BR112020004041A2

BR112020004041A2 - ligação com base click

Info

Publication number: BR112020004041A2
Application number: BR112020004041-0A
Authority: BR
Inventors: Thomas Frischmuth; Sascha Serdjukow
Original assignee: Baseclick Gmbh
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2020-09-08
Also published as: AU2018338781A1; KR20200057708A; AU2018338781B2; EP3688004A1; WO2019063803A1; CA3070514A1; CN111183144A; US20200361984A1; JP2020536524A

Abstract

A presente invenção refere-se a métodos e reagentes para acoplamento de moléculas através de uma chamada reação click na presença de um catalisador e um cátion de metal adequados. Ainda, a invenção refere-se a uma composição ativadora para tal reação de ligação, um estojo de reagente de ligação click, um dispositivo para realização de tal reação de ligação click e o uso de tais método, composição, estojo de reagente e dispositivo para melhorar a eficiência de acoplamento de moléculas através de uma reação click, especialmente no contexto de métodos de sequenciamento de ácido nucleico de próxima geração.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "LIGAÇÃO COM BASE CLICK".

DESCRIÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a métodos e reagentes para acoplamento de moléculas através de uma chamada reação click na presença de um catalisador adequado. Ainda, a invenção refere-se a uma composição ativadora para tal reação de ligação click, um estojo de reagente para ligação click, um dispositivo para realização de tal reação de ligação click e ao uso de tal método, composição, estojo de reagente e dispositivo para melhorar a eficiência de acoplamento de moléculas através de uma reação click, especialmente no contexto de métodos de sequenciamento de ácido nucleico de próxima reação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Em 2001/2002 os grupos de Sharpless e Meldal definiram independentemente o conceito de "Química click" e os critérios para uma transformação ser considerada uma reação "Click" (Sharpless, K.B. e outros, Angew. Chem. 2002, 114, 2708; Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596, Meldal, M. e outros, J. Org. Chem., 2002, 67, 3057). Desde então, a reação catalisada por cobre de azidas com alcinos para dar 1,2,3-triazóis, uma variação da cicloadição Huisgen 1,3-dipolar (R. Huisgen, 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry (Ed.: A. Padwa), Wiley, New York, 1984), se tornou a reação Click mais amplamente usada. Como resultado de suas condições suaves e alta eficiência, essa reação encontrou uma miríade de aplicações em biologia e ciências de material, tais como, por exemplo, propósitos de marcação de DNA (Gramlich, P.M.A. e outros, Postsynthetic DNA Modification through the Copper- Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition Reaction. Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 8350).

[003] A análise rápida de material genético quanto a uma sequência-alvo específica, por exemplo, quanto à presença de polimorfismo de nucleotídeo único, à presença de um certo gene tal como um gene de resistência ou de mRNA, requer ferramentas fáceis de usar, eficientes e confiáveis. Um grande problema é a necessidade de detectar DNA ou RNA de interesse diretamente em amostras biológicas pequenas tal como sangue de paciente ou plantas. Essas proveem o analito apenas em quantidades pequenas. A fim de obter a sensibilidade requerida, uma etapa de amplificação é geralmente requerida onde ou o analito de ácido nucleico é amplificado antes da análise ou um método de detecção é usado em que o sinal de detecção pequeno, diretamente obtido a partir do analito de DNA/RNA, é amplificado.

[004] Métodos para a amplificação do analito de ácido nucleico incluem PCR e outros protocolos de amplificação de ácido nucleico. Amplificação por PCR tem a grande vantagem que, dentro de um grupo de filamentos de DNA diferentes obtidos de um material biológico, apenas a sequência de DNA de interesse é amplificada. Essa é a base para uma análise confiável de genes únicos em amostras biológicas complexas.

[005] Ligação enzimática de oligonucleotídeos é um procedimento padrão em vários protocolos para manipulação de oligonucleotídeo e é requerida para sequenciamento, clonagem e muitas outras tecnologias à base de DNA e RNA. As enzimas envolvidas na catálise da reação de ligação formam ligações fosfodiéster entre extremidades 5’-fosfato de DNA ou RNA e extremidades 3’-hidroxila. A fim de funcionar eficientemente, as ligases requerem oligonucleotídeos de filamento duplo, que são preferivelmente pré-organizados através do uso de extremidades coesas ou até mesmo filamentos em ponte. A reação de ligação pode unir qualquer extremidade 5’-fosfato com qualquer 3- hidroxila, uma vez que a reação não é específica de sequência. Essa falta de especificidade de substrato é uma grande vantagem para uma aplicação geral ampla de ligações enzimáticas e contribuiu para sua aplicação ampla. Ironicamente, há ao mesmo tempo um grande desafio para muitas aplicações de sequenciamento uma vez que artefatos de sequência são gerados a partir da união não específica de fragmentos de oligonucleotídeo. Uma vez que quase toda tecnologia de sequenciamento requer ligação de uma sequência de oligonucleotídeo conhecida, os chamados adaptadores, para ligação de iniciador durante sequenciamento e amplificação por PCR, isso pode gerar recombinação artefatual, formação de quimera de sequência (filamentos de DNA-RNA para sequenciamento de RNA) e dímeros de adaptador (um par de adaptadores ligados sem nenhuma sequência de inserção).

[006] A fim de reduzir artefatos de sequência, a extremidade 3’ do iniciador é bloqueada através da inserção de um 2’,3’- didesoxinucleotídeo (ddNTP). Isso evita formação de dímeros de adaptador e assegura ligação direcional correta, mas não pode influenciar recombinação artefatual e formação de quimera. Esses efeitos precisam ser corrigidos usando algoritmos especiais durante geração de contig (um conjunto de leituras de dados de sequência de sobreposição) a partir de leituras de sequência.

[007] A presente invenção refere-se a um método baseado em química click para a união não enzimática de moléculas, especialmente oligonucleotídeos, que é eficiente, específico de sítio e é compatível com amplificação por PCR. A reação entre dois oligonucleotídeos de filamento simples não modelados é mais eficiente do que reação de ligação enzimática comparável, desta maneira, por exemplo, eliminando a necessidade de síntese de segundo filamento em, por exemplo, sequenciamento de RNA.

[008] A preparação de oligonucleotídeos contendo alcino ou azida tem sido estudada extensivamente. De interesse especial para a presente invenção são "imitadores de estrutura principal", isto é,

alternativas não naturais para a ligação fosfodiéster, que podem ser gerados através de cicloadições de azida-alcino catalisadas por cobre (CuAAC). Alguns dos oligonucleotídeos contendo triazol resultantes podem ser convertidos em estruturas principais de fosfodiéster naturais através de enzimas polimerase sem mutação da sequência e então ser completamente biocompatíveis (Shivalingam e outros, Molecular Requirements of High-Fidelity Replication-Competent DNA Backbones for Orthogonal Chemical Ligation (2017) doi:10.1021/jacs.6b11530). A Figura 1 mostra a estrutura de algumas imitações de estrutural principal de triazol que são geradas através da química click, o fosfodiéster natural é mostrado no lado esquerdo para comparação.

[009] Uma aplicação especialmente útil dessa tecnologia de estrutura principal de DNA artificial se encontra na preparação da amostra para sequenciamento de próxima geração. Routh e outros (ClickSeq: Fragmentation-Free Next-Generation Sequencing via Click Ligation of Adaptors to Stochastically Terminated 3’-Azido cDNAs. J. Mol. Biol. 427, 2610-2616 (2015)) provê um protocolo para sequenciamento de RNA, em que um oligonucleotídeo adaptador sofre reação click com um fragmento de cDNA terminado em 3’-azida e uma reação de PCR é realizada para prover uma biblioteca de cDNA. Em comparação com um protocolo de preparação de biblioteca padrão que envolve uma ligação enzimática do oligonucleotídeo adaptador, esse método pode diminuir drasticamente a taxa de recombinação artefatual e formação de quimera de sequência.

[0010] Uma limitação grave para essa aplicação da tecnologia click em sequenciamento de DNA ou RNA até agora é uma eficiência menos do que satisfatória em que os fragmentos de cDNA bloqueados com 3’- azido usados no método são capturados durante geração de biblioteca. Apenas cerca de 10% dos fragmentos de cDNA bloqueados com 3’- azido poderiam ser ligados a um oligonucleotídeo modificado com alcino. Ainda, a conversão desse DNA de filamento simples ligado a triazol em um DNA de filamento duplo através de leitura da ligação triazol não é eficiente. Embora para experimentos de RNAseq padrão tal eficiência seja suficiente, para outras aplicações que necessitam uma captura completa do RNA ou DNA original, a eficiência da reação click e a subsequente leitura são consideradas inadequadas e devem ser melhoradas.

