘의 유사체를, 노스캐피노이드, 노스캐피노이드의 전구체, 노스캐피노이드의 대사물질, 노스캐피노이드의 유사체, 노스캐피노이드의 중간체, 및 노스캐피노이드의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 대사 경로를 따라 카나딘의 유도체인 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물을 생산하는 조작된 비-식물 세포 배양을 포함하고, 여기에서 조작된 비-식물 세포는 카나딘, 또는 카나딘의 유사체를 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소를 인코딩한 적어도 하나의 이종 서열을 포함한다. 상기 방법은 또한 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물을 갖는 생성물 스트림을 제공하기 위해 세포성 물질로부터 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물의 분리를 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포에서 적어도 하나의 효소의 양은 비-조작된 비-식물 세포에서 적어도 하나의 효소의 양 초과이다. 일부 구현예에서, 카나딘 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소는 TNMT, CYP82X2, CYP82Y1, CPY82X1, AT1, 6OMT, CXE1, CXE1, SDR1, MT2, 및 MT3으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드이다. 일부 구현예에서, 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 나르코톨린헤미아세탈, 나르코틴헤미아세탈, 나르코톨린, 및 노스카핀으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 나르코톨린헤미아세탈이고, 여기에서 조작된 비-식물 세포는 적어도 하나의 CYP82X1 및 CXE1을 포함한다. 일부 구현예에서, 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 나르코틴헤미아세탈이고, 여기에서 조작된 비-식물 세포는 적어도 하나의 MT2, MT3, 6OMT, 및 CXE1을 포함한다. 일부 구현예에서, 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 나르코톨린이고, 여기에서 조작된 비-식물 세포는 적어도 하나의 CXE1 및 SDR1을 포함한다. 일부 구현예에서, 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 노스카핀이고, 여기에서 조작된 비-식물 세포는 적어도 하나의 MT3, 6OMT, CXE1, 및 SDR1을 포함한다.
일부 구현예에서, 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 프로토베르베린 생성물이다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 1-하이드록시카나딘, N-메틸카나딘, N-메틸-오피오카르핀, 1-하이드록시-N-메틸카나딘, 나르코톨리날, 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘, 및 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 1-하이드록시카나딘이고, 여기에서 조작된 비-식물 세포는 CYP82Y1을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 N-메틸카나딘이고, 여기에서 조작된 비-식물 세포는 TNMT를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 N-메틸-오피오카르핀이고, 여기에서 조작된 비-식물 세포는 적어도 하나의 TNMT 및 CYP82X2를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 1-하이드록시-N-메틸-카나딘이고, 여기에서 조작된 비-식물 세포는 적어도 하나의 TNMT 및 CYP82Y1을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 나르코톨리날이고, 여기에서 조작된 비-식물 세포는 적어도 하나의 TNMT, CYP82Y1, 및 CYP82X1을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘이고, 여기에서 조작된 비-식물 세포는 적어도 하나의 TNMT, CYP82Y1, 및 CYP82X2를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘이고, 여기에서 조작된 비-식물 세포는 적어도 하나의 CYP82Y1, CYP82X2, 및 AT1을 포함한다.
일부 구현예에서, 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 노르코톨리노젠디알, 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신, 및 3-O-아세틸파파베록신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 노르코톨리노젠디알이고, 여기에서 조작된 비-식물 세포는 적어도 하나의 CYP82Y1, CYP82X2, 및 CYP82X1을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신이고, 여기에서 조작된 비-식물 세포는 적어도 하나의 CYP82X2, AT1, 및 CYP82X1을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로토베르베린 생성물은 3-O-아세틸파파베록신이고, 여기에서 조작된 비-식물 세포는 적어도 하나의 AT1, CYP82X1, MT3, 및 6OMT를 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 레티쿨린-생산 세포이다. 일부 구현예에서, 레티쿨린-생산 세포는 PTPS, SepR, PCD, QDHPR, DHFR, TyrH, NCS, DODC, CYP80B1, CPR, 6OMT, 4'OMT, CNMT, ARO4, ARO7, ARO10, 및 TKL1 생산용 코딩 서열을 포함하고, 여기에서 각 코딩 서열은 레티쿨린-생산 세포로 염색체에 의해 통합된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 TyrH, 4'OMT, 및 NCS를 생산하는 코딩 서열의 적어도 하나의 추가의 복사본은 레티쿨린-생산 세포로 염색체에 의해 통합되고, 그렇게 함으로써 레티쿨린-생산 세포 내에서 레티쿨린의 생산을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 레티쿨린-생산 세포는 적어도 하나의 BBE, S90MT, MT1, CAS, TNMT, CYP82Y1, CYP82X2, AT, CYP82X1, CXE1, SDR1, MT2, 및 MT3 생산용 적어도 하나의 이종 코딩 서열을 포함하고, 여기에서 각 코딩 서열은 레티쿨린-생산 세포로 염색체에 의해 통합된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 TyrH, 4'OMT, 및 NCS를 생산하는 코딩 서열의 적어도 하나의 추가의 복사본은 레티쿨린-생산 세포로 염색체에 의해 통합되고, 그렇게 함으로써 레티쿨린-생산 세포 내에서 레티쿨린의 생산을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 적어도 하나의 돌연변이체 효소를 인코딩한 적어도 하나의 이종 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 돌연변이체 효소는 CYP82Y1 N-말단 돌연변이체, CYP82X2 돌연변이체, CYP82X1 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 적어도 하나의 프로모터를 인코딩한 적어도 하나의 이종 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 HXT7, ADH1, PGK1, TPI1, PYK1, TEF1, GAL1, CYC1, PUT1, CIT2, 및 GPD로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 결합 면역글로불린 단백질 (BiP), DnaJ 단백질, 글루코오스 조절된 단백질 (GRP) 94, 결합 단백질 (BiP), 단백질 디설파이드 이소머라제 (PDI), 사이클로필린, 및 칼넥신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물 샤페론을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 효소는 조작된 비-식물 세포에서 한 구획에 공간적으로 국재화되고, 여기에서 상기 구획은 미토콘드리아, 내형질 망 (ER), 골지, 액포, 핵, 원형질막, 페록시솜, 및 주변세포질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 효소는 조작된 비-식물 세포에서 구획의 외부에 공간적으로 국재화된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 효소는 조작된 비-식물 세포에서 구획의 내부에 공간적으로 국재화된다.
일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 적어도 하나의 테일러링 효소 인코딩용 적어도 하나의 이종 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 테일러링 효소는 할로게나제, 프레날트랜스퍼라제, 글리코실라제, 메틸라제, 디메틸라제, 및 옥시도리덕타제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 미생물 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 박테리아 세포, 및 효모 세포의 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 효모 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 시험관내 조건하에서 배양된다. 일부 구현예에서, 조작된 비-식물 세포는 생체내 조건하에서 배양된다.
일부 구현예에서, 생성물 스트림은 리그닌, 플라보노이드, 페난트레오이드, 라텍스, 루비스코, 메콘산, 슈도모르핀, 나르세인, 테바올, 및 화분의 군으로부터 선택되는 5 ppm 초과의 분자를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 생성물 스트림은 살충제의 검출가능한 양을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 생성물 스트림은 비-식물 세포의 적어도 하나의 부분을 함유한다. 일부 구현예에서, 비-식물 세포는 조작된 비-식물 세포이다. 일부 구현예에서, 비-식물 세포의 적어도 하나의 부분은 생성물 스트림에서 검출가능한 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 비-식물 세포의 적어도 하나의 부분은 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법을 이용하여 검출가능하다. 일부 구현예에서, 비-식물 세포의 적어도 하나의 부분은 질량 분광분석법을 이용하여 검출가능하다. 일부 구현예에서, 비-식물 세포의 적어도 하나의 부분은 분광법을 이용하여 검출가능하다. 일부 구현예에서, 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 적어도 액체-액체 추출을 이용하여 상기 생성물 스트림으로부터 회수된다. 일부 구현예에서, 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 발효 공정이 완료된 직후 회수된다.
본 발명의 추가의 측면은, 카나딘, 또는 카나딘의 유사체를, 노스캐피노이드, 노스캐피노이드의 전구체, 노스캐피노이드의 대사물질, 노스캐피노이드의 유사체, 노스캐피노이드의 중간체, 및 노스캐피노이드의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 대사 경로를 따라 카나딘의 유도체인 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물을 포함한 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 또한 비-식물 세포의 적어도 하나의 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-식물 세포는 조작된 비-식물 세포이다. 일부 구현예에서, 비-식물 세포의 적어도 하나의 부분은 생성물 스트림에서 검출가능한 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 비-식물 세포의 일부는 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법을 이용하여 검출가능하다. 일부 구현예에서, 비-식물 세포의 적어도 하나의 부분은 질량 분광분석법을 이용하여 검출가능하다.
일부 구현예에서, 비-식물 세포의 적어도 하나의 부분은 분광법을 이용하여 검출가능하다. 일부 구현예에서, 조성물은 리그닌, 플라보노이드, 페난트레오이드, 라텍스, 루비스코, 메콘산, 슈도모르핀, 나르세인, 테바올, 및 화분의 군으로부터 선택되는 5 ppm 초과의 분자를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 살충제의 검출가능한 양을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 노스카핀을 포함한다. 일부 구현예에서, 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 나르코톨린을 포함한다. 일부 구현예에서, 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 나르코틴헤미아세탈을 포함한다. 일부 구현예에서, 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 나르코톨린헤미아세탈을 포함한다. 일부 구현예에서, 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 3-O-아세틸파파베록신을 포함한다. 일부 구현예에서, 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물은 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신을 포함한다.
조작된 숙주 세포는 출발 화합물부터 관심 노스캐피노이드 또는 이들의 전구체까지 합성 경로에서 관여된 다양한 효소용 이종 코딩 서열을 포함할 수 있다. 숙주 세포의 이종 코딩 서열에 의해 인코딩된 효소의 활성을 촉진시키는 배양 조건하에서 조작된 숙주 세포를 배양시킴으로써 노스캐피노이드, 이들의 유도체, 및/또는 이들의 전구체의 생산 방법이 또한 제공된다. 본 발명의 측면은 추가로 본 발명의 방법에서 용도를 찾는 조성물, 예를 들면, 숙주 세포, 출발 화합물 및 키트, 등을 포함한다.
참조에 의한 편입
본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 각 개별적인 공보, 특허, 또는 특허 출원이 참조로 편입되도록 특이적으로 및 개별적으로 지시되는 것처럼 동일한 정도로 참조로 본원에서 편입된다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 신규 특징은 첨부된 청구범위에서 특수성으로 제시된다. 본 발명의 특징 및 이점의 더 나은 이해는 예시적인 구현예를 제시한 하기 상세한 설명을 참조로 수득될 것이고, 여기에서 본 발명의 원리, 및 이의 수반되는 하기 도면들은 이용된다:
도1은 식물에서 생화학적 확인에 기반된 카나딘의 노스카핀으로의 전환용 생합성 도식을 예시한다.
도2A는, 본 발명의 구현예에 따라서, 사카로마이세스 세레비지애에서 생화학적 특성화에 기반하여 카나딘의 노스카핀으로의 전환용 생합성 도식을 예시한다.
도2B는, 본 발명의 구현예에 따라서, 사카로마이세스 세레비지애에서 생화학적 특성화에 기반하여 카나딘의 노스카핀으로의 전환 및 부산물의 생산용 또 다른 생합성 도식을 예시한다.
도3은, 본 발명의 구현예에 따라서, 조작된 효모 균주에 의해 배양 배지에 분비된 화합물의 액체 크로마토그래피-질량 분광법 (LC-MS) 분석으로부터 EIC (추출물 이온 크로마토그래프) 기록을 예시한다.
도4는 본 발명의 구현예에 따라서 도 3에서 기재된 화합물용 양이온 전기분무 이온화 (ESI) 질량 스펙트럼 MS/MS 단편화를 예시한다.
도5는, 본 발명의 구현예에 따라서, 파파베르 솜니페럼 또는 캘리포니아 양귀비로부터 TNMT를 발현하는 및 카나딘의 존재하에 성장된 효모로부터 생체내 N-메틸카나딘의 합성을 예시한다.
도6은, 본 발명의 구현예에 따라서, PsTNMT의 존재 있거나 없이, 다양한 프로모터의 CYP82Y1 다운스트림의 상이한 버전의 발현과 함께 카나딘의 존재하에, 성장된 효모로부터 생체내 검정의 결과를 예시한다.
도7은, 본 발명의 구현예에 따라서, PsTNMT 및 CYP82Y1A의 존재하에, 다양한 프로모터 (GAL1, GPD, PGK1, HXT7)의 CYP82X2 다운스트림의 발현과 함께 카나딘의 존재하에 성장된 효모로부터 생체내 검정의 결과를 예시한다.
도8은, 본 발명의 구현예에 따라서, CYP82X2 및 PsAT1 있거나 없이, PsTNMT 및 CYP82Y1A의 존재하에, 다양한 프로모터 (GAL1, GPD, PGK1, CYC1, ADH1, HXT7)의 야생형 (WT) 다운스트림의 발현과 카나딘의 존재하에 성장된 효모로부터 생체내 검정의 결과를 예시한다.
도9는, 본 발명의 구현예에 따라서, 노르라우다노솔린의 노스카핀으로의 전환용 생합성 도식을 예시한다.
도10은, 본 발명의 구현예에 따라서, 조작된 노스카핀 생산 효모 균주에 의해 배양 배지에 분비된 화합물의 LC-MS 분석으로부터 EIC (추출물 이온 크로마토그래프) 기록을 예시한다.
도11은, 본 발명의 구현예에 따라서, 노르라우다노솔린으로부터 노스카핀의 생합성을 예시한다.
도12는, 본 발명의 구현예에 따라서, 티로신으로부터 노스카핀의 생합성 경로를 예시한다.
도13은, 본 발명의 구현예에 따라서, 효모에서 노스카핀의 신생 생산의 LC-MS 분석으로부터 EIC (추출물 이온 크로마토그래프) 기록을 예시한다.
도14는, 본 발명의 구현예에 따라서, 효모에서 노스캐피노이드의 신생 생산의 예시적 생합성 도식을 예시한다.
도15는, 본 발명의 구현예에 따라서, 효모에서 노스캐피노이드의 신생 생산의 또 다른 예시적 생합성 도식을 예시한다.
도16은, 본 발명의 구현예에 따라서, 글루코오스의 4-HPA, 도파민, 및 3,4-DHPA로의 전환용 생합성 도식을 예시한다.
도17은, 본 발명의 구현예에 따라서, 노르코클라우린을 통해 L-티로신의 레티쿨린으로의 전환용 생합성 도식을 예시한다.
도18은, 본 발명의 구현예에 따라서, 노르라우다노솔린을 통해 L-티로신의 레티쿨린으로의 전환용 생합성 도식을 예시한다.
도19는, 본 발명의 구현예에 따라서, 테트라하이드로바이오프테린의 합성, 재순환, 및 구제 경로의 예를 예시한다.
도20은, 본 발명의 구현예에 따라서, L-티로신의 프로토베르베린, 프탈리드이소퀴놀린, 및 베르베린 알칼로이드 생성물로의 전환용 생합성 도식을 예시한다.
도21은, 본 발명의 구현예에 따라서, L-티로신의 노스카핀, 노스캐피노이드, 및 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물로의 전환용 생합성 도식을 예시한다.
도22는, 본 발명의 구현예에 따라서, L-티로신의 산구이나린 및 벤조펜안트리딘 알칼로이드로의 전환용 생합성 도식을 예시한다.
상세한 설명
본 개시내용은 조작된 숙주 세포에서 다양한 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 (바이어스), 예컨대 노스캐피노이드의 생산 방법을 제공한다. 본 개시내용은 조작된 숙주 세포에서 생산된 다양한 노스캐피노이드의 조성물을 추가로 제공한다.
노스캐피노이드는 인간 암의 치료용 화학치료제로서 관심있는 높은 수용해도를 갖는 미세소관-조절 항암제의 신흥 부류이다. 노스캐피노이드는 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드로서 특성화된 화합물을 포함하는 아편 알칼로이드의 부류이다. 향상된 종양 특이성 및 종양 퇴화, 및 정상 조직에 대한 거의 없는 또는 무 독성을 보여주는 수많은 노스캐피노이드가 합성되었다. 컴퓨터를 이용한 설계 및 구조-활성 관계 연구에 의해 도움을 받는, 노스캐피노이드의 스캐폴드 구조내 상이한 지점에서 연속적인 합성 변형에 기반하여, 노스캐피노이드는 변형에 기반된 상이한 “생성”으로 분류되었다. 노스카핀은 50년 넘는 동안 기침 억제제로서 전세계적으로 사용된 및 식물에서 자연적으로 만들어지는 노스캐피노이드 화합물이다. 노스카핀은 많은 노스캐피노이드 화합물이 유도된 모 화합물이다. 암을 치료하기 위한 노스카핀의 능력은 1998년에 입증되었다. 암 치료에 요구된 용량이 기침 억제제로서 작용하는 경우보다 훨씬 높아도 (암 치료에 대하여 1,000-2,250 mg/일 대. 기침 치료에 대하여 45-200 mg/일), 노스카핀의 부작용은 전통적 화학요법 약물보다 더 적다. 노스크페인은 1 노스카핀 분자 / 튜불린 이량체의 화학양론으로 튜불린에 결합한다. 그러나, 탈중합하는 (노코다졸, 콜히친, 및 빈카 알칼로이드) 또는 튜불린 (파클리탁셀)을 과 중합하는 다른 튜불린 결합 화학치료제와 달리, 노스카핀의 항암 활성은 세포자멸사를 일으키는 독특한 미세소관 결합 방식을 통해 미세소관의 그의 동력학 안정화로부터 유도될 수 있다. 약리적 관점으로부터, 노스카핀은 미세소관 결합 약물로서 많은 이점을 갖는다: 다중약물 내성 암 세포주에 대해 유효하고, 정상 분할 세포와 상이하게 암 세포에 영향을 미치고, 유의미한 부작용 없이 더 나은 약동학 프로파일을 갖는다.
본 발명의 측면이 더 상세히 기재되기 전에, 본 발명이, 그대로, 물론, 다양할 수 있지만, 비제한적으로 기재된 특정한 구현예인 것이 이해되어야 한다. 본 발명의 범위가 단지 첨부된 청구범위에 의해 제한될 것이기 때문에, 본원에서 사용된 용어가 단지 특정한 구현예의 기재 목적이고, 제한된 의도가 아님이 또한 이해 되어야 한다.
값의 범위가 제공된 경우, 맥락이 명확히 달리 지시하지 않는 한 하한의 단위의 열번째까지, 그 범위의 상한과 하한 및 그 언급된 범위에서 임의의 다른 언급된 또는 개입 값 사이에서, 각 개입 값이 본 발명 내에서 포함되는 것이 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 더 작은 범위에서 독립적으로 포함될 수 있고 본 발명 내에 또한 포함되고, 상기 언급된 범위에서 임의의 특이적으로 제외된 한계 처리된다. 언급된 범위가 한계의 한쪽 또는 양쪽을 포함하는 경우, 상기 포함된 한계의 한쪽 또는 양쪽을 배제한 범위가 본 발명에서 또한 포함된다.
특정 범위는 용어 "약"에 의해 선행되는 수치로 본원에서 나타난다. 용어 "약"은 선행하는 정확한 수치, 뿐만 아니라 용어가 선행하는 수에 근접하는 또는 가까운 수치에 대하여 문자적 지지를 제공하기 위해 본원에서 사용된다. 수치가 특이적으로 인용된 수치에 근접하는 또는 가까운지의 결정에서, 근접한 또는 가까운 비인용된 수치는, 나타내는 맥락에서, 특이적으로 인용된 수치의 실질적인 등가를 제공하는 수치일 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기재된 것과 유사한 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 또한 사용될 수 있어도, 대표적인 예시적인 방법 및 물질은 이제 기재된다.
용어 “경로 유도체”는 본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들면, 하나 이상의 치환체를 부가, 제거, 변형, 및/또는 추가로 치환함으로써, 적어도 하나의 구조적 차이만큼 상이한 모 또는 참조 화합물 (예를 들면, 본원에서 개시된 화합물)의 구조로부터 유도된 화학 구조를 갖는 화합물을 지칭한다. 구조적 차이는, 예를 들면, 고리화 또는 개환 전환을 통해 모 또는 참조 화합물의 코어를 변경할 수 있다. 예를 들어, 레티쿨린의 경로 유도체는 살루타리딘 및 테바인을 포함한다. 구조적 차이는 임의의 방법, 예를 들면, 유도된 화학적 변환, 효소 촉매작용, 및/또는 자발적인 반응에 의해 발생할 수 있다. 반대로 명확히 지시하지 않는 한, 비록 일부 경우에서, 유도체가 모 또는 참조 화합물로부터 합성될 수 있어도, 경로 유도체는 출발 물질 또는 중간체로서 모 또는 참조 화합물을 이용하여 합성될 필요는 없다.
용어 “유사체” 및 “유도체”는 본원에서 사용된 바와 같이 적어도 하나의 구조적 차이를 가짐으로써, 예를 들면, 모 또는 참조 화합물로부터 하나 이상의 치환체를 부가, 제거, 변형, 및/또는 추가로 치환함으로써, 모 또는 참조 화합물 (예를 들면, 본원에서 개시된 화합물)의 구조와 상이한 화학 구조를 갖는 화합물을 지칭한다. 구조적 차이는, 예를 들면, 고리화 또는 개환 전환을 통해 모 또는 참조 화합물의 코어를 변경할 수 있다. 예를 들어, N-메틸카나딘, 9-메틸-N-메틸카나딘, 및 6-클로로-카나딘은 카나딘의 유사체이다. 티로신의 유사체는, 예를 들어, α-클로로-티로신, α-메틸 티로신, 및 3-니트로-티로신을 포함한다. 구조적 차이는 임의의 방법, 예를 들면, 유도된 화학적 변환, 효소 촉매작용, 및/또는 자발적인 반응에 의해 발생할 수 있다. 반대로 명확히 지시되지 않는 한, 일부 경우에서, 유사체가 모 또는 참조 화합물로부터 합성될 수 있어도, 유사체는 출발 물질 또는 중간체로서 모 또는 참조 화합물을 이용하여 합성될 필요는 없다.
용어 “기능화된 유도체”는 본원에서 사용된 바와 같이 참조 화합물과 식별하는 구조적 특징을 갖는 화합물을 지칭하고, 여기에서 식별하는 특징은 화합물의 합성에서 사용된 출발 물질에 존재하였다. 예를 들어, 2개 화합물을 식별하는 클로라이드가 사용된 출발 물질의 특징이었고 합성에서 단계에 의해 도입되지 않았음에 따라, 3-클로로-레티쿨린은 α-클로로-l-티로신으로부터 생산될 수 있고 레티쿨린의 기능화된 유도체가 되도록 본원에서 고려된다. 추가 예는 6-하이드록시-카나딘, α-하이드록시-l-티로신으로부터 숙주 세포에 의해 생산될 수 있는 카나딘의 기능화된 유도체, 및 7-니트로-나르코톨린, 3-니트로-l-티로신으로부터 생산된 나르코톨린의 기능화된 유도체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 및 첨부된 청구범위에서, 단수 형태는 맥락이 명확히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 것이 주목된다. 청구범위가 임의의 선택적인 구성요소를 배제하도록 작성될 수 있다는 것이 추가로 주목된다. 이와 같이, 상기 서술은 청구항 구성요소의 설명, 또는 “부정적” 제한의 사용과 함께 “단독으로,” “단지” 등등과 같은 배타적인 용어의 사용을 위하여 선행된 기준으로서 작용하도록 의도된다.
본 개시내용의 판독시 당해 분야의 숙련가에 명백할 바와 같이, 본원에서 기재된 및 예시된 각각의 개별적인 구현예는 본 발명의 범위 또는 취지의 이탈 없이 임의의 다른 몇 개의 구현예의 특징에서 쉽게 분리될 수 있거나 또는 상기 특징과 조합될 수 있는 별개의 구성요소 및 특징을 갖는다. 임의의 인용된 방법은 인용된 사례의 순서 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
노스캐피노이드
노스캐피노이드 생성물을 생산하는 숙주 세포가 제공된다. 노스캐피노이드 생성물은 노스캐피노이드, 노스캐피노이드 전구체, 노스캐피노이드의 대사물질, 노스캐피노이드의 유사체, 노스캐피노이드의 중간체, 및/또는 노스캐피노이드 유도체를 포함한다. 일부 예에서, 숙주 세포의 조작된 균주 예컨대 본 발명의 조작된 균주는, 비제한적으로, 벤질이소퀴놀린 알칼로이드, 프로토베르베린, 세코베르빈, 프탈라이드이소퀴놀린, 및 다른 것을 포함하는 몇 개의 구조적 클래스를 거친 노스캐피노이드 생성물 및 이들의 변형의 생산용 플랫폼을 제공한다. 각각의 이들 클래스는 부류의 구성원으로 이어질 수 있는 조작된 숙주 세포 생합성 경로의 임의의 편리한 구성원의, 이들의 생합성 전구체, 중간체, 및 대사물질을 포함하는 의미이다. 화합물의 비-제한 예는 각각의 이들 구조적 클래스에 대하여 아래 주어진다. 일부 경우에서, 주어진 예의 구조는 벤질이소퀴놀린 알칼로이드로서 자체 특성화될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 본 화학 독립체는, 단일 거울상이성질체, 라세미 혼합물, 광학적으로 순수한 형태, 부분입체이성질체의 혼합물, 및 중간체 혼합물을 포함하여, 모든 가능한 이성질체를 포함하는 의미이다.
프로토베르베린은, 비제한적으로, 스코울레린, 체일란티폴린, 스틸로핀, 난디닌, 자트로르히진, 스테폴리딘, 디스크레타민, 시스-N-메틸스틸로핀, 테트라하이드로콜룸바민, 팔마틴, 테트라하이드로팔마틴, 콜룸바민, 카나딘, N-메틸카나딘, 1-하이드록시카나딘, 베르베린, N-메틸-오피오카르핀, 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘, 및 1-하이드록시-10-O-아세틸-N-메틸카나딘을 포함할 수 있다.
세코베르빈 은, 비제한적으로, 4'-O-데스메틸마크란트알데하이드, 4'-O-데스메틸파파베록신, 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신, 파파베록신, 및 3-O-아세테일파파베록신을 포함할 수 있다.
프탈라이드이소퀴놀린은, 비제한적으로, 나르코톨린헤미아세탈, 나르코틴헤미아세탈, 나르코톨린, 노스카핀, 아들루미딘, 아들루민, (+) 또는 (-)-바이쿠쿨린, 카프노이딘, 카를루민, 코를레딘, 코를루미딘, 데쿰베닌, 5'-O-데메틸나르코틴, (+) 또는 (-)-α 또는 β-히드라스틴, 및 하이퍼코우민을 포함할 수 있다.
노스캐피노이드는 노스카핀의 유도체 또는 유사체일 수 있고 그대로 또한 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드로서 특성화될 수 있다. 임의의 편리한 노스캐피노이드는 대상체 숙주 세포에서 생산을 위하여 표적화될 수 있다. 관심 노스카핀 유사체는, 비제한적으로, 6′, 9′, 1 및 7-위치에서 변형, 6′-위치에서 자연 발생 N-메틸기의, 예를 들면, N-에틸아미노카보닐로의 대체, 9′-위치에서, 예를 들면, 할로, 아릴, 알킬, 아지도, 또는 니트로로의 치환, 7-위치에서 유리 페놀을 드러내기 위한 위치선택적 O-데메틸화, 및 1-위치에서 락톤의 상응하는 사이클릭 에테르로의 환원을 포함하는 노스카핀 화합물; 예컨대 화합물 9-브로모노스카핀, 9-니트로노스카핀, 및 9-아지도노스카핀 및 Naik 등 에 의해 기재된 화합물,Journal of Molecular Modeling, 2012, 18(1):307-318, 및 Lopus and Naik, “Taking aim at a dynamic target:Noscapinoids as microtubule-targeted cancer therapeutics”, Pharmacological Reports, 67 (1) 2015, 56-62 (2014 온라인 공개됨) (그의 개시내용은 본원에서 전체적으로 참조로 편입됨).
용어 “노스캐피노이드 생성물”은 노스캐피노이드, 노스캐피노이드 전구체, 노스캐피노이드의 대사물질, 노스캐피노이드의 유사체, 노스캐피노이드의 중간체, 및/또는 노스캐피노이드 유도체를 포함하는 의미이다. 일부 예에서, 노스캐피노이드 유도체 및/또는 노스캐피노이드들의 유도체는 경로 유도체를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 노스캐피노이드 유도체 및/또는 노스캐피노이드들의 유도체는 기능화된 유도체를 포함할 수 있다. 예에서, 노스캐피노이드 생성물은, 비제한적으로, 하기를 포함하는, 세포의 합성 경로에서 관심 노스카핀 또는 노스캐피노이드에 대한 전구체일 수 있는 임의의 편리한 프로토베르베린, 세코베르베린, 또는 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드를 지칭할 수 있다: 1-하이드록시-N-메틸카나딘, 노스카핀, 나르코톨린, 나르코틴헤미아세탈, 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신, 나르코톨린헤미아세탈, N-메틸로피오카르핀, 1, 13-디하이드록시-N-메틸카나딘, 1-하이드록시-13-O아세틸-N-메틸카나딘, 나르코톨리노젠디알 (즉, 4'-O-데스메틸파파베록신), 나르코톨리날 (즉, 4'-O-데스메틸마크란트알데하이드), 및 1-하이드록시카나딘.일부 사례에서, 노스캐피노이드 생성물은 관심 합성 경로에서 카나딘으로부터 다운스트림, 또는 카나딘의 유사체이다.
일부 구현예에서, 세포는 노스카핀을 생산한다. 특정 사례에서, 세포는 노스카핀의 유도체를 생산한다. 일부 경우에서, 세포는 도 2A 및 2B에서 기재되는 노스카핀 전구체를 생산한다. 일부 사례에서, 세포는 1-하이드록시-N-메틸카나딘을 생산한다. 특정 구현예에서, 세포는 1-하이드록시카나딘을 생산한다. 일부 경우에서, 세포는 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘을 생산한다. 일부 사례에서, 세포는 N-메틸-오피오카르핀을 생산한다. 특정 경우에서, 세포는 4'-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신을 생산한다. 특정 구현예에서, 세포는 나르코톨리날 및 나르코톨리노젠디알을 생산한다.
노스캐피노이드 또는 이들의 전구체에 대한 합성 경로는 숙주 세포에서 생성될 수 있고, 임의의 편리한 출발 화합물(들) 또는 물질로 출발할 수 있다. 숙주 세포에서 생성된 합성 경로는 관심 노스캐피노이드의 전구체인 임의의 편리한 화합물로 출발할 수 있다. 대상체 숙주 세포의 합성 경로는 바람직한 출발 화합물로부터 표적 알칼로이드의 생산을 제공하기 위해 임의의 편리한 업스트림 또는 다운스트림 합성 경로에 연결될 수 있다. 출발 화합물은 표적으로부터 제거된 하나 이상의 생합성 단계 (예컨대 2 이상, 3 이상, 또는 몇 개의 제거된 생합성 단계)인 전구체일 수 있다. 일부 경우에서, 출발 화합물은 숙주 세포에 의해 자체 생산된다. 세포는 (S)-N-메틸카나딘, 1-하이드록시-N-메틸카나딘, 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘, 1-하이드록시-13-O아세틸-N-메틸카나딘, 4'-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신, 나르코톨린헤미아세탈, 및 나르코톨린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 노스카핀 전구체를 포함하는 합성 경로를 통해 카나딘으로부터 관심 노스카핀 또는 노스캐피노이드를 생산할 수 있다.
