CN107002103B - 产生类诺斯卡品的微生物以及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供工程化的非植物细胞，所述工程化的非植物细胞沿着将坎那丁或坎那丁的类似物转化为类诺斯卡品产物的代谢路径产生作为坎那丁衍生物的苄基异喹啉生物碱产物。本发明还提供培养产生类诺斯卡品产物的工程化的非植物细胞的方法和药物组合物。

Description

产生类诺斯卡品的微生物以及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求以下各个申请的优先权：在2014年11月17日提交的美国临时申请号62/080,610；在2015年1月23日提交的美国临时申请号62/107,238；在2015年5月4 日提交的美国临时申请号62/156,701；在2015年5月8日提交的美国临时申请号 62/159,122；和在2015年6月11日提交的美国临时申请号62/174,475，所述案件的公开 内容以引用方式整体并入本文中。
政府权利
本发明是由美国国家卫生研究院根据合同号AT007886颁发的。政府对发明有一定的权利。
概要
本公开提供在工程化的宿主细胞中产生多种苄基异喹啉生物碱(BIA)(例如类诺斯 卡品(noscapinoid))的方法。本公开进一步提供在工程化的宿主细胞中产生的多种类诺斯 卡品的组合物。
本发明的一个方面提供工程化的非植物细胞，其产生类诺斯卡品、类诺斯卡品的前 体、类诺斯卡品的代谢物、类诺斯卡品的类似物、类诺斯卡品的中间体和/或类诺斯卡品的衍生物。在实例中，工程化的宿主细胞可以利用坎那丁(canadine)作为起始化合物，所述起始化合物可以添加到工程化的宿主细胞中。在其他实例中，工程化的宿主细胞可以 利用由细胞从诸如全去甲劳丹碱(norlaudanosoline)或酪氨酸等前体产生的坎那丁。在其他实例中，工程化的宿主细胞从工程化成从酪氨酸产生类诺斯卡品的酵母细胞可以重新产生类诺斯卡品、类诺斯卡品的前体、类诺斯卡品的代谢物、类诺斯卡品的类似物、类 诺斯卡品的中间体和/或类诺斯卡品的衍生物，其中酪氨酸在酵母细胞中自然产生。在其 他实例中，工程化的宿主细胞可以产生类诺斯卡品、类诺斯卡品的前体、类诺斯卡品的 代谢物、类诺斯卡品的类似物、类诺斯卡品的中间体、类诺斯卡品的功能化衍生物和/ 或类诺斯卡品的衍生物，所述化合物是使用前体化合物(例如酪氨酸)的类似物形成的。
在实例中，本发明的一个方面提供工程化的非植物细胞，所述工程化的非植物细胞 沿着将坎那丁或坎那丁的类似物转化为类诺斯卡品产物的代谢路径产生作为坎那丁衍生 物的苄基异喹啉生物碱产物，所述类诺斯卡品产物包含至少一种选自由类诺斯卡品、类诺斯卡品的前体、类诺斯卡品的代谢物、类诺斯卡品的类似物、类诺斯卡品的中间体和 类诺斯卡品的衍生物组成的组的化合物，其中在工程化的非植物细胞中产生的苄基异喹 啉生物碱产物的量大于在非植物细胞中产生的苄基异喹啉生物碱产物的量。
在一些实施方案中，工程化的非植物细胞包含一个或多个用于编码参与代谢路径的 至少一种酶的异源编码序列，所述代谢路径将坎那丁或坎那丁的类似物转化为类诺斯卡 品产物。在一些实施方案中，工程化的非植物细胞包含编码参与代谢路径的多于一种酶的异源编码序列，所述代谢路径将坎那丁或坎那丁的类似物转化为类诺斯卡品产物。另外，在一些实施方案中，工程化的非植物细胞包含编码参与代谢路径的两种不同酶的异 源编码序列，所述代谢路径将坎那丁或坎那丁的类似物转化为类诺斯卡品产物。在一些 实施方案中，工程化的非植物细胞包含编码参与代谢路径的多于三种不同酶的异源编码 序列，所述代谢路径将坎那丁或坎那丁的类似物转化为类诺斯卡品产物。在一些实施方 案中，至少一种酶将工程化的非植物细胞内的化合物转化为苄基异喹啉生物碱产物。在 一些实施方案中，所述化合物是在工程化的非植物细胞内产生的。在一些实施方案中， 参与将坎那丁转化为类诺斯卡品产物的代谢路径的至少一种酶选自由以下组成的组： TNMT、CYP82X2、CYP82Y1、CPY82X1、AT1、6OMT、CXE1、CXE2、SDR1、MT2 和MT3。
在一些实施方案中，苄基异喹啉生物碱产物是苯酞异喹啉生物碱。在一些实施方案 中，苯酞异喹啉生物碱产物是罂粟壳碱半缩醛，且在其他实施方案中，参与代谢路径的至少一种酶包含CXE1，且其中CXE1将4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛(papaveroxine)转化为罂粟壳碱半缩醛。在一些实施方案中，苯酞异喹啉生物碱产物是那可汀半缩醛(narcotinehemiacetal)，且在其他实施方案中，参与代谢路径的至少一种酶包含MT2和MT3，且其中MT2和MT3将罂粟壳碱半缩醛转化为那可汀半缩醛。在一些实施方案中， 参与代谢路径的至少一种酶包含MT2和6OMT，且其中MT2和6OMT将罂粟壳碱半缩 醛转化为那可汀半缩醛。在一些实施方案中，参与代谢路径的至少一种酶包含4’OMT， 且其中4’OMT将罂粟壳碱半缩醛转化为那可汀半缩醛。
在一些实施方案中，苯酞异喹啉生物碱产物是罂粟壳碱，且在其他实施方案中，参与代谢路径的至少一种酶包含SDR1，且其中SDR1将罂粟壳碱半缩醛转化为罂粟壳碱。 在一些实施方案中，苯酞异喹啉生物碱产物是诺斯卡品(noscapine)，且在其他实施方案 中，参与代谢路径的至少一种酶包含MT2和MT3，且其中MT2和MT3将罂粟壳碱转 化为诺斯卡品。在一些实施方案中，参与代谢路径的至少一种酶包含MT2和6OMT， 且其中MT2和6OMT将罂粟壳碱转化为诺斯卡品。在一些实施方案中，参与代谢路径 的至少一种酶包含4’OMT，且其中4’OMT将罂粟壳碱转化为诺斯卡品。在一些实施方 案中，参与代谢路径的至少一种酶包含SDR1，且其中SDR1将那可汀半缩醛转化为诺 斯卡品。
在一些实施方案中，苄基异喹啉生物碱产物是原小檗碱产物。在一些实施方案中，原小檗碱产物选自由以下组成的组：1-羟基坎那丁、N-甲基坎那丁、N-甲基-左旋蛇果黄 堇碱、1-羟基-N-甲基-坎那丁、那可托林(narcotolinal)、1,13-二羟基-N-甲基坎那丁和1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那丁。在一些实施方案中，原小檗碱产物是1-羟基坎那丁， 其中参与代谢路径的至少一种酶包含CYP82Y1，且其中CYP82Y1将坎那丁转化为1- 羟基坎那丁。在一些实施方案中，原小檗碱产物是N-甲基坎那丁，其中参与代谢路径的 至少一种酶包含TNMT，且其中TNMT将坎那丁转化为N-甲基坎那丁。在一些实施方 案中，原小檗碱产物是N-甲基-左旋蛇果黄堇碱，其中参与代谢路径的至少一种酶包含 CYP82X2，且其中CYP82X2将N-甲基坎那丁转化为N-甲基-左旋蛇果黄堇碱。在一些 实施方案中，原小檗碱产物是1-羟基-N-甲基-坎那丁，其中参与代谢路径的至少一种酶 包含CYP82Y1，且其中CYP82Y1将N-甲基坎那丁转化为1-羟基-N-甲基-坎那丁。
在一些实施方案中，原小檗碱产物是那可托林，其中参与代谢路径的至少一种酶包 含CYP82X1，且其中CYP82X1将1-羟基-N-甲基-坎那丁转化为那可托林。在一些实施 方案中，原小檗碱产物是1,13-二羟基-N-甲基坎那丁，其中参与代谢路径的至少一种酶 包含CYP82X2，且其中CYP82X2将1-羟基-N-甲基-坎那丁转化为1,13-二羟基-N-甲基 坎那丁。在一些实施方案中，原小檗碱产物是1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那丁，其中 参与代谢路径的至少一种酶包含AT1，且其中AT1将1,13-二羟基-N-甲基坎那丁转化为 1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那丁。
在一些实施方案中，苄基异喹啉生物碱产物选自由那可托林吉地(narcotolinogendial)、4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛和3-O-乙酰基罂粟奥辛组成的组。在一些实施方案中，原小檗碱产物是那可托林吉地，其中参与代谢路径的至少一种 酶包含CYP82X1，且其中CYP82X1将1,13-二羟基-N-甲基坎那丁转化为那可托林吉地。 在一些实施方案中，原小檗碱产物是4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛，其中参与代谢 路径的至少一种酶包含CYP82X1，且其中CYP82X1将1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那 丁转化为4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛。在一些实施方案中，原小檗碱产物是3-O- 乙酰基罂粟奥辛，其中参与代谢路径的至少一种酶包含MT2和MT3，且其中MT2和 MT3将4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛转化为3-O-乙酰基罂粟奥辛。在一些实施方案 中，原小檗碱产物是3-O-乙酰基罂粟奥辛，其中参与代谢路径的至少一种酶MT2和 6OMT，且其中MT2和6OMT将4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛转化为3-O-乙酰基 罂粟奥辛。在一些实施方案中，原小檗碱产物是3-O-乙酰基罂粟奥辛，其中参与代谢路 径的至少一种酶包含4’OMT，且其中4’OMT将4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛转化 为3-O-乙酰基罂粟奥辛。
在一些实施方案中，工程化的非植物细胞选自由微生物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞和酵母细胞组成的组。在一些实施方案中，工程化的非植物细胞是酵母 细胞。在一些实施方案中，工程化的非植物细胞是产生牛心果碱的细胞。在一些实施方 案中，产生牛心果碱的细胞包含用于产生PTPS、SepR、PCD、QDHPR、DHFR、TyrH、 NCS、DODC、CYP80B1、CPR、6OMT、4’OMT、CNMT、ARO4、ARO7、ARO10 和TKL1的编码序列，其中每一编码序列是通过染色体整合到产生牛心果碱的细胞中。 在一些实施方案中，产生TyrH、4’OMT和NCS中的至少一种的编码序列的至少一个额 外拷贝是通过染色体整合到产生牛心果碱的细胞中，从而增加产生牛心果碱的细胞内牛 心果碱的产生。在一些实施方案中，产生牛心果碱的细胞包含至少一个用于产生BBE、 S90MT、MT1、CAS、TNMT、CYP82Y1、CYP82X2、AT1、CYP82X1、CXE1、SDR1、 MT2和MT3中的至少一种的异源编码序列，其中每一编码序列是通过染色体整合到产 生牛心果碱的细胞中。在一些实施方案中，产生TyrH、4’OMT和NCS中的至少一种的 编码序列的至少一个额外拷贝是通过染色体整合到产生牛心果碱的细胞中，从而增加产 生牛心果碱的细胞内牛心果碱的产生。在一些实施方案中，产生CYP82X2和MT1中的 至少一种的编码序列的至少一个额外拷贝是通过染色体整合到产生牛心果碱的细胞中， 从而增加产生牛心果碱的细胞内诺斯卡品的产生。
在一些实施方案中，工程化的非植物细胞包含至少一个用于编码至少一种突变酶的 异源序列。在一些实施方案中，至少一种突变酶选自由CYP82Y1N-端突变体、CYP82X2 突变体、CYP82X1突变体组成的组。在一些实施方案中，工程化的非植物细胞包含至少 一个用于编码至少一种启动子的异源序列。在一些实施方案中，所述至少一种启动子选 自由HXT7、ADH1、PGK1、TPI1、PYK1、TEF1、GAL1、CYC1、PUT1、CIT2和 GPD组成的组。
在一些实施方案中，工程化的非植物细胞包含一种或多种选自由以下组成的组的植 物蛋白伴侣：结合性免疫球蛋白(BiP)、DnaJ蛋白、葡萄糖调节蛋白(GRP)94、结合蛋 白(BiP)、蛋白二硫化物异构酶(PDI)、亲环素和钙联蛋白。在一些实施方案中，酶中的 一种或多种在空间上定位于工程化的非植物细胞中的区室，其中区室选自由线粒体、内 质网(ER)、高尔基体(golgi)、液泡、细胞核、质膜、过氧化物酶体和周质组成的组。在 一些实施方案中，一种或多种酶在空间上定位于工程化的非植物细胞中的区室的外部。 在一些实施方案中，一种或多种酶在空间上定位于工程化的非植物细胞中的区室的内部。 在一些实施方案中，工程化的非植物细胞包含至少一个用于编码至少一种裁剪酶 (tailoringenzyme)的异源编码序列。在一些实施方案中，至少一种裁剪酶选自由卤化酶、 异戊烯转移酶、糖基化酶、甲基化酶、去甲基化酶和氧化还原酶组成的组。
本发明的另一方面提供形成具有苄基异喹啉生物碱产物的产物流的方法，所述苄基 异喹啉生物碱产物为坎那丁的下游产物(downstream)。所述方法包含培养工程化的非植 物细胞，所述工程化的非植物细胞沿着将坎那丁或坎那丁的类似物转化为类诺斯卡品产 物的代谢路径产生作为坎那丁衍生物的苄基异喹啉生物碱产物，所述类诺斯卡品产物包 含至少一种选自由类诺斯卡品、类诺斯卡品的前体、类诺斯卡品的代谢物、类诺斯卡品的类似物、类诺斯卡品的中间体和类诺斯卡品的衍生物组成的组的化合物，其中工程化 的非植物细胞包含至少一个用于编码至少一种参与将坎那丁或坎那丁类似物转化为类诺 斯卡品产物的代谢路径的酶的异源序列。所述方法还包含从细胞材料中分离出苄基异喹 啉生物碱产物以提供具有苄基异喹啉生物碱产物的产物流。
在一些实施方案中，工程化的非植物细胞中的至少一种酶的量多于未工程化的非植 物细胞中的至少一种酶的量。在一些实施方案中，至少一种参与将坎那丁转化为类诺斯卡品产物的代谢路径的酶选自由TNMT、CYP82X2、CYP82Y1、CPY82X1、AT1、6OMT、 CXE1、CXE1、SDR1、MT2和MT3组成的组。
在一些实施方案中，苄基异喹啉生物碱产物是苯酞异喹啉生物碱。在一些实施方案 中，苯酞异喹啉生物碱产物选自由罂粟壳碱半缩醛、那可汀半缩醛、罂粟壳碱和诺斯卡品组成的组。在一些实施方案中，苯酞异喹啉生物碱产物是罂粟壳碱半缩醛，且其中工 程化的非植物细胞包含CYP82X1和CXE1中的至少一种。在一些实施方案中，苯酞异 喹啉生物碱产物是那可汀半缩醛，且其中工程化的非植物细胞包含MT2、MT3、6OMT 和CXE1中的至少一种。在一些实施方案中，苯酞异喹啉生物碱产物是罂粟壳碱，且其 中工程化的非植物细胞包含CXE1和SDR1中的至少一种。在一些实施方案中，苯酞异 喹啉生物碱产物是诺斯卡品，且其中工程化的非植物细胞包含MT3、6OMT、CXE1和 SDR1中的至少一种。
在一些实施方案中，苄基异喹啉生物碱产物是原小檗碱产物。在一些实施方案中，原小檗碱产物选自由以下组成的组：1-羟基坎那丁、N-甲基坎那丁、N-甲基-左旋蛇果黄 堇碱、1-羟基-N-甲基坎那丁、那可托林、1,13-二羟基-N-甲基坎那丁和1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那丁。在一些实施方案中，原小檗碱产物是1-羟基坎那丁，且其中工程化的 非植物细胞包含CYP82Y1。在一些实施方案中，原小檗碱产物是N-甲基坎那丁，且其 中工程化的非植物细胞包含TNMT。在一些实施方案中，原小檗碱产物是N-甲基-左旋 蛇果黄堇碱，且其中工程化的非植物细胞包含TNMT和CYP82X2中的至少一种。在一 些实施方案中，原小檗碱产物是1-羟基-N-甲基-坎那丁，且其中工程化的非植物细胞包 含TNMT和CYP82Y1中的至少一种。在一些实施方案中，原小檗碱产物是那可托林， 且其中工程化的非植物细胞包含TNMT、CYP82Y1和CYP82X1中的至少一种。在一些 实施方案中，原小檗碱产物是1,13-二羟基-N-甲基坎那丁，且其中工程化的非植物细胞 包含TNMT、CYP82Y1和CYP82X2中的至少一种。在一些实施方案中，原小檗碱产物 是1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那丁，且其中工程化的非植物细胞包含CYP82Y1、 CYP82X2和AT1中的至少一种。
在一些实施方案中，苄基异喹啉生物碱产物选自由诺可托林吉地(norcotolinogendial)、4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛和3-O-乙酰基罂粟奥辛组成的组。在一些实施方案中，原小檗碱产物是诺可托林吉地，且其中工程化的非植物细胞包 含CYP82Y1、CYP82X2和CYP82X1中的至少一种。在一些实施方案中，原小檗碱产 物是4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛，且其中工程化的非植物细胞包含CYP82X2、AT1 和CYP82X1中的至少一种。在一些实施方案中，原小檗碱产物是3-O-乙酰基罂粟奥辛， 且其中工程化的非植物细胞包含AT1、CYP82X1、MT3和6OMT中的至少一种。
在一些实施方案中，工程化的非植物细胞是产生牛心果碱的细胞。在一些实施方案 中，产生牛心果碱的细胞包含用于产生PTPS、SepR、PCD、QDHPR、DHFR、TyrH、 NCS、DODC、CYP80B1、CPR、6OMT、4’OMT、CNMT、ARO4、ARO7、ARO10 和TKL1的编码序列，其中每一编码序列是通过染色体整合到产生牛心果碱的细胞中。 在一些实施方案中，产生TyrH、4’OMT和NCS中的至少一种的编码序列的至少一个额 外拷贝是通过染色体整合到产生牛心果碱的细胞中，从而增加产生牛心果碱的细胞内牛 心果碱的产生。在一些实施方案中，产生牛心果碱的细胞包含至少一个用于产生BBE、 S90MT、MT1、CAS、TNMT、CYP82Y1、CYP82X2、AT、CYP82X1、CXE1、SDR1、 MT2和MT3中的至少一种的异源编码序列，其中每一编码序列是通过染色体整合到产 生牛心果碱的细胞中。在一些实施方案中，产生TyrH、4’OMT和NCS中的至少一种的编码序列的至少一个额外拷贝是通过染色体整合到产生牛心果碱的细胞中，从而增加产生牛心果碱的细胞内牛心果碱的产生。
在一些实施方案中，工程化的非植物细胞包含至少一个编码至少一种突变酶的异源 序列。在一些实施方案中，至少一种突变酶选自由CYP82Y1N-端突变体、CYP82X2突 变体、CYP82X1突变体组成的组。在一些实施方案中，工程化的非植物细胞包含至少一 个编码至少一种启动子的异源序列。在一些实施方案中，所述至少一种启动子选自由 HXT7、ADH1、PGK1、TPI1、PYK1、TEF1、GAL1、CYC1、PUT1、CIT2和GPD 组成的组。
在一些实施方案中，工程化的非植物细胞包含一种或多种选自由以下组成的组的植 物蛋白伴侣：结合性免疫球蛋白(BiP)、DnaJ蛋白、葡萄糖调节蛋白(GRP)94、结合蛋 白(BiP)、蛋白二硫化物异构酶(PDI)、亲环素和钙联蛋白。在一些实施方案中，酶中的 一种或多种在空间上定位于工程化的非植物细胞中的区室，其中区室选自由线粒体、内 质网(ER)、高尔基体、液泡、细胞核、质膜、过氧化物酶体和周质组成的组。在一些实 施方案中，一种或多种酶在空间上定位于工程化的非植物细胞中的区室的外部。在一些 实施方案中，一种或多种酶在空间上定位于工程化的非植物细胞中的区室的内部。
在一些实施方案中，工程化的非植物细胞包含至少一个用于编码至少一种裁剪酶的 异源编码序列。在一些实施方案中，所述至少一种裁剪酶选自由卤化酶、异戊烯转移酶、糖基化酶、甲基化酶、去甲基化酶和氧化还原酶组成的组。在一些实施方案中，工程化 的非植物细胞选自微生物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞和酵母细胞的组。 在一些实施方案中，工程化的非植物细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，工程化的非 植物细胞是在体外条件下培养。在一些实施方案中，工程化的非植物细胞是在体内条件 下培养。
在一些实施方案中，产物流不含有超过5ppm的选自以下各项的组的分子：木质素、类黄酮、类菲(phenanthreoid)、乳胶、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶、袂康酸、假吗啡(pseudomorphine)、那碎因(narceine)、蒂巴酚(thebaol)和花粉。在一些实施方案中，产物流不含可检测量的杀虫剂。在一些实施方案中，产物流含有非植物细胞的至少一部分。在一些实施方案中，非植物细胞是工程化的非植物细胞。在一些实施方案中，非植物细 胞的至少一部分以可检测量存在于产物流中。在一些实施方案中，非植物细胞的至少一 部分使用液相色谱-质谱法可检测。在一些实施方案中，非植物细胞的至少一部分使用质 谱法可检测。在一些实施方案中，非植物细胞的至少一部分使用光谱法可检测。在一些 实施方案中，苄基异喹啉生物碱产物是使用至少液-液萃取从所述产物流中回收。在一些 实施方案中，苄基异喹啉生物碱产物是在完成发酵过程之后立即回收。
本发明的另一方面提供包含苄基异喹啉生物碱产物的药物组合物，所述苄基异喹啉 生物碱产物为沿着将坎那丁或坎那丁类似物转化为类诺斯卡品产物的代谢路径的坎那丁 衍生物，所述类诺斯卡品产物包含至少一种选自由类诺斯卡品、类诺斯卡品的前体、类诺斯卡品的代谢物、类诺斯卡品的类似物、类诺斯卡品的中间体和类诺斯卡品的衍生物 组成的组的化合物。所述药物组合物还包含非植物细胞的至少一部分。在一些实施方案 中，非植物细胞是工程化的非植物细胞。在一些实施方案中，非植物细胞的至少一部分 以可检测量存在于产物流中。在一些实施方案中，非植物细胞的部分使用液相色谱-质谱 法可检测。在一些实施方案中，非植物细胞的至少一部分使用质谱法可检测。
在一些实施方案中，非植物细胞的至少一部分使用光谱法可检测。在一些实施方案 中，所述组合物不含有超过5ppm的选自以下各项的组的分子：木质素、类黄酮、类菲、 乳胶、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶、袂康酸、假吗啡、那碎因、蒂巴酚和花粉。在一些 实施方案中，所述组合物不含可检测量的杀虫剂。在一些实施方案中，苄基异喹啉生物 碱产物包含诺斯卡品。在一些实施方案中，苄基异喹啉生物碱产物包含罂粟壳碱。在一 些实施方案中，苄基异喹啉生物碱产物包含那可汀半缩醛。在一些实施方案中，苄基异 喹啉生物碱产物包含罂粟壳碱半缩醛。在一些实施方案中，苄基异喹啉生物碱产物包含 3-O-乙酰基罂粟奥辛。在一些实施方案中，苄基异喹啉生物碱产物包含4’-O-去甲基-3-O- 乙酰基罂粟奥辛。
工程化的宿主细胞可以包括参与从起始化合物到所关注类诺斯卡品或其前体的合 成路径的各种酶的异源编码序列。还提供产生类诺斯卡品、其衍生物和/或其前体的方法， 所述方法是通过在促进由宿主细胞的异源编码序列编码的酶的活性的培养条件下培养工 程化宿主细胞进行。本发明的方面进一步包括组合物(例如宿主细胞)、起始化合物和试 剂盒等，其可以用于本发明的方法中。
以引用方式并入
此说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请都以引用方式并入本文中，其并 入程度与每一个别出版物、专利或专利申请特别且个别地指示以引用方式并入是一样的。
附图简述
本发明的新颖特性具体地阐述于随附权利要求书中。通过参考以下利用本发明的原 理并且阐述阐释性实施方案的详细说明和附图将更好地了解本发明的特性和优点，其中：
图1图解说明基于植物中的生物化学鉴定将坎那丁转化为诺斯卡品的生物合成方案。
图2A图解说明根据本发明的实施方案基于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的生 物化学表征将坎那丁转化为诺斯卡品的生物合成方案。
图2B图解说明根据本发明的实施方案基于酿酒酵母的生物化学表征将坎那丁转化 为诺斯卡品并且产生副产物的另一生物合成方案。
图3图解说明根据本发明的实施方案来自由工程化的酵母菌株分泌到培养基中的化 合物的液相色谱-质谱法(LC-MS)分析的EIC(萃取离子色谱)迹线。
图4图解说明根据本发明的实施方案在图3中描述的化合物的阳离子电喷雾电离(ESI)质谱MS/MS片段化。
图5图解说明根据本发明的实施方案在表达来自罂粟(Papaver somniferum)或花菱 草(Eschscholzia californica)的TNMT并且在坎那丁存在下生长的酵母体内N-甲基坎那 丁的合成。
图6图解说明根据本发明的实施方案在具有或不具有PsTNMT下在坎那丁存在下生长且在各种启动子的下游表达不同形式的CYP82Y1的酵母的体内测定结果。
图7图解说明根据本发明的实施方案在PsTNMT和CYP82Y1A存在下在坎那丁存 在下生长且在各种启动子(GAL1、GPD、PGK1、HXT7)的下游表达CYP82X2的酵母的 体内测定结果。
图8图解说明根据本发明的实施方案在具有或不具有CYP82X2和PsAT1的情况下在PsTNMT和CYP82Y1A存在下在坎那丁存在下生长且在各种启动子(GAL1、GPD、 PGK1、CYC1、ADH1、HXT7)的下游表达野生型(WT)的酵母的体内测定结果。
图9图解说明根据本发明的实施方案将全去甲劳丹碱转化为诺斯卡品的生物合成方 案。
图10图解说明根据本发明的实施方案来自由工程化的产生诺斯卡品的酵母菌株分 泌到培养基中的化合物的LC-MS分析的EIC(萃取离子色谱)迹线。
图11图解说明根据本发明的实施方案诺斯卡品从全去甲劳丹碱的生物合成。
图12图解说明根据本发明的实施方案诺斯卡品从酪氨酸的生物合成路径。
图13图解说明根据本发明的实施方案来自酵母中诺斯卡品重新产生的LC-MS分析的EIC(萃取离子色谱)迹线。
图14图解说明根据本发明的实施方案在酵母中类诺斯卡品的重新产生的例示性生 物合成示意图。
图15图解说明根据本发明的实施方案在酵母中类诺斯卡品的重新产生的另一例示 性生物合成示意图。
图16图解说明根据本发明的实施方案将葡萄糖转化为4-HPA、多巴胺(dopamine)和3,4-DHPA的生物合成方案。
图17图解说明根据本发明的实施方案通过去甲乌药碱将L-酪氨酸转化为牛心果碱 的生物合成方案。
图18图解说明根据本发明的实施方案通过全去甲劳丹碱将L-酪氨酸转化为牛心果 碱的生物合成方案。
图19图解说明根据本发明的实施方案四氢生物喋呤的合成、循环和再利用路径的实例。
图20图解说明根据本发明的实施方案将L-酪氨酸转化为原小檗碱、苯酞异喹啉和小檗碱生物碱产物的生物合成方案。
图21图解说明根据本发明的实施方案将L-酪氨酸转化为诺斯卡品、类诺斯卡品和苯酞异喹啉生物碱产物的生物合成方案。
图22图解说明根据本发明的实施方案将L-酪氨酸转化为血根碱和苯啡啶生物碱的 生物合成方案。
详述
本公开提供在工程化宿主细胞中产生多种苄基异喹啉生物碱(BIA)(例如类诺斯卡 品)的方法。本公开进一步提供在工程化宿主细胞中产生的多种类诺斯卡品的组合物。
