WO2015078633A1

WO2015078633A1 - Lichtmikroskop mit innenfokussierendem objektiv und mikroskopieverfahren zum untersuchen mehrerer mikroskopischer objekte

Info

Publication number: WO2015078633A1
Application number: PCT/EP2014/072090
Authority: WO
Inventors: Helmut Lippert; Jörg SIEBENMORGEN; Jan Huisken; Florian Fahrbach
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy Gmbh; MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
Priority date: 2013-11-27
Filing date: 2014-10-15
Publication date: 2015-06-04
Also published as: US10634888B2; US20170160529A1; EP3074808A1; US10422983B2; JP2017501441A; JP6774874B2; US20190384046A1; DE102013019951A1; JP2021006927A; DE102013019951B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Lichtmikroskop zum Untersuchen mikroskopischer Objekte mit hohem Durchsatz. Das Mikroskop umfasst eine Lichtquelle zum Beleuchten eines Messbereichs, ein Probengefäß, in dem die mikroskopischen Objekte nacheinander in den Messbereich bewegbar sind, sowie Abbildungsmittel und eine Detektionseinrichtung zum Messen von Detektionslicht, das von einem in dem Messbereich befindlichen mikroskopischen Objekt kommt. Das Mikroskop ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass die Abbildungsmittel ein Detektionsobjektiv mit ortsfester Frontoptik und bewegbarer Fokussieroptik umfassen, wobei die Fokussieroptik hinter der Frontoptik und vor einer Zwischenbildebene angeordnet ist und zur Höhenverstellung einer Detektionsebene verstellbar ist. Die Erfindung betrifft zudem ein entsprechendes Mikroskopieverfahren.

Description

LICHTMIKROSKOP MIT INNENFOKUSSIERENDEM OBJEKTIV UND MIKROSKOPIEVERFAHREN ZUM UNTERSUCHEN MEHRERER MIKROSKOPISCHER OBJEKTE

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Lichtmikroskop zum Untersuchen mehrerer mikroskopischer Objekte nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 sowie auf ein Mikroskopieverfahren zum Untersuchen mehrerer mikroskopischer Objekte nach dem Oberbegriff des Anspruchs 13.

Ein grundlegendes Einsatzgebiet von Lichtmikroskopen kann in einer möglichst schnellen Untersuchung einer Vielzahl von Proben gesehen werden. Hierfür ausgelegte Mikroskope werden auch als Hochdurchsatz- oder Hlgh-Throughput- Mikroskope bezeichnet. Die untersuchten Proben, die auch als mikroskopische Objekte bezeichnet werden, können beispielsweise biologische Organismen umfassen. Oftmals werden die Objekte in einem Trägermedium, beispielsweise einem wässrigen Medium oder einem Gel, befördert.

Um große Probenmengen zu bewältigen, umfasst ein gattungsgemäßes Lichtmikro- skop eine Lichtquelle zum Beleuchten eines Messbereichs, ein Probengefäß, in dem die mikroskopischen Objekte nacheinander in den Messbereich bewegbar sind, sowie Abbildungsmittel und eine Detektionseinrichtung zum Messen von Detektions- licht, das von einem in dem Messbereich befindlichen mikroskopischen Objekt kommt. Ein entsprechendes gattungsgemäßes Mikroskopieverfahren zum Untersuchen mehrerer mikroskopischer Objekte umfasst zumindest die Schritte, dass ein Messbereich beleuchtet wird, dass in einem Probengefäß die mikroskopischen Objekte nacheinander in den Messbereich bewegt werden, und dass mit Abbildungsmitteln und ei- ner Detektionseinrichtung Detektionslicht gemessen wird, das von einem im Messbereich befindlichen mikroskopischen Objekt kommt.

Auch bei Mikroskopen und Mikroskopieverfahren, die für eine möglichst hohe Geschwindigkeit ausgelegt sind, ist es bei guter Bildqualität erstrebenswert, die erreich- bare Geschwindigkeit weiter zu erhöhen. Dabei soll ein kostengünstiger Mikroskopaufbau ermöglicht sein.

Ein gattungsgemäßes Mikroskop ist in US 8,228,499 B2 beschrieben. Hier werden in einem Gel aufgenommene Proben nacheinander in den Messbereich geführt. Das Positionieren der Probe erfordert dabei jedoch verhältnismäßig viel Zeit. Ein weiteres gattungsgemäßes Mikroskop ist in WO 2010/012980 A1 beschrieben. Hier ist zwar keine verhältnismäßig zeitaufwendige Probenpositionierung erforderlich. Dafür ist der apparative Aufbau, welcher drei hintereinander angeordnete Mikroskope umfasst, unerwünscht hoch. Eine kostengünstige Untersuchung einer großen Probenanzahl ist daher mit diesem Mikroskop ebenfalls nicht möglich. Als eine A u f g a b e der Erfindung kann angesehen werden, ein Lichtmikroskop und ein Mikroskopieverfahren bereitzustellen, welche eine möglichst schnelle und kostengünstige Untersuchung einer großen Probenanzahl ermöglichen.

Diese Aufgabe wird durch das Lichtmikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 13 gelöst. Vorteilhafte Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden außerdem in der folgenden Beschreibung erläutert.

Bei dem Lichtmikroskop der oben genannten Art umfassen erfindungsgemäß die Abbildungsmittel ein Detektionsobjektiv mit ortsfester Frontoptik und bewegbarer Fo- kussieroptik, wobei die Fokussieroptik hinter der Frontoptik und vor einer Zwischenbildebene angeordnet ist und zur Höhenverstellung einer Detektionsebene verstellbar ist.

Bei dem Verfahren der oben genannten Art werden erfindungsgemäß mit der Detektionseinrichtung nacheinander mehrere Probenbilder zu unterschiedlichen Detekti- onsebenen aufgenommen, die mit einer bewegbaren Fokussieroptik eingestellt wer- den, welche hinter einer ortsfesten Frontoptik des Detektionsobjektivs und vor einer Zwischenbildebene angeordnet ist.

