JP2020536524A

JP2020536524A - クリックベースのライゲーション

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Publication number: JP2020536524A
Application number: JP2020518080A
Authority: JP
Inventors: フリシュムートトーマス; セルジュコフザシャ
Original assignee: ベースクリックゲーエムベーハー
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2020-12-17
Also published as: CN111183144A; BR112020004041A2; CA3070514A1; KR20200057708A; EP3688004A1; US20200361984A1; AU2018338781B2; WO2019063803A1; AU2018338781A1

Abstract

本発明は、適した触媒の存在下でのいわゆるクリック反応によって分子をカップリングするための新たな方法及び試薬に関する。さらに、本発明は、かかるクリックライゲーション反応のためのアクチベーター組成物、クリックライゲーション試薬キット、かかるクリックライゲーション反応を実施するための装置、並びに特に次世代の核酸配列決定法に関してクリック反応による分子のカップリングの効率を改善するためのかかる方法、組成物、試薬キット及び装置の使用に関する。

Description

本発明は、適した触媒の存在下でのいわゆるクリック反応によって分子をカップリングするための新たな方法及び試薬に関する。さらに、本発明は、かかるクリックライゲーション反応のためのアクチベーター組成物、クリックライゲーション試薬キット、かかるクリックライゲーション反応を実施するための装置、並びに特に次世代核酸シーケンシング法に関してクリック反応による分子のカップリングの効率を改善するためのかかる方法、組成物、試薬キット及び装置の使用に関する。

背景技術
２００１年／２００２年に、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ及びＭｅｌｄａｌのグループは、「クリックケミストリー」の概念及び「クリック」反応として考慮される形質転換のための基準を独立して定義した（Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．ら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００２，１１４，２７０８；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２，４１，２５９６，Ｍｅｌｄａｌ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００２，６７，３０５７）。それ以来、アジドとアルキンとの銅触媒化反応により１，２，３−トリアゾールが得られる１，３−双極子ヒュスゲン環化付加反応の変型（Ｒ．Ｈｕｉｓｇｅｎ，１，３−ＤｉｐｏｌａｒＣｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｅｄ．：Ａ．Ｐａｄｗａ），Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８４）が最も広く使用されるクリック反応となった。その緩い条件及び高い効率の結果として、この反応は、生物学及び材料科学における無数の適用、例えばＤＮＡ標識目的を見出した（Ｇｒａｍｌｉｃｈ，Ｐ．Ｍ．Ａ．ら、ＰｏｓｔｓｙｎｔｈｅｔｉｃＤＮＡＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅＣｏｐｐｅｒ−ＣａｔａｌｙｚｅｄＡｚｉｄｅ−ＡｌｋｙｎｅＣｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎＲｅａｃｔｉｏｎ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００８，４７，８３５０）。

特定の標的配列についての、例えば一塩基多型の存在、耐性遺伝子のような特定の遺伝子、又はｍＲＮＡの存在についての遺伝物質の迅速な分析は、使いやすく、効率的で信頼性の高いツールが要求される。主な問題は、小さな生物学的試料、例えば患者の血液又は植物において、目的のＤＮＡ又はＲＮＡを直接検出する必要があることである。これらは、微量の分析物のみを提供する。要求される感度に到達するために、通常、核酸分析物を分析前に増幅させるか、又はＤＮＡ／ＲＮＡ分析物から直接得られる微小な検出信号を増幅させる検出方法を使用する増幅ステップが要求される。

核酸分析物の増幅方法は、ＰＣＲ及び他の核酸増幅プロトコルを含む。ＰＣＲ増幅は、生物学的材料から得られた異なるＤＮＡ鎖のプール内で、目的のＤＮＡ配列のみが増幅される大きな利点を有する。これは、複雑な生物学的試料における単一遺伝子の信頼性のある分析の基礎である。

オリゴヌクレオチドの酵素によるライゲーションは、オリゴヌクレオチド操作のための多数のプロトコルにおける標準的な手法であり、かつシーケンシング、クローニング並びに多くの他のＤＮＡベース及びＲＮＡベースの技術のために要求される。ライゲーション反応の触媒に含まれる酵素は、ＤＮＡ又はＲＮＡの５’−リン酸末端と３’−ヒドロキシル末端との間にホスホジエステル結合を形成する。効率的に作用するために、リガーゼは、好ましくは付着末端又はスプリント鎖を使用することにより事前に組織化されている二本鎖オリゴヌクレオチドを必要とする。ライゲーション反応は、反応が配列特異的ではないため、任意の５’−リン酸末端と任意の３’−ヒドロキシル末端とを結合できる。この基質特異性の欠如は、酵素によるライゲーションの幅広い一般的な適用についての大きな利点であり、かつその幅広い適用に寄与している。皮肉なことに、これは同時に、配列人工産物がオリゴヌクレオチド断片の非特異的結合から生じるために、多くのシーケンシング適用についての大きな課題である。ほぼ全てのシーケンシング技術が、シーケンシング及びＰＣＲ増幅中のプライマー結合のために公知のオリゴヌクレオチド配列、いわゆるアダプターのライゲーションを必要とするため、人工的な組換え、配列キメラ形成（ＲＮＡシーケンシングのためのＤＮＡ−ＲＮＡ鎖）及びアダプター二量体（挿入配列のない連結されたアダプター対）形成を生じうる。

配列人工産物を減らすために、プライマーの３’−末端が、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）の挿入により阻害される。これは、アダプター二量体形成を妨げ、正確な直接のライゲーションを確実にするが、しかし人工的な組換え及びキメラ形成に影響を及ぼすことができない。これらの影響は、配列読み取りデータからのコンティグ（一連の重複配列データ読み取りデータ）生成中に特別なアルゴリズムを使用して修正する必要がある。

本発明は、効率的であり、部位特異的であり、ＰＣＲ増幅に適合する、分子、特にオリゴヌクレオチドの酵素によらない結合のためのクリックケミストリーベースの方法に関しする。２つの非鋳型化一本鎖オリゴヌクレオチド間の反応は、同等の酵素によるライゲーション反応よりも効率的であり、例えば、ＲＮＡシーケンシングにおける第二の鎖合成の必要性を排除する。

アルキン又はアジド含有オリゴヌクレオチドの製造は、広く研究されている。本発明について特に興味深いのは、「骨格模倣物」、すなわち銅触媒化アジドアルキン環化付加反応（ＣｕＡＡＣ）によって生成できるホスホジエステル結合の非天然代替物である。得られるトリアゾール含有オリゴヌクレオチドのいくつかは、配列の変異なしにポリメラーゼ酵素により天然のホスホジエステル骨格に変換されるため、完全に生体適合性がある（Ｓｈｉｖａｌｉｎｇａｍら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆＨｉｇｈ−ＦｉｄｅｌｉｔｙＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ＣｏｍｐｅｔｅｎｔＤＮＡＢａｃｋｂｏｎｅｓｆｏｒＯｒｔｈｏｇｏｎａｌＣｈｅｍｉｃａｌＬｉｇａｔｉｏｎ（２０１７）ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａｃｓ．６ｂ１１５３０）。図１は、クリックケミストリーにより生じたいくつかのトリアゾール骨格模倣物の構造を示し、天然のホスホジエステルを比較として左側に示す。

この人工ＤＮＡ骨格技術の特に有用な適用は、次世代シーケンシングのための試料調製にある。Ｒｏｕｔｈら（ＣｌｉｃｋＳｅｑ：Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ−ＦｒｅｅＮｅｘｔ−ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇｖｉａＣｌｉｃｋＬｉｇａｔｉｏｎｏｆＡｄａｐｔｏｒｓｔｏＳｔｏｃｈａｓｔｉｃａｌｌｙＴｅｒｍｉｎａｔｅｄ３’−ＡｚｉｄｏｃＤＮＡｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２７，２６１０−２６１６（２０１５））は、ＲＮＡシーケーシングのためのプロトコルを提供し、このプロトコルでは、アダプターオリゴヌクレオチドをクリックして、３’−アジド末端化ｃＤＮＡ断片にし、そしてＰＣＲ反応を実施してｃＤＮＡライブラリーを提供する。アダプターオリゴヌクレオチドの酵素によるライゲーションを含む標準ライブラリー調製プロトコルと比較して、この方法は、人工的組換え及び配列キメラ形成の速度を劇的に減少させることができた。