类诺斯卡品是新兴类型的具有高水溶解性的微管调节抗癌剂，其作为用于治疗人癌 症的化学治疗剂令人感兴趣。类诺斯卡品属于鸦片(opium)生物碱的种类，所述鸦片生物 碱包括以苯酞异喹啉生物碱为特征的化合物。已经合成了多种类诺斯卡品，其显示增强的肿瘤特异性和肿瘤消退并且对正常组织几乎没有或没有毒性。基于类诺斯卡品的支架结构的不同点的接续合成修饰，辅以计算机设计和结构-活性关系研究，已基于修饰将类诺斯卡品分类为不同的“代”。诺斯卡品是类诺斯卡品化合物，50多年来其一直在世界各 地被用作咳嗽遏抑剂并且是在植物中自然制得的。诺斯卡品是母体化合物，已从所述母 体化合物衍生出许多类诺斯卡品化合物。诺斯卡品治疗癌症的能力在1998年就已得到证 实。尽管治疗癌症所需要的剂量远高于在其用作咳嗽遏抑剂时(癌症治疗的1,000-2,250 mg/天比对咳嗽治疗的45-200mg/天)，但诺斯卡品的副作用比传统化学疗法药物更少。 诺斯卡品以一个诺斯卡品分子/微管蛋白二聚体的化学计量结合到微管蛋白。然而，与结 合解聚(诺考达唑(nocodazole)、秋水仙碱(colchicine)和长春花生物碱(vinca alkaloid))或 过聚合微管蛋白(太平洋紫杉醇(paclitaxel))的其他微管蛋白化学治疗剂不同的是，诺斯卡品的抗癌活性可能源于其通过造成细胞凋亡的独特微管结合模式的微管的动力学稳定。从药理学角度来看，诺斯卡品作为微管结合药物具有许多优点：其可有效对抗耐多药性 癌细胞系，与正常分裂细胞不同地影响癌细胞，并且具有更好的药物代谢动力学性质， 没有显著副作用。
在详细描述本发明的方面之前，应了解本发明不应限于所描述的具体实施方案，因 此当然可以变化。还应了解本文所使用的术语是仅出于描述具体实施方案的目的并且并 不意图进行限制，因为本发明的范围将仅由随附权利要求限制。
除非上下文另外明确指示，否则在提供值的范围时，在所述范围的上限与下限之间 的每个以下限单位的十分之一为基准的中间值和在所陈述范围内的任何其他所陈述值或 中间值也涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围 内并且也涵盖在本发明内，在所陈述范围内受到任何特别排除的限制。在所陈述范围包括所述限值中的一个或两个时，不包括那些限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明内。
本文呈现某些在数值前具有术语“约”的范围。术语“约”在本文中用于为其之前的确 切数值以及接近或近似所述术语前的数值的数值提供文字支持。在确定数值是接近还是 近似特别叙述数值时，接近或近似的未叙述数值可以是在呈现其的背景下提供特别叙述 数值的实质等效物的数值。
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技 术人员通常理解相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中还可以使用类似或等效于本 文所描述的那些方法和材料的任何方法和材料，但现在描述代表性阐释性方法和材料。
本文所用术语“路径衍生物”指的是具有衍生自母体或参考化合物的结构的化学结 构的化合物(例如本文公开的化合物)，所述化学结构的不同之处在于至少一个结构差异， 例如在于一个或多个取代基被添加、去除、修饰和/或进一步取代。结构差异可以通过(例 如)环化或开环转化而改变母体或参考化合物的核心。例如，牛心果碱的路径衍生物包括 多花罂粟碱(salutaridine)和蒂巴因(thebaine)。结构差异可通过任一方法(例如通过诱导的 化学转化、通过酶促催化和/或通过自发反应)而产生。除非明确指示相反的情形，否则 路径衍生物无需使用母体或参考化合物作为起始材料或作为中间体来合成，但在一些情 形下，可以从母体或参考化合物合成衍生物。
本文所用术语“类似物”和“衍生物”指的是具有与母体或参考化合物的结构不同的 化学结构的化合物(例如化合物本文公开的)，不同之处在于具有至少一个结构差异，例如从母体或参考化合物添加、去除、修饰和/或进一步取代一个或多个取代基。结构差异 可以通过(例如)环化或开环转化而改变母体或参考化合物的核心。例如，N-甲基坎那丁、 9-甲基-N-甲基坎那丁和6-氯-坎那丁是坎那丁的类似物。酪氨酸的类似物包括(例如)α- 氯-酪氨酸、α-甲基酪氨酸和3-硝基-酪氨酸。结构差异可通过任一方法(例如通过诱导的 化学转化、通过酶促催化和/或通过自发反应)产生。除非明确指示相反的情形，否则类 似物无需使用母体或参考化合物作为起始材料或作为中间体来合成，但在一些情形下， 可以从母体或参考化合物合成类似物。
本文所用术语“功能化衍生物”指的是具有与参考化合物有区别的结构特性的化合 物，其中有区别的特性是存在于化合物的合成中所使用的起始材料中。例如，3-氯-牛心果碱可以从α-氯-l-酪氨酸产生并且在本文中被视为牛心果碱的功能化衍生物，因为区分所述两种化合物的氯离子是所用起始材料的特性并且不是通过合成中的步骤引入的。其他实例包括宿主细胞可以从α-羟基-l-酪氨酸产生的坎那丁的功能化衍生物6-羟基-坎那丁和从3-硝基-l-酪氨酸产生的罂粟壳碱的功能化衍生物7-硝基-罂粟壳碱。
应注意，除非上下文另有明确指示，否则如本文和随附权利要求中所使用的单数形 式“一(a、an)”和“所述”包括复数个指示物。应进一步注意可以起草权利要求以排除任一 可选要素。因此，这声明旨在与要求保护的要素的叙述结合使用诸如“唯一”、“仅”等等排他性术语或使用“否定”限制的先行基础。
所属领域技术人员在阅读此公开内容之后将明了，本文所描述和阐释的个别实施方 案中的每一个都具有离散组分和特性，所属组分和特性可容易地与其他几个实施方案中 的任一个的特性分离或组合，而不背离本发明的范围或精神。任一所叙述方法可按照所叙述事件的顺序或按照在逻辑上可能的任何其他顺序来实施。
类诺斯卡品
本发明提供产生类诺斯卡品产物的宿主细胞。类诺斯卡品产物包括类诺斯卡品、类 诺斯卡品的前体、类诺斯卡品的代谢物、类诺斯卡品的类似物、类诺斯卡品的中间体和/或类诺斯卡品的衍生物。在一些实例中，宿主细胞的工程化菌株(例如本发明的工程化菌株)提供产生跨几个结构类别的类诺斯卡品产物和其修饰的平台，包括(但不限于)苄基异喹啉生物碱、原小檗碱、西库柏宾(secoberbine)、苯酞异喹啉和其他。这些类别中的每 一种都意在包括可以产生所述类别成员的工程化宿主细胞生物合成路径的任一合宜成员 的生物合成前体、中间体和其代谢物。在下文针对这些结构类别中的每一种给出化合物 的非限制性实例。在一些情形下，所给实例的结构可以或可以不被自身描述为苄基异喹 啉生物碱。本发明化学实体意在包括所有可能的异构体，包括单一对映异构体、外消旋 混合物、光学纯形式、非对映异构体的混合物和中间体混合物。
原小檗碱可以包括(但不限于)金黄紫堇碱、碎叶紫堇碱、刺罂粟碱、南天竹碱、药根碱、光千金藤定碱、离生木瓣树胺、顺式-N-甲基刺罂粟碱、四氢非洲防己碱、掌叶防 己碱、四氢掌叶防己碱、非洲防己碱、坎那丁、N-甲基坎那丁、1-羟基坎那丁、小檗碱、 N-甲基-左旋蛇果黄堇碱、1,13-二羟基-N-甲基坎那丁和1-羟基-10-O-乙酰基-N-甲基坎那 丁。
西库柏宾可以包括(但不限于)4’-O-去甲基马克兰特醛 (4’-O-desmethylmacrantaldehyde)、4’-O-去甲基罂粟奥辛、4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟 奥辛、罂粟奥辛和3-O-乙酰基罂粟奥辛。
苯酞异喹啉可以包括(但不限于)罂粟壳碱半缩醛、那可汀半缩醛、罂粟壳碱、诺斯卡品、紫罂粟次碱、紫罂粟碱、(+)或(-)-荷苞牡丹碱(bicuculline)、咖诺定(capnoidine)、紫堇明(carlumine)、对叶延胡索碱(corledine)、紫堇米定碱(corlumidine)、夏无碱(decumbenine)、5’-O-去甲基那可汀、(+)或(-)-α或β-北美黄连碱和细果角茴香碱。
类诺斯卡品可以是诺斯卡品的衍生物或类似物并且因此还可以被表征为苯酞异喹 啉生物碱。任何合宜的类诺斯卡品都可以被靶向以在本发明宿主细胞中产生。所关注诺斯卡品类似物包括(但不限于)包括以下的诺斯卡品化合物：在6′位、9′位、1位和7位的 修饰、用(例如)N-乙基胺基羰基替代6′位的天然存在的N-甲基、在9′-位经(例如)卤基、 芳基、烷基、叠氮基或硝基取代、区域选择性O-去甲基化以露出7位的游离酚和将内酯 在1位还原成相应的环状醚；例如化合物9-溴诺斯卡品、9-硝基诺斯卡品和9-叠氮基诺 斯卡品和Naik等人Journal of Molecular Modeling,2012,18(1):307-318和Lopus和Naik,“Taking aim at a dynamic target:Noscapinoids as microtubule-targeted cancertherapeutics”,Pharmacological Reports,67(1)2015,56-62(在线公布，2014)所描述的那 些化合物，所述文献的公开内容以引用方式整体并入本文中。
术语“类诺斯卡品产物”意在包括类诺斯卡品、类诺斯卡品的前体、类诺斯卡品的代 谢物、类诺斯卡品的类似物、类诺斯卡品的中间体和/或类诺斯卡品的衍生物。在一些实例中，类诺斯卡品衍生物和/或类诺斯卡品的衍生物可以包含路径衍生物。在一些实例中，类诺斯卡品衍生物和/或类诺斯卡品的衍生物可以包含功能化衍生物。在实例中，类诺斯卡品产物可以指代任何合宜的原小檗碱、断裂小檗碱(secoberberine)或苯酞异喹啉生物碱，其可以是细胞合成路径中的诺斯卡品前体或所关注类诺斯卡品，包括(但不限于)1- 羟基-N-甲基坎那丁、诺斯卡品、罂粟壳碱、那可汀半缩醛、4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂 粟奥辛、罂粟壳碱半缩醛、N-甲基左旋蛇果黄堇碱、1,13-二羟基-N-甲基坎那丁、1-羟 基-13-O乙酰基-N-甲基坎那丁、那可托林吉地(也就是4’-O-去甲基罂粟奥辛)、那可托林 (也就是4’-O-去甲基马克兰特醛)和1-羟基坎那丁。在一些情况下，类诺斯卡品产物是所 关注合成路径中坎那丁的下游产物或坎那丁的类似物。
在一些实施方案中，细胞产生诺斯卡品。在某些情况下，细胞产生诺斯卡品的衍生物。在一些情形下，细胞产生图2A和2B中所描述的诺斯卡品前体。在一些情况下，细 胞产生1-羟基-N-甲基坎那丁。在某些实施方案中，细胞产生1-羟基坎那丁。在一些情形 下，细胞产生1,13-二羟基-N-甲基坎那丁。在一些情况下，细胞产生N-甲基-左旋蛇果 黄堇碱。在某些情形下，细胞产生4’-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛。在某些实施方案中， 细胞产生那可托林和那可托林吉地。
类诺斯卡品或其前体的合成路径可以在宿主细胞中生成并且可以始于任何合宜的 起始化合物或材料。在宿主细胞中生成的合成路径可以始于为所关注类诺斯卡品的前体 的任何合宜化合物。本发明宿主细胞的合成路径可以与任何合宜的上游或下游产物合成 路径连接以从期望起始化合物产生靶标生物碱。起始化合物可以是从靶标去除一个或多 个生物合成步骤(例如去除两个或更多个、三个或更多个或几个生物合成步骤)的前体。在一些情形下，起始化合物本身由宿主细胞产生。细胞可以通过包括一种或多种诺斯卡 品前体的合成路径从坎那丁产生诺斯卡品或所关注类诺斯卡品，所述诺斯卡品前体选自 由以下组成的组：(S)-N-甲基坎那丁、1-羟基-N-甲基坎那丁、1,13-二羟基-N-甲基坎那丁、1-羟基-13-O乙酰基-N-甲基坎那丁、4’-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛、罂粟壳碱半缩醛和罂粟壳碱。
产生所关注起始化合物的任何合宜的宿主细胞都可适用于本发明细胞中以产生类 诺斯卡品或其前体。所关注起始化合物包括(但不限于)可以存在于内源性类诺斯卡品路 径中的全去甲劳丹碱、坎那丁、金黄紫堇碱、四氢小檗红碱、刺罂粟碱、碎叶紫堇碱、 四氢掌叶防己碱和靶标分子的任何其他合宜前体。在一些情形下，将起始化合物添加到 宿主细胞中，所述宿主细胞将所述化合物转化为所关注类诺斯卡品或其前体。在一些实 施方案中，起始化合物是坎那丁。图2A和2B图解说明从(S)-坎那丁开始合成诺斯卡品 和其前体的路径。在某些实施方案中，起始化合物是全去甲劳丹碱。图9图解说明从全 去甲劳丹碱开始合成诺斯卡品和其前体的路径。在某些情况下，起始化合物可以由产生 全去甲劳丹碱的细胞或产生坎那丁的细胞产生，所述细胞适于包括产生所关注类诺斯卡 品或其前体的生物合成路径。在某些实施方案中，起始化合物是酪氨酸。
因此，起始材料可以是非天然存在的或起始材料可以是天然存在的。基于宿主细胞 中存在的合成路径，还可以在所需合成路径中使用其他化合物作为起始材料。起始材料的来源可以来自宿主细胞本身，例如酪氨酸，或可以从外部来源将起始材料添加或补充 到宿主细胞。例如，如果宿主细胞在液体培养物(体内环境)中生长，那么可以用起始材 料(例如酪氨酸或全去甲劳丹碱)补充细胞培养基，所述起始材料被运输到细胞中并转化 为所需产物。
宿主细胞
如上文所汇总，本发明的一个方面是产生类诺斯卡品产物的宿主细胞。如本文所使 用，术语“产生类诺斯卡品的细胞”意在包括工程化以通过合成路径从起始化合物产生类 诺斯卡品产物的细胞。本发明宿主细胞可以产生任何合宜的类诺斯卡品产物，包括(但不 限于)1-羟基-N-甲基坎那丁、N-甲基坎那丁、诺斯卡品、罂粟壳碱、那可汀半缩醛、4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛、罂粟壳碱半缩醛、N-甲基左旋蛇果黄堇碱、1-羟基-13-O- 乙酰基-N-甲基坎那丁、1,13-二羟基-N-甲基坎那丁、那可托林吉地、3-O-乙酰基-罂粟奥 辛、那可托林和1-羟基坎那丁。
在本发明宿主细胞和方法中可以利用任何合宜的细胞。在一些情形下，宿主细胞是 非植物细胞。在一些情况下，宿主细胞可以被描述为微生物细胞。在某些情形下，宿主细胞是昆虫细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞或酵母细胞。在产生本发明细胞产生本发明 产生类诺斯卡品的细胞中可以利用任何合宜类型的宿主细胞，参见(例如) US2008/0176754、WO/2012/039438、WO2013136057、US20140273109和在2014年11 月3日提交的PCT申请序列号US2014/063738，所述申请的公开内容以引用方式整体并 入。
所关注宿主细胞包括(但不限于)细菌细胞，例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大 肠杆菌(Escherichia coli)、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙氏杆菌(Salmonella typhimuium)细胞；昆虫细胞，例如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)S2和草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)Sf9细胞；和酵母细胞，例如酿酒酵母、栗酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。在一些实例中，宿 主细胞是酵母细胞或大肠杆菌(E.coli)细胞。在一些情形下，宿主细胞是酵母细胞。在一 些情况下，宿主细胞来自工程化以产生的酵母菌株。在某些情况下，酵母细胞是可用于 工业过程中的酵母细胞，例如来自毕赤酵母属的酵母细胞，包括(但不限于)粉状毕赤酵 母(P.farinose)、异常毕赤酵母(P.anomala)、黑迪氏毕赤酵母(P.heedii)、季也蒙毕赤酵母 (P.guilliermondii)、克鲁弗毕赤酵母(P.kluyveri)、膜璞毕赤酵母(P.membranifaciens)、挪 威毕赤酵母(P.norvegensis)、奥默毕赤酵母(P.ohmeri)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、甲 醇毕赤酵母(Pichia methanolica)和亚膜毕赤酵母(P.subpelliculosa)。
在US2008/0176754、WO/2012/039438、WO2013136057、US20140273109和PCT 申请序列号US2014/063738中由Smolke等人描述的宿主细胞中的任一种可以适用于本 发明细胞和方法中。在某些实施方案中，酵母细胞可以是酿酒酵母(酿酒酵母(S. cerevisiae))物种。在某些实施方案中，酵母细胞可以是栗酒裂殖酵母物种。在某些实施 方案中，酵母细胞可以是巴斯德毕赤酵母物种。酵母作为宿主细胞是令人关注的，因为 细胞色素P450蛋白能适当地折叠到内质网膜中从而维持其活性。在实例中，细胞色素 P450蛋白参与一些所关注生物合成路径。在其他实例中，细胞色素P450蛋白参与类诺 斯卡品产物的产生。
可用于本发明中的所关注酵母菌株包括(但不限于)CEN.PK(基因型：MATa/αura3-52/ura3-52 trp1-289/trp1-289 leu2-3_112/leu2-3_112 his3 Δ1/his3 Δ1MAL2-8C/MAL2-8C SUC2/SUC2)、S288C、W303、D273-10B、X2180、A364A、∑1278B、 AB972、SK1和FL100。在某些情形下，酵母菌株是以下中的任一种：S288C(MATα； SUC2 mal mel gal2CUP1 flo1 flo8-1 hap1)、BY4741(MATα；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0； ura3Δ0)、BY4742(MATα；his3Δ1；leu2Δ0；lys2Δ0；ura3Δ0)、BY4743(MATa/MATα； his3Δ1/his3Δ1；leu2Δ0/leu2Δ0；met15Δ0/MET15；LYS2/lys2Δ0；ura3Δ0/ura3Δ0)和WAT11 或W(R)，W303-B菌株的衍生菌株(MATa；ade2-1；his3-11,-15；leu2-3,-112；ura3-1； canR；cyr+)，所述菌株分别表达拟南芥(Arabidopsis thaliana)NADPH-P450还原酶ATR1 和酵母NADPH-P450还原酶CPR1。在另一实施方案中，酵母细胞是W303α(MATα； his3-11,15 trp1-1 leu2-3ura3-1 ade2-1)。其他所关注酵母菌株的特性和基因型可以参见 EUROSCARF(web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/col_index.html)。
宿主细胞的遗传修饰
宿主细胞可以工程化以包括一种或多种产生类诺斯卡品产物的修饰(例如两种或更 多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多种修饰)。在一些情形下，修饰是遗传修饰，例如基因或其片段的突变、添加或缺失或基因或其片段的转录调节。 如本文所使用，术语“突变”指的是相对于参考序列或基序的氨基酸残基或核苷酸残基缺 失、插入或取代。突变可以在原始基因座处作为定向突变并入天然存在基因中。在一些 情形下，突变可以作为在单独基因座处作为遗传整合引入的基因的另一拷贝或作为附加 型载体(如2μ或着丝粒质粒)上的另一拷贝并入。在某些情况下，酶的底物抑制拷贝是在 天然细胞转录调节下进行。在一些情况下，酶的底物抑制拷贝是在蛋白质表达的工程化 组成型或动态调节的情况下通过将其置于合成启动子的控制之下引入。在一些实例中， 一种或多种修饰的目标可以是天然存在基因。在一些实例中，一种或多种修饰的目标可 以是非天然存在基因。在一些实例中，可以将非天然存在基因插入宿主细胞中。在其他 实例中，可以通过一种或多种修饰改变非天然存在基因，之后将其插入宿主细胞中。
工程化的宿主细胞可能过度产生一种或多种类诺斯卡品产物。过度产生意味着相对 于对照细胞(例如未修饰细胞)细胞具有改良的或增加的类诺斯卡品产物产生。改良的或 增加的产生意味着在对照没有产生类诺斯卡品产物时，产生一定量的类诺斯卡品产物，以及在对照产生一些类诺斯卡品产物的情况中，增加约10％或更多，例如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％ 或更多，例如2倍或更多倍，例如5倍或更多倍(包括10倍或更多倍)。
在一些情形下，所述一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种) 修饰可以选自：生物合成酶基因中的底物抑制缓解突变；生物合成酶基因中的产物抑制 缓解突变；辅因子回收促进机制；生物合成酶基因中的反馈抑制缓解突变；和生物合成酶基因的转录调节修饰；酶基因中的失活突变。
底物抑制缓解突变
在一些情况下，工程化的宿主细胞是在细胞的一种或多种生物合成酶基因中包括一 种或多种底物抑制缓解突变(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多种)的细胞。在一些实例中，所述一种或多种生物合成酶基因对于细胞是天然的(例如存在于未修饰细胞中)。在一些实例中，所述一种或多种生物合成酶基因 对于细胞是非天然的。如本文所使用，术语“底物抑制缓解突变”指的是缓解细胞的底物 抑制控制机制的突变。
缓解底物抑制的突变相对于对照细胞在所关注细胞中减少受调节酶的抑制并且增 加受调节化合物或其下游生物合成产物的含量。在一些情形下，受调节酶的缓解抑制意味着抑制的IC50增加2倍或更多倍，例如增加3倍或更多倍、5倍或更多倍、10倍或更 多倍、30倍或更多倍、100倍或更多倍、300倍或更多倍、1000倍或更多倍或甚至更多 倍。增加的含量意味着工程化的宿主细胞中受调节化合物或其下游产物的含量为对照细 胞中受调节化合物或其下游产物的含量的110％或更多、例如120％或更多、130％或更 多、140％或更多、150％或更多、160％或更多、170％或更多、180％或更多、190％或 更多或200％或更多，例如至少3倍或更多倍、至少5倍或更多倍、至少10倍或更多倍 或甚至更多倍。
工程化的宿主细胞中针对诺斯卡品产物含量调节的各种底物抑制控制机制和生物 合成酶可以被靶向用于底物抑制缓解。工程化的宿主细胞可以在一种或多种生物合成酶 基因中包括一种或多种底物抑制缓解突变。所述一种或多种突变可以位于生物合成酶受 到调节控制的任何合宜的生物合成酶基因中。在一些实施方案中，工程化的宿主细胞可以在一种或多种生物合成酶基因(例如表1中所描述的那些基因中的一个)中包括一种或多种底物抑制缓解突变。
可以利用任何合宜数量和类型的突变来缓解底物抑制控制机制。在某些实施方案中，本发明的工程化的宿主细胞可以在工程化的宿主细胞内的一种或多种生物合成酶基因中包括1种或多种、2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6 种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更 多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种或甚至15种或更多种底物抑制缓 解突变，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种底物抑制缓解 突变。
辅因子回收促进机制
在一些情况下，工程化的宿主细胞是在细胞的一种或多种生物合成酶基因中包括一 种或多种辅因子回收促进机制(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多种)的细胞。在一些实例中，所述一种或多种生物合成酶基因对于细胞是天然的(例如存在于未修饰细胞中)。在一些实例中，所述一种或多种生物合成酶基 因对于细胞是非天然的。如本文所使用，术语“辅因子回收促进机制”指的是促进细胞的 辅因子回收控制机制的机制。在一些实例中，用于回收的所述一种或多种所关注辅因子 包括(但不限于)S-腺苷甲硫氨酸、烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟碱酰胺腺嘌呤二核 苷酸、四氢生物喋呤和黄素腺嘌呤二核苷酸。
在工程化的宿主细胞中针对类诺斯卡品产物含量调节的各种辅因子回收控制机制 和生物合成酶可以被靶向用于辅因子回收促进。工程化的宿主细胞可以在一种或多种生 物合成酶基因中包括一种或多种辅因子回收促进机制。在一些实例中，工程化的宿主细胞可以在一种或多种生物合成酶基因(例如表1中所描述的那些基因中的一种)中包括一种或多种辅因子回收促进机制。
可以利用任何合宜数量和类型的机制来促进辅因子回收控制机制。在某些实施方案 中，本发明的工程化的宿主细胞可以在工程化的宿主细胞内的一种或多种生物合成酶基 因中包括1种或多种、2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6 种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更 多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种或甚至15种或更多种辅因子回收 促进机制，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种辅因子回收 促进机制。
产物抑制缓解突变
在一些情况下，工程化的宿主细胞是在细胞的一种或多种生物合成酶基因中包括一 种或多种产物抑制缓解突变(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多种)的细胞。在一些实例中，所述一种或多种生物合成酶基因对于细胞是天然的(例如存在于未修饰细胞中)。在一些实例中，所述一种或多种生物合成酶基因 对于细胞是非天然的。如本文所使用，术语“产物抑制缓解突变”指的是缓解工程化的宿 主细胞的短期和/或长期产物抑制控制机制的突变。短期产物抑制是细胞中在辅底物结合 位点处存在竞争结合的控制机制。长期产物抑制是细胞中远离所需路径存在不可逆结合 的控制机制。
缓解产物抑制的突变相对于对照细胞可在所关注细胞中减少受调节酶的抑制并且 增加受调节化合物或其下游生物合成产物的含量。在一些情形下，受调节酶的缓解抑制意味着抑制的IC50增加2倍或更多倍，例如增加3倍或更多倍、5倍或更多倍、10倍或 更多倍、30倍或更多倍、100倍或更多倍、300倍或更多倍、1000倍或更多倍或甚至更 多倍。增加的含量意味着的对照细胞中受调节化合物或其下游产物的含量为工程化的宿 主细胞中受调节化合物或其下游产物的含量的110％或更多，例如120％或更多、130％ 或更多、140％或更多、150％或更多、160％或更多、170％或更多、180％或更多、190％ 或更多或200％或更多，例如至少3倍或更多倍、至少5倍或更多倍、至少10倍或更多 倍或甚至更多倍。
工程化的宿主细胞中针对类诺斯卡品产物含量调节的各种产物抑制控制机制和生 物合成酶可以被靶向用于产物抑制缓解。工程化的宿主细胞可以在一种或多种生物合成 酶基因中包括一种或多种产物抑制缓解突变。突变可以位于生物合成酶受到调节控制的 任何合宜的生物合成酶基因中。在一些实施方案中，工程化的宿主细胞在一种或多种生物合成酶基因(例如表1中所描述的那些基因中的一种)中包括一种或多种产物抑制缓解突变。
可以利用任何合宜数量和类型的突变来缓解产物抑制控制机制。在某些实施方案中，本发明的工程化的宿主细胞可以在工程化的宿主细胞内的一种或多种生物合成酶基因中包括1种或多种、2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6 种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更 多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种或甚至15种或更多种产物抑制缓 解突变，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种产物抑制缓解 突变。
反馈抑制缓解突变