Als ein erster Kerngedanke der Erfindung kann erachtet werden, zur Höhenverstellung der Detektionsebene, welche scharf auf die Detektionseinrichtung abgebildet wird, eine Probenverschiebung überflüssig zu machen. Eine Bewegung des Probengefäßes ist wegen der verhältnismäßig hohen zu bewegenden Massen zeitaufwän- dig. Hingegen sind bei den Fokussiermitteln die zu bewegenden Massen gering, so dass eine besonders hohe Geschwindigkeit möglich wird.

Eine weitere grundlegende Idee kann in der Anordnung und Gestaltung der Fokus- siermittel als Innenfokussierung gesehen werden. So befinden sich die Fokussiermittel im Strahlengang hinter einer ortsfesten Frontoptik. Dadurch kommt es zu keinen Beeinflussungen oder Bewegungen der Probe oder eines angrenzenden Mediums, wenn die Fokussiermittel verstellt werden. Zudem sind die Fokussiermittel vor einer Zwischenbildebene angeordnet. Diese bezeichnet die im Strahlengang des Detekti- onslichts erste Ebene, die zur Detektionsebene optisch konjugiert ist. In diese Zwischenbildebene wird die Detektionsebene mit den Abbildungsmitteln abgebildet. Durch diese vordere Anordnung der Fokussiermittel kann mit einer verhältnismäßig geringen Anzahl optischer Komponenten eine Probenuntersuchung erfolgen. Insbesondere sind keine weiteren Objektive oder Mikroskope im Strahlengang hinter dem Detektionsobjektiv zur Höhenänderung der abgebildeten Detektionsebene erforderlich. So werden im Vergleich zu beispielsweise dem Mikroskop aus WO 2010/012980 die apparativen Kosten erheblich gesenkt.

Es können sämtliche optische Grenzflächen ab dem Probengefäß bis zur Frontoptik während aufeinanderfolgenden Messungen unterschiedlicher mikroskopischer Ob- jekte sowie unterschiedlicher Detektionsebenen ortsfest sein. Diese Eigenschaften sind von hoher Bedeutung, um große Probenmengen mit geringen Einstellzeiten untersuchen zu können. Indem bei einer Probenbewegung ein die Probe umgebendes Probenmedium, beispielsweise Wasser, durchgängig in Kontakt mit dem Probengefäß bleibt, verschiebt sich keine optische Grenzfläche, wenn nacheinander unter- schiedliche mikroskopische Objekte gemessen werden. Die optischen Grenzflächen können insbesondere eine Grenzfläche vom Probenmedium zum Probengefäß, eine Grenzfläche vom Probengefäß zu einer Probengefäßumgebung und eine Grenzflä- che von der Probengefäßumgebung zur Frontoptik umfassen. Weitere Grenzflächen können abhängig von der Gestaltung der Probengefäßumgebung vorhanden sein. Als wesentlicher Vorteil können all diese optischen Grenzflächen ortsfest bleiben, wenn unterschiedliche Detektionsebenen nacheinander auf die Detektionseinrichtung abgebildet und gemessen werden.

Durch die Erfindung wird ermöglicht, dass zwischen zumindest einigen der Aufnahmen der Probenbilder über eine Verstellung der Fokussiermittel die Detektionsebene in Richtung einer optischen Achse des Detektionsobjektivs verschoben wird. Die hierbei aufgenommenen Probenbilder können sodann zu einem dreidimensionalen Probenbild zusammengefügt werden. Für die Aufnahme der Probenbilder zu verschiedenen Detektionsebenen kann das untersuchte Objekt ruhen. Erst nach Ab- schluss dieser Aufnahmen wird das Objekt aus dem Messbereich hinaus und ein nächstes Objekt in den Messbereich hinein bewegt. Dieses Vorgehen ist besonders bevorzugt, wenn eine Bewegungsrichtung der Objekte komplanar mit den Detekti- onsebenen ist.

Alternativ können nacheinander mehrere Probenbilder aufgenommen werden, wobei zumindest zwischen Aufnahmen verschiedener Probenbilder die mikroskopischen Objekte bewegt werden, und die aufgenommenen Probenbilder werden zu einem dreidimensionalen Probenbild zusammengefügt. Somit kann auch die Probenbewe- gung genutzt werden, um verschiedene Probenbereiche nacheinander zu untersuchen. Bei dieser Ausführung kann vorgesehen sein, eine Probenbewegung ausschließlich zwischen, nicht aber während, Aufnahmen von Probenbildern durchzuführen. Dadurch beeinflusst die Probenbewegung nicht die Bildqualität und es können mehrere Detektionsebenen untersucht werden, die zueinander höhenversetzt sind, aber keinen Lateralversatz relativ zum mikroskopischen Objekt aufweisen. Alternativ ist es aber auch bevorzugt, die mikroskopischen Objekte kontinuierlich zu bewegen, also auch während einer Probenbildaufnahme. Dadurch kann eine hohe Untersuchungsgeschwindigkeit erreicht werden, wobei durch die gleichbleibende Bewegungsgeschwindigkeit der Proben Störeinflüsse vermieden werden. Bei einer genü- gend schnellen Aufnahme wirkt sich die Probenbewegung nicht nachteilig auf die

Bildqualität aus. Die Richtung der Probenbewegung, mit welcher die mikroskopischen Objekte nacheinander durch den Messbereich bewegt werden, steht senkrecht oder schräg zu einer Detektionsachse, entlang welcher das Detektionsobjektiv Detektionslicht aufnimmt und weiterleitet. Diese Detektionsachse kann auch als optische Achse des Detektionsobjektivs bezeichnet werden. Während durch die Fokussiermittel eine Höhenverstellung der Detektionsebene in Richtung der Detektionsachse erfolgt, bewirkt die Probenbewegung eine hierzu quere Relativverschiebung zwischen der Detektionsebene und der Probe. Für die Untersuchung jeder einzelnen mikroskopischen Probe können daher auch mehrere Probenbilder mit gleicher Einstellung der Fokus- siermittel aufgenommen werden, wobei durch die Probenbewegung verschiedene Bereiche desselben mikroskopischen Objekts untersucht werden. Diese Probenbilder können sodann mit den Probenbildern, für deren Aufnahme eine Einstellung der Fokussiermittel geändert wurde, zu einem Gesamtbild zusammengefügt werden.