これまでのＤＮＡ又はＲＮＡシーケンシングにおけるクリック技術のこの適用に対する厳しい制限は、十分に効率的ではなく、前記方法で使用される３’−アジドをブロックしたｃＤＮＡ断片がライブラリー調製中にキャプチャされる。３’−アジドをブロックしたｃＤＮＡ断片の約１０％のみが、アルキン修飾したオリゴヌクレオチドに連結されうる。さらに、トリアゾール連結のリードスルーを介したこのトリアゾールに連結した一本鎖ＤＮＡの二本鎖ＤＮＡへの変換は効率的ではない。標準のＲＮＡｓｅｑ実験ではかかる効率で十分であってよいが、オリジナルのＲＮＡ又はＤＮＡの完全なキャプチャを必要とする他の適用では、クリック反応及び続くリードスルーの効率は不十分であると見なされ、改善されなければならない。

したがって、本発明の目的は、クリック技術の次世代シーケンシングへの成功した適用を確立するために、特にクリックライゲーションのより高い効率を達成する手段を提供することである。

発明の要約
本発明は、クリック官能基としてアルキン基及びアジド基を使用するクリック反応における２つの反応パートナーを連結する効率を改善することに関する。以下で意図されたクリック反応は、金属触媒、特に不均一Ｃｕ（Ｉ）又は他の適した金属触媒によって触媒される、アジドである１，３−双極性部分と末端アルキンである不飽和部分との間の反応である。触媒される形でのクリック反応は、５員の複素環１，２，３−トリアゾール部分をもたらす非協奏的なイオン性機構である。

第一の態様に従って、本発明は、クリック反応で第一の分子を第二の分子に連結するための方法に関し、その際第一の分子は、アルキン基である第一のクリック官能基を含み、かつ第二の分子は、アジド基である第二のクリック官能基を含み、前記方法は、触媒、好ましくは不均一Ｃｕ触媒の存在下で反応混合物中で第一の分子と第二の分子との接触を含み、クリック反応が反応混合物中で追加の金属カチオンの存在下で実施されることを特徴とする。

本発明の他の態様は、クリック反応において使用するためのアクチベーター組成物であり、その際、アルキン基である第一のクリック官能基を含む第一の分子とアジド基である第二のクリック官能基を含む第二の分子とが、触媒、好ましくは不均一Ｃｕ触媒の存在下で結合され、前記アクチベーター混合物は、金属カチオン、Ｃｕ（Ｉ）安定化リガンド、及び任意に有機溶媒を含む。

さらに本発明の他の態様は、１つの構成要素として触媒と第二の構成要素として本発明によるアクチベーター組成物とを少なくとも含むクリックライゲーション試薬キットである。

さらに本発明の他の態様は、少なくとも１つの反応チャンバーを有する装置に関し、該反応チャンバーは、２つの反応パートナー間のクリック反応を実施するための触媒、好ましくは不均一Ｃｕ触媒を含み、かつさらに金属カチオン又は本発明のアクチベーター組成物を反応チャンバーに含む。

さらに本発明の他の態様は、効率的に分子、好ましくはオリゴヌクレオチドをクリック反応により連結するための、前記の方法、組成物、試薬キット、及び装置の使用に関する。かかる分子の例は、検出可能な標識を保有する。したがって、ライゲーションは、分析物、例えば試料中の核酸の検出のために使用されうる標識生体分子を提供でき、特にクリック反応により標識された化合物の使用を含み、検出されるべき分析物との会合生成物を形成する。特に、前記方法、組成物、試薬キット及び装置は、ＲＮＡライブラリー調製、ＤＮＡライブラリー調製を含む次世代シーケンシング技術において、及び複雑なオリゴヌクレオチド混合物の分析、特にパラレル及び多重ＲＴ−ｑＰＣＲ適用において使用されうる。さらに、本発明の前記方法、組成物、試薬キット及び装置は、ライゲーション方法（例えば、ＡＢＩからの「ソリッドシーケンシング」）によるシーケンシングのために、リガーゼ鎖反応において、選択方法において、特に組換えＤＮＡを形成するための選択方法において、及び遺伝子合成において使用されうる。

本発明を導く研究は、驚くべきことに、触媒、特にＣｕ（Ｉ）触媒、特に不均一Ｃｕ（Ｉ）触媒によって触媒されるクリック反応に対する金属イオンの添加が、特にオリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチドのクリック反応速度を大幅に改善できることを示している。この改善は、スプリントオリゴヌクレオチドを介して反応パートナーを事前に組織化することによってのみ得られた収率で、骨格官能化オリゴヌクレオチド間の効率的なクリック反応を可能にする。

好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、スプリントオリゴヌクレオチドについての要求を回避し、かつさらに高い収率のクリックライゲーション反応を導く、クリック反応のための改善された条件について提供する。本発明の条件下で実施できるかかるクリック反応の例において、３’−アルキン又は３’−アジドで修飾したヌクレオチドが、例えば逆転写（ＲＮＡシーケンシング）中に又は平滑末端化（一本鎖ＤＮＡオーバーハングをヌクレオチドで満たす及び／又は除去する）中に酵素により導入することによって、及び／又はｄＡテーリング（平滑末端二本鎖ＤＮＡの３’末端へのヌクレオチド、ほとんどの場合にｄＡＴＰの非鋳型付加）によって、オリゴヌクレオチドに導入されてよい。ＲＮＡシーケンシングについて、第一のアダプター（アダプターは、プライマー結合及びハイブリダイゼーションのための相補配列を含む短いオリゴヌクレオチドである）を、部分的にランダム化したプライマーを使用して導入することができる。第二のアダプターは、３’−アルキン又は３’−アジド末端化ｃＤＮＡにクリック結合される。ＣｌｉｃｋＡｄａｐｔＲＮＡライブラリー調製中のかかる反応の概要を図２ａに示す。

特にかかるＲＮＡシーケンシングの記載内容において、５’末端にアダプターのより下流の領域に相補的な配列を含むプライマー結合及びハイブリダイゼーションのための相補配列を含むアダプターを使用することが可能であり、さらに好ましくあってよい。逆回文配列又は逆リピートは、かかる相補配列についての例である。アダプター配列のこれら相補部分のハイブリダイゼーションは、アダプターの５’末端に二本鎖ループの形成を導く。５’末端に二本鎖ループを含むかかるアダプターを使用することは、反応混合物に含まれる同一の又は他のＲＮＡ上で他の配列とアダプターがハイブリダイズしないことを確実にする。相応する反応を、図２ｂ）において概略図として示す。

二本鎖部分に加えて、一本鎖ループ領域がかかるアダプターにおいて存在する一方で、かかるループ領域が、非特異的ハイブリダイゼーションを引き起こす可能性は低い。それにもかかわらず、かかるループ領域を小さく保つことが好ましい。好ましくは、ループ領域は、１０ヌクレオチド未満、より好ましくは６ヌクレオチド未満を含み、最も好ましくはループ領域は３ヌクレオチドのみを含む。

ＤＮＡシーケンシングについて、第一のアダプターは、酵素的により３’−アルキン又は３’−アジドを修飾させたオリゴヌクレオチドにクリック結合される（第二のアダプターは、アダプターの部分的に相補的な結合領域（例えば１２ｍｅｒ）を介してＰＣＲ中に導入される）。それぞれのＣｌｉｃｋＡｄａｐｔＤＮＡライブラリー調製のワークフローを図３に示す。プライマー又はアダプターは、種々の試料の１つへの続く相関を可能にするインデックス配列を含みうる。これは、複数の酵素により製造した試料の混合物にクリックシーケンシング技術を適用することを可能にする。過剰な修飾ヌクレオチドの除去後に、ＰＣＲ増幅及び／又はシーケンシングに必要であるヌクレオチド配列を導入するために、酵素により製造及び精製した修飾オリゴヌクレオチドとアダプターとして作用する５’−アルキン又は５’−アジド修飾オリゴヌクレオチドとの間でクリックライゲーションを実施する。この目的のために、アダプターオリゴヌクレオチドは、好ましくは、固相合成及びかかる合成の終わりで導入される５’修飾を介して製造される。