관심 출발 화합물을 생산하는 임의의 편리한 숙주 세포는 노스캐피노이드 또는 이들의 전구체를 생산하기 위해 대상체 세포에서 사용에 적응될 수 있다. 관심 출발 화합물은, 비제한적으로, 노르라우다노솔린, 카나딘, 스코울레린, 테트라하이드로베르베르루빈, 스틸로핀, 체일란티폴린, 테트라하이드로팔마틴, 및 내인성 노스캐피노이드 경로에서 존재할 수 있는 표적 분자의 임의의 다른 편리한 전구체를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 출발 화합물은 화합물을 관심 노스캐피노이드, 또는 이들의 전구체로 전환시키는 숙주 세포에 부가된다. 일부 구현예에서, 출발 화합물은 카나딘이다. 도.2A 및 2B는 (S)-카나딘으로부터 출발하는 노스카핀 및 이들의 전구체에 대한 합성 경로를 예시한다. 특정 구현예에서, 출발 화합물은 노르라우다노솔린이다. 도9는 노르라우다노솔린으로부터 출발하는 노스카핀 및 이들의 전구체에 대한 합성 경로를 예시한다. 특정 사례에서, 출발 화합물은 관심 노스캐피노이드, 또는 이들의 전구체의 생산을 제공하는 생합성 경로를 포함하도록 적응되는 노르라우다노솔린-생산 세포 또는 카나딘-생산 세포에 의해 생산될 수 있다. 특정 구현예에서, 출발 화합물은 티로신이다.
따라서, 출발 물질은 비-자연 발생일 수 있거나 또는 출발 물질은 자연 발생일 수 있다. 다른 화합물은, 숙주 세포에 존재하는 합성 경로에 기반하여, 원하는 합성 경로에서 출발 물질로서 또한 사용될 수 있다. 출발 물질의 공급원은 숙주 세포 자체, 예를 들면, 티로신 기원일 수 있거나, 또는 출발 물질은 외부 공급원으로부터 숙주 세포에 부가 또는 보강될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 액체 배양액 (생체내 환경)에서 성장하면, 세포 배지는, 세포에 수송되고 원하는 생성물로 전환되는, 출발 물질, 예를 들면, 티로신 또는 노르라우다노솔린으로 보강될 수 있다.
숙주 세포
상기 요약된 바와 같이, 본 발명의 하나의 측면은 노스캐피노이드 생성물을 생산하는 숙주 세포이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “노스캐피노이드-생산 세포”는 합성 경로를 통해 출발 화합물로부터 노스캐피노이드 생성물을 생산하기 위해 조작되는 세포를 포함하는 의미이다. 대상체 숙주 세포는, 비제한적으로, 1-하이드록시-N-메틸카나딘, N-메틸카나딘, 노스카핀, 나르코톨린, 나르코틴헤미아세탈, 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신, 나르코톨린헤미아세탈, N-메틸로피오카르핀, 1-하이드록시-13-O아세틸-N-메틸카나딘, 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘, 나르코톨리노젠디알, 3-O-아세틸-파파베록신, 나르코톨리날, 및 1-하이드록실카나딘을 포함하는, 임의의 편리한 노스캐피노이드 생성물을 생산할 수 있다.
임의의 편리한 세포는 대상체 숙주 세포 및 방법에서 이용될 수 있다. 일부 경우에서, 숙주 세포는 비-식물 세포이다. 일부 사례에서, 숙주 세포는 미생물 세포로서 특성화될 수 있다. 특정 경우에서, 숙주 세포는 곤충 세포, 포유동물 세포, 박테리아 세포, 또는 효모 세포이다. 숙주 세포의 임의의 편리한 유형은 대상체 노스캐피노이드-생산 세포를 생산하는 대상체 세포의 생산에서 이용될 수 있다, 참고, 예를 들면, 하기: US2008/0176754, WO/2012/039438, WO2013136057, US20140273109, 및 PCT 출원 시리즈 번호 US2014/063738 (2014년 11월 3일 출원), (그들의 개시내용은 전체적으로 참조로 편입됨).
관심 숙주 세포는, 비제한적으로, 박테리아 세포, 예컨대 바실러스 서브틸리스, 에스케리치아 콜라이 , 스트렙토마이세스 , 및 살모넬타이피무이움 세포, 곤충 세포 예컨대 드로소필라 멜라노가스테르 S2 및 스포도프테라 프루지페르다 Sf9 세포, 및 효모 세포 예컨대 사카로마이세스 세레비지애, 쉬조사카로마이세스 폼베, 및 피치아 패스토리스 세포를 포함한다. 일부 예에서, 숙주 세포는 효모 세포 또는 E. 콜리 세포이다. 일부 경우에서, 숙주 세포는 효모 세포이다. 일부 사례에서, 숙주 세포는 생산하도록 조작된 효모의 균주 기원이다. 특정 사례에서, 효모 세포는 산업적 공정에서 용도를 찾는 것, 예컨대, 비제한적으로, P. 파리노세 , P. 아노말라 , P. 히이디이 , P. 구일리에르몬디 , P. 클루이베리 , P. 멤브라니파시엔스 , P. 노르베겐시스 , P. 오메리 , P. 패스토리스 , 피치아 메탄올리카 , 및 P. 서브펠리쿨로사를 포함하여, 제우스 피치아로부터 효모 세포이다.
US2008/0176754, WO/2012/039438, WO2013136057, US20140273109, 및 Smolke 등 에 의해 PCT 출원 시리즈 번호 US2014/063738에서 기재된 임의의 숙주 세포는 대상체 세포 및 방법에서 사용에 적응될 수 있다. 특정 구현예에서, 효모 세포는 종 사카로마이세스 세레비지애 (S. 세레비지애)일 수 있다. 특정 구현예에서, 효모 세포는 종 쉬조사카로마이세스 폼베일 수 있다. 특정 구현예에서, 효모 세포는 종 피치아 패스토리스일 수 있다. 사이토크롬 P450 단백질이 그의 활성이 유지되도록 내형질 망 막에서 적절히 접을 수 있기 때문에 효모는 숙주 세포로서 관심이다. 예에서, 사이토크롬 P450 단백질은 관심 일부 생합성 경로에 관여된다. 추가의 예에서, 사이토크롬 P450 단백질은 노스캐피노이드 생성물의 생산에 관여된다.
본 발명에서 용도를 찾은 관심 효모 균주는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: CEN.PK (유전자형:MATa/α ura3 -52/ ura3 -52 trp1 -289/ trp1 -289 leu2 -3_112/leu2-3_112 his3 Δ1 / his3 Δ1 MAL2 -8C/ MAL2 -8C SUC2 / SUC2), S288C, W303, D273-10B, X2180, A364A, ∑1278B, AB972, SK1, 및 FL100.특정 경우에서, 효모 균주는 임의의 S288C (MATα; SUC2 mal mel gal2 CUP1 flo1 flo8-1 hap1), BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0), BY4742 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; lys2Δ0; ura3Δ0), BY4743 (MATa/MATα; his3Δ1/his3Δ1; leu2Δ0/leu2Δ0; met15Δ0/MET15; LYS2/lys2Δ0; ura3Δ0/ura3Δ0), 및 WAT11 또는 W(R), 아라비돕시스 탈리아나 NADPH-P450 환원효소 ATR1 및 효모 NADPH-P450 환원효소 CPR1, 각각을 발현시키는 W303-B 균주 (MATa; ade2-1; his3-11, -15; leu2-3,-112; ura3-1; canR; cyr+)의 유도체이다. 또 다른 구현예에서, 효모 세포는 W303alpha (MATα; his3-11,15 trp1-1 leu2-3 ura3-1 ade2-1)이다. 추가의 관심 효모 균주의 동일성 및 유전자형은 EUROSCARF (weB. uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/col_index.html)에서 찾아질 수 있다.
숙주 세포에 대한 유전적 변형
숙주 세포는 노스캐피노이드 생성물의 생산을 제공하는 하나 이상의 변형 (예컨대 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 또는 심지어 초과 변형)을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 경우에서, 변형은 유전적 변형, 예컨대 유전자 또는 이들의 단편의 돌연변이, 부가, 또는 결실, 또는 유전자 또는 이들의 단편의 전사 조절이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "돌연변이"는 참조 서열 또는 모티프에 비하여 아미노산(들) 잔기 또는 뉴클레오타이드(들) 잔기의 결실, 삽입, 또는 치환을 지칭한다. 돌연변이는 최초 유전자좌에서 고유 유전자에 유도된 돌연변이로서 편입될 수 있다. 일부 경우에서, 돌연변이는 분리된 유전자좌에서 유전적 통합으로서 도입된 유전자의 추가의 복사본으로서, 또는 에피솜 벡터 예컨대 2μ 또는 동원체 플라스미드상의 추가의 복사본으로서 편입될 수 있다. 특정 사례에서, 효소의 기질 저해된 복사본은 고유 세포 전사 조절하에 있다. 일부 사례에서, 효소의 기질 저해된 복사본은 합성 프로모터의 관리하에 배치시킴으로써 단백질 발현의 조작된 구성적 또는 동적 조절로 도입된다. 일부 예에서, 하나 이상의 변형의 목적은 고유 유전자일 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 변형의 목적은 비-고유 유전자일 수 있다. 일부 예에서, 비-고유 유전자는 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 추가 예에서, 비-고유 유전자는 숙주 세포에 삽입됨에 앞서 하나 이상의 변형에 의해 변경될 수 있다.
조작된 숙주 세포는 하나 이상의 노스캐피노이드 생성물을 과잉생산할 수 있다. 과잉생산하다 라는 것은 세포가 대조 세포 (예를 들면, 비변형된 세포)에 비하여 노스캐피노이드 생성물의 개선된 또는 증가된 생산을 갖는 것을 의미한다. 개선된 또는 증가된 생산은 대조군이 노스캐피노이드 생성물 생산을 갖지 않는 노스캐피노이드 생성물의 일부 양의 생산, 뿐만 아니라 대조군이 일부 노스캐피노이드 생성물 생산을 갖는 상황에서 약 10% 이상, 예컨대 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 80% 이상, 약 100% 이상, 예컨대 2-배 이상, 예컨대 10-배 이상을 포함하여, 5-배 이상의 증가 모두를 의미한다.
일부 경우에서, 하나 이상의 (예컨대 2 이상, 3 이상, 또는 4 이상) 변형은 하기로부터 선택될 수 있다: 생합성 효소 유전자에서 기질 억제 완화 돌연변이; 생합성 효소 유전자에서 생성물 억제 완화 돌연변이; 보조인자 회수 촉진 기전; 생합성 효소 유전자에서 피드백 억제 완화 돌연변이; 및 생합성 효소 유전자의 전사 조절 변형; 효소 유전자에서 불활성화 돌연변이.
기질 억제 완화 돌연변이
일부 사례에서, 조작된 숙주 세포는 세포의 하나 이상의 생합성 효소 유전자에서 하나 이상의 기질 억제 완화 돌연변이 (예컨대 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 또는 심지어 초과)를 포함하는 세포이다. 일부 예에서, 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 세포에 고유하다 (예를 들면, 비변형된 세포에 존재한다).일부 예에서, 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 세포에 비-고유하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “기질 억제 완화 돌연변이”는 세포의 기질 억제 제어 기전을 완화하는 돌연변이를 지칭한다.
기질 억제를 완화하는 돌연변이는 대조 세포에 비하여 관심 세포에서 조절된 효소의 억제를 감소시키고 조절된 화합물 또는 이들의 다운스트림 생합성 생성물의 증가된 수준을 제공한다. 일부 경우에서, 조절된 효소의 억제 완화는 억제의 IC50이 2-배 이상만큼, 예컨대 3-배 이상, 5-배 이상, 10-배 이상, 30-배 이상, 100-배 이상, 300-배 이상, 1000-배 이상, 또는 심지어 초과만큼 증가되는 것을 의미한다. 증가된 수준은 대조 세포내 조절된 화합물 또는 이들의 다운스트림 생성물의 것의 110% 이상, 예컨대 120% 이상, 130% 이상, 140% 이상, 150% 이상, 160% 이상, 170% 이상, 180% 이상, 190% 이상, 또는 200% 이상, 예컨대 조작된 숙주 세포내 조절된 화합물 또는 이들의 다운스트림 생성물의 적어도 3-배 이상, 적어도 5-배 이상, 적어도 10-배 이상 또는 심지어 초과인 수준을 의미한다.
노스카핀 생성물의 수준의 조절에 관련한 조작된 숙주 세포내 생합성 효소 및 다양한 기질 억제 제어 기전은 기질 억제 완화에 대하여 포적화될 수 있다. 조작된 숙주 세포는 하나 이상의 생합성 효소 유전자에서 하나 이상의 기질 억제 완화 돌연변이를 포함할 수 있다. 하나 이상의 돌연변이는 생합성 효소가 조절 제어 처리되는 임의의 편리한 생합성 효소 유전자에서 위치될 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 숙주 세포는 하나 이상의 생합성 효소 유전자 예컨대 표 1에서 기재된 유전자에서 하나 이상의 기질 억제 완화 돌연변이를 포함할 수 있다.
돌연변이의 임의의 편리한 수치 및 유형은 기질 억제 제어 기전을 완화하도록 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조작된 숙주 세포는 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 또는 심지어 15 이상 기질 억제 완화 돌연변이, 예컨대 조작된 숙주 세포내의 하나 이상의 생합성 효소 유전자에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 기질 억제 완화 돌연변이를 포함할 수 있다.
보조인자 회수 촉진 기전
일부 사례에서, 조작된 숙주 세포는 세포의 하나 이상의 생합성 효소 유전자에서 하나 이상의 보조인자 회수 촉진 기전 (예컨대 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 또는 심지어 초과)를 포함하는 세포이다. 일부 예에서, 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 세포에 고유하다 (예를 들면, 비변형된 세포에 존재한다).일부 예에서, 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 세포에 비-고유하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “보조인자 회수 촉진 기전”은 세포의 보조인자 회수 제어 기전을 촉진시키는 기전을 지칭한다. 일부 예에서, 회수용 하나 이상의 관심 보조인자는 비제한적으로 S-아데노실 메티오닌, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 포스페이트, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드, 테트라하이드로바이오프테린, 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드를 포함한다.
노스캐피노이드 생성물의 수준의 조절에 관련하는 조작된 숙주 세포에서 생합성 효소 및 다양한 보조인자 회수 제어 기전은 보조인자 회수 촉진에 대하여 표적화될 수 있다. 조작된 숙주 세포는 하나 이상의 생합성 효소 유전자에서 하나 이상의 보조인자 회수 촉진 기전을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 하나 이상의 생합성 효소 유전자 예컨대 표 1에서 기재된 유전자에서 하나 이상의 보조인자 회수 촉진 기전을 포함할 수 있다.
기전의 임의의 편리한 수치 및 유형은 보조인자 회수 제어 기전을 촉진시키도록 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조작된 숙주 세포는 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 또는 심지어 15 이상 보조인자 회수 촉진 기전 예컨대 조작된 숙주 세포내의 하나 이상의 생합성 효소 유전자에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 보조인자 회수 촉진 기전을 포함할 수 있다.
생성물 억제 완화 돌연변이
일부 사례에서, 조작된 숙주 세포는 세포의 하나 이상의 생합성 효소 유전자에서 하나 이상의 생성물 억제 완화 돌연변이 (예컨대 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 또는 심지어 초과)를 포함하는 세포이다. 일부 예에서, 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 세포에 고유하다 (예를 들면, 비변형된 세포에 존재한다).일부 예에서, 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 세포에 비-고유하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “생성물 억제 완화 돌연변이”는 조작된 숙주 세포의 단기 및/또는 장기간 생성물 억제 제어 기전을 완화하는 돌연변이를 지칭한다. 단기 생성물 억제는 보조기질 결합 부위에서 경쟁적 결합이 있는 세포의 제어 기전이다. 장기간 생성물 억제는 원하는 경로에서 떨어져서 화합물의 비가역적 결합이 있는 세포의 제어 기전이다.
생성물 억제를 완화하는 돌연변이는 대조 세포에 비하여 관심 세포에서 조절된 효소의 억제를 감소시키고 조절된 화합물 또는 이들의 다운스트림 생합성 생성물의 증가된 수준을 제공한다. 일부 경우에서, 조절된 효소의 억제 완화는 억제의 IC50이 2-배 이상만큼, 예컨대 3-배 이상, 5-배 이상, 10-배 이상, 30-배 이상, 100-배 이상, 300-배 이상, 1000-배 이상, 또는 심지어 초과만큼 증가되는 것을 의미한다. 증가된 수준은 대조 세포내 조절된 화합물 또는 이들의 다운스트림 생성물의 것의 110% 이상, 예컨대 120% 이상, 130% 이상, 140% 이상, 150% 이상, 160% 이상, 170% 이상, 180% 이상, 190% 이상, 또는 200% 이상, 예컨대 조작된 숙주 세포내 조절된 화합물 또는 이들의 다운스트림 생성물의 적어도 3-배 이상, 적어도 5-배 이상, 적어도 10-배 이상 또는 심지어 초과인 수준을 의미한다.
노스캐피노이드 생성물의 수준의 조절에 관련되는 조작된 숙주 세포에서 생합성 효소 및 다양한 생성물 억제 제어 기전은 생성물 억제 완화에 대하여 표적화될 수 있다. 조작된 숙주 세포는 하나 이상의 생합성 효소 유전자에서 하나 이상의 생성물 억제 완화 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이는 생합성 효소가 조절 제어 처리되는 임의의 편리한 생합성 효소 유전자에서 위치될 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 숙주 세포는 하나 이상의 생합성 효소 유전자 예컨대표 1에 기재된 유전자 중 하나에서 하나 이상의 생성물 억제 완화 돌연변이를 포함한다.
돌연변이의 임의의 편리한 수치 및 유형은 생성물 억제 제어 기전을 완화하도록 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조작된 숙주 세포는 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 또는 심지어 15 이상 생성물 억제 완화 돌연변이, 예컨대 조작된 숙주 세포내의 하나 이상의 생합성 효소 유전자에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 생성물 억제 완화 돌연변이를 포함할 수 있다.
피드백 억제 완화 돌연변이
일부 사례에서, 조작된 숙주 세포는 세포의 하나 이상의 생합성 효소 유전자에서 하나 이상의 피드백 억제 완화 돌연변이 (예컨대 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 또는 심지어 초과)를 포함하는 세포이다. 일부 경우에서, 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 세포에 고유하다 (예를 들면, 비변형된 세포에 존재한다). 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 예에서 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 세포에 비-고유하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “피드백 억제 완화 돌연변이”는 조작된 숙주 세포의 피드백 억제 제어 기전을 완화하는 돌연변이를 지칭한다. 피드백 억제는 화합물이 특정 수준까지 축적하는 경우 조절된 화합물의 합성 경로에서 효소가 저해되는 세포의 제어 기전이고, 그렇게 함으로써 세포에서 화합물의 양을 균형맞춘다. 피드백 억제를 완화하는 돌연변이는 대조 세포에 비하여 조작된 숙주 세포에서 조절된 효소의 억제를 감소시킨다. 이런 식으로, 조작된 숙주 세포는 조절된 화합물 또는 이들의 다운스트림 생합성 생성물의 증가된 수준을 제공한다. 일부 경우에서, 조절된 효소의 억제 완화는 억제의 IC50이 2-배 이상만큼, 예컨대 3-배 이상, 5-배 이상, 10-배 이상, 30-배 이상, 100-배 이상, 300-배 이상, 1000-배 이상, 또는 심지어 초과만큼 증가되는 것을 의미한다. 증가된 수준은 대조 세포내 조절된 화합물 또는 이들의 다운스트림 생성물의 것의 110% 이상, 예컨대 120% 이상, 130% 이상, 140% 이상, 150% 이상, 160% 이상, 170% 이상, 180% 이상, 190% 이상, 또는 200% 이상, 예컨대 숙주 세포내 조절된 화합물 또는 이들의 다운스트림 생성물의 적어도 3-배 이상, 적어도 5-배 이상, 적어도 10-배 이상 또는 심지어 초과인 수준을 의미한다.
관심 바이어스의 수준 조절에 관련되는 생합성 효소 및 다양한 피드백 억제 제어 기전은 숙주 세포에서 완화를 위하여 표??화될 수 있다. 숙주 세포는 세포에 고유한 하나 이상의 생합성 효소 유전자에서 하나 이상의 피드백 억제 완화 돌연변이를 포함할 수 있다. 하나 이상의 돌연변이는 생합성 효소가 조절 제어 처리되는 임의의 편리한 생합성 효소 유전자에서 위치될 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 숙주 세포는 하나 이상의 생합성 효소 유전자 예컨대표 1에 기재된 유전자의 하나에서 하나 이상의 피드백 억제 완화 돌연변이를 포함할 수 있다.
돌연변이의 임의의 편리한 수치 및 유형은 피드백 억제 제어 기전을 완화하도록 이용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "돌연변이"는 참조 서열 또는 모티프에 비하여 아미노산(들) 잔기 또는 뉴클레오타이드(들) 잔기의 결실, 삽입, 또는 치환을 지칭한다. 돌연변이는 최초 유전자좌에서 고유 유전자에 유도된 돌연변이로서 편입될 수 있다. 일부 경우에서, 돌연변이는 분리된 유전자좌에서 유전적 통합으로서 도입된 유전자의 추가의 복사본으로서, 또는 에피솜 벡터 예컨대 2μ 또는 동원체 플라스미드상의 추가의 복사본으로서 편입될 수 있다. 특정 사례에서, 효소 피드백 저해된 복사본은 고유 세포 전사 조절하에 있다. 일부 사례에서, 효소의 피드백 저해된 복사본은 합성 프로모터의 제어하에 배치시킴으로써 단백질 발현의 조작된 구성적 또는 동적 조절로 도입된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조작된 숙주 세포는 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 또는 심지어 15 이상 피드백 억제 완화 돌연변이, 예컨대 조작된 숙주 세포내의 하나 이상의 생합성 효소 유전자에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 피드백 억제 완화 돌연변이를 포함할 수 있다.
전사 조절 변형
숙주 세포는 세포의 하나 이상의 생합성 효소 유전자의 하나 이상의 전사 조절 변형 (예컨대 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 또는 심지어 초과 변형)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 세포에 고유하다. 일부 예에서, 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 세포에 비-고유하다. 세포의 임의의 편리한 생합성 효소 유전자는 전사 조절에 대하여 표적화될 수 있다. 전사 조절은 변형된 세포에서 관심 유전자의 발현이 대조 세포 (예를 들면, 비변형된 세포)에 비하여 조절, 예를 들면, 증가 또는 감소, 향상 또는 재생되는 것을 의미한다. 일부 경우에서, 관심 유전자의 전사 조절은 발현의 증가 또는 향상을 포함한다. 발현의 증가 또는 향상은 관심 유전자의 발현 수준이 대조군, 즉 (예를 들면, 임의의 편리한 유전자 발현 검정을 이용함으로써) 변형되지 않은 동일한 세포에서 발현과 비교된 경우 2-배 이상, 예컨대 5-배 이상 및 때때로 25-, 50-, 또는 100-배 이상 및 특정 구현예에서 300-배 이상 또는 초과 만큼 증가되는 것을 의미한다. 대안적으로, 세포내 관심 유전자의 발현이 검출불가능한 정도까지 낮은 사례에서, 발현이 쉽게 검출가능한 수준까지 증가되면 관심 유전자의 발현 수준은 증가되는 것으로 고려된다. 특정 사례에서, 관심 유전자의 전사 조절은 발현의 감소 또는 억압을 포함한다. 발현의 감소 또는 억압은 관심 유전자의 발현 수준이 대조군과 비교된 경우 2-배 이상, 예컨대 5-배 이상 및 때때로 25-, 50-, 또는 100-배 이상 및 특정 구현예에서 300-배 이상 또는 초과만큼 감소되는 것을 의미한다. 일부 경우에서, 발현은 검출불가능한 수준까지 감소된다. 대상체 숙주 세포에서 사용을 위하여 적응될 수 있는 관심 숙주 세포의 변형은 하기에 기재된다: 미국공개 번호 .20140273109 (14/211,611) (Smolke 등 저, 그의 개시내용은 전체적으로 참조로 본원에서 편입된다).
일부 구현예에서, 전사 조절 변형은 강한 프로모터의 하나 이상의 생합성 효소 유전자의 고유 프로모터로의 치환 또는 강한 프로모터의 제어하에 유전자 또는 유전자들의 추가의 복사본(들)의 발현을 포함할 수 있다. 관심 유전자의 발현을 구동하는 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있고, 단, 프로모터는 숙주 세포에서 활성일 수 있다. 관심 유전자는 그의 고유 프로모터로부터 발현될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 관심 유전자는 비-고유 프로모터로부터 발현될 수 있다. 요건이 아니어도, 상기 프로모터는 이들이 사용되는 숙주에서 중간 내지 고 강도일 수 있다. 프로모터는 조절될 수 있거나 또는 구성적일 수 있다. 일부 구현예에서, 배양 배지에서 글루코오스의 존재하에 단지 부드럽게 재생되거나, 또는 글루코오스 재생되지 않는 프로모터는 사용될 수 있다. 수많은 적합한 프로모터가 있고, 이들의 예는 하기를 포함한다: 당분해 유전자의 프로모터 예컨대 (푸룩토오스 바이포스페이트 알돌라아제를 인코딩한) B. 서브틸리스 tsr 유전자의 프로모터 또는 (글리세르알데하이드-포스페이트 탈수소효소에 대하여 코딩한) 효모 S. 세레비지애 로부터 GAPDH 프로모터 (Bitter G.A., Meth . Enzymol .152:673 684 (1987)). 다른 강한 관심 프로모터는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 빵 효모의 ADHI 프로모터 (Ruohonen L., 등, J. Biotechnol .39:193 203 (1995)), 포스페이트-기아 유도된 프로모터 예컨대 효모의 PHO5 프로모터 (Hinnen, A., 등, in Yeast Genetic Engineering, Barr, P.J., 등 eds, Butterworths (1989), B. 리케니포르미스 로부터 알칼리성 포스파타제 프로모터 (Lee.J.W.K., 등 ,J .Gen.Microbiol.137:1127 1133 (1991)), GPD1, 및 TEF1.관심 효모 프로모터는, 비제한적으로, 유도성 프로모터 예컨대 Gal1-10, Gal1, GalL, GalS, 억제성 프로모터 Met25, tetO, 및 구성적 프로모터 예컨대 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소 프로모터 (GPD), 알코올 탈수소효소 프로모터 (ADH), 번역-연신 인자-1-알파 프로모터 (TEF), 사이토크롬 c-옥시다제 프로모터 (CYC1), MRP7 프로모터, 등을 포함한다. 일부 사례에서, 강한 프로모터는 GPD1이다. 특정 사례에서, 강한 프로모터는 TEF1이다. 호르몬 예컨대 글루코코르티코이드, 스테로이드, 및 갑상선 호르몬에 의한 유도성인 프로모터를 함유한 자율적으로 복제 효모 발현 벡터는 또한 공지되고, 비제한적으로, 글루코르티코이드 반응 요소 (GRE) 및 갑상선 호르몬 반응 요소 (TRE)를 포함한다, 참고 예를 들면, 하기에 기재된 프로모터: 미국특허번호 7,045,290. 구성적 또는 유도성 프로모터 예컨대 알파 인자, 알코올 옥시다제, 및 PGH를 함유한 벡터가 사용될 수 있다. 추가적으로 임의의 프로모터/인핸서 조합은 (진핵 프로모터 데이터 베이스 EPDB에 따라) 관심 유전자의 발현을 구동하도록 또한 사용될 수 있다. 숙주 세포에 특이적인 임의의 편리한 프로모터, 예를 들면, 하기가 선택될 수 있음이 이해된다: E. 콜리.일부 경우에서, 프로모터 선택은 전사, 및 그러므로, 에너지 자원을 최소화하면서 생산을 최대화하기 위한 효소 수준을 최적화하도록 사용될 수 있다.
불활성화 돌연변이
조작된 숙주 세포는 세포의 효소에 하나 이상의 불활성화 돌연변이 (예컨대 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 또는 심지어 초과)를 포함할 수 있다. 하나 이상의 불활성화 돌연변이의 봉입체는 관심 BIA 또는 동일한 것을 초래하는 바람직한 효소 또는 전구체의 수준을 증가시키기 위해 조작된 숙주 세포의 합성 경로의 플럭스를 변형시킬 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 불활성화 돌연변이는 세포에 고유한 효소에 대한 것이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 하나 이상의 불활성화 돌연변이는 세포에 비-고유한 효소에 대한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, “불활성화 돌연변이”는 세포의 유전자 또는 조절 DNA 서열에 대한 하나 이상의 돌연변이를 의미하고, 여기에서 돌연변이(들)은 그 관심 유전자에 의해 발현된 단백질의 생물학적 활성을 불활성화시킨다. 일부 경우에서, 유전자는 세포에 고유하다. 일부 사례에서, 유전자는 불활성화되는 및 숙주 세포에 의해 생산된 관심 BIA의 합성 경로에 연결되거나 또는 이의 일부인 효소를 인코딩한다. 일부 사례에서, 불활성화 돌연변이는 관심 유전자를 제어하는 조절 DNA 서열에 위치된다. 특정 경우에서, 불활성화 돌연변이는 유전자의 프로모터에 대한 것이다. 임의의 편리한 돌연변이는 (예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이) 관심 유전자 또는 조절 DNA 서열을 불활성화하도록 이용될 수 있다. “불활성화된” 또는 “불활성화하다”는 돌연변이된 유전자에 의해 발현된 단백질의 생물학적 활성이 비-돌연변이된 대조군 유전자에 의해 발현된 대조군 단백질에 비하여 10% 이상, 예컨대 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 99% 이상만큼 감소되는 것을 의미한다. 일부 경우에서, 단백질은 효소이고 불활성화 돌연변이는 효소의 활성을 감소시킨다.
일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 세포에 고유한 효소에서 불활성화 돌연변이를 포함한다. 임의의 편리한 효소는 불활성화를 위하여 표적화될 수 있다. 관심 효소는 조작된 숙주 세포의 합성 경로에서의 작용이 노스캐피노이드 생성물의 수준을 감소시키는 경향이 있는 표 1에서 기재된 효소를 비제한적으로 포함할 수 있다.
이종 코딩 서열
일부 사례에서, 조작된 숙주 세포는, 예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이, 조작된 숙주 세포가 원하는 노스캐피노이드 생성물을 생산하게 만드는 활성(들)을 인코딩하는 하나 이상의 이종 코딩 서열 (예컨대 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상)을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이종 코딩 서열"은 펩타이드 또는 단백질 또는 그의 등가 아미노산 서열, 예를 들면, 숙주 유기체에서 정상적으로 존재하지 않고 적절한 조건하에 숙주 세포에서 발현될 수 있는 효소에 대하여 코딩하는, 또는 궁극적으로 효소에 대하여 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 지시하도록 사용된다. 이와 같이, "이종 코딩 서열"은 숙주 세포에서 정상적으로 존재하는 코딩 서열의 다중 복사본을 지시하고, 이로써 세포는 세포에서 정상적으로 존재하지 않는 코딩 서열의 추가의 복사본을 발현하고 있다. 이종 코딩 서열은 RNA 또는 이들의 임의의 유형, 예를 들면, mRNA, DNA 또는 이들의 임의의 유형, 예를 들면, cDNA, 또는 RNA/DNA 의 하이브리드일 수 있다. 관심 코딩 서열은, 비제한적으로, 코딩 서열로서 상기 특징을 포함하는 전장 전사 단위, 인트론, 프로모터 영역, 3'-UTRs, 및 인핸서 영역을 포함한다.
조작된 숙주 세포는 이종 코딩 서열을 축적하기 위해 하나 이상의 유전적 변이를 보유하도록 또한 변형될 수 있다. 고유 숙주 게놈의 변경은 원하는 경로를 방해할 수 있는 특이적 단백질의 발현을 감소 또는 제거하기 위한 게놈의 변형을 비제한적으로 포함한다. 상기 고유 단백질의 존재는 경로의 중간체 또는 최종 생성물 중 하나를 원하는 경로에서 사용가능하지 않은 다른 화합물 또는 대사물질로 빠르게 전환시킬 수 있다. 따라서, 고유 효소의 활성이 감소되었거나 또는 전적으로 부재이었으면, 생산된 중간체는 원하는 생성물로 편입에 더욱 쉽게 이용가능할 것이다. 일부 사례에서, 비제한적으로, ATP-결합카세트 (ABC) 수송체, 다중약물 내성 (MDR) 펌프, 및 관련된 전사 인자를 포함한, 다면발현성 약물 반응에서 관여된 단백질처럼, 단백질의 발현 제거가 관심일 수 있는 경우.