在一些情况下，工程化的宿主细胞是在细胞的一种或多种生物合成酶基因中包括一 种或多种反馈抑制缓解突变(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多种)的细胞。在一些情形下，所述一种或多种生物合成酶基因对于细胞是天然的(例如存在于未修饰细胞中)。另外或或者，在一些实例中，所述一种或多种生 物合成酶基因对于细胞是非天然的。如本文所使用，术语“反馈抑制缓解突变”指的是缓 解工程化的宿主细胞的反馈抑制控制机制的突变。反馈抑制是细胞中受调节化合物合成 路径中的酶在所述化合物积累到某一水平时被抑制从而平衡细胞中所述化合物的量的控 制机制。缓解反馈抑制的突变相对于对照细胞在工程化的宿主细胞中减少受调节酶的抑 制。以此方式，工程化的宿主细胞增加受调节化合物或其下游生物合成产物的含量。在 一些情形下，受调节酶的缓解抑制意味着抑制的IC50增加2倍或更多倍，例如增加3倍 或更多倍、5倍或更多倍、10倍或更多倍、30倍或更多倍、100倍或更多倍、300倍或 更多倍、1000倍或更多倍或甚至更多倍。增加的含量意味着对照细胞中受调节化合物或 其下游产物的含量为宿主细胞中受调节化合物或其下游产物的含量的110％或更多，例 如120％或更多、130％或更多、140％或更多、150％或更多、160％或更多、170％或更 多、180％或更多、190％或更多,或200％或更多，例如至少3倍或更多倍、至少5倍或 更多倍、至少10倍或更多倍或甚至更多。
在宿主细胞中针对所关注BIA的含量的调节的各种反馈抑制控制机制和生物合成酶可以被靶向用于缓解。宿主细胞可以在一种或多种对于细胞天然的生物合成酶基因中包括一种或多种反馈抑制缓解突变。所述一种或多种突变可以位于生物合成酶受到调节控制的任何合宜的生物合成酶基因中。在一些实施方案中，工程化的宿主细胞可以在一 种或多种生物合成酶基因(例如表1中所描述的那些基因中的一种)中包括一种或多种反 馈抑制缓解突变。
可以利用任何合宜数量和类型的突变来缓解反馈抑制控制机制。如本文所使用，术 语“突变”指的是相对于参考序列或基序的氨基酸残基或核苷酸残基的缺失、插入或取代。 突变可以在原始基因座处作为定向突变并入天然存在基因。在一些情形下，突变可以在 单独基因座处作为以遗传整合引入的基因的另一拷贝或作为附加型载体(例如2μ或着丝 粒质粒)上的另一拷贝并入。在某些情况下，酶的反馈抑制拷贝是在天然细胞转录调节下 进行。在一些情况下，酶的反馈抑制拷贝是在蛋白质表达的工程化组成型或动态调节的情况下通过将其置于合成启动子的控制之下引入。
在某些实施方案中，本发明的工程化的宿主细胞可以在工程化的宿主细胞内的一种 或多种生物合成酶基因中包括1种或多种、2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、 5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更 多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种或甚至15种或更 多种反馈抑制缓解突变，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15 种反馈抑制缓解突变。
转录调节修饰
宿主细胞可以包括细胞的一种或多种生物合成酶基因的一种或多种转录调节修饰 (例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多种修饰)。在一些实例中，所述一种或多种生物合成酶基因对于细胞是天然的。在一些实例中，所 述一种或多种生物合成酶基因对于细胞是非天然的。细胞的任何合宜的生物合成酶基因 都可以被靶向用于转录调节。转录调节意味着相对于对照细胞(例如未修饰细胞)在被修 饰细胞中所关注基因的表达被调节，例如增加或减少、增强或抑制。在一些情形下，所 关注基因的转录调节包括增加或增强表达。增加或增强表达意味着与对照(也就是在未修 饰的相同细胞中的表达)相比，所关注基因的表达水平增加2倍或更多倍，例如增加5倍 或更多倍并且有时增加25倍、50倍或100倍或更多倍，并且在某些实施方案中为300 倍或更多倍或更高(例如通过使用任何合宜的基因表达测定)。或者，在细胞中的所关注 基因表达得如此低使得其检测不到的情形下，如果表达增加到容易可检测的水平，那么 所关注基因的表达水平被视为有所增加。在某些情况下，所关注基因的转录调节包括减 少或抑制表达。减少或抑制表达意味着与对照相比，所关注基因的表达水平减少2倍或 更多倍，例如减少5倍或更多倍并且有时候减少25倍、50倍或100倍或更多倍并且在 某些实施方案中为300倍或更多倍或更高。在一些情形下，表达减少到检测不到的水平。 可适用于本发明宿主细胞中的所关注宿主细胞过程的修饰在美国公布号20140273109 (14/211,611)中由Smolke等人描述，所述公布的公开内容以引用方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，转录调节修饰可以包括用强启动子取代所述一种或多种生物合 成酶基因的天然启动子或使一种或多种基因的额外拷贝的表达处于强启动子之下。所关 注基因的启动子驱动表达可以是组成型启动子或可诱导型启动子，前提是启动子在宿主 细胞中可具有活性。所关注基因可以从其天然启动子来表达。另外或或者，所关注基因可以从非天然启动子来表达。尽管不作要求，但此类启动子在使用其的宿主中可以是中 等强度到高强度的。启动子可以是调节型或组成型的。在一些实施方案中，可以使用不 受葡萄糖抑制或仅因培养基中葡萄糖的存在受轻微抑制的启动子。存在众多适宜启动子， 其实例包括糖酵解基因的启动子，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)tsr基因的启动子(编码 果糖二磷酸醛缩酶)或来自酵母酿酒酵母的GAPDH启动子(编码甘油醛-磷酸脱氢酶) (BitterG.A.,Meth.Enzymol.152:673 684(1987))。其他所关注强启动子包括(但不限于) 面包酵母(baker's yeast)的ADHI启动子(Ruohonen L.等人，J.Biotechnol.39:193 203(1995))、磷酸盐饥饿诱导型启动子(例如酵母的PHO5启动子(Hinnen,A.等人，YeastGenetic Engineering,Barr,P.J.等人编辑,Butterworths(1989))、来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的碱性磷酸酶启动子(Lee.J.W.K.等人，J.Gen.Microbiol.137:1127 1133(1991))、GPD1和TEF1。所关注酵母启动子包括(但不限于)可诱导型启动子(例如 Gal1-10、Gal1、GalL、GalS、可抑制启动子Met25、tetO)和组成型启动子(例如甘油醛 3-磷酸脱氢酶启动子(GPD)、醇脱氢酶启动子(ADH)、翻译-延长因子-1-α启动子(TEF)、 细胞色素c-氧化酶启动子(CYC1)、MRP7启动子等)。在一些情况下，强启动子是GPD1。 在某些情况下，强启动子是TEF1。含有可通过激素(例如糖皮质激素、类固醇和甲状腺 激素)诱导的启动子的自主复制型酵母表达载体也为已知的且包括(但不限于)糖皮质激素 应答元件(GRE)和甲状腺激素应答元件(TRE)，例如参见在美国专利号7,045,290中描述 的那些启动子。可以使用含有组成型或可诱导启动子(例如α因子、醇氧化酶和PGH)的 载体。另外，还可以使用任一启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库EPDB)来驱动 所关注基因的表达。应了解可以选择对宿主细胞特异的任何合宜启动子，例如大肠杆菌。 在一些情形下，可以使用启动子选择来优化转录且因此优化酶含量以最大化产量同时最 小化能源。
使突变失活
工程化的宿主细胞可以包括针对细胞酶的一种或多种失活突变(例如两种或更多种、 三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多种)。包含一种或多种失活突变 可以改变工程化的宿主细胞的合成路径的通量以增加所关注BIA或产生所述BIA的期望酶或前体的含量。在一些实例中，所述一种或多种失活突变是针对对于细胞天然的酶。 另外或或者，所述一种或多种失活突变是针对对于细胞非天然的酶。如本文所使用，“失 活突变”意思是针对细胞的基因或调节DNA序列的一种或多种突变，其中所述突变使通 过所述所关注基因表达的蛋白质的生物活性失活。在一些情形下，基因对于细胞是天然 的。在一些情况下，基因所编码的酶失活且为由宿主细胞产生的所关注BIA的合成路径 的一部分或与之相连。在一些情况下，失活突变位于控制所关注基因的调节DNA序列 中。在某些情形下，失活突变是针对基因的启动子。可以利用任何合宜的突变(例如如本 文所描述)使所关注基因或调节DNA序列失活。“失活(inactivated或inactivates)”意味着 相对于由非突变对照基因表达的对照蛋白质，由突变基因表达的蛋白质的生物活性降低 10％或更多，例如降低20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更 多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多或99％或更多。 在一些情形下，蛋白质是酶并且失活突变降低所述酶的活性。
在一些实例中，工程化的宿主细胞包括对于细胞天然的酶中的失活突变。任何合宜 的酶都可以被靶向用于失活。所关注酶可以包括(但不限于)表1中所描述的那些酶，其在工程化宿主细胞的合成路径中的作用往往降低类诺斯卡品产物的含量。
异源编码序列
在一些情况下，工程化的宿主细胞具有一个或多个用于编码使得工程化的宿主细胞 能够产生所需类诺斯卡品产物的活性的异源编码序列(例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个)，例如如本文所描述。如本文所使用，术语“异源编 码序列”用于指示任一编码或最后编码肽或蛋白质或其等效氨基酸序列(例如酶)的多核 苷酸，其通常不存在于宿主生物体中并且可以在适当条件下在宿主细胞中表达。因此，“异 源编码序列”包括通常存在于宿主细胞中的编码序列的多个拷贝，使得细胞表达通常不存 在于细胞中的编码序列的额外拷贝。异源编码序列可以是RNA或其任一类型(例如 mRNA)、DNA或其任一类型(例如cDNA)或RNA/DNA的混合物。所关注编码序列包括 (但不限于)包括诸如编码序列、内含子、启动子区、3'-UTR和增强子区等特性的全长转 录单元。
工程化的宿主细胞还可以被修饰以具有一种或多种遗传变化以纳入异源编码序列。 天然宿主基因组的变化包括(但不限于)修饰基因组以减少或消除可以干扰所需路径的特 定蛋白质的表达。此类天然蛋白的存在可以将路径的中间体或最终产物中的一种迅速转 化为不为所需路径使用的代谢物或其他化合物。因此，如果天然酶的活性降低或完全不 存在，那么所产生中间体可能更容易用于并入所需要产物中。在一些情况下，蛋白质表达的消除可能令人感兴趣，如在参与多效性药物响应的蛋白质(包括(但不限于)ATP-结合盒(ABC)运输蛋白、耐多药性(MDR)泵和相关转录因子)中。
宿主细胞可以被修饰以包括各种提供期望活性或性质的植物蛋白。可以在工程化的 宿主细胞中利用与所关注类诺斯卡品或其前体的合成相关的任何合宜的植物蛋白，例如 酶、蛋白伴侣、辅因子等。在一些情形下，宿主细胞包括植物蛋白伴侣蛋白。植物蛋白 伴侣可以促进所关注酶在宿主细胞中的作用，从而改良所关注类诺斯卡品或其前体的产 生。所关注植物蛋白伴侣包括(但不限于)结合性免疫球蛋白(BiP)、DnaJ蛋白、葡萄糖调 节蛋白(GRP)94、结合蛋白(BiP)、蛋白二硫化物异构酶(PDI)、亲环素和钙联蛋白。
异源编码序列包括(但不限于)编码酶的序列(野生型或等效序列)，其在植物中通常 负责产生类诺斯卡品产物。在一些情形下，异源序列所编码的酶可以是1-BIA路径中的酶中的任一种并且可以来自任何合宜的来源。可以基于所需产物来选择用于具体合成路径的由异源编码序列编码的酶的选择和数量。在某些实施方案中，本发明的宿主细胞可 以包括1种或多种、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个 或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多 个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个或甚至15个或更多个异源编码序列， 例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个异源编码序列。
如本文所使用，术语“异源编码序列”还包括肽或酶的编码部分(也就是肽或酶的cDNA或mRNA序列)以及全长转录单元(也就是包括内含子和外显子的基因)的编码部 分，以及“密码子经优化”序列、截短序列或编码酶或编码其等效氨基酸序列的其他形式 的变化序列，前提是所述等效氨基酸序列产生功能蛋白。此类等效氨基酸序列可以具有 一种或多种氨基酸的缺失，其中缺失在N-端、C-端或在内部。设想截短的形式，只要其 具有本文所指示的催化能力即可。还设想两种或更多种酶的融合物以促进路径中代谢物 的转移，前提是维持催化活性。
可以通过建模和/或筛选来鉴定可操作片段、突变或截短形式。在一些情形下，这是 通过以下实现的：以逐步方式使(例如)蛋白质的N-端、C-端或内部区缺失，随后与原始序列相比分析所得衍生物对所需要反应的活性。如果所述衍生物以此能力操作，那么其 被视为构成酶本身的等效衍生物。任何合宜的所关注酶都可以突变或工程化以在工程化 的宿主细胞中提供期望的生物活性。在一些情形下，突变酶工程化以促进酶的正确折叠。 在某些情况下，突变酶工程化以相对于非突变酶增加酶的期望活性或性质。在某些情况 下，突变酶工程化以相对于非突变酶减少酶的不期望活性或性质。在一些实施方案中， 细胞包括一个或多个编码一种或多种突变酶的异源编码序列。在一些情况下，突变酶是 CYP82Y1N-端突变体。CYP82Y1的N-端可以工程化以促进酶的正确折叠。图6图解说 明使用各种CYP82Y1酶突变的类诺斯卡品前体产生的增加。在一些情形下，第一酶的 活性是通过将N-端标签与第二酶的N-端标签交换来改良的。
本发明的方面还涉及编码与各种酶的天然氨基酸序列等效的氨基酸序列的异源编 码序列。“等效”氨基酸序列被定义为与特定氨基酸序列不同而是含有至少一些氨基酸变 化(缺失、取代、倒置、插入等)的氨基酸序列，在用于所需目的时，与特定氨基酸序列 的类似活性相比，所述“等效”氨基酸序列并不实质上影响蛋白质的生物活性。等效序列 还意欲包括那些已工程化和/或进化成具有与原始氨基酸序列不同的性质的序列。所关注 可变性质包括催化活性、底物特异性、选择性、稳定性、溶解性、定位等。在某些实施 方案中，“等效”氨基酸序列含有在氨基酸水平上与特定氨基酸序列至少80％-99％同一 性，在一些情形下至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％和更多，在某些情形下，在氨基酸水平上至少95％、96％、97％、98％和99％同一 性。在一些情形下，氨基酸序列可以相同但DNA序列被改变以(例如)优化(例如)宿主生 物体的密码子使用。
在一些情况下，每一类型酶的表达是通过额外基因拷贝(也就是多个拷贝)增加，从 而增加类诺斯卡品产物的中间体的积累和/或产生。本发明的实施方案包括通过同时表达 单一或多种酶的多种物种变体来增加宿主细胞中类诺斯卡品产物的产生。在一些情形下， 在宿主细胞中包括单一或多种酶的额外基因拷贝。可以利用任何合宜的方法，在宿主细 胞中包括用于酶的异源编码序列的多个拷贝。
在一些实例中，工程化的宿主细胞包括用于酶的异源编码序列的多个拷贝，例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个或甚至10个或更多个拷贝。 在某些实施方案中，工程化的宿主细胞包括用于一种或多种酶的异源编码序列的多个拷 贝，例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个等的多个拷贝。在一些情形下， 用于酶的异源编码序列的多个拷贝源自两种或更多种与宿主细胞相比不同来源生物体。 例如，工程化的宿主细胞可以包括一个异源编码序列的多个拷贝，而拷贝中的每一个源 自不同的来源生物体。因此，基于由异源编码序列编码的所关注酶的种间差异，每一拷 贝可以包括显式序列的一些变化形式。
除非另外注明，否则异源编码序列如GENBANK中所报道。所关注酶的列表在表1 中显示。本发明的宿主细胞可以包括来自任一来源的所列示酶的任一组合。除非另有指 示，否则本文公开的登录号指的是GenBank。一些登录号指的是酵母属基因组数据库 (SGD)，其可在万维网上在www.yeastgenome.org处获得。
在一些实施方案中，细胞包括一个或多个用于编码一种或多种所关注酶(例如如本文 所描述)的异源编码序列。所关注酶包括(但不限于)表1中所描述的那些酶。在某些实施 方案中，细胞包括编码四氢原小檗碱N-甲基转移酶(TNMT)的异源编码序列。在一些情况下，细胞包括编码N-甲基坎那丁1-羟化酶(CYP82Y1)的异源编码序列。在一些情形下， 细胞包括编码1-羟基-N-甲基坎那丁13-羟化酶(CYP82X2)的异源编码序列。在某些情况 下，细胞包括编码1,13-二羟基-N-甲基坎那丁3-O乙酰基转移酶(PsAT1)的异源编码序列。 在一些实施方案中，细胞包括编码4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合成酶(CYP82X1) 的异源编码序列。在一些情况下，细胞包括编码那可汀半缩醛合成酶(PsCXE1)的异源编 码序列。在某些情况下，细胞包括编码诺斯卡品合成酶(PsSDR1)的异源编码序列。在一 些情形下，细胞包括一个或多个编码一种或多种选自PsMT3和Ps6OMT的酶的异源编 码序列(例如两个或更多个)。在一些情形下，细胞包括一个或多个编码一种或多种选自 PsMT3、Ps6OMT和PsMT2的酶的异源编码序列(例如两个或更多个)。在某些情形下， 细胞包括编码酶PsMT3和PsMT2的异源编码序列。在某些情形下，细胞包括编码酶 Ps6OMT和PsMT2的异源编码序列。在某些实施方案中，细胞包括编码酶CYP82Y1、 CYP82X1和CYP82X2的异源编码序列。异源编码序列可以使用任何合宜的方法在宿主 细胞中表达。在一些情况下，异源编码序列从低拷贝构建体表达。在一些情形下，细胞 包括源自选自罂粟(P.somniferum)和花菱草(E.californica)的源生物体的异源编码序列。 在一些实施方案中，细胞缺乏所关注酶(例如如本文所描述)。在某些实施方案中，细胞 缺乏一种或多种选自以下的酶：PsMT2、PsMT3、Ps6OMT、CYP82X1、CYP82X2、 PsTNMT或EcTNMT、PsCXE1、PsSDR1、PsAT1和CYP82Y1。在某些实施方案中， 细胞缺乏两种或更多种(例如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多 种、七种或更多种、八种或更多种或九种或更多种)选自以下的酶：PsMT2、PsMT3、Ps6OMT、CYP82X1、CYP82X2、TNMT、PsCXE1、PsSDR1、PsAT1和CYP82Y1。 可以选择本文所述酶的两种或更多种的任一组合以从本发明细胞排除。
在一些实施方案中，细胞包括PsMT3酶。在一些实施方案中，细胞包括Ps6OMT 酶。在一些情况下，细胞包括为同二聚体或异二聚体的酶(例如任两种本文所描述的合宜 酶的二聚体)。在某些情况下，细胞包括PsMT2+MT3的异二聚体酶。在某些情形下，细 胞包括PsMT2+6OMT的异二聚体酶。
在一些情况下，宿主细胞包括用于CPR酶的异源编码序列。在本发明宿主细胞中可以利用任何合宜的CPR酶。在某些情况下，CPR酶是拟南芥P450还原酶(ATR)(例 如ATR1)或来自罂粟的CPR酶(PsCPR)。细胞可以使用一种或多种在细胞中提供诺斯卡 品的衍生化的酶产生所关注类诺斯卡品。在某些实施方案中，细胞包括一个或多个用于 一种或多种选自以下的酶的异源编码序列：P450、卤化酶、糖基化酶、甲基转移酶、乙 酰基转移酶、短链脱氢酶、羧基酯酶和异戊二烯基转移酶。
细胞可以从全去甲劳丹碱产生类诺斯卡品或其前体。图9图解说明从全去甲劳丹碱 开始合成诺斯卡品和其前体的路径。在一些实施方案中，细胞包括一个或多个用于编码一种或多种酶选自以下的异源编码序列：TNMT、PsAT1、CYP82X1、PsCXE1、PsSDR1、 PsMT3、PsMT2、CYP82Y1、CYP82X1、S9OMT、Ps6OMT、Ps4’OMT、PsCNMT、 PsBBE、AtATR1和CYP719A。异源编码序列可以使用任何合宜的方法在细胞中被表达。 所关注表达方法视各种因素(例如所关注酶和所关注细胞产物)而变化且包括(但不限于) 染色体整合、从YAC表达、从低拷贝质粒表达和从高拷贝质粒表达。在某些实施方案中， 细胞从YAC表达TNMT、PsAT1、CYP82X1、PsCXE1、PsSDR1、PsMT2。在某些实 施方案中，细胞从YAC表达CYP82Y1、CYP82X1、PsCXE1、PsSDR1、PsMT3。在某 些实施方案中，细胞从YAC表达CYP82X2、CYP82X1、PsCXE1、PsSDR1、PsMT2、 PsAT1、TNMT。在某些情况下，细胞从低拷贝质粒表达CYP82Y1和CYP82X1。在一 些情况下，细胞从高拷贝质粒表达S9OMT。在一些情形下，Ps6OMT、Ps4’OMT, PsCNMT、PsBBE、AtATR1和CYP719A是通过染色体整合于细胞中。在一些情形下， TNMT、PsAT1、CYP82X1、PsCXE1、PsSDR1、PsMT3、PsMT2、CYP82Y1、CYP82X1、 S9OMT、Ps6OMT、Ps4’OMT、PsCNMT、PsBBE、AtATR1和CYP719A是通过染色 体整合于细胞中。在一些情形下，RnPTPS、RnSepR、RnPCD、RnQDHPR、RnDHFR、 RnTyrH、CjNCS、PpDODC、EcCYP80B1、PsCPR、Ps6OMT、Ps4’OMT、PsCNMT、ARO4(Q166K)、ARO7(T226I)、ARO10、TKL1、TNMT、PsAT1、CYP82X1、PsCXE1、 PsSDR1、PsMT3、PsMT2、CYP82Y1、CYP82X1、S9OMT、PsBBE和CYP719A是通 过染色体整合于细胞中。
在一些实施方案中，宿主细胞(例如酵母菌株)工程化以通过将一种或多种酶定位到 细胞中的区室选择性产生所关注类诺斯卡品或其前体。细胞的任何合宜的区室或结构都 可以被靶向用于定位所关注酶。在一些实施方案中，细胞包括在空间上定位到酵母细胞中的区室的酶，其中区室选自线粒体、内质网(ER)、高尔基体、液泡、细胞核、质膜、 过氧化物酶体和周质。在一些情况下，酶通过将ER靶标序列融合到蛋白质的N-端而被 定位到酵母内质网。在某些情形下，所关注酶在空间上定位到酵母细胞中的区室的外部。 在一些情况下，所关注酶在空间上定位到酵母细胞中的区室的内部。
在一些情形下，酶可以位于宿主细胞中，使得由此酶产生的化合物在达到可以将所 述化合物转化为不期望代谢物的经定位酶之前以自发方式重排或通过另一酶转化为期望 代谢物。可以选择两种酶之间的空间距离以防止酶中的一种直接作用于化合物而产生不 期望代谢物并且限制不期望终产物(例如不期望类鸦片副产物)的产生。在某些实施方案 中，本文所述酶中的任一种可以单独地或与第二种酶一起定位到宿主细胞中的任何合宜 区室中，所述合宜区室包括(但不限于)细胞器、内质网、高尔基体、液泡、细胞核、质 膜或周质。
在一些实施方案中，宿主细胞包括包含定位标签的酶中的一种或多种。任何合宜的 定位标签都可以被利用。在一些情形下，定位标签是附接在酶的N-端和或C-端的肽序列。 可以利用任何合宜的方法将标签附接到酶。在一些情形下，定位标签源自内源性酵母蛋 白。此类标签可提供到各种酵母细胞器(包括(但不限于)内质网(ER)、线粒体(MT)、质膜(PM)和液泡(V))的路径选择。在某些情况下，标签包括或源自尾部锚定型类蛋白内的的 跨膜结构域。在一些实施方案中，定位标签将酶定位于细胞器的外部。在某些实施方案 中，定位标签将酶定位于细胞器的内部。
在一些情况下，每一类型酶的表达都可通过额外基因拷贝(也就是多个拷贝)而增加， 这可增加中间体积累且最后增加类诺斯卡品和/或类诺斯卡品前体的产生。本发明的实施 方案包括通过同时表达单一或多种酶的多种物种变体来增加宿主细胞中的类诺斯卡品产 生。在一些情形下，在宿主细胞中包括单一或多种酶的额外基因拷贝。可以利用任何合 宜的方法，在宿主细胞中包括用于酶的异源编码序列的多个拷贝。
在一些实施方案中，宿主细胞包括用于酶的异源编码序列的多个拷贝，例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个或甚至10个或更多个拷贝。在某 些实施方案中，宿主细胞包括用于一种或多种酶的异源编码序列的多个拷贝，例如两个 或更多个、三个或更多个、四个或更多个等的多个拷贝。在一些情况下，宿主细胞包括 编码选自以下的酶的异源编码序列的多个拷贝：CYP82Y1、CYP82X1、CYP82X2、 PsCXE1、PsSDR1、PsMT2和PsMT3。在某些情形下，在宿主细胞中包括编码酶 CYP82Y1、CYP82X1、CYP82X2、PsCXE1、PsSDR1和PsMT3的异源编码序列中的每 一个的多个拷贝。
在一些情形下，用于酶的异源编码序列的多个拷贝源自两种或更多种与宿主细胞不 同的来源生物体。例如，宿主细胞可以包括一个异源编码序列的多个拷贝，而拷贝中的每一个源自不同的来源生物体。在某些情形下，拷贝源自罂粟和花菱草来源生物体。因 此，基于由异源编码序列编码的所关注酶的种间差异，每一拷贝可以包括显式序列的一 些变化形式。在一些情况下，宿主细胞包括多个异源编码序列，所述异源编码序列各自 编码酶并且各自源自与宿主细胞不同的来源生物体。在一些实施方案中，宿主细胞包括 源自两种或更多种与宿主细胞不同的来源生物体的酶的拷贝。在某些实施方案中，细胞 包括两个或更多个异源编码序列，其各自编码TNMT酶。在一些情况下，宿主细胞包括 两个或更多个异源编码序列，其各自编码TNMT并且源自不同的来源生物体。在某些情 形下，TNMT酶的来源生物体选自罂粟和花菱草。
可以对工程化的宿主细胞培养基进行取样并监测类诺斯卡品产物的产生。可以使用 任何合宜的方法观察和测量类诺斯卡品产物。所关注方法包括(但不限于)LC-MS方法(例 如如本文所描述)，其中所关注样品是通过与已知量的标准化合物相比较来分析。另外， 还有其他方式可观察和/或测量类诺斯卡品产物。观察和/或测量BIA的替代方式的实例 尤其包括GC-MS、UV-vis光谱法、NMR、LC-NMR、LC-UV、TLC、毛细管电泳。可 以通过(例如)m/z和MS/MS片段化图案证实一致性，并且可以通过已知滞留时间的LC 迹线峰和/或EIC MS峰分析通过参考已知量的化合物标准物的相应LC-MS分析实现化 合物的定量或测量。
方法
过程步骤
如上文所汇总，本发明的方面包括制备类诺斯卡品产物的方法。因此，本发明的方面包括在一或多种宿主细胞修饰(例如如本文所描述)功能性表达的条件下培养工程化的宿主细胞，使得所述细胞将所关注起始化合物转化为类诺斯卡品产物。本发明的方面还 提供方法，其包括在适于蛋白质产生的条件下培养工程化的宿主细胞，使得一个或多个 异源编码序列功能性表达并将所关注起始化合物转化为类诺斯卡品产物。在实例中，所 述方法是制备类诺斯卡品产物的方法，其包括培养工程化的宿主细胞(例如如本文所描 述)；向细胞培养物中添加起始化合物；和从细胞培养物中回收类诺斯卡品产物。