アルキン修飾分子として、例えば、以下の構造を有する市販の構成要素を使用できる：

クリック反応のための触媒として、金属触媒、好ましくはＣｕ触媒、及び最も好ましくは不均一Ｃｕ（Ｉ）触媒を使用する。特に、欧州特許番号第２４１６８７８号（ＥＰ２４１６８７８Ｂ１）において記載される触媒は、クリック反応のための触媒活性のある銅種の源として供給できる。特に、かかる触媒の詳細な説明が提供されている欧州特許番号第２４１６８７８号の段落番号［００２９］〜［００３１］を参照する。本発明において、クリック反応は、アジドと末端アルキン基との間の形式的な（３＋２）環化付加の銅触媒化変動を含む。アジド／アルキン反応の結果としての１，２，３−トリアゾールの不可逆的な形成は、生物におけるアジド及び末端アルキンの不足により二重直交であり、要求される化学基は小さく（生体分子の環境の妨害を最小限にした組み込み）、該反応は位置選択的であり、１，４位置異性体の排他的形成をもたらす。

次の反応は、アジドと末端アルキンのクリックライゲーションの基礎である

［式中、Ｒ₁及びＲ₂は、クリック反応における第一及び第二のパートナーである］。

クリック反応条件は、例えば前述の先行技術文献から当業者に公知である。通常、クリック反応は、室温又はわずかに高い温度、好ましくは２０〜６０℃、より好ましくは３０〜５０℃、最も好ましくは４０〜４５℃で水性反応混合物中で実施される。温度に依存して、反応は、通常、１０分〜数時間、好ましくは３０分〜３時間、及び最も好ましくは４０〜９０分のインキュベート時間を要求する。反応条件は重要ではなく、クリック産物の製造のために使用される試薬の量及び体積に調整できる。

触媒は、好ましくは不均一Ｃｕ触媒、より好ましくは不均一Ｃｕ（Ｉ）触媒である。しかしながら、他の金属触媒、及び特に他の不均一金属触媒、例えばＺｒ、Ｗ、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｃｏ、Ｔｈ、Ｉｒ；Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ａｇ、Ａｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ及び他の金属イオンが、クリック反応ライゲーションの触媒作用に直接的又は間接的に寄与することが報告されており、本発明の記載内容内でも使用できることに注意すべきである。代わりに、均一なＣｕ（Ｉ）触媒もクリックライゲーションのために使用されうる。不均一Ｃｕ触媒は、元素の銅又は金属−Ｃ−触媒、すなわち、炭素系支持体、例えばそれらに組み込まれたＣｕイオン又はＣｕ（Ｉ）イオンを生成できる元素の銅を有する木炭を含む固体Ｃｕ触媒である。特に好ましい実施形態において、不均一Ｃｕ触媒は、Ｈ．Ｌｉｐｓｈｕｔｚ及びＢ．Ｒ．ＴａｆｔによってＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００６，４５，８２３５−８２３８において記載されるように製造されてよいＣｕ（Ｉ）−Ｃ−触媒である。

不均一触媒は、微粒子触媒、例えば、１０ｎｍ〜１０００μｍ、好ましくは１００μｍ〜８００μｍのサイズを有する粒子からなる不均一触媒であってよい。代わりに、触媒は、多孔質非粒子状触媒、例えばそれらに埋め込まれた触媒活性粒子を有する固体マトリックスであってもよい。

さらなる実施形態において、不均一なＣｕ触媒とは異なる材料、例えば生体分子、好ましくは核酸または核酸類似体を固定化できるクロマトグラフィー材料であるさらなる固体キャリア材料が含まれる。好ましくは、クリック混合物の他の成分からのクリック反応産物の分離及び精製を可能にする材料が含まれる。分離及び精製についての例示的なメカニズムは、サイズ排除又はアフィニティークロマトグラフィーである。

適したクロマトグラフィー材料の例は、イオン交換材料、親水性材料又は疎水性材料である。好ましい実施形態において、親水性材料、例えばシリカゲルは、不均一触媒と組み合わせて使用されうる。他の好ましい実施形態において、疎水性材料、例えばシリカＣ１８又はＣ４又はイオン交換樹脂は、不均一触媒と組み合わせて使用されうる。さらに好ましい実施形態において、固体担体材料は、生体分子、特に核酸及び核酸類似体の固相合成のために使用される樹脂であってよい。

固定化された反応パートナーと溶液中に自由に存在する反応パートナーとの間のクリック反応が、不均一なＣｕ触媒系により効果的に触媒されてよいことが見出された。この戦略は、クリック反応と、最終的に反応混合物中に存在する不純物及び／又は過剰な試薬もしくは塩からの生成物の精製及び／又は分離とを同時に達成することが可能であってよい。

本発明による方法において、反応混合物は追加の金属カチオンを含む。本発明の記載内容内で、「追加の金属カチオン」という用語は、クリック反応中に存在するか又はカチオン形態で現れる触媒金属とは異なる金属カチオンをいう。

好ましい金属カチオンは、アルカリ金属、アルカリ土類金属、又は類似の特性を有する他の二価金属イオン、例えば亜鉛（Ｚｎ²⁺）である。本発明の好ましい実施形態において、反応混合物に添加されるかかる金属カチオン、及び特にかかるアルカリ金属は、Ｎａ⁺とは異なる。本発明の特に好ましい実施形態において、二価のアルカリ土類金属イオン、特にＭｇ²⁺イオンが反応混合物中に存在し、これはアニオン性ＤＮＡリン酸骨格について特に適したカチオンであることが証明されている。本発明の目的のために使用されるさらに好ましい追加のカチオンは、Ｌｉ⁺、Ｋ⁺、及びＺｎ²⁺である。

この目的のために、対応する金属塩及び特にＭｇ²⁺塩が反応混合物に含まれる。本発明に至る研究中に、驚くべきことに、反応混合物への金属カチオン及び特にＭｇ²⁺の添加が、オリゴヌクレオチドのリン酸骨格上の銅種について全ての可能なリガンド位置が追加のカチオンによって占められることが見出された。結果として、反応混合物中の触媒として利用可能な銅種の量が増加し、そして反応速度が著しく改善される。

クリック反応混合物中の追加の金属カチオンの適した量は、１〜２００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは５〜２５ｍｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは１０〜２０ｍｍｏｌ／ｌである。

本発明によるクリック反応において、さらに、触媒金属安定化リガンド、特に、Ｃｕ及び好ましくはＣｕ（Ｉ）安定化リガンドを含むことが好ましい。かかるリガンドとして、公知の金属リガンド、例えばアミン及びポリトリアゾール（Ｔ．Ｒ．Ｃｈａｎ，Ｒ．Ｈｉｌｇｒａｆ，Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ及びＶ．Ｖ．Ｆｏｋｉｎ，ＯｒｇａｎｉｃＬｅｔｔｅｒｓ，２００４，６，２８５３−２８５５．）、特にトリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾールメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）、２−（４−（（ビス（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３，−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）酢酸（ＢＴＴＡＡ）、２−（４−（（ビス（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３，−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エチルスルフェート（ＢＴＴＥＳ）（Ｄ．ＳｏｒｉａｎｏＤｅｌＡｍｏ，Ｗ．Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｊｉａｎｇ，Ｃ．Ｂｅｓａｎｃｅｎｅｙ，Ａ．Ｃ．Ｙａｎ，Ｍ．Ｌｅｖｙ，Ｙ．Ｌｉｕ，Ｆ．Ｌ．Ｍａｒｌｏｗ，Ｐ．Ｗｕ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０，１３２，１６８９３−１６８９９．）、トリス（（１−ベンジル−４−トリアゾリル）メチル）アミン（ＴＢＴＡ）又は類似の金属安定化特性を有するそれらの類似体を、反応混合物中で使用してよい。これらの金属リガンドは、例えばＣｕ（Ｉ）触媒を安定化し、かつ反応性酸素種の形成に対してオリゴヌクレオチドを保護する。さらに、かかる金属リガンドの添加は、クリック反応の反応速度も改善する。