[0011] Portanto, é um objeto da presente invenção prover meios para obter uma eficiência maior, especialmente da ligação click, a fim de estabelecer aplicação bem-sucedida da tecnologia click para o sequenciamento de próxima geração.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0012] A presente invenção refere-se à melhoria da eficiência de ligação de dois parceiros de reação em uma reação click usando um grupo alcino e um grupo azida como os grupos funcionais de click. A reação click é daqui em diante compreendida ser uma reação entre uma porção 1,3-dipolar, que é uma azida, com uma porção insaturada, que é uma alcino terminal, catalisada por um catalisador de metal, especialmente um Cu(I) heterogêneo ou um outro catalisador de metal adequado. A reação click na forma catalisada é um mecanismo iônico não combinado que resulta em uma porção 1,2,3-triazol heterocíclica de 5 membros.

[0013] De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para acoplamento de uma primeira molécula a uma segunda molécula em uma reação click, em que a primeira molécula compreende um primeiro grupo click funcional que é um grupo alcino, e a segunda molécula compreende um segundo grupo click funcional, que é um grupo azida, o método compreendendo contato das primeira e segunda moléculas em uma mistura de reação na presença de um catalisador, preferivelmente um catalisador de Cu heterogêneo,

o método sendo caracterizado pelo fato de que a reação click é realizada na presença de cátions de metal adicionais na mistura de reação.

[0014] Um aspecto adicional da presente invenção é uma composição ativadora para uso em uma reação click, em que uma primeira molécula compreendendo um primeiro grupo click funcional, que é um grupo alcino, e uma segunda molécula compreendendo um segundo grupo click funcional, que é um grupo azida, são acopladas na presença de um catalisador, preferivelmente um catalisador de Cu heterogêneo, a dita mistura ativadora compreendendo cátions de metal, ligantes de estabilização de Cu(I)- e opcionalmente um solvente orgânico.

[0015] Ainda um aspecto adicional da presente invenção é um estojo de reagente de ligação click compreendendo pelo menos como um componente um catalisador e como um segundo componente uma composição ativadora de acordo com a presente invenção.

[0016] Ainda um aspecto adicional da presente invenção refere-se a um dispositivo tendo pelo menos uma câmara de reação, em que a câmara de reação compreende um catalisador, preferivelmente um catalisador de Cu heterogêneo para realização de uma reação click entre dois parceiros de reação e ainda em que cátions de metal ou uma composição ativadora da presente invenção estão contidos na câmara de reação.

[0017] Ainda um aspecto adicional da presente invenção se refere ao uso dos métodos, composições, estojos de reagente e dispositivos acima para ligar eficientemente moléculas, preferivelmente oligonucleotídeos, através de uma reação click. Um exemplo de tais moléculas carrega um marcador detectável. A ligação pode então prover biomoléculas marcadas que podem ser usadas para detectar um analito, por exemplo, um ácido nucleico em uma amostra,

particularmente envolvendo o uso de um composto marcado por uma reação click, que forma um produto associado com o analito a ser detectado. Em particular, os métodos, composições, estojos de reagente e dispositivos podem ser usados em tecnologias de sequenciamento de próxima geração, incluindo preparação de biblioteca de RNA, preparação de biblioteca de DNA e na análise de misturas de oligonucleotídeo complexas, especialmente aplicações de RT-qPCR paralelas e multiplex. Ainda, os métodos, composições, estojos de reagente e dispositivos da presente invenção podem ser usados para sequenciamento através de métodos de ligação (por exemplo, "Sequenciamento Sólido" de ABI), em reações da cadeia ligase, em métodos de clonagem, em particular para formar um DNA recombinante e em síntese de gene.

[0018] A pesquisa que levou à presente invenção mostrou que surpreendentemente adição de íons de metal a uma reação click que é catalisada por um catalisador, em particular por um catalisador de Cu(I), especialmente um catalisador de Cu(I) heterogêneo, pode melhorar imensamente especialmente a cinética de reação click oligonucleotídeo- oligonucleotídeo. Essa melhoria permite reações click eficientes entre os oligonucleotídeos funcionalizados da estrutura principal em rendimentos que foram até agora apenas obtidos através de pré- organização dos parceiros de reação através de oligonucleotídeos em ponte.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES PREFERIDAS

[0019] A presente invenção provê condições melhoradas para reações click, que evitam a necessidade de oligonucleotídeos em ponte e ainda levam a rendimentos altos da reação de ligação click. Em um exemplo de tal reação click que pode ser realizada sob as condições da presente invenção, um nucleotídeo modificado com 3’-alcino ou 3’-azida pode ser introduzido em um oligonucleotídeo, por exemplo, através de incorporação enzimática durante transcrição reversa (sequenciamento de RNA) ou durante embotamento (saliências de DNA de filamento simples são cheias com nucleotídeos e/ou removidas) e/ou através de formação de cauda de dA (adição não modelada de nucleotídeos, mais frequentemente dATP, à extremidade 3’ de DNA de filamento duplo embotado). Para sequenciamento de RNA, um primeiro adaptador (adaptadores são oligonucleotídeos curtos contendo sequências complementares para ligação e hibridização de iniciador) pode ser introduzido usando um iniciador parcialmente aleatorizado. Um segundo adaptador é ligado de modo click ao cDNA terminado em 3’-alcino ou 3’-azida. Uma apresentação esquemática de tal reação durante preparação de biblioteca de RNA ClickAdapt é mostrada na Fig. 2a.

[0020] Especialmente no contexto de tal sequenciamento de RNA, é possível e pode ser ainda mais preferível empregar adaptadores contendo sequências complementares para ligação e hibridização de iniciador que contêm em sua extremidade 5’ uma sequência que é complementar a uma região mais a jusante do adaptador. Sequências palindrômicas invertidas ou repetições invertidas são exemplos para tais sequências complementares. Hibridização dessas partes complementares da sequência de adaptador leva à formação de uma alça de filamento duplo na extremidade 5’ do adaptador. Uso de tal adaptador contendo uma alça de filamento duplo na extremidade 5’ assegura que o adaptador não hibridize com outras sequências nem no mesmo ou um outro RNA contido na mistura de reação. Uma reação correspondente é apresentada esquematicamente na Fig. 2b).

[0021] Embora uma área de alça de filamento simples esteja presente em tais adaptadores, além da parte de filamento duplo, tal área de alça não é provável causar hibridização não específica. Não obstante, é preferido manter tal área de alça pequena. Preferivelmente a área de alça compreende menos de 10 nucleotídeos, mais preferivelmente menos de 6 nucleotídeos e sobretudo preferivelmente a área de alça compreende apenas 3 nucleotídeos.

[0022] Para sequenciamento de DNA o primeiro adaptador é ligado de modo click ao oligonucleotídeo enzimaticamente modificado com 3’- alcino ou 3’-azida (o segundo adaptador é introduzido durante PCR através de uma região de ligação parcialmente complementar (por exemplo, 12 mer) dos adaptadores). O respectivo fluxo de trabalho da preparação da biblioteca de DNA de ClickAdapt é mostrado na Fig. 3. O iniciador ou o adaptador pode conter uma sequência de índice para permitir uma correlação subsequente com uma de amostras diferentes. Isso permite aplicação da tecnologia de sequenciamento click a misturas de várias amostras enzimaticamente produzidas. Após remoção de nucleotídeo modificado em excesso, uma ligação click é realizada entre os oligonucleotídeos modificados enzimaticamente produzidos e modificados e um oligonucleotídeo modificado com 5’- alcino ou 5’-azida agindo como um adaptador a fim de introduzir sequências de nucleotídeo que são necessárias para amplificação por PCR e/ou sequenciamento. Para essa finalidade, o oligonucleotídeo adaptador é preferivelmente produzido através de síntese de fase sólida e a modificação 5’ introduzida no final de tal síntese.

[0023] Como o elemento de modificação de alcino, blocos de formação comercialmente disponíveis podem ser usados, por exemplo, tendo a estrutura que segue:

[0024] Como um catalisador para a reação click, um catalisador de metal, preferivelmente um catalisador de Cu, e sobretudo preferivelmente um catalisador de Cu(I) heterogêneo, é usado. Em particular, um catalisador como descrito na EP 2 416 878 B1 pode servir como a fonte para a espécie de cobre ativo catalítico para a reação click. Ele é especialmente referido nos parágrafos [0029] a [0031] da EP 2 416 878 B1, em que uma descrição detalhada de tais catalisadores é provida. Na presente invenção, a reação click compreende uma variação catalisada de cobre de uma cicloadição (3+2) formal entre a azida e o grupo alcino terminal. A formação irreversível de 1,2,3-triazóis como um resultado da reação de azida/alcino é biortogonal devido à falta de azidas e alcinos terminais em organismos, os grupos químicos requeridos são pequenos (incorporação com rompimento mínimo do ambiente da biomolécula) e a reação é regiosseletiva, resultando em formação exclusiva do regioisômero 1,4.

[0025] A reação que segue é a base da ligação click de azidas e alcinos terminais em que R1 e R2 são primeiro e segundo parceiros na reação click.

