JP2021006927A - 光学顕微鏡および顕微鏡使用法 - Google Patents

Abstract

【課題】高スループットで微小物体を検査する光学顕微鏡を提供する。【解決手段】顕微鏡１００は、測定区画を照光する光源と、微小物体２２が内部で測定区画内に連続して移動できるサンプル容器２０と、測定区画内に配置された微小物体２２から到来する検出光を測定する検出装置３０とを含む。顕微鏡１００は、結像手段１０が、固定式前方光学部品１１と可動式焦点合わせ光学部品とを備える検出レンズ１０を含み、焦点合わせ光学部品が、前方光学部品１１の背後で中間像面の正面に配置され、この焦点合わせ光学系１２を調整することで、検出面の高さを調整できる。【選択図】図１

Description

本発明は、複数の微小物体を検査する光学顕微鏡、および複数の微小物体を検査するための顕微鏡使用法に関する。

光学顕微鏡が適用される基本的な分野は、複数の試料の実現可能な最速の検査にあると認識できる。この用途に合わせて設計された顕微鏡は、高スループット顕微鏡としても知られている。

微小物体とも記述される検査試料は、例えば、生体組織を含み得る。これらの物体は、担持媒体、例えば、水性媒体又はゲル内で搬送されることが多い。

大量の試料を管理するために、一般的な光学顕微鏡は、測定領域を照光する光源と、微小物体を内部で順次測定領域に移送できる試料槽とに加え、測定領域に配置された微小物体から到来する検出光を測定するための結像手段及び検査ユニットを含む。

複数の微小物体を検査するための、対応する一般的な顕微鏡使用法は、測定領域を照光するステップと、試料槽内で微小物体を順次検査領域に移送するステップと、検査領域内に配置された微小物体から到来する検出光を、結像手段及び検査ユニットを用いて測定するステップと、を少なくとも含む。

実現可能な最高速度に合わせて設計された顕微鏡及び顕微鏡使用法の場合においても、良好な像質で、達成可能な速度を更に引き上げることが求められる。これにより、費用効果の高い顕微鏡構造が実現することになる。

一般的な顕微鏡は、特許文献１に記載されている。ここでは、ゲル内に収容された試料が次々と測定領域内に運ばれる。ただし、試料の位置決めにかなり長い時間が必要である。

更に他の一般的な顕微鏡は、特許文献２に記載されている。ここでは、かなり長い時間を要する試料の位置決めは、実のところ不要である。ただし、その一方で、前後に配置された３つの顕微鏡を含む装置構成の要求基準が好ましからざる高さにある。したがって、この顕微鏡では多数の試料の費用効果の高い検査も同様に不可能である。

米国特許第８，２２８，４９９号明細書 国際特許公開第２０１０／０１２９８０号公報

本発明の目的は、可能な限り高速で最大の費用効果が得られる、多数の試料の検査に役立つ光学顕微鏡及び顕微鏡使用法を提供することであると認識できる。

この目的は、各独立請求項に係る発明によって達成される。

本発明に係る方法及び本発明に係る光学顕微鏡の有利な変形例は、従属請求項の対象であり、下記の説明において更に説明される。

前述したタイプの光学顕微鏡において、結像手段は、本発明によれば、固定式前方光学系及び可動式焦点合わせ光学系を備える検出用対物レンズを含み、焦点合わせ光学系は、前方光学系の後方で中間像面の正面に配置され、この焦点合わせ光学系を調整することで、検出面の高さを調節することができる。

前述したタイプの方法において、本発明によれば、検出ユニットによって、異なる検出面上の複数の試料像が順次記録される。これらの検出面は、検出用対物レンズの固定式前方光学系の背後で中間像面の正面に配置された可動式焦点合わせ光学系を用いて調整される。

検出ユニットにおいて鮮明に結像される検出面の高さ調整に関して、試料を変位させる必要がないという点は、本発明の中核概念であると見なせる。試料槽の移動は、移動すべき質量が比較的大きいために時間のかかる作業となる。一方、焦点合わせ手段の場合は、移動すべき質量が小さいため、比較的速い速度を実現できる。

他の基本的概念は、インナーフォーカス式の焦点合わせ手段の構成及び設計において認識され得る。したがって、この焦点合わせ手段は、固定式の前方光学系の後方の光路内に設けられる。試料又は隣接する媒体は、焦点合わせ手段を調整する際にその影響を受けることも移動されることもない。また、焦点合わせ手段は、中間像面の正面に配置される。この像面は、検出光の光路において検出面と光学結合される第１平面を意味する。検出面は、結像手段によってこの中間像面内に結像される。このように前部に焦点合わせ手段を設けることによって、比較的少ない個数の光学部品で試料を検査することができる。特に、結像される検出面の高さを調整するために、検出用対物レンズの後方の光路に更に他の対物レンズ又は顕微鏡を必要としない。例えば、特許文献２の顕微鏡と比べ、本装置の費用は大幅に低減される。