在某些情形下，在细胞中产生的类诺斯卡品在细胞中用作中间体或起始材料，其本 身随后被转化为所关注的下游苄基异喹啉生物碱(BIA)。通过本文所描述的产生类诺斯卡 品的细胞可以产生任何合宜的BIA。可适用于本发明方法中的所关注的产生BIA的细胞包括(但不限于)由Smolke等人在US20140273109中描述的那些，所述案件的公开内容以 引用方式整体并入本文中。因此，在一些实施方案中，所述方法进一步包括在足以从类 诺斯卡品产生BIA的条件下培养宿主细胞和从细胞培养物中回收BIA。
发酵培养基可以含有适宜的碳底物。适于实施本公开的方法碳源可以涵盖各种含碳 底物。适宜底物可以包括(但不限于)单糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖)、寡糖(例如乳糖、蔗糖、棉子糖)、多糖(例如淀粉、纤维素)或其组合。在一些情形下，可以使用 来自可再生原料的未纯化混合物(例如玉米浆、甜菜糖蜜、大麦芽)。在一些情形下，碳 底物可以是一碳底物(例如甲醇、二氧化碳)或二碳底物(例如乙醇)。在其他情形下，可以 利用其他含碳化合物，例如，甲胺、葡萄胺糖和氨基酸。
可以用培养工程化的宿主细胞的任何合宜方法产生类诺斯卡品产物。所采用的具体 方案可视(例如)工程化的宿主细胞、异源编码序列、所关注酶、所关注BIA等而变化。 细胞可以存在于任何合宜的环境中，例如细胞能表达一种或多种功能异源酶的环境。在 一些实施方案中，在有助于酶表达的条件下并利用可获得的适当底物培养细胞以容许在 体内产生类诺斯卡品产物。在一些实施方案中，从工程化的宿主提取功能酶用于在体外 条件下产生类诺斯卡品产物。在一些情况下，将工程化的宿主细胞放回到多细胞宿主生 物体中。工程化的宿主细胞处于任一生长期，包括(但不限于)稳定期和对数生长期等。 另外，培养本身可以是连续培养或者其可以是分批培养。
细胞可以在适当发酵培养基中在14-40℃的温度下生长。细胞可以在以任一合宜的 速度(例如200rpm)振荡下生长。细胞可以在适宜pH下生长。适于发酵的pH范围可以 在pH 5到9之间。可以在好氧、厌氧或微好氧条件下实施发酵。可以使用任何适宜的生 长培养基。适宜生长培养基可以包括(但不限于)常见的商业制备的培养基，例如合成限 定型(SD)基础培养基或富含酵母提取物蛋白胨葡萄糖(YEPD)的培养基。可以使用适于微 生物的任何其他富集型、限定型或合成型生长培养基。
细胞可以在基本上任一大小和形状的容器中培养。适于实施本公开的方法的容器的 实例可以包括(但不限于)多孔摇板、试管、烧瓶(有挡板和无挡板)和生物反应器。培养物 的体积可以在10微升到大于10,000升的范围内。
可以包括向生长培养基中添加已知可以产生生物碱所需的方式调节代谢的药剂。在 非限制性实例中，可以将2’3’-单磷酸环腺苷添加到生长培养基中以调节分解代谢物抑制。
对于具体细胞类型而言任何合宜的细胞培养条件都可以被利用。在某些实施方案中，包括一种或多种修饰的宿主细胞可在标准或容易优化的条件下利用标准细胞培养基和补充剂来培养。作为一个实例，标准生长培养基在不需要用于质粒维持的选择压力时 可以含有20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和20g/L葡萄糖(YPD)。含有质粒的宿主细 胞在含有1.7g/L酵母氮碱、5g/L硫酸铵和20g/L葡萄糖且补充有为生长和选择所需要 的适当氨基酸的合成型完全(SC)培养基中生长。可用于可诱导酶的表达的替代碳源包括 (但不限于)蔗糖、棉子糖和半乳糖。细胞在实验室中在体积在1-1000mL范围内或更大 的容器中(例如在试管或烧瓶中)在任何合宜的温度(例如30℃)和以任一合宜速率(例如 200rpm)振荡下生长。
可以扩大培养体积以在更大的发酵容器中生长，例如，作为工业过程的一部分。工业发酵过程可以在封闭式分批、补料分批或连续恒化器条件或任一适宜的发酵模式下实施。在一些情形下，细胞可以作为整体细胞催化剂固定于底物上并且经受发酵条件用于 生物碱产生。
分批发酵是封闭系统，其中培养基的组成在开始发酵时进行设定且在发酵过程期间 不改变。在开始发酵时将所需生物体接种到培养基中。在一些情况下，在对系统作出改变以控制诸如pH和氧浓度(而非碳)等因素的情况下运行分批发酵。在此类发酵系统中， 系统的生物质和代谢物组成在发酵的过程中连续发生变化。细胞通常继续进行到延滞期， 然后到对数期(高生长速率)，然后到稳定期(生长速率降低或停止)且最后到死亡期(如果 未处理)。
连续发酵是开放系统，其中将限定的发酵培养基连续添加到生物反应器中并且从容 器连续移除等量的发酵培养基用于加工。连续发酵系统通常经操作以维持稳态生长条件， 使得必须通过发酵中的生长速率来平衡由移除培养基引起的细胞损失。连续发酵通常在 细胞处于恒定的高细胞密度的条件下操作。连续发酵容许调节一种或多种影响靶标产物 浓度和/或细胞生长的因素。
液体培养基可以包括(但不限于)添加本文所述组分的富集型或合成限定型培养基。 可以将培养基组分溶解于水中并通过热、压力、过滤、辐射、化学或其任一组合进行灭菌。可以分开制备几种培养基组分并进行灭菌且然后在发酵容器中进行合并。可以缓冲 培养基以辅助在整个发酵中维持恒定pH。
在发酵的过程中可以监测或控制过程参数(包括温度、溶解氧、pH、搅拌、通气速率和细胞密度)。例如，可以通过浸没于培养基中的温度探针监测发酵过程的温度。可以 通过调节夹套温度将培养温度控制在设定点。水可以在外部冷冻器中冷却且然后流入生 物反应器控制塔中并在容器中维持设定点温度所需要的温度下循环到夹套。
另外，在发酵过程中可以监测气体流参数。例如，气体可以通过喷淋器流入培养基中。适于本公开的方法的气体可以包括压缩空气、氧气和氮气。气体流可以为固定速率 或经调节以维持溶解氧设定点。
可还以监测培养基的pH。在实例中，可以通过浸没于容器内部的培养基中的pH 探针来监测pH。如果pH控制生效，那么可以通过酸和碱泵调节pH，所述泵将每一溶 液以所需要的速率添加到培养基中。用于控制pH的酸溶液可以是硫酸或盐酸。用于可 控制pH的碱溶液可以是氢氧化钠、氢化化钾或氢氧化铵。
另外，可以通过浸没于培养基中的溶解氧探针监测培养基中的溶解氧。如果溶解氧 调节生效，那么可以通过增加或减小搅拌速度调节氧含量。还可以通过增加或减小气体流速调节溶解氧含量。气体可以是压缩空气、氧气或氮气。
在发酵过程中还可以监测搅拌速度。在实例中，搅拌器电动机可以驱动搅动器。搅拌器速度可以在整个发酵中设定为始终如一的rpm或者可以经动态调节以维持设定的溶解氧含量。
另外，在发酵过程中可以监测浊度。在实例中，可以使用浊度探针测量细胞密度。或者，可以通过从生物反应器取出样品测量细胞密度并在分光光度计中分析样品。另外，可以时间间隔通过无菌取样装置从生物反应器移除样品。可以分析样品中由宿主细胞产生的生物碱。还可以分析样品的其他代谢物和糖、培养基组分消耗或细胞密度。
在另一实例中，在发酵过程期可以监测原料参数。具体来说，可以使用外部泵将原料(包括糖和其他碳源)、营养素和辅因子添加到发酵中。在发酵期间还可以添加其他组分，包括(但不限于)止泡剂、盐、螯合剂、表面活性剂和有机液体。
用于在宿主细胞中优化异源多核苷酸的表达的任何合宜的密码子优化技术都可适 用于本发明宿主细胞和方法中，例如参见Gustafsson,C.等人(2004)TrendsBiotechnol, 22,346-353，所述文献以引用方式整体并入。
本发明方法还可以包括向细胞培养物中添加起始化合物。任何合宜的添加方法都可 适用于本发明方法中。可以用充足量的所关注起始材料(例如如本文所描述)(例如mM到μM量(例如介于约1mM到5mM之间)的起始化合物)补充细胞培养物。应了解所添加 起始材料的量、添加时间和速率、所添加材料的形式等都可以根据各种因素而变化。起 始材料可以纯净形式添加或者预先溶解于适宜溶剂(例如细胞培养基、水或有机溶剂)中。 起始材料可以浓缩形式(例如所需浓度的10倍)添加以最小化添加时细胞培养基的稀释。 起始材料可以一个或多个批次或通过经延长的时间段(例如小时或天)连续添加来添加。
从发酵培养基离析产物的方法
本发明方法还可以包括从细胞培养物中回收类诺斯卡品产物。任何合宜的分离和离 析方法(例如色谱法或沉淀法)都可以适用于本发明方法中以从细胞培养物中回收类诺斯 卡品产物。可以使用过滤方法使可溶性部分与细胞培养物的不溶性部分分离。在一些情形下，可以使用液相色谱法(例如反相HPLC、尺寸排阻、正相色谱法)使所关注类诺斯 卡品产物与细胞培养物的其他可溶性组分分离。在一些情形下，可以使用萃取方法(例如 液体萃取、基于pH的纯化、固相萃取、亲和色谱、离子交换等)使类诺斯卡品产物与细 胞培养物的其他组分分离。
可以使用本领域已知的方法从发酵培养基离析所产生的生物碱。可以在发酵之后立 即(或在一些情况下在发酵期间)实施多个回收步骤用于所需产物的初始回收。通过这些 步骤，可以使生物碱(例如类诺斯卡品产物)与细胞、细胞碎片和废物和其他营养素分离， 糖和有机分子可留在废培养基中。此过程可用于产生富含类诺斯卡品产物的产物。
在实例中，通过向分批反应器中提供工程化的酵母细胞和原料(包括营养素和水)形 成具有类诺斯卡品产物的产物流。具体来说，可以通过将工程化的酵母细胞孵育至少约5分钟的时间段以产生包含类诺斯卡品产物和细胞材料的溶液使工程化的酵母细胞经受发酵。在工程化的酵母细胞已经受发酵之后，可使用至少一个分离单元从细胞材料中分 离出类诺斯卡品产物以得到包含类诺斯卡品产物的产物流。具体来说，产物流可以包括 类诺斯卡品产物以及其他组分，例如澄清的酵母培养基。另外，类诺斯卡品产物可以包 含一种或多种类诺斯卡品产物，例如一种或多种类诺斯卡品化合物。
可以使用不同的方法从生物反应器培养基移除包括类诺斯卡品产物的细胞。在实例 中，可以通过随时间沉降移除细胞。此沉降过程可以通过冷冻或通过添加澄清剂(例如二 氧化硅)来加速。然后可以从反应器的顶部抽取废培养基或者可以从反应器的基底倒出细 胞。或者，可以通过过滤器、膜或其他多孔材料过滤来移除细胞。还可以通过离心(例如，通过连续流动离心)或通过使用连续提取器移除细胞。
如果一些有价值的类诺斯卡品产物存在于细胞内部，那么可以渗透化或溶解细胞并 且可以通过上文所描述方法中的任一种移除细胞碎片。用于渗透化细胞的试剂可以包括 (但不限于)有机溶剂(例如DMSO)或盐(例如乙酸锂)。溶解细胞的方法可以包括添加表面 活性剂(例如十二烷基硫酸钠)或通过珠粒研磨或超声波处理进行机械破坏。
可以通过添加与水性培养基不混溶的有机液体通过液-液萃取从澄清的废培养基提 取类诺斯卡品产物。在实例中，除其他加工步骤以外，可以使用液-液萃取。适宜有机液体的实例包括(但不限于)肉豆蔻酸异丙基酯、乙酸乙酯、氯仿、乙酸丁酯、甲基异丁基 酮、油酸甲酯、甲苯、油醇、丁酸乙酯。可以将有机液体添加到少到10％或多达100％ 体积的水性培养基中。
在一些情形下，可以在开始发酵时或在发酵期间的任一时间添加有机液体。此萃取 发酵过程可以通过连续移除有机相的类诺斯卡品产物来增加来自宿主细胞的类诺斯卡品 产物的产量。
搅动可使有机相与水性培养基一起形成乳液。促进两个相分离成不同层的方法可以 包括(但不限于)添加反乳化剂或成核剂，或调节pH。还可以通过(例如)连续圆锥板离心对乳液实施离心来分离两个相。
或者，可以使有机相与水性培养基离析，使得其可在萃取之后以物理方式移除。例如，可以将溶剂囊封在膜中。
在实例中，可以使用吸附方法从发酵培养基提取类诺斯卡品产物。在实例中，可以通过添加树脂(例如
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XAD4)或另一通过吸附移除类诺斯卡品产物的试剂从澄清的废培养基萃取类诺斯卡品产物。然后可以使用有机溶剂从树脂释放类诺斯卡品产物。适宜有机溶剂的实例包括(但不限于)甲醇、乙醇、乙酸乙酯或丙酮。
还可以使用过滤从发酵培养基提取类诺斯卡品产物。在高pH下，类诺斯卡品产物可以在生物反应器中形成晶体样沉淀物。此沉淀物可以通过过滤器、膜或其他多孔材料 过滤来直接移除。还可以通过离心和/或倾析收集沉淀物。
上文所描述的萃取方法可以原位(在生物反应器中)或非原位(例如在培养基流出生 物反应器并且与萃取剂接触，然后再循环回到容器中的外部环路中)。或者，可以在结束发酵之后使用从生物反应器容器移除的澄清培养基实施萃取方法。
本发明方法还可以包括从细胞培养物中回收类诺斯卡品或其前体。任何合宜的分离 和离析方法(例如在碱性条件下的有机溶剂萃取、固相萃取、色谱法或沉淀法)都可以适用于本发明方法中以从细胞培养物中回收所关注类诺斯卡品或其前体。可以使用过滤方法使可溶性部分与细胞培养物的不溶性部分分离。在一些情形下，使用液相色谱方法(例如反相HPLC、尺寸排阻、正相色谱)使类诺斯卡品或前体与细胞培养物的其他可溶性组 分分离。在某些情形下，产生类诺斯卡品的细胞(例如如本文所描述)将类诺斯卡品转化 为下游的所关注BIA。因此，还可以应用上文所描述方法中的任一种来回收所产生的任 何所关注BIA。
还包括工程化宿主细胞用于产生所关注类诺斯卡品或其前体的目的的方法。将DNA 插入宿主细胞中可以使用任何合宜方法来实现。使用所述方法将异源编码序列插入宿主 细胞中，使得宿主细胞功能性地表达酶并将所关注起始化合物转化为所关注产物类诺斯 卡品或其前体。
在一些实施方案中，细胞包括一种或多种用于异源编码序列中的一个或多个(例如如 本文所描述)的启动子。在本发明宿主细胞和方法中可以利用任何合宜的启动子。驱动异 源编码序列的表达的启动子可以是组成型启动子或可诱导型启动子，前提是所述启动子 在宿主细胞中可以具有活性。异源编码序列可以从其天然启动子表达，或可以使用非天 然启动子。此类启动子在使用其的宿主中可以具有低到高的强度。在一些实施方案中，细胞包括一种或多种强启动子。启动子可以是调节型或组成型的。在某些实施方案中， 使用不受葡萄糖抑制或仅受培养基中葡萄糖的存在轻微抑制的启动子。所关注启动子包 括(但不限于)糖酵解基因的启动子(例如枯草芽孢杆菌tsr基因的启动子(编码果糖双磷酸盐醛缩酶)或来自酵母酿酒酵母的GAPDH启动子(编码甘油醛-磷酸脱氢酶))、面包酵母 的ADH1启动子、磷酸盐饥饿诱导型启动子(例如酵母的PHO5启动子、来自地衣芽孢 杆菌的碱性磷酸酶启动子)、酵母可诱导型启动子(例如Gal1-10、Gal1、GalL、GalS、 可抑制启动子Met25、tetO)和组成型启动子(例如甘油醛3-磷酸脱氢酶启动子(GPD)、醇 脱氢酶启动子(ADH1)、翻译-延长因子-1-α启动子(TEF)、细胞色素c-氧化酶启动子 (CYC1)、MRP7启动子、GAL1、HXT7、PGK1、TPI1、PYK1、TEF1等)。含有可通 过激素(例如糖皮质激素、类固醇和甲状腺激素)诱导的启动子的自主复制型酵母表达载 体还可以被使用并且包括(但不限于)糖皮质激素应答元件(GRE)和甲状腺激素应答元件 (TRE)。这些和其他实例在美国专利号7,045,290中有描述，所述案件(包括其中所引用的 参考文献)以引用方式并入。可以使用含有组成型或可诱导启动子(例如α因子、醇氧化 酶和PGH)的其他载体。另外，还可以使用任一启动子/增强子组合(根据真核启动子数据 库EPDB)来驱动基因的表达。任何合宜的适当启动子都可以被选用于宿主细胞(例如大肠 杆菌)。还可以使用启动子选择来优化转录且因此优化酶含量以最大化产量同时最小化能 源。
在一些情况下，细胞包括一种或多种选自HXT7、ADH1、PGK1、TPI1、PYK1和 TEF1的强启动子。在某些实施方案中，细胞包括一个或多个用于编码CYP82Y1或 CYP82Y1突变的异源编码序列且包括HXT7启动子。在某些情形下，细胞产生1-羟基-N- 甲基坎那丁。在某些情况下，细胞产生1-羟基坎那丁。在一些实施方案中，细胞包括一 个或多个用于编码CYP82X2或CYP82X2突变体的异源编码序列且包括HXT7启动子。 在某些情况下，细胞产生1,13-二羟基-N-甲基坎那丁。在一些情况下，细胞包括一个或 多个编码CYP82X2或CYP82X2突变体的异源编码序列且包括一种或多种选自PGK1 和GPD的启动子。在某些实施方案中，细胞产生N-甲基-左旋蛇果黄堇碱。在一些情况 下，细胞包括一个或多个用于编码CYP82X1或CYP82X1突变体的异源编码序列且包括 HXT7启动子。在某些实施方案中，细胞产生4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛。
在本发明宿主细胞和方法中可以利用任何合宜的载体。所关注载体包括用于酵母和 其他细胞的载体。酵母载体可以分为4个一般类别：整合型载体(YIp)、自主复制型高拷贝数载体(YEp)、自主复制型低拷贝数载体(YCp)和用于克隆大片段的载体(YAC)。可以 通过任何合宜的转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。
从富含生物碱的溶液纯化产物的方法
后续纯化步骤可涉及使用本领域已知的方法处理富含类诺斯卡品产物的发酵后溶 液以高纯度回收个别的所关注产物物质。
在一个实例中，可以将萃取在有机相中的类诺斯卡品产物转移到水性溶液中。在一 些情形下，可以通过热和/或真空蒸发有机溶剂并且可以将所得粉末溶解于具有适宜pH的水性溶液中。在另一实例中，可以通过添加促进将类诺斯卡品产物萃取到水相的处于 适宜pH下的水性溶液从有机相萃取类诺斯卡品产物。然后可以通过倾析、离心或另一 方法移除水相。
可以通过(例如)利用适宜螯合剂处理进一步处理含有类诺斯卡品产物的溶液以移除 金属。可以通过沉淀进一步处理含有类诺斯卡品产物的溶液以移除其他杂质(例如蛋白质 和DNA)。在一个实例中，用适当沉淀剂(例如乙醇、甲醇、丙酮或异丙醇)处理含有类诺斯卡品产物的溶液。在替代实例中，可以通过透析或通过使较小生物碱与污染性生物巨 分子分离的尺寸排阻的其他方法移除DNA和蛋白质。
在其他实例中，可使用本领域已知的方法通过连续交叉流过滤以高纯度提取含有类 诺斯卡品产物的溶液。
如果溶液含有类诺斯卡品产物的混合物，那么可以使用本领域已知的方法使所述溶 液经受酸-碱处理以产生个别类诺斯卡品产物物质。在此过程中，调节水性溶液的pH以沉淀个别类诺斯卡品产物。
为进行高纯度小规模制备，可以通过液相色谱以单一步骤纯化类诺斯卡品产物。
酵母衍生的生物碱API比对植物衍生的API
澄清的酵母培养基(CYCM)可以含有多种杂质。可以通过真空和/或热对澄清的酵母 培养基进行脱水以产生富含生物碱的粉末。此产物类似于罂粟秆的浓缩物(CPS)，其通过 种植罂粟的国家出口并且被API制造商购买。出于本发明的目的，CPS是任一类型经纯化植物提取物的代表性实例，可以从中最后进一步纯化所需生物碱产物。表2和表3突 出这两种产物的杂质，所述杂质可以对CYCM或CPS具有特异性或可以存在于二者中。 尽管一些类诺斯卡品产物所具有的色素可能为杂质，但其他类诺斯卡品产物本身可被分 类为色素。因此，可以基于非色素杂质评估这些类诺斯卡品产物的杂质。另外，在一些 实例中，使用发酵过程产生的类诺斯卡品产物可以含有在发酵过程中用于产生类诺斯卡 品产物的一或多个细胞的部分。例如，当使用酵母产生类诺斯卡品产物时，酵母细胞的 部分可以在类诺斯卡品产物内。通过分析起源不明的产物的这些杂质的子集，本领域技 术人员可确定产物是起源于酵母产生宿主还是植物产生宿主。
API级药物成分是高度被纯化的分子。因此，可以指示API的植物源或酵母源的杂质(例如表2和表3中所列示的那些)可能不存在于产物的API阶段。实际上，源自本发 明酵母菌株的许多API产物可能很大程度上与传统的植物衍生的API无法区分。然而在 一些情形下，可以使用化学合成方法使常规生物碱化合物经受化学修饰，所述常规生物 碱化合物可能在需要此类化学修饰的基于植物的产物中显示为化学杂质。例如，化学衍 生化通常可产生与化学合成过程相关的一组杂质。在某些情形中，这些修饰可以在酵母 产生平台中以生物方式实施，从而避免与化学衍生相关的一些杂质存在于酵母衍生的产 物中。具体来说，来自化学衍生产物的这些杂质可能存在于使用化学合成过程产生的API 产物中但使用酵母衍生的产物产生的API产物中可能不存在。或者，如果将酵母衍生的 产物与化学方式衍生的产物混合，那么所得杂质可以存在但其量小于可在仅含有或主要 含有化学衍生的产物的API中所预期的量。在此实例中，通过分析API产物的这些杂质 的子集，本领域技术人员可确定产物是源自酵母产生宿主还是传统的化学衍生化途径。
可能存在于生物合成的API中但不存在于化学衍生的API中的杂质的非限制性实例可以包括用于产生类诺斯卡品产物的非植物细胞的部分。在实例中，生物合成的API 可以包括用于在酵母细胞内发酵类诺斯卡品产物的酵母细胞的部分。另外，在酵母衍生 的化合物和植物衍生的化合物都通过化学合成方法经受化学修饰的情形下，预期在产物 中可能存在与化学合成过程相关的相同杂质。在此一情形中，可以如上文所描述分析起 始材料(例如CYCM或CPS)。
工程化宿主细胞的方法
本文还包括出于产生类诺斯卡品产物的目的工程化宿主细胞的方法。将DNA插入宿主细胞中可以使用任何合宜的方法来实现。使用所述方法将异源编码序列插入工程化的宿主细胞中，使得宿主细胞功能性表达酶并将所关注起始化合物转化为类诺斯卡品产物。
在本发明工程化的宿主细胞和方法中可以利用任何合宜的启动子。驱动异源编码序 列表达的启动子可以是组成型启动子或可诱导启动子，前提是启动子在工程化的宿主细 胞中具有活性。可以从天然启动子表达异源编码序列，或者可以使用非天然启动子。此类启动子在使用其的宿主中可以具有低到高的强度。启动子可以是调节型或组成型的。 在某些实施方案中，使用不受葡萄糖抑制或仅受培养基中葡萄糖的存在轻微抑制的启动 子。所关注启动子包括(但不限于)糖酵解基因的启动子(例如枯草芽孢杆菌tsr基因的启 动子(编码果糖双磷酸盐醛缩酶基因的启动子区)或酵母酿酒酵母基因的启动子(编码甘油 醛3-磷酸脱氢酶)(GPD、GAPDH或TDH3))、面包酵母的ADH1启动子、磷酸盐饥饿 诱导型启动子(例如酵母的PHO5启动子、来自地衣芽孢杆菌的碱性磷酸酶启动子)、酵 母可诱导启动子(例如Gal1-10、Gal1、GalL、GalS、可抑制启动子Met25、tetO)和组成 型启动子(例如甘油醛3-磷酸脱氢酶启动子(GPD)、醇脱氢酶启动子(ADH)、翻译-延长因 子-1-α启动子(TEF)、细胞色素c-氧化酶启动子(CYC1)、MRP7启动子等)。含有可通过 激素(例如糖皮质激素、类固醇和甲状腺激素)诱导的启动子的自主复制型酵母表达载体 还可以被使用且包括(但不限于)糖皮质激素应答元件(GRE)和甲状腺激素应答元件 (TRE)。这些和其他实例在美国专利号7,045,290中有描述，所述案件(包括其中所引用的 参考文献)以引用方式并入。可以使用含有组成型或可诱导启动子的(例如α因子、醇氧 化酶和PGH)的其他载体。另外，还可以使用任一启动子/增强子组合(根据真核启动子数 据库EPDB)来驱动基因的表达。宿主细胞(例如大肠杆菌)可以选择任何合宜的适当启动 子。还可以使用启动子选择来优化转录且因此优化酶含量以最大化产量同时最小化能源。
在本发明工程化的宿主细胞和方法中可以利用任何合宜的载体。所关注载体包括用 于酵母和其他细胞中的载体。酵母载体的类型可以分为4个一般类别：整合型载体(YIp)、 自主复制型高拷贝数载体(YEp或2μ质粒)、自主复制型低拷贝数载体(YCp或着丝粒质 粒)和用于克隆大片段的载体(YAC)。可通过任何合宜的转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。可以使用另一来源的DNA(例如PCR生成的双链DNA产物，或 合成的双链或单链寡核苷酸)通过整合到基因组中来工程化酵母。任一单一转化事件可以 包括一种或几种核酸(载体、双链或单链DNA片段)以在遗传上修饰宿主细胞。
效用
例如如上文所描述的本发明工程化的宿主细胞和方法可用于各种应用中。所关注应 用包括(但不限于)：研究应用和治疗性应用。本发明的方法可用于各种不同的应用中，包括产生类诺斯卡品产物的任何合宜的应用。
本发明工程化的宿主细胞和方法可用于各种治疗性应用中。所关注治疗性应用包括 那些制备包括类诺斯卡品产物的药物产物的应用。本文所描述的工程化的宿主细胞产生 类诺斯卡品产物。本发明宿主细胞可用于从可用于产生所关注BIA的简单且廉价的起始材料(包括坎那丁)产生所关注类诺斯卡品产物和类诺斯卡品终产物。因此，本发明宿主 细胞可用于提供有治疗活性的类诺斯卡品产物。
在一些情况下，工程化的宿主细胞和方法可用于产生商业规模量的其类诺斯卡品产 物，其中这些化合物的化学合成具有低产率而不是用于大规模生产的可行方式。在某些情形下，所述宿主细胞和方法用于发酵设施中，所述发酵设施包括(例如)容许快速产生 用于治疗产物的类诺斯卡品产物的5,000-200,000升容量的生物反应器(发酵罐)。此类应 用可以包括从可发酵碳源(例如纤维素、淀粉和游离糖)以工业规模产生类诺斯卡品产物。
本发明工程化的宿主细胞和方法可用于各种研究应用中。本发明宿主细胞和方法可 用于分析各种酶对各种类诺斯卡品产物的生物合成路径的效应。另外，工程化的宿主细胞可以工程化以产生可用于在尚未证实的治疗功能方面测试所关注生物活性的类诺斯卡品产物。在一些情形下，包括各种编码各种酶的异源编码序列的宿主细胞工程化阐释朝 向类诺斯卡品产物的高产量生物合成路径。在某些情形下，研究应用包括产生用于所关 注治疗分子的类诺斯卡品产物，然后可以将所述类诺斯卡品产物进一步化学修饰或衍生 化为所需产物或针对增加的所关注治疗活性进行筛选。在一些情形中，使用宿主细胞菌 株来筛选在此类路径中关注的酶活性，从而可以通过在这些菌株中产生的代谢物的转化 发现酶。本发明宿主细胞和方法可以用作植物专用代谢物的产生平台。
本发明工程化的宿主细胞和方法可以用作植物专用代谢物的产生平台。本发明宿主 细胞和方法可以用作药物库研发以及植物酶发现的平台。例如，本发明工程化的宿主细胞和方法可用于通过以下研发基于天然产物的药物库：采用产生感兴趣的支架分子(例如原鸦片碱)的酵母菌株并且通过组合生物合成或通过化学方式进一步功能化化合物结构。通过以此方式产生药物库，任何潜在药物攻击已与适于大规模培养和产生的产生宿主相联系。作为另一实例，这些本发明工程化的宿主细胞和方法可用于植物酶发现中。本发 明宿主细胞提供所定义代谢物的整洁背景以表达植物EST库以鉴定新的酶活性。本发明 宿主细胞和方法为酵母中植物酶的功能表达和增加的活性提供表达方法和培养条件。
试剂盒和系统
本发明的方面进一步包括试剂盒和系统，其中试剂盒和系统可以包括本发明方法中 所采用的一种或多种组分，例如如本文所描述的工程化的宿主细胞、起始化合物、异源编码序列、载体、培养基等。在一些实施方案中，本发明试剂盒包括工程化的宿主细胞(例如如本文所描述)和一种或多种选自以下的组分：起始化合物、异源编码序列和/或包括 其的载体、载体、生长原料、适用于表达系统中的组分(例如细胞、克隆载体、多个克隆 位点(MCS)、双向启动子、内部核糖体进入位点(IRES)等)和培养基。
可以在试剂盒中提供本文所描述组分中的任一种，例如包括一种或多种修饰的宿主 细胞、起始化合物、培养基等。适用于制备和使用异源编码序列、克隆载体和表达系统的各种组分可用于本发明试剂盒中。试剂盒还可以包括管、缓冲液等和使用说明书。试 剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或如果所需可以在单个容器中将其中的 一些或全部组分预先合并成试剂混合物。
还提供产生类诺斯卡品产物的系统，其中所述系统可以包括包括一种或多种修饰(例 如如本文所描述)的工程化的宿主细胞、起始化合物、培养基、发酵罐和发酵设备，例如适于维持宿主细胞的生长条件、取样和监测设备和组分等的装置。适用于大规模发酵酵 母细胞的各种组分可用于本发明系统中。
在一些情形下，所述系统包括用于大规模发酵工程化的宿主细胞和监测和纯化由发 酵的宿主细胞产生的类诺斯卡品产物的组分。在某些实施方案中，将一种或多种起始化合物(例如如本文所描述)添加到系统中，发酵罐中的工程化的宿主细胞通过所述条件产生一种或多种所需类诺斯卡品产物。在一些情况下，宿主细胞产生类诺斯卡品产物(例如如本文所描述)。