[0026] Condições de reação click são conhecidas do versado na técnica a partir dos, por exemplo, documentos da técnica anterior acima citados. Geralmente, a reação click é realizada em uma mistura de reação aquosa em temperatura ambiente ou temperatura ligeiramente elevada, preferivelmente entre 20 e 60ºC, mais preferivelmente a 30- 50ºC, sobretudo preferivelmente 40-45ºC. Dependendo da temperatura, a reação geralmente necessitará um tempo de incubação de a partir de 10 minutos a várias horas, preferivelmente 30 minutos a 3 horas e sobretudo preferivelmente 40-90 minutos. As condições de reação não são críticas e podem ser ajustadas para as quantidades e volumes de reagentes usados para a preparação de produtos click.

[0027] O catalisador é preferivelmente um catalisador de Cu heterogêneo, mais preferivelmente um catalisador de Cu(I) heterogêneo. Deve ser observado, no entanto, que outros catalisadores de metal e especialmente outros catalisadores de metal heterogêneos, tais como Zr, W, Fe, Ru, Co, Th, Ir; Ni, Pd, Ag, Au, Zn, Cd, Hg, e outros íons de metal foram relatados contribuir diretamente ou indiretamente para uma catálise da ligação de reação click e podem ser também usados dentro do contexto da presente invenção. Alternativamente, também um catalisador de Cu(I) homogêneo pode ser usado para a ligação click. O catalisador de Cu heterogêneo é cobre elementar ou um catalisador de metal-C, isto é, um catalisador de Cu sólido compreendendo um apoio baseado em carbono tal como carvão tendo íons de Cu incorporados no mesmo ou cobre elementar, que pode gerar íons de Cu(I). Em uma modalidade especialmente preferida, o catalisador de Cu heterogêneo é um catalisador de Cu(I)-C que pode ser preparado como descrito por H. Lipshutz e B. R. Taft in Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 8235-8238.

[0028] O catalisador heterogêneo pode ser um catalisador em partículas, por exemplo, um catalisador heterogêneo consistindo em partículas tendo um tamanho de a partir de 10 nm a 1000 µm, preferivelmente de a partir de 100 µm a 800 µm. Alternativamente, o catalisador pode ser também um catalisador não em partícula poroso, por exemplo, uma matriz sólida tendo incrustadas nela partículas cataliticamente ativas.

[0029] Em uma modalidade adicional, um material carreador sólido adicional é incluído, o qual é um material diferente do catalisador de Cu heterogêneo, por exemplo, um material cromatográfico no qual uma biomolécula tal como preferivelmente um ácido nucleico ou análogo de ácido nucleico pode ser imobilizada. Preferivelmente, são incluídos materiais que permitem separação e purificação do produto de reação click de outros constituintes da mistura de reação. Mecanismos exemplares para separação e purificação são cromatografia por exclusão de tamanho e por afinidade.

[0030] Exemplos de materiais cromatográficos adequados são um material de troca iônica, um material hidrofílico ou um material hidrofóbico. Em uma modalidade preferida, um material hidrofílico, por exemplo, sílica gel, pode ser usado em combinação com o catalisador heterogêneo. Em uma outra modalidade preferida, um material hidrofóbico, por exemplo, sílica C18 ou C4 ou uma resina de troca iônica, pode ser usado em combinação com o catalisador heterogêneo. Em ainda uma modalidade preferida adicional, o material carreador sólido pode ser uma resina que é usada para síntese de fase sólida de biomoléculas, especialmente ácidos nucleicos ou análogos de ácido nucleico.

[0031] Foi constatado que a reação click entre um parceiro de reação imobilizado e um parceiro de reação que está presente livre em solução pode ser efetivamente catalisada por um sistema de catalisador de Cu heterogêneo. Essa estratégia pode permitir obter simultaneamente a reação click e a purificação e/ou a separação do produto das impurezas e/ou de outros reagentes ou sais em excesso eventualmente presentes na mistura de reação.

[0032] No método de acordo com a presente invenção, a mistura de reação contém cátions de metal adicionais. Dentro do contexto da presente invenção, o termo "cátions de metal adicionais" se refere a cátions de metal que são diferentes do metal de catalisador presente ou emergindo em forma catiônica durante a reação click.

[0033] Cátions de metal preferidos são metais alcalinos e alcalino- terrosos ou outros íons de metal divalentes com propriedades similares tal como, por exemplo, zinco (ZN2+). Em uma modalidade preferida da invenção, tais cátions de metal e especialmente tais metais alcalinos a serem adicionados à mistura de reação são diferentes de Na+. Em uma modalidade especialmente preferida da presente invenção, íons de metal alcalino-terroso divalente e em particular íons de Mg2+ estão presentes na mistura de reação, que foram provados ser cátions especialmente adequados para a estrutura principal de fosfato de DNA aniônico. Cátions adicionais ainda preferidos usados para os propósitos da invenção são Li+, K+ e ZN2+.

[0034] Para esse propósito, sais de metal correspondentes e especialmente sais de Mg2+ estão incluídos na mistura de reação. Durante a pesquisa levando à presente invenção, foi surpreendentemente constatado que a adição de cátions de metal e especialmente Mg2+ à mistura de reação faz com que todas as posições de ligante possíveis para espécies de cobre na estrutura principal de fosfato dos oligonucleotídeos sejam ocupadas pelos cátions adicionais. Como uma consequência, a quantidade de espécie de cobre que está disponível como um catalisador na mistura de reação é aumentada e a cinética de reação é notadamente melhorada.

[0035] Quantidades adequadas de cátions de metal adicionais na mistura de reação click são 1 a 200 mmol/l, preferivelmente 5 a 25 mmol, especialmente preferivelmente 10 a 20 mmol/l.

[0036] Na reação click de acordo com a presente invenção, é preferido incluir ainda um ligante de estabilização de metal de catalisador, especialmente um ligante de estabilização de Cu e preferivelmente um Cu(I). Como tal ligante, ligantes de metal conhecidos, tais como aminas e politriazóis (T. R. Chan, R. Hilgraf, K. B. Sharpless e V. V. Fokin, Organic Letters, 2004, 6, 2853-2855.), especialmente ácido Tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amina (THPTA), 2- (4-((bis((1-(terc-butil)-1H-1,2,3,-triazol-4-il)metil)amino)metil)-1H-1,2,3-

triazolil-1-il)acético (BTTAA), sulfato de 2-(4-((bis((1-(terc-butil)-1H- 1,2,3,-triazol-4-il)metil)amino)metil)-1H-1,2,3-triazolil-1-il) etila (BTTES) (D. Soriano Del Amo, W. Wang, H. Jiang, C. Besanceney, A. C. Yan, M. Levy, Y. Liu, F. L. Marlow, P. Wu, J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 16893–

16899.), Tris((1-benzil-4-triazolil)metil)amina (TBTA) ou análogos dos mesmos tendo propriedades de estabilização de metal similares, podem ser usados na mistura de reação. Esses ligantes de metal estabilizam, por exemplo, o catalisador de Cu(I) e protegem os oligonucleotídeos contra formação de espécies reativas a oxigênio. Ainda, adição de tais ligantes de metal também melhora a cinética de reação da reação click.

[0037] Ligantes de metal estão incluídos na mistura de reação click em uma quantidade de 10 a 4000 µmol, preferivelmente 400 a 1000 µmol/l e especialmente preferivelmente 700 a 900 µmol/l.

[0038] Em uma modalidade preferida adicional da presente invenção, um solvente orgânico é adicionado à mistura de reação. Em particular, sulfóxido de dimetila (DMSO) pode ser vantajosamente incluído na mistura de reação. Adição de tal solvente orgânico e especialmente DMSO tem um efeito positivo adicional sobre a eficiência da reação click entre dois oligonucleotídeos. É suposto que DMSO perturbe as estruturas secundárias de oligonucleotídeos e desta maneira melhore a acessibilidade dos grupos funcionais dos parceiros de reação, por exemplo, os grupos azida e alcino. Dentro do contexto da presente invenção, adição para um teor final de 1 a 10% (v/v) de tal solvente orgânico, especialmente DMSO, à mistura de reação é considerada útil, adição de solventes orgânicos para um teor final de 2 a 8% (v/v) e especialmente 4 a 6% (v/v) na mistura de reação é preferida.

[0039] Surpreendentemente foi observado que a presença de íons de metal adicionais, especialmente a presença de íons de metal divalentes correspondentes na mistura de reação da reação click, causa um aumento notável em formação de produto de reação click. Comparado com a reação realizada sem adição de tais cátions de metal divalentes, o rendimento de produto de click poderia ser pelo menos duplicado ou até mesmo triplicado. Uso da mistura de reação que contém ainda o solvente orgânico, especialmente DMSO, e um ligante de estabilização de Cu melhora mais o desempenho e leva a resultados e rendimentos altamente satisfatórios de produto de click. Esses efeitos do método de acordo com a presente invenção levam a reações e usos subsequentes de tais produtos de click, especialmente a reações de PCR para preparação de biblioteca de DNA ou RNA e sequenciamento de próxima geração.