金属リガンドは、１０〜４０００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは５００〜１０００μｍｏｌ／ｌ及び特に好ましくは７００〜９００μｍｏｌ／ｌの量でクリック反応混合物中に含まれる。

さらに好ましい本発明の実施形態において、有機溶媒が反応混合物に添加される。特に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が、反応混合物中に有利に含まれうる。かかる有機溶媒及び特にＤＭＳＯの添加は、２つのオリゴヌクレオチド間のクリック反応の効率に対してさらにプラス効果をもたらす。ＤＭＳＯはオリゴヌクレオチドの二次構造を乱し、したがって反応パートナーの官能基、例えばアジド基及びアルキン基の到達性を改善すると想定される。本発明の記載内容内で、反応混合物への１〜１０％（ｖ／ｖ）の最終含有量でのかかる有機溶媒、特にＤＭＳＯの添加が有用であると考えられ、反応混合物中で２〜８％（ｖ／ｖ）、特に４〜６％（ｖ／ｖ）の最終含有量での有機溶媒の添加が好ましい。

驚くべきことに、追加の金属イオンの存在、特にクリック反応の反応混合物中の対応する二価金属イオンの存在が、クリック反応産物の形成における著しい増加をもたらすことが観察された。かかる二価金属カチオンを添加せずに実施した反応と比較して、クリック産物の収率は、少なくとも２倍又は３倍であってよい。さらに有機溶媒、特にＤＭＳＯ、及びＣｕ安定化リガンドを含む反応混合物を使用することは、性能をさらに改善し、クリック産物の非常に満足のいく結果及び収率を導く。本発明による方法のこれらの効果は、かかるクリック産物の後続反応及び使用に、特にＤＮＡ又はＲＮＡライブラリー調製及び次世代シーケンシングのためのＰＣＲ反応に引き継がれる。

追加の金属イオン、特に二価金属イオン、及びクリックライゲーションの効率のためのいくつかの他の物質の関連性を考慮して、本発明のさらなる主題は、Ｃｕ触媒化反応、好ましくは、不均一Ｃｕ触媒の存在下で実施する反応において一方では末端アルキン基により、他方はアジド基により官能化された分子をカップリングするためにクリック反応で使用するためのアクチベーター組成物である。かかるアクチベーター組成物は、金属カチオンを含む。前記したように、クリック反応混合物へのかかる追加の金属カチオン、好ましくはアルカリ土類金属カチオン及び特に好ましくはＭｇ²⁺イオンの添加は、ＤＮＡ又はＲＮＡリン酸骨格への銅触媒種の結合を妨げる。かかる結合は、かかる金属カチオンを添加することなく生じ、クリック反応に利用可能な触媒の量を減らす。金属カチオン、特に二価金属カチオンの存在により、リン酸骨格上の結合部位をブロックし、触媒として利用可能な銅の量が増加し、反応速度が改善される。

既に詳細に上記で説明したように、Ｃｕ（Ｉ）−安定化リガンドの存在及び／又は有機溶媒、特にＤＭＳＯの存在は、さらに、２つのオリゴヌクレオチド間のクリック反応の効率を改善する。したがって、本発明による好ましいアクチベーター組成物は、二価金属カチオン及び有機溶媒及び少なくとも１つのＣｕ安定化リガンドを含む。特に好ましくは、二価金属カチオンとしてＭｇ²⁺、及びＤＭＳＯ、及びＴＨＰＴＡ、ＢＴＴＡＡ、その類似体又はかかるリガンドの任意の混合物から選択される少なくとも１つのＣｕ安定化リガンドを含むアクチベーター組成物である。

アクチベーター組成物は、クリック反応混合物中で１〜２００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは５〜２５ｍｍｏｌ／ｌ及び特に好ましくは１０〜２０ｍｍｏｌ／ｌの二価金属カチオン、１０〜４０００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは５００〜１０００μｍｏｌ／ｌ及び特に好ましくは７００〜９００μｍｏｌ／ｌのＣｕ安定化リガンド、及び／又は１〜１０％（ｖ／ｖ）、好ましくは２〜８％（ｖ／ｖ）及び特に好ましくは４〜６％（ｖ／ｖ）の有機溶媒、好ましくはＤＭＳＯの濃度を提供する量でこれらのエフェクター分子を含む。

本発明によるアクチベーター組成物は、クリック反応の効率を改善するのに役立つ前記物質の１つ、２つ又は全てを含む組成物として提供されうる。アクチベーター組成物は、エフェクター物質の事前希釈を含む水性組成物であってよい。アクチベーター組成物は、他の溶媒、特にさらなる有機溶媒又は水と有機溶媒との組み合わせも含みうる。アクチベーター組成物は、他の物質、例えば緩衝物質、又はクリック反応の実施中に含まれてよい任意の他の物質をさらに含みうる。

本発明のさらなる目的は、クリックライゲーション試薬キット、例えば、第一の成分として前記で定義された触媒、特にＣｕ触媒及び好ましくは不均一Ｃｕ（Ｉ）触媒、並びに第二の成分として本発明によるアクチベーター組成物を少なくとも含む試薬キットである。より詳細に前記で開示されているように、アクチベーター組成物は、アルキン官能化及びアジド官能化オリゴヌクレオチドのライゲーションにおける銅触媒クリック反応に明確なプラスの効果を有する。したがって、本発明の試薬キットは、本明細書に開示されるクリックライゲーション方法の実施を促進するために、触媒及びアクチベーター組成物のエフェクター分子を一緒に提供する。好ましい実施形態において、クリックライゲーション試薬キットは、アクチベーター組成物として、金属カチオン、好ましくはアルカリ土類金属カチオン及び特にＭｇ²⁺だけでなく、少なくとも１つの有機溶媒及びＣｕ安定化リガンドが存在する、対応する好ましい実施形態を含む。最良の結果を得るために、３つ全てのエフェクター物質を含むアクチベーター組成物が本発明のクリックライゲーション試薬キットに含まれる。

本発明のクリックライゲーション試薬キットに含まれるＣｕ（Ｉ）触媒は、好ましくは、欧州特許番号第２４１６８７８号において記載される不均一触媒である。

任意に、かかる試薬キットは、クリック反応の実施において、必要な成分であり、及び／又は有利であるさらなる物質を含む。前記成分に加えて、本発明のクリックライゲーション試薬キットは、アダプター又はプライマーとして作用しうる少なくとも１つのアジド官能化又はアルキン官能化オリゴヌクレオチドをさらに含みうる。試薬キットは、標識、標識化したクリック官能基、修飾及び非修飾ヌクレオチド、酵素、緩衝液、アダプター及び／又はプライマー、精製のためのさらなるキャリア材料又はクロマトグラフィー材料、好ましくは本発明及びそれらの種々の適用によるクリックライゲーション方法の記載内容において前記した材料を含みうる。前記したように、実施されるべき反応に応じて、アダプター又はプライマーの５’末端にループ及び二本鎖領域を形成する相補配列を含む、アダプター及びプライマーが含まれてよい。

本発明のさらに好ましい実施形態において、クリックライゲーション試薬キットは、クリックライゲーション産物を増幅するための続くＰＣＲ反応のために、ＤＮＡ又はＲＮＡライブラリー調製及びシーケンシングのために、例えば複雑なオリゴヌクレオチド混合物の分析のために要求される物質及び成分をさらに含んでよい。