このため、試料槽から前方光学系までの全ての光学境界領域は、異なる微小物体と異なる検出面を順次測定している間、固定されてよい。これらの特性は、短い調整時間で大量の試料を検査できるようにする上で非常に重要である。試料を取り囲む試料媒体、例えば、水は、試料の測定中、常に試料槽と接触しているため、異なる微小物体が次々と測定されるときに、光学境界領域が移動することはない。光学境界領域としては、特に、試料媒体から試料槽までの境界領域、試料槽から試料槽環境までの境界領域、及び試料槽環境から前方光学系までの境界領域が挙げられる。試料槽環境の設計によっては、更なる境界領域が存在し得る。重要な利点として、これらすべての光学境界領域は、異なる検出面が検出ユニット上に結像されて次々と測定されるときに、固定された状態に残ることができる。

本発明によって、少なくともいくつかの試料像の記録処理の間で焦点合わせ手段を調整することで、検出用対物レンズの光軸の方向に検出面を変位させることが可能になる。この後、記録された試料像を結合して、３次元の試料像を生成できる。異なる検出面で試料像を記録する際に、検査対象の物体は静止した状態であってよい。

物体は、これらの記録処理の完了後においてのみ、測定領域から移動されて、次の物体が測定領域内に送られる。この処理は、物体の移動方向が検出面と同一平面である場合に特に好ましい。

これに代えて、複数の試料像が順次記録されてもよく、この場合、微小物体は少なくとも異なる試料像の記録処理の間で移動され、記録された試料像は、３次元の試料像を形成するために結合される。したがって、試料の移動を利用して、異なる試料領域を次々と検査することもできる。この構成では、試料像の記録処理中ではなく、記録処理と記録処理の間でのみ試料の移動を実行することを提供できる。このとき、試料の移動が像質に影響を与えることはなく、複数の検出面について、互いに高さがオフセットされた状態にありながら、微小物体に対しては横方向にオフセットされていない状態の検出面を検査することができる。ただし、これに代えて、微小物体を継続的に移動する、すなわち試料の記録中にも移動することも好ましい。これにより高速の検査速度を実現でき、試料の定速移動により、干渉作用が回避される。十分に速い記録処理であれば、試料の移動が像質に不利な影響を及ぼすことはない。

微小物体が一つずつ測定領域を通って移送される方向である試料の移動方向は、検出用対物レンズが検出光を受け取って送り出す方向である検出軸に対して垂直であるか、又は傾斜している。この検出軸は、検出用対物レンズの光軸と表現することもできる。検出軸の方向における検出面の高さ調整が、焦点合わせ手段によって達成される一方で、試料の移動により、検出面と試料の間に、横断方向の相対変位が生じる。したがって、個別の各微小試料の検査で、焦点合わせ手段の同じ設定を用いて複数の試料像を記録でき、試料の移動によって、同一の微小物体の異なる領域が検査される。これらの試料画像は、この後、焦点合わせ手段の設定を変えて記録した試料像と結合することができ、これにより全体像が形成される。

下記で詳述する好ましい構成において、検出面は、物体の移動方向に対して傾斜しており、移動方向と同一平面ではない。検出面の高さ調整は、ここでも検出面と垂直に実施される。この変形例では、測定継続時間が重要である。この継続時間は、第１検出面の試料像の記録処理の開始から、焦点合わせ手段で調整された検出面の試料像の記録処理の開始までに要する期間を表し得る。微小物体が運ばれる流動速度と、測定継続時間とを互いに合わせて調整できるため、物体を基準に順次検査される２つの検出面の間の距離が、記録される試料像の被写界深度にほぼ対応するように構成できる。したがって、順次測定される検出面の間の距離は、ここでは、停止した参照点を基準に表されるのではなく、移動している物体を基準として表される。これにより、算出された全体像は、物体の移動方向にも所望の高分解能を有する。

試料像は、微小物体が測定領域内に配置されたときにのみ自動的に記録されると好ましい。このために監視測定を行うことができ、これにより、微小物体が測定領域に配置されたかどうかを判定できる。異なる検出面における複数の試料像の記録は、測定領域内に微小物体の存在が確認されたときにのみ開始される。監視測定は、光バリア又は光走査装置を用いて費用効果よく実現することができ、この光バリア又は光走査装置は、特に、測定領域の手前で測定管に取り付けることができる。これに代えて、例えば、検出用対物レンズを用いて測定領域の透過光像を記録することもできる。また、第１試料像の記録は、監視測定値として機能できるため、焦点合わせ手段の調整及び更なる試料像の記録は、像内に微小物体の1つが検出された場合にのみ実行される。