Bei einer bevorzugten, im Späteren näher beschriebenen Ausführung Ist die Detekti- onsebene schräg, also nicht komplanar, zur Bewegungsrichtung der Objekte ausgerichtet. Eine Höhenverstellung der Detektionsebene erfolgt auch hier senkrecht zur Detektionsebene. Bei dieser Variante ist eine Messabstandsdauer bedeutsam. Diese kann die Zeitdauer bezeichnen, die ab einem Beginn einer Probenbildaufnahme einer ersten Detektionsebene bis zu einem Beginn einer Probenbildaufnahme einer mit den Fokussiermitteln verstellten Detektionsebene benötigt wird. Eine Fließgeschwindigkeit, mit welcher die mikroskopischen Objekte befördert werden, und die Messabstandsdauer können nun so aufeinander abgestimmt sein, dass der Abstand zwischen zwei nacheinander untersuchten Detektionsebenen relativ zum Objekt höchstens der Schärfentiefe der aufgenommenen Probenbilder entspricht. Der Abstand zwischen den nacheinander gemessenen Detektionsebenen wird hier also nicht relativ zu einem ruhenden Bezugspunkt, sondern relativ zum bewegenden Objekt ausgedrückt. Ein berechnetes Gesamtbild weist dadurch auch in Bewegungsrichtung der Objekte eine gewünscht hohe Auflösung auf.

Vorzugsweise sollen Probenbilder nur dann automatisch aufgenommen werden, wenn sich auch ein mikroskopisches Objekt im Messbereich befindet. Dazu kann eine Überwachungsmessung durchgeführt werden, mit welcher ermittelt wird, ob sich ein mikroskopisches Objekt im Messbereich befindet. Eine Aufnahme mehrerer Probenbilder zu verschiedenen Detektionsebenen wird nur dann gestartet, wenn die Anwesenheit eines mikroskopischen Objekts im Messbereich festgestellt worden ist. Die Überwachungsmessung kann kostengünstig mit einer Lichtschranke oder einem Lichttaster erfolgen, der insbesondere am Messrohr vorm Messbereich angeordnet sein kann. Alternativ kann auch ein Durchlichtbild des Messbereichs aufgenommen werden, beispielsweise mit dem Detektionsobjektiv. Zudem kann auch die Aufnahme eines ersten Probenbilds als Überwachungsmessung dienen, so dass eine Verstellung der Fokussiermittel und eine weitere Probenbildaufnahme nur erfolgen, wenn eines der mikroskopischen Objekte im Bild erkannt wird.

Eine Verstellung der Fokussieroptik kann in prinzipiell beliebiger Weise erfolgen. Präzise und schnelle Änderungen sind insbesondere bei hydraulisch verstellbaren Fokussieroptiken möglich.

Die Fokussieroptik kann mindestens eine entlang der optischen Achse des Detekti- onsobjektivs verschiebbare Linse umfassen. Besonders kurze Verstellzeiten der Fokussieroptik können erreicht werden, wenn die Fokussieroptik mindestens eine late- ral verschiebbare Komponente aufweist, welche abhängig von ihrer lateralen Verschiebung unterschiedliche Brechkräfte bewirkt. Diese Komponenten können zwei, insbesondere asphärische, Platten umfassen, die zur Änderung ihrer gemeinsam bewirkten Brechkraft lateral zueinander verschiebbar sind. Hierbei kann es sich um sogenannte Alvarez-Platten handeln. Die Richtung einer lateralen Verschiebung steht quer, insbesondere senkrecht, zur optischen Achse des Detektionsobjektivs.

Weiterhin kann die Fokussieroptik auch eine Optikkomponente aufweisen, beispielsweise eine Linse, deren Form für eine Fokusverstellung änderbar ist. Als Formänderung kann insbesondere ein Krümmungsradius von einer oder mehreren Grenzflächen der Optikkomponente verändert werden. Für besonders schnelle Fokusände- rungen kann es sich bei der Optikkomponente um eine elektrisch einstellbare Linse (ETL, electrically tunable lens) handeln.

Zum Befördern der mikroskopischen Objekte durch das Probengefäß sind bevorzugt Beförderungsmittel vorhanden. Bei diesen kann es sich beispielsweise um eine Pumpe handeln, oder allgemeiner um ein Mittel, mit dem unter Energieverbrauch eine kontrollierte Geschwindigkeit der mikroskopischen Objekte und/oder eines diese umgebenden Probenmediums eingestellt werden kann. Das Probengefäß selbst umfasst vorzugsweise ein Messrohr, durch welches die mikroskopischen Objekte transportierbar sind. Das Messrohr kann auch durch einen Schlauch oder eine Kapillare gebildet sein. Die mikroskopischen Objekte werden dem Messrohr von einem Reservoir zugeführt, welches beispielsweise ein Aquarium, ein Fischtank oder eine Multiwell-Platte sein kann. Eine Multiwell-Platte bezeichnet einen Probenhalter mit mehreren Vertiefungen zur separaten Probenaufnahme.