[0040] Considerando a relevância de íons de metal adicionais, especialmente íons de metal divalentes e algumas outras substâncias para a eficiência da ligação click, uma matéria-objeto adicional da presente invenção é uma composição ativadora para uso na reação click para acoplamento de moléculas que são funcionalizadas por um lado por um grupo alcino terminal e por outro lado um grupo azida em uma reação catalisada por Cu, preferivelmente uma reação realizada na presença de um catalisador de Cu heterogêneo. Tal composição ativadora contém cátions de metal. Como mencionado acima, adição de tais cátions de metal adicionais à mistura de reação click, preferivelmente cátions de metal alcalino-terroso e especialmente preferivelmente íons de Mg2+, evita ligação das espécies de catalisador de cobre à estrutura principal de fosfato de DNA ou RNA. Tal ligação ocorre sem adição de tais cátions de metal e reduz a quantidade de catalisador disponível para a reação click. Devido à presença de cátions de metal, especialmente cátions de metal divalentes no bloqueio dos sítios de ligação na estrutura principal de fosfato, a quantidade de cobre que está disponível como um catalisador é aumentada e a cinética de reação melhorada.

[0041] Como já explicado acima em detalhes, a presença de ligantes de estabilização de Cu(I) e/ou a presença de um solvente orgânico, especialmente DMSO, melhora mais a eficiência da reação click entre os dois oligonucleotídeos. Portanto, uma composição ativadora preferida de acordo com a presente invenção contém os cátions de metal divalentes e um solvente orgânico e pelo menos um ligante de estabilização de Cu. Especialmente preferido é uma composição ativadora contendo como o cátion de metal divalente Mg 2+ e DMSO e pelo menos um ligante de estabilização de Cu selecionado de THPTA, BTTAA, análogos do mesmo ou qualquer mistura de tais ligantes.

[0042] A composição ativadora contém essas moléculas efetoras em quantidades que proveem uma concentração na mistura de reação click dos cátions de metal divalentes de 1 a 200 mmol/, preferivelmente 5 a 25 mmol/ e especialmente preferivelmente 10 a 20 mmol/l; o ligante de estabilização de Cu de 10 a 4000 µmol/l, preferivelmente 500 a 1000 µmol/l e especialmente preferivelmente 700 a 900 µmol/l; e/ou o solvente orgânico, preferivelmente DMSO de 1 a 10% (v/v), preferivelmente 2 a 8% (v/v) e especialmente preferivelmente 4 a 6% (v/v).

[0043] A composição ativadora de acordo com a presente invenção pode ser provida como uma composição contendo uma, duas ou todas das substâncias mencionadas acima que ajudam a melhorar a eficiência da reação click. A composição ativadora pode ser uma composição aquosa contendo uma pré-diluição das substâncias efetoras. A composição ativadora pode também conter outros solventes, especialmente solventes orgânicos adicionais ou uma combinação de água e solventes orgânicos. A composição ativadora pode conter ainda outras substâncias tais como substâncias-tampão ou qualquer outra substância que possa ser incluída no desempenho da reação click.

[0044] Uma matéria-objeto adicional da presente invenção é um estojo de reagente de ligação click, tal estojo de reagente compreendendo pelo menos como um componente um catalisador como acima definido, especialmente um catalisador de Cu e preferivelmente um catalisador de Cu(I) heterogêneo, e como um segundo componente uma composição ativadora de acordo com a presente invenção. Como revelado acima em mais detalhes, a composição ativadora tem um efeito positivo distinto sobre a reação click catalisada por cobre em ligação de oligonucleotídeos funcionalizados por alcino e azida. Portanto, um estojo de reagente da presente invenção provê o catalisador bem como a(s) molécula(s) efetora(s) da composição ativadora juntos a fim de facilitar a implementação do método de ligação click revelado aqui. Em modalidades preferidas, o estojo de reagente de ligação click contém como a composição ativadora a modalidade correspondentemente preferida, em que não apenas cátions de metal, preferivelmente cátions de metal alcalino-terroso e especialmente Mg2+, mas também pelo menos um de um solvente orgânico e um ligante de estabilização de Cu está presente. Para resultados melhores, uma composição ativadora contendo todas as três substâncias efetoras é incluída no estojo de reagente de ligação click da presente invenção.

[0045] O catalisador de Cu(I) que está incluído no estojo de reagente de ligação click da invenção é preferivelmente um catalisador heterogêneo como descrito na EP 2 416 878 B1.

[0046] Opcionalmente, tal estojo de reagente contém substâncias adicionais que são componentes necessários e/ou vantajosos na realização da reação click. Em adição aos componentes mencionados acima, um estojo de reagente de ligação click da presente invenção pode conter ainda pelo menos um oligonucleotídeo funcionalizado por azida ou alcino, que pode agir como um adaptador ou iniciador. O estojo de reagente pode conter marcadores, grupos funcionais click marcados, nucleotídeos modificados e não modificados, enzimas, tampões, adaptadores e/ou iniciadores, materiais carreadores ou materiais cromatográficos adicionais para purificação, preferivelmente materiais como descrito acima no contexto do método de ligação click de acordo com a invenção e as suas várias aplicações. Como mencionado acima, dependendo da reação a ser realizada, adaptadores e iniciadores podem ser incluídos, os quais contêm sequências complementares que formam uma alça e uma área de filamento duplo na extremidade 5’ do adaptador ou iniciador.

[0047] Em uma modalidade preferida adicional da presente invenção, o estojo de reagente de ligação click pode conter ainda substâncias e componentes necessários para uma reação de PCR subsequente para amplificar o produto ligado por click, para preparação e sequenciamento de biblioteca de DNA ou RNA, por exemplo, para análise de misturas de oligonucleotídeo complexas.

[0048] Uma matéria-objeto ainda adicional da presente invenção é um dispositivo que facilita realização da reação click da presente invenção. Tal dispositivo compreende pelo menos uma câmara de reação, tal câmara de reação compreendendo um catalisador, preferivelmente um catalisador de Cu heterogêneo para realização da reação click entre dois parceiros de reação. Respectivos dispositivos são revelados e descritos mais na EP 2 146 878 B1 e tal descrição se aplica também a dispositivos que podem ser usados de acordo com a presente invenção.

[0049] De acordo com a presente invenção, em adição à presença de um ou mais componentes de uma reação de ligação click, o dispositivo compreende ainda cátions de metal adicionais como acima definido, especialmente cátions de metal divalente, preferivelmente cátions de metal alcalino-terroso e especialmente Mg2+, ou uma composição ativadora como acima descrito com as uma ou mais câmaras de reação de tal dispositivo. Uma vez que a reação click pode ser realizada em volumes muito pequenos, os dispositivos podem ser, por exemplo, cavidades de placa de microtitulação, pontas de pipeta ou colunas giratórias, compreendendo um ou mais compartimentos que podem agir como a pelo menos uma câmara de reação. Íons de metal ou outros componentes preferidos empregados de acordo com a presente invenção estão presentes em tais dispositivos na pelo menos uma das câmaras de reação onde a reação click é realizada.

[0050] Deve ser compreendido que dentro do contexto da presente invenção todas as maneiras diferentes de realização de tal reação click e todas as substâncias que são descritas para tais propósitos são incluídas contanto que as exigências essenciais dos métodos, composições, estojos de reagente e dispositivos da invenção como acima descrito sejam satisfeitas. Portanto, todas as outras formas, variantes e melhorias de reações click que não são explicitamente descritas aqui são consideradas aplicáveis também dentro do contexto da presente invenção contanto que a mistura de reação click para a ligação click catalisada inclua pelo menos os íons de metal adicionais e especialmente os cátions de metal divalente que foram mostrados pela presente invenção ter um efeito vantajoso considerável sobre a eficiência e rendimento da reação click. Embora a presença desses cátions, especialmente cátions alcalino-terrosos e sobretudo preferivelmente íons de Mg2+, seja essencial para resolução do objeto da presente invenção, outros aspectos da reação click podem variar dependendo, por exemplo, da natureza das moléculas a serem acopladas através da ligação click, do catalisador realmente usado, das condições de reação e dos usos pretendidos e respectivas reações subsequentes a serem realizadas.

[0051] O uso dos métodos, composições, estojos de reagente e dispositivos para ligar eficientemente moléculas, preferivelmente oligonucleotídeos, através da reação click a fim de prover produtos de reação click que podem ser usados em reações subsequentes é uma matéria-objeto adicional da presente invenção. Como tais reações subsequentes, são incluídas todas as reações que requerem produtos de ligação que têm pureza alta e são providos em um rendimento alto de chumbo suficiente para realizar tal reação subsequente. Exemplos de tais reações subsequentes são PCR ou outros métodos de amplificação para análise de amostras de DNA ou RNA, especialmente onde misturas de oligonucleotídeo complexas devem ser analisadas. A presente invenção permite obter produtos de ligação click de oligonucleotídeos constituindo "imitações de estrutura principal", isto é, de moléculas de RNA ou DNA contendo alternativas não naturais para ligações fosfodiéster em suas estruturas principais. Uma vez que foi constatado que tais substâncias são totalmente biocompatíveis, a amplificação de tais moléculas é altamente eficaz e útil especialmente para as chamadas aplicações de sequenciamento de próxima geração.