焦点合わせ光学系の調整は、原則的に任意に実行することができる。特に、油圧方式で調整可能な焦点合わせ光学系を用いることで、正確且つ迅速な変更を実現できる。

焦点合わせ光学系は、検出用対物レンズの光軸に沿って変位可能な少なくとも1つのレンズを含んでよい。極めて短時間での焦点合わせ光学系の調整は、焦点合わせ光学系が少なくとも１つの横方向に変位可能な構成要素を含み、その構成要素が自身の横方向の変位に応じて異なる屈折力を生じる場合に実現できる。これらの構成要素は、２つのプレート、特に非球面のプレートを含むことができ、これらのプレートを横方向に相対移動することで、２つのプレートの協働によって生じる屈折力を変化させることができる。この２つのプレートは、いわゆるアルバレス（Alvarez）プレートであってよい。横方向変位の方向は、検出用対物レンズの光軸を横断する方向、特に、光軸と垂直な方向である。

また、焦点合わせ光学系は、焦点調整のために形状を変更できる光学部品、例えばレンズを備えることもできる。形状の変更として、特に、光学部品の1つ以上の境界領域の曲率半径が変更されてよい。極めて迅速に焦点を変えるために、光学部品は、電気的に調整可能なレンズ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｌｅｎｓ，ＥＴＬ）であってよい。

試料槽の中で微小物体を搬送するために、搬送手段が好ましく設けられる。この手段は、例えば、ポンプであってよく、より一般的には、エネルギを消費することで、微小物体と微小物体を取り巻く試料媒体の少なくともいずれかの制御速度を調整できる手段であってよい。

試料槽自体が測定管を含むと好ましく、この測定管内で微小物体を移送できる。測定管は、管状要素又は毛細管によって形成されてもよい。微小物体は、タンクから測定管に送られるが、このタンクは、例えば、水槽、魚槽、又はマルチウェルプレートである。マルチウェルプレートは、試料を個別に収容するための複数の窪みを有する試料容器である。

好ましい実施形態において、測定管は角張った断面を有する。これにより、検出光は測定管の平坦な壁面を通過することになり、結像エラーが回避される。

代替の好ましい実施形態において、測定管は円形の断面を有する。これにより、測定管内の試料の移動が極めて均一になるため、試料の一部又は試料媒体が、角張った測定管の角部に張り付いて残ることがない。

測定管の形状の他に、測定管の材料によっても結像エラーを低減でき、連続した部品の光学設計を簡略化することができる。測定管の材料、及び測定管を通って運ばれる微小物体を内包する試料媒体の材料は、それぞれの屈折率が１５パーセント程度、好ましくは１０パーセント程度、互いに異なるように選択することができる。測定管にはＦＥＰ（フッ化エチレンプロピレン樹脂）が特に適し、試料媒体には水が特に適している。水に、宋養液又は他の物質を混合してもよい。また、屈折率ｎが１．３５であるＰＴＦＥ（ポリ四フッ化エチレン）、ｎ＝１．３４０２のフッ素重合体ＣＹＴＯＰ、ｎ＝１．３２８０〜１．３５７０のペルフルオロジオキソラン重合体、又はｎ＝１．３１３７のテフロン（登録商標）ＡＦ（Ａｍｏｒｐｈｏｕｓ Ｆｌｕｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ（非晶質フッ素樹脂））も水性試料媒体に適している。測定管にガラスを代用する場合は、屈折率が水よりも飛躍的に大きくなる。この点については、後段の光学系の設計、例えば、アナモルフィック光学系による設計で考慮する必要がある。水の代わりに、ヒドロゲル、又は、ヒドロゲルと水の混合液を試料媒体として利用することもできる。

屈折率の飛躍的増大を抑制するために、測定管と前方光学系との間に浸液を設けることができる。浸液を収容する容器が存在すると好ましく、この容器は、少なくとも検出面の領域において浸液が測定管の外殻表面を完全に取り囲み、且つ、測定処理において前方光学系が浸液と接触するように配置されることが好ましい。測定管を取り囲む浸液により、屈折数の増大を低減できるのみならず、環境条件、例えば、特定の温度に調整する、又は維持することが可能になる。

測定管は、検出用対物レンズに対して固定された状態、又は相対移動可能な状態で保持することができる。光軸の方向に沿った方向と光軸を横断する方向の少なくともいずれかの方向の平行移動を利用して、測定管を特定の方向に向けることができる。ただし、この構成においても、測定処理中、すなわち、異なる検出面で複数の試料像を記録しているあいだ、測定管の位置はそのまま維持される。