숙주 세포는 바람직한 활성 또는 특성을 제공하는 다양한 식물 단백질을 포함하도록 변형될 수 있다. 관심 노스캐피노이드 또는 이들의 전구체의 합성에 관련된 임의의 편리한 식물 단백질은 조작된 숙주 세포, 예컨대 효소, 샤페론, 보조인자, 등등에서 이용될 수 있다. 일부 경우에서, 숙주 세포는 식물 샤페론 단백질을 포함한다식물 샤페론은 숙주 세포에서 관심 효소의 작용을 용이하게 하고, 그렇게 함으로써 관심 노스캐피노이드 또는 이들의 전구체의 개선된 생산을 제공한다. 관심 식물 샤페론은, 비제한적으로, 결합 면역글로불린 단백질 (BiP), DnaJ 단백질, 글루코오스 조절된 단백질 (GRP) 94, 결합 단백질 (BiP), 단백질 디설파이드 이소머라제 (PDI), 사이클로필린, 및 칼넥신을 포함한다.
이종 코딩 서열은 비제한적으로 야생형 또는 등가 서열인 효소를 인코딩하는, 식물내 노스캐피노이드 생성물의 생산을 정상적으로 책임지는 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 이종 서열이 코딩하는 효소가 1-BIA 경로에서 임의의 효소일 수 있고, 임의의 편리한 공급원 출처일 수 있다. 특정한 합성 경로용 이종 코딩 서열에 의해 인코딩된 효소의 선택 및 수치는 원하는 생성물에 기반하여 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 또는 심지어 15 이상 이종 코딩 서열, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 이종 코딩 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이종 코딩 서열"은 또한 펩타이드 또는 효소의 코딩부, 즉, 펩타이드 또는 효소의 cDNA 또는 mRNA 서열, 뿐만 아니라 전장 전사 단위, 즉, 인트론 및 엑손을 포함한 유전자의 코딩부, 뿐만 아니라 "코돈 최적화된" 서열, 절단된 서열 또는 효소에 대하여 코딩하는 또는 그의 등가 아미노산 서열에 대하여 코딩하는 다른 형태의 변경된 서열을 포함하고, 단, 등가 아미노산 서열은 기능성 단백질을 생산한다. 상기 등가 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산의 결실을 가질 수 있고, 결실은 N-말단, C-말단, 또는 내부이다. 절단된 형태는 이들이 본원에서 지시된 촉매적 능력을 갖는 한 구상된다. 2 이상 효소의 융합은 경로에서 대사물질의 이동을 용이하게 하도록 또한 구상되고, 단, 촉매적 활성은 유지된다.
작동가능한 단편, 돌연변이체, 또는 절단된 형태는 모델링 및/또는 스크리닝에 의해 확인될 수 있다. 일부 경우에서, 이는, 예를 들어, 단계적인 방식으로 단백질의 N-말단, C-말단, 또는 내부 영역의 결실, 그 다음 최초 서열과 비교된 원하는 반응용 그의 활성에 관한 수득한 유도체의 분석에 의해 달성된다. 문제의 유도체가 상기 수용력으로 작동하면, 적절한 효소의 등가 유도체를 구성하는 것이 고려된다. 임의의 편리한 관심 효소는 조작된 숙주 세포에서 바람직한 생물학적 활성을 제공하도록 돌연변이 또는 조작될 수 있다. 일부 경우에서, 돌연변이체 효소는 효소의 정확한 접힘을 용이하게 하도록 조작된다. 특정 사례에서, 돌연변이체 효소는 비-돌연변이된 효소에 비하여 효소의 바람직한 활성 또는 특성을 증가시키도록 조작된다. 특정 사례에서, 돌연변이체 효소는 비-돌연변이된 효소에 비하여 효소의 바람직하지 않은 활성 또는 특성을 감소시키도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 돌연변이체 효소를 인코딩하는 하나 이상의 이종 코딩 서열을 포함한다. 일부 사례에서, 돌연변이체 효소는 CYP82Y1 N-말단 돌연변이체이다. CYP82Y1의 N-말단은 효소의 정확한 접힘을 용이하게 하도록 조작될 수 있다. 도6 은 다양한 CYP82Y1 효소 돌연변이체를 이용하여 노스캐피노이드 전구체 생산의 증가를 예시한다. 일부 경우에서, 제1 효소의 활성은 제2 효소의 것과 N-말단 태그의 맞바꾸기를 통해 개선된다.
본 발명의 측면은 또한 다양한 효소에 대하여 고유 아미노산 서열에 등가인 아미노산 서열에 대하여 코딩하는 이종 코딩 서열에 관련한다. “등가”인 아미노산 서열은, 특이적 아미노산 서열에 동일하지 않은, 그러나 원하는 목적에 사용될 때, 특이적 아미노산 서열의 유사한 활성과 비교된 경우 단백질의 생물학적 활성에 본질적으로 영향을 미치지 않는 적어도 일부 아미노산 변화 (결실, 치환, 역전, 삽입, 등)을 함유하는 아미노산 서열로서 정의된다. 등가 서열은 또한 최초 아미노산 서열과 상이한 특성을 갖기 위해 조작된 및/또는 방출된 것을 포함하는 의미이다. 변경가능한 관심 특성은 촉매적 활성, 기질 특이성, 선택성, 안정성, 용해도, 국재화, 등을 포함한다. 특정 구현예에서, "등가" 아미노산 서열은 특이적 아미노산 서열에 대한 아미노산 수준에서 적어도 80%-99% 동일성, 일부 경우에서 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 및 초과 특정 경우에서, 아미노산 수준에서 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99% 동일성을 함유한다. 일부 경우에서, 아미노산 서열은 동일할 수 있지만 그러나 DNA 서열은 예를 들어 숙주 유기체에 대하여 코돈 용법을 최적화하도록 예컨대 변경된다.
일부 사례에서, 효소의 각 유형의 발현은, 노스캐피노이드 생성물의 중간체 축적 및/또는 생산을 증가시키는, 추가의 유전자 복사본 (즉, 다중 복사본)을 통해 증가된다. 본 발명의 구현예는 단일 또는 다중 효소의 다중 종 변이체의 동시 발현을 통해 숙주 세포에서 노스캐피노이드 생성물의 증가된 생산을 포함한다. 일부 경우에서, 단일 또는 다중 효소의 추가의 유전자 복사본은 숙주 세포에서 포함된다. 임의의 편리한 방법은 숙주 세포내 효소용 이종 코딩 서열의 다중 복사본을 포함하여 이용될 수 있다.
일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소용 이종 코딩 서열의 다중 복사본, 예컨대 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 또는 심지어 10 이상 복사본을 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 숙주 세포는 하나 이상의 효소용 이종 코딩 서열의 다중 복사본, 예컨대 2 이상, 3 이상, 4 이상, 등의 다중 복사본을 포함한다. 일부 경우에서, 효소용 이종 코딩 서열의 다중 복사본은 숙주 세포와 비교된 경우 2 이상 상이한 공급원 유기체로부터 유도된다. 예를 들어, 조작된 숙주 세포는 하나의 이종 코딩 서열의 다중 복사본을 포함할 수 있고, 각각의 복사본은 상이한 공급원 유기체로부터 유도된다. 이와 같이, 각 복사본은 이종 코딩 서열에 의해 인코딩되는 관심 효모의 종간 차이에 기반된 명백한 서열에서 일부 변화를 포함할 수 있다.
달리 지적되지 않는 한, 이종 코딩 서열은 유전자은행에서 보고된 바와 같다. 관심 효소의 목록은 표 1에서 보여진다. 본 발명의 숙주 세포는 임의의 공급원으로부터 열거된 효소의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 개시된 수탁 번호는 유전자은행을 지칭한다. 일부 수탁 번호는 www.yeastgenome.org에서 월드와이드웹으로 이용가능한 사카로마이세스 게놈 데이터베이스 (SGD)를 지칭한다.
일부 구현예에서, 세포는 (예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이) 하나 이상의 관심 효소를 인코딩하는 하나 이상의 이종 코딩 서열을 포함한다. 관심 효소는, 비제한적으로, 표 1에 기재된 효소를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 테트라하이드로프로토베르베린 N-메틸전달효소 (TNMT)를 인코딩하는 이종 코딩 서열을 포함한다. 일부 사례에서, 세포는 N-메틸카나딘 1-하이드록실라제 (CYP82Y1)를 인코딩하는 이종 코딩 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 세포는 1-하이드록시-N-메틸카나딘 13-하이드록실라제 (CYP82X2)를 인코딩하는 이종 코딩 서열을 포함한다. 특정 사례에서, 세포는 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘 3-O 아세틸 전달효소 (PsAT1)를 인코딩하는 이종 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신 합성효소 (CYP82X1)를 인코딩하는 이종 코딩 서열을 포함한다. 일부 사례에서, 세포는 나르코틴헤미아세탈 합성효소 (PsCXE1)를 인코딩하는 이종 코딩 서열을 포함한다. 특정 사례에서, 세포는 노스카핀 합성효소 (PsSDR1)를 인코딩하는 이종 코딩 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 세포는 PsMT3 및 Ps6OMT로부터 선택된 하나 이상의 효소를 인코딩하는 하나 이상의 이종 코딩 서열 (예를 들면, 2 이상)을 포함한다. 일부 경우에서, 세포는 PsMT3, Ps6OMT, 및 PsMT2로부터 선택된 하나 이상의 효소를 인코딩하는 하나 이상의 이종 코딩 서열 (예를 들면, 2 이상)을 포함한다. 특정 경우에서, 세포는 효소 PsMT3 및 PsMT2를 인코딩하는 이종 코딩 서열을 포함한다. 특정 경우에서, 세포는 효소 Ps6OMT 및 PsMT2를 인코딩하는 이종 코딩 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 효소 CYP82Y1, CYP82X1, 및 CYP82X2를 인코딩하는 이종 코딩 서열을 포함한다. 이종 코딩 서열은 임의의 편리한 방법을 이용하여 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 일부 사례에서, 이종 코딩 서열은 낮은-복사본 작제물로부터 발현된다. 일부 경우에서, 세포는 P. 솜니페룸 및 E. 칼리포르니카으로부터 선택된 공급원 유기체로부터 유도되는 이종 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 (예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이) 관심 효소가 부족하다. 특정 구현예에서, 세포는 PsMT2, PsMT3, Ps6OMT, CYP82X1, CYP82X2, PsTNMT 또는 EcTNMT, PsCXE1, PsSDR1, PsAT1, 및 CYP82Y1로부터 선택된 하나 이상의 효소가 부족하다. 특정 구현예에서, 세포는 PsMT2, PsMT3, Ps6OMT, CYP82X1, CYP82X2, TNMT, PsCXE1, PsSDR1, PsAT1, 및 CYP82Y1로부터 선택된 2 이상 (예컨대 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상 또는 9 이상) 효소가 부족하다. 본원에서 기재된 효소의 2 이상의 임의의 조합은 대상체 세포로부터 제외되도록 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 PsMT3 효소를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 Ps6OMT 효소를 포함한다. 일부 사례에서, 세포는 동형이량체 또는 이종이량체 (예를 들면, 본원에서 기재된 임의의 2 편리한 효소의 이량체)인 효소를 포함한다. 특정 사례에서, 세포는 PsMT2+MT3의 이종이량체 효소를 포함한다. 특정 경우에서, 세포는 PsMT2+6OMT의 이종이량체 효소를 포함한다.
일부 사례에서, 숙주 세포는 CPR 효소용 이종 코딩 서열을 포함한다. 임의의 편리한 CPR 효소는 대상체 숙주 세포에서 이용될 수 있다. 특정 사례에서, CPR 효소는 아라비돕시스 탈리아나 P450 환원효소 (ATR), 예를 들면, 하기이다: P. 솜니페룸 (PsCPR)로부터 ATR1, 또는 CPR 효소. 세포는 세포에서 노스카핀의 유도체화를 제공하는 하나 이상의 효소를 이용하여 관심 노스캐피노이드를 생산할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 P450, 할로게나제, 글리코실라제, 메틸전달효소, 아세틸전달효소, 단쇄 탈수소효소, 카복실에스테라제, 및 프레닐전달효소로부터 선택된 하나 이상의 효소용 하나 이상의 이종 코딩 서열을 포함한다.
세포는 노르라우다노솔린으로부터 노스캐피노이드 또는 이들의 전구체를 생산할 수 있다. 도9는 노르라우다노솔린으로부터 출발하는 노스카핀 및 이들의 전구체에 대한 합성 경로를 예시한다. 일부 구현예에서, 세포는 TNMT, PsAT1, CYP82X1, PsCXE1, PsSDR1, PsMT3, PsMT2, CYP82Y1, CYP82X1, S9OMT, Ps6OMT, Ps4'OMT, PsCNMT, PsBBE, AtATR1, 및 CYP719A로부터 선택된 하나 이상의 효소를 인코딩하는 하나 이상의 이종 코딩 서열을 포함한다. 이종 코딩 서열은 임의의 편리한 방법을 이용하여 세포에서 발현될 수 있다. 관심 발현 방법은 다양한 인자 예컨대 관심 효소 및 관심 세포 생성물에 따라 다양하고, 비제한적으로, 염색체 통합, YAC로부터 발현, 낮은-복사본 플라스미드로부터 발현 및 높은-복사본 플라스미드로부터 발현을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 YAC로부터 TNMT, PsAT1, CYP82X1, PsCXE1, PsSDR1, PsMT2를 발현시킨다. 특정 구현예에서, 세포는 YAC로부터 CYP82Y1, CYP82X1, PsCXE1, PsSDR1, PsMT3을 발현시킨다. 특정 구현예에서, 세포는 YAC로부터 CYP82X2, CYP82X1, PsCXE1, PsSDR1, PsMT2, PsAT1, TNMT를 발현시킨다. 특정 사례에서, 세포는 낮은-복사본 플라스미드로부터 CYP82Y1 및 CYP82X1을 발현시킨다. 일부 사례에서, 세포는 높은-복사본 플라스미드로부터 S9OMT를 발현시킨다. 일부 경우에서, Ps6OMT, Ps4'OMT, PsCNMT, PsBBE, AtATR1, 및 CYP719A는 세포에서 염색체에 의해 통합된다. 일부 경우에서, TNMT, PsAT1, CYP82X1, PsCXE1, PsSDR1, PsMT3, PsMT2, CYP82Y1, CYP82X1, S9OMT, Ps6OMT, Ps4'OMT, PsCNMT, PsBBE, AtATR1, 및 CYP719A는 세포에서 염색체에 의해 통합된다. 일부 경우에서, RnPTPS, RnSepR, RnPCD, RnQDHPR, RnDHFR, RnTyrH, CjNCS, PpDODC, EcCYP80B1, PsCPR, Ps6OMT, Ps4'OMT, PsCNMT, ARO4(Q166K), ARO7(T226I), ARO10, TKL1, TNMT, PsAT1, CYP82X1, PsCXE1, PsSDR1, PsMT3, PsMT2, CYP82Y1, CYP82X1, S9OMT, PsBBE, 및 CYP719A는 세포에서 염색체에 의해 통합된다.
일부 구현예에서, 숙주 세포 (예를 들면, 효모 균주)는, 세포내 구획에 하나 이상의 효소를 국재화시킴으로써 관심 노스캐피노이드, 또는 이들의 전구체의 선택적 생산을 위하여 조작된다. 세포의 임의의 편리한 구획 또는 구조는 관심 효소의 국재화를 위하여 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 효모 세포내 구획에 공간적으로 국재화되는 효소를 포함하고, 여기에서 구획은 미토콘드리아, 내형질 망 (ER), 골지, 액포, 핵, 원형질막, 페록시솜, 및 주변세포질로부터 선택된다. 일부 사례에서, 효소는 단백질의 N-말단에 ER 표적화 서열의 융합에 의해 효모 내형질 망에 국재화된다. 특정 경우에서, 관심 효소는 효모 세포내 구획의 외부에 공간적으로 국재화된다. 일부 사례에서, 관심 효소는 효모 세포내 구획의 내부에 공간적으로 국재화된다.
일부 경우에서, 효소는 숙주 세포에서 위치될 수 있어서 이로써 상기 효소에 의해 생산된 화합물이 자발적으로 재배열하고, 바람직하지 않은 대사물질로 화합물을 전환시킬 수 있는 국재화된 효소를 달성하기 전에 또 다른 효소에 의해 바람직한 대사물질로 전환된다. 2 효소 사이의 공간적 거리는 바람직하지 않은 대사물질을 만들기 위해 화합물상에 직접적으로 작용함으로부터 효소의 하나를 예방하도록, 및 바람직하지 않은 말단 생성물 (예를 들면, 바람직하지 않은 오피오이드 부산물)의 생산을 제한하도록 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에서 기재된 임의의 효소는, 단수로 또는 제2 효소와 함께, 비제한적으로, 세포소기관, 내형질 망, 골지, 액포, 핵, 원형질막, 또는 주변세포질을 포함하여, 숙주 세포내 임의의 편리한 구획으로 국재화될 수 있다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 국재화 태그를 포함하는 하나 이상의 효소를 포함한다. 임의의 편리한 국재화 태그는 이용될 수 있다. 일부 경우에서, 국재화 태그는 효소의 N-말단 및 또는 C-말단에서 부착되는 펩타이드 서열이다. 임의의 편리한 방법은 효소에 태그의 부착을 위하여 이용될 수 있다. 일부 경우에서, 국재화 태그는 내인성 효모 단백질로부터 유도된다. 상기 태그는, 비제한적으로, 내형질 망 (ER), 미토콘드리아 (MT), 원형질막 (PM), 및 액포 (V)를 포함하여, 다양한 효모 세포소기관에 라우팅을 제공할 수 있다. 특정 사례에서, 태그는 단백질의 꼬리-고정된 부류로부터 막통과 도메인을 포함하거나 또는 상기로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 국재화 태그는 세포소기관의 외부에 효소를 위치시킨다. 특정 구현예에서, 국재화 태그는 세포소기관의 내부에 효소를 위치시킨다.
일부 사례에서, 효소의 각 유형의 발현은 추가의 유전자 복사본 (즉, 다중 복사본)을 통해 증가되고, 이는 중간체 축적 및 궁극적으로 노스캐피노이드 및/또는 노스캐피노이드 전구체 생산을 증가시킨다. 본 발명의 구현예는 단일 또는 다중 효소의 다중 종 변이체의 동시 발현을 통해 숙주 세포에서 증가된 노스캐피노이드 생산을 포함한다. 일부 경우에서, 단일 또는 다중 효소의 추가의 유전자 복사본은 숙주 세포에서 포함된다. 임의의 편리한 방법은 숙주 세포내 효소용 이종 코딩 서열의 다중 복사본을 포함하여 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 효소용 이종 코딩 서열의 다중 복사본, 예컨대 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 또는 심지어 10 이상 복사본을 포함한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 하나 이상의 효소용 이종 코딩 서열의 다중 복사본, 예컨대 2 이상, 3 이상, 4 이상, 등의 다중 복사본을 포함한다. 일부 사례에서, 숙주 세포는 CYP82Y1, CYP82X1, CYP82X2, PsCXE1, PsSDR1, PsMT2, 및 PsMT3으로부터 선택된 효소를 인코딩하는 이종 코딩 서열의 다중 복사본을 포함한다. 특정 경우에서, 효소 CYP82Y1, CYP82X1, CYP82X2, PsCXE1, PsSDR1, 및 PsMT3을 인코딩하는 각각의 이종 코딩 서열의 다중 복사본은 숙주 세포에서 포함된다.
일부 경우에서, 효소용 이종 코딩 서열의 다중 복사본은 숙주 세포와 비교된 경우 2 이상 상이한 공급원 유기체로부터 유도된다. 예를 들어, 숙주 세포는 하나의 이종 코딩 서열의 다중 복사본을 포함할 수 있고, 각각의 복사본은 상이한 공급원 유기체로부터 유도된다. 특정 경우에서, 복사본은 P. 솜니페룸 및 E. 칼리포르니카 공급원 유기체로부터 유도된다. 이와 같이, 각 복사본은 이종 코딩 서열에 의해 인코딩되는 관심 효모의 종간 차이에 기반된 명백한 서열에서 일부 변화를 포함할 수 있다. 일부 사례에서, 숙주 세포는 각각 효소를 인코딩하는 및 숙주 세포와 비교된 경우 상이한 공급원 유기체로부터 각각 유도되는 다중 이종 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 숙주 세포와 비교된 경우 2 이상 상이한 공급원 유기체로부터 유도된 효소의 복사본을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 각각 TNMT 효소를 인코딩하는 2 이상 이종 코딩 서열을 포함한다. 일부 사례에서, 숙주 세포는 각각 TNMT를 인코딩하는 및 상이한 공급원 유기체로부터 유도되는 2 이상 이종 코딩 서열을 포함한다. 특정 경우에서, TNMT 효소용 공급원 유기체는 P. 솜니페룸 및 E. 칼리포르니카로부터 선택된다.
조작된 숙주 세포 배지는 노스캐피노이드 생성물의 생산을 위하여 샘플링 및 모니터링될 수 있다. 노스캐피노이드 생성물은 임의의 편리한 방법을 이용하여 관측 및 측정될 수 있다. 관심 방법은, 비제한적으로, 관심 샘플이 표준 화합물의 공지된 양과 비교로 분석되는 (예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같은) LC-MS 방법을 포함한다. 추가적으로, 노스캐피노이드 생성물이 관측 및/또는 측정될 수 있는 다른 방식이 있다. 바이어스의 대안적인 관측 및/또는 측정 방식의 예는 다른 것 중에서 GC-MS, UV-vis 분광법, NMR, LC-NMR, LC-UV, TLC, 모세관 전기영동을 포함한다. 동일성은, 예를 들면, m/z 및 MS/MS 단편화 패턴에 의해 확인될 수 있고, 화합물의 정량화 또는 측정은 화합물의 표준의 공지된 양의 상응하는 LC-MS 분석을 참조로 공지된 체류 시간의 LC 미량 피크 및/또는 EIC MS 피크 분석을 통해 달성될 수 있다.
방법
처리 단계
상기 요약된 바와 같이, 본 발명의 측면은 노스캐피노이드 생성물의 제조 방법을 포함한다. 이와 같이, 본 발명의 측면은 (예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이) 하나 이상의 숙주 세포 변형이 기능적으로 발현되어 이로써 세포가 관심 출발 화합물을 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 조건하에 조작된 숙주 세포의 배양을 포함한다. 하나 이상의 이종 코딩 서열이 기능적으로 발현되고 관심 출발 화합물을 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 단백질 생산에 적합한 조건하에 조작된 숙주 세포의 배양을 포함하는 방법이 또한 제공된다. 예에서, 상기 방법은 (예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이) 조작된 숙주 세포의 배양; 세포 배양액에 출발 화합물의 부가; 및 세포 배양액으로부터 노스캐피노이드 생성물의 회수를 포함하는 노스캐피노이드 생성물의 제조 방법이다.
특정 경우에서, 세포에서 생산되는 노스캐피노이드는 자체적으로 그 뒤에 관심 다운스트림 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 (BIA)로 전환되는 출발 물질 또는 중간체로서 세포에서 이용된다. 임의의 편리한 바이어스는 본원에서 기재된 노스캐피노이드-생산 세포를 통해 생산될 수 있다. 주제 방법에서 사용을 위하여 적응될 수 있는 관심 BIA-생산 세포는, 비제한적으로, Smolke 등에 의해 US20140273109에서 기재된 것을 포함하고, 그의 개시내용은 전체적으로 본원에서 참조로 편입된다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 상기 방법은 추가로 노스캐피노이드로부터 BIA를 생산하기에 충분한 조건하에 숙주 세포의 배양 및 세포 배양액으로부터 BIA의 회수를 포함한다.
발효 배지는 적합한 탄소 기질을 함유할 수 있다. 본 개시내용의 방법을 수행하기에 적합한 탄소의 공급원은 다양한 탄소 함유 기질을 포함할 수 있다. 적합한 기질은, 제한 없이, 모노사카라이드 (예를 들면, 글루코오스, 푸룩토오스, 갈락토오스, 자일로스), 올리고당 (예를 들면, 락토오스, 수크로오스, 라피노오스), 다당류 (예를 들면, 전분, 셀룰로오스), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 재생가능한 공급원료로부터 미정제된 혼합물 (예를 들면, 옥수수 침지액, 사탕무 당밀, 보리 맥아)은 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 탄소 기질은 1-탄소 기질 (예를 들면, 메탄올, 이산화탄소) 또는 2-탄소 기질 (예를 들면, 에탄올)일 수 있다. 다른 경우에서, 다른 탄소 함유 화합물, 예를 들어, 메틸아민, 글루코사민, 및 아미노산은 이용될 수 있다.
조작된 숙주 세포의 임의의 편리한 배양 방법은 노스캐피노이드 생성물의 생산을 위하여 이용될 수 있다. 이용되는 특정한 프로토콜은, 예를 들면, 조작된 숙주 세포, 이종 코딩 서열, 관심 효소, 관심 바이어스, 등에 따라 다양할 수 있다. 세포는 임의의 편리한 환경, 예컨대 세포가 하나 이상의 기능성 이종 효소를 발현시킬 수 있는 환경에서 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 효소 발현을 수행하는 조건하에 및 생체내 노스캐피노이드 생성물의 생산을 허용하기 위해 이용가능한 적절한 기질로 배양된다. 일부 구현예에서, 기능성 효소는 시험관내 조건하에 노스캐피노이드 생성물의 생산을 위하여 조작된 숙주로부터 추출된다. 일부 사례에서, 조작된 숙주 세포는 다중세포 숙주 유기체에 역으로 배치된다. 조작된 숙주 세포는, 비제한적으로, 고정상 및 로그-성장 상, 등을 포함하여, 성장의 임의의 상이다. 또한, 배양액 자체는 연속식 배양액일 수 있거나 또는 이들은 회분식 배양액일 수 있다.
세포는 14-40 ℃ 사이의 온도로 적절한 발효 배지에서 성장될 수 있다. 세포는 임의의 편리한 속도로 교반하면서 성장될 수 있다 (예를 들면, 하기: 200 rpm). 세포는 적합한 pH에서 성장될 수 있다. 발효를 위한 적합한 pH 범위는 pH 5-9 사이일 수 있다. 발효는 호기성, 혐기성, 또는 미량호기성 조건하에 수행될 수 있다. 임의의 적합한 성장 배지가 사용될 수 있다. 적합한 성장 배지는, 제한 없이, 공통의 상업적으로 제조된 배지 예컨대 합성 정의된 (SD) 최소 배지 또는 효모 추출물 펩톤 덱스트로오스 (YEPD) 풍부한 배지를 포함할 수 있다. 미생물에 적절한 임의의 다른 농축된, 정의된, 또는 합성 성장 배지는 사용될 수 있다.
세포는 본질적으로 임의의 크기 및 형상의 용기에서 배양될 수 있다. 본 개시내용의 방법을 수행하기에 적합한 용기의 예는, 제한 없이, 다중-웰 쉐이크 플레이트, 시험관, 플라스크 (배플드 및 비-배플드), 및 생물반응기를 포함할 수 있다. 배양액의 용적은 10 마이크로리터 내지 10,000 리터 초과 범위일 수 있다.
알칼로이드의 생산에 바람직한 방식으로 대사를 조절하도록 공지되는 성장 배지의 제제의 부가는 포함될 수 있다. 비-제한 예로, 사이클릭 아데노신 2'3'-모노포스페이트는 이화대사물 억압을 조절하기 위해 성장 배지에 부가될 수 있다.
특정한 세포 유형을 위한 임의의 편리한 세포 배양 조건이 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 변형을 포함하는 숙주 세포는, 표준 세포 배양 배지 및 보충물로, 표준 또는 쉽게 최적화된 조건하에 배양된다. 하나의 예로서, 플라스미드 유지를 위한 선택적 압력이 요구되지 않는 경우 표준 성장 배지는 20 g/L 효모 추출물, 10 g/L 펩톤, 및 20 g/L 덱스트로오스 (YPD)를 함유할 수 있다. 숙주 세포 함유 플라스미드는 성장 및 선택에 요구된 적절한 아미노산으로 보강된 1.7 g/L 효모 질소 염기, 5 g/L 암모늄 설페이트, 및 20 g/L 덱스트로오스를 함유한 합성 완벽한 (SC) 배지에서 성장된다. 유도성 효소 발현에 유용할 수 있는 대안적인 탄소 공급원은, 비제한적으로, 수크로오스, 라피노오스, 및 갈락토오스를 포함한다. 세포는 임의의 편리한 온도에서 성장된다 (예를 들면, 하기: 30ºC) 임의의 편리한 속도로 교반하면서 (예를 들면, 하기: 200 rpm) 실험실내에, 용기에서, 예를 들면, 1-1000 mL, 또는 더 큰 범위의 용적으로 시험관 또는 플라스크에서.
배양 용적은 더 큰 발효 용기에서, 예를 들어, 산업적 공정의 일부로서 성장을 위하여 규모확대될 수 있다. 산업적 발효 공정은 폐쇄된-배치식, 유가식, 또는 연속식 케모스탯 조건하에, 또는 발효의 임의의 적합한 방식하에 수행될 수 있다. 일부 경우에서, 세포는 전체의 세포 촉매로서 기판 상에 고정될 수 있고 알칼로이드 생산을 위하여 발효 조건 처리될 수 있다.
배치 발효는 폐쇄된 시스템이고, 여기에서 배지의 조성물은 발효의 초기에 설정되고 발효 공정 동안 변경되지 않는다. 원하는 유기체(들)은 발효의 초기에 배지에 예방접종된다. 일부 사례에서, 배치 발효는 인자 예컨대 pH 및 산소 농도 (그러나 탄소 아님)를 제어하기 위해 시스템에 적용된 변경으로 실시된다. 발효 시스템의 상기 유형에서, 시스템의 바이오매스 및 대사물질 조성물은 발효의 과정에 걸쳐 연속적으로 변화한다. 세포는 전형적으로 래그 시간을 통해, 그 다음 대수 증식 (높은 성장률), 그 다음 고정상 (감소된 또는 중단된 성장률), 및 결국 사망 단계까지 (미처리된채 남겨진 경우) 진행한다.
연속식 발효는 개방된 시스템이고, 여기에서 정의된 발효 배지는 생물반응기에 연속적으로 부가되고 발효 배지의 동등량은 가공용 용기로부터 연속적으로 제거된다. 연속식 발효 시스템은 정상 상태 성장 조건을 유지하도록 일반적으로 작동되고, 이로써 제거되는 배지로 인한 세포 손실은 발효에서 성장률에 의해 균형을 맞춰져야 한다. 연속식 발효는 세포가 일정한 높은 세포 밀도인 조건에서 일반적으로 작동된다. 연속식 발효는 표적 생성물 농도 및/또는 세포 성장에 영향을 미치는 하나 이상의 인자의 조절을 허용한다.
액체 배지는, 비제한적으로, 상기 기재된 첨가제 구성요소를 갖는 풍부한 또는 합성 한정 배지를 포함한다. 배지 구성요소는 물에서 용해될 수 있고 열, 압력, 여과, 방사선, 화학물질, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 멸균될 수 있다. 몇 개의 배지 구성요소는 분리하여 제조 및 멸균될 수 있고, 및 그 다음 발효 용기에서 조합될 수 있다. 배양 배지는 발효 내내 일정한 pH 유지를 돕기 위해 완충될 수 있다.
온도, 용해된 산소, pH, 교반, 공기 공급량, 및 세포 밀도를 포함하는 공정 파라미터는 발효의 과정에 걸쳐 모니터링 또는 제어될 수 있다. 예를 들어, 발효 공정의 온도는 배양 배지에서 액침된 온도 프로브로 모니터링될 수 있다. 배양 온도는 재킷 온도조절에 의해 설정값에서 제어될 수 있다. 물은 외부 냉각기에서 냉각될 수 있고 그 다음 생물반응기 제어 타워에 유동될 수 있고 용기에서 설정값 온도를 유지하기 위해 요구된 온도에서 재킷에 순환될 수 있다.
추가적으로, 기체 유동 파라미터는 발효 공정에서 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 기체는 스파아저를 통해 배지에 유동될 수 있다. 본 개시내용의 방법에 적합한 기체는 압축된 공기, 산소, 및 질소를 포함할 수 있다. 기체 유동은 고정된속도일 수 있거나 또는 용해된 산소 설정값을 유지하도록 조절될 수 있다.
배양 배지의 pH는 또한 모니터링될 수 있다. 예에서, pH는 용기 내부의 배양 배지에 액침되는 pH 프로브로 모니터링될 수 있다. pH 제어가 시행중이면, pH는 요구된 속도로 배지에 각 용액을 부가하는 산 및 염기 펌프에 의해 조정될 수 있다. pH를 조절하기 위해 사용된 산 용액은 황산 또는 염산일 수 있다. pH를 조절하기 위해 사용된 바탕 용액은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 또는 수산화암모늄일 수 있다.
