JP2020528908A - 血管遮断剤および免疫チェックポイント阻害剤を含む癌の予防または治療用の組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、（Ｓ）−Ｎ−（４−（３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−４−（３，４，５−トリメトキシベンゾイル）フェニル）チアゾール−２−イル）−２−アミノ−３−メチルブタンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩、および免疫チェックポイント阻害剤を含む癌の予防または治療用の組成物を提供する。本発明の組成物は、優れた癌治療効果を示す。

Description

本発明は、血管遮断剤（ＶＤＡ）および免疫チェックポイント阻害剤を含む癌の予防または治療用の組成物に関する。

免疫療法は、最近、免疫学分野の発展により人体免疫体系に対する多くの理解がなされることによって開発された新しい腫瘍治療法であって、患者自身の免疫体系を利用して副作用が少なく且つ長期間の抗腫瘍免疫を得ることができるという長所がある。

免疫療法の目標は、腫瘍細胞または腫瘍抗原を認識して腫瘍細胞を除去できる腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＣＴＬ）を生成させることにある。すなわち、腫瘍抗原ペプチドが主要組織適合性複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）に搭載され、腫瘍細胞そのものまたは抗原提示細胞によりＴリンパ球に提示されて、Ｔリンパ球を活性化させ、ＣＴＬへの分化およびＣＴＬの増加を誘導する。

ただ、大半の人体の腫瘍は個体の免疫監視を避けるので治療が難しいが、その原因として、１）大半の腫瘍抗原は胎生期の間に表現されたり正常細胞において発現されたりもする自己抗原の一部であるか、または免疫誘発の程度が非常に弱いので抗原として認知されることができず、２）腫瘍細胞によるＭＨＣ発現が低調であるか、または腫瘍抗原が腫瘍細胞内で不完全に処理されて全く提示されることができず、３）大半の腫瘍細胞は抗原提示に必須的な補助刺激分子を表現することができず、４）腫瘍が分泌する抑制性サイトカインによって免疫監視を避けることができるということが挙げられる。

一方、血管遮断剤（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔ；ＶＤＡ）は、血管内皮細胞の細胞骨格の微小管を選択的に破壊して形成されている腫瘍血管を迅速で且つ選択的に遮断することを目標とし、腫瘍中心部にある細胞の虚血性壊死を誘導することができる。しかし、大半の血管遮断剤（ＶＤＡ）は、それを単独で処理する場合、生存リム（ｖｉａｂｌｅ ｒｉｍ）から腫瘍が速く再成長できるという問題があり、その結果、そのような薬物の治療的有用性を低下させることとなる。

ＷＯ２００９／１１９９８０ ＷＯ２０１６／１３０８３９ ＷＯ２０１６／１９７２０４

Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２０１４；６３：９２５−９３８

本発明者らは、血管遮断剤の単独使用が有する問題を解決しつつ、免疫療法を用いた免疫治療剤の長所を最大限に活かせる新規な癌の予防または治療用の組成物、およびその治療方法を提供するために様々な研究を試みた。

本発明の目的は、血管遮断剤および免疫チェックポイント阻害剤を含む癌の予防または治療用の組成物を提供することにある。

本発明の目的は、血管遮断剤および免疫チェックポイント阻害剤を必要とする個体に投与することを含む癌の治療方法を提供することにある。

本発明の目的は、癌治療用薬剤を製造するための血管遮断剤および免疫チェックポイント阻害剤の用途を提供することにある。

本発明の目的は、癌の治療に用いるための血管遮断剤および免疫チェックポイント阻害剤を含む組成物を提供することにある。

本発明の組成物は、癌に対する優れた予防または治療活性を示し、腫瘍の再発可能性が低いという長所を有する。したがって、本発明の組成物は、癌の予防、改善または治療用として適用できる。

化学式２の化合物の処理に応じた、成熟した樹状細胞マーカーであるＣＤ８０の発現の増加を確認した結果である。 化学式２の化合物の処理に応じた、成熟した樹状細胞マーカーであるＣＤ８６の発現の増加を確認した結果である。 化学式２の化合物の処理に応じた、成熟した樹状細胞マーカーであるＭＨＣＩＩの発現の増加を確認した結果である。 化学式２の化合物の処理に応じた、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の分泌量の増加を確認した結果である。 化学式２の化合物の処理に応じた、樹状細胞の貪食作用の増加を確認した結果である。 癌動物モデルにおける、血管遮断剤および免疫チェックポイント阻害剤（ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、またはこれらの全て）の単独または併用投与に応じた癌治療効果を確認した結果である。 癌動物モデルにおける、血管遮断剤および免疫チェックポイント阻害剤（ＰＤ−Ｌ１）の単独または併用投与に応じた癌治療効果を確認した結果である。