本発明のさらに他の目的は、本発明のクリック反応の実施を容易にする装置である。かかる装置は、少なくとも１つの反応チャンバーを含み、かかる反応チャンバーは、２つの反応パートナー間のクリック反応を実施するための触媒、好ましくは不均一Ｃｕ触媒を含む。それぞれの装置は開示されており、さらに欧州特許番号第２４１６８７８号において記載されており、かかる開示は、本発明に従って使用できる装置にも適用される。

本発明に従って、クリックライゲーション反応の１つ以上の成分の存在に加えて、前記装置は、前記で定義した追加の金属カチオン、特に二価金属カチオン、好ましくはアルカリ土類金属カチオン及び特にＭｇ²⁺、又は前記したアクチベーター組成物を、かかる装置の１つ以上の反応チャンバー内でさらに含む。クリック反応を非常に小さい体積で実施してよいため、前記装置は、例えば、少なくとも１つの反応チャンバーとして作用することができる１つ以上の区画を含む、マイクロタイタープレートウェル、ピペットチップ又はスピンカラムであってよい。本発明に従って使用される金属イオン又は他の好ましい成分は、クリック反応が実施される少なくとも１つの反応チャンバーにおけるかかる装置中に存在する。

本発明の記載内容内で、前記した本発明の方法、組成物、試薬キット及び装置の本質的な要求に適合する限り、かかるクリック反応を実施する全ての異なる方法及びかかる目的のために記載された全ての物質が含まれることを理解すべきである。したがって、本明細書において明示的に記載されていないクリック反応の他の全ての形態、変法、及び改良は、触媒化クリックライゲーションのためのクリック反応混合物が、本発明によりクリック反応の効率及び収率に対してかなり有利な効果を有することが示された追加の金属イオン及び特に二価の金属カチオンを含む限り、本発明の記載内容内でも適用できるとみなされる。これらのカチオン、特にアルカリ土類カチオン及び最も好ましくはＭｇ²⁺イオンの存在が本発明の目的を解決するために必須である一方で、クリック反応の他の態様は、例えば、クリックライゲーションによって結合されるべき分子の性質、実際に使用される触媒、反応条件及び意図される使用、並びに実施されるべきそれぞれの後続反応に非常に依存しうる。

後続反応で使用されうるクリック反応産物を提供するためにクリック反応を介して、分子、好ましくはオリゴヌクレオチドを効率的に連結するための方法、組成物、試薬キット及び装置の使用が、本発明のさらなる目的である。かかる後続反応としては、高純度を有し、かかる後続反応を実施するために十分なリード高収率で提供されるライゲーション産物を要求する全ての反応が含まれる。かかる後続反応の例は、特に複雑なオリゴヌクレオチド混合物を分析する場合に、ＤＮＡ又はＲＮＡの試料を分析するためのＰＣＲ又は他の増幅方法である。本発明は、「骨格模倣物」を構成するオリゴヌクレオチドの、すなわちその骨格中にホスホジエステル結合の非天然の代替物を含むＲＮＡ又はＤＮＡ分子のクリックライゲーション産物を得ることが可能である。かかる物質は完全に生体適合性であることが見出されているため、かかる分子の増幅は非常に効果的であり、かつ特にいわゆる次世代シーケンシング適用に有用である。

前記した条件が例えばＲＮＡシーケンシングライブラリー調製に適用される場合に、第二のアダプターを効率的に一本鎖ｃＤＮＡにクリック結合でき、従って第二の鎖の合成が不要になり、合計の調製時間が短縮される。クリック反応の生体直交性及び特異性によって、クリックライゲーションは、もっぱらアジド官能化分子とアルキン官能化分子との間で生じる。アジドは、天然のデオキシヌクレオチドが、低濃度の例えば断片を末端化する３’−アジド−２’，３’−ジデオキシヌクレオチドで補われるため、ｃＤＮＡ合成中に推測統計学的に導入される。５’−アルキン修飾アダプターオリゴは、固相ＤＮＡ合成により製造でき、かつ精製することなしに使用できる。それというのも、５’−アルキンは、固相合成の最後に組み込まれ、短い非標識鎖をクリック結合させることができないからである。

本発明のクリック概念は、特に好ましくはＤＮＡライブラリー調製プロトコルに適用されうる。ＤＮＡ断片は、一般に、ＤＮＡポリメラーゼによる平滑化及びｄＡテーリングによって修飾されて、より効率的な続く酵素によるライゲーションを可能にする。平滑化又はｄＡテーリング中に天然のｄＮＴＰを例えば３’−アジド−２’，３’−ジデオキシヌクレオチドに置き換えることは、５’−アルキンアダプターオリゴヌクレオチドへのクリックライゲーションのためにアジド基を導入する。

例えば上記のＲｏｕｔｈらにより記載されたＣｌｉｃｋＳｅｑ技術の記載内容における本発明の適用は、複雑なオリゴヌクレオチド混合物を分析する場合にも非常に価値がある。ＲＮＡ−ウイルスＲＮＡについての並列分析は、多重ＲＴ−ｑＰＣＲを実施することにより行うことができる。この目的のために、いくつかのウイルスＲＮＡ特異的プライマー（例えば、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎等）が、逆転写反応（例えばＣｌｉｃｋＡｄａｐｔ反応）のために試料中のＲＮＡに付加される。アジド末端化ｃＤＮＡ断片は、続くＰＣＲ増幅のためのプライマー結合部位を提供するためにアダプターにクリック結合される。クリックライゲーションの特異性によって、人為的な組み換えは生じず、検出ごとの個別のｑＰＣＲセットアップは不要になる。したがって、前記技術は、大規模な並列ＲＴ−ｑＰＣＲ適用の基礎を提供する。

この技術の適用範囲は、シーケンシング、ライゲーション法によるシーケンシング（例えばＡＢＩ社からの「ＳｏｌｉｄＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」）、リガーゼ連鎖反応、クローニング法（組換えＤＮＡを実施するため）、及び遺伝子合成のための全ての他のＤＮＡ及びＲＮＡライブラリー調製キットを含み、２つ以上の分子が、クリック官能基を介して連結される。部分的に一般的に及び部分的により詳細に、可能な適用が上記に記載されている一方で、本明細書において記載される条件下で実施されるクリックライゲーションを含む他の反応も本発明の範囲内に含まれることを理解すべきである。