추가로, 용해된 산소는 배양 배지에서 액침된 용해된 산소 프로브에 의해 배양 배지에서 모니터링될 수 있다. 용해된 산소 조절이 시행중이면, 산소 수준은 교반 속도의 증가 또는 감소에 의해 조정될 수 있다. 용해된 산소 수준은 가스 유량의 증가 또는 감소에 의해 또한 조정될 수 있다. 기체는 압축된 공기, 산소, 또는 질소일 수 있다.
교반 속도는 발효 공정에서 또한 모니터링될 수 있다. 예에서, 교반기 모터는 진탕기를 구동시킬 수 있다. 교반기 속도는 발효내내 일관된 rpm에서 설정될 수 있거나 또는 설정 용해된 산소 수준을 유지하도록 동적으로 조절될 수 있다.
추가적으로, 탁도는 발효 공정에서 모니터링될 수 있다. 예에서, 세포 밀도는 탁도 프로브를 이용하여 측정될 수 있다. 대안적으로, 세포 밀도는 생물반응기로부터 샘플의 취득 및 분광측정기에서 이들의 분석에 의해 측정될 수 있다. 추가로, 샘플은 멸균된 샘플링 장치를 통해 시간 간격에서 생물반응기로부터 제거될 수 있다. 샘플은 숙주 세포에 의해 생산된 알칼로이드에 대하여 분석될 수 있다. 샘플은 다른 대사물질 및 당, 배양 배지 구성요소의 고갈, 또는 세포의 밀도에 대하여 또한 분석될 수 있다.
또 다른 예에서, 공급원료 파라미터는 발효 공정 모니터링될 수 있다. 특히, 외부 펌프를 이용하여 발효에 부가될 수 있는 당류 및 다른 탄소 공급원, 영양소, 및 보조인자를 포함한 공급원료. 다른 구성요소는, 제한 없이, 항발포, 염, 킬레이트제, 계면활성제, 및 유기 액체를 포함하여 발효 동안 또한 부가될 수 있다.
숙주 세포에서 이종 폴리뉴클레오타이드의 발현 최적화용 임의의 편리한 코돈 최적화 기술은 대상체 숙주 세포 및 방법에서 사용을 위하여 적응될 수 있다, 참고 예를 들면, 하기: Gustafsson, C. 등 (2004) Trends Biotechnol, 22, 346-353 (이는 전체적으로 참조로 편입된다).
주제 방법은 세포 배양액에 출발 화합물의 부가를 또한 포함할 수 있다. 임의의 편리한 부가 방법은 주제 방법에서 사용을 위하여 적응될 수 있다. 세포 배양액은 (예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이) 관심 출발 물질의 충분한 양, 예를 들면, 출발 화합물의 mM 내지 μM 양 예컨대 약 1-5 mM로 보강될 수 있다. 부가된 출발 물질의 양, 부가의 타이밍 및 속도, 부가된 물질의 형태, 등이 다양한 인자에 따라 다양할 수 있음이 이해된다. 출발 물질은 순수하게 부가될 수 있거나 또는 적합한 용매 (예를 들면, 세포 배양 배지, 물, 또는 유기 용매)에서 예비-용해될 수 있다. 출발 물질은 농축된 형태로 부가될 수 있다 (예를 들면, 하기: 10x 원하는 농도 초과) 부가시 세포 배양 배지의 희석을 최소화하기 위해.출발 물질은 하나 이상의 배치에서, 또는 장시간에 걸쳐 (예를 들면, 시간 또는 일) 연속식 부가에 의해 부가될 수 있다.
발효 배지로부터 생성물의 단리 방법
주제 방법은 세포 배양액으로부터 노스캐피노이드 생성물의 회수를 또한 포함할 수 있다. 임의의 편리한 분리 및 단리 방법 (예를 들면, 크로마토그래피 방법 또는 침전 방법)은 세포 배양액으로부터 노스캐피노이드 생성물을 회수하기 위해 주제 방법에서 사용을 위하여 적응될 수 있다. 여과 방법은 세포 배양액의 불용성 분획으로부터 가용성을 분리시키도록 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 액체 크로마토그래피 방법 (예를 들면, 역상 HPLC, 크기 배제, 정상 크로마토그래피)은 세포 배양액의 다른 가용성 구성요소로부터 관심 노스캐피노이드 생성물을 분리시키도록 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 추출 방법 (예를 들면, 액체 추출, pH 기반 정제, 고상 추출, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환, 등)은 세포 배양액의 다른 구성요소로부터 노스캐피노이드 생성물을 분리시키도록 사용될 수 있다.
생산된 알칼로이드는 당해 기술에서 공지된 방법을 이용하는 발효 배지로부터 단리될 수 있다. 수많은 회수 단계는 원하는 생성물의 초기 회수용 발효 직후 (또는 일부 사례에서, 동안) 수행될 수 있다. 이들 단계를 통해, 알칼로이드 (예를 들면, 노스캐피노이드 생성물)은 세포, 세포성 잔해 및 폐기물, 및 다른 영양소로부터 분리될 수 있고, 유기 분자는 소비된 배양 배지에서 유지할 수 있다. 상기 공정은 노스캐피노이드 생성물이 풍부한 생성물을 수득하도록 사용될 수 있다.
예에서, 노스캐피노이드 생성물을 갖는 생성물 스트림은 조작된 효모 세포 그리고 영양소 및 물을 포함한 공급원료의 배치 반응기에 제공에 의해 형성된다. 특히, 조작된 효모 세포는 노스캐피노이드 생성물 및 세포성 물질을 포함한 용액을 생산하기 위해 적어도 약 5 분의 기간 동안 조작된 효모 세포의 인큐베이팅에 의해 발효 처리될 수 있다. 일단 조작된 효모 세포가 발효 처리되면, 적어도 하나의 분리 단위는 노스캐피노이드 생성물을 포함한 생성물 스트림을 제공하기 위해 세포성 물질로부터 노스캐피노이드 생성물을 분리시키도록 사용될 수 있다. 특히, 생성물 스트림은 노스캐피노이드 생성물 뿐만 아니라 추가의 구성요소, 예컨대 정화된 효모 배양 배지를 포함할 수 있다. 추가적으로, 노스캐피노이드 생성물은 하나 이상의 노스캐피노이드 생성물, 예컨대 하나 이상의 노스캐피노이드 화합물을 포함할 수 있다.
상이한 방법은 노스캐피노이드 생성물을 포함하는 생물반응기 배지로부터 세포를 제거하도록 사용될 수 있다. 예에서, 세포는 경시적으로 침강에 의해 제거될 수 있다. 침강의 상기 공정은 칠링 또는 청징제 예컨대 실리카의 부가에 의해 가속화될 수 있다. 소비된 배양 배지는 그 다음 반응기의 최상부로부터 사이펀처리될 수 있거나 또는 세포는 반응기의 최하부로부터 경사분리될 수 있다. 대안적으로, 세포는 필터, 막, 또는 다른 다공성 물질을 통해 여과로 제거될 수 있다. 세포는 원심분리, 예를 들어, 연속식 유동 원심분리 또는 연속식 추출기에 의해 또한 제거될 수 있다.
일부 귀중한 노스캐피노이드 생성물이 세포 내부에 존재하면, 세포는 투과 또는 용해될 수 있고 세포 잔해는 상기 기재된 임의의 방법에 의해 제거될 수 있다. 세포를 투과가능하도록 사용된 제제는, 제한 없이, 하기를 포함할 수 있다: 유기 용매 (예를 들면, DMSO) 또는 염 (예를 들면, 리튬 아세테이트). 세포를 용해시키는 방법은 계면활성제 예컨대 나트륨 도데실 설페이트의 부가, 또는 비드 밀링 또는 초음파처리에 의한 기계적 파괴를 포함할 수 있다.
노스캐피노이드 생성물은 수성 배양 배지와 불혼화성인 유기 액체의 부가에 의해 액체-액체 추출을 통해 정화된 소비된 배양 배지로부터 추출될 수 있다. 예에서, 액체-액체 추출의 사용은 다른 처리 단계에 더하여 사용될 수 있다. 적합한 유기 액체의 예는, 비제한적으로, 이소프로필 미리스테이트, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 메틸이소부틸 케톤, 메틸 올레이트, 톨루엔, 올레일 알코올, 에틸 부티레이트를 포함한다. 유기 액체는 수성 매질의 용적의 10% 만큼 적게 또는100% 만큼 많게 부가될 수 있다.
일부 경우에서, 유기 액체는 발효의 시작에서 또는 발효 동안 임의의 시간에서 부가될 수 있다. 추출성 발효의 상기 공정은 유기상에 노스캐피노이드 생성물의 연속적 제거에 의해 숙주 세포로부터 노스캐피노이드 생성물의 수율을 증가시킬 수 있다.
진탕은 유기상이 수성 배양 배지와 에멀젼을 형성하도록 할 수 있다. 상이한 층들로 2상의 분리를 조장하는 방법은, 제한 없이, 탈유화제 또는 핵제의 부가, 또는 pH의 조정을 포함할 수 있다. 에멀젼은, 예를 들어, 연속식 원뿔형 플레이트 원심분리에 의해 2상을 분리시키도록 또한 원심분리될 수 있다.
대안적으로, 유기상은 추출 이후 물리적으로 제거될 수 있도록 수성 배양 배지로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 용매는 막에서 캡슐화될 수 있다.
예에서, 노스캐피노이드 생성물은 흡착 방법을 이용하여 발효 배지로부터 추출될 수 있다. 예에서, 노스캐피노이드 생성물은 수지 예컨대 Amberlite® XAD4 또는 흡착에 의해 노스캐피노이드 생성물을 제거하는 또 다른 제제의 부가에 의해 정화된 소비된 배양 배지로부터 추출될 수 있다. 노스캐피노이드 생성물은 그 다음 유기 용매를 이용하여 수지로부터 방출될 수 있다. 적합한 유기 용매의 예는, 비제한적으로, 메탄올, 에탄올, 에틸 아세테이트, 또는 아세톤을 포함한다.
노스캐피노이드 생성물은 여과를 이용하여 발효 배지로부터 또한 추출될 수 있다. 높은 pH에서, 노스캐피노이드 생성물은 생물반응기에서 결정성-유사 침전물을 형성할 수 있다. 상기 침전물은 필터, 막, 또는 다른 다공성 물질을 통한 여과에 의해 직접적으로 제거될 수 있다. 상기 침전물은 원심분리 및/또는 경사분리에 의해 또한 수집될 수 있다.
상기 기재된 추출 방법은 그 자리에서(생물반응기에서) 또는 그 자리 외에서 (예를 들면, 배지가 생물반응기 밖으로 유동하고 추출 제제를 접촉시키고, 그 다음 용기에 역으로 재순환되는 외부 루프에서) 수행될 수 있다. 대안적으로, 추출 방법은 발효가 생물반응기 용기로부터 제거된 정화된 배지를 이용하여 말단화된 이후 수행될 수 있다.
주제 방법은 세포 배양액으로부터 노스캐피노이드 또는 이들의 전구체의 회수를 또한 포함할 수 있다. 임의의 편리한 분리 및 단리 방법 (예를 들면, 염기성 조건하에 유기 용매 추출, 고상 추출, 크로마토그래피 방법, 또는 침전 방법)은 세포 배양액으로부터 관심 노스캐피노이드 또는 이들의 전구체를 회수하기 위해 주제 방법에서 사용을 위하여 적응될 수 있다. 여과 방법은 세포 배양액의 불용성 분획으로부터 가용성을 분리시키도록 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 액체 크로마토그래피 방법 (예를 들면, 역상 HPLC, 크기 배제, 정상 크로마토그래피)는 세포 배양액의 다른 가용성 구성요소로부터 노스캐피노이드 또는 전구체를 분리시키도록 사용된다. 특정 경우에서, (예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이) 노스캐피노이드-생산 세포는 노스캐피노이드를 관심 다운스트림 BIA로 전환시킨다. 이와 같이, 상기 기재된 임의의 방법은 또한 생산되는 임의의 관심 바이어스의 회수에 적용될 수 있다.
관심 노스캐피노이드 또는 이들의 전구체의 생산 목적을 위하여 숙주 세포의 조작 방법이 또한 포함된다. 숙주 세포에 DNA의 삽입은 임의의 편리한 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 상기 방법은 숙주 세포에 이종 코딩 서열을 삽입하도록 사용되어 이로써 숙주 세포가 기능적으로 효소를 발현시키고 관심 출발 화합물을 관심 생성물 노스캐피노이드 또는 이들의 전구체로 전환시킨다.
일부 구현예에서, 세포는 (예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이) 하나 이상의 이종 코딩 서열에 대하여 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 임의의 편리한 프로모터는 주제 숙주 세포 및 방법에서 이용될 수 있다. 이종 코딩 서열의 발현을 구동하는 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있고, 단, 프로모터는 숙주 세포에서 활성일 수 있다. 이종 코딩 서열은 그의 고유 프로모터로부터 발현될 수 있거나, 또는 비-고유 프로모터는 사용될 수 있다. 상기 프로모터는 이들이 사용되는 숙주에서 저 내지 고 강도일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 강한 프로모터를 포함한다. 프로모터는 조절될 수 있거나 또는 구성적일 수 있다. 특정 구현예에서, 재생된 글루코오스가 아니거나, 또는 배양 배지에서 글루코오스의 존재에 의해 단지 부드럽게 재생되는 프로모터가 사용된다. 관심 프로모터는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 당분해 유전자의 프로모터 예컨대 (푸룩토오스 비스포스페이트 알돌라아제 인코딩한) B. 서브틸리스 tsr 유전자의 프로모터 또는 (글리세르알데하이드-포스페이트 탈수소효소에 대하여 코딩한) 효모 S. 세레비지애로부터 GAPDH 프로모터, 빵 효모의 ADH1 프로모터, 포스페이트-기아 유도된 프로모터 예컨대 효모의 PHO5 프로모터, B. 리케니포르미스로부터 알칼리성 포스파타제 프로모터, 효모 유도성 프로모터 예컨대 Gal1-10, Gal1, GalL, GalS, 억제성 프로모터 Met25, tetO, 및 구성적 프로모터 예컨대 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소 프로모터 (GPD), 알코올 탈수소효소 프로모터 (ADH1), 번역-연신 인자-1-α 프로모터 (TEF), 사이토크롬 c-옥시다제 프로모터 (CYC1), MRP7 프로모터, GAL1, HXT7, PGK1, TPI1, PYK1, TEF1, 등. 호르몬 예컨대 글루코코르티코이드, 스테로이드, 및 갑상선 호르몬에 의해 유도성인 프로모터를 함유한 자율적으로 복제하는 효모 발현 벡터는 또한 사용될 수 있고, 비제한적으로, 글루코르티코이드 반응 요소 (GRE) 및 갑상선 호르몬 반응 요소 (TRE)를 포함한다. 이들 및 다른 실시예는 아래 기재된다: 미국특허번호 7,045,290 (이는 참조로 편입되고, 본 명세서에서 인용된 참조문헌을 포함한다). 구성적 또는 유도성 프로모터 예컨대 α 인자, 알코올 옥시다제, 및 PGH를 함유한 추가의 벡터가 사용될 수 있다. (진핵 프로모터 데이터 베이스 EPDB에 따라) 추가적으로 임의의 프로모터/인핸서 조합은 또한 유전자의 발현을 구동하도록 사용될 수 있다. 임의의 편리한 적절한 프로모터는 하기에 대하여 선택될 수 있다: 숙주 세포, 예를 들면, E. 콜리. 전사체를 최적화하기 위한 프로모터 선택, 및 그러므로, 에너지 자원의 최소화 동안 생산을 최대화하기 위한 효소 수준을 또한 이용할 수 있다.
일부 사례에서, 세포는 HXT7, ADH1, PGK1, TPI1, PYK1, 및 TEF1로부터 선택된 하나 이상의 강한 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 CYP82Y1 또는 CYP82Y1 돌연변이체를 인코딩하는 하나 이상의 이종 코딩 서열을 포함하고 HXT7 프로모터를 포함한다. 특정 경우에서, 세포는 1-하이드록시-N-메틸카나딘을 생산한다. 특정 사례에서, 세포는 1-하이드록시카나딘을 생산한다. 일부 구현예에서, 세포는 CYP82X2 또는 CYP82X2 돌연변이체를 인코딩하는 하나 이상의 이종 코딩 서열을 포함하고 HXT7 프로모터를 포함한다. 특정 사례에서, 세포는 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘을 생산한다. 일부 사례에서, 세포는 CYP82X2 또는 CYP82X2 돌연변이체를 인코딩하는 하나 이상의 이종 코딩 서열을 포함하고 PGK1 및 GPD로부터 선택된 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 N-메틸-오피오카르핀을 생산한다. 일부 사례에서, 세포는 CYP82X1 또는 CYP82X1 돌연변이체를 인코딩하는 하나 이상의 이종 코딩 서열을 포함하고 HXT7 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신을 생산한다.
임의의 편리한 벡터는 주제 숙주 세포 및 방법에서 이용될 수 있다. 관심 벡터는 효모 및 다른 세포에서 사용을 위하여 벡터를 포함한다. 효모 벡터는 4 일반적인 카테고리로 분해될 수 있다: 통합 벡터 (YIp), 자율적으로 복제하는 높은 복사본-수치 벡터 (YEp), 자율적으로 복제하는 낮은 복사본-수치 벡터 (YCp) 및 큰 단편 클로닝용 벡터 (YACs). 벡터 DNA는 임의의 편리한 전환 또는 형질감염 기술을 통해 원핵 또는 진핵 세포에 도입될 수 있다.
알칼로이드-풍부한 용액으로부터 생성물 정제 방법
후속의 정제 단계는 고순도로 개별적인 관심 생성물 종을 회수하기 위해 당해 기술에서 공지된 방법을 이용하여 노스캐피노이드 생성물이 풍부한 후-발효 용액 처리를 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 유기상에서 추출된 노스캐피노이드 생성물은 수용액에 이동될 수 있다. 일부 경우에서, 유기 용매는 열 및/또는 진공에 의해 증발될 수 있고, 수득한 분말은 적합한 pH의 수용액에서 용해될 수 있다. 추가 예에서, 노스캐피노이드 생성물은 수성상에 노스캐피노이드 생성물의 추출을 촉진시키는 적합한 pH에서 수용액의 부가에 의해 유기상으로부터 추출될 수 있다. 수성상은 그 다음 경사분리, 원심분리, 또는 또 다른 방법에 의해 제거될 수 있다.
노스캐피노이드 생성물-함유 용액은, 예를 들어, 적합한 킬레이트제로 처리에 의해 금속을 제거하도록 추가로 처리될 수 있다. 노스캐피노이드 생성물-함유 용액은 침전에 의해 다른 불순물, 예컨대 단백질 및 DNA를 제거하도록 추가로 처리될 수 있다. 하나의 예에서, 노스캐피노이드 생성물-함유 용액은 적절한 침전 제제 예컨대 에탄올, 메탄올, 아세톤, 또는 이소프로판올로 처리된다. 대안적인 예에서, DNA 및 단백질은 생물학적 거대분자의 오염으로부터 더 작은 알칼로이드를 분리시키는 크기 배제의 다른 방법 또는 투석에 의해 제거될 수 있다.
추가 예에서, 노스캐피노이드 생성물을 함유한 용액은 당해 기술에서 공지된 방법을 이용하여 연속식 교차-유동 여과에 의해 고순도로 추출될 수 있다.
용액이 노스캐피노이드 생성물의 혼합물을 함유하면, 당해 기술에서 공지된 방법을 이용하여 개별적인 노스캐피노이드 생성물 종을 수득하기 위해 산-염기 처리될 수 있다. 이 공정에서, 수용액 pH는 개별적인 노스캐피노이드 생성물을 침전시키도록 조정된다.
고순도, 소규모 침전을 위하여, 노스캐피노이드 생성물은 액체 크로마토그래피에 의해 단일 단계로 정제될 수 있다.
효모-유도된 알칼로이드 APIs 대 식물-유도된 APIs
정화된 효모 배양 배지 (CYCM)는 복수의 불순물을 함유할 수 있다. 정화된 효모 배양 배지는 알칼로이드-풍부 분말을 수득하기 위해 진공 및/또는 열에 의해 탈수될 수 있다. 상기 생성물은, 양귀비-재배 국가로부터 수출되는 및 API 제조자에 의해 구매되는, 양귀비 줄기 농축물 (CPS)과 비슷하다. 본 발명의 목적을 위하여, CPS는 원하는 알칼로이드 생성물(들)이 궁극적으로 추가로 정제될 수 있는 정제된 식물 추출물의 임의의 유형의 대표적인 예이다. 표 2 및 표 3은 CYCM 또는 CPS에 특이적일 수 있거나 또는 모두에 존재할 수 있는 이들 2 생성물에서 불순물을 강조한다. 일부 노스캐피노이드 생성물이 불순물로서 안료를 가질 수 있는 반면, 다른 노스캐피노이드 생성물은 안료 자체로서 분류될 수 있다. 따라서, 이들 노스캐피노이드 생성물은 비-안료 불순물에 기반된 불순물에 대하여 평가될 수 있다. 추가적으로, 일부 예에서, 발효 공정을 이용하여 생산되는 노스캐피노이드 생성물은 노스캐피노이드 생성물을 생산하기 위한 발효 공정에서 사용되는 하나 이상의 세포의 일부를 함유할 수 있다. 예를 들어, 효모가 노스캐피노이드 생성물을 생성물하도록 사용되는 경우, 효모 세포의 일부는 노스캐피노이드 생성물 내일 수 있다. 이들 불순물의 서브셋에 대하여 미공지된 기원의 생성물 분석으로, 당해 기술의 숙련가는 생성물이 효모 또는 식물 생산 숙주로부터 유래되었는지를 결정할 수 있다.
API-등급 약제학적 성분은 고순도 분자이다. 이와 같이, API (예컨대 표 2 및 표 3에 열거된 것)의 식물- 또는 효모-기원을 지시할 수 있는 불순물은 생성물의 API 단계에서 존재할 수 없다. 사실상, 본 발명의 효모 균주로부터 유도된 많은 API 생성물은 전통적 식물-유도된 APIs로부터 크게 구별할 수 없을 수 있다. 일부 경우에서, 그러나, 종래의 알칼로이드 화합물은 화학 합성 접근법을 이용하여 화학 변형 처리될 수 있고, 이는 상기 화학 변형이 필요한 식물-기반 생성물에서 화학 불순물로서 보여줄 수 있다. 예를 들어, 화학 유도체화는 종종 화학 합성 공정에 관련된 불순물의 세트를 초래할 수 있다. 특정 상황에서, 이들 변형은 효모 생산 플랫폼에서 생물학적으로 수행될 수 있고, 그렇게 함으로써 효모-유도된 생성물에 존재함으로부터 화학 유도와 관련된 불순물의 일부를 피한다. 특히, 화학 유도 생성물로부터 이들 불순물은 화학 합성 공정을 이용하여 생산되는 API 생성물에서 존재할 수 있지만 효모-유도된 생성물을 이용하여 생산되는 API 생성물로부터 부재할 수 있다. 대안적으로, 효모-유도된 생성물이 화학적으로-유도된 생성물과 혼합되면, 수득한 불순물은 존재할 수 있지만 유일하게 또는 주로 화학적으로-유도된 생성물을 함유하는 API에서 예상될 것보다 더 적은 양일 수 있다. 상기 예에서, 이들 불순물의 서브셋에 대하여 API 생성물을 분석함으로써 당해 기술의 숙련가는 생성물이 효모 생산 숙주 또는 전통적 화학 유도체화 경로에서 유래되었는지를 결정할 수 있다.
생합성된 APIs에서 존재할 수 있지만 화학적으로-유도된 APIs가 아닌 불순물의 비-제한 예는 노스캐피노이드 생성물을 생산하도록 이용되는 비-식물 세포의 일부를 포함할 수 있다. 예에서, 생합성된 APIs는 효모 세포 내에 노스캐피노이드 생성물을 발효시키도록 이용되는 효모 세포의 일부를 포함할 수 있다. 추가적으로, 효모-유도된 화합물 및 식물-유도된 화합물 둘 모두가 화학 합성 접근법을 통해 화학 변형 처리되는 경우에서, 화학 합성 공정과 관련된 동일한 불순물은 생성물에서 예상될 수 있다. 그와 같은 상황에서, 하기 출발 물질 (예를 들면, CYCM 또는 CPS)은 상기에서 기재된 바와 같이 분석될 수 있다.
숙주 세포의 조작 방법
노스캐피노이드 생성물의 생산 목적을 위하여 숙주 세포의 조작 방법이 또한 포함된다. 숙주 세포에 DNA의 삽입은 임의의 편리한 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 상기 방법은 조작된 숙주 세포에 이종 코딩 서열을 삽입하도록 이용되어 이로써 숙주 세포는 기능적으로 효소를 발현시키고 관심 출발 화합물을 노스캐피노이드 생성물로 전환시킨다.
임의의 편리한 프로모터는 주제 조작된 숙주 세포 및 방법에서 이용될 수 있다. 이종 코딩 서열의 발현을 구동한 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있고, 단, 프로모터는 조작된 숙주 세포에서 활성이다. 이종 코딩 서열은 그의 고유 프로모터로부터 발현될 수 있거나, 또는 비-고유 프로모터는 사용될 수 있다. 상기 프로모터는 이들이 사용되는 숙주에서 저 내지 고 강도일 수 있다. 프로모터는 조절될 수 있거나 또는 구성적일 수 있다. 특정 구현예에서, 재생된 글루코오스가 아니거나, 또는 배양 배지에서 글루코오스의 존재에 의해 단지 부드럽게 재생되는 프로모터가 사용된다. 관심 프로모터는 비제한적으로 하기를 포함한다: 당분해 유전자의 프로모터 예컨대 (푸룩토오스 비스포스페이트 알돌라아제 유전자의 프로모터 영역을 인코딩한) B. 서브틸리스 tsr 유전자의 프로모터 또는 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소 (GPD, GAPDH, 또는 TDH3)에 대하여 코딩한 효모 S. 세레비지애 유전자로부터 프로모터, 빵 효모의 ADH1 프로모터, 포스페이트-기아 유도된 프로모터 예컨대 효모의 PHO5 프로모터, B. 리케니포르미스로부터 알칼리성 포스파타제 프로모터, 효모 유도성 프로모터 예컨대 Gal1-10, Gal1, GalL, GalS, 억제성 프로모터 Met25, tetO, 및 구성적 프로모터 예컨대 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소 프로모터 (GPD), 알코올 탈수소효소 프로모터 (ADH), 번역-연신 인자-1-α 프로모터 (TEF), 사이토크롬 c-옥시다제 프로모터 (CYC1), MRP7 프로모터, 등. 호르몬 예컨대 글루코코르티코이드, 스테로이드, 및 갑상선 호르몬에 의해 유도성인 프로모터를 함유한 자율적으로 복제하는 효모 발현 벡터는 또한 사용될 수 있고, 비제한적으로, 글루코르티코이드 반응 요소 (GRE) 및 갑상선 호르몬 반응 요소 (TRE)를 포함한다. 이들 및 다른 실시예는 아래 기재된다: 미국특허번호 7,045,290 (이는 참조로 편입되고, 본 명세서에서 인용된 참조문헌을 포함한다). 구성적 또는 유도성 프로모터 예컨대 α 인자, 알코올 옥시다제, 및 PGH를 함유한 추가의 벡터가 사용될 수 있다. (진핵 프로모터 데이터 베이스 EPDB에 따라) 추가적으로 임의의 프로모터/인핸서 조합은 또한 유전자의 발현을 구동하도록 사용될 수 있다. 임의의 편리한 적절한 프로모터는 하기에 대하여 선택될 수 있다: 숙주 세포, 예를 들면, E. 콜리. 전사체를 최적화하기 위한 프로모터 선택, 및 그러므로, 에너지 자원을 최소화하면서 생산을 최대화하기 위한 효소 수준을 또한 이용할 수 있다.
임의의 편리한 벡터는 주제 조작된 숙주 세포 및 방법에서 이용될 수 있다. 관심 벡터는 효모 및 다른 세포에서 사용을 위하여 벡터를 포함한다. 효모 벡터의 유형은 4 일반적인 카테고리로 분해될 수 있다: 통합 벡터 (YIp), 자율적으로 복제하는 높은 복사본-수치 벡터 (YEp 또는 2μ 플라스미드), 자율적으로 복제하는 낮은 복사본-수치 벡터 (YCp 또는 동원체 플라스미드) 및 큰 단편 (YACs) 클로닝용 벡터. 벡터 DNA는 임의의 편리한 전환 또는 형질감염 기술을 통해 원핵 또는 진핵 세포에 도입된다. 또 다른 공급원의 DNA (예를 들면PCR-생성된 이중가닥 DNA 생성물, 또는 합성된 이중가닥 또는 단일가닥 올리고뉴클레오타이드)는 게놈에 통합에 의해 효모를 조작하도록 사용될 수 있다. 임의의 단일 전환 사례는 숙주 세포를 유전자 상으로 변형시키기 위해 하나 또는 몇 개의 핵산 (벡터, 이중가닥 또는 단일가닥 DNA 단편)을 포함할 수 있다.
유용성
본 발명의 조작된 숙주 세포 및 방법은, 예를 들면, 상기에서 기재된 바와 같이, 다양한 적용에서 용도를 찾는다. 관심 적용은, 비제한적으로 하기를 포함한다: 연구 적용 및 치료적 적용.본 발명의 방법은 노스캐피노이드 생성물의 생산의 경우 임의의 편리한 적용을 포함하는 다양한 상이한 적용에서 용도를 찾는다.
주제 조작된 숙주 세포 및 방법은 다양한 치료적 적용에서 용도를 찾는다. 관심 치료적 적용은 약제학적 생성물의 제제가 노스캐피노이드 생성물을 포함하는 적용을 포함한다. 본원에서 기재된 조작된 숙주 세포는 노스캐피노이드 생성물을 생산한다. 주제 숙주 세포는, 카나딘, 및 노스캐피노이드 말단 생성물을 포함하여, 관심 바이어스의 생산에서 용도를 찾을 수 잇는 간단한 및 값싼 출발 물질로부터 관심 노스캐피노이드 생성물을 생산하도록 이용될 수 있다. 이와 같이, 주제 숙주 세포는 치료적으로 활성 노스캐피노이드 생성물의 공급에서 용도를 찾는다.
일부 사례에서, 조작된 숙주 세포 및 방법은 이들 화합물의 화학 합성이 저 수율이고 대규모 생산을 위하여 실행가능한 수단이 아닌 이들의 노스캐피노이드 생성물의 상업적 규모 양의 생산에서 용도를 찾는다. 특정 경우에서, 숙주 세포 및 방법은 예를 들면, 하기의 생물반응기 (발효조)를 포함하는 발효 시설에서 이용된다: 치료적 생성물용 노스캐피노이드 생성물의 급속 생산을 허용하는 5,000-200,000 리터 수용력. 상이기 적용은 발효성 탄소 공급원 예컨대 셀룰로오스, 전분, 및 유리 당류로부터 노스캐피노이드 생성물의 산업적 규모 생산을 포함할 수 있다.
주제 조작된 숙주 세포 및 방법은 다양한 연구 적용에서 용도를 찾는다. 주제 숙주 세포 및 방법은 다양한 노스캐피노이드 생성물의 생합성 경로에 관하여 다양한 효소의 효과를 분석하도록 사용될 수 있다. 또한, 조작된 숙주 세포는 아직 입증되지 않은 치료적 기능으로서 관심 생물활성용 시험에서 용도를 찾는 노스캐피노이드 생성물을 생산하도록 조작될 수 있다. 일부 경우에서, 다양한 효소에 대하여 인코딩하는 다양한 이종 코딩 서열을 포함하기 위한 숙주 세포의 조작은 노스캐피노이드 생성물에 대한 고수율 생합성 경로를 설명한다. 특정 경우에서, 연구 적용은 증가된 관심 치료적 활성용 스크리닝을 위하여 또는 원하는 생성물에 그 다음 추가로 화학적으로 변형 또는 유도될 수 있는 관심 치료적 분자용 노스캐피노이드 생성물의 생산을 포함한다. 일부 사례에서, 숙주 세포 균주는, 이들 균주에서 생산된 대사물질의 전환을 통해 효소 발견을 초래할 수 있는, 상기 경로에서 관심있는 효소 활성에 대하여 스크리닝하도록 사용된다. 주제 숙주 세포 및 방법은 식물 특화된 대사물질용 생산 플랫폼으로서 사용될 수 있다.