Bei einer bevorzugten Ausgestaltung ist das Messrohr im Querschnitt eckig. Hiermit durchläuft Detektionslicht eine ebene Wand des Messrohrs, womit Abbildungsfehler vermieden werden. Bei einer alternativen bevorzugten Ausführung hat das Messrohr einen runden Querschnitt. Damit wird eine besonders gleichmäßige Probenbewegung durch das Messrohr erreicht, ohne dass Teile der Probe oder des Probenmediums an Eckbereichen eines eckigen Messrohrs haften bleiben.

Außer durch die Form des Messrohrs können auch durch dessen Material Abbil- dungsfehler reduziert und das Optikdesign der darauf folgenden Komponenten vereinfacht werden. So können das Material des Messrohrs und ein Probenmedium, in dem die mikroskopischen Objekte durch das Messrohr transportiert werden, so gewählt sind, dass ihre Brechungsindizes um höchstens 15%, bevorzugt höchstens 10%, voneinander abweichen. Besonders geeignet sind für das Messrohr FEP (Fluorethylenpropylen) und als Probenmedium Wasser, wobei dem Wasser auch eine Nährflüssigkeit oder andere Substanzen zugesetzt sein können. Zu einem wäss- rigen Probenmedium eignen sich auch PTFE (Polytetrafluorethylen) mit einem Brechungsindex n von 1 ,35, das Fluorpolymer Cytop mit n = 1 ,3402, perfluorodioxolane Polymere mit n = 1 ,3280 bis 1 ,3570 oder Teflon AF (amorphes Fluoroplastik) mit n = 1 ,3137. Wird stattdessen Glas für das Messrohr verwendet, liegt ein Brechungsindexsprung zu Wasser vor, welcher bei der Auslegung des darauf folgenden optischen Systems zu berücksichtigen ist, zum Beispiel durch eine anamorphotische Optik. Anstelle von Wasser kann als Probenmedium auch ein Hydrogel oder ein Gemisch aus einem Hydrogel und Wasser eingesetzt werden. Um Sprünge im Brechungsindex zu reduzieren, kann zwischen dem Messrohr und der Frontoptik eine Immersionsflüssigkeit angeordnet werden. Vorzugsweise ist ein Behälter zur Aufnahme einer Immersionsflüssigkeit vorhanden und so angeordnet, dass die Immersionsflüssigkeit zumindest im Bereich der Detektionsebene eine Mantelfläche des Messrohrs vollständig umgibt und dass in einem Messbetrieb die Frontoptik mit der Immersionsflüssigkeit in Kontakt ist. Indem die Immersionsflüssigkeit das Messrohr umgibt, kann sie nicht nur dazu dienen, Brechzahlsprünge zu reduzie- ren, sondern auch Umgebungsbedingungen einzustellen oder konstant zu halten, etwa eine bestimmte Temperatur.

Das Messrohr kann entweder starr oder beweglich bezüglich des Detektionsobjektivs gehalten sein. Translatorische Verschiebungen des Messrohrs in Richtung der optischen Achse und/oder quer dazu können zum Ausrichten des Messrohrs genutzt werden. Während dem Messbetrieb, das heißt der Aufnahme mehrerer Probenbilder zu verschiedenen Detektionsebenen, bleibt die Position des Messrohrs jedoch auch bei dieser Ausführung unverändert.

Es können auch Antriebsmittel zum Drehen des Messrohrs um eine Drehachse vorhanden sein, die mit einer Längsachse des Messrohrs übereinstimmt. Die Drehachse verläuft also mittig entlang dem Messrohr und nicht bloß parallel zu dessen Längsachse. Ist die Wand des Messrohrs rotationssymmetrisch, so bleibt auch bei einer Drehung eine durch die Wand gebildete optische Grenzfläche ortsgleich oder ortsfest. Durch eine Drehung können vorteilhafterweise verschiedene Probenbereiche beobachtet werden, ohne dass sich optische Grenzflächen verschieben und dies im Strahlengang des Detektionslichts berücksichtigt werden müsste.

Das Probengefäß kann auch nach oben geöffnet sein. Die Frontoptik kann bei dieser Ausführung in ein im Probengefäß befindliches Probenmedium, in welchem sich die mikroskopischen Objekte befinden, eingetaucht sein. Vorteilhafterweise wird hierdurch die Anzahl optischer Grenzflächen reduziert. Das Probengefäß ist auch hier so gestaltet, dass sich die mikroskopischen Objekte darin bewegen können. Diese Bewegung kann von den mikroskopischen Objekten selbst ausgehen, beispielsweise wenn es sich bei diesen um lebendige Organismen wie Zebrafische handelt. Alternativ kann eine Bewegung auch aktiv über eine Strömung im Probengefäß erzeugt werden, etwa mittels einer Pumpe, eines Rührstabs oder einem Temperaturgradien- ten innerhalb des Probengefäßes.

Für eine kostengünstige Gestaltung, die gleichwohl ein präzises Verstellen der Detektionsebene ermöglicht, sind sämtliche Komponenten der Abbildungsmittel, welche Detektionslicht von der Detektionsebene zur Detektionseinrichtung leiten, entlang genau einer optischen Achse angeordnet. Die optische Achse selbst kann hierbei über beispielsweise Spiegel Richtungsänderungen aufweisen. Es werden aber insbesondere nicht zwei Objektive oder Mikroskope hintereinander und schräg ange- ordnet, wie es zum Beispiel in WO 2010/012980 A1 genutzt wird, um unter anderem eine Fokussierung zu ändern. Bei einer solchen Anordnung steht die optische Achse des hinteren Mikroskops schräg auf eine Zwischenbildebene, die vom ersten Mikroskop erzeugt wird, womit die Abbildungsmittel nicht entlang einer, sondern zumindest zwei optischen Achsen angeordnet sind. Die Art der Mikroskopie kann bei der Erfindung prinzipiell beliebig sein. Beispielsweise kann eine konfokale Filterung durchgeführt werden. In diesem Fall wird das Beleuchtungslicht über das Detektionsobjektiv auf die Probe geleitet.