前記目的を達成するために本発明者らが研究努力した結果、血管遮断剤（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔ；ＶＤＡ）および免疫チェックポイント阻害剤を含む癌の予防または治療用の医薬組成物を完成するに至った。

血管遮断剤（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔ；ＶＤＡ）は、血管内皮細胞の細胞骨格の微小管を選択的に破壊して形成されている腫瘍血管を迅速で且つ選択的に遮断することを目標とし、腫瘍中心部にある細胞の虚血性壊死を誘導することができる。

本発明において、前記血管遮断剤として用いられた化合物は、下記化学式１で表される（Ｓ）−Ｎ−（４−（３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−４−（３，４，５−トリメトキシベンゾイル）フェニル）チアゾール−２−イル）−２−アミノ−３−メチルブタンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩である。

本発明において、前記化学式１の化合物は、例えば、国際特許公報ＷＯ２００９−１１９９８０号に開示された製法により製造できるが、これに制限されるものではない。

本発明において、薬学的に許容可能な塩は、医薬業界で通常用いられる塩を意味し、例えば、カルシウム、ポタシウム、ナトリウムまたはマグネシウムなどから製造された無機イオン塩；塩酸、硝酸、リン酸、臭素酸、ヨウ素酸、過塩素酸または硫酸などから製造された無機酸塩；酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸、マンデル酸、プロピオン酸、乳酸、グリコール酸、グルコン酸、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルクロン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、カルボン酸またはバニリン酸などから製造された有機酸塩；メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸またはナフタレンスルホン酸などから製造されたスルホン酸塩；グリシン、アルギニン、リジンなどから製造されたアミノ酸塩；またはトリメチルアミン、トリエチルアミン、アンモニア、ピリジン、ピコリンなどから製造されたアミン塩などが挙げられるが、列挙されたこれらの塩によって本発明で意味する塩の種類が制限されるものではない。

具体的には、（Ｓ）−Ｎ−（４−（３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−４−（３，４，５−トリメトキシベンゾイル）フェニル）チアゾール−２−イル）−２−アミノ−３−メチルブタンアミドの塩は塩酸塩であってもよい。

本発明において、前記化学式１の化合物の活性代謝産物は、下記化学式２で表される（４−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）フェニル）（３，４，５−トリメトキシフェニル）メタノンであってもよい。前記「活性代謝産物」という用語は、生体の同化または異化作用の代謝過程で発生する物質のうち実際に治療対象体内で薬理活性を示す物質である。

本発明において、前記癌の予防または治療用の医薬組成物に含まれる化学式１の化合物が個体内の代謝過程により前記化学式２の化合物として存在して癌の予防、改善または治療効果を示すことができる。

本願発明に係る化学式１の化合物は、腫瘍血管を迅速で且つ選択的に遮断して腫瘍中心部にある細胞の虚血性壊死を起こすだけでなく、樹状細胞を活性化させることができる。

本発明の一実施例によれば、前記化学式２の化合物が樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ＤＣ）の成熟を促進させ、貪食作用を増加させ、外部抗原提示能を増加させる（図１〜図５）。

前記樹状細胞は、抗腫瘍免疫力を誘導できる細胞であって、貪食作用などにより抗原を取得し、ＭＨＣに抗原ペプチドを搭載して表現することによって抗原特異的Ｔ細胞受容体を有したＴリンパ球の活性を強力に誘導する。また、樹状細胞が活性化する場合、ＩＬ−１２を発現してＴリンパ球のアポトーシスを防ぎ、Ｔリンパ球の分化とＣＴＬ活性を誘導し、ナチュラルキラー細胞の活性を増加させて抗腫瘍免疫力を高める特性を示す。

したがって、本発明の癌の予防または治療用の医薬組成物において、化学式１の化合物およびその活性代謝産物である化学式２の化合物は、血管遮断剤としての作用効果だけでなく、樹状細胞を活性化させ、貪食作用および外部抗原提示能を増加させる作用効果を示す。