駆動手段を設けて、測定管の長手方向軸線と一致する回転軸を中心として測定管を回転させてもよい。このため、回転軸は、測定管の長手方向軸線と単に平行であるのみならず、測定管の中心に沿って延びる。測定管の壁面が回転対称である場合は、回転を行った際にも、壁面によって形成される光学境界領域は、同じ位置又は固定状態に残る。回転により、光学境界領域を変位させなくても、検出光の光路内であると考えることができ、異なる試料領域を有利に観察できる。

試料槽は上部が開口していてもよい。前方光学系は、本実施形態において、試料槽内の試料媒体の中に浸漬することができ、この試料媒体内に微小物体が配置される。これにより、光学境界領域の数が有利に低減される。ここで、試料槽は、その内部で微小物体が移動できるようにも設計される。この移動は、例えば、微小物体がゼブラフィッシュ等の生物である場合に、微小物体自体によって生じ得る。これに代えて、移動は、例えば、ポンプ、撹拌棒、又は試料槽内の温度勾配を利用した試料槽内の流れによって能動的に生成することもできる。

費用効果の高い設計でありながら、検出面の精密な調整が可能である設計のために、検出面から検出ユニットまで検出光を送る結像手段の構成要素は全て正確に一つの光軸に沿って配置される。光軸自体は、例えば、ミラーによって方向を変えることができる。ただし、２つの対物レンズ又は顕微鏡が互いに前後して配置されて、例えば、特許文献２に記載されたように、特に焦点を変化させるために、傾斜して構成されることはない。このような構成において、後方の顕微鏡の光軸は、第１の顕微鏡によって形成される中間像面に対して傾斜して構成されるため、結像手段は、一つの光軸に沿うのではなく、少なくとも２つの光軸に沿って配置される。

顕微鏡は、本発明において原則的に任意のタイプのものであってよい。例えば、共焦点フィルタリングを実行できる。この場合、照明光は、検出用対物レンズによって試料まで案内される。

ただし、光学顕微鏡は、単一面照明顕微鏡法（ＳＰＩＭ）に合わせて設計されると特に好ましい。このため、顕微鏡は、光源から照射された照明光を測定領域内に案内する検出用対物レンズとは別に照明用対物レンズを備える。照明用対物レンズは、その光軸が検出用対物レンズの光軸と垂直になるように配置される。したがって、照明光の伝搬方向が検出面内に位置できるため、検出面の上下の試料領域は全く照光されないか、又はほとんど照光されることがなく有利である。共焦点測定を用いる場合と同様に、ＳＰＩＭでも高い深さ分解能を実現できる。一方で、必要な測定継続時間は比較的短く、この点は、高い試料スループットを達成する上で有利である。

検出用対物レンズは、その光軸が測定管の長手方向軸線と垂直になるように配置することができる。これにより、測定管の望ましくない光学効果を低く抑えることができる。

ただし、代替の構成として、検出用対物レンズは、その光軸が測定管の長手方向軸線に対して９０度とは異なる角度を成す向きになるように配置されてもよい。ＳＰＩＭ測定に関して、照明用対物レンズは、検出用対物レンズと垂直になり、ひいては測定管の長手方向軸線に対して傾斜するように配置されてよい。これにより、測定管の長手方向に生じる試料の移動が検出面に対して傾斜することが保証されて有利である。したがって、試料の移動は、検出用対物レンズの高さ方向、すなわち検出用対物レンズの光軸に沿った方向成分を有する。このため、試料の移動は、検出面と試料との間の相対的な高さ調整をもたらす。

したがって、電子制御手段を用いることで、順次測定される２つの検出面の間の所望の高さ間隔は、相互に依存的に制御される焦点合わせ手段と試料の移動とによって、試料を基準に調整することができる。

例えば、電子制御手段は、２つの試料像の記録処理の間で焦点合わせ光学系を利用して、微小物体の移動方向とは逆向きに一つの方向成分を有する方向に、検出面を調整することができる。したがって、一つの微小物体について、単に試料を移動するだけで行われる場合よりも高速に複数の試料像を記録することができる。

これに代えて、又はこれに加えて、電子制御手段は、２つの試料像の記録処理の間で、焦点合わせ光学系を利用して、微小物体の移動方向に方向成分を有する方向に、検出面を調整するように適合されてもよい。これにより、例えば、微小物体の比較的高速の流れが実現すると同時に、特定の微小物体についての多数の試料像を記録することができる。

また、この変形例は、画像処理手段により第１の試料像が最初に評価され、その評価結果に応じて更に他の試料像が記録される場合に有利である。この場合、第１の試料像の送信、加工、及び評価中に実行される試料の移動は、検出面を移動する焦点合わせ手段により、少なくとも部分的に補正することができる。