주제 조작된 숙주 세포 및 방법은 식물 특화된 대사물질용 생산 플랫폼으로서 사용될 수 있다. 주제 숙주 세포 및 방법은 약물 라이브러리 개발 뿐만 아니라 식물 효소 발견용 플랫폼으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 주제 조작된 숙주 세포 및 방법은 흥미로운 스캐폴드 분자, 예컨대 프로토핀을 생산하는 효모 균주의 취득, 및 추가로 조합 생합성을 통해 또는 화학적 수단에 의한 화합물 구조의 기능화에 의해 천연 생성물 기반 약물 라이브러리의 개발에서 용도를 찾을 수 있다. 이런 식으로 약물 라이브러리를 생산함으로써, 임의의 포텐셜 약물 히트는 대규모 배양 및 생산에 잘 받아들이는 생산 숙주와 이미 관련된다. 또 다른 예로서, 이들 주제 조작된 숙주 세포 및 방법은 식물 효소 발견에서 용도를 찾을 수 있다. 주제 숙주 세포는 신규 효소 활성을 확인하기 위해 식물 EST 라이브러리를 발현하도록 정의된 대사물질의 깨끗한 배경을 제공한다. 주제 숙주 세포 및 방법은 효모에서 식물 효소의 기능성 발현 및 증가된 활성에 발현 방법 및 배양 조건을 제공한다.
키트 및 시스템
본 발명의 측면은 추가로 키트 및 시스템을 포함하고, 여기에서 키트 및 시스템은 본 발명의 방법에서 이용된 하나 이상의 구성요소, 예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이, 조작된 숙주 세포, 출발 화합물, 이종 코딩 서열, 벡터, 배양 배지, 등을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 주제 키트는 (예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이) 조작된 숙주 세포, 및 하기로부터 선택된 하나 이상의 구성요소를 포함한다: 출발 화합물, 이종 코딩 서열 및/또는 동일한 것을 포함한 벡터, 벡터, 성장 공급원료, 발현 시스템에서 사용에 적합한 구성요소 (예를 들면, 세포, 클로닝 벡터, 다중 클로닝 부위 (MCS), 2방향성 프로모터, 내부 리보솜 유입 부위 (IRES), 등), 및 배양 배지.
본원에서 기재된 임의의 구성요소, 예를 들면, 하나 이상의 변형, 출발 화합물, 배양 배지, 등을 포함하는 숙주 세포는 키트에서 제공될 수 있다. 이종 코딩 서열, 클로닝 벡터 및 발현 시스템의 제조 및 이용에 적합한 다양한 구성요소는 주제 키트에서 용도를 찾을 수 있다. 키트는 또한 튜브, 버퍼, 등, 및 사용 지침을 포함할 수 있다. 키트의 다양한 시약 구성요소는 분리된 컨테이너에 존재할 수 있거나, 또는 이들 일부 또는 전부는 바라던 대로 단일 컨테이너에서 시약 혼합물에 사전-조합될 수 있다.
노스캐피노이드 생성물 생산용 시스템이 또한 제공되고, 여기에서 상기 시스템은 (예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이) 하나 이상의 변형을 포함한 조작된 숙주 세포, 출발 화합물, 배양 배지, 발효조 및 발효 장비, 예를 들면, 숙주 세포용 성장 조건 유지에 적합한 장치, 샘플링 및 모니터링 장비 및 구성요소, 등등을 포함할 수 있다. 효모 세포의 대규모 발효에서 사용에 적합한 다양한 구성요소는 주제 시스템에서 용도를 찾을 수 있다.
일부 경우에서, 상기 시스템은 조작된 숙주 세포의 대규모 발효, 및 발효된 숙주 세포에 의해 생산된 노스캐피노이드 생성물의 모니터링 및 정제용 구성요소를 포함한다. 특정 구현예에서, (예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이) 하나 이상의 출발 화합물은, 발효조내 조작된 숙주 세포가 하나 이상의 원하는 노스캐피노이드 생성물을 생산하는 조건하에서, 시스템에 부가된다. 일부 사례에서, 숙주 세포는 (예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이) 노스캐피노이드 생성물을 생산한다.
일부 경우에서, 상기 시스템은 주제 숙주 세포에 의해 생산된 하나 이상의 노스캐피노이드 생성물 화합물의 모니터링 및 또는 분석 방법을 포함한다. 예를 들어, 본원에서 기재된 바와 같이 LC-MS 분석 시스템, 크로마토그래피 시스템, 또는 샘플이 표준에, 예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이 분석 및 비교될 수 있는 임의의 편리한 시스템. 발효 배지는 샘플링 및 분석에 의해 발효 이전 및 동안 임의의 편리한 시간에 모니터링될 수 있다. 출발 화합물의 노스캐피노이드 생성물로의 전환이 완벽한 경우, 발효는 중단될 수 있고 노스캐피노이드 생성물의 정제가 실시될 수 있다. 이와 같이, 일부 경우에서, 주제 시스템은 생산되는 숙주 세포 배지로부터 노스캐피노이드 생성물의 정제에 적합한 정제 구성요소를 포함한다. 정제 구성요소는, 비제한적으로, 실리카 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, HIC 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 액체 추출, 및 pH 추출 방법을 포함하여, 발효에 의해 생산된 노스캐피노이드 생성물을 정제하기 위해 사용될 수 있는 임의의 편리한 수단을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 주제 시스템은 시스템에 하나 이상의 출발 화합물의 입력 이후 관심 노스캐피노이드 발효 생성물의 생산 및 단리를 제공한다.
하기 실시예는 본 발명의 제조 및 사용 방법의 완벽한 개시내용 및 설명을 당해 분야의 숙련가에게 제공하기 위해 설정되고, 발명자들이 그들의 발명으로서 여기는 것의 범위를 제한할 의도가 아니며 아래 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험을 것을 나타내는 의도가 아니다사용된 수치 (예를 들면 양, 온도, 등)에 관하여 정확도를 보장하기 위해 노력하였지만, 일부 실험적인 오차 및 편차는 고려되어야 한다. 달리 명시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨온도이고, 및 압력은 대기압 또는 그 근처이다.
실험
노스카핀 및 합성 중간체 생산용 조작된 효모 사카로마이세스 세레비지애 , 및 다양한 노스캐피노이드.
효모 균주는 노스카핀 및 유도체를 생산하기 위해 전환을 수행할 수 있다. 화합물 이들 균주의 예는 하기이고: N-메틸카나딘, 1-하이드록시-N-메틸카나딘, 노스카핀, 나르코톨린, 나르코틴헤미아세탈, 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신, 3-O-아세틸파파베록신, 나르코톨린헤미아세탈, N-메틸오피오카르핀e, 1, 13-디하이드록시-N-메틸카나딘, 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘, 나르코톨리노젠디알, 1-하이드록시카나딘, 및 나르코톨리날, 이들 중에서 1-하이드록실카나딘, 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신, 나르코톨린헤미아세탈, 나르코톨린헤미아세탈, 1, 13-디하이드록시-N-메틸카나딘, 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘, 나르코톨리노젠디알, 나르코톨리날은 이전에 전혀 확인되지 않았다. 또한, 효모 세포는 노스카핀의 생합성 경로의 보정, 효소 기능의 특성화, 및 이종 경로 재구성의 입증에 의해 조작되어 식물 천연 생성물 생합성에 대한 효율적인 및 정확한 접근법을 생산한다.
실시예 1: 카나딘으로부터 노스카핀, 합성 중간체 및 유도체를 합성하는 효모 균주
프로토베르베린 및 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드, 예컨대 1-하이드록시-N-메틸카나딘, 노스카핀, 나르코톨린, 나르코틴헤미아세탈, 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신, 3-O-아세틸파파베록신, 나르코톨린헤미아세탈, N-메틸로피오카르핀, 1, 13-디하이드록시-N-메틸카나딘, 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘, 나르코톨리노젠디알, 나르코톨리날, 1-하이드록시카나딘을 생산하는 효모 균주가 개발되었다.
도.2A 및 2B는 카나딘에서 노스카핀으로의 합성 경로를 묘사한다. 상기 경로는 CYP82X1, CYP82X2, PsAT1, CYP82Y1, PsCXE1, PsSDR1, N4'OMT의 효소 활성을 포함한다. 노스카핀 생합성 경로는 다양한 노스카핀 합성 중간체 및 유도체를 생산하기 위해 효모에서 조작되었다.
1.1) 카나딘으로부터 N-메틸카나딘을 생산하기 위해, P. 솜니페룸 (PsTNMT) 또는 E. 칼리포르니카 (EcTNMT)로부터 테트라하이드로프로토베르베린 N-메틸전달효소 (TNMT)는 염색체에 의해 통합된 ATR1을 갖는 효모 균주에서 (예를 들면, 낮은-복사본 플라스미드 또는 염색체에 의해 통합된) 낮은-복사본 작제물로부터 발현된다 (도 3 및 4). 각각의 효소의 다른 가능한 변이체는 표 1에 포함된다.
1.2) 카나딘으로부터 1-하이드록시-N-메틸카나딘을 생산하기 위해, P. 솜니페룸 으로부터 CYP82Y1은 이전에 기재된 N-메틸카나딘 생산 균주에서 낮은-복사본 플라스미드로 발현된다 (도 3 및 4). 각각의 효소의 다른 가능한 변이체는 표 1에 포함된다.
1.3) 1, 13-디하이드록시-N-메틸카나딘을 생산하기 위해, P. 솜니페룸로부터 CYP82X2는 이전에 기재된 1-하이드록시-N-메틸카나딘 생산 균주에서 (예를 들면, 낮은-복사본 플라스미드 또는 염색체에 의해 통합된) 낮은-복사본 작제물로부터 발현된다 (도 3 및 4). 각각의 효소의 다른 가능한 변이체는 표 1에 포함된다.
1.4) 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘을 생산하기 위해, P. 솜니페룸 로부터 PsAT1은 이전에 기재된 1, 13-디하이드록시-N-메틸카나딘 생산 균주에서 (예를 들면, 낮은-복사본 플라스미드, YAC 또는 염색체에 의해 통합된) 낮은-복사본 작제물로부터 발현된다 (도 3 및 4). 각각의 효소의 다른 가능한 변이체는 표 1에 포함된다.
1.5) 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신을 생산하기 위해, P. 솜니페룸 로부터 CYP82X1은 이전에 기재된 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘 생산 균주에서 낮은-복사본 작제물 (예를 들면, 낮은-복사본 플라스미드 또는 YAC)로부터 발현된다 (도 3 및 4). 각각의 효소의 다른 가능한 변이체는 표 1에 포함된다.
1.6) 나르코톨린헤미아세탈을 생산하기 위해, P. 솜니페룸 으로부터 PsCXE1은 이전에 기재된 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신 생산 균주에서 낮은-복사본 작제물 (예를 들면, 낮은-복사본 플라스미드 또는 YAC)로부터 발현된다 (도 3 및 4). 각각의 효소의 다른 가능한 변이체는 표 1에 포함된다.
1.7) 나르코톨린을 생산하기 위해, P. 솜니페룸 으로부터 PsSDR1은 이전에 기재된 나르코톨린헤미아세탈 생산 균주에서 낮은-복사본 작제물 (예를 들면, 낮은-복사본 플라스미드 또는 YAC)로부터 발현된다 (도 3 및 4). 각각의 효소의 다른 가능한 변이체는 표 1에 포함된다.
1.8) 노스카핀을 생산하기 위해, P. 솜니페룸 으로부터 PsMT3 또는 Ps6OMT 및 PsMT2는 이전에 기재된 나르코톨린 생산 균주에서 낮은-복사본 작제물 (예를 들면, 낮은-복사본 플라스미드 또는 YAC 또는 염색체 통합)으로부터 공동-발현된다 (도10). 각각의 효소의 다른 가능한 변이체는 표 1에 포함된다. Tf6OMT는 나르코톨린을 노스카핀으로 전환시키지 않는다.
1.9) 1-하이드록시카나딘을 생산하기 위해, P. 솜니페룸 으로부터 CYP82Y1은 염색체에 의해 통합된 ATR1을 갖는 효모 균주에서 낮은-복사본 플라스미드로부터 발현된다 (도 3 및 4). 각각의 효소의 다른 가능한 변이체는 표 1에 포함된다.
1.10) N-메틸-오피오카르핀을 생산하기 위해, P. 솜니페룸 으로부터 CYP82X2는 이전에 기재된 N-메틸카나딘 생산 균주에서 낮은-복사본 작제물 (예를 들면, 낮은-복사본 플라스미드 또는 YAC)로부터 발현된다 (도 3 및 4). 각각의 효소의 다른 가능한 변이체는 표 1에 포함된다.
1.11) 나르코톨리날을 생산하기 위해, P. 솜니페룸 으로부터 CYP82X1은 이전에 기재된 1-하이드록실-N-메틸카나딘 생산 균주에서 낮은-복사본 작제물 (예를 들면, 낮은-복사본 플라스미드 또는 YAC)로부터 발현된다 (도 3 및 4). 각각의 효소의 다른 가능한 변이체는 표 1에 포함된다.
1.12) 나르코톨리노젠디알을 생산하기 위해, P. 솜니페룸 으로부터 CYP82X1은 이전에 기재된 1, 13-디하이드록시-N-메틸카나딘 생산 균주에서 낮은-복사본 작제물 (예를 들면, 낮은-복사본 플라스미드 또는 YAC)로부터 발현된다 (도 3 및 4). 각각의 효소의 다른 가능한 변이체는 표 1에 포함된다.
1.13) 3-O-아세틸파파베록신을 생산하기 위해, P. 솜니페룸으로부터 PsMT3 또는 Ps6OMTand PsMT2는 이전에 기재된 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신 생산 균주에서 낮은-복사본 작제물 (예를 들면, 낮은-복사본 플라스미드 또는 YAC 또는 염색체 통합)로부터 공동-발현된다 (도10). 각각의 효소의 다른 가능한 변이체는 표 I에 포함된다.
1.14) 나르코틴헤미아세탈을 생산하기 위해, P. 솜니페룸 으로부터 PsMT3 또는 Ps6OMT 및 PsMT2는 이전에 기재된 나르코톨린헤미아세탈 생산 균주에서 낮은-복사본 작제물 (예를 들면, 낮은-복사본 플라스미드 또는 YAC 또는 염색체 통합)으로부터 공동-발현된다 (도10). 각각의 효소의 다른 가능한 변이체는 표 1에 포함된다.
1.15) 더 많은 노스카핀 유사체를 생산하기 위해, 특정 효소 또는 효소의 특정 세트는 노스카핀 생산 균주로부터 제거된다. 하나의 예는 히드라스틴을 합성하기 위해, PsMT2, PsMT3 또는 Ps6OMT 및 CYP82Y1이 이전에 기재된 노스카핀 생산 균주로부터 제외되는 것이다. 또한, 카나딘을 제외한 상이한 기질은 더 많은 노스카핀 유사체를 제공하기 위해 이전에 기재된 노스카핀 생산 균주에 공급된다. 기질은, 비제한적으로, (S)-스코울레린, (S)-테트라하이드로베르베르루빈, (S)-스틸로핀, (S)-체일란티폴린, 및 (S)-테트라하이드로팔마틴을 포함한다.
1.16) 더 많은 노스캐피노이드를 생산하기 위해, 테일러링 효소는 이전에 기재된 균주와 공동-발현된다. 노스카핀 (또는 중간체(들))-생산 균주에 도입된 효소의 예는, 비제한적으로, P450s, 할로게나제, 글리코실라제, 메틸전달효소, 프레닐전달효소를 포함한다. 하나의 예는 포유동물 간 P450 CYP2D6이 카나딘의 메틸렌디옥실 브릿지를 파괴하여 9,10-디메톡시-6,8,13,13a-테트라하이드로-5H-이소퀴놀리노[3,2-a]이소퀴놀린-2,3-디올을 제공할 수 있다는 것이다.
실시예 2:효모에서 노스카핀, 합성 중간체 및 유도체의 생합성 최적화 전략
조작된 효모 균주의 맥락에서 프로토베르베린 및 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드의 생산 최적화 툴 및 방법이 개발되었다. 하기 3개의 P450s의 효소 활성, 즉, CYP82Y1, CYP82X1, 및 CYP82X2는, 노스카핀 및 중간체 모두에 대하여 최적화되었다. 세포소기관 라우팅 툴키트는, 조작된 효모 균주에서 표적 노스카핀 또는 노스캐피노이드의 최적의 생산을 얻기 위해, P450s을 포함한, 하기 유형의 효소, 메틸전달효소, 아세틸전달효소, 단쇄 탈수소효소, 및 카복실에스테라제 사이에서 상호작용을 재배치 및 최적화하도록 이용된다.
2.1) 더 많은 N-메틸카나딘을 생산하기 위해, 상이한 종으로부터 TNMT 효소의 변이체는 효모에서 발현된다. 도5는 S. 세레비지애에서 발현된 상이한 TNMT 변이체로부터 N-메틸카나딘 생산의 측정을 도시한다. 데이터는 특정 TNMT 효소 변이체가 다른 것보다 N-메틸카나딘의 더 높은 수준을 생산한다는 것을 입증한다.
2.2) 카나딘으로부터 더 많은 1-하이드록시-N-메틸카나딘을 생산하기 위해, CYP82Y1의 N-말단은 효소의 정확한 접힘을 용이하게 하도록 조작되었다. 도6 은 상이한 온도 (25°C 및 30°C)하에 상이한 CYP82Y1 N-말단 돌연변이체를 이용한 1-하이드록시-N-메티카나딘 생산의 측정을 도시한다. 30°C에서 배양된 및 동일한 프로모터 (GAL1 프로모터)에 의해 조절된 경우, CYP82Y1의 활성은 N-말단 태그의 MSH (CYP82Y1A)의 것과의 맞바꿈을 통해 개선된다. 25°C에서 배양된 및 GPD 프로모터로 조절된 경우, CYP82Y1 및 CYP82Y1A의 활성은 유사하다. 데이터는 MSH의 N-말단 태그가 S. 세레비지애에서 가용성 CYP82Y1의 형성을 용이하게 한다는 것을 암시한다.
2.3) 카나딘으로부터 더 많은 1-하이드록시-N-메틸카나딘을 생산하기 위해, CYP82Y1의 최적의 전사 조절은 CYP82Y1 유전자의 상이한 유형의 프로모터 업스트림 시험을 통해 결정된다. 도6 은 상이한 온도 (25°C 및 30°C)하에 상이한 프로모터에 의해 조절된 CYP82Y1을 이용한 1- 하이드록시-N-메티카나딘 생산의 측정을 도시한다. 더 높은 배양 온도하에, CYP82Y1의 활성은 후기 단계 HXT7 (강한) 및 ADH1 (상대적으로 HXT7p보다 더 약한) 프로모터에 의해 조절된 경우 최고이다. 초기 성장 단계에서 활성화된 강한 프로모터, 예컨대 PGK1, TPI1, PYK1, TEF1 프로모터는 30°C에서 배양된 경우 덜 유효하다. 비교하자면, 조작된 효모 균주가 25°C에서 배양된 경우, HXT7 및 강한 프로모터에 의해 조절된 CYP82Y1의 활성은 대략 동일한 수준이다. 그리고 비교하자면, CYP82Y1이 ADH1 및 더 약한 CYC1 프로모터에 의해 조절된 경우 14-하이드록실-N-메틸카나딘의 생산은 더 낮다.
2.4) 더 많은 1-하이드록시카나딘을 생산하기 위해, 모든 CYP82Y1 돌연변이체 및 다양한 프로모터-CYP82Y1 조합은 25°C에서 S. 세레비지애내에 조사된다. CYP82Y1A의 HXT7 프로모터 업스트림은 1-하이드록시카나딘의 합성을 위하여 조합된다. 1-하이드록시-N-메틸카나딘의 생합성을 위하여, CYP82Y1 및 CYP82Y1A는 HXT7 프로모터에 의해 조절된 경우 25°C에서 유사한 효율을 나타내고; 그에 반해서, CYP82Y1A는 1-하이드록시카나딘의 생합성에 대하여 CYP82Y1의 2배 효율적이다 (도6).
2.5) 더 많은 1, 13-디하이드록시-N-메틸카나딘을 생산하기 위해, CYP82X2의 최적의 전사 조절은 CYP82X2 유전자의 상이한 유형의 프로모터 업스트림 시험을 통해 결정된다. 도7 은 25°C에서 상이한 프로모터에 의해 조절된 CYP82X2를 이용한 1, 13-디하이드록시-N-메틸카나딘 생산의 측정을 도시한다. CYP82Y1과 유사하게, HXT7 프로모터는 고수준의 1, 13-디하이드록시-N-메틸카나딘생산을 초래한다. 더욱이, CYP82X2의 추가의 복사본은 조작된 효모 균주에서 발현된다. 1-하이드록시-N-메틸카나딘의 양이 제한된 경우 CYP82X2가 1-하이드록시-N-메틸카나딘의 1, 13-디하이드록시-N-메틸카나딘으로의 전환에 효율적이기 때문에, CYP82X2의 전환 속도가 효모 세포의 외부에 1-하이드록시-N-메틸칸딘의 유출 속도만큼 빠르지 않다는 것이 제안된다. 따라서, TNMT는 1-하이드록시-N-메틸카나딘의 합성을 지연시키기 위해 조작된 효모 균주에서 재배치된다. 또한, CYP82X2 및 CYP82Y1은 내형질 망의 같은 측에 위치되도록 추가로 조작되어, CYP82X2의 1-하이드록시-N-메틸카나딘으로의 접근성을 증가시킨다.
2.6) 더 많은 N-메틸-오피오카르핀을 생산하기 위해, 다양한 프로모터-CYP82X2 조합은 나르코톨리노젠디알 생산 균주에서 또한 시험된다. 도7은 25°C에서 상이한 프로모터에 의해 조절된 CYP82X2를 이용한 N-메틸-오피오카르핀 생산의 측정을 도시한다. 상기 효소가 그의 천연 기질 1-하이드록시-N-메틸카나딘에서 기능하는 경우와 상이하게, CYP82X2는 PGK1 및 GPD 프로모터로부터 발현된 경우 N-메틸-오피오카르핀의 합성에 대하여 더 높은 활성을 나타낸다.
2.7) 더 많은 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신을 생산하기 위해, CYP82X1의 최적의 전사 조절은 CYP82X1 유전자의 상이한 유형의 프로모터 업스트림 시험을 통해 결정된다. 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신의 생산은 25°C에서 상이한 프로모터의 CYP82X1 다운스트림을 발현하는 상이한 효모 균주에서 측정된다. HXT7, ADH1, 및 CYC1 프로모터는 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신의 높은 합성 수준을 초래한다 (도8).
2.8) 더 많은 나르코톨리날 및 나르코톨리노젠디알을 생산하기 위해, CYP82X1의 최적의 전사 조절은 CYP82X1 유전자의 상이한 유형의 프로모터 업스트림 시험을 통해 결정된다. 나르코톨리날 또는 나르코톨리노젠디알 생산은 각 쌍 중에서 측정되고 비교된다. 나르코톨리날의 합성을 위하여, CYP82X1이 PGK1에 의해 조절된 경우 CYP82X1의 활성은 더 양호하다 (도8).
2.9) 노스카핀 생산 균주에서 3개의 이종 식물 P450s의 발현을 위하여 효모의 발현 스트레스를 감소시키기 위해, 선택적 식물 샤페론은 더 나은 효모 성장, 가용성 식물 P450s의 더 높은 수준 및 노스카핀의 더 높은 생산을 위하여 발현된다. 이용된 식물 샤페론은, 결합 면역글로불린 단백질 (BiP), DnaJ 단백질, 글루코오스 조절된 단백질 (GRP) 94, 결합 단백질 (BiP), 단백질 디설파이드 이소머라제 (PDI), 사이클로필린, 및 칼넥신을 포함한다.
2.10) 더 많은 노스카핀을 생산하기 위해, (CYP82X2, CYP82Y1, CYP82X1, PsCXE1, PsSDR1, PsMT2, 및 PsMT3 또는 Ps6OMT을 포함한) 다운스트림 효소의 추가의 복사본은 조작된 효모 균주에서 발현된다. 또한, 조작된 효모 균주에서 노스카핀 생산 수준은 효모에서 노스카핀 생합성 효소의 국재화 최적화에 의해 향상된다. 식물 생합성 효소의 최적의 국재화 방식은 그의 천연 맥락을 모방한다. 속도-제한 단계는 상이한 세포소기관에, 또는 이전의 단계의 효소의 부근에서 재- 국재화된다. 그리고 다양한 조합의 공동-국재화 및 생합성 효소의 수치는 조사된다.
2.11) 더 많은 노스카핀 중간체를 생산하기 위해, 다른 식물 종, 예컨대 하이드라스티스 카나덴시스, 디센트라 쿠쿨라리아, 및 아들루미아 푼고사로부터 다운스트림 생합성 효소의 변이체의 효율은 P. 솜니페룸으로부터의 것을 갖는 조작된 효모 균주에서와 비교된다. 또한, 일부 다운스트림 효소는 비천연 기질을 최종 노스카핀 유사체로 효율적으로 전환시킬 수 있기 위해 더욱 가요성 기질 특이성을 나타내도록 또한 조작된다.
실시예 3: 노르라우다노솔린으로부터 노스카핀을 합성하는 효모 균주
효모는, 카나딘으로부터 노스카핀을 생산하기 위한 조작된 효모 균주 내에서, 6개 추가의 효소 단계, 특이적으로 효소 Ps6OMT, Ps4'OMT, PsCNMT, PsBBE, S9OMT, 및 CYP719A에 의해 촉매화된 단계를 포함하도록 조작된다. 식물 천연 생성물의 생합성용 조작된 효모 균주는 효모 균주에 조작된 및 도입된 최대 15 이종 효소 단계를 포함한다 (도9).예에서, 효모에서 추가의 8개 효소는 노르라우다노솔린으로부터 레티쿨린을 생산하도록 조작될 수 있다. 추가의 예에서, 효모에서 추가의 6개 효소는 카나딘으로부터 노스카프닌을 생산하도록 조작될 수 있다.
노르라우다노솔린으로부터 노스카핀을 생산하기 위해, TNMT, PsAT1, CYP82X1, PsCXE1, PsSDR1, PsMT2, PsMT3은 YAC로부터 발현되고, CYP82Y1 및 CYP82X1은 낮은-복사본 플라스미드로부터 발현되고, S9OMT는 염색체에 의해 통합된 Ps6OMT, Ps4'OMT, PsCNMT, PsBBE, AtATR1, 및 CYP719A를 갖는 카나딘 생산 균주에서 높은-복사본 플라스미드로부터 발현된다. 또한, Ps6OMT, Ps4'OMT, PsCNMT, PsBBE, AtATR1, CYP719A, TNMT, S9OMT, CYP82Y1, CYP82X1, CYP82X2, PsCXE1, PsSDR1, PsMT2, 및 PsAT1은 염색체에 의해 통합된다. 각각의 효소의 다른 가능한 변이체는 표 I에 포함된다. CYP82X1 및/또는 S9OMT의 추가의 복사본은 노스카핀의 더 높은 생산을 위하여 낮은-복사본 플라스미드로부터 발현된다 (도11).
실시예 4: 신생 노스카핀을 합성하는 효모 균주
효모는, 노르라우다노솔린으로부터 노스카핀을 생산하기 위한 조작된 효모 균주 내에서, 13개 추가의 효소 단계, 특이적으로 효소 RnPTPS, RnSepR, RnPCD, RnQDHPR, RnDHFR, RnTyrH, CjNCS, PpDODC, EcCYP80B1, ARO4(Q166K), ARO7(T226I), ARO10, 및 TKL1에 의해 촉매화된 단계를 포함하도록 조작된다. 식물 천연 생성물의 생합성용 조작된 효모 균주는 효모 균주에 조작된 및 도입된 최대 28 이종 효소 단계를 포함한다 (도9).
새로이 노스카핀을 생산하기 위해, PsBBE, PsMT1 (PsS9OMT), CjCAS, TNMT, CYP82Y1, CYP82X2, PSAT1, CYP82X1, PsCXE1, PsSDR1, PsMT2, 및 PsMT3은 zwf1 결실 있거나 없이 효모 균주를 생산하는 레티쿨린의 3개 상이한 유전자좌 (leu2, trp1 , 및 his3)로 염색체에 의해 통합된다. 그리고 RnPTPS, RnSepR, RnPCD, RnQDHPR, RnDHFR, RnTyrH, CjNCS, PpDODC, EcCYP80B1, PsCPR, Ps6OMT, Ps4'OMT, PsCNMT, ARO4(Q166K), ARO7(T226I), ARO10, 및 TKL1 은, 레티쿨린의 생산을 향상시키기 위해 zwf1 유전자좌 또는 YPL250C 유전자좌로 염색체에 의해 통합된 RnTyrH, Ps4'OMT, CjNCS의 추가의 복사본으로, 레티쿨린의 신생 합성용 효모 균주로 염색체에 의해 통합된다. 각각의 효소의 다른 가능한 변이체는 표 I에서 포함된다. (도13).
실시예 5:신생 노스캐피노이드를 합성하는 효모 균주
노스카핀 생산 효모는 벤질이소퀴놀린, 프로토베르베린, 세코베르베린, 및 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드의 기능화된 유도체를 합성하기 위해 하나 또는 한 세트의 티로신 유사체로 대체된 티로신을 갖는 한정 배지에서 배양된다. 기능화된 유도체는 본원에서 사용된 바와 같이 참조 화합물과 식별하는 구조적 특징을 갖는 화합물을 지칭하고, 여기에서 식별하는 특징은 화합물의 합성에서 사용된 출발 물질에 존재하였다. 예를 들어, 2개 화합물을 식별하는 클로라이드가 사용된 출발 물질의 특징이었고 합성에서 단계에 의해 도입되지 않음에 따라, 3-클로로-레티쿨린은 α-클로로-l-티로신으로부터 생산될 수 있고 레티쿨린의 기능화된 유도체인 것으로 본원에서 고려된다. 추가 예는 하기를 포함한다: 6-하이드록시-카나딘, α-하이드록시-l-티로신으로부터 숙주 세포에 의해 생산될 수 있는 카나딘의 기능화된 유도체, 및 7-니트로-나르코톨린, 3-니트로-l-티로신으로부터 생산된 나르코톨린의 기능화된 유도체. 유사하게, 벤질이소퀴놀린, 프로토베르베린, 세코베르베린, 및 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드의 기능화된 유도체는 출발 물질 예컨대 티로신의 유사체로부터 생산될 수 있다. 추가의 예에서, 하나 이상의 세트의 유전자는 기능화된 유도체의 특정 그룹을 축적하기 위해 취득된다.
신생 노스캐피노이드를 생산하기 위해, 효모 균주는, zwf1 유전자좌 또는 YPL250C 유전자좌로 염색체에 의해 통합된 RnTyrH, Ps4'OMT, 및 CjNCS의 추가의 복사본, 및 ura3 유전자좌로 염색체에 의해 통합된 GAPDH, CYP82X2, TRP1, 및 PsMT1의 추가의 복사본으로, PsBBE, PsMT1 (PsS9OMT), CjCAS, TNMT, CYP82Y1, CYP82X2, PSAT1, CYP82X1, PsCXE1, PsSDR1, PsMT2, PsMT3, RnPTPS, RnSepR, RnPCD, RnQDHPR, RnDHFR, RnTyrH, CjNCS, PpDODC, EcCYP80B1, PsCPR, Ps6OMT, Ps4'OMT, PsCNMT, ARO4(Q166K), ARO7(T226I), ARO10, 및 TKL1을 발현하도록 조작된다. 조작된 노스카핀 생산 균주는 티로신 없이, 그러나 하나 또는 하나의 세트의 티로신 유사체를 갖는 한정 배지에서 배양되었고, 티로신 유사체는 비제한적으로 하기를 포함한다: α-치환된 L-티로신 (예를 들면 α-메틸 L-티로신, 반응식 1) 및 3-치환된 L-티로신 (예를 들면3-니트로-L-티로신, 반응식 2).벤질이소퀴놀린, 프로토베르베린, 세코베르베린, 및 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드의 기능화된 유도체는 노스카핀 생합성 경로를 따라 축적된다. 일부 경우에서, 벤질이소퀴놀린, 프로토베르베린, 또는 세코베르베린 알칼로이드의 더 많은 기능화된 유도체를 축적하기 위해, 특정 또는 특정 세트의 다운스트림 효소는 노스카핀 생산 균주로부터 제거된다.