本発明において、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫抑制力の高い癌において免疫反応の進行を防ぐ免疫チェックポイントを遮断して癌の免疫回避を阻害することにより癌を治療することができる。

免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）は、免疫学分野の発展により人体免疫体系に対する多くの理解がなされた結果で開発された新しい腫瘍治療剤として抗癌戦略に多く用いられている。前記阻害剤を用いて抗癌効果を示すための例示的なメカニズムとして、ＣＴＬＡ−４によるＴリンパ球抑制メカニズムと既に活性化したＴリンパ球を抑制するＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１メカニズムが挙げられる。しかし、免疫チェックポイント阻害剤だけを用いた治療は、治療効率が低く、効果が微少であるという限界が報告されている。

しかし、本発明の癌の予防または治療用の組成物は、他の治療メカニズムの抗癌剤である化学式１の化合物（血管遮断剤）と前記免疫チェックポイント阻害剤を併用投与して、相乗補完効果により免疫療法を通じて癌の予防および治療に役に立つ。

前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、融合タンパク質、アプタマーまたはその免疫チェックポイントタンパク質−結合断片であってもよい。例えば、免疫チェックポイント阻害剤は、抗免疫チェックポイントタンパク質抗体またはその抗原−結合断片である。

特定の例において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体、その誘導体またはその抗原−結合断片；抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その誘導体またはその抗原−結合断片；抗ＬＡＧ−３抗体、その誘導体またはその抗原−結合断片；抗ＯＸ４０抗体、その誘導体またはその抗原−結合断片；抗ＴＩＭ３抗体、その誘導体またはその抗原−結合断片；および抗ＰＤ−１抗体、その誘導体またはその抗原−結合断片の中から選択される。

例えば、免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、その誘導体またはその抗原−結合断片；トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、その誘導体またはその抗原−結合断片；ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、その誘導体またはその抗原−結合断片；ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、その誘導体またはその抗原−結合断片；ピディリズマブ（Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、その誘導体またはその抗原−結合断片；アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、その誘導体またはその抗原−結合断片；デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、その誘導体またはその抗原−結合断片；アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、その誘導体またはその抗原−結合断片；ＢＭＳ−９３６５５９、その誘導体またはその抗原−結合断片；ＢＭＳ−９８６０１６、その誘導体またはその抗原−結合断片；ＧＳＫ３１７４９９８、その誘導体またはその抗原−結合断片；ＴＳＲ−０２２、その誘導体またはその抗原−結合断片；ＭＢＧ４５３、その誘導体またはその抗原−結合断片；ＬＹ３３２１３６７、その誘導体またはその抗原−結合断片；およびＩＭＰ３２１組換え融合タンパク質の中から選択することができ、免疫チェックポイント阻害剤として使用できる抗体または他の形態の免疫チェックポイント阻害剤であれば、特に制限されずに用いることができる。

具体的には、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＴＩＭ３抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体からなる群より選択されるいずれか一つ以上が好ましい。前記抗体は、例えば、通常の抗体製造会社から購入して使用するか、または周知の抗体の製造方法により製造して使用してもよい。

前記免疫チェックポイント阻害剤は、上記で言及された免疫チェックポイント阻害剤として作用効果があるかまたはその阻害メカニズムに関与する低分子化合物であってもよい。このような低分子化合物は、例えば、免疫チェックポイントタンパク質に結合するかまたは免疫チェックポイント阻害に関連したメカニズムに関与する低分子化合物であってもよい。

具体的には、低分子化合物は、ＢＭＳ−２０２（ソース：ＢＭＳ）、ＢＭＳ−８（ソース：ＢＭＳ）、ＣＡ１７０（ソース：Ｃｕｒｉｓ／Ａｕｒｉｇｅｎｅ）、ＣＡ３２７（ソース：Ｃｕｒｉｓ／Ａｕｒｉｇｅｎｅ）、Ｅｐａｃａｄｏｓｔａｔ、ＧＤＣ−０９１９、ＢＭＳ−９８６２０５などであってもよい。免疫チェックポイント阻害剤として使用するかまたは関連の効果のある低分子化合物であれば、特に制限されずに用いることができる。

本発明の組成物は、化学式１の化合物（血管遮断剤）と免疫チェックポイント阻害剤を併用することによって、これらの併用に応じた相乗補完効果により癌の予防および治療活
性が顕著になる。