原則的に、試料の移動速度は、焦点合わせ光学系によって検出面を変位させる速度よりも遅くなるように調整することもできる。例えば、検出面について、対象の試料領域がその検出面であると特定された場合は、次に、試料の移動方向、又は試料の移動と逆方向に、試料に対して変位した更に他の検出面を検査することができる。

極めて高速の試料の検査では、少なくとも一つの第２の検出用対物レンズも設けることができるため、異なる検出面を、複数の検出用対物レンズによって同時に結像させることが可能になる。複数の検出用対物レンズは、検出光を同一の検出ユニットに順次案内することも、又は、異なる検出ユニットに同時に案内することもできる。

特に、単一面照明顕微鏡法では、焦点合わせ光学系の調整中に照明光の経路を同時に変化させると有益である。これにより、照明光は、常に、各瞬間に結像される検出面に沿って進むように移動することになる。このため、走査手段を照明用対物レンズの瞳内に配置することができ、これにより、照明光が測定領域内に案内される。瞳内の配置により、走査手段の光検出方向の変化が、試料槽内の照明光の経路の変位に帰結する。

一般に、検出面は、検出用対物レンズによって検出ユニット上に結像される、試料槽内の平面であると理解することができる。例えば、共焦点測定の場合、前述の平面の異なる領域を順次検出ユニット上に結像することができる。

検出ユニットは、原則的に、いずれかの感光性測定ユニットである。検出ユニットは、特定の時点において検出面を測定することができるように、少なくとも一つの２次元カメラセンサを含むと好ましい。

測定領域は検出面と同一であってよい。これは、例えば、検出面が精度よく照光されるＳＰＩＭを用いる場合に当てはまる。検出面の上又は下の領域も照光される場合、測定領域は、照光されて検出光を放射できる、試料槽内の領域であると理解することもでき、放射された検出光は、検出用対物レンズを介して検出ユニットに到達できる。

光源の照明光は、原則的に任意タイプ、特に、広帯域のタイプ、又は一つ以上狭波長域に限定されるタイプであってよい。また、光源は、原則的に、任意の構造であってよく、例えば、一つ以上のレーザを含むことができる。

検出光は、照明光を試料に照射した結果として試料から到来する光であると理解される。したがって、検出光は、蛍光若しくは他の冷光、又は、散乱、反射、若しくは回折された照明光であってよい。

本発明に関連する技術は、複数の微小物体（２２）を検査する光学顕微鏡であって、 測定領域を照光する光源と、内部で微小物体（２２）が順次測定領域内に移動できる試料槽（２０）と、測定領域内に配置された微小物体（２２）から到来する検出光（５）を測定する結像手段（１０）及び検出ユニット（３０）と、を含み、結像手段（１０）は、固定式前方光学系（１１）と、可動式焦点合わせ光学系（１２）とを含み、焦点合わせ光学系（１２）は、前方光学系（１１）の背後で中間像面の正面に配置されて、検出面（１５，１６）の高さ調整のための調整が可能である。

望ましくは、試料槽（２０）から前方光学系（１１）までの全ての光学境界領域は、異なる微小物体（２２）及び異なる検出面（１５，１６）の連続した測定処理中、定置されている。

望ましくは、焦点合わせ光学系（１２）は、横方向の変位に対応して異なる屈折力を生成する、少なくとも一つの横方向に変位可能性な構成要素を有する。

望ましくは、焦点合わせ光学系（１２）は、焦点調整のために形状を変更できる光学部品を備える。

望ましくは、試料槽（２０）は、測定管（２０）を含み、測定管（２０）の中で微小物体（２２）を搬送する搬送手段が設けられる。

望ましくは、測定管（２０）の材料と、測定管（２０）の中で移送される微小物体（２２）を内包する試料媒体の材料とが、各材料の屈折率が約１０％、互いにずれるように選択される。

望ましくは、浸液を収容する容器が設けられ、前記容器は、少なくとも検出面（１５，１６）の領域において、浸液が測定管（２０）の外殻表面を完全に包み込み、且つ、測定処理において、前方光学系（１１）が浸液と接触するように配置される。

望ましくは、試料槽（２０）は、上部において開口し、前方光学系（１１）は、試料槽（２０）内に配置された試料媒体内に沈められ、前記試料媒体内に微小物体（２２）が配置される。

望ましくは、照明光（４）を測定領域内に案内する照明用対物レンズ（３）が配設され、照明用対物レンズ（３）は、自身の光軸が検出用対物レンズ（１０）の光軸と直交するように位置決めされる。

望ましくは、検出用対物レンズ（１０）は、自身の光軸が測定管（２０）の長手方向軸線に対して９０°以外の角度を成すように配置される。

望ましくは、電子制御手段が設けられ、前記電子制御手段は、２回の試料像記録処理の間で、焦点合わせ光学系（１２）を利用して、微小物体（２２）の移動方向に沿った方向成分を有する方向で検出面（１５，１６）を調整するように構成される。