반응식 1.α-치환된 L-티로신으로부터 합성된 기능화된 유도체.
Figure pct00001
반응식 2.3-치환된 L-티로신으로부터 합성된 기능화된 유도체.
Figure pct00002
도면의 설명
도1은, 본 발명의 구현예에 따라서, 식물에서 생화학적 확인에 기반하여 카나딘의 노스카핀으로의 전환용 생합성 도식을 예시한다. 대시기호로 된 화살표는 확인되지 않은 효소 단계를 나타낸다. 고체 화살표는 효모 (PsMT1, CYP82Y1, PsSDR1)에서 이종 발현을 통해, 또는 P. 솜니페룸 (PsMT1, CYP719A21, CYP82X2, PsMT2, PsCXE1, PsSDR1)에서 바이러스 유도된 유전자 침묵화 (VIGS)를 통해 확인되는 효소 단계를 나타낸다. PsMT1, CYP719A21, CYP82X2, PsCXE1, PsSDR1, 및 PsMT2가 P. 솜니페룸에서 불활성화된 경우, (S)-카나딘, (S)-N-메틸카나딘, 나르코톨리날, 파파베록신, 나르코틴헤미아세탈, 및 나르코톨린은 따라서 축적된다.
도 2A는, 본 발명의 구현예에 따라서, 사카로마이세스 세레비지애에서 생화학적 특성화에 기반하여 카나딘의 노스카핀으로의 전환용 생합성 도식을 예시한다.
도 2A 및 2B는 카나딘으로부터 노스카핀의 합성용 업데이트된 생합성 경로를 묘사한다. 도2A는 노스카핀의 생합성용 주요 경로를 도시하고, 도 2B는 주요 경로 뿐만 아니라 부 생성물의 생산용 경로를 예시한다. 도 2A에서 나타낸 바와 같이, 및 효모에서 생화학적 특성화에 따라, CYP82X2는 1-하이드록시-N-메틸카나딘의 합성 이후 효소 단계를 촉진시킨다. 그 뒤에, PsAT1은 아세틸기를 부가하여 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘을 초래하고, 그 다음 CYP82X1은 C-N 결합 절단을 촉진시키고 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신을 합성한다. PsCXE1 및 PsSDR1은 이전에 시사된 바와 같이 기능하고 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신으로부터 나르코톨린을 합성한다. CYP82Y1은 1-하이드록시카나딘을 생산하기 위해 (S)-카나딘상에서 기능할 수 있다. N-메틸로피오카르핀은 CYP82X2의 활성에서 N-메틸카나딘으로부터 합성될 수 있다. 나르코톨리날은 TNMT, CYP82Y1 및 CYP82X1의 존재하에 카나딘으로부터 합성된다. CYP82X1이 1, 13-디하이드록시-N-메틸카나딘 생산 균주에 도입된 경우, 나르코톨리노젠디알이 생산된다.
도 2B는, 본 발명의 구현예에 따라서, 사카로마이세스 세레비지애에서 생화학적 특성화에 기반하여 카나딘의 노스카핀으로의 전환 및 부산물의 생산용 또 다른 생합성 도식을 예시한다.
도 3은, 본 발명의 구현예에 따라서, 조작된 효모 균주에 의해 배양 배지에 분비된 화합물의 액체 크로마토그래피-질량 분광법 (LC-MS) 분석으로부터 EIC 미량을 예시한다. 특히, 도 3은 노스카핀, 중간체 및 유도체 생산의 LC-MS 미량을 예시한다. 도3 은 조작된 효모 균주에 의해 배양 배지에 분비된 화합물의 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광분석법 (LC-MS) 분석을 도시한다. 모든 검정은 72시간 동안 250 μM 카나딘 (S, R 라세미 혼합물)의 존재하에 성장된 효모로부터 생체내 수행되었다. 배지는 원심분리를 통해 세포 펠렛으로부터 분리되었고 LC-MS에 의해 분석되었다. 양이온 전기분무 이온화 (ESI) 질량 스펙트럼은 하기로 수득되었다: Agilent 6320 이온 트랩 (전기분무 모세관 전압 -3.5 kV; 가열된 모세관 온도 350 ℃; 차단 가스:질소) (Agilent Zorbax SB-Aq 칼럼 (3.0 x 50 mm 1.8 마이크론) 및 Agilent Zorbax SB-Aq 보호 칼럼 (2.1 x 12.5 mm 5 마이크론)이 구비된 Agilent 1200 시리즈 HPLC에 커플링됨). LC 분리 방법은 7 분에 걸쳐 H2O:CH3OH 80:20 내지 40:60으로부터 구배 용출, 1 분에 걸쳐 100% CH3OH까지 구배 용출, 및 마지막으로 4 분 동안 0.5 mL min-1의 유량으로 등용매 용출이었다. 모든 용매는 0.1% 아세트산이었다.
도4는 도 3에서 기재된 화합물용 양이온 전기분무 이온화 (ESI) 질량 스펙트럼 MS/MS 단편화를 예시한다. 본 발명의 구현예에 따라서. 양이온 전기분무 이온화 (ESI) 질량 스펙트럼은 도 3에 기재된 바와 같이 수득되었다. 주어진 전구체 이온용 MS/MS 질량 스펙트럼은 40 ms 동안 1.00 V의 단편화 진폭 및 배경 가스로서 헬륨을 이용하여 수득되었다.
도5는, 본 발명의 구현예에 따라서, P. 솜니페룸 또는 캘리포니아 양귀비로부터 TNMT를 발현하는 및 카나딘의 존재하에 성장된 효모로부터 생체내 N-메틸카나딘의 합성을 예시한다. 검정은 P. 솜니페룸 또는 E. 칼리포르니카로부터 TNMT를 발현하는 및 72시간 동안 30°C에서 250 μM 카나딘 (S, R 라세미 혼합물)의 존재하에 성장된 효모로부터 생체내 수행되었다. 양이온 전기분무 이온화 (ESI) 질량 스펙트럼은 도 3에 기재된 바와 같이 수득되었다. 생성물용 추출된 이온 크로마토그램 분자 이온용 추출된 이온 크로마토그램은 작도되었고 수작업으로 통합되었다. 오차 막대는 3개 생물학적 복제물의 S.D.이다.
도6은, 본 발명의 구현예에 따라서, PsTNMT의 존재하에 또는 존재 없이, 다양한 프로모터의 CYP82Y1 다운스트림의 상이한 버전의 발현과 카나딘의 존재하에 성장된 효모로부터 생체내 검정의 결과를 예시한다. 검정은 72시간 동안 250 μM 카나딘 (S, R 라세미 혼합물)의 존재하에 성장된 효모로부터 생체내 수행되었다. 효모는, PsTNMT의 존재하에 또는 존재 없이, 다양한 프로모터의 CYP82Y1 다운스트림의 상이한 버전을 발현시킨다. 양이온 전기분무 이온화 (ESI) 질량 스펙트럼은 도 3에 기재된 바와 같이 수득되었다. 생성물용 추출된 이온 크로마토그램 분자 이온용 추출된 이온 크로마토그램은 작도되었고 수작업으로 통합되었다. 오차 막대는 3개 생물학적 복제물의 S.D.이다. A는 CYP82Y1의 상이한 버전에 의해 1-하이드록시-N-메틸카나딘의 생산을 도시한다 (1. CYP82Y1 태그의 N-말단은 다른 ER-결합 단백질의 N-말단과 교환된다; 2. 다른 ER-결합 단백질의 N-말단 태그는 CYP82Y1에 직접적으로 태그된다) 상이한 온도 (25°C 및 30°C)하에 염색체에 의해 통합된 PsTNMT를 갖는 효모 균주에서 다양한 프로모터 (GAL1, GPD, TPI1, TEF1, PGK1, PYK1, CYC1, ADH1, HXT7 프로모터)의 다운스트림.B는 25°C에서 HXT7 프로모터 또는 TPI11 프로모터의 CYP82Y1 또는 CYP82Y1A (MSH의 것으로 교환된 N-말단 태그를 갖는 CYP82Y1) 다운스트림을 발현하는 PsTNMT 통합된 S. 세레비지애에서 1-하이드록시-N-메틸카나딘 또는 1-하이드록시카나딘의 생산을 도시한다.
도7은, 본 발명의 구현예에 따라서, PsTNMT 및 CYP82Y1A의 존재하에, 다양한 프로모터 (GAL1, GPD, PGK1, HXT7)의 CYP82X2 다운스트림의 발현과 카나딘의 존재하에 성장된 효모로부터 생체내 검정의 결과를 예시한다. 검정은 72시간 동안 250 μM 카나딘 (S, R 라세미 혼합물)의 존재하에 성장된 효모로부터 생체내 수행되었다. 효모는 PsTNMT 및 CYP82Y1A의 존재하에 다양한 프로모터 (GAL1, GPD, PGK1, HXT7 프로모터)의 CYP82X2 다운스트림을 발현한다. 양이온 전기분무 이온화 (ESI) 질량 스펙트럼은 도 3에 기재된 바와 같이 수득되었다. 생성물용 추출된 이온 크로마토그램 분자 이온용 추출된 이온 크로마토그램은 작도되었고 수작업으로 통합되었다. 오차 막대는 3개 생물학적 복제물의 S.D.이다.
도8은, 본 발명의 구현예에 따라서, CYP82X2 및 PsAT1 있거나 없이, PsTNMT 및 CYP82Y1A의 존재하에, 다양한 프로모터 (GAL1, GPD, PGK1, CYC1, ADH1, HXT7)의 야생형 (WT) 다운스트림의 발현과 카나딘의 존재하에 성장된 효모로부터 생체내 검정의 결과를 예시한다.
검정은 72시간 동안 250 μM 카나딘 (S, R 라세미 혼합물)의 존재하에 성장된 효모로부터 생체내 수행되었다. 효모는 CYP82X2 및 PsAT1 있거나 없이 PsTNMT 및 CYP82Y1A의 존재하에 GAL1, HXT7, ADH1, CYC1, GPD, TEF1 및 PGK1 프로모터의 야생형 CYP82X1 다운스트림을 발현한다. 양이온 전기분무 이온화 (ESI) 질량 스펙트럼은 도 3에 기재된 바와 같이 수득되었다. 생성물용 추출된 이온 크로마토그램 분자 이온용 추출된 이온 크로마토그램은 작도되었고 수작업으로 통합되었다. 오차 막대는 3개 생물학적 복제물의 S.D.이다.
도9는, 본 발명의 구현예에 따라서, 노르라우다노솔린의 노스카핀으로의 전환용 생합성 도식을 예시한다.
도10은 3-O-아세틸-파파베록신, 나르코틴헤미아세탈 및 노스카핀의 LC-MS 미량을 예시한다. 특히, 도10은 본원에서 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 조작된 효모 균주에 의해 배양 배지에 분비된 화합물의 EIC-LCMS 분석을 도시한다.
도11은, 본 발명의 구현예에 따라서, 노르라우다노솔린으로부터 노스카핀의 생합성을 예시한다. A는 노스카핀 표준 (흑색)의 MS/MS 스펙트럼 및 노스카핀-생산 균주 CSYN16 (적색)의 배지를 도시한다. B는 발현 카세트의 상이한 세트를 번식하는 조작된 균주로부터 분석된 노스카핀 역가를 도시한다. CSYN16:염색체로부터 발현된 AtATR1, Ps6OMT, Ps4'OMT, PsCNMT, PsBBE, PsS9OMT, CjCAS, CYP82Y1, CYP82X2, PsAT1, PsSDR1, PsTNMT, PsMT2, CYP82X1, PsCXE1, 및 PsMT3.CSYN17_1:염색체로부터 발현된 AtATR1, Ps6OMT, Ps4'OMT, PsCNMT, PsBBE, TfS9OMT, CjCAS, CYP82Y1, CYP82X2, PsAT1, PsSDR1, PsMT2, PsTNMT, CYP82X1, PsCXE1, 및 PsMT3; 낮은-복사본 플라스미드로부터 발현된 CYP82X2.CSYN17_2:염색체로부터 발현된 AtATR1, Ps6OMT, Ps4'OMT, PsCNMT, PsBBE, TfS9OMT, CjCAS, CYP82Y1, CYP82X2, PsAT1, PsSDR1, PsMT2, PsTNMT, CYP82X1, PsCXE1, 및 PsMT3; 낮은-복사본 플라스미드로부터 발현된 PsS9OMT.CSYN18:염색체로부터 발현된 AtATR1, Ps6OMT, Ps4'OMT, PsCNMT, PsBBE, TfS9OMT, CjCAS, CYP82Y1, CYP82X2, PsAT1, PsSDR1, PsMT2, PsTNMT, CYP82X1, PsCXE1, 및 PsMT3; 낮은-복사본 플라스미드로부터 발현된 CYP82X2, PsS9OM.C는 노스카핀-생산 효모 균주 CSYN18의 m/z+=288 (흑색) 및 414 (적색)의 EIC를 도시한다. 막대는 5개 생물학적 복제물의 평균 값 ± 1 s.d.를 나타내고, 오차 막대는 복제물의 표준 편차를 나타낸다.
도12는, 본 발명의 구현예에 따라서, 티로신으로부터 노스카핀의 생합성 경로를 예시한다.
도13은, 본 발명의 구현예에 따라서, 효모에서 노스카핀의 신생 생산의 입증을 예시한다.
도14는, 본 발명의 구현예에 따라서, 효모에서 노스캐피노이드의 신생 생산의 예시적 생합성 도식을 예시한다. N4'OMT는 MT2, MT3 이종이량체를 나타낸다.
도15는, 본 발명의 구현예에 따라서, 효모에서 노스캐피노이드의 신생 생산의 또 다른 예시적 생합성 도식을 예시한다. N4'OMT는 MT2, MT3 이종이량체를 나타낸다.
도16은, 본 발명의 구현예에 따라서, 글루코오스의 4-HPA, 도파민, 및 3,4-DHPA로의 전환용 생합성 도식을 예시한다.
도17은, 본 발명의 구현예에 따라서, 노르코클라우린을 통해 L-티로신의 레티쿨린으로의 전환용 생합성 도식을 예시한다.
도18은, 본 발명의 구현예에 따라서, 노르라우다노솔린을 통해 L-티로신의 레티쿨린으로의 전환용 생합성 도식을 예시한다.
도19는, 본 발명의 구현예에 따라서, 테트라하이드로바이오프테린의 합성, 재순환, 및 구제 경로의 예를 예시한다.
도20은, 본 발명의 구현예에 따라서, L-티로신의 프로토베르베린, 프탈리드이소퀴놀린, 및 베르베린 알칼로이드 생성물로의 전환용 생합성 도식을 예시한다.
도21은, 본 발명의 구현예에 따라서, L-티로신의 노스카핀, 노스캐피노이드, 및 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물로의 전환용 생합성 도식을 예시한다.
도22는, 본 발명의 구현예에 따라서, L-티로신의 산구이나린 및 벤조펜안트리딘 알칼로이드로의 전환용 생합성 도식을 예시한다.
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효소 목록의 논의
숙주 세포는 관심 바이어스 및/또는 관심 효소의 생산을 제공하는 하나 이상의 변형 (예컨대 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 또는 심지어 초과 변형)을 포함하도록 조작될 수 있다. 표 1은 관심 바이어스 및/또는 조작된 숙주 세포에서 관심 효소의 생산을 제공하기 위해 하나 이상의 변형에 의해 작용될 수 있는 예시적 유전자의 목록을 제공한다.
표 1에서 제공된 바와 같이 유전자의 변형은 성장에 요구된 최소 영양소를 함유한 배지로 공급되는 조작된 숙주 세포로부터 관심 바이어스를 생산하도록 사용될 수 있다. 상기 최소 배지는 탄소 공급원, 질소 공급원, 아미노산, 비타민, 및 염을 함유할 수 있다. 예를 들어, 표 1에서 제공된 바와 같은 유전자의 변형은 당이 공급되는 조작된 숙주 세포로부터 관심 바이어스를 생산하도록 사용될 수 있다. 추가적으로, 표 1에서 제공된 바와 같은 하나 이상의 유전자의 변형은 약물 생산을 위하여 조작될 수 있는 숙주 세포의 생합성 공정을 증가시키도록 사용될 수 있다.
추가적으로, 조작된 숙주 세포에서 관심 바이어스 및/또는 관심 효소의 생산을 제공하기 위한 이들 변형의 사용은 유전자에 의해 생산될 수 있는 효소의 단순한 확인으로부터 쉽게 명백하지 않다. 특히, 숙주 세포, 예컨대 본원에서 기재된 바와 같이 효모 세포에서 재구성되는 합성 경로는 단일 유기체 내에서 자연에서 함께 작용하지 않는 다양한 효소를 포함한다. 추가적으로, 본원에서 논의된 효소의 일부는 그의 천연 맥락에서 BIA 생합성으로 작용하지 않는다. 추가로, 본원에서 기재된 효소의 일부는 특히 숙주 세포, 예컨대 효모 세포를 기능하도록 방출되지 않고, 함께 기능하도록 방출되지 않는다. 이들 경우에, 효소가, 다운스트림 BIA 말단 생성물을 생산하는 경로를 통해 충분한 플럭스를 갖기 위해, 숙주 세포, 예컨대 효모의 합성 BIA 경로의 맥락에서 충분한 활성을 나타낼 것이 명백하지 않을 것이다.
예를 들어, 식물 효소는 이종 미생물 숙주, 예컨대 효모에서 종종 기능적으로 발현하기 어렵다. 많은 사례에서 효소는 잘못 접혀질 수, 숙주 세포 내에서 정확하게 국재화되지 않을 수, 및/또는 부정확하게 가공될 수 있다. 효모와 식물 사이에서 단백질 번역 및 가공에서의 차이는 효모 숙주에서 검출가능한 활성 없음까지 실질적으로 감소됨을 나타내는 이들 효소를 초래할 수 있다. 이들 도전은 내막 국재화된 효소, 예컨대 BIA 경로에서 강력하게 나타나는 사이토크롬 P450s에 대하여 통상적으로 일어난다. 더욱 감소된 효소 활성은, 원하는 BIA 생성물의 높은-수준 축적을 확보하기 위해 각 단계에서 충분한 활성을 요구하는, 복합체 바이어스를 생산하기 위해 조작 효모를 실질적으로 도전할 수 있다.
추가적으로, BIA 경로에서 많은 초기 전구체 (즉, 티로신부터 노르코클라우린까지 중간체)에 작용할 수 있는, 일부 숙주 세포, 예컨대 효모에서 내인성 효소/경로가 있고, 따라서 이들 경쟁 내인성 경로가 주어지면 실질적인 BIA 생산을 달성하기 위한 이종 경로를 통해 충분한 플럭스일 것이 쉽게 명백하지 않을 수 있다. 예를 들어, 에리치(Erlich) 경로 (Hazelwood, 등 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74: 2259-66; Larroy, 등 2003. Chem. Biol. Interact. 143-144: 229-38; Larroy, 등 2002. Eur. J. Biochem. 269: 5738-45)는 효모에서 초기 BIA 경로에서의 많은 중간체를 원하지 않는 생성물로 전환시키는 및 플럭스를 합성 경로로부터 우회시키는 작용을 할 주요 내인성 경로이다.
추가로, 본원에서 논의된 바와 같이, 및 표 1에서 제공된 바와 같이 많은 효소는, 이종 효모 숙주에 이동시 잃게 될 수 있는, 고유 식물 숙주에서, 공간적 조절을 포함하여, 매우 특이적 조절 전략하에 기능할 수 있다. 또한, 식물은, pH, 산화환원 상태, 및 기질, 보조기질, 조효소, 및 보조인자 유용성을 포함하여, 효소가 기능하도록 방출되는 효모 세포 보다 매우 상이한 생화학적 환경을 나타낸다. 고유 숙주와 이종 효모 숙주 사이에서 생화학적 환경 및 조절 전략의 차이가 주어지면, 효소가 효모 환경의 맥락에서의 경우 실질적인 활성을 나타낼 것이 명백하지 않고 추가로 이들이 복합체 BIA 화합물에 대하여 직접적인 단순 전구체 예컨대 당에 함께 작용할 것이 명백하지 않다. 효모 숙주에서 효소의 활성 유지는 많은 경로가 많은 반응 단계 (>10)를 가짐에 따라 특히 중요하고, 이로써 이들 단계가 효율적이지 않으면 원하는 다운스트림 생성물의 축적을 예상못할 것이다.
또한, 고유 식물 숙주에서, 이들 경로에서 관련된 대사물질은 상이한 세포 및 조직 유형을 거쳐 국재화될 수 있다. 몇 개의 예에서, 생합성에 대하여 특화될 수 있는 세포 유형 및 대사물질 축적에 대하여 합성될 수 있는 세포 유형이 있다. 상기 유형의 세포 특화는 이종 효모 숙주 내에서 경로를 발현한 경우 잃을 수 있고, 세포에서 이들 대사물질의 독성 조절에 중요한 역할을 할 수 있다. 따라서, 효모가 이들 화합물의 독성에 의해 손상됨 없이 이들 대사물질을 생합성 및 축적하기 위해 성공적으로 조작될 수 있음이 명백하지 않다.
하나의 예로서, 고유 식물 숙주에서, 효소 BBE는 동적 세포하 국재화를 갖는다고 보고된다. 특히, 효소 BBE는 초기에 ER에서 출발하고 그 다음 액포로 분류된다 (Bird and Facchini.2001.Planta.213:888-97).식물에서 BBE의 ER-회합이 하기를 제공한다는 것이 시사되었다 (Alcantara, 등 2005.Plant Physiol.138:173-83) BBE 활성에 대하여 최적의 염기성 pH (pH ~8.8) (Ziegler and Facchini.2008.Annu.Rev.Plant Biol.59:735-69).또 다른 예로서, 식물 세포 내의 특화된 소포에서 산구이나린 생합성이 발생한다는 증거가 있다 (Amann, 등 1986.Planta.167:310-20) (그러나 중간체의 단지 일부가 소포에서 축적한다).이는 다른 효소 활성 및/또는 독성 효과로부터 이들을 격리시키기 위해 발생할 수 있다.
또 다른 예로서, 모르피난 경로 분지에서 생합성 효소는 모두 식물내 혈관 조직의 일부인 체관부에 국재화된다. 체관부에서, 경로 효소는 2 세포 유형 사이에서 추가로 분할될 수 있다: 모든 식물에 공통인 체 요소, 및 특화된 세포 유형인 유관은 특화된 2차 대사물질을 만드는 특정 식물에서만 존재한다. 업스트림 효소 (즉, NCS부터 SalAT까지)는 체 요소에서 우세하고, 다운스트림 효소 (즉, T6ODM, COR, CODM)는 주로 유관에서이다 (Onoyovwe, 등 2013.Plant Cell.25:4110-22). 추가적으로, 노스카핀 생합성 경로에서 최종 단계가 유관에서 발생한다는 것이 발견되었다 (Chen and Facchini.2014.Plant J.77:173-84). 양귀비 유관 미세환경의 성질이 여전히 조사중이어도, 상기 구획화는 중간체의 단리 또는 추적, 최적의 pH 제공, 보조인자의 공급 향상에 의해 생합성 조절에 크게 중요할 것으로 고려된다 (Ziegler and Facchini.2008.Annu.Rev.Plant Biol.59:735-69). 추가로, 몇 개의 효소가 식물 2차 대사에 공통인 다중-효소 복합체 또는 대사성 채널로서 기능할 수 있다는 것이 예상된다 (Kempe, 등 2009.Phytochemistry.70:579-89; Allen, 등 2004.Nat.Biotechnol.22:1559-66). 생합성 효소가 상이한 숙주로부터 조합되고/되거나 이종 효모 세포에서 재조합으로 발현된 경우 이들 복합체 또는 채널이 고유 숙주에서 그대로 형성할 것이 명확하지 않다. 추가의 예에서, 콥티스 야포니카에서, 베르베린은 뿌리 조직에서 생합성되고 그 다음 특화된 ATP-결합 카세트 수송 단백질의 작용을 통해 근경 내에서 축적된다 (Shitan, 등 2013.Phytochemistry.91:109-16).오피엄 파피에서, 모르피난 알칼로이드는 라텍스 (유관 세포의 세포질) 내에서 축적된다 (Martin, 등 1967.Biochemistry.6:2355-63).
추가로, 심지어 이들 고려사항들 없이, 또한 본원에서 기재된 경로에서 몇 개의 단계에 대한 식물 효소가 아직 특성화되지 않은 사례가 있다. 예를 들어, 티로신의 초기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 스캐폴드 노르코클라우린으로의 전환이 아직 특성화되지 않았다. 추가적으로, 나르코톨린의 노스카핀으로의 전환이 본원에서 기재된 바와 같이 불과 최근에 특성화되었다. 따라서, 본원에서 기재된 경로에서 몇 개의 단계 동안, 대안적인 생합성 도식은 바이어스의 생합성에 대하여 자연에서 함께 정상적으로 발생하지 않은 효소 활성을 맺어줌으로써 또는 재구성된 경로에서 사용하기 위해 게놈 서열 정보로부터 신규 효소 활성을 확인함으로써 생산되었다.
예를 들어, 티로신의 도파민으로의 2-단계 전환은, 자연적으로 함께 발생하지 않고 상기 경로의 맥락에서 또는 식물 효소와 기능하도록 방출되지 않았던, 적어도 5 포유동물 효소 및 1 박테리아 효소를 조합함으로써 달성될 수 있다. 이들 사례에서, 이들이 자연에서 방출되지 않았던 및 이들이 이종 미생물 숙주 및 상기 경로의 맥락에서 효과적으로 기능할 화합물의 생합성을 위하여 이들 효소를 이용하는 것이 명백할 수 없다. 또 다른 예로서, 나르코톨린의 노스카핀으로의 전환을 책임지는 효소는 미공지되었다. 식물체내 조사가 상기 전환에서 관여된 PsMT2를 지시하여도, PsMT2 자체는 노스카핀을 제공하기 위해 나르코톨린을 메틸화시킬 수 없다. 본원에서 논의된 바와 같이 신규 효소 복합체는 효모에서 및 합성 BIA 경로의 맥락에서 상기 O-메틸화 반응을 수행한다. Ps6OMT와 PsMT3 사이에서 높은 서열 유사성 때문에, 식물에서 기능성 PsMT2/PsMT3 효소 복합체를 발견하는 것은 어려웠을 것이다. 효모에서 깨끗한 효소 배경은 본원에서 언급된 바와 같이 가능한 나르코톨린 4'-O-메틸전달효소로서 PsMT2/PsMT3 이종이량체를 발견한다.
관심 바이어스 및/또는 관심 효소를 생산하기 위해 변형의 목적인 유전자의 예는 아래 논의된다. 추가적으로, 유전자는 관심 바이어스 및/또는 관심 효소의 생성에서 사용되는 경로를 예시하는 일련의 도 의 맥락에서 논의된다.
[ TLK1 ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 트란스케톨라제의 발현을 변형시킬 수 있다. 트란스케톨라제는 TKL1 유전자에 의해 인코딩된다. 예에서, 트란스케톨라제는, 도 16에서 참조된 바와 같이, 푸룩토오스-6-포스페이트 + 글리세르알데하이드-3-포스페이트 ↔ 크실룰로스-5-포스페이트 + 에리트로스-4-포스페이트의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 TKL1 유전자의 구성적 과발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 TKL1 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 TKL1 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 TKL1 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. TKL1 유전자는 사카로마이세스 세레비지애 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, TKL1 유전자는 자연 발생 유전자와 100% 유사할 수 있다.
[ ZWF1 ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소는 ZWF1 유전자에 의해 인코딩된다. 예에서, 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소는, 도 16에서 참조된 바와 같이, 글루코오스-6-포스페이트 →6-포스포글루코노락톤의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 ZWF1 유전자의 코딩 영역을 결실하도록 변형될 수 있다. 대안적으로, 조작된 숙주 세포는, 예컨대 불활성화 돌연변이를 도입함으로써, ZWF1 유전자의 작용기를 무능하게 하도록 변형될 수 있다.
[ ARO4 ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 3-데옥시-D-아라비노-헤툴로소네이트-7-포스페이트 (DAHP) 합성효소의 발현을 변형시킬 수 있다. DAHP 합성효소는 ARO4 유전자에 의해 인코딩된다. 예에서, DAHP 합성효소는, 도 16에서 참조된 바와 같이, 에리트로스-4-포스페이트 + 포스포에놀피루브산 →DAHP의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 하나 이상의 피드백 억제 완화 돌연변이를 편입시키기 위해 ARO4 유전자를 변형시킬 수 있다. 특히, 피드백 억제 완화 돌연변이 (예를 들면, ARO4FBR)는 최초 유전자좌에서 고유 ARO4 유전자에 대한 유도된 돌연변이로서; 분리된 유전자좌에서 유전적 통합으로서 도입된 추가의 복사본으로서; 또는 에피솜 벡터 예컨대 2-μm 또는 동원체 플라스미드에서 추가의 복사본으로서 편입될 수 있다. 돌연변이 ARO4FBR에서 식별자 “FBR”은 피드백 내성 돌연변이체 및 돌연변이를 지칭한다. DAHP 합성효소 효소의 피드백 저해된 복사본은, 예컨대 조작된 숙주 세포가 효모 세포인 경우, 고유 효모 전사 조절하일 수 있다. 대안적으로, DAHP 합성효소 효소의 피드백 저해된 복사본은 합성 프로모터의 관리하에 배치됨으로써 단백질 발현의 조작된 구성적 또는 동적 조절을 갖는 조작된 숙주 세포에 도입될 수 있다. 일부 경우에서, ARO4 유전자는 사카로마이세스 세레비지애로부터 유도될 수 있다. 일부 경우에서, ARO4 유전자는 자연 발생 유전자와 100% 유사할 수 있다. ARO4 유전자에 대한 변형의 예는 피드백 억제 내성 돌연변이, K229L, 또는 Q166K를 포함한다.
[ ARO7 ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 코리스메이트 뮤타제의 발현을 변형시킬 수 있다. 코리스메이트 뮤타제는 ARO7 유전자에 의해 인코딩된다. 예에서, 코리스메이트 뮤타제는, 도 16에서 참조된 바와 같이, 코리스메이트 →프레페네이트의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 하나 이상의 피드백 억제 완화 돌연변이를 편입하기 위해 ARO7 유전자를 변형시킬 수 있다. 특히, 피드백 억제 완화 돌연변이 (예를 들면, ARO7FBR)는 최초 유전자좌에서 고유 ARO7 유전자에 대한 유도된 돌연변이로서; 분리된 유전자좌에서 유전적 통합으로서 도입된 추가의 복사본으로서; 또는 에피솜 벡터 예컨대 2-μm 또는 동원체 플라스미드에서 추가의 복사본으로서 편입될 수 있다. 돌연변이 ARO7FBR에서 식별자 “FBR”은 피드백 내성 돌연변이체 및 돌연변이를 지칭한다. 코리스메이트 뮤타제 효소의 피드백 저해된 복사본은 예컨대 조작된 숙주 세포가 효모 세포인 경우 고유 효모 전사 조절하일 수 있다. 대안적으로, 코리스메이트 뮤타제 효소의 피드백 저해된 복사본은 합성 프로모터의 관리하에 배치함으로써 단백질 발현의 조작된 구성적 또는 동적 조절을 갖는 조작된 숙주 세포에 도입될 수 있다. 일부 경우에서, ARO7 유전자는 사카로마이세스 세레비지애로부터 유도될 수 있다. 일부 경우에서, ARO7 유전자는 자연 발생 유전자와 100% 유사할 수 있다. ARO7 유전자에 대한 변형의 예는 피드백 억제 내성 돌연변이 또는 T226I을 포함한다.
[ ARO10 ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 페닐피루베이트 탈탄산효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 페닐피루베이트 탈탄산효소는 ARO10 유전자에 의해 인코딩된다. 예에서, 페닐피루베이트 탈탄산효소는 도 16에서 참조된 바와 같이 하이드록시페닐피루베이트 →4-하이드록시페닐아세테이트 (4HPA)의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 ARO10 유전자의 구성적 과발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 ARO10 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 ARO10 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포내에 ARO10 유전자의 과발현에 대한 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. ARO10 유전자는 사카로마이세스 세레비지애 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, ARO10 유전자는 자연 발생 유전자와 100% 유사할 수 있다.