これに制限されるものではないが、本発明の組成物の治療メカニズムの一例示として、次のように癌の予防および治療に顕著な効果を示すことができる。化学式１の化合物が樹状細胞を活性化させてＴリンパ球の活性化が順次起こるが、前記Ｔリンパ球の活性化ステップまたは活性化したＴリンパ球が癌細胞を認識して殺すステップにおいて、免疫チェックポイントは前記ステップを遮断してＴリンパ球の活性を抑制することができる。しかし、化学式１の化合物と併用投与される免疫チェックポイント阻害剤は前記Ｔリンパ球活性抑制ステップを遮断することができるため、Ｔリンパ球の活性を保持することができる。したがって、化学式１の化合物によるＴリンパ球活性化メカニズムと免疫チェックポイント阻害剤による癌細胞のＴリンパ球活性化抑制遮断メカニズムの互いに異なるメカニズムの組み合わせによる癌の予防または治療活性の相乗効果を達成することができる。

本発明の一実施例において、化学式１の化合物と抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体またはこれらの全てを併用投与する時、単独投与に比べて上昇した癌治療効果を示すことを確認した（図６）。

本発明の一実施例において、化学式１の化合物と抗ＰＤ−Ｌ１抗体を併用投与する時、単独投与に比べて上昇した癌治療効果を示すことを確認した（図７）。

したがって、組成物は、化学式１の化合物、および抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む。具体的には、組成物は、化学式１の化合物および抗ＣＴＬＡ４抗体を含む。具体的には、化学式１の化合物および抗ＰＤ−１抗体を含む。具体的には、化学式１の化合物および抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。具体的には、化学式１の化合物、抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＴＬＡ−４を含む。

本発明において、本発明の組成物は、癌の予防または治療用として有用に用いられることができる。前記癌としては、人体の各種癌、婦人科腫瘍、内分泌系癌、中枢神経系腫瘍、尿管癌などが挙げられ、具体的には、肺癌、胃癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫、子宮癌、卵巣癌、大腸癌、乳癌、子宮肉腫、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸部癌腫、膣癌腫、外陰部癌腫、食道癌、喉頭癌、小腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、多発性骨髄腫、慢性または急性白血病、幼年期の固形腫瘍、リンパ腫（例えば、分化リンパ腫、第１中枢神経系リンパ腫）、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌腫、腎盂癌腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、メルケル細胞腫、尿路腫瘍または脳下垂体腺腫を含み、これらに制限されるものではない。より具体的には、本発明の医薬組成物は、大腸癌、皮膚黒色腫、肺癌、胃癌、リンパ腫、メルケル細胞腫、尿路腫瘍および多発性骨髄腫からなる群より選択されたいずれか一つの癌の治療に用いられることができる。

本発明の医薬組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有した者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体を用いて製剤化することによって単位用量の形態に製造するかまたは多用量容器内に入れて製造することができる。

前記薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これらに制限されるものではない。本発明の医薬組成
物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。好適な薬剤学的に許容される担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．、１９９５）に詳細に記載されている。

本発明の組成物は、２種の別個の製剤を含むものであってもよく、１個の製剤からなってもよい。

本発明の組成物は、目的とする方法に応じて、経口投与するかまたは非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）してもよい。

本発明において、前記（Ｓ）−Ｎ−（４−（３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−４−（３，４，５−トリメトキシベンゾイル）フェニル）チアゾール−２−イル）−２−アミノ−３−メチルブタンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩は非経口または経口投与することができ、好ましくは、経口投与することができる。

また、前記免疫チェックポイント阻害剤は、経口または非経口投与することができる。

例えば、免疫チェックポイント阻害剤として抗体、融合タンパク質、アプタマーまたはその免疫チェックポイントタンパク質−結合断片は、非経口投与することができる。

例えば、免疫チェックポイント阻害剤として低分子化合物は、経口または非経口投与することができる。

本発明の組成物において、前記有効成分の好適な投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などに応じてその範囲が様々である。本発明の（Ｓ）−Ｎ−（４−（３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−４−（３，４，５−トリメトキシベンゾイル）フェニル）チアゾール−２−イル）−２−アミノ−３−メチルブタンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩の１日投与量は約１〜２０ｍｇ／ｍ^２であり、好ましくは５〜１５ｍｇ／ｍ^２である。また、本発明の免疫チェックポイント阻害剤として抗体、融合タンパク質、アプタマーまたはその免疫チェックポイントタンパク質−結合断片の１日投与量は約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは１〜３０ｍｇ／ｋｇである。本発明の免疫チェックポイント阻害剤として低分子化合物の１日投与量は約１ｍｇ〜１５００ｍｇであり、好ましくは２００ｍｇ〜８００ｍｇである。