望ましくは、第２の検出用対物レンズが設けられ、前記第２の検出用対物レンズは、自身を含む２つの検出用対物レンズによって２つの異なる検出面を同時に結像できるように配置される。

また、本発明に関連する技術は、測定領域が照光され、試料槽（２０）内で、微小物体（２２）が順次前記測定領域内に移送され、前記測定領域内に配置された微小物体（２２）から到来する検出光が、結像手段（１０）及び検出ユニット（３０）を用いて測定される、複数の微小物体（２２）を検査する顕微鏡使用法であって、複数の試料画像が、検出ユニット（３０）によって順次、異なる検出面（１５，１６）で記録され、検出面（１５，１６）は、検出用対物レンズ（１０）の固定式前方光学系（１１）の背後で中間像面の正面に配置される可動式焦点合わせ光学系（１２）を用いて調整される。

望ましくは、複数の試料像が順次記録され、微小物体（２２）が、少なくとも異なる試料像の記録処理の間で移動され、前記記録された試料像が結合されて３次元試料像を形成する。

望ましくは、第１検出面（１５）の試料像の記録の開始から、焦点合わせ手段で調整された検出面（１６）の試料像の記録の開始までの測定継続時間と、微小物体（２２）が搬送される流れ速度とが互いに応じて調整されて、順次検査される２つの検出面（１５）の間の物体（２２）を基準とした距離が、記録された試料像の被写界深度に実質的に対応するように構成される。

望ましくは、監視用測定を実行して、微小物体（２２）が前記測定領域内に配置されたかどうかを判定し、異なる検出面（１５，１６）における複数の試料像の記録が、前記測定領域内で微小物体（２２）の存在が確認された場合にのみ開始されるようにする。

本発明の更に他の特徴及び利点について、付属の模式図を参照して下記で説明する。

本発明に係る光学顕微鏡の例示的実施形態を示す図である。 本発明に係る光学顕微鏡の更に他の例示的実施形態を示す切取図である。

同一の部品及び同一の作用を有する部品は、図面において、概して同一の参照番号が付与されている。

図１に、本発明に係る光学顕微鏡１００の第１の例示的実施形態を模式的に示す。光学顕微鏡１００は、主要な構成要素として、検出用対物レンズ１０と、検査対象である微小物体２２を配置できる試料槽２０とを含む。

図示した例の微小物体２２は、ゼブラフィッシュ２２である。これらは、水性試料媒体内に配置され、水性試料媒体は、不定の気泡及びその気泡によって引き起こされる結像効果を防ぐために、試料槽２０内を完全に満たすように充填される。

試料槽２０は、測定管２０として形成される。測定管２０は、タンク１と排出系２とを接続する。測定管２０には、タンク１から微小物体が供給される。測定管２０の中で試料媒体、ひいてはゼブラフィッシュ２２を搬送するためにポンプを設けることができる。ただし、これに代えて、ゼブラフィッシュ２２は、測定管２０内を自力で移動することもできる。排出系２は、タンク１までの循環路を形成できる。

試料２２は測定管２０内の測定領域を通って順次移動するため、高スループットで試料２２を検査することができる。図示した状況において、測定領域は、検出面１５によって形成され、この検出面１５が検出用対物レンズ１０を検出ユニット３０上に結像させる。照光された試料２２から到来する検出光には、図において参照番号５が付与されている。

光源（図示せず）が、測定領域ひいては検出面を照光する。光学顕微鏡１００は、単一面照明顕微鏡法に合わせて設計されることが好ましい。このため、照明光は、横断方向において、特に検出用対物レンズ１０の光軸と垂直に試料２２まで案内される。図１において、検出用対物レンズ１０の光軸は、垂直方向に延び、照明光の伝搬方向は、用紙の平面に向かって又は用紙の平面から外に向かって延びる。したがって、基本的に検出面１５のみが照光される。

光軸の方向に互いにオフセットされた異なる検出面１５，１６を検査するためには、従来の顕微鏡法では、ほとんどの場合に試料槽２０と対物レンズ１０の間の距離６を変化させている。ただし、この場合に移動される質量は大きいため、この処理にはかなりの時間がかかる。また、距離６の変化は、光学設計に好ましくない作用をもたらす。例えば、対物レンズの後段に設けられる拡大縮小光学系の調整にも比較的時間がかかる。

これに対し本発明では、焦点合わせ光学系１２によって検出ユニット３０上に結像される検出面１５又は１６の高速の調整が実現する。この焦点合わせ光学系１２は、対物レンズ１０内で、対物レンズ１０の前方光学系１１の後段に配置される。この配置により、焦点合わせ光学系１２の移動が、光学境界領域、及び試料槽２０と対物レンズ１０との間の距離に影響を及ぼすことがなくなる。