在一些情形下，系统包括监测和/或分析一种或多种由本发明宿主细胞产生的类诺斯 卡品产物化合物的过程。例如，如本文所描述的LC-MS分析系统、色谱系统或可以分析样品并将其与标准相比较的任何合宜的系统，例如如本文所描述。可以在发酵之前和 期间的任何合宜时间通过取样和分析来监测发酵培养基。当起始化合物完全转化为类诺 斯卡品产物时，可以终止发酵并可以纯化类诺斯卡品产物。因此，在一些情形下，本发 明系统包括适于从产生类诺斯卡品产物的宿主细胞培养基中纯化类诺斯卡品产物的纯化 组分。纯化组分可以包括可用于纯化由发酵产生的类诺斯卡品产物的任何合宜方式，包 括(但不限于)二氧化硅色谱法、反相色谱法、离子交换色谱法HIC色谱法、尺寸排阻色 谱法、液体萃取和pH萃取方法。在一些情形下，本发明系统提供在将一种或多种起始 化合物输入系统中之后所关注类诺斯卡品发酵产物的产生和离析。
提出以下实施例以便为本领域技术人员提供关于如何制备和使用本发明的完整公 开内容和描述，且既不旨在限制发明人认为是其发明的范围，他们也不旨在表示下文实验是所实验的全部或唯一的实验。已努力确保数值(例如量、温度等)的精确性，但应计 及一些实验误差及偏差。除非另有指示，否则份数是重量份数，分子量是重量平均分子 量，温度是以摄氏度计，并且压力是或接近大气压。
实验
工程化酵母酿酒酵母用于产生诺斯卡品和合成中间体和各种类诺斯卡品。
酵母菌株能将实施向产生诺斯卡品和衍生物的转化。这些菌株可以产生的化合物的 实例是N-甲基坎那丁、1-羟基-N-甲基坎那丁、诺斯卡品、罂粟壳碱、那可汀半缩醛、4’-O- 去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛、3-O-乙酰基罂粟奥辛、罂粟壳碱半缩醛、N-甲基左旋蛇果黄堇碱、1,13-二羟基-N-甲基坎那丁、1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那丁、那可托林吉地、1-羟基坎那丁和那可托林，其中1-羟基坎那丁、4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛、 罂粟壳碱半缩醛、罂粟壳碱半缩醛、1,13-二羟基-N-甲基坎那丁、1-羟基-13-O-乙酰基-N- 甲基坎那丁、那可托林吉地、那可托林在之前从未被鉴定过。另外，通过以下工程化酵 母细胞：校正诺斯卡品的生物合成路径、表征酶促功能，和证实用于产生朝向植物天然 产物生物合成的有效且精确的方法的异源路径重构。
实施例1：从坎那丁合成诺斯卡品、合成中间体和衍生物的酵母菌株
研发产生原小檗碱和苯酞异喹啉生物碱的酵母菌株，例如1-羟基-N-甲基坎那丁、诺斯卡品、罂粟壳碱、那可汀半缩醛、4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛、3-O-乙酰基罂 粟奥辛、罂粟壳碱半缩醛、N-甲基左旋蛇果黄堇碱、1,13-二羟基-N-甲基坎那丁、1-羟 基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那丁、那可托林吉地、那可托林、1-羟基坎那丁。
图2A和2B绘示从坎那丁到诺斯卡品的合成路径。此路径包括CYP82X1、 CYP82X2、PsAT1、CYP82Y1、PsCXE1、PsSDR1、N4’OMT的酶活性。在酵母中工程 化诺斯卡品生物合成路径以产生各种诺斯卡品合成中间体和衍生物。
1.1)为了从坎那丁产生N-甲基坎那丁，从通过染色体整合ATR1的酵母菌株中的低拷贝构建体(例如低拷贝质粒或通过染色体整合)表达来自罂粟(PsTNMT)或花菱草(EcTNMT)的四氢原小檗碱N-甲基转移酶(TNMT)(图3和4)。每一种酶的其他可能的变 体都包括在表1内。
1.2)为了从坎那丁产生1-羟基-N-甲基坎那丁，在先前描述的产生N-甲基坎那丁的 菌株中的低拷贝质粒上表达来自罂粟的CYP82Y1(图3和4)。每一种酶的其他可能的变体都包括在表1内。
1.3)为了产生1,13-二羟基-N-甲基坎那丁，从先前所描述的产生1-羟基-N-甲基坎 那丁的菌株中的低拷贝构建(例如低拷贝质粒或通过染色体整合)表达来自罂粟的CYP82X2(图3和4)。每一种酶的其他可能的变体都包括在表1内。
1.4)为了产生1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那丁，从先前所描述的产生1,13-二羟 基-N-甲基坎那丁的菌株中的低拷贝构建体(例如低拷贝质粒、YAC或通过染色体整合)表达来自罂粟的PsAT1(图3和4)。每一种酶的其他可能的变体都包括在表1内。
1.5)为了产生4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛，从先前所描述的产生1-羟基 -13-O-乙酰基-N-甲基坎那丁的菌株中的低拷贝构建体(例如低拷贝质粒或YAC)表达来自罂粟的CYP82X1(图3和4)。每一种酶的其他可能的变体都包括在表1内。
1.6)为了产生罂粟壳碱半缩醛，从先前所描述的产生4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟 奥辛的菌株中的低拷贝构建体(例如低拷贝质粒或YAC)表达来自罂粟的PsCXE1(图3和4)。每一种酶的其他可能的变体都包括在表1内。
1.7)为了产生罂粟壳碱，从先前所描述的产生罂粟壳碱半缩醛的菌株中的低拷贝构 建体表达来自罂粟的PsSDR1(例如低拷贝质粒或YAC)(图3和4)。每一种酶的其他可 能的变体都包括在表1内。
1.8)为了产生诺斯卡品，从先前所描述的产生罂粟壳碱的菌株中的低拷贝构建体(例如低拷贝质粒或YAC或染色体整合)共表达来自罂粟的PsMT3或Ps6OMT和PsMT2 (图10)。每一种酶的其他可能的变体都包括在表1内。Tf6OMT不将罂粟壳碱转化为诺 斯卡品。
1.9)为了产生1-羟基坎那丁，从通过染色体整合ATR1的酵母菌株中的低拷贝质粒表达来自罂粟的CYP82Y1(图3和4)。每一种酶的其他可能的变体都包括在表1内。
1.10)为了产生N-甲基-左旋蛇果黄堇碱，从先前所描述的产生N-甲基坎那丁的菌株中的低拷贝构建体(例如低拷贝质粒或YAC)表达来自罂粟的CYP82X2(图3和4)。每 一种酶的其他可能的变体都包括在表1内。
1.11)为了产生那可托林，从先前所描述的产生1-羟基-N-甲基坎那丁的菌株中的低 拷贝构建体(例如低拷贝质粒或YAC)表达来自罂粟的CYP82X1(图3和4)。每一种酶的 其他可能的变体都包括在表1内。
1.12)为了产生那可托林吉地，从先前所描述的产生的菌株中的1,13-二羟基-N-甲 基坎那丁的低拷贝构建体(例如低拷贝质粒或YAC)表达来自罂粟的CYP82X1(图3和4)。每一种酶的其他可能的变体都包括在表1内。
1.13)为了产生3-O-乙酰基罂粟奥辛，从先前所描述的产生4’-O-去甲基-3-O-乙酰 基罂粟奥辛的菌株中的低拷贝构建体(例如低拷贝质粒或YAC或染色体整合)共表达来自 罂粟的PsMT3或Ps6OMT和PsMT2(图10)。每一种酶的其他可能的变体都包括在表I 内。
1.14)为了产生那可汀半缩醛，从先前所描述的产生罂粟壳碱半缩醛的菌株中的低 拷贝构建体(例如低拷贝质粒或YAC或染色体整合)共表达来自罂粟的PsMT3或 Ps6OMT和PsMT2(图10)。每一种酶的其他可能的变体都包括在表1内。
1.15)为了产生更多的诺斯卡品类似物，从产生诺斯卡品的菌株移除某一酶或某一 组酶。一个实例是合成北美黄连碱，从先前所描述的产生诺斯卡品的菌株排除PsMT2、PsMT3或Ps6OMT和CYP82Y1。另外，将不同于坎那丁的不同底物进给到先前所描述 的产生诺斯卡品的菌株以得到更多的诺斯卡品类似物。所述底物包括(但不限于)(S)-金黄 紫堇碱、(S)-四氢小檗红碱、(S)-刺罂粟碱、(S)-碎叶紫堇碱和(S)-四氢掌叶防己碱。
1.16)为了产生更多的类诺斯卡品，利用先前所描述的菌株共表达裁剪酶。引入产生诺斯卡品(或中间体)的菌株中的酶的实例包括(但不限于)P450、卤化酶、糖基化酶、 甲基转移酶、异戊二烯基转移酶。一个实例是哺乳动物肝脏P450 CYP2D6可以断裂坎那 丁的亚甲基二氧杂环己基桥以得到9,10-二甲氧基-6,8,13,13a-四氢-5H-异喹啉并[3,2-a]异喹啉-2,3-二醇。
实施例2：用于在酵母中优化诺斯卡品、合成中间体和衍生物的生物合成的策略
研发用于在工程化的酵母菌株内优化原小檗碱和苯酞异喹啉生物碱的产生的工具 和方法。优化三种P450(也就是CYP82Y1、CYP82X1和CYP82X2)的酶促活性以朝向 诺斯卡品和中间体。利用细胞器路径选择工具盒来重定位和优化以下类型酶(包括P450、 甲基转移酶、乙酰基转移酶、短链脱氢酶和羧基酯酶)之间的相互作用，以便在工程化的 酵母菌株中最优产生靶标诺斯卡品或类诺斯卡品。
2.1)为了产生更多的N-甲基坎那丁，在酵母中表达来自不同物种的TNMT酶的变体。图5绘示从在酿酒酵母中表达的不同TNMT变体产生的N-甲基坎那丁的测量。数 据证实某些TNMT酶变体所产生的N-甲基坎那丁的含量高于其他TNMT酶变体。
2.2)为了从坎那丁产生更多1-羟基-N-甲基坎那丁，工程化CYP82Y1的N-端以促进酶的正确折叠。图6绘示在不同温度(25℃和30℃)下使用不同的CYP82Y1N-端突变 体所产生的1-羟基-N-甲基坎那丁的测量。当在30℃下培养并通过相同启动子(GAL1启 动子)调节时，CYP82Y1的活性可通过将N-端标签与MSH(CYP82Y1A)的N-端标签交 换来改良。当在25℃下培养并通过GPD启动子调节时，CYP82Y1和CYP82Y1A的活 性是类似的。数据暗示MSH的N-端标签促进在酿酒酵母中形成可溶性CYP82Y1。
2.3)为了从坎那丁产生更多的1-羟基-N-甲基坎那丁，通过测试CYP82Y1基因上游的不同类型启动子确定CYP82Y1的最优转录调节。图6绘示在不同温度(25℃和30℃) 下使用通过不同启动子调节的CYP82Y1产生的1-羟基-N-甲基坎那丁的测量。在较高培 养温度下，当通过晚期HXT7(强)和ADH1(比HXT7p相对更弱)启动子调节时，CYP82Y1 的活性最高。当在30℃下培养时，在早期生长阶段活化的强启动子(例如PGK1、TPI1、 PYK1、TEF1启动子)更不有效。相比之下，当在25℃下培养工程化的酵母菌株时，通 过HXT7和强启动子调节的CYP82Y1的活性大约在相同水平。且相比之下，当通过 ADH1和弱CYC1启动子调节CYP82Y1时，14-羟基-N-甲基坎那丁的产生更低。
2.4)为了产生更多的1-羟基坎那丁，在25℃下在酿酒酵母中检验所有CYP82Y1突变和各种启动子-CYP82Y1组合。将CYP82Y1A上游的HXT7启动子组合用于合成1- 羟基坎那丁。对于1-羟基-N-甲基坎那丁的生物合成，在25℃下在通过HXT7启动子调 节时，CYP82Y1和CYP82Y1A展现类似的效率；相反，对于1-羟基坎那丁的生物合成， CYP82Y1A的有效性为CYP82Y1的两倍(图6)。
2.5)为了产生更多的1,13-二羟基-N-甲基坎那丁，通过测试CYP82X2基因上游的不同类型启动子确定CYP82X2的最优转录调节。图7绘示在25℃下使用通过不同启动 子调节的CYP82X2所产生的1,13-二羟基-N-甲基坎那丁的测量。与CYP82Y1类似， HXT7启动子产生高含量的1,13-二羟基-N-甲基坎那丁。另外，在工程化的酵母菌株中 表达CYP82X2的额外拷贝。由于CYP82X2在1-羟基-N-甲基坎那丁的量有限时可有效 地将1-羟基-N-甲基坎那丁转化为1,13-二羟基-N-甲基坎那丁，因此有人提出CYP82X2 的转化速率不如1-羟基-N-甲基坎那丁从酵母细胞出来的速率快。因此，在工程化的酵母 菌株中重定位TNMT以延迟1-羟基-N-甲基坎那丁的合成。另外，将CYP82X2和 CYP82Y1进一步工程化为定位于内质网的同侧，以增加CYP82X2与1-羟基-N-甲基坎 那丁的接近。
2.6)为了产生更多的N-甲基-左旋蛇果黄堇碱，还在产生那可托林吉地的菌株中测 试各种启动子-CYP82X2组合。图7绘示在25℃下使用通过不同启动子调节的CYP82X2 所产生的N-甲基-左旋蛇果黄堇碱的测量。与在CYP82X2作用于其天然底物1-羟基-N- 甲基坎那丁时不同，在从PGK1和GPD启动子表达时，此酶对N-甲基-左旋蛇果黄堇碱 的合成展现更高的活性。
2.7)为了产生更多的4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛，通过测试CYP82X1基因上游的不同类型启动子确定CYP82X1的最优转录调节。在25℃下在不同启动子的下游 表达CYP82X1的不同酵母菌株中测量4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛的产生。HXT7、 ADH1和CYC1启动子产生高合成含量的4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛(图8)。
2.8)为了产生更多的那可托林和那可托林吉地，通过测试CYP82X1基因上游的不同类型启动子确定CYP82X1的最优转录调节。测量那可托林或那可托林吉地的产生并 在每一对中进行比较。对于那可托林的合成，当CYP82X1通过PGK1来调节时，CYP82X1 的活性更好(图8)。
2.9)为了在产生诺斯卡品的菌株中减少酵母对于三种异源植物P450表达的表达应 力，表达选择性植物蛋白伴侣用于更好的酵母生长、可溶性植物P450的更高含量和诺斯卡品的更多产生。所利用的植物蛋白伴侣包括结合性免疫球蛋白(BiP)、DnaJ蛋白、葡 萄糖调节蛋白(GRP)94、结合蛋白(BiP)、蛋白二硫化物异构酶(PDI)、亲环素和钙联蛋 白。
2.10)为了产生更多的诺斯卡品，在工程化的酵母菌株中表达下游酶(包括CYP82X2、CYP82Y1、CYP82X1、PsCXE1、PsSDR1、PsMT2和PsMT3或Ps6OMT) 的额外拷贝。另外，通过优化诺斯卡品生物合成酶在酵母中的定位来增强工程化的酵母 菌株中诺斯卡品的产量。植物生物合成酶的最优定位模式模仿其天然环境。将限速步骤 重定位到不同的细胞器，或重定位于先前步骤的酶附近。并且检验各种组合和数量的生 物合成酶的共定位。
2.11)为了产生更多的诺斯卡品中间体，在工程化的酵母菌株中将来自其他植物物 种(例如白毛茛(Hydrastis Canadensis)、兜状荷包牡丹(Dicentra cucullaria)和北美荷包藤 (Adlumia fungosa))的下游生物合成酶变体的效率与来自罂粟的下游生物合成酶变体的 效率相比较。另外，还将一些下游酶工程化成展现更加灵活的底物特异性以便能有效地 将非天然底物转化为最终诺斯卡品类似物。
实施例3：从全去甲劳丹碱合成诺斯卡品的酵母菌株
工程化酵母以包括六个额外酶促步骤，特别是那些在从坎那丁产生诺斯卡品的工程 化的酵母菌株内通过酶Ps6OMT、Ps4’OMT、PsCNMT、PsBBE、S9OMT和CYP719A 催化的酶促步骤。用于生物合成植物天然产物的工程化的酵母菌株包括多达15个异源酶 促步骤工程化和引入酵母菌株中(图9)。在实例中，可以工程化酵母中的另外8种酶以从 全去甲劳丹碱产生牛心果碱。在其他实例中，可以酵母中的另外6种酶以从坎那丁产生 诺斯卡品。
为了从全去甲劳丹碱产生诺斯卡品，从YAC表达TNMT、PsAT1、CYP82X1、 PsCXE1、PsSDR1、PsMT2、PsMT3，从低拷贝质粒表达CYP82Y1和CYP82X1，在产 生坎那丁的通过染色体整合Ps6OMT、Ps4’OMT、PsCNMT、PsBBE、AtATR1和 CYP719A的菌株中从高拷贝质粒表达S9OMT。另外，通过染色体整合Ps6OMT、 Ps4’OMT、PsCNMT、PsBBE、AtATR1、CYP719A、TNMT、S9OMT、CYP82Y1、 CYP82X1、CYP82X2、PsCXE1、PsSDR1、PsMT2和PsAT1。每一种酶的其他可能的 变体都包括在表I内。从低拷贝质粒表达CYP82X1和/或S9OMT额外拷贝以更多的产 生诺斯卡品(图11)。
实施例4：重新合成诺斯卡品的酵母菌株
工程化酵母以包括十三个额外酶促步骤，特别使那些在从全去甲劳丹碱产生诺斯卡 品的工程化的酵母菌株内通过酶RnPTPS、RnSepR、RnPCD、RnQDHPR、RnDHFR、 RnTyrH、CjNCS、PpDODC、EcCYP80B1、ARO4(Q166K)、ARO7(T226I)、ARO10 和TKL1催化的酶促步骤。用于生物合成植物天然产物的工程化的酵母菌株包括多达28 个异源酶促步骤工程化和引入酵母菌株中(图9)。
为了重新产生诺斯卡品，将PsBBE、PsMT1(PsS9OMT)、CjCAS、TNMT、CYP82Y1、CYP82X2、PSAT1、CYP82X1、PsCXE1、PsSDR1、PsMT2和PsMT3通过染色体整合 到产生牛心果碱的具有或没有zwf1缺失的酵母菌株的三个不同基因座(leu2、trp1和his3) 中。并且将RnPTPS、RnSepR、RnPCD、RnQDHPR、RnDHFR、RnTyrH、CjNCS、 PpDODC、EcCYP80B1、PsCPR、Ps6OMT、Ps4’OMT、PsCNMT、ARO4(Q166K)、 ARO7(T226I)、ARO10和TKL1通过染色体整合到酵母菌株中用于重新合成牛心果碱， 且将RnTyrH、Ps4’OMT、CjNCS的额外拷贝通过染色体整合到zwf1基因座或YPL250C 基因座中以增强牛心果碱的产生。每一种酶的其他可能的变体都包括在表I内(图13)。
实施例5：重新合成类诺斯卡品的酵母菌株
在酪氨酸被酪氨酸类似物中的一种或一个集合替代的限定培养基中培养产生诺斯 卡品的酵母，以便合成苄基异喹啉、原小檗碱、断裂小檗碱和苯酞异喹啉生物碱的功能化衍生物。如本文所使用的功能化衍生物指的是一种具有可将其与参考化合物区分开的结构特性的化合物，其中区分性特性存在于用于合成化合物的起始材料中。例如，3-氯- 牛心果碱可以从α-氯-l-酪氨酸产生并且在本文中被视为牛心果碱的功能化衍生物，因为 区分所述两种化合物的氯离子是所用起始材料的特性而不是通过合成中的步骤引入的。 其他实例包括6-羟基-坎那丁(可以通过宿主细胞从α-羟基-l-酪氨酸产生的坎那丁的功能化衍生物)和7-硝基-罂粟壳碱(从3-硝基-l-酪氨酸产生的罂粟壳碱的功能化衍生物)。类似 地，苄基异喹啉、原小檗碱、断裂小檗碱和苯酞异喹啉生物碱的功能化衍生物可以从诸如酪氨酸的类似物等起始材料产生。在其他实例中，取出一组或多组基因以积累某些组 功能化衍生物。
为了重新产生类诺斯卡品，工程化酵母菌株以表达PsBBE、PsMT1(PsS9OMT)、CjCAS、TNMT、CYP82Y1、CYP82X2、PSAT1、CYP82X1、PsCXE1、PsSDR1、PsMT2、 PsMT3、RnPTPS、RnSepR、RnPCD、RnQDHPR、RnDHFR、RnTyrH、CjNCS、PpDODC、 EcCYP80B1、PsCPR、Ps6OMT、Ps4’OMT、PsCNMT、ARO4(Q166K)、ARO7(T226I)、 ARO10和TKL1，其中RnTyrH、Ps4’OMT和CjNCS的额外拷贝是通过染色体整合到 zwf1基因座或YPL250C基因座中，并且GAPDH、CYP82X2、TRP1和PsMT1的额外 拷贝是通过染色体整合到ura3基因座中。在没有酪氨酸、但具有一种或一组酪氨酸类似 物的限定培养基中培养工程化产生诺斯卡品的菌株，所述酪氨酸类似物包括(但不限于) α-取代的L-酪氨酸(例如α-甲基L-酪氨酸，方案1)和3-取代的L-酪氨酸(例如3-硝基-L- 酪氨酸，方案2)。沿着诺斯卡品生物合成路径积累苄基异喹啉、原小檗碱、断裂小檗碱 和苯酞异喹啉生物碱的功能化衍生物。在一些情形下，为积累更多的苄基异喹啉、原小 檗碱或断裂小檗碱生物碱的功能化衍生物，从产生诺斯卡品的菌株移除某些或某些组下 游酶。
方案1.从α-取代的L-酪氨酸合成的功能化衍生物。
Figure BDA0001322766790000441
方案2.从3-取代的L-酪氨酸合成的功能化衍生物。
Figure BDA0001322766790000442
图式说明
图1图解说明根据本发明的实施方案基于植物中的生物化学鉴定生物用于将坎那丁 转化为诺斯卡品的合成方案。虚线箭头指示未证实的酶促步骤。实线箭头指示通过酵母(PsMT1、CYP82Y1、PsSDR1)中的异源表达或通过罂粟(PsMT1、CYP719A21、CYP82X2、 PsMT2、PsCXE1、PsSDR1)中病毒诱导的基因沉默(VIGS)证实的酶促步骤。当PsMT1、 CYP719A21、CYP82X2、PsCXE1、PsSDR1和PsMT2在罂粟中失活时，(S)-坎那丁、 (S)-N-甲基坎那丁、那可托林、罂粟奥辛、那可汀半缩醛和罂粟壳碱因此得以积累。
图2A图解说明根据本发明的实施方案基于酿酒酵母的生物化学表征将坎那丁转化 为诺斯卡品的生物合成方案。
图2A和2B绘示从坎那丁合成诺斯卡品的更新的生物合成路径。图2A绘示用于生物合成诺斯卡品的主要路径并且图2B图解说明主要路径以及用于产生副产物的路径。 如在图2A中并且根据酵母中的生物化学表征可看出，CYP82X2催化在合成1-羟基-N- 甲基坎那丁之后的酶促步骤。随后，PsAT1添加乙酰基以产生1-羟基-13-O-乙酰基-N- 甲基坎那丁，随后CYP82X1催化C-N键裂解并合成4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛。 PsCXE1和PsSDR1如先前所表明发挥作用并从4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合成罂 粟壳碱。CYP82Y1可以作用于(S)-坎那丁以产生1-羟基坎那丁。N-甲基左旋蛇果黄堇碱 可以根据CYP82X2的活性从N-甲基坎那丁合成。那可托林是在TNMT、CYP82Y1和 CYP82X1存在下从坎那丁合成。当将CYP82X1引入产生1,13-二羟基-N-甲基坎那丁的 菌株中时，产生那可托林吉地。
图2B图解说明根据本发明的实施方案基于酿酒酵母的生物化学表征将坎那丁转化 为诺斯卡品并产生副产物的另一生物合成方案。
图3图解说明根据本发明的实施方案由工程化的酵母菌株分泌到培养基中的化合物 的液相色谱-质谱法(LC-MS)分析的EIC迹线。具体来说，图3图解说明诺斯卡品、中间 体和衍生物产生的LC-MS迹线。图3绘示由工程化的酵母菌株分泌到培养基中的化合 物的液相色谱串联质谱法(LC-MS)分析。所有测定都在250μM坎那丁(S,R外消旋混合 物)存在下生长72h的酵母体内实施。通过离心将培养基与细胞沉淀分离并且通过 LC-MS进行分析。利用耦合到配备有Agilent Zorbax SB-Aq管柱(3.0×50mm 1.8微米) 和Agilent Zorbax SB-Aq guard管柱(2.1×12.5mm 5微米)的Agilent 1200Series HPLC 的Agilent 6320IonTrap(电喷雾毛细管电压-3.5kV；加热毛细管温度350℃；保护气体： 氮)获得阳离子电喷雾电离(ESI)质谱。LC分离方法为在7min内H2O:CH3从80:20到 40:60的梯度洗脱、在1min内100％CH3OH的梯度洗脱和最后4min的等度洗脱，并 且流速为0.5mL min-1。两种溶剂都为0.1％乙酸。
图4图解说明根据本发明的实施方案在图3中描述的化合物的阳离子电喷雾电离(ESI)质谱MS/MS片段化。如针对图3所描述获得阳离子电喷雾电离(ESI)质谱。并且以1.00V的片段化振幅保持40ms并且利用氦作为背景气体获得给定前体离子的MS/MS 质谱。
图5图解说明根据本发明的实施方案在表达来自罂粟或花菱草的TNMT并且在坎那丁存在下生长的酵母体内N-甲基坎那丁体的合成。在表达来自罂粟或花菱草的TNMT 并且在30℃下在250μM坎那丁(S,R外消旋混合物)存在下生长72h的酵母体内实施测 定。如针对图3所描述获得阳离子电喷雾电离(ESI)质谱。绘制分子离子的产物萃取离子 色谱图的萃取离子色谱图并且手动进行整合。误差棒是三个生物重复的S.D.。
图6图解说明根据本发明的实施方案在具有或不具有PsTNMT下在坎那丁存在下生长且在各种启动子的下游表达不同形式的CYP82Y1的酵母的体内测定结果。在250 μM坎那丁(S,R外消旋混合物)存在下生长72h的酵母体内实施测定。酵母在具有或不 具有PsTNMT下在各种启动子的下游表达不同形式的CYP82Y1。如针对图3所描述获 得阳离子电喷雾电离(ESI)质谱。绘制分子离子的产物萃取离子色谱图的萃取离子色谱图 并手动进行整合。误差棒是三个生物重复的S.D.。A绘示在不同温度(25℃和30℃)下在 通过染色体整合PsTNMT的酵母菌株中在各种启动子(GAL1、GPD、TPI1、TEF1、PGK1、 PYK1、CYC1、ADH1、HXT7启动子)的下游通过不同形式的CYP82Y1(1.将CYP82Y1 标签的N-端与其他ER-结合蛋白的N-端交换；2.将其他ER-结合蛋白的N-端标签直接 贴到CYP82Y1上)的1-羟基-N-甲基坎那丁的产生。B绘示在25℃下在HXT7启动子或 TPI11启动子的下游表达CYP82Y1或CYP82Y1A(N-端标签与MSH的N-端标签交换的 CYP82Y1)且整合PsTNMT的酿酒酵母中1-羟基-N-甲基坎那丁或1-羟基坎那丁的产生。
图7图解说明根据本发明的实施方案在PsTNMT和CYP82Y1A存在下在坎那丁存 在下生长且在各种启动子(GAL1、GPD、PGK1、HXT7)的下游表达CYP82X2的酵母的 体内测定结果。在250μM坎那丁(S,R外消旋混合物)存在下生长72h的酵母体内实施 测定。酵母在PsTNMT和CYP82Y1A存在下在各种启动子(GAL1、GPD、PGK1、HXT7 启动子)的下游表达CYP82X2。如针对图3所描述获得阳离子电喷雾电离(ESI)质谱。绘 制分子离子的产物萃取离子色谱图的萃取离子色谱图并手动进行整合。误差棒是三个生 物重复的S.D.。
图8图解说明根据本发明的实施方案在PsTNMT和CYP82Y1A存在下、在具有和 不具有CYP82X2和PsAT1下在坎那丁存在下生长且在各种启动子(GAL1、GPD、PGK1、 CYC1、ADH1、HXT7)的下游表达野生型(WT)的酵母的体内测定结果。在250μM坎那 丁(S,R外消旋混合物)存在下生长72h的酵母体内实施测定。在PsTNMT和CYP82Y1A 存在下在具有或没有CYP82X2和PsAT1的情况下，酵母在GAL1、HXT7、ADH1、CYC1、 GPD、TEF1和PGK1启动子的下游表达野生型CYP82X1。如针对图3所描述获得阳离 子电喷雾电离(ESI)质谱。绘制分子离子的产物萃取离子色谱图的萃取离子色谱图并手动 进行整合。误差棒是三个生物重复的S.D.。
图9图解说明根据本发明的实施方案将全去甲劳丹碱转化为诺斯卡品的生物合成方 案。
图10图解说明3-O-乙酰基-罂粟奥辛、那可汀半缩醛和诺斯卡品的LC-MS迹线。 具体来说，图10绘示使用如本文所描述的方法通过工程化的酵母菌株分泌到培养基中的 化合物的EIC-LCMS分析。