[0052] Quando as condições declaradas acima são aplicadas, por exemplo, à preparação de biblioteca de sequenciamento de RNA, o segundo adaptador pode ser eficientemente ligado através de click a cDNA de filamento simples, desta maneira tornando síntese de segundo filamento desnecessária e o tempo de preparação total é reduzido. Devido à bio-ortogonalidade e especificidade da reação click, a ligação click ocorre exclusivamente entre moléculas funcionalizadas por azida e alcino. A azida é introduzida estocasticamente durante síntese de cDNA uma vez que os desoxinucleotídeos naturais são suplementados com concentração baixa de, por exemplo, 3’-azido-2’,3’- didesoxinucleotídeos, o que finaliza os fragmentos. O adaptador oligo modificado com 5’-alcino pode ser preparado através de síntese de DNA de fase sólida e pode ser usado sem purificação, uma vez que o 5’-

alcino é incorporado por último em síntese de fase sólida e filamentos não marcados mais curtos não podem ser ligados por meio de click.

[0053] O conceito click inventivo pode especialmente preferivelmente ser aplicado a protocolos de preparação de biblioteca de DNA. Os fragmentos de DNA são geralmente modificados através de embotamento e formação de cauda de dA através de polimerase de DNA para permitir ligação enzimática subsequente mais eficiente. Substituição dos dNTPs naturais com, por exemplo, 3’-azido-2’,3’- didesoxinucleotídeos durante embotamento ou formação de cauda de dA introduz grupos azida para ligação click nos oligonucleotídeos adaptadores com 5’-alcino.

[0054] Aplicação da presente invenção no contexto da tecnologia ClickSeq como descrito, por exemplo, por Routh e outros, vide supra, é também extremamente valiosa se misturas de oligonucleotídeos complexas tiverem que ser analisadas. Análises paralelas para RNA- RNA de vírus podem ser feitas sem realização de RT-qPCR multiplex. Para este propósito, vários iniciadores específicos de RNA de vírus (por exemplo, HIV, hepatite C, etc.) são adicionados a RNA em uma amostra para uma reação de transcrição reversa (por exemplo, uma reação ClickAdapt). Fragmentos de cDNA terminados em azida são ligados por meio de click a um adaptador para prover sítios de ligação de iniciador para amplificação por PCR subsequente. Devido à especificidade da ligação click, nenhuma recombinação artefatual pode ocorrer, tornando configurações de qPCR separadas para cada detecção desnecessárias. Portanto, a tecnologia provê uma base para aplicações de RT-qPCR paralelas massivas.

[0055] Áreas de aplicação dessa tecnologia incluem todos os outros estojos de preparação de biblioteca de DNA e RNA para sequenciamento, sequenciamento através de métodos de ligação (por exemplo, "Sequenciamento Sólido", de ABI), reação da cadeia ligase,

métodos de clonagem (para realizar DNA recombinante) e síntese de gene, em que duas ou mais moléculas são ligadas através de grupos funcionais click. Embora parcialmente em geral e parcialmente em mais detalhes aplicações possíveis tenham sido descritas acima, deve ser compreendido que outras reações incluindo uma ligação click realizada sob as condições descritas aqui são também incluídas no escopo da presente invenção.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0056] A Fig. 1 mostra a estrutura de algumas imitações de estrutura principal de triazol geradas através de química click (B-D) comparado com o fosfodiéster natural (A). Exemplos experimentais subsequentes no contexto de amplificação por PCR são mostrados para a imitação de estrutura principal de triazol (B) apenas; Fig. 2a) mostra uma preparação de biblioteca de RNA ClickAdapt que é um dos métodos de interesse na presente invenção. Ela envolve uma síntese de cDNA combinada, fragmentação e ligação por meio click de adaptador. Síntese de segundo filamento é obsoleta uma vez que ssDNA pode ser eficientemente ligado por meio de click; Fig. 2b) mostra a mesma preparação de biblioteca de RNA ClickAdapt que a Fig. 2a) para a qual, no entanto, um 1º adaptador compreendendo uma alça de filamento duplo na extremidade 5’ está incluído; Fig. 3 mostra um fluxo de trabalho de preparação de biblioteca de DNA ClickAdapt que é um método adicional de interesse na presente invenção. Um DNA de filamento duplo (ds) da amostra é fragmentado e os fragmentos são manipulados através de embotamento e formação de cauda de dA tal como em uma preparação de biblioteca de DNA padrão. Ao usar, por exemplo, 3’-azido-2’,3’- didesoxinucleotídeos ao invés de dNTPs naturais, dsDNA terminado em 3’-azida é obtido. Após remoção de nucleotídeos em excesso através de purificação do fragmento (incluindo seleção por tamanho), o primeiro adaptador sofre reação click com o fragmento através de seu grupo 5’- alcino.

O segundo adaptador é introduzido durante amplificação por PCR através de uma sequência 3’ curta (cerca de 12 pb) que é o complemento reverso da extremidade 5’ do primeiro adaptador e age como o primeiro iniciador para amplificação; Fig. 4 mostra a influência de vários cátions sobre a eficiência e rendimento da reação click; Fig. 5 mostra produtos de PCR de cDNA produzido a partir de um cDNA terminado em 3’-azida e um adaptador 5’-alcino usando polimerases de DNA diferentes; e a Fig. 6 mostra o resultado de sequenciamento Sanger do produto ligado através de click amplificado da Fig. 5; Fig. 7 mostra estruturas exemplares de nucleotídeos modificados de azida e alcino para incorporação enzimática e subsequente uso em ligação click; Fig. 8 mostra estruturas de extremidades 5’ exemplares de oligonucleotídeos adaptadores para ligação click (A-C). Oligonucleotídeo modificado com 5’-alcino (com a base B = timina de estrutura A) foi usado para os exemplos 1, 2 e 4 (nas Figuras 4, 5 e 9). A estrutura B foi usada nos exemplos 1 e 4 subsequentes (nas Figuras 4 e 9); Fig. 9 mostra o rendimento da reação click oligo-oligo para uma concentração baixa de oligo; Fig. 10 mostra um gel de agarose tingido com brometo de etídio (3% em TAE) de amostras de PCR com modelo de preparação de biblioteca click de mRNA de eGFP.

O cDNA modelo foi gerado usando misturas de nucleotídeo diferentes (constante de dNTP 500 µM, vários AzddNTP) durante transcrição reversa (rt). M = marcador de DNA de peso molecular baixo (NEB), 1 = dNTP apenas, 2 = AzddNTP 100 µM, 3 = AzddNTP 50 µM, 4 = AzddNTP 25 µM, 5 = AzddNTP 10 µM. Fig. 11 mostra um cromatograma de HPL analítico de uma reação CuAAC oligo-corante usando MgSO4 como um aditivo; Fig. 12 mostra um resultado de HPLC analítica de uma mistura de reação bruta click oligo-oligo a 260 nm de detecção. O pico em 5,6 min corresponde ao oligo modificado com alcino, o pico em 7,6 min corresponde ao oligo modificado com azida. Os dois picos que são novos após a reação click (6,1 e 6,4 min) têm a massa correta do produto de click. Cerca de 80% dos picos integrados têm a massa confirmada ESI-MS do produto de click.

[0057] Os exemplos que seguem são providos para propósitos de ilustração. Exemplo 1: preparação de produtos de click

[0058] Em um frasco de reação de 200 µL, um pélete de reator único (600-800 µm, contendo cobre elementar) foi combinado com 12,5 µL de mistura de reação e incubado a 45º C por 60 min. A mistura de reação consistia em THPTA 4 mM, 55 µM de uma oligoalcina1, 55 µM de uma azida azida oligo1, quando influência de cátion foi estudada cátions monovalentes 16 mM (ou cátion divalente 8 mM). dH2O foi usado para ajustar o volume para 12,5 µL final se necessário.

[0059] Após a incubação a amostra foi girada rapidamente e o sobrenadante foi transferido para um frasco novo para parar a reação. As amostras foram analisadas em géis de agarose 2,5% (10 x 15 cm) preparados em tampão TAE (TRIS 20 mM, ácido acético 10 mM, EDTA 0,5 mM).

