JP2020515582A - 腫瘍関連マクロファージの治療における使用のための葉酸コンジュゲート - Google Patents

Abstract

本明細書においてコンジュゲート5として記載されるコンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩を使用する、がんの治療方法が提供される。腫瘍関連マクロファージを標的とする、コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を使用する、がんの治療方法も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2017年3月29日出願のPCT国際出願番号PCT/US2017/024770に対する優先権を主張する。上記出願の開示の全体は、参照することにより本出願に包含される。
技術分野
本明細書に記載の本発明は、式：

で示されるコンジュゲート(以下、「コンジュゲート5」と称する)を使用する、がんの治療方法に関する。本明細書に記載の本発明は、腫瘍関連マクロファージを標的とする、コンジュゲート5を使用するがんの治療方法にも関する。

放射線療法、化学療法、ホルモン療法などの抗がん技術における重要な開発が行われているという事実にもかかわらず、がんは依然として米国の心臓病に続く第2の主要な死因である。がんは、ほとんどの場合、マイトマイシン、パクリタキセル、カンプトテシンなどの非常に強力な薬物を利用した化学療法で治療される。多くの場合、これらの化学療法剤は用量反応効果を示し、細胞の死滅は薬物の用量に比例する。したがって、新生物を根絶するためには、非常に攻撃的なスタイルの投薬が必要である；しかしながら、高用量の化学療法は、がん細胞に対する選択性の低さと正常細胞に対する重度の毒性により妨げられる。この腫瘍特異的治療の欠如は、現在の化学療法で克服する必要がある多くの障害の1つである。

現在の化学療法の制限に対する1つの解決策は、生物学的に有効な濃度の薬剤を非常に高い特異性で腫瘍組織に送達することである。この目標を達成するために、抗がん剤をホルモン、抗体、およびビタミンと結合させることによって、腫瘍選択薬を開発するために多くの努力が払われてきた。たとえば、低分子量のビタミン、葉酸、および他の葉酸受容体結合化合物およびリガンドは、葉酸受容体陽性のがん細胞および腫瘍の標的化剤として特に有用である。

葉酸はビタミンBファミリーのメンバーであり、核酸とアミノ酸の生合成に関与することにより、細胞の生存に不可欠な役割を果たす。この必須ビタミンは、葉酸受容体陽性のがん細胞を標的とすることにより、複合抗がん剤の特異性を高める高親和性リガンドでもある。葉酸受容体(FR)は、非粘液性卵巣がんの90％以上で上方制御されていることが見いだされている。葉酸受容体は、腎臓がん、脳腫瘍、肺がん、および乳がんでも高〜中程度のレベルで見られる。同時に、ほとんどの正常組織では葉酸受容体が低レベルで発生し、それが、がん細胞を選択的に標的とするメカニズムにつながることが報告されている。葉酸受容体は非常に高い特異性で腫瘍組織に薬剤を送達するために使用できるが、葉酸受容体をまったく発現しない、または所望の特異性を提供するのに十分な数ではない多くのがんがある。したがって、そのような葉酸受容体陰性がんに薬剤を送達する標的療法を開発する必要がある。

腫瘍形成促進性である腫瘍関連マクロファージ(TAM)が存在する。これらのマクロファージは、腫瘍の微小環境に見られ、B細胞およびT細胞の活性化の阻害、腫瘍関連抗原提示の阻害、細胞傷害性顆粒放出の阻害、および血管新生の増加などの反応を引き起こすことにより、腫瘍形成促進性でありうる。したがって、TAMを枯渇させるか、またはTAMの活性を阻害する治療法は有用である。

出願人は、薬物をTAMに標的化することにより、葉酸受容体を過剰発現するか、または葉酸受容体を十分な数で発現しないか、またはまったく発現しない腫瘍およびがんを、治療できることを発見した。本明細書は、コンジュゲート5またはその薬学的に許容される塩をTAM標的化剤として使用してTAMを標的化することによる、がんの治療方法を記載する。出願人は、腫瘍形成促進性であるTAMのサブセットが、葉酸受容体2としても知られる葉酸受容体βを発現することを発見した。したがって、出願人は、これらの腫瘍形成促進性TAMを、葉酸を標的化リガンドとして使用してこれらのTAMにコンジュゲートを送達して、腫瘍形成促進性TAMを枯渇させるか、または阻害して、がん細胞自体が葉酸受容体を発現するかどうかにかかわらず、宿主動物のがんを治療できることを発見した。本明細書に記載の方法は、葉酸受容体を発現しないがん、ならびに葉酸受容体を発現するがんを治療するために使用できることを理解いただきたい。

1つの実施態様では、がんの治療方法が提供される。この方法は、宿主動物のがんにおける腫瘍関連マクロファージの存在を同定するステップ、および治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与するステップを含む。

もう1つの実施態様では、がんの治療方法が提供される。この方法は、宿主動物に治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を投与するステップを含み、ここで、宿主動物は以前に葉酸造影剤コンジュゲートを投与されており、宿主動物の葉酸受容体の状態は陰性であると決定されている。