图11图解说明根据本发明的实施方案诺斯卡品从全去甲劳丹碱的生物合成。A绘示诺斯卡品标准品(黑色)和产生诺斯卡品的菌株CSYN16的培养基(红色)的MS/MS光 谱。B绘示从具有不同组表达盒的工程化菌株分析的诺斯卡品滴度。CSYN16：从染色体 表达AtATR1、Ps6OMT、Ps4'OMT、PsCNMT、PsBBE、PsS9OMT、CjCAS、CYP82Y1、 CYP82X2、PsAT1、PsSDR1、PsTNMT、PsMT2、CYP82X1、PsCXE1和PsMT3。 CSYN17_1：从染色体表达AtATR1、Ps6OMT、Ps4'OMT、PsCNMT、PsBBE、TfS9OMT、 CjCAS、CYP82Y1、CYP82X2、PsAT1、PsSDR1、PsMT2、PsTNMT、CYP82X1、PsCXE1 和PsMT3；从低拷贝质粒表达CYP82X2。CSYN17_2：从染色体表达AtATR1、Ps6OMT、 Ps4'OMT、PsCNMT、PsBBE、TfS9OMT、CjCAS、CYP82Y1、CYP82X2、PsAT1、PsSDR1、PsMT2、PsTNMT、CYP82X1、PsCXE1和PsMT3；从低拷贝质粒表达PsS9OMT。 CSYN18：从染色体表达AtATR1、Ps6OMT、Ps4'OMT、PsCNMT、PsBBE、TfS9OMT、 CjCAS、CYP82Y1、CYP82X2、PsAT1、PsSDR1、PsMT2、PsTNMT、CYP82X1、PsCXE1 和PsMT3；从低拷贝质粒表达CYP82X2、PsS9OM。C绘示产生诺斯卡品的酵母菌株 CSYN18的m/z+＝288(黑色)和414(红色)的EIC。误差棒代表五个生物重复的平均值±1 s.d.并且误差棒代表所述重复的标准偏差。
图12图解说明根据本发明的实施方案从酪氨酸生物合成诺斯卡品的路径。
图13图解说明根据本发明的实施方案在酵母中诺斯卡品的重新产生的证实。
图14图解说明根据本发明的实施方案在酵母中类诺斯卡品的重新产生的例示性生 物合成示意图。N4’OMT代表MT2、MT3异二聚体。
图15图解说明根据本发明的实施方案在酵母中的类诺斯卡品的重新产生的另一例 示性生物合成示意图。N4’OMT代表MT2、MT3异二聚体。
图16图解说明根据本发明的实施方案将葡萄糖转化为4-HPA、多巴胺和3,4-DHPA的生物合成方案。
图17图解说明根据本发明的实施方案通过去甲乌药碱将L-酪氨酸转化为牛心果碱 的生物合成方案。
图18图解说明根据本发明的实施方案通过全去甲劳丹碱将L-酪氨酸转化为牛心果 碱的生物合成方案。
图19图解说明根据本发明的实施方案的四氢生物喋呤的合成、循环和再利用路径的实例。
图20图解说明根据本发明的实施方案将L-酪氨酸转化为原小檗碱、苯酞异喹啉和小檗碱生物碱产物的生物合成方案。
图21图解说明根据本发明的实施方案将L-酪氨酸转化为诺斯卡品、类诺斯卡品和苯酞异喹啉生物碱产物的生物合成方案。
图22图解说明根据本发明的实施方案将L-酪氨酸转化为血根碱和苯啡啶生物碱的 生物合成方案。
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酶列表的论述
宿主细胞可以工程化以包括一种或多种修饰(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多种修饰)从而产生所关注BIA和/或所关注酶。 表1提供可以被一种或多种修饰作用从而在工程化的宿主细胞中产生所关注BIA和/或 所关注酶的例示性基因的列表。
如表1中所提供的基因修饰可用于从用含有生长所需要的基本营养素的培养基提供 的工程化的宿主细胞产生所关注BIA。此基础培养基可以含有碳源、氮源、氨基酸、维 生素和盐。例如，如表1中所提供的基因修饰可用于从进给糖的工程化的宿主细胞产生 所关注BIA。另外，如表1中所提供的一种或多种基因的修饰可用于扩大可以工程化用 于药物产生的宿主细胞的生物合成过程。
另外，仅从鉴定可由基因产生的酶不易明了使用这些修饰在工程化的宿主细胞中产 生所关注BIA和/或所关注酶。具体来说，如本文所描述已在宿主细胞(例如酵母细胞)中重构的合成路径包含在单一生物体内本质上不共同起作用的各种酶。另外，一些本文 所论述的酶在其天然环境中并不对BI生物合成起作用。另外，一些本文所描述的酶未 进化成在具体宿主细胞(例如酵母细胞)中起作用且未进化成共同起作用。在这些情形下， 可能无法显而易见酶可以在宿主细胞(例如酵母)中在合成BIA路径的情况中展现充足的 活性，以使充足的通量通过所述路径以产生下游BIA终产物。
例如，植物酶通常难以在异源微生物宿主(例如酵母)中功能性地表达。在许多情形 下，酶可能错误折叠、在宿主细胞内不正确定位和/或不正确地加工。在酵母与植物之间的蛋白质翻译和加工的差异可导致这些酶在酵母宿主中展现实质上降低到检测不到的活性。定位在内膜的酶(例如细胞色素P450)通常出现这些变化，这在BIA路径中有很强的 代表性。甚至降低的酶活性也可能对工程化酵母产生复杂的BIA构成重大挑战，这需要 在每一步骤中都具有充足的活性以确保高水平积累所需要的BIA产物。
另外，在一些宿主细胞(例如酵母)中存在可能作用于BIA路径中的许多早期前体(也 就是从酪氨酸到去甲乌药碱的中间体)的内源性酶/路径，且因此可能鉴于这些竞争性的 内源性路径而不会明了可有充足的通量通过异源路径以达成大量BIA产生。例如，酵母中的Erlich路径(Hazelwood等人2008.Appl.Environ.Microbiol.74:2259-66；Larroy 等人2003.Chem.Biol.Interact.143-144:229-38；Larroy等人2002.Eur.J.Biochem.269:5738-45)是主要的内源性路径，其可能起作用以将早期BIA路径中的许多中间体转化为 不需要的产物并从合成路径转移通量。
此外，如本文所论述和如表1中所提供的许多酶都可以在天然植物宿主中在非常特 定的调节策略(包括空间调节)下起作用，所述酶在转移到异源酵母宿主之后可能丧失。另外，植物呈现与酵母细胞非常不同的生物化学环境，酶在所述生物化学环境下进化成 起作用，所述生物化学环境包括pH、氧化还原状态和底物、辅底物、辅酶和辅因子可 用性。鉴于在天然宿主与异源酵母宿主之间的生物化学环境和调节策略的差异，酶在酵 母环境中时不明显展现大量活性且另外所述酶不明显可共同起作用以将诸如糖等简单前 体转化成复杂的BIA化合物。因为许多路径都具有许多反应步骤(>10个)，所以在酵母 宿主中维持酶的活性特别重要，因此如果这些步骤不是有效的，那么可以预计所需下游 产物不会积累。
另外，在天然植物宿主中，这些路径中的相关代谢物可以定位在不同的细胞和组织 类型内。在几个实例中，存在可以专门用于生物合成的细胞类型和可经合成用于代谢物积累的细胞类型。在异源酵母宿主内在路径中表达时，此类型的细胞专门化可能丧失并 且可能在控制这些代谢物对细胞的毒性方面起重要作用。因此，不会显而易见酵母可以 成功地工程化以生物合成和积累这些代谢物而不会受这些化合物的毒性伤害。
作为一个实例，在天然植物宿主中，报道酶BBE具有动态的亚细胞定位。具体来说，酶BBE最初在ER中开始且然后被分到液泡(Bird和Facchini.2001.Planta.213: 888-97)。已表明植物中BBE的ER-缔合(Alcantara等人2005.Plant Physiol.138:173-83) 为BBE活性提供最优的碱性pH(pH为约8.8)(Ziegler和Facchini.2008.Annu.Rev. PlantBiol.59:735-69)。作为另一实例，有证据表明血根碱生物合成是在植物细胞内的 专门泡囊中发生(Amann等人1986.Planta.167:310-20)，但只有一部分中间体积累在泡 囊中。这可能发生以便将它们与其他酶活性和/或毒性效应隔离。
作为另一实例，吗啡喃(morphinan)路径分支中的生物合成酶都定位到作为植物维 管组织的一部分的韧皮部。在韧皮部中，可以在两种细胞类型之间进一步划分路径酶：所有植物共有的筛管分子，和为仅存在于某些制备专门次级代谢物的植物中的专门细胞类型的乳汁管。筛管分子中主要为上游酶(也就是从NCS到SalAT)且乳汁管中大多为下 游酶(也就是T6ODM、COR、CODM)(Onoyovwe等人2013Plant Cell.25:4110-22)。 另外，已发现诺斯卡品生物合成路径中的最后步骤是在乳汁管中进行的(Chen和 Facchini.2014.PlantJ.77:173-84)。认为此区室化对于调节生物合成非常重要，所述调 节通过是离析或运输中间体、提供最优pH、增强辅因子的供应来实现，但是罂粟乳汁 管微环境的性质仍在研究(Ziegler和Facchini.2008.Annu.Rev.Plant Biol.59:735-69)。 另外，预测几种酶可以作为植物次级代谢共有的多酶复合体或代谢通道使用(Kempe等 人2009.Phytochemistry.70:579-89；Allen等人2004.Nat.Biotechnol.22:1559-66)。当 来自不同宿主的生物合成酶被组合和/或在异源酵母细胞中重组表达时，不清楚这些复合 体或通道将如同其在天然宿主中一样形成。在另一实例中，在日本黄连中，在根部组织 中生物合成小檗碱且所述小檗碱然后通过专门ATP-结合盒运输蛋白的作用积累于根茎 内(Shitan等人2013.Phytochemistry.91:109-16)。在鸦片罂粟中，吗啡喃生物碱积累于 乳胶(乳汁管细胞的细胞质)内(Martin等人1967.Biochemistry.6:2355-63)。
另外，即使存在这些研究，但情形还是用于本文所描述路径中的几个步骤的植物酶 尚未被表征。例如，酪氨酸到早期苄基异喹啉生物碱支架去甲乌药碱的转化就尚未被表征。另外，罂粟壳碱到诺斯卡品的转化只是最近才如本文所描述被表征的。因此，对于 本文所描述路径中的几个步骤，通过将通常不会共同天然存在的酶活性结合在一起用于 BIA的生物合成或根据基因组序列信息鉴定新的酶活性，产生替代生物合成方案以用于 重构路径中。
例如，可以通过将不会共同天然存在且不会进化成在此路径的情况中或与植物酶一 起发挥作用的至少5种哺乳动物酶和1种细菌酶组合来实现酪氨酸到多巴胺的两步骤转化。在这些情况中，这些酶用于化合物的生物合成可能不是很明显，所述酶在自然界中 不进化且其可在异源微生物宿主和此路径的情况中有效发挥作用。作为另一实例，负责 将罂粟壳碱转化为诺斯卡品的酶是未知的。尽管原位转化研究指示PsMT2参与此转化， 但PsMT2本身无法甲基化罂粟壳碱以得到诺斯卡品。如本文所论述的新颖酶复合体在 酵母中和在合成BIA路径的情况中实施此O-甲基化反应。由于Ps6OMT与PsMT3之 间的序列相似度较高，在植物中可能难以发现功能PsMT2/PsMT3酶复合体。酵母中的 纯净酶背景使得作为罂粟壳碱4’-O-甲基转移酶的PsMT2/PsMT3异二聚体的发现可能 如本文所陈述。
下文论述作为目标进行修饰以产生所关注BIA和/或所关注酶的基因的实例。另外， 在一系列图解说明用于生成所关注BIA和/或所关注酶中的路径的图的情况中论述基因。
[TLK1]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶转酮醇酶的表达。转酮醇酶是由TKL1基因编码。在实例中，转酮醇酶催化果糖-6-磷酸+甘油醛-3-磷酸
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木酮糖 -5-磷酸+赤藻糖-4-磷酸的反应，如在图16中提及。工程化的宿主细胞可以被修饰以在 工程化的宿主细胞中包括TKL1基因的组成型过表达。另外或或者，工程化的宿主细胞 可以被修饰以在工程化的宿主细胞中以合成方式调节TKL1基因的表达。在实例中，工 程化的宿主细胞可以被修饰以并入TKL1基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或或 者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞内引入用于TKL1基因过表达 的强启动子元件。TKL1基因可能源自酿酒酵母或另一物种。在一些实例中，TKL1基 因与天然存在基因可以为100％类似。
[ZWF1]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是由ZWF1基因编码。在实例中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化 葡萄糖-6-磷酸→6-磷酸葡糖酸内酯的反应，如在图16中所提及。工程化的宿主细胞可以 被修饰以在工程化的宿主细胞中删除ZWF1基因的编码区。或者，工程化的宿主细胞可 以通过(例如)引入失活突变被修饰以使ZWF1基因的功能性丧失。
[ARO4]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶3-去氧-D-阿拉伯糖基-庚糖酮酸-7-磷酸(DAHP)合成酶的表达。DAHP合成酶是由ARO4基因编码。在实例中，DAHP 合成酶催化赤藻糖-4-磷酸+磷酸烯醇丙酮酸→DAHP的反应，如在图16中所提及。工 程化的宿主细胞可以修饰ARO4基因以并入一种或多种反馈抑制缓解突变。具体来说， 反馈抑制缓解突变(例如ARO4FBR)可以如下并入：作为天然ARO4基因的定向突变在原 始基因座并入；作为以遗传整合引入的另一拷贝在单独基因座并入；或作为附加型载体 (例如2-μm或着丝粒质粒)上的另一拷贝。突变ARO4FBR中的标识符“FBR”指的是反馈 抗性突变体和突变。例如当工程化的宿主细胞是酵母细胞时，DAHP合成酶的反馈抑制 拷贝可处于天然酵母转录调节之下。或者，DAHP合成酶的反馈抑制拷贝可以通过将其 置于合成启动子的控制下被引入到具有工程化的蛋白质表达组成型或动态调节的工程化 宿主细胞中。在一些情形下，ARO4基因可以衍生自酿酒酵母。在一些情形下，ARO4 基因与天然存在基因可以为100％类似。ARO4基因的修饰的实例包括反馈抑制抗性突 变、K229L或Q166K。
[ARO7]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶分支酸变位酶的表达。分支酸变位酶是由ARO7基因编码。在实例中，分支酸变位酶催化分支酸→预苯酸的反应， 如在图16中所提及。工程化的宿主细胞可以修饰ARO7基因以并入一种或多种反馈抑 制缓解突变。具体来说，反馈抑制缓解突变(例如ARO7FBR)可以如下并入：作为针对天 然ARO7基因的定向突变在原始基因座引入；作为以遗传整合引入的另一拷贝在单独基 因座引入；或作为附加型载体(例如2-μm或着丝粒质粒)上的另一拷贝。突变ARO7FBR中的标识符“FBR”是指反馈抗性突变体和突变。例如当工程化的宿主细胞是酵母细胞时， 分支酸变位酶的反馈抑制拷贝可以处于天然酵母转录调节下。或者，分支酸变位酶的反 馈抑制拷贝可以通过将其置于合成启动子的控制下引入具有工程化的蛋白质表达组成型 或动态调节的工程化宿主细胞中。在一些情形下，ARO7基因可以源自酿酒酵母。在一 些情形下，ARO7基因与天然存在基因可以为100％类似。ARO7基因的修饰的实例包 括反馈抑制抗性突变或T226I。
[ARO10]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶苯丙酮酸脱羧酶的表达。苯丙酮酸脱羧酶是由ARO10基因编码。在实例中，苯丙酮酸脱羧酶催化羟基苯丙酮酸 →4-羟基苯乙酸(4HPA)的反应，如在图16中所提及。工程化的宿主细胞可以被修饰以在 工程化的宿主细胞中包括ARO10基因的组成型过表达。另外或或者，工程化的宿主细 胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中以合成方式调节ARO10基因的表达。在实例中， 工程化的宿主细胞可以被修饰以并入ARO10基因的一或多个拷贝或额外拷贝。另外或 或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞内引入用于过表达ARO10 基因的强启动子元件。ARO10基因可以源自酿酒酵母或另一物种。在一些实例中，ARO10 基因与天然存在基因可以为100％类似。
[ARO9]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶芳香族胺基转移酶的表达。芳香族胺基转移酶是由ARO9基因编码。在实例中，芳香族胺基转移酶催化羟基苯丙酮 酸+谷氨酸盐→酪氨酸+α-酮戊二酸的反应，如在图16中所提及。工程化的宿主细胞 可以被修饰以在工程化的宿主细胞中包括ARO9基因的组成型过表达。另外或或者，工 程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中以合成方式调节ARO9基因的表 达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被修饰以并入ARO9基因的一个或多个拷贝或额 外拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞内中引入用 于过表达ARO9基因的强启动子元件。ARO9基因可以源自酿酒酵母或另一物种。在一 些实例中，ARO9基因与天然存在基因可以为100％类似。
[TyrH]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶酪氨酸羟化酶的表达。酪氨酸羟化酶是由TyrH基因编码。在实例中，酪氨酸羟化酶催化酪氨酸→L-DOPA的反应， 如在图16和17中所提及。工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中包括 TyrH基因的组成型表达。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿 主细胞中以合成方式调节TyrH基因的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被修饰 以并入TyrH基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞可以 被修饰以在工程化的宿主细胞内中引入用于过表达TyrH基因的强启动子元件。TyrH基 因可以源自智人、褐鼠、小家鼠或另一物种。在一些实例中，TyrH基因与天然存在基 因可以为100％类似。
[DODC]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶L-DOPA脱羧酶的表达。 L-DOPA脱羧酶是由DODC基因编码。在实例中，L-DOPA脱羧酶催化L-DOPA→多巴 胺的反应，如在图16和17中所提及。工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主 细胞中包括DODC基因的组成型表达。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在 工程化的宿主细胞中以合成方式调节DODC基因的表达。在实例中，工程化的宿主细胞 可以被修饰以并入DODC基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程化的宿 主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞内中引入用于过表达DODC基因的强启动子 元件。DODC基因可以源自恶臭假单胞菌、褐鼠或另一物种。在一些实例中，DODC基 因与天然存在基因可以为100％类似。
[NCS]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶去甲乌药碱合成酶的表达。去甲乌药碱合成酶是由NCS基因编码。在实例中，去甲乌药碱合成酶催化4HPA+多巴 胺→(S)-去甲乌药碱的反应，如在图17中所提及。具体来说，图17图解说明根据本发 明的实施方案通过去甲乌药碱将L-酪氨酸转化为牛心果碱的生物合成方案。图17提供 以下酶的使用：如本文所论述的TyrH，酪氨酸羟化酶；DODC，DOPA脱羧酶；NCS， 去甲乌药碱合成酶；6OMT，6-O-甲基转移酶；CNMT，乌药碱N-甲基转移酶；CYP80B1， 细胞色素P450 80B1；CPR，细胞色素P450NADPH还原酶；4’OMT，3’羟基-N-甲基 乌药碱4’-O-甲基转移酶。L-DOPA，L-3,4-二羟基苯丙氨酸；和4-HPA，4-羟基苯基乙 醛。在图17中图解说明的酶中，4-HPA和L-酪氨酸是在酵母中天然合成的。所显示的 所有其他代谢物都不是在酵母中天然产生的。另外，尽管TyrH被绘示为催化L-酪氨酸 到L-DOPA的转化，但如说明书中所描述还可以使用其他酶实施此步骤。例如，还可以 使用酪氨酸酶实施L-酪氨酸到L-DOPA的转化。另外，还可以使用诸如细胞色素P450 氧化酶等其他酶实施L-酪氨酸到L-DOPA的转化。此类酶对相关的BIA前体化合物(包 括L-DOPA和L-酪氨酸)可以展现氧化酶活性。
另外，去甲乌药碱合成酶催化3,4-DHPA+多巴胺→(S)-全去甲劳丹碱的反应，如在图18中所提及。具体来说，图18图解说明根据本发明的实施方案通过全去甲劳丹碱 将L-酪氨酸转化为牛心果碱的生物合成方案。图18提供以下酶的使用：TyrH，酪氨酸 羟化酶；DODC，DOPA脱羧酶；maoA，单胺氧化酶；NCS，去甲乌药碱合成酶；6OMT， 6-O-甲基转移酶；CNMT，乌药碱N-甲基转移酶；4’OMT，3’羟基-N-甲基乌药碱4’-O- 甲基转移酶。L-DOPA，L-3,4-二羟基苯丙氨酸；和3,4-DHPA，3,4-二羟基苯基乙醛。在 图18中图解说明的酶中，L-酪氨酸是在酵母中天然合成的。在图18中所显示的其他代 谢物不是在酵母中天然产生的。
工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中包括NCS基因的组成型表达。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中以合成方式调 节NCS基因的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被修饰以并入NCS基因的一个 或多个拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主 细胞内中引入用于过表达NCS基因的强启动子元件。另外，去甲乌药碱合成酶可以具有 N-端截短。在一些情形下，NCS基因可以进行密码子优化用于在酿酒酵母中表达。NCS 基因可以源自日本黄连、罂粟、大红罂粟、黄花唐松草、岩黄连或另一物种。在一些实 例中，NCS基因与天然存在基因可以为80％类似。
[6OMT]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶去甲乌药碱6-O-甲基转移酶的表达。去甲乌药碱6-O-甲基转移酶是由6OMT基因编码。在一些实例中，去甲乌药碱 6-O-甲基转移酶催化去甲乌药碱→乌药碱的反应，如在图17中所提及。在其他实例中， 去甲乌药碱6-O-甲基转移酶催化全去甲劳丹碱→3’羟基乌药碱的反应，以及本文详述的 其他反应，例如在图18中所提供的那些反应。另外，工程化的宿主细胞可以被修饰以在 工程化的宿主细胞中包括6OMT基因的组成型表达。另外或或者，工程化的宿主细胞可 以被修饰以在工程化的宿主细胞中以合成方式调节6OMT基因的表达。在实例中，工程 化的宿主细胞可以被修饰以并入6OMT基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或或 者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞内中引入用于过表达6OMT基 因的强启动子元件。6OMT基因可以源自罂粟、黄花唐松草、日本黄连或另一物种。在 一些实例中，6OMT基因与天然存在基因可以为100％类似。
[CNMT]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶乌药碱-N-甲基转移酶的表达。乌药碱-N-甲基转移酶是由CNMT基因编码。在一些实例中，乌药碱-N-甲基转移酶 催化乌药碱→N-甲基乌药碱的反应，如在图17中所提及。在其他实例中，乌药碱-N-甲 基转移酶可以催化3’羟基乌药碱→3’羟基-N-甲基乌药碱的反应。在其他实例中，乌药碱 -N-甲基转移酶可以催化本文详述的其他反应，例如在图18中所提供的那些反应。另外， 工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中包括CNMT基因的组成型表达。 另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中以合成方式调节 CNMT基因的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被修饰以并入CNMT基因的一 个或多个拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿 主细胞内中引入用于过表达CNMT基因的强启动子元件。CNMT基因可以源自罂粟、 黄花唐松草、日本黄连或另一物种。在一些实例中，CNMT基因与天然存在基因可以为 100％类似。
[4’OMT]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶4’-O-甲基转移酶的表达。4’-O-甲基转移酶是由4’OMT基因编码。在一些实例中，4’-O-甲基转移酶催化3’-羟基-N-甲基乌药碱→牛心果碱的反应，如在图17中所提及。在其他实例中，4’-O-甲基转移酶 催化本文详述的其他反应，例如在图18中所提供的那些反应。另外，工程化的宿主细胞 可以被修饰以在工程化的宿主细胞中包括4’OMT基因的组成型表达。另外或或者，工 程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中以合成方式调节4’OMT基因的表 达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被修饰以并入4’OMT基因的一个或多个拷贝或 额外拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞内中引入 用于过表达4’OMT基因的强启动子元件。4’OMT基因可以源自罂粟、黄花唐松草、日 本黄连或另一物种。在一些实例中，4’OMT基因与天然存在基因可以为100％类似。
[CYP80B1]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶细胞色素P450 80B1的表达。细胞色素P450 80B1是由CYP80B1基因编码。在实例中，细胞色素P450 80B1 催化N-甲基乌药碱→3’-羟基-N-甲基乌药碱的反应，如在图17中所提及。工程化的宿主 细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中包括细胞色素P450 80B1基因的组成型表达。 另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中以合成方式调节细 胞色素P45080B1基因的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被修饰以并入细胞色 素P450 80B1基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞可以 被修饰以在工程化的宿主细胞内中引入用于过表达细胞色素P450 80B1基因的强启动子 元件。在一些情形下，CYP80B1基因可以进行密码子优化以在酿酒酵母中表达。细胞色 素P450 80B1基因可以源自罂粟、花菱草、黄花唐松草或另一物种。在一些实例中，P450 80B1基因与天然存在基因可以为77％类似。