[0060] As amostras foram preparadas com corante de carregamento púrpura 20% (NEB, New England BioLabs Inc.) e escada de DNA de peso molecular baixo (25-766 pb, NEB, N3233) foi preparada adequadamente; geralmente 0,5 µL de marcador foi usado em volume de carregamento de 5 µL. Os géis foram administrados em tampão TAE aplicando energia constante (10 W, max. 500 V, max. 100 mA) por 60 min. Então, os géis foram incubados em uma diluição de brometo de etídio 1:10 000 recém-preparada por 15 min e então descorados em dH2O por 15 min. Para visualização um Gel Doc EZ Imager (Bio Rad) foi usado. Oligonucleotídeos Oligo1 alcino: 5’-TAA TGA TAC GGC GAC CAC CGA GAT CTA CAC TCT TTC CCT ACA CGA CGC TCT TCC GAT CT-3' T = 5’-alcino dT B=T Azida azida oligo1: 5‘-N3-TGG AGT TCG TGA CCG CCG CCG GGA TCA CTC TCG GCA TGG ACG AGC TGT ACA AGT AAA GC -3‘ B=T

[0061] Devido às condições de click não ideais usadas neste experimento (muito THPTA, fonte de cobre insuficiente), a influência de adição de cátion de adição de metal alcalino (terroso) se torna aparente. A Fig. 4 mostra o gel 2,5% da reação click de oligonucleotídeo e a influência de cátions diferentes sobre a eficiência de click e rendimento de produto. Na ausência de um cátion adicional (slot 1) um rendimento de menos de 5% do produto de click foi observado sob as condições descritas acima. Através da adição de íons de Mg2+ (8 mM), o rendimento é melhorado para cerca de 30%. Como uma comparação, uma concentração de 16 mM de cátions monovalentes também foi analisada, no entanto, apenas uma leve melhora do rendimento foi observada (slots 3-5, rendimentos de 5 a 10%). Exemplo 2: amplificação por PCR do produto de click

[0062] A viabilidade do protocolo de ClickAdapt é exemplificada para uma sequência de RNA modelo. O RNA foi hibridizado para iniciador1 e então transcrito de modo reverso na presença de 200 µM de dTTP, dGTP, dCTP e 3’-azido-ddATP usando transcriptase reversa de MuLV. Nucleotídeos e enzima foram removidos através de purificação do cDNA usando o estojo de remoção de nucleotídeo (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.

[0063] Oligo1 alcino foi submetido à reação click com o cDNA purificado em um frasco de reação de 200 µL com um pélete de reator único (600-800 µm, contendo cobre elementar) em uma mistura de reação total de 12,5 µL e incubado a 45o C por 60 min.

[0064] A mistura de reação consistia em 800 µM de THPTA, MgCl2 20 mM, DMSO 5% (v/v), 7 µM de oligo1 alcino e cerca de 4 µM de cDNA purificado. dH2O foi usado para ajustar o volume para 12,5 µL final se necessário.

[0065] Após a incubação, a amostra foi rapidamente girada e o sobrenadante foi transferido para um novo frasco para parar a reação. A reação click bruta foi diluída 1:1000, 1:5000 e 1:10000 (max. 4 nM, 0,8 nM e 0,4 nM) para amplificação por PCR sem purificação adicional.

[0066] Em um frasco de reação de 200 µL, amplificações por PCR foram preparadas em um volume total de 20 µL. Diluições de reação click foram combinadas com 200 µM de dNTPS, 10 pmol de iniciador2 e iniciador3 e uma unidade de polimerase. Para as várias polimerases, tampões Pfu, Phusion, Q5, One Taq e Dream Taq foram usados de acordo com as recomendações do fabricante. As amostras foram submetidas a um programa de ciclização térmico em um termociclizador (BioRad).

[0067] Como uma condição de ciclização padrão, as condições que seguem foram usadas: etapa temperatura duração 1 95 °C 2 min 2 95 °C 15 s 3 51 °C 20 s 25 x 4 72 °C 30 s 5 72 °C 2 min

[0068] Para a polimerase de Pfu, diluições de modelo diferentes e uma condição de ciclização alternativa foram estudadas: etapa temperatura duração 1 95 °C 2 min 2 95 °C 15 s 3 52 °C 5s 25 x 4 72 °C 20 s 5 72 °C 2 min

[0069] Após a incubação, a amostra foi rapidamente girada e uma alíquota foi analisada em géis de agarose 3% (10 x 15 cm) preparados em tampão TAE (TRIS 20 mM, ácido acético 10 mM, EDTA 0,5 mM).

[0070] As amostras foram preparadas com corante de carregamento púrpura 20% (NEB) e escada de DNA de peso molecular baixo (25-766 pb, NEB, N3233) foi preparada adequadamente; geralmente 0,5 µL de marcador foi usado em volume de carregamento de 5 µL. Géis foram administrados em um tampão TAE aplicando energia constante (100 W, max. 500 V, max. 100 mA) por 60 min. Então, géis foram incubados em uma diluição de brometo de etídio 1:10 000 recém-preparada por 15 min e então descorados em dH 2O por 15 min. Para visualização um Gel Doc EZ Imager (Bio Rad) foi usado.

[0071] A Figura 5A ilustra o fluxo de trabalho do ClickAdapt (descrito acima) que foi feito para o RNA modelo mostrado. O fluxo de trabalho envolve transcrição reversa do RNA em cDNA. Através da substituição de dATP natural por 3’-AzddATP, o cDNA é terminado com uma 3’- azida. Após remoção de nucleotídeos em excesso através de purificação do cDNA, um adaptador de 5’-alcino é ligado por meio de click à 3’-azida e a mistura de reação bruta é usada como um modelo para PCR.

[0072] A Figura 5B é um gel de agarose tingido com brometo de etídio de amostras de PCR tratadas de acordo com o fluxo de trabalho de ClickAdapt para o RNA modelo em 5A. Uma vez que o modelo contendo triazol é amplificado por várias polimerases sob condições diferentes, isso ilustra a biocompatibilidade da imitação de estrutura principal não natural. Oligonucleotídeos Oligo1 alcino (vide exemplo 1) RNA modelo: 5’-UUC GAC AAA CGA AAA CAC AAA CAC AAA CCA AAC AGA AAA CAG UAC AUG UAA UCG ACC A-3’ Iniciador1 (para transcrição reversa) 5´-FAM-TGG TCG ATT ACA TGT AC-3‘; FAM = fluoresceína Iniciador2 5’-TGG TCG ATT ACA TGT ACT GTT TT-3’ Iniciador3 5’- AGA TCG GAA GAG CGT CG-3’ cDNA resultante após transcrição reversa:

5’-FAM-TGG TCG ATT ACA TGT ACT GTT TTC TGT TTG GTT TGT GTT TGT GTT TTC GTT TGT CGA-N3 Produto de click resultante: 5’-FAM-TGG TCG ATT ACA TGT ACT GTT TTC TGT TTG GTT TGT

GTT TGT GTT TTC GTT TGT CGA TAA TGA TAC GGC GAC CAC CGA GAT CTA CAC TCT TTC CCT ACA CGA CGC TCT TCC GAT CT- 3’ AT = A e T unidos através de imitação de estrutura principal B Produto de PCR resultante: 5’-TGG TCG ATT ACA TGT ACT GTT TTC TGT TTG GTT TGT GTT

TGT GTT TTC GTT TGT CGA TAA TGA TAC GGC GAC CAC CGA GAT CTA CAC TCT TTC CCT ACA CGA CGC TCT TCC GAT CT-3’ Exemplo 3: determinação de sequência do produto amplificado

[0073] O produto de amplificação foi analisado através de um processo que determina a sequência de nucleobases em um ácido nucleico. Sequências adaptadoras que foram incluídas permitem uma hibridização de um oligonucleotídeo complementar, para imobilização, determinação de sequência ou amplificação adicional.

[0074] A Figura 6 mostra os resultados de sequenciamento Sanger de um dos produtos de amplificação do exemplo 2. Foi determinado que usando a polimerase de DNA Phusion, quaisquer mutações poderiam ser observadas na ou próximo da posição da modificação de estrutura principal de triazol. O resultado indica que o produto de reação click pode ser incluído com sucesso em uma reação de PCR para prover quantidades grandes de produtos de PCR em eficiência e precisão altas. Exemplo 4: ligação click de concentração baixa na presença e na ausência de reator (fonte de cobre)

[0075] Em um frasco de reação de 200 µL, dois péletes de reator (600-800 µm, contendo cobre elementar; amostra 1) ou quaisquer péletes de reator (amostra 2) foram combinados com 12,5 µL de mistura de reação e incubados a 45º C por 60 min.

[0076] A mistura de reação consistia em 800 µM de THPTA, MgCl2 200 mM, 7 µM de oligo1 alcino e 7 µM de azida oligo1 em dH2O.

[0077] Após a incubação, a amostra foi rapidamente girada e o sobrenadante foi transferido para um frasco novo para parar a reação. Amostras foram analisadas em géis de agarose 3% (10 x 15 cm) preparados em tampão TAE (TRIS 20 mM, ácido acético 10 mM, EDTA 0,5 mM).