[ ARO9 ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 방향족 아미노기전달효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 방향족 아미노기전달효소는 ARO9 유전자에 의해 인코딩된다. 예에서, 방향족 아미노기전달효소는 도 16에서 참조된 바와 같이 하이드록시페닐피루베이트 + 글루타메이트 →티로신 + 알파-케토글루테레이트의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 ARO9 유전자의 구성적 과발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 ARO9 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 ARO9 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 ARO9 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. ARO9 유전자는 사카로마이세스 세레비지애 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, ARO9 유전자는 자연 발생 유전자와 100% 유사할 수 있다.
[ TyrH ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 티로신 하이드록실라제의 발현을 변형시킬 수 있다. 티로신 하이드록실라제는 TyrH 유전자에 의해 인코딩된다. 예에서, 티로신 하이드록실라제는 도 16 및 17에서 참조된 바와 같이 티로신 →L-DOPA의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 TyrH 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 TyrH 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 TyrH 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 TyrH 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. TyrH 유전자는 호모사피엔스, 래투스 노르베기쿠스 , 무스 무스큘러스 , 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, TyrH 유전자는 자연 발생 유전자와 100% 유사할 수 있다.
[ DODC ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 L-DOPA 탈탄산효소의 발현을 변형시킬 수 있다. L-DOPA 탈탄산효소는 DODC 유전자에 의해 인코딩된다. 예에서, L-DOPA 탈탄산효소는 도 16 및 17에서 참조된 바와 같이 L-DOPA →도파민의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 DODC 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 DODC 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 DODC 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 DODC 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. DODC 유전자는 슈도모나스 푸티다 , 래투스 노르베기쿠스 , 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, DODC 유전자는 자연 발생 유전자와 100% 유사할 수 있다.
[ NCS ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 노르코클라우린 합성효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 노르코클라우린 합성효소는 NCS 유전자에 의해 인코딩된다. 예에서, 노르코클라우린 합성효소는 도 17에서 참조된 바와 같이 4HPA + 도파민→(S)-노르코클라우린의 반응을 촉매화한다. 특히, 도17은, 본 발명의 구현예에 따라서, 노르코클라우린을 통해 L-티로신의 레티쿨린으로의 전환용 생합성 도식을 예시한다. 도17은 하기의 용도를 제공한다: 효소 TyrH, 티로신 하이드록실라제; DODC, DOPA 탈탄산효소; 본원에서 논의된 바와 같이, NCS, 노르코클라우린 합성효소; 6OMT, 6-O-메틸전달효소; CNMT, 콕라우린 N-메틸전달효소; CYP80B1, 사이토크롬 P450 80B1; CPR, 사이토크롬 P450 NADPH 환원효소; 4'OMT, 3'하이드록시-N-메틸콕라우린 4'-O-메틸전달효소. L-DOPA, L-3,4-디하이드록시페닐알라닌; 및 4-HPA, 4-하이드록시페닐아세틸알데하이드. 하기에서 예시되는 효소 중에서: 도17, 4-HPA 및 L-티로신은 효모에서 자연적으로 합성된다. 나타난 모든 다른 대사물질은 효모에서 자연적으로 생산되지 않는다. 추가적으로, TyrH가 L-티로신의 L-DOPA로의 전환 촉매화로서 묘사되어도, 다른 효소는 또한 명세서에서 기재된 바와 같이 이러한 단계를 수행하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 티로시나제는 또한 L-티로신의 L-DOPA의 전환을 수행하도록 사용될 수 있다. 또한, 다른 효소 예컨대 사이토크롬 P450 옥시다제는 또한 L-티로신의 L-DOPA로의 전환을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 상기 효소는 L-DOPA 및 L-티로신을 포함한 관련된 BIA 전구체 화합물에서 옥시다제 활성을 나타낼 수 있다.
추가적으로, 노르코클라우린 합성효소는 도 18에서 참조된 바와 같이 3,4-DHPA + 도파민→(S)-노르라우다노솔린의 반응을 촉매화한다. 특히, 도18은, 본 발명의 구현예에 따라서, 노르라우다노솔린을 통해 L-티로신의 레티쿨린으로의 전환용 생합성 도식을 예시한다. 도18은 하기의 용도를 제공한다: 효소 TyrH, 티로신 하이드록실라제; DODC, DOPA 탈탄산효소; maoA, 모노아민 옥시다제; NCS, 노르코클라우린 합성효소; 6OMT, 6-O-메틸전달효소; CNMT, 콕라우린 N-메틸전달효소; 4'OMT, 3'하이드록시-N-메틸콕라우린 4'-O-메틸전달효소. L-DOPA, L-3,4-디하이드록시페닐알라닌; 및 3,4-DHPA, 3,4-디하이드록시페닐아세트알데하이드. 도 18에서 예시되는 효소 중에서, L-티로신은 효모에서 자연적으로 합성된다. 도 18에서 보여준 다른 대사물질은 효모에서 자연적으로 생산되지 않는다.
조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 NCS 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 NCS 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 NCS 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 NCS 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로, 노르코클라우린 합성효소는 N-말단 절단을 가질 수 있다. 일부 경우에서, NCS 유전자는 사카로마이세스 세레비지애에서 발현에 코돈 최적화될 수 있다. NCS 유전자는 콥티스 야포니카 , 파파베르 솜니페럼 , 파파베르 브락테아툼 , 탈리시툼 플라붐 , 코리달리스 삭시콜라 , 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, NCS 유전자는 자연 발생 유전자와 80% 유사할 수 있다.
[ 6OMT ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 노르코클라우린 6-O-메틸전달효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 노르코클라우린 6-O-메틸전달효소는 6OMT 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 예에서, 노르코클라우린 6-O-메틸전달효소는 도 17에서 참조된 바와 같이 노르코클라우린 →콕라우린의 반응을 촉매화한다. 다른 예에서, 노르코클라우린 6-O-메틸전달효소는 노르라우다노솔린 →3'하이드록시콕라우린의 반응, 뿐만 아니라 본원에서 상세한 다른 반응, 예컨대 도 18에서 제공된 것을 촉매화한다. 추가적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 6OMT 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 6OMT 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 6OMT 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 6OMT 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. 6OMT 유전자는 P. 솜니페룸 , T. 플라붐 , 콥티스 야포니카, 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, 6OMT 유전자는 자연 발생 유전자와 100% 유사할 수 있다.
[ CNMT ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 콕라우린-N-메틸전달효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 콕라우린-N-메틸전달효소는 CNMT 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 예에서, 콕라우린-N-메틸전달효소는 도 17에서 참조된 바와 같이 콕라우린→N-메틸콕라우린의 반응을 촉매화한다. 다른 예에서, 콕라우린-N-메틸전달효소 효소는 3'하이드록시콕라우린 →3'하이드록시-N-메틸콕라우린의 반응을 촉매화할 수 있다. 다른 예에서, 콕라우린-N-메틸전달효소는 본원에서 상세한 다른 반응, 예컨대 도 18에서 제공된 것을 촉매화할 수 있다. 추가적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 CNMT 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 CNMT 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 CNMT 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 CNMT 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. CNMT 유전자는 P. 솜니페룸 , T. 플라붐 , 콥티스 야포니카, 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, CNMT 유전자는 자연 발생 유전자와 100% 유사할 수 있다.
[ 4'OMT ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 4'-O-메틸전달효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 4'-O-메틸전달효소는 4'OMT 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 예에서, 4'-O-메틸전달효소는 도 17에서 참조된 바와 같이 3'-하이드록시-N-메틸콕라우린→레티쿨린의 반응을 촉매화한다. 다른 예에서, 4'-O-메틸전달효소는 본원에서 상세한 다른 반응, 예컨대 도 18에서 제공된 것을 촉매화한다. 추가적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 4'OMT 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 4'OMT 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 4'OMT 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 4'OMT 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. 4'OMT 유전자는 P. 솜니페룸 , T. 플라붐, 콥티스 야포니카, 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, 4'OMT 유전자는 자연 발생 유전자와 100% 유사할 수 있다.
[ CYP80B1 ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 사이토크롬 P450 80B1의 발현을 변형시킬 수 있다. 사이토크롬 P450 80B1은 CYP80B1 유전자에 의해 인코딩된다. 예에서, 사이토크롬 P450 80B1은 도 17에서 참조된 바와 같이 N-메틸콕라우린→3'-하이드록시-N-메틸콕라우린의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 사이토크롬 P450 80B1 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 사이토크롬 P450 80B1 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 사이토크롬 P450 80B1 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 사이토크롬 P450 80B1 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에서, CYP80B1 유전자는 사카로마이세스 세레비지애에서 발현에 코돈 최적화될 수 있다. 사이토크롬 P450 80B1 유전자는 P. 솜니페룸 , E. 칼리포르니카 , T. 플라붐 , 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, P450 80B1 유전자는 자연 발생 유전자와 77% 유사할 수 있다.
[ PTPS ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 6-피루보일 테트라하이드로바이오프테린 (PTP) 합성효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 피루보일 테트라하이드로바이오프테린 합성효소는 PTPS 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 예에서, 6-피루보일 테트라하이드로바이오프테린 합성효소는 도 19에서 참조된 바와 같이 디하이드로네오프테린 삼인산 →PTP의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 PTPS 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 PTPS 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 PTPS 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 PTPS 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에서, PTPS 유전자는 사카로마이세스 세레비지애에서 발현을 위하여 코돈 최적화될 수 있다. PTPS 유전자는 래투스 노르베기쿠스 , 호모사피엔스 , Mus 무스큘러스, 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, PTPS 유전자는 자연 발생 유전자와 80% 유사할 수 있다.
[ SepR ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 세피아프테린 환원효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 세피아프테린 환원효소는 SepR 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 예에서, 세피아프테린 환원효소는 도 19에서 참조된 바와 같이 PTP→BH4의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 SepR 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 SepR 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 SepR 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 SepR 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에서, SepR 유전자는 사카로마이세스 세레비지애에서 발현을 위하여 코돈 최적화될 수 있다. SepR 유전자는 래투스 노르베기쿠스 , 호모사피엔스 , 무스 무스큘러스, 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, SepR 유전자는 자연 발생 유전자와 72% 유사할 수 있다.
[ PCD ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 4a-하이드록시테트라하이드로바이오프테린 (프테린-4α-카비놀아민) 탈수효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 4a-하이드록시테트라하이드로바이오프테린 탈수효소는 PCD 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 예에서, 4a-하이드록시테트라하이드로바이오프테린 탈수효소는 도 19에서 참조된 바와 같이 4a-하이드록시테트라하이드로바이오프테린→H2O + 퀴노노이드 디하이드로프테리딘의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 PCD 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 PCD 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 PCD 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형시킬 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 PCD 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에서, PCD 유전자는 사카로마이세스 세레비지애에서 발현을 위하여 코돈 최적화될 수 있다. PCD 유전자는 래투스 노르베기쿠스 , 호모사피엔스 , 무스 무스큘러스, 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, PCD 유전자는 자연 발생 유전자와 79% 유사할 수 있다.
[ QDHPR ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 퀴노노이드 디하이드로프테리딘 환원효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 퀴노노이드 디하이드로프테리딘 환원효소는 QDHPR 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 예에서, 퀴노노이드 디하이드로프테리딘 환원효소는 도 19에서 참조된 바와 같이 퀴노노이드 디하이드로프테리딘→BH4의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 QDHPR 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 QDHPR 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 QDHPR 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 QDHPR 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에서, QDHPR 유전자는 사카로마이세스 세레비지애에서 발현을 위하여 코돈 최적화될 수 있다. QDHPR 유전자는 래투스 노르베기쿠스 , 호모사피엔스 , 무스 무스큘러스, 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, QDHPR 유전자는 자연 발생 유전자와 75% 유사할 수 있다.
[ DHFR ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 디하이드로폴레이트 환원효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 디하이드로폴레이트 환원효소는 DHFR 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 예에서, 디하이드로폴레이트 환원효소는 도 19에서 참조된 바와 같이 7,8-디하이드로바이오프테린 (BH2)→5,6,7,8-테트라하이드로바이오프테린 (BH4)의 반응을 촉매화한다. 상이기 반응은 도 17에서 예시된 바와 같이 티로신의 L-DOPA로의 전환용 보조-기질로서 BH4의 회수에 유용할 수 있다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 DHFR 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 DHFR 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 DHFR 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 DHFR 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에서, DHFR 유전자는 사카로마이세스 세레비지애에서 발현을 위하여 코돈 최적화될 수 있다. DHFR 유전자 래투스 노르베기쿠스 , 호모사피엔스, 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, DHFR 유전자는 자연 발생 유전자와 77% 유사할 수 있다.
[CPR] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 사이토크롬 P450 환원효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 사이토크롬 P450 환원효소는 다른 반응 예컨대 출원 전반에 걸쳐 도에서 기재된 것을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 CPR 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 CPR 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 CPR 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 CPR 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. CPR 유전자는 E. 칼리포르니카 , P. 솜니페룸 , H. 사피엔스, S. 세레비지애 , A. 탈리아나 , 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, CPR 유전자는 자연 발생 유전자와 100% 유사할 수 있다.
[ BBE ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 베르베린 브릿지 효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 베르베린 브릿지 효소는 BBE 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 예에서, 베르베린 브릿지 효소는 도 20에서 참조된 바와 같이 (S)-레티쿨린→(S)-스코울레린의 반응을 촉매화한다. 도20은, 본 발명의 구현예에 따라서, L-티로신의 프로토베르베린 알칼로이드로의 전환용 생합성 도식을 예시한다. 특히, 도 20은 하기의 용도를 제공한다: 효소 BBE, 베르베린 브릿지 효소; S9OMT, 스코울레린 9-O-메틸전달효소; CAS, 카나딘 합성효소; CPR, 사이토크롬 P450 환원효소; 및 STOX, 테트라하이드로프로토베르베린 옥시다제. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 BBE 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 BBE 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 BBE 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 BBE 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. BBE 유전자는 파파베르 솜니페럼 , 아르게모네 멕시카나 , 캘리포니아 양귀비 , 베르베리스 스톨로니 페라, 탈릭트룸 플라붐 subsp . 글라우쿰 , 콥티스 야포니카 , 파파베르 spp., 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, BBE 유전자는 자연 발생 유전자와 99% 유사할 수 있다.
[ S9OMT ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 S-아데노실-L-메티오닌:( S)-스코울레린 9-O-메틸전달효소의 발현을 변형시킬 수 있다. S-아데노실-L-메티오닌:( S)-스코울레린 9-O-메틸전달효소는 S9OMT 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 예에서, S-아데노실-L-메티오닌:( S)-스코울레린 9-O-메틸전달효소는 도 20에서 참조된 바와 같이 S-아데노실-L-메티오닌 + (S)-스코울레린→S-아데노실-L-호모시스테인 + (S)-테트라하이드로콜룸바민의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 S9OMT 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 S9OMT 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 S9OMT 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 S9OMT 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에서, S9OMT 유전자는 사카로마이세스 세레비지애에서 발현을 위하여 코돈 최적화될 수 있다. S9OMT 유전자는 하기로부터 유도될 수 있다: 탈릭트룸 플라붐 subsp . 글라우쿰 , 콥티스 야포니카 , 콥티스 차이넨시스 , 파파베르 솜 니페럼, 탈릭트룸 spp ., 콥티스 spp ., 파파베르 spp ., 또는 또 다른 종.일부 예에서, S9OMT 유전자는 자연 발생 유전자와 100% 유사할 수 있다. 예에서, S9OMT 유전자는 자연 발생 유전자와 80% 유사할 수 있다.
[CAS] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 (S)-카나딘 합성효소의 발현을 변형시킬 수 있다. (S)-카나딘 합성효소는 CAS 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 예에서, (S)-카나딘 합성효소는 도 20에서 참조된 바와 같이 (S)-테트라하이드로콜룸바민→(S)-카나딘의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 CAS 유전자를 발현하도록 변형될 수 있다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 CAS 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 CAS 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 CAS 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 CAS 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. CAS 유전자는 하기로부터 유도될 수 있다: 탈릭트룸 플라붐 subsp . 글라우쿰 , 콥티스 야포니카 , 탈릭트룸 spp., 콥티스 spp., 또는 또 다른 종.일부 예에서, CAS 유전자는 자연 발생 유전자와 100% 유사할 수 있다.
[ TNMT ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 테트라하이드로프로토베르베린-N-메틸전달효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 테트라하이드로프로토베르베린-N-메틸전달효소는 TNMT 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 예에서, 테트라하이드로프로토베르베린-N-메틸전달효소는 도 21에서 참조된 바와 같이 카나딘→N-메틸카나딘의 반응을 촉매화한다. 도21은, 본 발명의 구현예에 따라서, L-티로신의 노스카핀, 노스캐피노이드, 및 프탈리드이소퀴놀린으로의 전환용 생합성 도식을 예시한다. 특히, 도21은 하기의 용도를 제공한다: 효소 BBE, 베르베린 브릿지 효소; S9OMT, 스코울레린 9-O-메틸전달효소; CAS, 카나딘 합성효소; CPR, 사이토크롬 P450 환원효소; TNMT, 테트라하이드로프로토베르베린 시스-N-메틸전달효소; CYP82Y1, N-메틸카나딘 1-하이드록실라제; CYP82X2, 1-하이드록시-N-메틸카나딘 13-하이드록실라제; AT1, 1,13-디하이드록시-N-메틸candine 13-O-아세틸전달효소; CYP82X1, 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신 합성효소; CXE1, 나르코틴 헤미아세탈 합성효소; NOS (또는 SDR1), 노스카핀 합성효소; MT2, 나르코톨린-4'-O-메틸트란스퍼라제 1; MT3, 나르코톨린-4'-O-메틸전달효소 2; 및 6OMT, 6-O-메틸전달효소.
다른 예에서, 테트라하이드로프로토베르베린-N-메틸전달효소는 도 22에서 참조된 바와 같이 스틸로핀→시스-N-메틸스틸로핀의 반응을 촉매화한다. 도22는, 본 발명의 구현예에 따라서, L-티로신의 산구이나린 및 벤조펜안트리딘 알칼로이드로의 전환용 생합성 도식을 예시한다. 특히, 도22는 하기의 용도를 제공한다: 효소 BBE, 베르베린 브릿지 효소; CFS, 체일란티폴린 합성효소; STS, 스틸로핀 합성효소; TNMT, 테트라하이드로베르베린 N-메틸전달효소; MSH, 시스-N-메틸스틸로핀 14-하이드록실라제; P6H, 프로토핀 6-하이드록실라제; 및 DBOX, 디하이드로벤조페난트리드 옥시다제. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 TNMT 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 TNMT 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 TNMT 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 TNMT 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에서, TNMT 유전자는 사카로마이세스 세레비지애에서 발현을 위하여 코돈 최적화될 수 있다. TNMT 유전자는 파파베르 솜니페럼 , 캘리포니아 양귀비 , 파파베르 브락테아툼 , 아르게모네 멕시카나 , 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, TNMT 유전자는 자연 발생 유전자와 100% 유사할 수 있다. 예에서, TNMT 유전자는 자연 발생 유전자와 81% 유사할 수 있다.
[ CYP82Y1 ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 N-메틸카나딘→1-하이드록실라제의 발현을 변형시킬 수 있다. N-메틸카나딘 1-하이드록실라제는 CYP82Y1 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 예에서, N-메틸카나딘 1-하이드록실라제는 도 21에서 참조된 바와 같이 N-메틸카나딘 1-하이드록시-N-메틸카나딘의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 CYP82Y1 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 CYP82Y1 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 CYP82Y1 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 CYP82Y1 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에서, CYP82Y1 유전자는 사카로마이세스 세레비지애에서 발현을 위하여 코돈 최적화될 수 있다. 일부 예에서 CYP82Y1은 N-말단에서 변형될 수 있다. CYP82Y1 유전자는 하기로부터 유도될 수 있다: 파파베르 솜니페럼 , 파파베르 spp., 플란타고 아레나리아 , 라우울피아 헤테로필라 , 아들루미아 푼고사 , 하이드라스티스 카나덴시스 , 스틸로메콘 헤테로필라 , 히페코움 , 또는 또 다른 종.일부 예에서, CYP82Y1 유전자는 자연 발생 유전자와 70-78% 유사할 수 있다.
[ CYP82X2 ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 1-하이드록시-N-메틸카나딘 13-하이드록실라제의 발현을 변형시킬 수 있다. 1-하이드록시-N-메틸카나딘 13-하이드록실라제는 CYP82X2 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 예에서, 1-하이드록시-N-메틸카나딘 13-하이드록실라제는 하기의 반응을 촉매화한다: 1-하이드록시-N-메틸카나딘 →1-하이드록시-N-메틸로피오카르핀 (즉1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘), 도 21에서 참조된 바와 같이. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 CYP82X2 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 CYP82X2 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 CYP82X2 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 CYP82X2 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에서, CYP82X2 유전자는 사카로마이세스 세레비지애에서 발현을 위하여 코돈 최적화될 수 있다. 일부 예에서 CYP82X2는 N-말단에서 변형될 수 있다. CYP82X2 유전자는 하기로부터 유도될 수 있다: P. 솜니페룸 , 파파베르 spp , 플란타고 아레나리아 , 라우울피아 헤테로필라 , 아들루미아 푼고사 , 하이드라스티스 카나덴시스 , 스틸로메콘 헤테로필라 , 닥틸리카프노스 토룰로사 , 글라우시움 플라붐 , 베르베리스 라우리나 , B. 불가리스, 코리달리스 spp , 푸마리아 spp , 닥틸리카프노스 spp., 또는 또 다른 종.일부 예에서, CYP82X2 유전자는 자연 발생 유전자와 70-77% 유사하다. 다른 예에서, CYP82X2 유전자는 N-말단 조작을 경험할 수 있다. 예에서, N-말단 조작은 N-말단 절단을 포함할 수 있다.
[ CYP82X1 ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신 합성효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신 합성효소는 CYP82X1 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 예에서, 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신 합성효소는 도 21에서 참조된 바와 같이 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘→4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신의 반응을 촉매화한다. 추가적으로, CYP82X1은 1-하이드록시-N-메틸카나딘 →4'-O-데스메틸마크란트알데하이드의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 CYP82X1 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 CYP82X1 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 CYP82X1 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 CYP82X1 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에서, CYP82X1 유전자는 사카로마이세스 세레비지애에서 발현을 위하여 코돈 최적화될 수 있다. 일부 예에서 CYP82X1은 N-말단에서 변형될 수 있다. CYP82X1 유전자는 하기로부터 유도될 수 있다: 파파베르 솜니페럼 , 파파베르 spp., 플란타고 아레나리아 , 라우울피아 헤테로필라 , 아들루미아 푼고사 , 하이드라스티스 카나덴시스, 스틸로메콘 헤테로필라 , 히페코움 , 또는 또 다른 종.일부 예에서, CYP82X1 유전자는 자연 발생 유전자와 be 71-77% 유사할 수 있다. 다른 예에서, CYP82X1 유전자는 N-말단 조작을 경험할 수 있다. 예에서, N-말단 조작은 N-말단 절단을 포함할 수 있다.
[MT2 및 MT3] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 나르코톨린 4'-O-메틸라제의 발현을 변형시킬 수 있다. 나르코톨린 4'-O-메틸라제는 MT2 및 MT3 유전자에 의해 인코딩된 O-메틸전달효소 모노머에 의해 형성된 이종이량체이다. 일부 예에서, 나르코톨린 4'-O-메틸라제는 도 2에서 참조된 바와 같이 나르코톨린→노스카핀의 반응을 촉매화한다. 추가적으로, 나르코톨린 4'-O-메틸라제는 나르코톨린네헤미아세탈 →나르코틴헤미아세탈 및 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신 →3-O-아세틸파파베록신의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 MT2 및 MT3 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 MT2 및 MT3 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 MT2 및 MT3 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 MT2 및 MT3 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에서, MT2 및 MT3 유전자는 사카로마이세스 세레비지애에서 발현을 위하여 코돈 최적화될 수 있다. MT2 및 MT3 유전자는 P. 솜니페룸 , 파파베르 spp , 푸마리아 파르비플로라 , 플란타고 아레나리아 , 라우울피아 헤테로필라 , 또는 또 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, MT2 및 MT3 유전자는 자연 발생 유전자와 각각, 80% 및 79% 유사할 수 있다. 일부 예에서, Ps6OMT는 MT3으로 치환될 수 있다.
[AT1] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 1, 13-디하이드록시-N-메틸카나딘 13-O 아세틸 전달효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 1, 13-디하이드록시-N-메틸카나딘 13-O 아세틸전달효소는 AT1 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 예에서, 1, 13-디하이드록시-N-메틸카나딘 13-O→아세틸전달효소는 도 2에서 참조된 바와 같이 1, 13-디하이드록시-N-메틸카나딘 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘의 반응을 촉매화한다. 도2는, 본 발명의 구현예에 따라서, 카나딘의 노스카핀으로의 전환용 생합성 도식을 예시한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 AT1 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 AT1 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 AT1 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 AT1 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에서, AT1 유전자는 사카로마이세스 세레비지애에서 발현을 위하여 코돈 최적화될 수 있다. AT1 유전자는 하기로부터 유도될 수 있다: P. 솜니페룸 , 파파베르 spp , 플란타고 아레나리아 , 라우울피아 헤테로필라 , 아들루미아 푼고사 , 하이드라스티스 카나덴시스 , 스틸로메콘 헤테로필라 , 히페코움 렙토카르품 , 닥틸리카프노스 토룰로사 , 글라우시움 플라붐 , 베르베리스 라우리나 , B. 불가리스, 코리달리스 spp , 푸마리아 spp , 닥틸리카프노스 spp , 또는 또 다른 종.일부 예에서, AT1 유전자는 자연 발생 유전자와 81% 유사할 수 있다.
[ CXE1 또는 CXE2 ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 나르코틴헤미아세탈 합성효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 나르코틴헤미아세탈 합성효소는 CXE1 유전자에 의해 인코딩된다. CXE2 유전자에 의해 인코딩된 효소는 나르코틴헤미아세탈 합성효소로서 또한 기능할 수 있다. 일부 예에서, 나르코틴헤미아세탈 합성효소는 도 2에서 참조된 바와 같이 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신→나르코톨린헤미아세탈 및 3-O-아세틸파파베록신→나르코틴헤미아세탈의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 CXE1 또는 CXE2 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 CXE1 또는 CXE2 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 CXE1 또는 CXE2 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 CXE1 또는 CXE2 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에서, CXE1 또는 CXE2 유전자는 사카로마이세스 세레비지애에서 발현을 위하여 코돈 최적화될 수 있다. CXE1 또는 CXE2 유전자는 하기로부터 유도될 수 있다: P. 솜니페룸 , 파파베르 spp , 플란타고 아레나리아 , 라우울피아 헤테로필라 , 아들루미아 푼고사 , 하이드라스티스 카나덴시스 , 스틸로메콘 헤테로필라 , 히페코움 렙토카르품 , 닥틸리카프노스 토룰로사 , 글라우시움 플라붐 , 베르베리스 라우리나 , B. 불가리스, 코리달리스 spp , 푸마리아 spp , 닥틸리카프노스 spp , 또는 또 다른 종.일부 예에서, CXE1 유전자 또는 CXE2 유전자는 자연 발생 유전자와 78% 유사할 수 있다.
[ SDR1 ] 일부 예에서, 조작된 숙주 세포는 효소 노스카핀 합성효소의 발현을 변형시킬 수 있다. 노스카핀 합성효소는 SDR1 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 예에서, 노스카핀 합성효소는 도 2에서 참조된 바와 같이 나르코톨린헤미아세탈 →나르코톨린의 반응을 촉매화한다. 추가적으로, 노스카핀 합성효소는 나르코틴헤미아세탈 →노스카핀의 반응을 촉매화한다. 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 SDR1 유전자의 구성적 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포에서 SDR1 유전자의 발현을 합성으로 조절하도록 변형될 수 있다. 예에서, 조작된 숙주 세포는 SDR1 유전자의 복사본, 복사본들, 또는 추가의 복사본을 편입하도록 변형될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 내에 SDR1 유전자의 과발현을 위하여 강한 프로모터 요소의 도입을 편입하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에서, SDR1 유전자는 사카로마이세스 세레비지애에서 발현을 위하여 코돈 최적화될 수 있다. SDR1 유전자는 하기로부터 유도될 수 있다: P. 솜니페룸 , 파파베르 spp , 플란타고 아레나리아 , 라우울피아 헤테로필라 , 아들루미아 푼고사 , 하이드라스티스 카나덴시스 , 스틸로메콘 헤테로필라 , 히페코움 렙토카르품 , 닥틸리카프노스 토룰로사 , 글라우시움 플라붐 , 베르베리스 라우리나 , B. 불가리스, 코리달리스 spp , 푸마리아 spp , 닥틸리카프노스 spp , 또는 또 다른 종.일부 예에서, SDR1 유전자는 자연 발생 유전자와 79% 유사할 수 있다.
상기 언급된 유전자의 예는, 플라스미드 (2μ, ARS/CEN), YAC, 또는 게놈을 포함하는, 숙주 세포에서 수많은 상이한 플랫폼으로부터 발현될 수 있다. 또한, 상기 언급된 유전자 서열의 예는 하기에서 발현을 위하여 고유 또는 코돈 최적화될 수 있다: 원하는 이종 숙주 (예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애).
예에서, 그 조작된 비-식물 숙주 세포는 카나딘으로부터 노스캐피노이드 또는 이들의 전구체를 생산한다. 일부 예에서, 노스캐피노이드 또는 이들의 전구체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 1-하이드록시-N-메틸카나딘, N-메틸카나딘, 노스카핀, 나르코톨린, 나르코틴헤미아세탈, 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신, 나르코톨린헤미아세탈, N-메틸로피오카르핀, 1,13-디하이드록실-N-메틸카나딘, 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘, 나르코톨리노젠디알, 나르코톨리날 및 1-하이드록시카나딘. 추가의 예에서, 세포는 노스카핀을 생산할 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (S)-N-메틸카나딘, 1-하이드록시-N-메틸카나딘, 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘, 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘, 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신, 나르코톨린헤미아세탈, 및 나르코톨린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 노스카핀 전구체를 포함하는 합성 경로를 통해 카나딘으로부터 노스캐피노이드 또는 이들의 전구체를 생산할 수 있다.
일부 추가의 예에서, 세포는 하나 이상의 효소를 인코딩하는 하나 이상의 이종 코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 이종 코딩 서열은 테트라하이드로프로토베르베린 N-메틸전달효소 (TNMT)를 인코딩할 수 있다. 다른 예에서, 하나 이상의 이종 코딩 서열은 N-메틸카나딘 1-하이드록실라제 (CYP82Y1)를 인코딩한다. 추가 예에서, 하나 이상의 이종 코딩 서열은 1-하이드록시-N-메틸카나딘 13-하이드록실라제 (CYP82X2)를 인코딩한다. 추가적으로, 하나 이상의 이종 코딩 서열은 1, 13-디하이드록실-N-메틸카나딘 13-O 아세틸 전달효소 (PsAT1)를 인코딩할 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 이종 코딩 서열은 4'-O-데스메틸-3-아세틸파파베록신 합성효소 (CYP82X1)를 인코딩한다. 추가적으로, 일부 예에서, 하나 이상의 이종 코딩 서열은 나르코틴헤미아세탈 합성효소 (PsCXE1)를 인코딩할 수 있다.
추가적으로, 하나 이상의 이종 코딩 서열은 노스카핀 합성효소 (PsSDR1)를 인코딩할 수 있다. 다른 예에서, 하나 이상의 이종 코딩 서열은 PsMT3 및 Ps6OMT로부터 선택된 하나 이상의 효소를 인코딩할 수 있다. 추가로, 하나 이상의 이종 코딩 서열은 효소 CYP82Y1, CYP82X1, 및 CYP82X2를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 CPR 효소를 위하여 이종 코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, CPR 효소는 ATR1이다. 다른 예에서, 하나 이상의 이종 코딩 서열 은 낮은-복사본 작제물로부터 발현된다. 추가 예에서, 세포는 PsMT3, Ps6OMT, PsMT2, 및 CYP82Y1로부터 선택된 하나 이상의 효소가 부족할 수 있다.