図１は、天然のホスホジエステル（Ａ）と比較した、クリックケミストリーによって生じたいくつかのトリアゾール骨格模倣物（Ｂ〜Ｄ）の構造を示す。ＰＣＲ増幅の記載内容における続く実施例はトリアゾール骨格模倣物（Ｂ）のみに示される。図２ａ）は本発明における対象の方法の１つである概略的なＣｌｉｃｋＡｄａｐｔＲＮＡライブラリー調製を示す。これは、ｃＤＮＡ合成、断片化及びアダプタークリックライゲーションの組み合わせを含む。ｓｓＤＮＡを効率的にクリック結合できるため、第二の鎖合成を省略する。図２ｂ）は、図２ａ）と同一のＣｌｉｃｋＡｄａｐｔＲＮＡライブラリー調製を示すが、５’末端に二本鎖ループを含む第一のアダプターが含まれる。図３は、本発明における対象のさらなる方法である概略的なＣｌｉｃｋＡｄａｐｔＤＮＡライブラリー調製のワークフローを示す。試料の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを断片化し、標準ＤＮＡライブラリー調製において平滑化及びｄＡテーリングにより断片を操作する。例えば天然のｄＮＴＰの代わりに３’−アジド−２’，３’−ジデオキシヌクレオチドを使用することにより、３’アジド末端化ｄｓＤＮＡを得る。断片精製（サイズ選択を含む）により過剰なヌクレオチドを除去した後に、５’アルキン基を介して第一のアダプターを断片にクリックする。第二のアダプターを、ＰＣＲ増幅中に、第一のアダプターの５’末端の逆相補であり、増幅のための第一のプライマーとして作用する短い（約１２ｂｐの）３’配列を介して導入する。図４は、クリック反応の効率及び収率に対する種々のカチオンの影響を示す。図５は、異なるＤＮＡポリメラーゼを使用する３’−アジド末端化ｃＤＮＡ及び５’−アルキンアダプターから製造したｃＤＮＡのＰＣＲ産物を示す。図６は、図５の増幅させたクリックライゲーションによる産物のサンガーシーケンシングの結果を示す。図７は、酵素による取り込みおよびその後のクリックライゲーションでの使用のためのアジドおよびアルキン修飾ヌクレオチドの例示的な構造を示す。図８は、クリックライゲーションのためのアダプターオリゴヌクレオチドの例示的な５’末端の構造を示す（Ａ〜Ｃ）。５’−アルキン修飾オリゴヌクレオチド（塩基Ｂ＝構造Ａのチミンを有する）を実施例１、２及び４について使用した（図４、５及び９）。構造Ｂを、続く実施例１及び４（図４及び９）において使用した。図９は、低オリゴ濃度についてのオリゴ−オリゴクリック反応の収率を示す。図１０は、ｅＧＦＰｍＲＮＡのクリックライブラリー調製からの鋳型でのＰＣＲ試料の臭化エチジウムで染色したアガロースゲル（ＴＡＥ中３％）を示す。鋳型ｃＤＮＡを、逆転写（ｒｔ）中に異なるヌクレオチド混合物（ｄＮＴＰ定数５００μＭ、種々のＡｚｄｄＮＴＰ）を使用して生成した。Ｍ＝低分子量ＤＮＡマーカー（ＮＥＢ）、１＝ｄＮＴＰのみ、２＝１００μＭのＡｚｄｄＮＴＰ、３＝５０μＭのＡｚｄｄＮＴＰ、４＝２５μＭのＡｚｄｄＮＴＰ、５＝１０μＭのＡｚｄｄＮＴＰ。図１１は、添加剤としてＭｇＳＯ₄を使用するオリゴ色素ＣｕＡＡＣ反応の分析ＨＰＬクロマトグラムを示す。図１２は、２６０ｎｍ検出でのオリゴ−オリゴクリック粗反応混合物からのＨＰＬＣ分析結果を示す。５．６分でのピークはアルキン修飾オリゴに対応し、７．６分でのピークはアジド修飾オリゴに対応する。クリック反応後の新たな２つのピーク（６．１分及び６．４分）は、クリック産物の正確な質量を有する。統合されたピークの約８０％でＥＳＩ−ＭＳがクリック産物の質量を確認した。

次の実施例は、説明の目的のために提供される。

実施例１：クリック産物の調製
２００μＬの反応バイアル中で、単一の反応体ペレット（６００〜８００μｍ、元素の銅を含む）を１２．５μＬの反応混合物と合し、そして４５℃で６０分間インキュベートした。反応混合物を、４ｍＭのＴＨＰＴＡ、５５μＭのアルキンオリゴ１、５５μＭのアジドオリゴ１から構成し、カチオンの影響を調べると１６ｍＭの一価カチオン（又は８ｍＭの二価カチオン）であった。ｄＨ₂Ｏを使用して、適宜最終的に１２．５μＬに体積を調整した。

インキュベート後に、試料を短時間にスピンダウンさせ、そしてその上清を新たなバイアルに移して反応を停止させた。試料を、ＴＡＥ緩衝液（２０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭの酢酸、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）中で調製した２．５％アガロースゲル（１０×１５ｃｍ）上で分析した。

試料を、２０％パープルローディングダイ（ＮＥＢ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓＩｎｃ．）で調製し、それに応じて低分子量ＤＮＡラダー（２５〜７６６ｂｐ、ＮＥＢ、Ｎ３２３３）を調製した；通常、０．５μＬのマーカーを、５μＬのローディング容量で使用した。ゲルを、一定の電力（１０Ｗ、最大５００Ｖ、最大１００ｍＡ）を適用して６０分間ＴＡＥ緩衝液で泳動させた。そして、ゲルを、新たに調製した１：１００００の臭化エチジウム希釈液で１５分間インキュベートし、そしてｄＨ₂Ｏで１５分間脱色した。視覚化のために、ＧｅｌＤｏｃＥＺＩｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用した。

オリゴヌクレオチド

この実験において使用した非理想的クリック条件（ＴＨＰＴＡが多すぎ、銅源が十分でない）により、アルカリ（土類）金属を添加するカチオン添加の影響が明らかになる。図４は、２．５％ゲルのオリゴヌクレオチドのクリック反応、並びにクリック効率及び産物収率に対する異なるカチオンの影響を示す。追加のカチオンが存在しない場合に（スロット１）、５％未満のクリック産物の収率を前記条件下で観察した。Ｍｇ²⁺イオン（８ｍＭ）の添加により、収率を約３０％まで改善させた。比較として、１６ｍＭの一価カチオン濃度も分析したが、収率のわずかな改善のみを観察した（スロット３〜５、収率５〜１０％）。

実施例２：クリック産物のＰＣＲ増幅
ＣｌｉｃｋＡｄａｐｔプロトコルの実現可能性は、モデルＲＮＡ配列についての例示である。ＲＮＡを、プライマー１にハイブリダイズさせ、そしてＭｕＬＶ逆転写酵素を使用して、２００μＭのｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及び３’−アジド−ｄｄＡＴＰの存在下で逆転写した。ヌクレオチド及び酵素を、製造業者の指示に従ってヌクレオチド除去キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡを精製することにより除去した。

アルキンオリゴ１を、合計１２．５μＬの反応混合液中で単一反応体ペレット（６００〜８００μｍ、元素の銅を含む）を有する２００μＬの反応バイアル中で精製したｃＤＮＡにクリックし、そして４５℃で６０分間インキュベートした。

反応混合物は、８００μＭのＴＨＰＴＡ、２０ｍＭのＭｇＣｌ₂、５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ、７μＭのアルキンオリゴ１及び約４μＭの精製ｃＤＮＡから構成されていた。ｄＨ₂Ｏを使用して、適宜最終的に１２．５μＬに体積を調整した。

インキュベート後に、試料を短時間にスピンダウンさせ、そしてその上清を新たなバイアルに移して反応を停止させた。粗クリック反応物を、さらに精製することなくＰＣＲ増幅のために１：１０００、１：５０００及び１：１００００（最大４ｎＭ、０．８ｎＭ及び０．４ｎＭ）に希釈した。

２００μＬの反応バイアル中で、ＰＣＲ増幅物を合計容量２０μＬで調製した。クリック反応物希釈液を、２００μＭのｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌのプライマー２及びプライマー３、並びに１単位のポリメラーゼと合した。種々のポリメラーゼについて、Ｐｆｕ、Ｐｈｕｓｉｏｎ、Ｑ５、ＯｎｅＴａｑ及びＤｒｅａｍＴａｑ緩衝液を、製造者の推奨に従って使用した。試料を、サーモサイクラー（ＢｉｏＲａｄ）で熱サイクリングプログラムにかけた。

標準的なサイクリング条件として、次の条件を使用した：

Ｐｆｕポリメラーゼについて、種々の鋳型希釈及び代わりのサイクリング条件を検討した：

インキュベート後に、試料を、短時間にスピンダウンさせ、そしてそのアリコートを、ＴＡＥ緩衝液（２０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭの酢酸、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）中で調製した３％アガロースゲル（１０×１５ｃｍ）上で分析した。

試料を、２０％パープルローディングダイ（ＮＥＢ）で調製し、それに応じて低分子量ＤＮＡラダー（２５〜７６６ｂｐ、ＮＥＢ、Ｎ３２３３）を調製した；通常、０．５μＬのマーカーを、５μＬのローディング容量で使用した。ゲルを、一定の電力（１０Ｗ、最大５００Ｖ、最大１００ｍＡ）を適用して６０分間ＴＡＥ緩衝液で泳動させた。そして、ゲルを、新たに調製した１：１００００の臭化エチジウム希釈液で１５分間インキュベートし、そしてｄＨ₂Ｏで１５分間脱色した。視覚化のために、ＧｅｌＤｏｃＥＺＩｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用した。