[0078] As amostras foram preparadas com corante de carregamento púrpura 20% (NEB) e escada de DNA de peso molecular baixo (25-766 pb, NEB, N3233) foi preparada adequadamente; geralmente 0,5 µL de marcador foi usado em um volume de carregamento de 5 µL. Os géis foram administrados em tampão TAE aplicando energia constante (10 W, max. 500 V, max. 100 mA) por 60 min. Então, géis foram incubados em uma diluição de brometo de etídio 1:10 000 recém-preparada por 15 min e então descorados em dH2O por 15 min. Para visualização um Gel Doc EZ Imager (Bio Rad) foi usado. Oligonucleotídeos Oligo1 alcino: 5’-TAA TGA TAC GGC GAC CAC CGA GAT CTA CAC TCT TTC CCT ACA CGA CGC TCT TCC GAT CT-3' T = 5’-alcino dT B=T Azida oligo1:

5‘-N3-TGG AGT TCG TGA CCG CCG CCG GGA TCA CTC TCG GCA TGG ACG AGC TGT ACA AGT AAA GC -3‘ B=T

[0079] Os resultados desse exemplo são mostrados na Figura 9. Um rendimento de 36% foi obtido após 60 min usando a condição click deste exemplo quando o reator estava presente. Quando o reator foi omitido, nenhum produto foi observado. Exemplo 5: protocolo de preparação de biblioteca de RNA usando mRNA de IVT

[0080] Aqui foram descritas condições experimentais detalhadas de protocolos de preparação de bibliotecas que foram obtidas durante o desenvolvimento do protocolo usando mRNA purificado transcrito in vitro (IVT) que codifica o gene eGFP. Transcrição Reversa

[0081] Em tubos livres de RNase de 200 µL, 250 ng de mRNA de IVT foram combinados com 100 pmol de iniciadores parcialmente aleatorizados, tampão de reação 1x, DTT 10 mM (ditiotreitol), dNTPP 500 µM, AzddNTP 100 µM e 200 unidades de transcriptase reversa. A) Esquema de Pipetagem de Hibridização de Iniciador: Configuração/ 1 2 3 4 5 Componente H2O 7,35 µL 6,95 µL 6,55 µL 5,35 µL 6,35 µL iniciador Illumina_N6 (100 µM) 1 µL 1 µL 1 µL 1 µL 1 µL eGFP mRNA (382 ng/µL) 0,65 µL 0,65 µL 0,65 µL 0,65 µL 0,65 µL dNTP (10 mM) 1 µL 1 µL 1 µL 1 µL 1 µL AzddNTP (2 mM) - - - - 1.0 µL AzddNTP (500 µM) - 0,4 µL 0,8 µL 2,0 µL -

[0082] Os componentes foram misturados pipetando suavemente e então aquecidos em termociclador para 65ºC por 3 min e então esfriados para 4ºC. Para adição dos componentes restantes uma mistura máster (para 6 configurações) foi preparada. Componente Volume H2O 18 µL Tampão de transcrição reversa1 (5x) 24 µL DTT1 (100 mM = 10x) 12 µL Transcriptase reversa Protoscript II1 (200 U/µL) 6 µL 1 = da NEB (número do produto M0368L)

[0083] A cada configuração hibridizada (1-5) foram adicionados 10 µL de mistura máster em temperatura ambiente (23º C) e após mistura através de pipetagem as transcrições reversas foram incubadas em um termociclador a 25ºC por 10 min, 42ºC (temperatura ótima para enzima de tr Protoscript II) por 50 min e 65ºC (desnaturação) por 20 min. Após esfriar para 4ºC, 5 µL de NaOH(aq) (1 M) foram adicionados a cada configuração e então incubados a 95ºC por 15 min, então 4ºC. As misturas foram neutralizadas através da adição de 5 µL de HCl(aq) (1 M) e então purificadas usando o estojo de purificação de PCR Qiagen (adição de 150 µL de tampão PB, etapa de eluição final usando 30 µL de H2O) de acordo com as recomendações do fabricante. Medição de NanoDrop configuração A260 β comentário volume quantidade [ng/µL] total de cDNA estimada 1 0,058 21,1 espectro de DNA 29 µL 610 ng intenso 2 0,054 19,6 espectro de DNA 28 µL 540 ng intenso 3 0,044 15,9 espectro de DNA 29 µL 460 ng típico 4 0,033 11,1 espectro de DNA 29 µL 320 ng típico 5 0,037 13,3 espectro de DNA 28 µL 370 ng típico

[0084] Uma concentração de AzddNTP aumentada durante transcrição reversa diminui rendimento de cDNA. Supomos que uma quantidade de AzddNTP aumentada diminua o tamanho de fragmento e fragmentos <100 mer são removidos durante purificação de cDNA. Ligação Click

[0085] Em um tubo de reação de 200 µL, dois péletes de reator foram combinados com 1,25 µL de ativador (MgCl2 200 mM, THPTA 8 mM em DMSO aquoso 50% (v/v) (10x), 1 µL de adaptador oligo alcino (100 µM) e 10,25 µL de cDNA purificado para cada configuração (1-5). A mistura foi incubada em um termomisturador a 45º C, 600 rpm por 60 min. Então cada amostra foi rapidamente girada e o sobrenadante foi transferido para um frasco limpo.

PCR

[0086] Em um tubo de reação de 200 µL, PCRs de 20 µL foram preparadas combinando 0,5 µL de reação click, 10 pmol de iniciador, 0,5 unidade de polimerase de DNA Phusion em tampão Phusion e 200 µM de dNTPS.

[0087] Uma mistura máster foi preparada para 6 configurações: Componente Volume H2O 75.6 µL Tampão Phusion HF3 (5x) 24 µL Iniciador P17-006_forw2 (10 µM) 6 µL Iniciador P17-006_rev3 (10 µM) 6 µL dNTPs (10 mM) 2.4 µL Polimerase Phusion3 (1U/µL) 3 µL 3 = da THERMO FISHER SCIENTIFIC, número do produto F530L

[0088] Os componentes foram misturados pipetando suavemente e 19,5 µL de mistura máster foram adicionados a 0,5 µL de reação click finalizada (sem pélete!) e misturados. As misturas resultantes foram incubadas em um termociclador aplicando o programa de temperatura que segue: T [°C] t [s] 98 30 98 10 30 52 10 x 72 40 72 120

[0089] 5 µL de cada amostra de PCR foram analisados através de eletroforese em gel de agarose. Amostra foram carregadas começando com dNTPS apenas (configuração 1, faixa 1) durante transcrição reversa inicial, que proveu uma faixa única fraca a 180 pb e os iniciadores (em torno de 35 pb). Amostras de PCR de cDNA, que foram geradas a partir da incorporação de AzddNTP durante transcrição reversa, resultaram em um esfregaço (faixa 2-5, configurações 5-2) de 100 pb (corte de tamanho de método de purificação) a 700 pb (faixa 5). Distribuição de tamanho de fragmento parecia aumentar da faixa 3-5, conforme a quantidade de AzddNTP era diminuída durante transcrição reversa de a partir de 50 µM a 10 µM (faixas 3 a 5). O gel de agarose tingido com brometo de etídio é mostrado na Fig. 10. Oligonucleotídeos Oligonucleo- Sequência (5’ a 3’) tídeo iniciador GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNN Illumina_N6 (100 µM) adaptador TAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACA oligo alcino CGACGCTCTTCCGATCT iniciador P17- GTGACTGGAGTTCAGACGTG 006_forw2 (10 µM) iniciador P17- GTCGTGTAGGGAAAGAGTGTA 006_rev3 (10 µM)

T = 5’-alcino dT B=T Exemplo 6: reação click oligocorante usando cátions de metal

[0090] Em um frasco de reação de 1500 µL, quatro péletes de reator foram combinados com 27,9 µL de mistura de reação e foram incubados a 45º C por 60 min.

[0091] A mistura de reação consistia em 17,9 mM de MgSO 4, 71,7 µM de SP2-Oligo, THPTA 1,8 mM, 144 µM de Azida Eterneon-Red 645 em 2,9 µL de DMSO e 25 µL de H2O.

[0092] Após a incubação a amostra foi rapidamente girada e o sobrenadante foi transferido para um frasco novo. Uma alíquota da amostra foi diluída em dH2O e então analisada através de HPLC analítica. RP-HPLC analítica foi realizada em um HPLC WATERS Alliance (Módulo de Separação e2695, Detector de Disposição de Fotodiodo) equipado com a coluna XbridgeTM OST C18 (2,5 µm, 4,6 x 50 mm) da WATERS. Um fluxo de 1,5 mL/min e uma temperatura de coluna de 40º C seguindo gradiente foram usados para separação de reações click: B 0-30% em 8 min, B 85% após 10 min, B 100% em 11 min. Tampão A: acetato de trietilamônio 0,1 M em água, pH = 7, tampão B: acetato de trietilamônio 0,1 M em acetonitrila 80% (v/v), pH = 7. Uma faixa de detecção de a partir de 220-680 nm foi usada para as rodadas.