Besonders bevorzugt ist das Lichtmikroskop aber zur Lichtblatt-Mikroskopie (SPIM, englisch: Single plane Illumination microscopy) gestaltet. Hierzu umfasst das Mikro- skop ein vom Detektionsobjektiv verschiedenes Beleuchtungsobjektiv zum Leiten von Beleuchtungslicht, das von der Lichtquelle ausgesendet wird, in den Messbereich. Das Beleuchtungsobjektiv ist so angeordnet, dass seine optische Achse senkrecht zu einer optischen Achse des Detektionsobjektivs steht. Dadurch kann eine Ausbreitungsrichtung des Beleuchtungslichts in der Detektionsebene liegen, womit Probenbereiche ober- und unterhalb der Detektionsebene vorteilhafterweise nicht oder nur kaum beleuchtet werden. Wie auch bei einer Konfokalmessung kann mit SPIM eine hohe Tiefenauflösung erreicht werden. Dabei ist die erforderliche Messdauer aber verhältnismäßig gering, was zum Erreichen eines hohen Probendurchsatzes vorteilhaft ist. Das Detektionsobjektiv kann mit seiner optischen Achse senkrecht zur Längsachse des Messrohrs angeordnet sein. Dadurch können ungewünschte optische Auswirkungen des Messrohrs gering gehalten werden.

Alternativ kann das Detektionsobjektiv aber auch so angeordnet sein, dass seine optische Achse unter einem von 90° verschiedenen Winkel zu einer Längsachse des Messrohrs ausgerichtet ist. Für eine SPIM-Messung kann ein Beleuchtungsobjektiv senkrecht zum Detektionsobjektiv und damit ebenfalls schräg zur Längsachse des Messrohrs angeordnet sein. Dadurch wird vorteilhafterweise erreicht, dass eine Pro- benbewegung, welche in Längsrichtung des Messrohrs erfolgt, schräg zur Detekti- onsebene steht. Die Probenbewegung hat also eine Richtungskomponente in Höhenrichtung des Detektionsobjektivs, das heißt entlang einer optischen Achse des Detektionsobjektivs. Daher führt die Probenbewegung zu einer Relativhöhenverstel- lung zwischen der Detektionsebene und der Probe.

So kann mit elektronischen Steuermitteln ein gewünschter Höhenabstand zwischen zwei nacheinander gemessenen Detektionsebenen relativ zur Probe eingestellt werden, indem die Fokussiermittel und die Probenbewegung abhängig voneinander gesteuert werden. Beispielsweise können die elektronischen Steuermittel zwischen zwei Probenbildaufnahmen die Detektionsebene mittels der Fokussieroptik in eine Richtung versteilen, welche eine Richtungskomponente entgegengesetzt zur Bewegungsrichtung der mikroskopischen Objekte hat. Dadurch können zu einem mikroskopischen Objekt schneller mehrere Probenbilder aufgenommen werden, als allein durch die Proben- bewegung möglich wäre.

Alternativ oder zusätzlich können die elektronischen Steuermittel auch dazu eingerichtet sein, zwischen zwei Probenbildaufnahmen die Detektionsebene mittels der Fokussieroptik in eine Richtung verstellen, welche eine Richtungskomponente in Bewegungsrichtung der mikroskopischen Objekte hat. Hierdurch wird beispielsweise eine verhältnismäßig hohe Fließgeschwindigkeit der mikroskopischen Objekte möglich, bei welcher gleichwohl eine hohe Anzahl an Probenbildern für ein bestimmtes mikroskopisches Objekt aufgenommen werden kann.

Zudem ist diese Variante vorteilhaft, wenn ein erstes Probenbild zunächst mit Bildverarbeitungsmitteln ausgewertet wird und abhängig von einem Auswertungsergeb- nis weitere Probenbilder aufgenommen werden sollen. In diesem Fall kann eine Probenbewegung, welche während der Übertragung, Verarbeitung und Auswertung des ersten Probenbilds erfolgt, zumindest teilweise kompensiert werden, indem die Fokussiermittel die Detektionsebene verschieben.

Prinzipiell kann die Geschwindigkeit der Probenbewegung auch so eingestellt wer- den, dass diese kleiner ist als eine Verschiebegeschwindigkeit der Detektionsebene durch die Fokussieroptik. Dadurch können zu einer Detektionsebene, beispielsweise wenn dort ein interessierender Probenbereich identifiziert wird, anschließend weitere Detektionsebenen untersucht werden, die relativ zur Probe in oder entgegengesetzt zur Probenbewegung verschoben sind.

Für eine besonders schnelle Probenuntersuchung kann auch mindestens ein zweites Detektionsobjektiv vorhanden sein, so dass mit den Detektionsobjektiven gleichzeitig verschiedene Detektionsebenen abbildbar sind. Die Detektionsobjektive können De- tektionslicht entweder zeitlich nacheinander zu derselben Detektionseinrichtung leiten, oder gleichzeitig zu verschiedenen Detektionseinrichtungen.

Insbesondere für eine Lichtblatt-Mikroskopie ist es zweckmäßig, bei einer Verstellung der Fokussieroptik gleichzeitig den Verlauf des Beleuchtungslichts zu ändern. So soll das Beleuchtungslicht in einer Weise verschoben werden, dass es stets entlang der momentan abgebildeten Detektionsebene verläuft. Hierzu können Scanmittel in einer Pupille eines Beleuchtungsobjektivs angeordnet sein, mit welchem Beleuchtungslicht in den Messbereich geleitet wird. Durch eine Anordnung in der Pupille bewirkt eine Änderung einer Lichtablenkrichtung der Scanmittel einen verschobenen Verlauf des Beleuchtungslichts im Probengefäß.