また、焦点合わせ光学系１２は、対物レンズ１０によって検出面１５又は１６の像が結像される中間像面の前方又は正面に配置される。これにより、中間像面から検出ユニット３０までの光路は、検出面１５又は１６のいずれを選択するのかに依存しなくなる、すなわち、検出面１５又は１６のいずれを結像させるのかに応じて中間像面と検出ユニット３０との間で光学要素を移動させる必要がない。したがって、簡単で費用効果の高い顕微鏡構成が実現する。これは、焦点合わせ光学系１２を利用することによって、試料２２から第１の中間像面までの光路の一部しか影響を受けないことに関連がある。

焦点合わせ光学系１２を利用して、極めて迅速な検出面の高さ変更を設定することができる。このため、焦点合わせ光学系１２は、アルバレスプレートを好ましく含むことができる。

測定管２０は、異なる検出面１５，１６の複数回の連続した測定中に固定状態に維持される。ただし、測定管２０は、測定の前又は後で、３つの空間方向２９に移動されても、又は測定管２０の長手方軸線を中心として矢印２８の方向に回転されてもよい。

微小物体２２が検出面１５，１６を通って実際に移送されたときに、異なる検出面１５，１６において試料像のみが記録されるように、監視測定を実行することができる。この監視測定は、図示した例において、光バリア１８を用いて実行され、検出用対物レンズ１０は原則的にこの監視測定にも利用することができる。

顕微鏡１００が単一面照明顕微鏡法に合わせて設計されている場合は、特に高速の試料の検査が可能である。微小物体２２の移動方向、すなわち、測定管２０の長手方向は、図１の場合と同様に検出面１５，１６と平行に位置できる。

ただし、特に好ましい代替例では、測定管２０の長手方向軸線に対して傾斜して位置する検出面が検査される。これに応じて設計される、本発明に係る光学顕微鏡１００の実施形態を、図２に切取図で示した。

図には、測定管２０内の測定領域内に照明光４を案内する照明用対物レンズ３と共に、検出光５を測定領域から先に送る検出用対物レンズ１０が示されている。

２つの対物レンズ３及び４の光軸は互いに直交すると共に、いずれも測定管２０の長手方向軸線に対して傾斜している。検出面の調整装置は、測定管２０の長手方向に、焦点合わせ光学系１２を通る方向成分を有する。瞬間的に結像される検出面１５又は１６と、微小物体２２との間の、該当する各検出面１５，１６に垂直な方向成分を有する方向における相対的変位は、焦点合わせ手段１２と、測定管２０内の試料の移動の両方によって実現する。このような２種類の調整可能性は、試料の検査に極めて高い柔軟性を提供し、この柔軟性は、特に、検査速度を向上させることに利用できる。

このように、本発明に係る光学顕微鏡１００は、特に高いスループットで試料２２を検査できる可能性を提供する。ここで、同一の試料２２において、高さ方向に互いにオフセットされた複数の面１５，１６を記録することによって３次元の試料像が特定される。

１ タンク、２ 排出系、３ 照明用対物レンズ、４ 照明光、５ 検出光、１０ 検出用対物レンズ、１１ 前方光学系、１２ 焦点合わせ光学系、１５ 検出面、１６ 更に他の検出面、１８ 光バリア、２０ 試料槽，測定管、２２ 微小物体，試料、２８ 測定管２０の変位についての空間方向、２９ 測定管２０の回転方向、３０ 検出ユニット、１００ 光学顕微鏡。

Claims (14)