図５Ａは、示されているモデルＲＮＡについて実施したＣｌｉｃｋＡｄａｐｔワークフロー（前記した）を示す。ワークフローは、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写を含む。天然のｄＡＴＰを３’−ＡｚｄｄＡＴＰに置き換えることによって、ｃＤＮＡを３’−アジドで末端化する。ｃＤＮＡの精製により過剰なヌクレオチドを除去した後に、５’−アルキンアダプターを３’−アジドにクリック結合し、そして粗反応混合物をＰＣＲの鋳型として使用する。

図５Ｂは、５ＡにおけるモデルＲＮＡについてのＣｌｉｃｋＡｄａｐｔワークフローに従って処理したＰＣＲ試料の臭化エチジウムで染色したアガロースゲルである。トリアゾール含有鋳型が異なる条件下で種々のポリメラーゼによって増幅されるため、これは非天然の骨格模倣物の生体適合性を示す。

オリゴヌクレオチド

実施例３：増幅産物の配列決定
増幅産物を、核酸中の核酸塩基の配列を決定するプロセスによって分析した。含まれているアダプター配列は、固定化、配列決定又はさらなる増幅のために、相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする。

図６は、実施例２の増幅産物の１つのサンガーシーケンシングの結果を示す。ＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼを使用して、トリアゾール骨格修飾の位置で又はその近くで変異を観察できなかったことを測定した。この結果は、クリック反応産物がＰＣＲ反応中にうまく含まれて、大量のＰＣＲ産物を高い効率及び精度で提供できることを示す。

実施例４：反応体（銅源）の有無での低濃度クリックライゲーション
２００μＬの反応バイアル中で、２つの反応体ペレット（６００〜８００μｍ、元素の銅を含む；試料１）又は反応体ペレットなし（試料２）を１２．５μＬの反応混合物と合し、そして４５℃で６０分間インキュベートした。

反応混合物は、８００μＭのＴＨＰＴＡ、２０ｍＭのＭｇＣｌ₂、ｄＨ₂Ｏ中で７μＭのアルキンオリゴ１及び７μＭのアジドオリゴ１から構成されていた。

インキュベート後に、試料を短時間にスピンダウンさせ、そしてその上清を新たなバイアルに移して反応を停止させた。試料を、ＴＡＥ緩衝液（２０ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍＭの酢酸、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）中で調製した３％アガロースゲル（１０×１５ｃｍ）上で分析した。

オリゴヌクレオチド

この実施例の結果を図９において示す。反応体が存在する場合にこの実施例のクリック条件を使用して６０分後に３６％の収率を得た。反応体を省略した場合に、生成物は観察されなかった。

実施例５：ＩＶＴｍＲＮＡを使用したＲＮＡライブラリー調製プロトコル
ここでは、ｅＧＦＰ遺伝子をコードする精製したｉｎｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡを使用したプロトコル開発中に得られたライブラリー調製プロトコルの詳細な実験条件を説明する。

逆転写
２００μＬのＲＮａｓｅｆｒｅｅｔｕｂｅ中で、２５０ｎｇのＩＶＴｍＲＮＡを、１００ｐｍｏｌ部分ランダム化プライマー、１×反応緩衝液、１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）、５００μＭのｄＮＴＰ、０〜１００μＭのＡｚｄｄＮＴＰ及び２００単位の逆転写酵素と合した。

穏やかにピペッティングすることにより成分を混合し、そしてサーモサイクラー中で３分間６５℃に加熱し、そして４℃に冷却した。残りの成分を追加するために、マスター混合物（６つのセットアップ用）を準備した：

それぞれのハイブリッド化しセットアップ（１〜５）に、室温（２３℃）で１０μＬのマスター混合物を添加し、そしてピペッティングにより混合した後に、逆転写物を、サーモサイクラー中で２５℃で１０分間、４２℃（ｐｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔＩＩｒｔ酵素について最適な温度）で５０分間、そして６５℃（変性）で２０分間インキュベートした。４℃に冷却した後に、５μＬのＮａＯＨ_(aq)（１Ｍ）をそれぞれのセットアップに添加し、そして９５℃で１５分間、続いて４℃でインキュベートした。混合物を５μＬのＨＣｌ_(aq)（１Ｍ）の添加により中和し、そして製造元の推奨に従ってＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製キット（１５０μＬのＰＢ緩衝液の添加、３０μＬのＨ₂Ｏを使用した最終溶出ステップ）を使用して精製した。

逆転写中にＡｚｄｄＮＴＰ濃度が増加すると、ｃＤＮＡ収率が減少する。ＡｚｄｄＮＴＰ量を増加すると断片サイズが小さくなり、ｃＤＮＡ精製中に１００ｍｅｒ未満の断片が除去されると想定する。

クリックライゲーション
２００μＬの反応管中で、２つの反応体ペレットを、それぞれのセットアップ（１〜５）について１．２５μＬのアクチベーター（２００ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ水溶液中で８ｍＭのＴＨＰＴＡ）（１０ｘ）、１μＬのアルキンアダプターオリゴ（１００μＭ）及び１０．２５μＬの精製ｃＤＮＡと合した。その混合物をサーモミキサー中で４５℃、６００ｒｐｍで、６０分間インキュベートした。そして、それぞれの試料を短時間スピンダウンさせ、その上清を新たなバイアルに移した。

ＰＣＲ
２００μＬの反応管中で、２０μＬのＰＣＲを、０．５μＬのクリック反応物、１０ｐｍｏｌのプライマー、Ｐｈｕｓｉｏｎ緩衝液中で０．５単位のＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ、及び２００μＭのｄＮＴＰを合することにより調製した。

６つのセットアップのためのマスター混合物を準備した：

その成分を穏やかにピペッティングすることにより混合し、１９．５μＬのマスター混合物を、０．５μＬの完成したクリック反応物に添加し（ペレットなし！）、そして混合した。得られた混合物を、次の温度プログラムを適用したサーモサイクラー中でインキュベートした：

それぞれのＰＣＲ試料５μＬをアガロースゲル電気泳動により分析した。試料を、最初の逆転写中にｄＮＴＰのみ（セットアップ１、レーン１）で開始してロードし、１８０ｂｐの弱い単一バンド及びプライマー（約３５ｂｐ）を提供した。逆転写中のＡｚｄｄＮＴＰ取り込みから生じたｃＤＮＡからのＰＣＲ試料は、１００ｂｐ（精製方法のサイズカットオフ）〜７００ｂｐ（レーン５）のスメア（レーン２〜５、セットアップ５〜２）をもたらした。ＡｚｄｄＮＴＰ量が逆転写中に５０μＭから１０μＭに減少したため（レーン３〜５）、断片サイズ分布は、レーン３〜５から増加するように見えた。臭化エチジウムで染色したアガロースゲルを図１０に示す。

オリゴヌクレオチド

実施例６：金属カチオンを使用したオリゴ染色クリック反応
１５００μＬの反応バイアル中で、４つの反応体ペレットを２７．９μＬの反応混合物と合し、４５℃で６０分間インキュベートした。

反応混合物は、１７．９ｍＭのＭｇＳＯ₄、７１．７μＭのＳＰ２−オリゴ、１．８ｍＭのＴＨＰＴＡ、２．９μＬのＤＭＳＯ中で１４４μＭのＥｔｅｒｎｅｏｎ−Ｒｅｄ６４５アジド、及び２５μＬのＨ₂Ｏからなった。

インキュベート後に、試料を短時間にスピンダウンさせ、そしてその上清を新たなバイアルに移した。試料のアリコートをｄＨ₂Ｏで希釈し、そして分析ＨＰＬＣで分析した。分析ＲＰ−ＨＰＬＣを、ＷＡＴＥＲＳからのＸＢｒｉｄｇｅ^TM ＯＳＴＣ１８カラム（２．５μｍ、４．６×５０ｍｍ）を備えた分析ＨＰＬＣＷＡＴＥＲＳＡｌｌｉａｎｃｅ（ｅ２６９５ＳｅｐａｒａｔｉｏｎＭｏｄｕｌｅ、２９９８ＰｈｏｔｏｄｉｏｄｅＡｒｒａｙＤｅｔｅｃｔｏｒ）で実施した。１．５ｍＬ／分の流量及び４０℃のカラム温度を使用して、次の勾配をクリック反応物の分離のために使用した：８分で０〜３０％Ｂ、１０分後に８５％Ｂ、１１分で１００％Ｂ。緩衝液Ａ：水中で０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ＝７、緩衝液Ｂ：８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中で０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ＝７。２２０〜６８０ｎｍの検出範囲を操作のために使用した。