また、本発明の組成物において、前記有効成分の好適な投与周期は、前記投与量に応じて決定できる。これに制限されるものではないが、本発明の（Ｓ）−Ｎ−（４−（３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−４−（３，４，５−トリメトキシベンゾイル）フェニル）チアゾール−２−イル）−２−アミノ−３−メチルブタンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩は１日１回〜３週間に１回投与されてもよく、具体的には１週間に２回投与されてもよい。また、これに制限されるものではないが、本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、１日１回〜３週間に１回投与されてもよい。

本発明は、本発明の血管遮断剤（ＶＤＡ）および免疫チェックポイント阻害剤を必要とする個体に投与することを含む癌の治療方法を提供する。本発明において、前記「個体」という用語は、哺乳動物、特にヒトを含む。前記治療方法は治療学的に有効な量の投与を含み、「治療学的に有効な量」という用語は癌の治療に有効な本発明の血管遮断剤（ＶＤＡ）および免疫チェックポイント阻害剤の量を示す。前記血管遮断剤および免疫チェックポイント阻害剤は、任意の順に順次または同時に投与することができる。

本発明は、癌治療用薬剤を製造するための血管遮断剤（ＶＤＡ）および免疫チェックポイント阻害剤の用途を提供する。薬剤を製造するための本発明の血管遮断剤（ＶＤＡ）および免疫チェックポイント阻害剤を含む組成物は許容される担体などを混合することができ、他の作用剤をさらに含むこともできる。

本発明は、癌の治療に用いるための血管遮断剤（ＶＤＡ）および免疫チェックポイント阻害剤を含む組成物を提供する。

本発明の用途、組成物、治療方法で言及された事項は互いに矛盾しない限り同様に適用される。

以下では、実施例を通じて本発明の構成および効果についてより詳しく説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。

＜実施例１＞ 化学式２の化合物の樹状細胞の活性増加効果の確認

１．実験方法

マウス骨髄由来の樹状細胞（ｂｏｎｅ−ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、ＢＭ−ＤＣ）の準備
ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨からマウス骨髄由来の樹状細胞を得た。前記細胞は、４０ｎｇ／ｍＬ ｒｍＧＭ−ＣＳＦ（ＪＷ Ｃｒｅａｇｅｎｅ、Ｓｕｎｇｎａｍ、Ｋｏｒｅａ）および２０ｎｇ／ｍＬ ｒｍＩＬ−４（ＪＷ ＣｒｅａＧｅｎｅ）を含み、１０％ ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および５０μＭの２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）に保持した。

有効成分の準備
化学式１の化合物の活性代謝物質である化学式２の化合物（化合物２）をＤＭＳＯに溶かして、細胞培地である前記マウス骨髄由来の樹状細胞の培地で希釈して準備した。

樹状細胞の表現型の確認
樹状細胞の表現型を確認するために、マウス骨髄由来の樹状細胞に化学式２の化合物を２４時間処理した後、骨髄由来の樹状細胞の細胞表面マーカーに対する抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ８０、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ８６、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＭＨＣ ＩＩに対する抗体）およびｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体で染色した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて行った。

樹状細胞が生産するサイトカインの測定
サイトカイン分泌の変化を確認するために、マウス骨髄由来の樹状細胞に化学式２の化合物を２４時間処理した後、細胞培地を用いてサイトカインを測定した。サイトカインの測定にはｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）が用いられ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１２を測定した。

樹状細胞の貪食作用の測定
樹状細胞の貪食作用を確認するために、１００ｎＭの化学式２の化合物をマウス骨髄由来の樹状細胞（２×１０^６／ウェル）に１８時間処理した後、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）をタグ付け（ｔａｇｇｉｎｇ）したオボアルブミン含有ミクロスフェア（ＯＶＡ−ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）を２時間添加して培養した。培養が完了した細胞をＰＢＳで洗浄後に細胞を収集してパラホルムアルデヒドで固定させた後、フローサイトメーターで分析を行った。

統計分析
対照群と処理群間の統計学的な有意性はＳｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔを用いて検証を行った。