もう1つの実施態様では、宿主動物における腫瘍関連マクロファージを阻害または枯渇させることによる、宿主動物におけるがんの治療方法が提供される。この方法は、コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を宿主動物に投与するステップを含み、ここで、腫瘍関連マクロファージは、抑制または枯渇される。

もう1つの実施態様では、宿主動物の腫瘍関連マクロファージを標的化する方法が提供される。この方法は、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与するステップを含み、ここで、腫瘍関連マクロファージは標的化される。

もう1つの実施態様では、腫瘍関連マクロファージが、がん、組織、または腫瘍の一部である、宿主動物におけるがんの治療方法が提供される。この方法は、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与し、腫瘍関連マクロファージを有するがんを治療するステップを含む。1つの実施態様では、コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩には、葉酸受容体αおよび/または葉酸受容体βに結合する葉酸が含まれる。

もう1つの実施態様では、葉酸受容体陰性がんの治療方法が提供される。この方法は、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与することを含み、ここで、腫瘍関連マクロファージは阻害または枯渇される。

もう1つの実施態様では、葉酸受容体陰性がんの治療方法が提供される。この方法は、腫瘍関連マクロファージを枯渇させるために、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与することを含む。

もう1つの実施態様では、葉酸受容体陰性がんの治療方法が提供される。この方法は、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与し、腫瘍関連マクロファージを有する葉酸受容体陰性がんを治療することを含む。

もう1つの実施態様では、宿主動物における葉酸受容体陰性がんの治療方法が提供される。この方法は、腫瘍関連マクロファージを標的化するために、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与することを含む。

本発明の追加の例示的かつ非限定的な実施態様は、以下の列挙された条項に記載される。以下の条項のすべての組み合わせは、本明細書に記載される本発明の追加の実施態様であると理解される。

1．治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与することを含む、葉酸受容体陰性がんの治療方法であって、腫瘍関連マクロファージが阻害または枯渇される方法。
2．腫瘍関連マクロファージを枯渇させるために、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与することを含む、葉酸受容体陰性がんの治療方法。
3．治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与し、腫瘍関連マクロファージを有する葉酸受容体陰性がんを治療することを含む、葉酸受容体陰性がんの治療方法。
4．腫瘍関連マクロファージを標的化するために、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与することを含む、葉酸受容体陰性がんの治療方法。
5．宿主動物のがんにおける腫瘍関連マクロファージの存在を同定するステップ、および治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与するステップを含む、がんの治療方法。
6．腫瘍関連マクロファージを阻害または枯渇させるために、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与するステップを含む、宿主動物におけるがんの治療方法。
7．腫瘍関連マクロファージを標的化するために、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与するステップを含む、宿主動物における腫瘍関連マクロファージを標的化する方法。
8．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、および／または、組織もしくは腫瘍の一部を形成する宿主動物におけるがんの治療方法であって、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与するステップ、および腫瘍関連マクロファージを有する葉酸受容体陰性がんを治療するステップを含む方法。
9．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性(pro-tumor)M2偏向CD163(+)表現型を有する、条項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
10．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向CD163(+)およびTGF-β(+)表現型を有する、条項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
11．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向CD11b(+)表現型を有する、条項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
12．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向CD163(+)およびCD11b(+)表現型を有する、条項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
13．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向F480(+)表現型を有する、条項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
14．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向F480(+)およびCD11b(+)表現型を有する、条項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
15．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向性であり、CD163(+)、IL10(+)、Arg1(+)、TGF-β(+)、VEGF(+)、CD206(+)、CD11b(+)、およびF480(+)表現型からなる群から選択される1つ以上のマーカーを発現する、条項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
16．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、および／または、組織もしくはがんの一部を形成し、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向性であり、CD163(+)、IL10(+)、Arg1(+)、TGF-β(+)、VEGF(+)、CD206(+)、CD11b(+)、およびF480(+)表現型からなる群から選択される1つ以上のマーカーを発現する、条項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
17．がんが、非小細胞肺がん、未分化甲状腺がん、膵管腺がん、頭頸部がん、表皮成長因子受容体陰性乳がん、中皮腫、成人古典的ホジキンリンパ腫、ブドウ膜黒色腫、膠芽腫、腎がん、平滑筋肉腫、および色素性絨毛結節性滑膜炎からなる群から選択される、条項1〜16のいずれか1つに記載の方法。
18．コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩が、宿主動物における腫瘍関連マクロファージを枯渇させる能力を有するか、または枯渇させる、条項1〜17のいずれか1つに記載の方法。
19．コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩が、宿主動物における腫瘍関連マクロファージの活性を阻害する能力を有するか、または阻害する、条項1〜18のいずれか1つに記載の方法。
20．コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩が、非経口剤形で宿主動物に投与される、条項1〜19のいずれか1つに記載の方法。
21．非経口剤形が、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、くも膜下投与剤形からなる群から選択される、条項20に記載の方法。
22．治療有効量が、約0.05 μmol/kg〜約6.0 μmol/宿主動物体重kgである、条項1〜21のいずれか1つに記載の方法。
23．治療有効量が、約0.05 μmol/kg〜約4.0 μmol/宿主動物体重kgである、条項1〜22のいずれか1つに記載の方法。
24．治療有効量が、約0.05 μmol/kg〜約2.0 μmol/宿主動物体重kgである、条項1〜23のいずれか1つに記載の方法。
25．治療有効量が、約0.05 μmol/kg〜約1.0 μmol/宿主動物体重kgである、条項1〜24のいずれか1つに記載の方法。
26．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向CD163(+)、IL10(+)、Arg1(+)、TGF-β(+)、VEGF(+)、CD206(+)、CD11b(+)、およびF480(+)表現型を有する、条項1〜8のいずれか1つに記載の方法。