[0093] Um oligonucleotídeo modificado com alcino foi reagido com Azida Eterneon Red 645 usando MgSO4 como um aditivo em adição a cobre do pélete do reator e o ligante. Na presença de MgSO4, um rendimento de conversão de produto de click de 85% foi obtido para a reação bruta após 60 min de incubação (Figura 11). Exemplo 7. Cromatograma de HPL de uma click oligo-oligo

[0094] Em um frasco de reação de 200 µL, um pélete de reator (600- 800 µm, contendo cobre elementar) foi combinado com 6,7 µL de mistura de reação e incubado a 45º C por 60 min. A mistura de reação consistia em 800 µM de THPTA, MgCl2 20 mM, 455 µM de biotina oligo alcino e 450 µM de biotina oligo alcino em dH2O com DMSO 5% (v/v).

[0095] Após a incubação, a amostra foi rapidamente girada e o sobrenadante foi transferido para um frasco novo. Uma alíquota da amostra foi diluída em dH2O e então analisada através de HPLC analítica. RP-HPLC analítica foi realizada em um HPLC WATERS Alliance (Módulo de Separação e2695, Detector de Disposição de Fotodiodo 2998) equipado com a coluna XbridgeTM OST C18 (2,5 µm, 4,6 x 50 mm) da WATERS. Um fluxo de 1,5 mL/min e uma temperatura de coluna de 40º C seguindo gradiente foram usados para separação de reações click: B 0-30% em 8 min, B 85% após 10 min, B 100% em 11 min. Tampão A: acetato de trietilamônio 0,1 M em água, pH = 7, tampão B: acetato de trietilamônio 0,1 M em 80% (v/v) de acetonitrila, pH = 7. Uma faixa de detecção de a partir de 220-680 nm foi usada para as rodadas.

[0096] Uma reação entre um oligonucleotídeo modificado com alcino sozinho ou azida sozinha foi estudada através de HPLC analítica, uma vez que o tempo de retenção do oligonucleotídeo modificado com alcino (Rt = 5,62 min) era muito diferente do oligonucleotídeo modificado com azida (Rt = 7,64 min). Após 60 min a 45º C, quase toda a quantidade completa de oligonucleotídeo modificado com azida foi consumida. Dois picos novos principais foram observados em 6,10 e 6,38 min, que tinham a massa do produto de click desejado em ESI-MS subsequente. Devido ao ligeiro excesso de oligonucleotídeo modificado com alcino, um pico distinto da oligo alcino foi observado no final da reação (5,618 min).

[0097] Tabela de pico dos picos integrados mostrados na Figura 12.

Entrada Rt [min] Área Altura % de Área 1 5,618 337824 86604 13,25 2 5,790 102820 11520 4,03 3 6,102 627408 81837 24,60 4 6,379 1434201 262451 56,24 5 7,642 47989 9893 1,88 Oligonucleotídeos Oligonucleotídeo Sequência (5’ a 3’) Modificação Biotina oligo alcino Biotina-TEG-GTT CTA GAA GGC TAA X = C8-alcino dU

GAA AAA TCT CXA CCA Biotina oligo azida Biotina-TEG-GTT CTA GAA GGC TAA Y = PEG12 GAA AAA TCT CYA CCA amino azida dT Y = PEG12 amino azida dT X = C8-alcino dU Biotina-TEG

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para acoplamento de uma primeira molécula a uma segunda molécula em uma reação de ligação click, em que a primeira molécula compreende um primeiro grupo click funcional, que é um grupo alcino, e a segunda molécula compreende um segundo grupo click funcional, que é um grupo azida, o método compreendendo contato das primeira e segunda moléculas em uma mistura de reação na presença de um catalisador, caracterizado pelo fato de que a reação click é realizada na presença de cátions de metal de adição na mistura de reação.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que como cátions de metal adicionais, cátions de metal alcalino ou alcalinoterroso, preferivelmente Li+, K+, Mg2+ ou Zn2+, estão presentes na mistura de reação click.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os cátions de metal estão contidos na mistura de reação click em uma quantidade de 1 a 200 mmol/l, preferivelmente 5 a 25 mmol/l e sobretudo preferivelmente 10 a 20 mmol/l.

4. Método, de acordo com qualquer reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a mistura de reação click compreende um solvente orgânico, preferivelmente DMSO e/ou um ligante de estabilização de Cu, preferivelmente selecionado de pelo menos um de Tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amina (THPTA), ácido 2-(4-((bis((1- (terc-butil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)metil)-1H-1,2,3-triazol-1- il)acético (BTTAA), Tris((1-benzil-4-triazolil)metil)amina (TBTA), sulfato de 2-(4-((bis((1-(terc-butil)-1H-1,2,3,-triazol-4-il)metil)amino)metil)-1H- 1,2,3-triazolil-1-il) etila (BTTES) ou análogos dos mesmos, especialmente outros politriazóis tridentados.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico está contido na mistura de reação click em uma quantidade de 2 a 10% (v/v), preferivelmente 4 a 6% (v/v), e/ou o ligante de estabilização de Cu(I) está contido na mistura de reação click em uma quantidade de 10 a 4000 µmol/l, preferivelmente 500 a 1000 µmol/l.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o catalisador é um catalisador de Cu, preferivelmente um catalisador de Cu heterogêneo.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das primeira e segunda moléculas é uma biomolécula, preferivelmente selecionada de nucleosídeos, nucleotídeos, ácidos nucleicos, aminoácidos, peptídeos, sacarídeos e lipídeos, e onde especialmente preferivelmente ambas as primeira e segunda moléculas são oligonucleotídeos.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das primeira e segunda moléculas carrega um marcador detectável.

9. Composição ativadora para uso em uma reação de ligação click caracterizada pelo fato de que uma primeira molécula compreendendo um primeiro grupo click funcional, que é um grupo alcino, e uma segunda molécula compreendendo um segundo grupo click funcional, que é um grupo azida, são acopladas na presença de um catalisador, preferivelmente um catalisador de Cu heterogêneo, a dita mistura ativadora compreendendo cátions de metal adicionais e ainda um solvente orgânico e/ou um ligante de estabilização de Cu.

10. Composição ativadora, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que os cátions de metal divalentes são cátions de metal alcalinoterroso, preferivelmente Mg2+, e/ou o ligante de estabilização de Cu é selecionado de pelo menos um de Tris(3-

hidroxipropiltriazolilmetil)amina (THPTA), ácido 2-(4-((bis((1-(terc-butil)- 1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)acético (BTTAA), Tris((1-benzil-4-triazolil)metil)amina (TBTA), sulfato de 2-(4- ((bis((1-(terc-butil)-1H-1,2,3,-triazol-4-il)metil)amino)metil)-1H-1,2,3- triazolil-1-il) etila (BTTES) ou análogos dos mesmos, especialmente outros politriazóis tridentados, e/ou o solvente orgânico é DMSO.

11. Composição ativadora, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que compreende o cátion de metal em uma quantidade de 1 a 200 mmol/l, preferivelmente 5 a 25 mmol, e/ou o solvente orgânico está em uma quantidade de 2 a 10% (v/v), preferivelmente 4 a 6% (v/v), e/ou o ligante de estabilização de Cu em uma quantidade de 10 a 4000 µmol/l, preferivelmente 500 a 1000 µmol/l.

12. Estojo de reagente de ligação click caracterizado pelo fato de que compreende como um componente um catalisador de Cu heterogêneo e como um segundo componente uma composição ativadora como definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 11.

13. Estojo de reagente de ligação click, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais componentes adicionais de uma reação click, preferivelmente selecionados do grupo consistindo em uma primeira molécula compreendendo um primeiro grupo Click funcional, que é um grupo alcino, uma segunda molécula compreendendo um segundo grupo Click funcional, que é um grupo azida, tampões, solventes, enzimas, nucleotídeos modificados e/ou não modificados, iniciador(es) (index) e/ou adaptadores incluindo opcionalmente uma alça de filamento duplo na extremidade 5’, e opcionalmente materiais cromatográficos.

14. Dispositivo caracterizado pelo fato de que tem pelo menos uma câmara de reação compreendendo um catalisador de Cu heterogêneo para uma reação de ligação click para acoplamento de uma primeira molécula a uma segunda molécula, em que a primeira molécula compreende um primeiro grupo click funcional, que é um grupo alcino, e a segunda molécula compreende um segundo grupo click funcional, que é um grupo azida, e opcionalmente um material carreador sólido, em que pelo menos em uma câmara de reação do dispositivo cátions de metal ou uma composição ativadora de acordo com 9 a 11 estão presentes.

15. Uso do método como definido nas reivindicações 1 a 8, uma composição ativadora como definida nas reivindicações 9 a 11, um estojo de reagente de ligação click como definido nas reivindicações 12 e 13 ou um dispositivo como definido na reivindicação 14, caracterizado pelo fato de ser para prover produtos de reação click, opcionalmente incluindo ainda reações subsequentes selecionadas de amplificação de RNA ou DNA, métodos de marcação de RNA ou DNA e métodos de sequenciamento de RNA ou DNA.