1. 複数の微小物体（２２）を検査する光学顕微鏡であって、
   測定領域を照光する光源と、
   内部で前記微小物体（２２）が順次測定領域内に移動できる試料槽（２０）と、
   前記測定領域内に配置された前記微小物体（２２）から到来する検出光（５）を測定する結像手段（１０）及び検出ユニット（３０）と、を含み、
   前記結像手段（１０）は、固定式前方光学系（１１）と、可動式焦点合わせ光学系（１２）とを含み、前記可動式焦点合わせ光学系（１２）は、前記固定式前方光学系（１１）と前記検出ユニット（３０）との間に配置されて、前記固定式前方光学系（１１）から見て前記検出ユニット（３０）側とは反対側にある検出面（１５，１６）の高さ調整のための調整が可能であり、
   前記試料槽（２０）は、測定管（２０）を含み、
   前記光学顕微鏡には浸液を収容する容器が設けられ、前記容器は、少なくとも前記検出面（１５，１６）の領域において、前記浸液が前記測定管（２０）の外殻表面を包み込み、且つ、測定処理において、前記固定式前方光学系（１１）が前記浸液と接触するように配置されている、光学顕微鏡。
2. 前記試料槽（２０）から前記固定式前方光学系（１１）までの光学境界面は、異なる前記微小物体（２２）及び異なる前記検出面（１５，１６）の連続した測定処理中、定置されており、
   前記光学境界面は、試料媒体と前記試料槽（２０）との間の光学的な境界面と、前記試料槽（２０）と前記浸液との間の光学的な境界面と、前記浸液と前記固定式前方光学系（１１）との間の光学的な境界面とを含む、請求項１に記載の光学顕微鏡。
3. 前記可動式焦点合わせ光学系（１２）は、横方向の変位に対応して異なる屈折力を生成する、少なくとも一つの横方向に変位可能性な構成要素を有する、請求項１または請求項２に記載の光学顕微鏡。
4. 前記可動式焦点合わせ光学系（１２）は、焦点調整のために形状を変更できる光学部品を備える、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の光学顕微鏡。
5. 前記測定管（２０）の中で前記微小物体（２２）を搬送する搬送手段が設けられる、請求項１に記載の光学顕微鏡。
6. 前記測定管（２０）の材料と、前記測定管（２０）の中で移送される前記微小物体（２２）を内包する試料媒体の材料とが、各材料の屈折率が最大で１０％、互いにずれるように選択される、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の光学顕微鏡。
7. 照明光（４）を測定領域内に案内する照明用対物レンズ（３）が配設され、前記照明用対物レンズ（３）は、自身の光軸が検出用対物レンズ（１０）の光軸と直交するように位置決めされる、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の光学顕微鏡。
8. 検出用対物レンズ（１０）が、自身の光軸が前記測定管（２０）の長手方向軸線に対して９０°以外の角度を成すように配置される、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の光学顕微鏡。
9. 電子制御手段が設けられ、前記電子制御手段は、２回の試料像記録処理の間で、前記可動式焦点合わせ光学系（１２）を利用して、前記微小物体（２２）の移動方向に沿った方向成分を有する方向で前記検出面（１５，１６）を調整するように構成される、請求項８に記載の光学顕微鏡。
10. 第２の検出用対物レンズが設けられ、前記第２の検出用対物レンズは、自身を含む２つの検出用対物レンズによって２つの異なる検出面を同時に結像できるように配置される、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の光学顕微鏡。
11. 測定領域が照光され、
    試料槽（２０）内で、微小物体（２２）が順次前記測定領域内に移送され、
    前記測定領域内に配置された前記微小物体（２２）から到来する検出光が、結像手段（１０）及び検出ユニット（３０）を用いて測定される、複数の前記微小物体（２２）を検査する顕微鏡使用法であって、
    複数の試料画像が、前記検出ユニット（３０）によって順次、異なる検出面（１５，１６）で記録され、
    前記検出面（１５，１６）は、検出用対物レンズ（１０）における可動式焦点合わせ光学系（１２）であって、前記検出ユニット（３０）と、検出用対物レンズ（１１）における固定式前方光学系（１１）との間に配置された可動式焦点合わせ光学系（１２）を用いて調整され、
    前記検出面（１５，１６）は、前記固定式前方光学系（１１）から見て前記検出ユニット（３０）側とは反対側にあり、
    前記試料槽（２０）は、測定管（２０）を含み、
    前記光学顕微鏡には浸液を収容する容器が設けられ、前記容器は、少なくとも前記検出面（１５，１６）の領域において、前記浸液が前記測定管（２０）の外殻表面を包み込み、且つ、測定処理において、前記固定式前方光学系（１１）が前記浸液と接触するように配置されている、顕微鏡使用法。
12. 複数の試料像が順次記録され、
    前記微小物体（２２）が、少なくとも異なる試料像の記録処理の間で移動され、
    前記記録された試料像が結合されて３次元試料像を形成する、請求項１１に記載の顕微鏡使用法。
13. 第１検出面（１５）の試料像の記録の開始から、前記可動式焦点合わせ光学系（１２）で調整された前記検出面（１６）の試料像の記録の開始までの測定継続時間と、前記微小物体（２２）が搬送される流れ速度とが互いに応じて調整されて、順次検査される２つの前記検出面（１５）の間の前記微小物体（２２）を基準とした距離が、記録された試料像の被写界深度に実質的に対応するように構成される、請求項１１または請求項１２に記載の顕微鏡使用法。
14. 監視用測定を実行して、前記微小物体（２２）が前記測定領域内に配置されたかどうかを判定し、異なる前記検出面（１５，１６）における複数の試料像の記録が、前記測定領域内で前記微小物体（２２）の存在が確認された場合にのみ開始されるようにする、請求項１１から請求項１３のいずれか１項に記載の顕微鏡使用法。