일부 경우에서, 세포는 노스캐피노이드를 생산할 수 있고 P450, 할로게나제, 글리코실라제, 메틸전달효소, 아세틸전달효소, 단쇄 탈수소효소, 카복실에스테라제, 및 프레닐전달효소로부터 선택된 하나 이상의 효소용 하나 이상의 이종 코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 이종 코딩 서열은 P. 솜니페룸 및 E. 칼리포르니카로부터 선택된 공급원 유기체로부터 유도될 수 있다. 일부 예에서, 세포는 진핵 세포이다. 일부 경우에서, 진핵 세포는 효모 세포이다. 추가 예에서, 효모 세포는 S. 세레비지애 세포이다. 추가적으로, 일부 경우에서, 세포는 세포와 비교된 경우 2 이상 상이한 공급원 유기체로부터 유도된 하나 이상의 효소를 포함한다. 추가 사례에서, 세포는 세포와 비교된 경우 효소를 각각 인코딩하고 상이한 공급원 유기체로부터 각각 유도되는 다중 이종 코딩 서열을 포함한다. 추가적으로, 세포는 TNMT 효소를 각각 인코딩하는 2 이상 이종 코딩 서열을 포함할 수 있다. 추가로, TNMT를 각각 인코딩하는 2 이상 이종 코딩 서열은 상이한 공급원 유기체로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 공급원 유기체는 P. 솜니페룸 및 E. 칼리포르니카로부터 선택 선택될 수 있다.
일부 추가의 예에서, 하나 이상의 이종 코딩 서열은 하나 이상의 돌연변이체 효소를 인코딩할 수 있다. 추가적으로, 하나 이상의 돌연변이체 효소는 CYP82Y1 N-말단 돌연변이체일 수 있다. 추가 예에서, 세포는 하나 이상의 이종 코딩 서열용 하나 이상의 프로모터를 포함할 수 있다. 추가적으로, 일부 경우에서 하나 이상의 프로모터는 강한 프로모터를 포함한다. 예에서, 프로모터는 HXT7, ADH1, PGK1, TPI1, PYK1, TEF1, GAL1, CYC1, GPD로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 추가적으로, 일부 예에서, 하나 이상의 이종 코딩 서열은 CYP82Y1 또는 CYP82Y1 돌연변이체를 인코딩하고 하나 이상의 프로모터는 HXT7을 포함한다. 일부 경우에서, 세포는 1-하이드록시-N-메틸카나딘 또는 1-하이드록시카나딘을 생산할 수 있다. 추가로, 일부 예에서, 하나 이상의 이종 코딩 서열은 CYP82X2 또는 CYP82X2 돌연변이체를 인코딩하고 하나 이상의 프로모터는 HXT7을 포함한다.
일부 추가의 사례에서, 세포는 1, 13-디하이드록시-N-메틸카나딘을 생산할 수 있다. 추가적으로, 하나 이상의 이종 코딩 서열은 CYP82X2 또는 CYP82X2 돌연변이체를 인코딩할 수 있고 하나 이상의 프로모터는 PGK1 및 GPD를 포함한다. 추가로, 세포는 N-메틸-오피오카르핀을 생산할 수 있다. 하나 이상의 이종 코딩 서열은 CYP82X1 또는 CYP82X1 돌연변이체를 인코딩할 수 있고 하나 이상의 프로모터는 HXT7을 포함한다. 추가적으로, 세포는 4'-O-데스메틸-2-O-아세틸파파베록신을 생산할 수 있거나, 또는 세포는 나르코톨리날 및 나르코톨리노젠디알을 생산할 수 있다. 추가 예에서, 세포는 결합 면역글로불린 단백질 (BiP), DnaJ 단백질, 글루코오스 조절된 단백질 (GRP) 94, 결합 단백질 (BiP), 단백질 디설파이드 이소머라제 (PDI), 사이클로필린, 및 칼넥신으로부터 선택된 하나 이상의 식물 샤페론을 포함할 수 있다.
예에서, 세포는 하나 이상의 이종 코딩 서열의 다중 복사본을 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 이종 코딩 서열은 CYP82Y1, CYP82X2, CYP82X1, PsCXE1, PsSDR1, 및 PsMT3으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 인코딩한다. 추가적으로, 일부 예에서, 하나 이상의 이종 코딩 서열의 다중 복사본은 세포와 비교된 경우 2 이상 상이한 공급원 유기체로부터 유도된다. 추가 예에서, 하나 이상의 효소는 효모 세포에서 한 구획에 공간적으로 국재화되고, 여기에서 상기 구획은 미토콘드리아, 내형질 망 (ER), 골지, 액포, 핵, 원형질막, 페록시솜, 및 주변세포질로부터 선택된다. 추가적으로, 예에서, 하나 이상의 효소는 효모 세포에서 구획의 외부에 공간적으로 국재화된다. 추가로, 예에서, 하나 이상의 효소는 효모 세포에서 구획의 내부에 공간적으로 국재화된다.
추가 예에서, 세포는 노르라우다노솔린으로부터 노스카핀 알칼로이드를 생산할 수 있다. 추가적으로, 세포는 TNMT, PsAT1, CYP82X1, PsCXE1, PsSDR1, PsMT3, CYP82Y1, CYP82X1, S9OMT, PsMT2, Ps6OMT, Ps4'OMT, PsCNMT, PsBBE, CPR1, 및 CYP719A로부터 선택된 하나 이상의 효소를 인코딩하는 하나 이상의 이종 코딩 서열을 포함할 수 있다. 추가로, 세포는 YAC로부터 TNMT, PsAT1, CYP82X1, PsCXE1, PsSDR1, PsMT2를 발현시킬 수 있다. 추가적으로, 세포는 낮은-복사본 플라스미드로부터 CYP82Y1 및 CYP82X1을 발현시킬 수 있다. 다른 예에서, 세포는 높은-복사본 플라스미드로부터 S9OMT를 발현시킬 수 있다. 일부 경우에서, Ps6OMT, Ps4'OMT, PsCNMT, PsBBE, CPR1, 및 CYP719A는 세포에서 염색체에 의해 통합된다.
일부 예에서, 노스캐피노이드 또는 이들의 전구체를 생산하기 위한 단백질 생산에 적합한 조건하에 청구항 1 내지 56 중 임의의 하나에 따라 숙주 세포 배양을 포함하는, 노스캐피노이드 또는 이들의 전구체의 제조 방법이 제공된다. 일부 경우에서, 상기 방법은 세포 배양액으로부터 노스캐피노이드 또는 이들의 전구체의 회수를 추가로 포함할 수 있다. 다른 예에서, 상기 방법은 노스캐피노이드로부터 BIA를 생산하기에 충분한 조간하에 세포의 배양; 및 세포 배양액으로부터 BIA의 회수를 추가로 포함할 수 있다. 추가의 예에서, 상기 방법은 세포 배양액에 출발 화합물의 부가를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 출발 화합물은 카나딘이다. 일부 경우에서, 출발 화합물은 노르라우다노솔린이다. 추가적으로, 일부 경우에서, 출발 화합물은 티로신 또는 티로신 유사체이다. 추가로, 예에서, 상기 방법은 세포 배양액에 성장 공급원료의 부가를 추가로 포함할 수 있다.
전술한 발명이 이해의 명확성의 목적을 위하여 예시 및 예의 방식으로 일부 상세히 기재되어 있어도, 특정 변화 및 변형이 첨부된 청구범위의 취지 또는 범위에서 이탈 없이 만들어질 수 있는 본 발명의 교시의 점에서 당해 분야의 숙련가에 용이하게 명백하다.
따라서, 상기는 본 발명의 원리를 단지 예시한다. 본원에서 명백하게 기재되지 않거나 또는 보이지 않아도, 본 발명의 원리를 구현하고 그 취지 및 범위내에 포함되는 다양한 배열을 당해 분야의 숙련가가 고안할 수 있을 것임이 인정될 것이다. 더욱이, 본원에서 인용된 모든 예 및 조건적 언어는 본 발명의 원리 및 선행기술의 추가에 발명자들에 의해 기여된 개념의 이해에서 독자를 돕도록 주로 의도되고, 상기 특이적으로 인용된 예 및 조건에 제한 없이 그대로 해석된다. 또한, 본 발명의 원리, 측면, 및 구현예 뿐만 아니라 이들의 특이적 예를 본원에서 인용한 모든 서술은 이들의 모든 구조적 및 기능적 등가물을 포함하도록 의도된다. 추가적으로, 상기 등가물이 구조와 무관하게 현재 공지된 등가물 및 미래에 개발된 등가물, 즉, 동일한 기능을 수행하는 개발된 임의의 요소 모두를 포함하는 것이 의도된다. 본 발명의 범위는, 따라서, 본원에서 보여진 및 기재된 예시적 구현예에 제한되도록 의도되지 않는다. 오히려, 발명의 범위 및 취지는 첨부된 청구범위에 의해 형체화된다.

Claims (120)

  1. 카나딘, 또는 카나딘의 유사체를, 노스캐피노이드, 노스캐피노이드의 전구체, 노스캐피노이드의 대사물질, 노스캐피노이드의 유사체, 노스캐피노이드의 중간체, 및 노스캐피노이드의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 노스캐피노이드 생성물로 전환하는 대사 경로를 따라 카나딘의 유도체인 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물의 조작된 비-식물 세포로서, 상기 조작된 비-식물 세포에서 생산되는 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물의 양이 상기 비-식물 세포에서 생산되는 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물의 상기 양 초과인, 조작된 비-식물 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 카나딘, 또는 카나딘의 유사체를 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 상기 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소를 인코딩한 하나 이상의 이종 코딩 서열을 포함하는, 조작된 비-식물 세포.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 카나딘, 또는 카나딘의 유사체를 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 상기 대사 경로에서 관여된 1 초과 효소를 인코딩한 이종 코딩 서열을 포함하는, 조작된 비-식물 세포.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 카나딘, 또는 카나딘의 유사체를 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 상기 대사 경로에서 관여된 2개의 상이한 효소를 인코딩한 이종 코딩 서열을 포함하는, 조작된 비-식물 세포.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 카나딘, 또는 카나딘의 유사체를 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 상기 대사 경로에서 관여된 3 초과 상이한 효소를 인코딩한 이종 코딩 서열을 포함하는, 조작된 비-식물 세포.
  6. 청구항 2에 있어서, 상기 적어도 하나의 효소가 상기 조작된 비-식물 세포 내의 화합물을 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 화합물이 상기 조작된 비-식물 세포 내에 생산되는, 조작된 비-식물 세포.
  8. 청구항 2에 있어서, 카나딘을 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 TNMT, CYP82X2, CYP82Y1, CPY82X1, AT1, 6OMT, CXE1, CXE2, SDR1, MT2, 및 MT3으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 비-식물 세포.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드인, 조작된 비-식물 세포.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 나르코톨린헤미아세탈인, 조작된 비-식물 세포.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 CXE1을 포함하고, 상기 CXE1이 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신을 나르코톨린헤미아세탈로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 나르코틴헤미아세탈인, 조작된 비-식물 세포.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 MT2 및 MT3을 포함하고, 상기 MT2 및 MT3이 나르코톨린헤미아세탈을 나르코틴헤미아세탈로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 MT2 및 6OMT를 포함하고, 상기 MT2 및 6OMT가 나르코톨린헤미아세탈을 나르코틴헤미아세탈로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  15. 청구항 12에 있어서, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 4'OMT를 포함하고, 상기 4'OMT가 나르코톨린헤미아세탈을 나르코틴헤미아세탈로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  16. 청구항 9에 있어서, 상기 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 나르코톨린인, 조작된 비-식물 세포.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 SDR1을 포함하고, 상기 SDR1이 나르코톨린헤미아세탈을 나르코톨린으로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  18. 청구항 9에 있어서, 상기 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 노스카핀인, 조작된 비-식물 세포.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 MT2 및 MT3을 포함하고, 상기 MT2 및 MT3이 나르코톨린을 노스카핀으로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  20. 청구항 18에 있어서, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 MT2 및 6OMT를 포함하고, 상기 MT2 및 6OMT가 나르코톨린을 노스카핀으로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  21. 청구항 18에 있어서, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 4'OMT를 포함하고, 상기 4'OMT가 나르코톨린을 노스카핀으로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  22. 청구항 18에 있어서, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 SDR1을 포함하고, 상기 SDR1이 나르코틴헤미아세탈을 노스카핀으로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  23. 청구항 8에 있어서, 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 프로토베르베린 생성물인, 조작된 비-식물 세포.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 1-하이드록시카나딘, N-메틸카나딘, N-메틸-오피오카르핀, 1-하이드록시-N-메틸-카나딘, 나르코톨리날, 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘, 및 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 비-식물 세포.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 1-하이드록시카나딘이고, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 CYP82Y1을 포함하고, 상기 CYP82Y1이 카나딘을 1-하이드록시카나딘으로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  26. 청구항 24에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 N-메틸카나딘이고, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 TNMT를 포함하고, 상기 TNMT가 카나딘을 N-메틸카나딘으로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  27. 청구항 24에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 N-메틸-오피오카르핀이고, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 CYP82X2를 포함하고, 상기 CYP82X2가 N-메틸카나딘을 N-메틸-오피오카르핀으로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  28. 청구항 24에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 1-하이드록시-N-메틸-카나딘이고, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 CYP82Y1을 포함하고, 상기 CYP82Y1이 N-메틸카나딘을 1-하이드록시-N-메틸-카나딘으로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  29. 청구항 24에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 나르코톨리날이고, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 CYP82X1을 포함하고, 상기 CYP82X1이 1-하이드록시-N-메틸-카나딘을 나르코톨리날로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  30. 청구항 24에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘이고, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 CYP82X2를 포함하고, 상기 CYP82X2가 1-하이드록시-N-메틸-카나딘을 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘으로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  31. 청구항 24에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘이고 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 AT1을 포함하고, 상기 AT1이 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘을 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘으로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  32. 청구항 1에 있어서, 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 나르코톨리노젠디알, 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신, 및 3-O-아세틸파파베록신으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 비-식물 세포.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 나르코톨리노젠디알이고, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 CYP82X1을 포함하고, 상기 CYP82X1이 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘을 나르코톨리노젠디알로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  34. 청구항 32에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신이고, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 CYP82X1을 포함하고, 상기 CYP82X1이 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘을 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신으로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  35. 청구항 32에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 3-O-아세틸파파베록신이고, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 MT2 및 MT3을 포함하고, 상기 MT2 및 MT3이 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신을 3-O-아세틸파파베록신으로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  36. 청구항 32에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 3-O-아세틸파파베록신이고, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소 MT2 및 6OMT, 상기 MT2 및 6OMT가 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신을 3-O-아세틸파파베록신으로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  37. 청구항 32에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 3-O-아세틸파파베록신이고, 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 4'OMT를 포함하고, 상기 4'OMT가 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신을 3-O-아세틸파파베록신으로 전환시키는, 조작된 비-식물 세포.
  38. 청구항 1에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 미생물 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 박테리아 세포, 및 효모 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 비-식물 세포.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 효모 세포인, 조작된 비-식물 세포.
  40. 청구항 1에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 레티쿨린-생산 세포인, 조작된 비-식물 세포.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 레티쿨린-생산 세포가 PTPS, SepR, PCD, QDHPR, DHFR, TyrH, NCS, DODC, CYP80B1, CPR, 6OMT, 4'OMT, CNMT, ARO4, ARO7, ARO10, 및 TKL1 생산용 코딩 서열을 포함하고, 각 코딩 서열이 상기 레티쿨린-생산 세포로 염색체에 의해 통합되는, 조작된 비-식물 세포.
  42. 청구항 41에 있어서, 적어도 하나의 TyrH, 4'OMT, 및 NCS를 생산하는 코딩 서열의 적어도 하나의 추가의 복사본이 상기 레티쿨린-생산 세포로 염색체에 의해 통합되고, 그렇게 함으로써 상기 레티쿨린-생산 세포 내에 레티쿨린의 생산을 증가시키는, 조작된 비-식물 세포.
  43. 청구항 40에 있어서, 상기 레티쿨린-생산 세포가 적어도 하나의 BBE, S90MT, MT1, CAS, TNMT, CYP82Y1, CYP82X2, AT1, CYP82X1, CXE1, SDR1, MT2, 및 MT3 생산용 적어도 하나의 이종 코딩 서열을 포함하고, 각 코딩 서열이 상기 레티쿨린-생산 세포로 염색체에 의해 통합되는, 조작된 비-식물 세포.
  44. 청구항 40에 있어서, TyrH, 4'OMT, 및 NCS의 적어도 하나를 생산하는 코딩 서열의 적어도 하나의 추가의 복사본이 상기 레티쿨린-생산 세포로 염색체에 의해 통합되고, 그렇게 함으로써 상기 레티쿨린-생산 세포 내에 레티쿨린의 생산을 증가시키는, 조작된 비-식물 세포.
  45. 청구항 40에 있어서, 적어도 하나의 CYP82X2 및 MT1을 생산하는 코딩 서열의 적어도 하나의 추가의 복사본이 상기 레티쿨린-생산 세포로 염색체에 의해 통합되고, 그렇게 함으로써 상기 레티쿨린-생산 세포 내에 노스카핀의 생산을 증가시키는, 조작된 비-식물 세포.
  46. 청구항 1에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 적어도 하나의 돌연변이체 효소를 인코딩한 적어도 하나의 이종 서열을 포함하는, 조작된 비-식물 세포.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 적어도 하나의 돌연변이체 효소가 CYP82Y1 N-말단 돌연변이체, CYP82X2 돌연변이체, CYP82X1 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 비-식물 세포.
  48. 청구항 1에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 적어도 하나의 프로모터를 인코딩한 적어도 하나의 이종 서열을 포함하는, 조작된 비-식물 세포.
  49. 청구항 48에 있어서, 상기 적어도 하나의 프로모터가 HXT7, ADH1, PGK1, TPI1, PYK1, TEF1, GAL1, CYC1, PUT1, CIT2, 및 GPD로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 비-식물 세포.
  50. 청구항 1에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 결합 면역글로불린 단백질 (BiP), DnaJ 단백질, 글루코오스 조절된 단백질 (GRP) 94, 결합 단백질 (BiP), 단백질 디설파이드 이소머라제 (PDI), 사이클로필린, 및 칼넥신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물 샤페론을 포함하는, 조작된 비-식물 세포.
  51. 청구항 1에 있어서, 하나 이상의 상기 효소가 상기 조작된 비-식물 세포의 한 구획에 공간적으로 국재화되고, 상기 구획이 미토콘드리아, 내형질 망 (ER), 골지, 액포, 핵, 원형질막, 페록시솜, 및 주변세포질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 비-식물 세포.
  52. 청구항 51에 있어서, 상기 하나 이상의 효소가 상기 조작된 비-식물 세포에서 상기 구획의 상기 외부에 공간적으로 국재화되는, 조작된 비-식물 세포.
  53. 청구항 51에 있어서, 상기 하나 이상의 효소가 상기 조작된 비-식물 세포에서 상기 구획의 상기 내부에 공간적으로 국재화되는, 조작된 비-식물 세포.
  54. 청구항 1에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 적어도 하나의 테일러링 효소를 인코딩하기 위하여 적어도 하나의 이종 코딩 서열을 포함하는, 조작된 비-식물 세포.
  55. 청구항 54에 있어서, 상기 적어도 하나의 테일러링 효소가 할로게나제, 프레날트랜스퍼라제, 글리코실라제, 메틸라제, 디메틸라제, 및 옥시도리덕타제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 비-식물 세포.
  56. 카나딘의 다운스트림인 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물을 갖는 생성물 스트림의 형성 방법으로서, 하기 단계를 포함하는, 방법:
    a. 카나딘, 또는 카나딘의 유사체를, 노스캐피노이드, 노스캐피노이드의 전구체, 노스캐피노이드의 대사물질, 노스캐피노이드의 유사체, 노스캐피노이드의 중간체, 및 노스캐피노이드의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 대사 경로를 따라 카나딘의 유도체인 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물을 생산하는 조작된 비-식물 세포의 배양 단계로서, 여기에서 상기 조작된 비-식물 세포가 카나딘, 또는 카나딘의 유사체를 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 상기 대사 경로에서 관여된 적어도 하나의 효소를 인코딩한 적어도 하나의 이종 서열을 포함하는, 단계; 및
    b. 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물을 갖는 생성물 스트림을 제공하기 위해 세포성 물질로부터 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물의 분리 단계.
  57. 청구항 56에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포에서 상기 적어도 하나의 효소의 상기 양이 상기 비-조작된 비-식물 세포에서 상기 적어도 하나의 효소의 상기 양 초과인, 방법.
  58. 청구항 56에 있어서, 카나딘을 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 상기 대사 경로에서 관여된 상기 적어도 하나의 효소가 TNMT, CYP82X2, CYP82Y1, CPY82X1, AT1, 6OMT, CXE1, CXE1, SDR1, MT2, 및 MT3으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  59. 청구항 56에 있어서, 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드인, 방법.
  60. 청구항 59에 있어서, 상기 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 나르코톨린헤미아세탈, 나르코틴헤미아세탈, 나르코톨린, 및 노스카핀으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  61. 청구항 60에 있어서, 상기 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 나르코톨린헤미아세탈이고, 상기 조작된 비-식물 세포가 적어도 하나의 CYP82X1 및 CXE1을 포함하는, 방법.
  62. 청구항 60에 있어서, 상기 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 나르코틴헤미아세탈이고, 상기 조작된 비-식물 세포가 적어도 하나의 MT2, MT3, 6OMT, 및 CXE1을 포함하는, 방법.
  63. 청구항 60에 있어서, 상기 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 나르코톨린이고, 상기 조작된 비-식물 세포가 적어도 하나의 CXE1 및 SDR1을 포함하는, 방법.
  64. 청구항 60에 있어서, 상기 프탈리드이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 노스카핀이고, 상기 조작된 비-식물 세포가 적어도 하나의 MT3, 6OMT, CXE1, 및 SDR1을 포함하는, 방법.
  65. 청구항 56에 있어서, 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 프로토베르베린 생성물인, 방법.
  66. 청구항 65에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 1-하이드록시카나딘, N-메틸카나딘, N-메틸-오피오카르핀, 1-하이드록시-N-메틸카나딘, 나르코톨리날, 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘, 및 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  67. 청구항 66에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 1-하이드록시카나딘이고, 상기 조작된 비-식물 세포가 CYP82Y1을 포함하는, 방법.
  68. 청구항 65에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 N-메틸카나딘이고, 상기 조작된 비-식물 세포가 TNMT를 포함하는, 방법.
  69. 청구항 65에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 N-메틸-오피오카르핀이고, 상기 조작된 비-식물 세포가 적어도 하나의 TNMT 및 CYP82X2를 포함하는, 방법.
  70. 청구항 65에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 1-하이드록시-N-메틸-카나딘이고, 상기 조작된 비-식물 세포가 적어도 하나의 TNMT 및 CYP82Y1을 포함하는, 방법.
  71. 청구항 65에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 나르코톨리날이고, 상기 조작된 비-식물 세포가 적어도 하나의 TNMT, CYP82Y1, 및 CYP82X1을 포함하는, 방법.
  72. 청구항 65에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 1,13-디하이드록시-N-메틸카나딘이고, 상기 조작된 비-식물 세포가 적어도 하나의 TNMT, CYP82Y1, 및 CYP82X2를 포함하는, 방법.
  73. 청구항 65에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 1-하이드록시-13-O-아세틸-N-메틸카나딘이고, 상기 조작된 비-식물 세포가 적어도 하나의 CYP82Y1, CYP82X2, 및 AT1을 포함하는, 방법.
  74. 청구항 56에 있어서, 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 노르코톨리노젠디알, 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신, 및 3-O-아세틸파파베록신으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  75. 청구항 74에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 노르코톨리노젠디알이고, 상기 조작된 비-식물 세포가 적어도 하나의 CYP82Y1, CYP82X2, 및 CYP82X1을 포함하는, 방법.
  76. 청구항 74에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신이고, 상기 조작된 비-식물 세포가 적어도 하나의 CYP82X2, AT1, 및 CYP82X1을 포함하는, 방법.
  77. 청구항 74에 있어서, 상기 프로토베르베린 생성물이 3-O-아세틸파파베록신이고, 상기 조작된 비-식물 세포가 적어도 하나의 AT1, CYP82X1, MT3, 및 6OMT를 포함하는, 방법.
  78. 청구항 56에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 레티쿨린-생산 세포인, 방법.
  79. 청구항 78에 있어서, 상기 레티쿨린-생산 세포가 PTPS, SepR, PCD, QDHPR, DHFR, TyrH, NCS, DODC, CYP80B1, CPR, 6OMT, 4'OMT, CNMT, ARO4, ARO7, ARO10, 및 TKL1 생산용 코딩 서열을 포함하고, 각 코딩 서열이 상기 레티쿨린-생산 세포로 염색체에 의해 통합되는, 방법.
  80. 청구항 79에 있어서, 적어도 하나의 TyrH, 4'OMT, 및 NCS를 생산하는 코딩 서열의 적어도 하나의 추가의 복사본이 상기 레티쿨린-생산 세포로 염색체에 의해 통합되고, 그렇게 함으로써 상기 레티쿨린-생산 세포 내에 레티쿨린의 생산을 증가시키는, 방법.
  81. 청구항 78에 있어서, 상기 레티쿨린-생산 세포가 적어도 하나의 BBE, S90MT, MT1, CAS, TNMT, CYP82Y1, CYP82X2, AT, CYP82X1, CXE1, SDR1, MT2, 및 MT3 생산용 적어도 하나의 이종 코딩 서열을 포함하고, 각 코딩 서열이 상기 레티쿨린-생산 세포로 염색체에 의해 통합되는, 방법.
  82. 청구항 78에 있어서, 적어도 하나의 TyrH, 4'OMT, 및 NCS를 생산하는 코딩 서열의 적어도 하나의 추가의 복사본이 상기 레티쿨린-생산 세포로 염색체에 의해 통합되고, 그렇게 함으로써 상기 레티쿨린-생산 세포 내에 레티쿨린의 생산을 증가시키는, 방법.
  83. 청구항 56에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 적어도 하나의 돌연변이체 효소를 인코딩한 적어도 하나의 이종 서열을 포함하는, 방법.
  84. 청구항 83에 있어서, 상기 적어도 하나의 돌연변이체 효소가 CYP82Y1 N-말단 돌연변이체, CYP82X2 돌연변이체, CYP82X1 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  85. 청구항 56에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 적어도 하나의 프로모터를 인코딩한 적어도 하나의 이종 서열을 포함하는, 방법.
  86. 청구항 85에 있어서, 상기 적어도 하나의 프로모터가 HXT7, ADH1, PGK1, TPI1, PYK1, TEF1, GAL1, CYC1, PUT1, CIT2, 및 GPD로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  87. 청구항 56에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 결합 면역글로불린 단백질 (BiP), DnaJ 단백질, 글루코오스 조절된 단백질 (GRP) 94, 결합 단백질 (BiP), 단백질 디설파이드 이소머라제 (PDI), 사이클로필린, 및 칼넥신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물 샤페론을 포함하는, 방법.
  88. 청구항 56에 있어서, 하나 이상의 상기 효소가 상기 조작된 비-식물 세포에서 한 구획에 공간적으로 국재화되고, 상기 구획이 미토콘드리아, 내형질 망 (ER), 골지, 액포, 핵, 원형질막, 페록시솜, 및 주변세포질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  89. 청구항 88에 있어서, 상기 하나 이상의 효소가 상기 조작된 비-식물 세포에서 상기 구획의 상기 외부에 공간적으로 국재화되는, 방법.
  90. 청구항 88에 있어서, 상기 하나 이상의 효소가 상기 조작된 비-식물 세포에서 상기 구획의 상기 내부에 공간적으로 국재화되는, 방법.
  91. 청구항 56에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 적어도 하나의 테일러링 효소 인코딩용 적어도 하나의 이종 코딩 서열을 포함하는, 방법.
  92. 청구항 91에 있어서, 상기 적어도 하나의 테일러링 효소가 할로게나제, 프레날트랜스퍼라제, 글리코실라제, 메틸라제, 디메틸라제, 및 옥시도리덕타제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  93. 청구항 56에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 미생물 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 박테리아 세포, 및 효모 세포의 군으로부터 선택되는, 방법.
  94. 청구항 93에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 효모 세포인, 방법.
  95. 청구항 56에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 시험관내 조건하에 배양되는, 방법.
  96. 청구항 56에 있어서, 상기 조작된 비-식물 세포가 생체내 조건하에 배양되는, 방법.
  97. 청구항 56에 있어서, 상기 생성물 스트림이 리그닌, 플라보노이드, 페난트레오이드, 라텍스, 루비스코, 메콘산, 슈도모르핀, 나르세인, 테바올, 및 화분의 군으로부터 선택되는 5 ppm 초과의 분자를 함유하지 않는, 방법.
  98. 청구항 56에 있어서, 상기 생성물 스트림이 살충제의 검출가능한 양을 함유하지 않는, 방법.
  99. 청구항 56에 있어서, 상기 생성물 스트림이 비-식물 세포의 적어도 하나의 부분을 함유하는, 방법.
  100. 청구항 99에 있어서, 상기 비-식물 세포가 조작된 비-식물 세포인, 방법.
  101. 청구항 99에 있어서, 상기 비-식물 세포의 상기 적어도 하나의 부분이 상기 생성물 스트림에서 검출가능한 양으로 존재하는, 방법.
  102. 청구항 101에 있어서, 상기 비-식물 세포의 상기 적어도 하나의 부분이 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법을 이용하여 검출가능한, 방법.
  103. 청구항 101에 있어서, 상기 비-식물 세포의 상기 적어도 하나의 부분이 질량 분광분석법을 이용하여 검출가능한, 방법.
  104. 청구항 101에 있어서, 상기 비-식물 세포의 상기 적어도 하나의 부분이 분광법을 이용하여 검출가능한, 방법.
  105. 청구항 56에 있어서, 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 적어도 액체-액체 추출을 이용하여 상기 생성물 스트림으로부터 회수되는, 방법.
  106. 청구항 56에 있어서, 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 발효 공정이 완료된 직후 회수되는, 방법.
  107. 하기를 포함하는, 약학적 조성물:
    카나딘, 또는 카나딘의 유사체를, 노스캐피노이드, 노스캐피노이드의 전구체, 노스캐피노이드의 대사물질, 노스캐피노이드의 유사체, 노스캐피노이드의 중간체, 및 노스캐피노이드의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 노스캐피노이드 생성물로 전환시키는 대사 경로를 따라 카나딘의 유도체인 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물; 및
    비-식물 세포의 적어도 하나의 부분.
  108. 청구항 107에 있어서, 상기 비-식물 세포가 조작된 비-식물 세포인, 약학적 조성물.
  109. 청구항 107에 있어서, 상기 비-식물 세포의 상기 적어도 하나의 부분이 상기 생성물 스트림에서 검출가능한 양으로 존재하는, 약학적 조성물.
  110. 청구항 109에 있어서, 상기 비-식물 세포의 상기 부분이 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법을 이용하여 검출가능한. 약학적 조성물.
  111. 청구항 109에 있어서, 상기 비-식물 세포의 상기 적어도 하나의 부분이 질량 분광분석법을 이용하여 검출가능한, 약학적 조성물.
  112. 청구항 109에 있어서, 상기 비-식물 세포의 상기 적어도 하나의 부분이 분광법을 이용하여 검출가능한, 약학적 조성물.
  113. 청구항 107에 있어서, 상기 조성물이 리그닌, 플라보노이드, 페난트레오이드, 라텍스, 루비스코, 메콘산, 슈도모르핀, 나르세인, 테바올, 및 화분의 군으로부터 선택되는 5 ppm 초과의 분자를 함유하지 않는, 약학적 조성물.
  114. 청구항 107에 있어서, 상기 조성물이 살충제의 검출가능한 양을 함유하지 않는, 약학적 조성물.
  115. 청구항 107에 있어서, 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 노스카핀을 포함하는, 약학적 조성물.
  116. 청구항 107에 있어서, 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 나르코톨린을 포함하는, 약학적 조성물.
  117. 청구항 105에 있어서, 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 나르코틴헤미아세탈을 포함하는, 약학적 조성물.
  118. 청구항 105에 있어서, 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 나르코톨린헤미아세탈을 포함하는, 약학적 조성물.
  119. 청구항 107에 있어서, 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 3-O-아세틸파파베록신을 포함하는, 약학적 조성물.
  120. 청구항 107에 있어서, 상기 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 생성물이 4'-O-데스메틸-3-O-아세틸파파베록신을 포함하는, 약학적 조성물.
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