Allgemein kann unter einer Detektionsebene eine Ebene innerhalb des Probengefäßes verstanden werden, welche mit dem Detektionsobjektiv auf die Detektionseinrichtung abgebildet wird. Dabei können verschiedene Bereiche der Ebene auch nacheinander auf die Detektionseinrichtung abgebildet werden, beispielsweise bei Konfokalmessungen.

Die Detektionseinrichtung ist eine prinzipiell beliebige lichtempfindliche Messeinrichtung. Vorzugsweise umfasst sie mindestens einen zweidimensionalen Kamerasensor, um eine Detektionsebene zu einem Zeitpunkt messen zu können. Der Messbereich kann identisch zur Detektionsebene sein. Dies ist beispielsweise bei SPIM der Fall, wo gerade die Detektionsebene beleuchtet wird. Werden auch Bereiche über oder unter der Detektionsebene beleuchtet, so kann unter dem Messbereich auch derjenige Bereich innerhalb des Probengefäßes verstanden werden, der beleuchtet wird und daraufhin Detektionslicht aussenden kann, welches über das Detektionsobjektiv die Detektionseinrichtung erreichen kann. Das Beleuchtungslicht der Lichtquelle kann prinzipiell beliebiger Art sein, insbesondere entweder breitbandig oder auf einen oder mehrere schmale Wellenlängenbereich beschränkt sein. Die Lichtquelle kann grundsätzlich ebenfalls beliebig aufgebaut sein und beispielsweise einen oder mehrere Laser umfassen. Unter dem Detektionslicht wird Licht verstanden, welches infolge der Bestrahlung der Probe mit Beleuchtungslicht von dieser ausgeht. So kann das Detektionslicht Fluoreszenzlicht sein, oder auch anderes Lumineszenzlicht oder gestreutes, reflektiertes oder gebeugtes Beleuchtungslicht.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden nachstehend mit Bezug auf die beigefügten schematischen Figuren beschrieben.

Fig. 1 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen

Lichtmikroskops.

Fig. 2 zeigt einen Ausschnitt eines weiteren Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops. Gleiche und gleich wirkende Bestandteile sind in den Figuren in der Regel mit denselben Bezugszeichen versehen.

In Fig. 1 ist ein erstes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 100 schematisch gezeigt. Das Lichtmikroskop 100 umfasst als wesentliche Komponenten ein Detektionsobjektiv 10 und ein Probengefäß 20, in dem sich zu un- tersuchende mikroskopische Objekte 22 befinden können.

Bei den mikroskopischen Objekten 22 handelt es sich beim dargestellten Beispiel um Zebrafische 22. Diese befinden sich in einem wässrigen Probenmedium, welches das Probengefäß 20 vollständig füllt, um variable Lufträume und dadurch bedingte Abbildungsbeeinflussungen zu vermeiden. Das Probengefäß 20 ist als Messrohr 20 gebildet. Dieses verbindet ein Reservoir 1 mit einem Ableitungssystem 2. Aus dem Reservoir 1 wird das Messrohr 20 mit mikroskopischen Objekten versorgt. Eine Pumpe kann vorgesehen sein, um das Probenmedium und damit die Zebrafische 22 durch das Messrohr 20 zu befördern. Alternativ können sich die Zebrafische 22 aber auch aus eigener Kraft durch das Mess- rohr 20 bewegen. Das Ableitsystem 2 kann einen Kreislauf zu dem Reservoir 1 bilden.

Indem die Proben 22 nacheinander durch einen Messbereich im Messrohr 20 bewegt werden, können Proben 22 mit hohem Durchsatz untersucht werden. Der Messbe- reich wird im dargestellten Fall über eine Detektionsebene 15 gebildet, welche das Detektionsobjektiv 10 auf eine Detektionseinrichtung 30 abbildet. Von einer beleuchteten Probe 22 ausgehendes Detektionslicht ist in der Figur mit dem Bezugszeichen 5 versehen.

Eine nicht dargestellte Lichtquelle beleuchtet den Messbereich und damit die Detek- tionsebene. Vorzugsweise ist das Lichtmikroskop 100 zur Lichtblattmikroskopie ausgelegt. Dazu wird Beleuchtungslicht quer, insbesondere senkrecht, zu einer optischen Achse des Detektionsobjektivs 0 auf die Probe 22 geleitet. Bei Fig. 1 verläuft die optische Achse des Detektionsobjektivs 10 vertikal und die Ausbreitungsrichtung des Beleuchtungslichts verläuft in die Papierebene hinein oder aus dieser heraus. Dadurch wird im Wesentlichen allein die Detektionsebene 15 beleuchtet.

Um verschiedene Detektionsebenen 15, 16, welche in Richtung der optischen Achse zueinander versetzt sind, zu untersuchen, wird bei herkömmlichen Mikroskopen meist der Abstand 6 zwischen dem Probengefäß 20 und dem Objektiv 10 verändert. Dies ist wegen der hierbei bewegten großen Massen aber verhältnismäßig zeitauf- wendig. Zudem hat ein sich ändernder Abstand 6 nachteilige Auswirkungen auf das Optikdesign. Ebenfalls relativ zeitintensiv ist eine Verstellung von beispielsweise einer dem Objektiv nachgeordneten Zoomoptik.

Hingegen erlaubt die Erfindung ein schnelles Verstellen der auf die Detektionseinrichtung 30 abgebildeten Detektionsebene 15 oder 16, indem eine Fokussieroptik 12 verstellt wird. Diese befindet sich im Objektiv 10 hinter einer Frontoptik 1 1 des Objektivs 10. Durch diese Anordnung beeinflusst eine Bewegung der Fokussieroptik 12 keine optischen Grenzflächen und keine Abmessungen zwischen dem Probengefäß 20 und dem Objektiv 10.