[PTPS]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶6-丙酮酰基四氢生物喋呤(PTP)合成酶的表达。丙酮酰基四氢生物喋呤合成酶是由PTPS基因编码。在一些实例中， 6-丙酮酰基四氢生物喋呤合成酶催化二氢新喋呤三磷酸→PTP的反应，如在图19中所 提及。工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中包括PTPS基因的组成型 表达。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中以合成方式 调节PTPS基因的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被修饰以并入PTPS基因的 一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的 宿主细胞内中引入用于过表达PTPS基因的强启动子元件。在一些情形下，PTPS基因 可以进行密码子优化以在酿酒酵母中表达。PTPS基因可以源自褐鼠、智人、小家鼠或 另一物种。在一些实例中，PTPS基因与天然存在基因可以为80％类似。
[SepR]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶墨蝶蛉还原酶的表达。墨蝶蛉还原酶是由SepR基因编码。在一些实例中，墨蝶蛉还原酶催化PTP→BH4的反应， 如在图19中所提及。工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中包括SepR 基因的组成型表达。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞 中以合成方式调节SepR基因的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被修饰以并入 SepR基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰 以在工程化的宿主细胞内中引入用于过表达SepR基因的强启动子元件。在一些情形下， SepR基因可以进行密码子优化以在酿酒酵母中表达。SepR基因可以源自褐鼠、智人、 小家鼠或另一物种。在一些实例中，SepR基因与天然存在基因可以为72％类似。
[PCD]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶4a-羟基四氢生物喋呤(喋呤-4α-甲醇胺)脱水酶的表达。4a-羟基四氢生物喋呤脱水酶是由PCD基因编码。在一些实 例中，4a-羟基四氢生物喋呤脱水酶催化4a-羟基四氢生物喋呤→H2O+醌类二氢喋啶的 反应，如在图19中所提及。工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中包括 PCD基因的组成型表达。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主 细胞中以合成方式调节PCD基因的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被修饰以 并入PCD基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被 修饰以在工程化的宿主细胞内中引入用于过表达PCD基因的强启动子元件。在一些情 形下，PCD基因可以进行密码子优化以在酿酒酵母中表达。PCD基因可以源自褐鼠、 智人、小家鼠或另一物种。在一些实例中，PCD基因与天然存在基因可以为79％类似。
[QDHPR]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶醌类二氢喋啶还原酶的表达。醌类二氢喋啶还原酶是由QDHPR基因编码。在一些实例中，醌类二氢喋啶还原酶 催化醌类二氢喋啶→BH4的反应，如在图19中所提及。工程化的宿主细胞可以被修饰 以在工程化的宿主细胞中包括QDHPR基因的组成型表达。另外或或者，工程化的宿主 细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中以合成方式调节QDHPR基因的表达。在实例 中，工程化的宿主细胞可以被修饰以并入QDHPR基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。 另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞内中引入用于过表达 QDHPR基因的强启动子元件。在一些情形下，QDHPR基因可以进行密码子优化以在 酿酒酵母中表达。QDHPR基因可以源自褐鼠、智人、小家鼠或另一物种。在一些实例 中，QDHPR基因与天然存在基因可以为75％类似。
[DHFR]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶二氢叶酸还原酶的表达。二氢叶酸还原酶是由DHFR基因编码。在一些实例中，二氢叶酸还原酶催化7,8-二氢生物 喋呤(BH2)→5,6,7,8-四氢生物喋呤(BH4)的反应，如在图19中所提及。此反应可用于回 收BH4作为共底物以将酪氨酸转化为L-DOPA，如图17中所图解说明。工程化的宿主 细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中包括DHFR基因的组成型表达。另外或或者， 工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中以合成方式调节DHFR基因的 表达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被修饰以并入DHFR基因的一个或多个拷贝或 额外拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞内中引入 用于过表达DHFR基因的强启动子元件。在一些情形下，DHFR基因可以进行密码子优 化以在酿酒酵母中表达。DHFR基因可以源自褐鼠、智人或另一物种。在一些实例中， DHFR基因与天然存在基因可以为77％类似。
[CPR]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶细胞色素P450还原酶的表达。细胞色素P450还原酶催化的其他反应，例如在图在整个申请中所描述的那些反应。工 程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中包括CPR基因的组成型表达。另 外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中以合成方式调节CPR 基因的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被修饰以并入CPR基因的一个或多个 拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞内 中引入用于过表达CPR基因的强启动子元件。CPR基因可以源自花菱草、罂粟、智人、 酿酒酵母、拟南芥或另一物种。在一些实例中，CPR基因与天然存在基因可以为100％ 类似。
[BBE]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶小檗碱桥酶的表达。小檗碱桥酶是由BBE基因编码。在一些实例中，小檗碱桥酶催化(S)-牛心果碱→(S)-金黄紫堇碱 的反应，如在图20中所提及。图20图解说明根据本发明的实施方案将L-酪氨酸转化为 原小檗碱生物碱的生物合成方案。具体来说，图20提供以下酶的使用：BBE，小檗碱桥 酶；S9OMT，金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶；CAS，坎那丁合成酶；CPR，细胞色素P450 还原酶；和STOX，四氢原小檗碱氧化酶。工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的 宿主细胞中包括BBE基因的组成型表达。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以 在工程化的宿主细胞中以合成方式调节BBE基因的表达。在实例中，工程化的宿主细胞 可以被修饰以并入BBE基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程化的宿主 细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞内中引入用于过表达BBE基因的强启动子元件。 BBE基因可以源自罂粟、蓟罂粟、花菱草、刺小檗、粉绿色黄花唐松草亚种、日本黄连、 罂粟属或另一物种。在一些实例中，BBE基因与天然存在基因可以为99％类似。
[S9OMT]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶S-腺苷-L-甲硫氨酸:(S)-金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶的表达。S-腺苷-L-甲硫氨酸:(S)-金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶是由S9OMT基因编码。在一些实例中，S-腺苷-L-甲硫氨酸:(S)-金黄紫堇碱9-O-甲基转 移酶催化S-腺苷-L-甲硫氨酸+(S)-金黄紫堇碱→S-腺苷-L-高半胱氨酸+(S)-四氢非洲防 己碱的反应，如在图20中所提及。工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞 中包括S9OMT基因的组成型表达。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工 程化的宿主细胞中以合成方式调节S9OMT基因的表达。在实例中，工程化的宿主细胞 可以被修饰以并入S9OMT基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程化的 宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞内中引入用于过表达S9OMT基因的强启动 子元件。在一些情形下，S9OMT基因可以进行密码子优化以在酿酒酵母中表达。S9OMT 基因可以源自粉绿色黄花唐松草亚种、日本黄连、黄连、罂粟、唐松草属、黄连属、罂 粟属或另一物种。在一些实例中，S9OMT基因与天然存在基因可以为100％类似。在实 例中，S9OMT基因与天然存在基因可以为80％类似。
[CAS]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶(S)-坎那丁合成酶的表达。(S)- 坎那丁合成酶是由CAS基因编码。在一些实例中，(S)-坎那丁合成酶催化(S)-四氢非洲 防己碱→(S)-坎那丁的反应，如在图20中所提及。工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中表达CAS基因。工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞 中包括CAS基因的组成型表达。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化 的宿主细胞中以合成方式调节CAS基因的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被修 饰以并入CAS基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞可以 被修饰以在工程化的宿主细胞内中引入用于过表达CAS基因的强启动子元件。CAS基 因可以源自粉绿色黄花唐松草亚种、日本黄连、唐松草属、黄连属或另一物种。在一些 实例中，CAS基因与天然存在基因可以为100％类似。
[TNMT]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶四氢原小檗碱-N-甲基转移酶的表达。四氢原小檗碱-N-甲基转移酶是由TNMT基因编码。在一些实例中，四氢原 小檗碱-N-甲基转移酶催化坎那丁→N-甲基坎那丁的反应，如在图21中所提及。图21 图解说明根据本发明的实施方案将L-酪氨酸转化为诺斯卡品、类诺斯卡品和苯酞异喹啉 的生物合成方案。具体来说，图21提供以下酶的使用：BBE，小檗碱桥酶；S9OMT， 金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶；CAS，坎那丁合成酶；CPR，细胞色素P450还原酶；TNMT， 四氢原小檗碱顺式-N-甲基转移酶；CYP82Y1，N-甲基坎那丁1-羟化酶；CYP82X2，1- 羟基-N-甲基坎那丁13-羟化酶；AT1，1,13-二羟基-N-甲基坎那丁13-O-乙酰基转移酶； CYP82X1，4'-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合成酶；CXE1，那可汀半缩醛合成酶；NOS (或SDR1)，诺斯卡品合成酶；MT2，罂粟壳碱-4'-O-甲基转移酶1；MT3，罂粟壳碱-4'-O- 甲基转移酶2；和6OMT，6-O-甲基转移酶。
在其他实例中，四氢原小檗碱-N-甲基转移酶催化刺罂粟碱→顺式-N-甲基刺罂粟碱 的反应，如在图22中所提及。图22图解说明根据本发明的实施方案将L-酪氨酸转化为血根碱和苯啡啶生物碱的生物合成方案。具体来说，图22提供以下酶的使用：BBE，小 檗碱桥酶；CFS，碎叶紫堇碱合成酶；STS，刺罂粟碱合成酶；TNMT，四氢小檗碱N- 甲基转移酶；MSH，顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶；P6H，原鸦片碱6-羟化酶；和 DBOX，二氢苯并菲啶氧化酶。工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中 包括TNMT基因的组成型表达。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化 的宿主细胞中以合成方式调节TNMT基因的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被 修饰以并入TNMT基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞 可以被修饰以在工程化的宿主细胞内中引入用于过表达TNMT基因的强启动子元件。在 一些情形下，TNMT基因可以进行密码子优化以在酿酒酵母中表达。TNMT基因可以源 自罂粟、花菱草、大红罂粟、蓟罂粟或另一物种。在一些实例中，TNMT基因与天然存 在基因可以为100％类似。在实例中，TNMT基因与天然存在基因可以为81％类似。
[CYP82Y1]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶N-甲基坎那丁1-羟化酶的表达。N-甲基坎那丁1-羟化酶是由CYP82Y1基因编码。在一些实例中，N-甲基坎那 丁1-羟化酶催化N-甲基坎那丁→1-羟基-N-甲基坎那丁的反应，如在图21中所提及。工 程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中包括CYP82Y1基因的组成型表达。 另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中以合成方式调节 CYP82Y1基因的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被修饰以并入CYP82Y1基因 的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化 的宿主细胞内中引入用于过表达CYP82Y1基因的强启动子元件。在一些情形下， CYP82Y1基因可以进行密码子优化以在酿酒酵母中表达。在一些实例中，CYP82Y1可 以在N-端被修饰。CYP82Y1基因可以源自罂粟、罂粟属、沙生车前、异叶蛇根草、北 美荷包藤、白毛茛、异叶风罂粟、角茴香属(Hypecoum)或另一物种。在一些实例中， CYP82Y1基因与天然存在基因可以为70-78％类似。
[CYP82X2]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶1-羟基-N-甲基坎那丁13- 羟化酶的表达。1-羟基-N-甲基坎那丁13-羟化酶是由CYP82X2基因编码。在一些实例中，1-羟基-N-甲基坎那丁13-羟化酶催化1-羟基-N-甲基坎那丁→1-羟基-N-甲基左旋蛇果黄堇碱(也就是1,13-二羟基-N-甲基坎那丁)的反应，如在图21中所提及。工程化的宿主 细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中包括CYP82X2基因的组成型表达。另外或或 者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中以合成方式调节CYP82X2 基因的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被修饰以并入CYP82X2基因的一个或 多个拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细 胞内中引入用于过表达CYP82X2基因的强启动子元件。在一些情形下，CYP82X2基因 可以进行密码子优化以在酿酒酵母中表达。在一些实例中，CYP82X2可以在N-端被修 饰。CYP82X2基因可以源自罂粟、罂粟属、沙生车前、异叶蛇根草、北美荷包藤、白毛 茛、异叶风罂粟、扭果紫金龙、黄海罂粟、月桂小檗、甜菜、紫堇属、球果紫堇属、紫 金龙属或另一物种。在一些实例中，CYP82X2基因与天然存在基因可以为70-77％类似。 在其他实例中，CYP82X2基因可以经历N-端工程化。在实例中，N-端工程化可以包括 N-端截短。
[CYP82X1]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶4’-O-去甲基-3-O-乙酰基 罂粟奥辛合成酶的表达。4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合成酶是由CYP82X1基因编码。在一些实例中，4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合成酶催化1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那丁→4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛的反应，如在图21中所提及。另外，CYP82X1催化1-羟基-N-甲基坎那丁→4’-O-去甲基马克兰特醛的反应。工程化的宿主细 胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中包括CYP82X1基因的组成型表达。另外或或者， 工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中以合成方式调节CYP82X1基因 的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被修饰以并入CYP82X1基因的一个或多个 拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞内 中引入用于过表达CYP82X1基因的强启动子元件。在一些情形下，CYP82X1基因可以 进行密码子优化以在酿酒酵母中表达。在一些实例中，CYP82X1可以在N-端被修饰。 CYP82X1基因可以源自罂粟、罂粟属、沙生车前、异叶蛇根草、北美荷包藤、白毛茛、 异叶风罂粟、角茴香属或另一物种。在一些实例中，CYP82X1基因与天然存在基因可以 为71-77％类似。在其他实例中，CYP82X1基因可以经历N-端工程化。在实例中，N- 端工程化可以包括N-端截短。
[MT2和MT3]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶罂粟壳碱4’-O-甲基 化酶的表达。罂粟壳碱4’-O-甲基化酶是通过由MT2和MT3基因编码的O-甲基转移酶 单体形成的的异二聚体。在一些实例中，罂粟壳碱4’-O-甲基化酶催化罂粟壳碱→诺斯卡 品的反应，如在图2中所提及。另外，罂粟壳碱4’-O-甲基化酶催化罂粟壳碱半缩醛→那 可汀半缩醛和4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛→3-O-乙酰基罂粟奥辛的反应。工程化 的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中包括MT2和MT3基因的组成型表达。 另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中以合成方式调节 MT2和MT3基因的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被修饰以并入MT2和MT3 基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工 程化的宿主细胞内中引入用于过表达MT2和MT3基因的强启动子元件。在一些情形下， MT2和MT3基因可以进行密码子优化以在酿酒酵母中表达。MT2和MT3基因可以源 自罂粟、罂粟属、小花球果紫堇、沙生车前、异叶蛇根草或另一物种。在一些实例中， MT2和MT3基因与天然存在基因分别可以为80％和79％类似。在一些实例中，可以用 Ps6OMT取代MT3。
[AT1]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶1,13-二羟基-N-甲基坎那丁13-O乙酰基转移酶的表达。1,13-二羟基-N-甲基坎那丁13-O乙酰基转移酶是由AT1基 因编码。在一些实例中，1,13-二羟基-N-甲基坎那丁13-O乙酰基转移酶催化1,13-二羟 基-N-甲基坎那丁→1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那丁的反应，如在图2中所提及。图2 图解说明根据本发明的实施方案将坎那丁转化为诺斯卡品的生物合成方案。工程化的宿 主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中包括AT1基因的组成型表达。另外或或者， 工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中以合成方式调节AT1基因的表 达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被修饰以并入AT1基因的一个或多个拷贝或额外 拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞内中引入用于 过表达AT1基因的强启动子元件。在一些情形下，AT1基因可以进行密码子优化以在酿 酒酵母中表达。AT1基因可以源自罂粟、罂粟属、沙生车前、异叶蛇根草、北美荷包藤、 白毛茛、异叶风罂粟、细果角茴香、扭果紫金龙、黄海罂粟、月桂小檗、甜菜、紫堇属、 球果紫堇属、紫金龙属或另一物种。在一些实例中，AT1基因与天然存在基因可以为81％ 类似。
[CXE1或CXE2]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶那可汀半缩醛合成酶的表达。那可汀半缩醛合成酶是由CXE1基因编码。由CXE2基因编码的酶还可以用 作那可汀半缩醛合成酶。在一些实例中，那可汀半缩醛合成酶催化4’-O-去甲基-3-O-乙 酰基罂粟奥辛→罂粟壳碱半缩醛和3-O-乙酰基罂粟奥辛→那可汀半缩醛的反应，如在 图2中所提及。工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中包括CXE1或 CXE2基因的组成型表达。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿 主细胞中以合成方式调节CXE1或CXE2基因的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可 以被修饰以并入CXE1或CXE2基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程 化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞内中引入用于过表达CXE1或CXE2基 因的强启动子元件。在一些情形下，CXE1或CXE2基因可以进行密码子优化以在酿酒 酵母中表达。CXE1或CXE2基因可以源自罂粟、罂粟属、沙生车前、异叶蛇根草、北 美荷包藤、白毛茛、异叶风罂粟、细果角茴香、扭果紫金龙、黄海罂粟、月桂小檗、甜 菜、紫堇属、球果紫堇属、紫金龙属或另一物种。在一些实例中，CXE1基因或CXE2 基因与天然存在基因可以为78％类似。
[SDR1]在一些实例中，工程化的宿主细胞可以改良酶诺斯卡品合成酶的表达。诺斯卡品合成酶是由SDR1基因编码。在一些实例中，诺斯卡品合成酶催化罂粟壳碱半缩 醛→罂粟壳碱的反应，如在图2中所提及。另外，诺斯卡品合成酶催化那可汀半缩醛→ 诺斯卡品的反应。工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞包括SDR1基因 的组成型表达中。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰以在工程化的宿主细胞中 以合成方式调节SDR1基因的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可以被修饰以并入 SDR1基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或或者，工程化的宿主细胞可以被修饰 以在工程化的宿主细胞内中引入用于过表达SDR1基因的强启动子元件。在一些情形下， SDR1基因可以进行密码子优化以在酿酒酵母中表达。SDR1基因可以源自罂粟、罂粟属、 沙生车前、异叶蛇根草、北美荷包藤、白毛茛、异叶风罂粟、细果角茴香、扭果紫金龙、 黄海罂粟、月桂小檗、甜菜、紫堇属、球果紫堇属、紫金龙属或另一物种。在一些实例 中，SDR1基因与天然存在基因可以为79％类似。
上述基因的实例可在宿主细胞中从多个不同平台表达，包括质粒(2μ，ARS/CEN)、YAC或基因组。另外，上述基因序列的实例可以是天然的或密码子被优化的用于在所需 异源宿主(例如酿酒酵母)中表达。
在实例中，工程化的非植物宿主细胞从坎那丁产生类诺斯卡品或其前体。在一些实 例中，类诺斯卡品或其前体选自由以下组成的组：1-羟基-N-甲基坎那丁、N-甲基坎那丁、 诺斯卡品、罂粟壳碱、那可汀半缩醛、4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛、罂粟壳碱半缩醛、N-甲基左旋蛇果黄堇碱、1,13-二羟基-N-甲基坎那丁、1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲 基坎那丁、那可托林吉地、那可托林和1-羟基坎那丁。在其他实例中，细胞可以产生诺 斯卡品。在一些实例中，细胞可以通过包含一种或多种选自由以下组成的组的诺斯卡品 前体的合成路径从坎那丁产生类诺斯卡品或其前体：(S)-N-甲基坎那丁、1-羟基-N-甲基 坎那丁、1,13-二羟基-N-甲基坎那丁、1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那丁、4’-O-去甲基 -3-O-乙酰基罂粟奥辛、罂粟壳碱半缩醛和罂粟壳碱。