アルキン修飾オリゴヌクレオチドを、反応体ペレット及びリガンドからの銅に加えて、添加剤としてＭｇＳＯ₄を使用してＥｔｅｒｎｅｏｎＲｅｄ６４５アジドと反応させた。ＭｇＳＯ₄の存在下で、６０分間のインキュベート後の粗反応物について８５％のクリック産物変換収率が得られた（図１１）。

実施例７：オリゴ−オリゴクリックのＨＰＬクロマトグラム
２００μＬの反応バイアル中で、１つの反応体ペレット（６００〜８００μｍ、元素の銅を含む）を６．７μＬの反応混合物と合し、そして４５℃で６０分間インキュベートした。反応混合物は、８００μＭのＴＨＰＴＡ、２０ｍＭのＭｇＣｌ₂、４５５μＭのアルキンオリゴビオチン、及び５％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を有するｄＨ₂Ｏ中で４５０μＭのアジドオリゴビオチンからなった。

アルキン修飾オリゴヌクレオチドの保持時間（Ｒｔ＝５．６２分）がアジド修飾オリゴヌクレオチド（Ｒｔ＝７．６４分）とはかなり異なるため、単一アルキン修飾オリゴヌクレオチドと単一アジド修飾オリゴヌクレオチドとの間の反応を分析ＨＰＬＣにより調査した。４５℃で６０分後に、ほぼ完全な量のアジド修飾オリゴヌクレオチドを消費した。２つの主な新しいピークを６．１０分及び６．３８分で観察し、続くＥＳＩ−ＭＳにおいて所望のクリック産物の質量があった。わずかに過剰なアルキン修飾オリゴヌクレオチドによって、アルキンオリゴの明確なピークを反応の終了時（５．６１８分）で観察した。

統合されたピークのピークテーブルを図１２において示す。

オリゴヌクレオチド

Claims

クリックライゲーション反応で第一の分子を第二の分子に結合するための方法において、第一の分子が、アルキン基である第一のクリック官能基を含み、かつ第二の分子が、アジド基である第二のクリック官能基を含み、前記方法が、触媒の存在下で反応混合物中で第一の分子と第二の分子との接触を含む方法であって、クリック反応が反応混合物中で追加の金属カチオンの存在下で実施されることを特徴とする、前記方法。
追加のアルカリ金属カチオン又はアルカリ土類金属カチオンとして、好ましくはＬｉ⁺、Ｋ⁺、Ｍｇ²⁺、又はＺｎ²⁺が、クリック反応混合物中に存在する、請求項１に記載の方法。
前記金属カチオンが、１〜２００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは５〜２５ｍｍｏｌ／ｌ、及び最も好ましくは１０〜２０ｍｍｏｌ／ｌの量でクリック反応混合物中に含まれる、請求項１又は２に記載の方法。
前記クリック反応混合物が、有機溶媒、好ましくはＤＭＳＯ、及び／又は好ましくはトリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）、２−（４−（（ビス（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）酢酸（ＢＴＴＡＡ）、トリス（（１−ベンジル−４−トリアゾリル）メチル）アミン（ＴＢＴＡ）、２−（４−（（ビス（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３，−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾリル−１−イル）エチルスルフェート（ＢＴＴＥＳ）又はそれらの類似体、特に他の三座型のポリトリアゾールの少なくとも１つから選択されるＣｕ安定化リガンドを含む、請求項１、２又は３のいずれか１項に記載の方法。
前記有機溶媒が、２〜１０％（ｖ／ｖ）、好ましくは４〜６％（ｖ／ｖ）の量でクリック反応混合物中に含まれ、及び／又はＣｕ（Ｉ）−安定化リガンドが、１０〜４０００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは５００〜１０００μｍｏｌ／ｌの量でクリック反応混合物中に含まれる、請求項４に記載の方法。
前記触媒が、Ｃｕ触媒、好ましくは不均一Ｃｕ触媒である、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
前記第一の分子及び前記第二の分子の少なくとも１つが、生体分子、好ましくはヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、アミノ酸、ペプチド、糖及び脂質から選択される生体分子であり、かつ特に好ましくは第一の分子と第二の分子の双方がオリゴヌクレオチドである、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
前記第一の分子及び前記第二の分子の少なくとも１つが、検出可能な標識を有する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
クリックライゲーション反応において使用するためのアクチベーター組成物であって、アルキン基である第一のクリック官能基を含む第一の分子とアジド基である第二のクリック官能基を含む第二の分子とが、触媒、例えば不均一Ｃｕ触媒の存在下で結合され、アクチベーター混合物が、追加の金属カチオン及びさらに有機溶媒及び／又はＣｕ安定化リガンドを含む、前記アクチベーター組成物。
二価の金属カチオンが、アルカリ土類金属カチオン、好ましくはＭｇ²⁺であり、及び／又は前記Ｃｕ安定化リガンドが、トリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）、２−（４−（（ビス（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）酢酸（ＢＴＴＡＡ）、トリス（（１−ベンジル−４−トリアゾリル）メチル）アミン（ＴＢＴＡ）、２−（４−（（ビス（（１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１Ｈ−１，２，３，−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾリル−１−イル）エチルスルフェート（ＢＴＴＥＳ）又はそれらの類似体、特に他の三座型のポリトリアゾールの少なくとも１つから選択され、及び／又は有機溶媒が、ＤＭＳＯである、請求項９に記載のアクチベーター組成物。
前記金属カチオンを１〜２００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは５〜２５ｍｍｏｌ／ｌの量で、及び／又は前記有機溶媒を２〜１０％（ｖ／ｖ）、好ましくは４〜６％（ｖ／ｖ）の量で、及び／又は前記Ｃｕ安定化リガンドを１０〜４０００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは５００〜１０００μｍｏｌ／ｌの量で含む、請求項９又は１０に記載のアクチベーター組成物。
第一の成分として不均一Ｃｕ触媒を、及び第二の成分として請求項９から１１までのいずれか１項に記載のアクチベーター組成物を含む、クリックライゲーション試薬キット。
アルキン基である第一のクリック官能基を含む第一の分子、アジド基である第二のクリック官能基を含む第二の分子、緩衝液、溶媒、酵素、修飾及び／又は非修飾ヌクレオチド、５’末端に二本鎖ループを任意に含む（インデックス）プライマー及び／又はアダプター、並びに任意にクロマトグラフィー材料からなる群から好ましくは選択されるクリック反応の１種以上のさらなる成分を含む、請求項１２に記載のクリックライゲーション試薬キット。
第一の分子を第二の分子に結合するためのクリックライゲーション反応のための不均一Ｃｕ触媒を含む少なくとも１つの反応チャンバーを有する装置であって、第一の分子がアルキン基である第一のクリック官能基を含み、第二の分子がアジド基である第二のクリック官能基、及び任意にさらに固体キャリア材料を含み、少なくとも装置の１つの反応チャンバーにおいて金属カチオン又は請求項９から１１までのいずれか１項記載のアクチベーター組成物が存在する、前記装置。
ＲＮＡ又はＤＮＡ増幅、ＲＮＡ又はＤＮＡ標識方法及びＲＮＡ又はＤＮＡシーケンシング方法から選択される後続反応を任意にさらに含む、クリック反応産物を提供するための、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法、請求項９から１１までのいずれか１項に記載のアクチベーター組成物、請求項１２又は１３に記載のクリックライゲーション試薬キット、又は請求項１４に記載の装置の使用。