Die Fokussieroptik 12 ist zudem vor einer Zwischenbildebene angeordnet, in welche mit dem Objektiv 10 ein Bild der Detektionsebene 15 oder 16 abgebildet wird. Ein Strahlengang ab der Zwischenbildebene bis zur Detektionseinrichtung 30 ist dadurch unabhängig von eine Auswahl einer der Detektionsebenen 15 oder 16, das heißt, es müssen keine optischen Elemente zwischen der Zwischenbildebene und der Detek- tionseinrichtung 30 abhängig davon, welche Detektionsebenen 15 oder 16 abgebildet werden soll, verändert werden. Hierdurch kann ein einfacher und kostengünstiger Mikroskopaufbau realisiert werden. Dafür ist maßgeblich, dass über die Fokussieroptik 12 allein ein Abschnitt des Strahlengangs von der Probe 22 bis zur ersten Zwischenbildebene beeinflusst wird.

Über die Fokussieroptik 12 kann eine besonders schnelle Höhenänderung der De- tektionsebene eingestellt werden. Hierzu kann die Fokussieroptik 12 vorzugsweise Alvarez-Platten umfassen.

Das Messrohr 20 bleibt während mehreren aufeinanderfolgenden Messungen verschiedener Detektionsebenen 15, 16 ortsfest. Davor oder anschließend kann das Messrohr 20 allerdings auch in den drei Raumrichtungen 29 verschoben oder in Richtung des Pfeils 28 um seine Längsachse gedreht werden. Damit nur dann Probenbilder zu verschiedenen Detektionsebenen 15, 16 aufgenommen werden, wenn tatsächlich ein mikroskopisches Objekt 22 durch die Detekti- onsebene 15, 16 befördert wird, kann eine Überwachungsmessung durchgeführt werden. Diese wird im dargestellten Beispiel mit einer Lichtschranke 18 durchgeführt, wobei prinzipiell auch das Detektionsobjektiv 10 hierfür eingesetzt werden kann. Besonders schnelle Probenuntersuchungen sind möglich, wenn das Mikroskop 100 zur Lichtblatt-Mikroskopie gestaltet ist. Dabei kann die Bewegungsrichtung der mikroskopischen Objekte 22, das heißt die Längsrichtung des Messrohrs 20, parallel zu den Detektionsebenen 15, 16 liegen, wie bei Fig. 1 der Fall.

Bei einer besonders bevorzugten Alternative werden aber Detektionsebenen unter- sucht, die schräg zur Längsachse des Messrohrs 20 liegen. Eine hierzu gestaltete Ausführung eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 100 ist ausschnittsweise in Fig. 2 dargestellt.

Diese zeigt ein Beleuchtungsobjektiv 3, welches Beleuchtungslicht 4 in den Messbereich im Messrohr 20 leitet, sowie das Detektionsobjektiv 10, das Detektionslicht 5 aus dem Messbereich weiterleitet. Die optischen Achsen der beiden Objektive 3 und 4 stehen senkrecht zueinander und jeweils schräg zur Längsachse des Messrohrs 20. Dadurch hat eine Verstellrichtung der Detektionsebene durch die Fokussieroptik 12 eine Richtungskomponente in Längsrichtung des Messrohrs 20. Somit kann eine Relativverschiebung zwischen der momentan abgebildeten Detektionsebene 15 oder 16 und einem mikroskopischen Objekt 22 in eine Richtung, welche eine Richtungskomponente senkrecht zur dieser Detektionsebene 15 oder 16 hat, sowohl über die Fokussiermittel 12 als auch über die Probenbewegung durchs Messrohr 20 erfolgen. Diese beiden Einstellmöglichkeiten bieten eine besonders hohe Flexibilität in der Probenuntersuchung, was insbe- sondere zur Erhöhung der Untersuchungsgeschwindigkeit genutzt werden kann.

Somit bietet das erfindungsgemäße Lichtmikroskop 100 die Möglichkeit, mit besonders großem Durchsatz Proben 22 zu untersuchen. Dabei wird ein dreidimensionales Probenbild ermittelt, indem mehrere zueinander in Höhenrichtung versetzte Ebenen 15, 16 derselben Probe 22 aufgenommen werden.

Bezugszeichenliste

1 Reservoir

2 Ableitungssystem

3 Beleuchtungsobjektiv 4 Beleuchtungslicht

5 Detektionslicht

10 Detektionsobjektiv

11 Frontoptik

12 Fokussieroptik 15 Detektionsebene

16 weitere Detektionsebene

18 Lichtschranke Probengefäß, Messrohr

mikroskopische Objekte, Proben

Raumrichtungen zur Verschiebung des Messrohrs 20 Rotationsrichtung des Messrohrs 20

Detektionseinrichtung

Lichtmikroskop

Claims

PATENTANSPRÜCHE

Lichtmikroskop zum Untersuchen mehrerer mikroskopischer Objekte (22), mit einer Lichtquelle zum Beleuchten eines Messbereichs,

mit einem Probengefäß (20), in dem die mikroskopischen Objekte (22) nacheinander in den Messbereich bewegbar sind,

mit Abbildungsmitteln (10) und einer Detektionseinrichtung (30) zum Messen von Detektionslicht (5), das von einem im Messbereich befindlichen mikroskopischen Objekt (22) kommt,

dadurch gekennzeichnet,

dass die Abbildungsmittel (10) ein Detektionsobjektiv (10) mit ortsfester Frontoptik (11) und bewegbarer Fokussieroptik (12) umfassen, welche hinter der Frontoptik (11) und vor einer Zwischenbildebene angeordnet ist und zur Höhenverstellung einer Detektionsebene (15, 16) verstellbar ist.