２．実験結果

樹状細胞の成熟化
化学式２の化合物をマウス骨髄由来の樹状細胞に処理した結果を図１〜３に示す。図１はＣＤ８０、図２はＣＤ８６、および図３はＭＨＣ ＩＩを細胞マーカーにして表現型を確認したものである。図１および図２から確認されるように、０．０１、０．１および１μＭの全ての濃度投与群においてＣＤ８０およびＣＤ８６が増加することを確認した。図３は、１００ｎＭ濃度での結果であり、成熟した樹状細胞の表現型としてＭＨＣＩＩが増加することを確認した。前記結果から、化学式２の化合物が樹状細胞を成熟化させることを確認した。

サイトカイン生産の増加
化学式２の化合物の処理に応じた、サイトカイン変化結果を図４に示す。化学式２の化合物をマウス骨髄由来の樹状細胞に処理した結果、全ての化学式２の化合物の投与群においてＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２が増加することを確認した。前記結果から、化学式２の化合物が樹状細胞を成熟化させることを確認した。

樹状細胞の貪食作用の増加
樹状細胞の貪食作用の測定結果を図５に示す。フローサイトメーターを用いた蛍光度の分析結果、化学式２の化合物が樹状細胞の貪食作用を増大させることを確認し、その結果として外部抗原に対する樹状細胞の貪食作用が増加することを確認した。

＜実施例２＞ 化学式１の化合物と免疫チェックポイント阻害剤の癌治療効能の相乗効果の確認（１）

１．実験方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにマウス大腸癌細胞株であるＭＣ３８（８×１０^４ｃｅｌｌ）を皮下に移植した。癌の大きさが４０〜６０ｍｍ^３になった時、ｖｅｈｉｃｌｅまたは５ｍｇ／ｋｇの化学式１の化合物を１週間に２回腹腔注射した。また、１ｕｇ／ｕＬ（２００ｕｇ／２００ｕＬ／ｍｏｕｓｅ）の抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体またはこれらの全て（ＢｉｏＸＣｅｌｌから購入）は、ｖｅｈｉｃｌｅまたは化学式１の化合物を投与して１日後に１週間に２回腹腔注射した。癌の大きさと体重は１週間に２回測定した。

２．実験結果
前記実験結果を図６に示す。

前記癌動物モデルにおいて、化学式１の化合物と抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体は、癌の成長を顕著に抑制した。具体的には、化学式１の化合物は抗ＰＤ−１抗体ま
たは抗ＣＴＬＡ−４抗体と各々併用した時、シナジー効果により非常に高い治療能を示した。さらに、化学式１の化合物を抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体と第３併用に投与した実験群において抗癌効果が最も増大して、１０匹の実験動物のうち２匹から癌が完全に消滅することが確認された。前記結果から、化学式１の化合物と免疫チェックポイント阻害剤の併用投与が癌治療にシナジー効果を持って顕著に優れた抗癌効果を示すことを確認した。

＜実施例３＞ 化学式１の化合物と免疫チェックポイント阻害剤の癌治療効能の相乗効果の確認（２）

１．実験方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにマウス大腸癌細胞株であるＭＣ３８（８×１０^４ｃｅｌｌ）を皮下に移植した。癌の大きさが４０〜６０ｍｍ^３になった時、ｖｅｈｉｃｌｅまたは５ｍｇ／ｋｇの化学式１の化合物を１週間に２回腹腔注射した。また、１ｕｇ／ｕＬ（２００ｕｇ／２００ｕＬ／ｍｏｕｓｅ）の抗ＰＤ−Ｌ１抗体をｖｅｈｉｃｌｅまたは化学式１の化合物を投与して１日後に１週間に２回腹腔注射した。癌の大きさと体重は１週間に２回測定した。

２．実験結果
前記実験結果を図７に示す。

前記癌動物モデルにおいて、化学式１の化合物と抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、癌の成長を顕著に抑制した。具体的には、化学式１の化合物は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と併用した時、シナジー効果により非常に高い治療能を示した。前記結果から、化学式１の化合物と免疫チェックポイント阻害剤の併用投与が癌治療にシナジー効果を持って顕著に優れた抗癌効果を示すことを確認した。

Claims (20)

1. 下記化学式１で表される（Ｓ）−Ｎ−（４−（３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−４−（３，４，５−トリメトキシベンゾイル）フェニル）チアゾール−２−イル）−２−アミノ−３−メチルブタンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩、および免疫チェックポイント阻害剤を含む癌の予防または治療用の医薬組成物。
   