在一些其他实例中，细胞可以包含一个或多个编码一种或多种酶的异源编码序列。 在一些实施方案中，所述一个或多个异源编码序列可以编码四氢原小檗碱N-甲基转移酶 (TNMT)。在其他实例中，所述一个或多个异源编码序列编码N-甲基坎那丁1-羟化酶(CYP82Y1)。在其他实例中，所述一个或多个异源编码序列编码1-羟基-N-甲基坎那丁 13-羟化酶(CYP82X2)。另外，所述一个或多个异源编码序列可以编码1,13-二羟基-N- 甲基坎那丁13-O乙酰基转移酶(PsAT1)。在一些实例中，所述一个或多个异源编码序列 编码4’-O-去甲基-3-乙酰基罂粟奥辛合成酶(CYP82X1)。另外，在一些实例中，所述一 个或多个异源编码序列可以编码那可汀半缩醛合成酶(PsCXE1)。
另外，所述一个或多个异源编码序列可以编码诺斯卡品合成酶(PsSDR1)。在其他实 例中，所述一个或多个异源编码序列可以编码一种或多种选自PsMT3和Ps6OMT的酶。 另外，所述一个或多个异源编码序列可以编码酶CYP82Y1、CYP82X1和CYP82X2。在 一些实施方案中，细胞可以包含用于CPR酶的异源编码序列。在一些实例中，CPR酶 是ATR1。在其他实例中，所述一个或多个异源编码序列是从低拷贝构建体表达。在其 他实例中，细胞可能缺乏一种或多种选自PsMT3、Ps6OMT、PsMT2和CYP82Y1的酶。
在一些情形下，细胞可以产生类诺斯卡品且可以包含一个或多个用于一种或多种选 自以下的酶的异源编码序列：P450、卤化酶、糖基化酶、甲基转移酶、乙酰基转移酶、 短链脱氢酶、羧基酯酶和异戊二烯基转移酶。在一些实例中，所述一个或多个异源编码 序列可以源自选自罂粟和花菱草的来源生物体。在一些实例中，细胞是真核细胞。在一 些情形下，真核细胞是酵母细胞。在其他实例中，酵母细胞是酿酒酵母细胞。另外，在 一些情形下，细胞包含一种或多种源自两种或更多种与所述细胞不同的来源生物体的酶。 在其他情形下，细胞包含多个各自编码酶且各自源自与所述细胞不同的来源生物体的异 源编码序列。另外，细胞可以包含两个或更多个各自编码TNMT酶的异源编码序列。另 外，所述两个或更多个各自编码TNMT的异源编码序列可以源自不同的来源生物体。在 一些实施方案中，来源生物体可以选自罂粟和花菱草。
在一些其他实例中，所述一个或多个异源编码序列可以编码一种或多种突变酶。另 外，一种或多种突变酶可以是CYP82Y1N-端突变体。在其他实例中，细胞可以包含一 种或多种用于所述一个或多个异源编码序列的启动子。另外，在一些情形下，所述一种 或多种启动子包含强启动子。在实例中，启动子可以选自由以下组成的组：HXT7、ADH1、 PGK1、TPI1、PYK1、TEF1、GAL1、CYC1、GPD。另外，在一些实例中，所述一个 或多个异源编码序列编码CYP82Y1或CYP82Y1突变并且所述一种或多种启动子包含 HXT7。在一些情形下，细胞可以产生1-羟基-N-甲基坎那丁或1-羟基坎那丁。另外，在 一些实例中，所述一个或多个异源编码序列编码CYP82X2或CYP82X2突变体并且所述 一种或多种启动子包含HXT7。
在一些其他情形下，细胞可以产生1,13-二羟基-N-甲基坎那丁。另外，所述一个或多个异源编码序列可以编码CYP82X2或CYP82X2突变体并且所述一种或多种启动子包 含PGK1和GPD。另外，细胞可以产生N-甲基-左旋蛇果黄堇碱。所述一个或多个异源 编码序列可以编码CYP82X1或CYP82X1突变体并且所述一种或多种启动子包含 HXT7。另外，细胞可以产生4’-O-去甲基-2-O-乙酰基罂粟奥辛，或细胞可以产生那可托 林和那可托林吉地。在其他实例中，细胞可以包含一种或多种选自以下的植物蛋白伴侣： 结合性免疫球蛋白(BiP)、DnaJ蛋白、葡萄糖调节蛋白(GRP)94、结合蛋白(BiP)、蛋白 二硫化物异构酶(PDI)、亲环素和钙联蛋白。
在实例中，细胞包含所述一个或多个异源编码序列的多个拷贝。在一些实例中，所述一个或多个异源编码序列编码一种或多种选自以下的酶：CYP82Y1、CYP82X2、 CYP82X1、PsCXE1、PsSDR1和PsMT3。另外，在一些实例中，所述一个或多个异源 编码序列的多个拷贝源自两种或更多种与细胞不同的来源生物体。在其他实例中，所述 酶中的一种或多种是在空间上定位到酵母细胞中的区室，其中所述区室是选自线粒体、 内质网(ER)、高尔基体、液泡、细胞核、质膜、过氧化物酶体和周质。另外，在实例中， 所述一种或多种酶是在空间上定位到酵母细胞中的区室的外部。另外，在实例中，所述 一种或多种酶是在空间上定位到酵母细胞中的区室的内部。
在其他实例中，细胞可以从全去甲劳丹碱产生诺斯卡品生物碱。另外，细胞可以包含一个或多个编码一种或多种选自以下的酶的异源编码序列：TNMT、PsAT1、CYP82X1、PsCXE1、PsSDR1、PsMT3、CYP82Y1、CYP82X1、S9OMT、PsMT2、Ps6OMT、Ps4’OMT、 PsCNMT、PsBBE、CPR1和CYP719A。另外，细胞可以从YAC表达TNMT、PsAT1、 CYP82X1、PsCXE1、PsSDR1、PsMT2。另外，细胞可以从低拷贝质粒表达CYP82Y1 和CYP82X1。在其他实例中，细胞可以从高拷贝质粒表达S9OMT。在一些情形下， Ps6OMT、Ps4’OMT、PsCNMT、PsBBE、CPR1和CYP719A是通过染色体整合于细胞 中。
在一些实例中，提供制备类诺斯卡品或其前体的方法，其包含在适于蛋白产生的条 件下培养如权利要求1到56中任一项的宿主细胞以产生类诺斯卡品或其前体。在一些情形下，所述方法可以进一步包含从细胞培养物中回收类诺斯卡品或其前体。在其他实例中，所述方法可以进一步包含在足以从类诺斯卡品产生BIA的条件下培养细胞；和从细 胞培养物中回收BIA。在其他实例中，所述方法可以进一步包含向细胞培养物中添加起 始化合物。在一些情形下，起始化合物是坎那丁。在一些情形下，起始化合物是全去甲 劳丹碱。另外，在一些情形下，起始化合物是酪氨酸或酪氨酸类似物。在其他实例中， 所述方法可以进一步包含向细胞培养物中添加生长原料。
尽管已出于理解清楚的目的借助图解说明和实例相当详细地描述了上述发明，但本 领域技术人员鉴于本发明的教示易于明了可以对其作出某些改变和修饰，这并不背离随 附权利要求书的精神或范围。
因此，前述内容仅阐释本发明的原理。应了解本领域技术人员将能设想出各种尽管 未明确描述或显示于本文中但体现本发明的原理且包括在本发明的精神和范围内的布置。此外，本文所叙述的所有实例和条件性语言都旨在协助读者理解本发明的原理和由 发明人贡献的概念以促进所述领域，且应视为对此类明确叙述的实例和条件无限制。此 外，本文中叙述本发明的原理、方面和实施方案以及其特定实例的所有陈述都旨在涵盖 其结构和功能等效形式。另外，此类等效形式包括目前已知的等效形式和未来将发展的 等效形式(也就是无论结构如何都实施相同功能的所发展的任何要素)。因此，本发明的 范围不打算限于本文所显示和描述的例示性实施方案。而是，通过随附权利要求书体现 本发明的范围和精神。

Claims (62)

1.一种工程化的微生物细胞，所述工程化的微生物细胞沿着将坎那丁、（S）-N-甲基坎那丁、1-羟基-N-甲基-坎那丁、1,13-二羟基-N-甲基坎那丁、1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那丁或4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛转化为类诺斯卡品产物的代谢路径产生作为坎那丁衍生物的苄基异喹啉生物碱产物，所述类诺斯卡品产物为至少一种选自由那可汀半缩醛、诺斯卡品和3-O-乙酰基罂粟奥辛组成的组的化合物，其中在所述工程化的微生物细胞中产生的所述苄基异喹啉生物碱产物的量大于在微生物细胞中产生的所述苄基异喹啉生物碱产物的量；
其中所述工程化的微生物细胞包含编码参与所述代谢路径的异二聚体酶的异源编码序列，所述异二聚体酶为PsMT2+PsMT3的异二聚体酶或PsMT2+Ps6OMT的异二聚体酶。
2.如权利要求1所述的工程化的微生物细胞，其中所述工程化的微生物细胞将细胞内的起始化合物转化为所述苄基异喹啉生物碱产物。
3.如权利要求2所述的工程化的微生物细胞，其中所述起始化合物是在所述工程化的微生物细胞内产生的。
4.如权利要求1所述的工程化的微生物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物是苯酞异喹啉生物碱。
5.如权利要求4所述的工程化的微生物细胞，其中所述苯酞异喹啉生物碱产物是罂粟壳碱半缩醛。
6.如权利要求4所述的工程化的微生物细胞，其中所述苯酞异喹啉生物碱产物是那可汀半缩醛。
7.如权利要求6所述的工程化的微生物细胞，其中参与所述代谢路径的所述酶为PsMT2+PsMT3的异二聚体酶，且其中所述PsMT2+PsMT3的异二聚体酶将罂粟壳碱半缩醛转化为那可汀半缩醛。
8.如权利要求6所述的工程化的微生物细胞，其中参与所述代谢路径的所述酶为PsMT2+Ps6OMT的异二聚体酶，且其中所述PsMT2+Ps6OMT的异二聚体酶将罂粟壳碱半缩醛转化为那可汀半缩醛。
9.如权利要求4所述的工程化的微生物细胞，其中所述苯酞异喹啉生物碱产物是罂粟壳碱。
10.如权利要求4所述的工程化的微生物细胞，其中所述苯酞异喹啉生物碱产物是诺斯卡品。
11.如权利要求10所述的工程化的微生物细胞，其中参与所述代谢路径的所述酶为PsMT2+PsMT3的异二聚体酶，且其中所述PsMT2+PsMT3的异二聚体酶将罂粟壳碱转化为诺斯卡品。
12.如权利要求10所述的工程化的微生物细胞，其中参与所述代谢路径的所述酶为PsMT2+Ps6OMT的异二聚体酶，且其中所述PsMT2+Ps6OMT的异二聚体酶将罂粟壳碱转化为诺斯卡品。
13.如权利要求1所述的工程化的微生物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物是原小檗碱产物。
14.如权利要求1所述的工程化的微生物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物选自由4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛和3-O-乙酰基罂粟奥辛组成的组。
15.如权利要求13所述的工程化的微生物细胞，其中所述原小檗碱产物是3-O-乙酰基罂粟奥辛，其中参与所述代谢路径的所述酶为PsMT2+PsMT3的异二聚体酶，且其中所述PsMT2+PsMT3的异二聚体酶将4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛转化为3-O-乙酰基罂粟奥辛。
16.如权利要求13所述的工程化的微生物细胞，其中所述原小檗碱产物是3-O-乙酰基罂粟奥辛，其中参与所述代谢路径的所述酶为PsMT2+Ps6OMT的异二聚体酶，且其中所述PsMT2+Ps6OMT的异二聚体酶将4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛转化为3-O-乙酰基罂粟奥辛。
17.如权利要求1所述的工程化的微生物细胞，其中所述工程化的微生物细胞是酵母细胞。
18.如权利要求1所述的工程化的微生物细胞，其中所述工程化的微生物细胞包含至少一个编码至少一种启动子的异源序列。
19.如权利要求18所述的工程化的微生物细胞，其中所述至少一种启动子选自由HXT7、ADH1、PGK1、TPI1、PYK1、TEF1、GAL1、CYC1、PUT1、CIT2和GPD组成的组。
20.如权利要求1所述的工程化的微生物细胞，其中所述工程化的微生物细胞包含一种或多种选自由以下组成的组的植物蛋白伴侣：结合性免疫球蛋白(BiP)、DnaJ蛋白、葡萄糖调节蛋白(GRP) 94、结合蛋白(BiP)、蛋白二硫化物异构酶(PDI)、亲环素和钙联蛋白。
21.如权利要求1所述的工程化的微生物细胞，其中所述酶中的一种或多种在空间上定位于所述工程化的微生物细胞中的区室，其中所述区室选自由线粒体、内质网(ER)、高尔基体、液泡、细胞核、质膜、过氧化物酶体和周质组成的组。
22.如权利要求21所述的工程化的微生物细胞，其中所述一种或多种酶在空间上定位于所述工程化的微生物细胞中的所述区室的外部。
23.如权利要求21所述的工程化的微生物细胞，其中所述一种或多种酶在空间上定位于所述工程化的微生物细胞中的所述区室的内部。
24.如权利要求1所述的工程化的微生物细胞，其中所述工程化的微生物细胞包含至少一个用于编码至少一种裁剪酶的异源编码序列。
25.如权利要求24所述的工程化的微生物细胞，其中所述至少一种裁剪酶选自由卤化酶、异戊烯转移酶、糖基化酶、甲基化酶、去甲基化酶和氧化还原酶组成的组。
26.一种形成具有苄基异喹啉生物碱产物的产物流的方法，所述苄基异喹啉生物碱产物是坎那丁的下游产物，所述方法包括：
a. 培养工程化的微生物细胞，所述工程化的微生物细胞沿着将坎那丁、（S）-N-甲基坎那丁、1-羟基-N-甲基-坎那丁、1,13-二羟基-N-甲基坎那丁、1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那丁或4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛转化为类诺斯卡品产物的代谢路径产生作为坎那丁衍生物的苄基异喹啉生物碱产物，所述类诺斯卡品产物为至少一种选自由那可汀半缩醛、诺斯卡品和3-O-乙酰基罂粟奥辛组成的组的化合物，其中所述工程化的微生物细胞包含至少一个编码参与所述代谢路径的异二聚体酶的异源序列，所述异二聚体酶为PsMT2+PsMT3的异二聚体酶或PsMT2+Ps6OMT的异二聚体酶；和
b. 从细胞材料中分离出所述苄基异喹啉生物碱产物以提供具有所述苄基异喹啉生物碱产物的产物流。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述工程化的微生物细胞中所述酶的量大于未工程化的微生物细胞中所述酶的量。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物是苯酞异喹啉生物碱。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述苯酞异喹啉生物碱产物是那可汀半缩醛。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述苯酞异喹啉生物碱产物是诺斯卡品。
31.如权利要求26所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物是原小檗碱产物。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述原小檗碱产物是3-O-乙酰基罂粟奥辛。
33.如权利要求26所述的方法，其中所述工程化的微生物细胞包含至少一个编码至少一种启动子的异源序列。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述至少一种启动子选自由HXT7、ADH1、PGK1、TPI1、PYK1、TEF1、GAL1、CYC1、PUT1、CIT2和GPD组成的组。
35.如权利要求26所述的方法，其中所述工程化的微生物细胞包含一种或多种选自由以下组成的组的植物蛋白伴侣：结合性免疫球蛋白(BiP)、DnaJ蛋白、葡萄糖调节蛋白(GRP)94、结合蛋白(BiP)、蛋白二硫化物异构酶(PDI)、亲环素和钙联蛋白。
36.如权利要求26所述的方法，其中所述酶中的一种或多种在空间上定位于所述工程化的微生物细胞中的区室，其中所述区室选自由线粒体、内质网(ER)、高尔基体、液泡、细胞核、质膜、过氧化物酶体和周质组成的组。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述一种或多种酶在空间上定位于所述工程化的微生物细胞中的所述区室的外部。
38.如权利要求36所述的方法，其中所述一种或多种酶在空间上定位于所述工程化的微生物细胞中的所述区室的内部。
39.如权利要求26所述的方法，其中所述工程化的微生物细胞包含至少一个用于编码至少一种裁剪酶的异源编码序列。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述至少一种裁剪酶选自由卤化酶、异戊烯转移酶、糖基化酶、甲基化酶、去甲基化酶和氧化还原酶组成的组。
41.如权利要求26所述的方法，其中所述工程化的微生物细胞是酵母细胞。
42.如权利要求26所述的方法，其中在体外条件下培养所述工程化的微生物细胞。
43.如权利要求26所述的方法，其中在体内条件下培养所述工程化的微生物细胞。
44.如权利要求26所述的方法，其中所述产物流不含有超过5 ppm的选自以下各项的组的分子：木质素、类黄酮、类菲、乳胶、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶、袂康酸、假吗啡、那碎因、蒂巴酚和花粉。
45.如权利要求26所述的方法，其中所述产物流不含可检测量的杀虫剂。
46.如权利要求26所述的方法，其中所述产物流含有工程化的微生物细胞的至少一部分。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述微生物细胞的所述至少一部分以可检测量存在于所述产物流中。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述微生物细胞的所述至少一部分使用液相色谱-质谱法可检测。
49.如权利要求47所述的方法，其中所述微生物细胞的所述至少一部分使用质谱法可检测。
50.如权利要求47所述的方法，其中所述微生物细胞的所述至少一部分使用光谱法可检测。
51.如权利要求26所述的方法，其中使用至少液-液萃取从所述产物流中回收所述苄基异喹啉生物碱产物。
52.如权利要求26所述的方法，其中在已完成发酵过程之后立即回收所述苄基异喹啉生物碱产物。
53.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
苄基异喹啉生物碱产物，所述苄基异喹啉生物碱产物为沿着将坎那丁、（S）-N-甲基坎那丁、1-羟基-N-甲基-坎那丁、1,13-二羟基-N-甲基坎那丁、1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那丁或4’-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛转化为类诺斯卡品产物的代谢路径的坎那丁衍生物，所述类诺斯卡品产物为至少一种选自由那可汀半缩醛、诺斯卡品和3-O-乙酰基罂粟奥辛组成的组的化合物；和
如权利要求1所述的工程化的微生物细胞的至少一部分。
54.如权利要求53所述的药物组合物，其中所述工程化的微生物细胞的所述至少一部分以可检测量存在于所述产物流中。
55.如权利要求54所述的药物组合物，其中所述工程化的微生物细胞的所述至少一部分使用液相色谱-质谱法可检测。
56.如权利要求54所述的药物组合物，其中所述工程化的微生物细胞的所述至少一部分使用质谱法可检测。
57.如权利要求54所述的药物组合物，其中所述工程化的微生物细胞的所述至少一部分使用光谱法可检测。
58.如权利要求53所述的药物组合物，其中所述组合物不含有超过5 ppm的选自以下各项的组的分子：木质素、类黄酮、类菲、乳胶、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶、袂康酸、假吗啡、那碎因、蒂巴酚和花粉。
59.如权利要求53所述的药物组合物，其中所述组合物不含可检测量的杀虫剂。
60.如权利要求53所述的药物组合物，其中所述苄基异喹啉生物碱产物包含诺斯卡品。
61.如权利要求53所述的药物组合物，其中所述苄基异喹啉生物碱产物包含那可汀半缩醛。
62.如权利要求53所述的药物组合物，其中所述苄基异喹啉生物碱产物包含3-O-乙酰基罂粟奥辛。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2964634A1 (en) * 2014-11-17 2016-05-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Noscapinoid-producing microbes and methods of making and using the same
CA2983419A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Benzylisoquinoline alkaloid (bia) precursor producing microbes, and methods of making and using the same
IL255136B2 (en) 2015-05-08 2023-09-01 Univ Leland Stanford Junior Methods for generating epimerases and benzylisoquinoline alkaloids
BR112020002050A2 (pt) 2017-08-03 2020-09-08 Antheia, Inc. epimerases engenheiradas alcaloides benzilisoquinolina e métodos de produção de alcaloides benzilisoquinolina
EP4181937A1 (en) * 2020-07-15 2023-05-24 Danmarks Tekniske Universitet Therapeutic microbes
EP4241572A1 (de) 2022-03-11 2023-09-13 Phytobiotics Futterzusatzstoffe GmbH Tierfutter oder tierfutterzusatz mit canadin und/oder canadin-derivat
CN117430614B (zh) * 2023-12-20 2024-03-08 首都医科大学 一种异喹啉类衍生物及其合成方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008067070A2 (en) * 2006-10-19 2008-06-05 California Institute Of Technology Compositions and methods for producing benzylisoquinolines alkaloids
CN103282500A (zh) * 2010-11-05 2013-09-04 巴斯夫植物科学有限公司 用于增加植物中产量和精细化学品生产的方法
WO2013136057A2 (en) * 2012-03-13 2013-09-19 Glaxosmithkline Australia Pty Limited Nucleic acid molecule

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070199090A1 (en) * 2006-02-22 2007-08-23 Nestor Apuya Modulating alkaloid biosynthesis
WO2012039438A1 (ja) * 2010-09-22 2012-03-29 石川県公立大学法人 植物ベンジルイソキノリンアルカロイドの生産方法
EP2565262A1 (en) * 2011-08-31 2013-03-06 VTU Holding GmbH Protein expression
BR112015023036A2 (pt) * 2013-03-15 2017-11-14 Univ Leland Stanford Junior método para preparar um produto alcaloide benzilisoquinolina e célula microbiana engenheirada que produz um produto alcaloide benzilisoquinolina
AU2014306345B2 (en) * 2013-08-16 2018-12-13 Willow Biosciences Inc. Compositions and methods for making noscapine and synthesis intermediates thereof
AU2015252707B2 (en) * 2014-04-29 2019-07-11 Willow Biosciences Inc. Improved methods for making and using polynucleotide sequences in the synthesis of alkaloid compounds
CA2964634A1 (en) * 2014-11-17 2016-05-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Noscapinoid-producing microbes and methods of making and using the same
CA2983419A1 (en) * 2015-05-04 2016-11-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Benzylisoquinoline alkaloid (bia) precursor producing microbes, and methods of making and using the same
IL255136B2 (en) * 2015-05-08 2023-09-01 Univ Leland Stanford Junior Methods for generating epimerases and benzylisoquinoline alkaloids

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008067070A2 (en) * 2006-10-19 2008-06-05 California Institute Of Technology Compositions and methods for producing benzylisoquinolines alkaloids
CN103282500A (zh) * 2010-11-05 2013-09-04 巴斯夫植物科学有限公司 用于增加植物中产量和精细化学品生产的方法
WO2013136057A2 (en) * 2012-03-13 2013-09-19 Glaxosmithkline Australia Pty Limited Nucleic acid molecule

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Publication number Publication date
AU2019257500A1 (en) 2019-11-28
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NZ731398A (en) 2018-11-30
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