2. Lichtmikroskop nach Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet,

dass sämtliche optische Grenzflächen ab dem Probengefäß (20) bis zur Frontoptik (11) während aufeinanderfolgenden Messungen unterschiedlicher mikroskopischer Objekte (22) sowie unterschiedlicher Detektionsebenen (15, 16) ortsfest sind.

3. Lichtmikroskop nach Anspruch 1 oder 2,

dadurch gekennzeichnet,

dass die Fokussieroptik (12) mindestens eine lateral verschiebbare Komponente aufweist, welche abhängig von ihrer lateralen Verschiebung unterschiedliche Brechkräfte bewirkt.

Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3,

dadurch gekennzeichnet,

dass die Fokussieroptik (12) eine Optikkomponente aufweist, deren Form für eine Fokusverstellung änderbar ist.

Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4,

dadurch gekennzeichnet,

dass das Probengefäß (20) ein Messrohr (20) umfasst und

dass Beförderungsmittel zum Befördern der mikroskopischen Objekte (22) durch das Messrohr (20) vorhanden sind.

Lichtmikroskop nach Anspruch 5,

dadurch gekennzeichnet,

dass ein Material des Messrohrs (20) und ein Probenmedium, in dem die mikroskopischen Objekte (22) durch das Messrohr (20) transportiert werden, so gewählt sind, dass ihre Brechungsindizes um höchstens 10% voneinander abweichen.

Lichtmikroskop nach Anspruch 5 oder 6,

dadurch gekennzeichnet,

dass ein Behälter zur Aufnahme einer Immersionsflüssigkeit vorhanden und so angeordnet ist, dass die Immersionsflüssigkeit zumindest im Bereich der Detektionsebene (15, 16) eine Mantelfläche des Messrohrs (20) vollständig umgibt und dass in einem Messbetrieb die Frontoptik (11) mit der Immersionsflüssigkeit in Kontakt ist.

Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6,

dadurch gekennzeichnet,

dass das Probengefäß (20) nach oben geöffnet ist und

dass die Frontoptik (11) in ein im Probengefäß (20) befindliches Probenmedium, in welchem sich die mikroskopischen Objekte (22) befinden, eingetaucht ist.

9. Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8,

dadurch gekennzeichnet,

dass ein Beleuchtungsobjektiv (3) zum Leiten von Beleuchtungslicht (4) in den Messbereich vorhanden und so angeordnet ist, dass seine optische Achse senkrecht zu einer optischen Achse des Detektionsobjektivs (10) steht.

10. Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 9,

dadurch gekennzeichnet,

dass das Detektionsobjektiv (10) so angeordnet ist, dass seine optische Achse unter einem von 90° verschiedenen Winkel zu einer Längsachse des Messrohrs (20) ausgerichtet ist.

11. Lichtmikroskop nach Anspruch 10,

dadurch gekennzeichnet,

dass elektronische Steuermittel vorhanden und dazu eingerichtet sind, zwischen zwei Probenbildaufnahmen die Detektionsebene (15, 16) mittels der Fokussieroptik (12) in eine Richtung zu verstellen, welche eine Richtungskomponente in Bewegungsrichtung der mikroskopischen Objekte (22) hat.

12. Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 11,

dadurch gekennzeichnet,

dass ein zweites Detektionsobjektiv vorhanden und so angeordnet ist, dass mit den beiden Detektionsobjektiven gleichzeitig zwei verschiedene Detekti- onsebenen abbildbar sind.

13. Mikroskopieverfahren zum Untersuchen mehrerer mikroskopischer Objekte (22),

bei dem ein Messbereich beleuchtet wird,

bei dem in einem Probengefäß (20) die mikroskopischen Objekte (22) nachei- nander in den Messbereich bewegt werden und

bei dem mit Abbildungsmitteln (10) und einer Detektionseinrichtung (30) De- tektionslicht (5) gemessen wird, das von einem im Messbereich befindlichen mikroskopischen Objekt (22) kommt,

dadurch gekennzeichnet, dass mit der Detektionseinrichtung (30) nacheinander mehrere Probenbilder zu unterschiedlichen Detektionsebenen (15, 16) aufgenommen werden, die mit einer bewegbaren Fokussieroptik (12) eingestellt werden, welche hinter einer ortsfesten Frontoptik (11) des Detektionsobjektivs (10) und vor einer Zwischenbildebene angeordnet ist.

Mikroskopieverfahren nach Anspruch 13,

dadurch gekennzeichnet,

dass nacheinander mehrere Probenbilder aufgenommen werden,

dass zumindest zwischen Aufnahmen verschiedener Probenbilder die mikroskopischen Objekte (22) bewegt werden,

dass die aufgenommenen Probenbilder zu einem dreidimensionalen Probenbild zusammengefügt werden.

15. Mikroskopieverfahren nach Anspruch 13 oder 14,

dadurch gekennzeichnet,

dass eine Messabstandsdauer, die ab einem Beginn einer Probenbildaufnahme einer ersten Detektionsebene (15) bis zu einem Beginn einer Probenbildaufnahme einer mit den Fokussiermitteln verstellten Detektionsebene (16) be- nötigt wird, und eine Fließgeschwindigkeit, mit welcher die mikroskopischen

Objekte (22) befördert werden, so aufeinander abgestimmt sind, dass der Abstand zwischen zwei nacheinander untersuchten Detektionsebenen (15) relativ zum Objekt (22) höchstens der Schärfentiefe der aufgenommenen Probenbilder entspricht.

16. Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 5,

dadurch gekennzeichnet,

dass eine Überwachungsmessung durchgeführt wird, mit welcher ermittelt wird, ob sich ein mikroskopisches Objekt (22) im Messbereich befindet, und dass nur dann eine Aufnahme mehrerer Probenbilder zu verschiedenen Detektionsebenen (15, 16) gestartet wird, wenn die Anwesenheit eines mikroskopischen Objekts (22) im Messbereich festgestellt worden ist.