   
2. （Ｓ）−Ｎ−（４−（３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−４−（３，４，５−トリメトキシベンゾイル）フェニル）チアゾール−２−イル）−２−アミノ−３−メチルブタンアミドの薬学的に許容可能な塩は塩酸塩である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記化学式１で表される化合物の活性代謝産物は、下記化学式２で表される（４−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）フェニル）（３，４，５−トリメトキシフェニル）メタノンである、請求項１に記載の医薬組成物。
   

   
4. 前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、融合タンパク質、アプタマーおよびその免疫チェックポイントタンパク質−結合断片から選択されるいずれか一つ以上である、請求項１に記載の医薬組成物。
5. 前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体、その誘導体またはその抗原−
   結合断片；抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その誘導体またはその抗原−結合断片；および抗ＰＤ−１抗体、その誘導体またはその抗原−結合断片から選択されるいずれか一つ以上である、請求項１に記載の医薬組成物。
6. 前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体またはこれらの全てである、請求項１に記載の医薬組成物。
7. 前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。
8. 前記癌は、大腸癌、皮膚黒色腫、肺癌、胃癌、リンパ腫、メルケル細胞腫、尿路腫瘍および多発性骨髄腫から選択されるいずれか一つである、請求項１に記載の医薬組成物。
9. 前記免疫チェックポイント阻害剤は低分子化合物である、請求項１に記載の医薬組成物。
10. 前記（Ｓ）−Ｎ−（４−（３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−４−（３，４，５−トリメトキシベンゾイル）フェニル）チアゾール−２−イル）−２−アミノ−３−メチルブタンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩は経口投与されるものである、請求項１に記載の医薬組成物。
11. 前記免疫チェックポイント阻害剤は非経口投与されるものである、請求項１に記載の医薬組成物。
12. 下記化学式１で表される（Ｓ）−Ｎ−（４−（３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−４−（３，４，５−トリメトキシベンゾイル）フェニル）チアゾール−２−イル）−２−アミノ−３−メチルブタンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩、および免疫チェックポイント阻害剤を必要とする個体に投与することを含む癌の治療方法。
    

    
13. （Ｓ）−Ｎ−（４−（３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−４−（３，４，５−トリメトキシベンゾイル）フェニル）チアゾール−２−イル）−２−アミノ−３−メチルブタンアミドの薬学的に許容可能な塩は塩酸塩である、請求項１２に記載の治療方法。
14. 前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体、その誘導体またはその抗原−結合断片；抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その誘導体またはその抗原−結合断片；および抗ＰＤ−１抗体、その誘導体またはその抗原−結合断片から選択されるいずれか一つ以上である、請求項１２に記載の治療方法。
15. 癌治療用薬剤を製造するための下記化学式１で表される（Ｓ）−Ｎ−（４−（３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−４−（３，４，５−トリメトキシベンゾイル）フェニル）チアゾール−２−イル）−２−アミノ−３−メチルブタンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩、および免疫チェックポイント阻害剤の用途。
    

    
16. （Ｓ）−Ｎ−（４−（３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−４−（３，４，５−トリメトキシベンゾイル）フェニル）チアゾール−２−イル）−２−アミノ−３−メチルブタンアミドの薬学的に許容可能な塩は塩酸塩である、請求項１５に記載の用途。
17. 前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体、その誘導体またはその抗原−結合断片；抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その誘導体またはその抗原−結合断片；および抗ＰＤ−１抗体、その誘導体またはその抗原−結合断片から選択されるいずれか一つ以上である、請求項１５に記載の用途。
18. 癌の治療に用いるための下記化学式１で表される（Ｓ）−Ｎ−（４−（３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−４−（３，４，５−トリメトキシベンゾイル）フェニル）チアゾール−２−イル）−２−アミノ−３−メチルブタンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩、および免疫チェックポイント阻害剤を含む組成物。
    

    
19. （Ｓ）−Ｎ−（４−（３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−４−（３，４，５−トリメトキシベンゾイル）フェニル）チアゾール−２−イル）−２−アミノ−３−メチルブタンアミドの薬学的に許容可能な塩は塩酸塩である、請求項１８に記載の組成物。
20. 前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体、その誘導体またはその抗原−結合断片；抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その誘導体またはその抗原−結合断片；および抗ＰＤ−１抗体、その誘導体またはその抗原−結合断片から選択されるいずれか一つ以上である、請求項１８に記載の組成物。

Images