本明細書に記載の実施態様のいずれかでは、がんは、葉酸受容体を発現してもよく、または葉酸受容体を発現しなくてもよい。前の段落の実施態様のいずれかでは、腫瘍関連マクロファージは、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージは、腫瘍促進性M2偏向CD163(+)表現型、腫瘍促進性M2偏向CD163(+)およびTGF-β(+)表現型、腫瘍促進性M2偏向CD163(+)、IL10(+)、Arg1(+)、TGF- β(+)、VEGF(+)、およびCD206(+)表現型を有してもよく、または腫瘍関連マクロファージは、腫瘍促進性M2偏向性であり、CD163(+)、IL10(+)、Arg1(+)、TGF-β(+)、VEGF(+)、CD206(+)、CD11b(+)、F480(+)、CD163(+)CD11b(+)、およびF480(+)CD11b(+)からなる群から選択される1つ以上のマーカーを発現してもよい。

本明細書に記載の実施態様のいずれかでは、がんは、非小細胞肺がん、未分化甲状腺がん、膵管腺がん、頭頸部がん、表皮成長因子受容体陰性乳がん、中皮腫、成人古典的ホジキンリンパ腫、ブドウ膜黒色腫、膠芽腫、腎がん、平滑筋肉腫、および色素性絨毛結節性滑膜炎からなる群から選択されうる。

本明細書に記載の実施態様のいずれかでは、コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩は、非経口剤形で宿主動物に投与されうる。非経口剤形は、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、くも膜下からなる群から選択されうる。
本明細書に記載の実施態様のいずれかでは、治療有効量は、約0.1 μmol/kg〜約6.0 μmol/kgのコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩；約0.1 μmol/kg〜約4.0 μmol/kgのコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩；または約0.1 μmol/kg〜約2.0 μmol/kgのコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩でありうる。

コンジュゲート5(●)およびコンジュゲート5と過剰の葉酸(■)で処置されたKB細胞に取り込まれた³H-チミジンのパーセンテージを示すチャートである。 0.5 μmol/kg SIWにて2週間投薬されたコンジュゲート5(上向き黒三角)が、非処置コントロール(■)と比較して、テストマウスのKB腫瘍サイズを減少させたことを示すチャートである。点線は、最終投薬日を示す。 非処置コントロール(■)と比較して、0.5 μmol/kgのコンジュゲート5 SIWにて2週間投薬されたテストマウス(上向き黒三角)の重量変化％を示すチャートである。 コンジュゲート5で0.5 μmol/kg SIWにて2週間投薬されたパクリタキセル耐性KB腫瘍を有するマウス(上向き黒三角)が、非処置コントロール(■)と比較して、腫瘍サイズが減少したことを示すチャートである。点線は、最終投薬日を示す。n＝5、{部分寛解、完全寛解、治癒}としてコンジュゲート5{0,1,4}。 コンジュゲート5で0.5 μmol/kg SIWにて2週間投薬されたプラチナ耐性KB腫瘍を有するマウス(■)、およびEC1456(下向き黒三角)で2.0 μmol/kg BIWにて2週間投薬されたプラチナ耐性KB腫瘍を有するマウス(下向き黒三角)が、非処置コントロール(●)と比較して、腫瘍サイズが減少したことを示すチャートである。点線は、最終投薬日を示す。n＝4、{部分寛解、完全寛解、治癒}としてコンジュゲート5{0,0,4}；EC1446 {0,2,2}。 コンジュゲート5で0.3 μmol/kg BIWにて2週間投薬されたST502 TNBC PDX腫瘍を有するマウス(上向き黒三角)は、非処置コントロール(■)と比較して、腫瘍サイズが減少したが、EC1456で2.0 μmol/kg BIWにて2週間投薬されたマウス(●)は、非処置コントロール(■)と比較して、腫瘍サイズが減少しなかったことを示すチャートである。点線は、最終投薬日を示す。n＝7、{部分寛解、完全寛解、治癒}としてコンジュゲート5{0,0,7}。 コンジュゲート5で0.5 μmol/kg SIWにて2週間投薬されたST070卵巣PDX腫瘍を有するマウス(●)は、非処置コントロール(■)と比較して、腫瘍サイズが減少したが、EC1456で4.0 μmol/kg SIWにて2週間投薬されたマウス(上向き黒三角)またはパクリタキセルで15.0 mg/kg SIWにて2週間投薬されたマウス(下向き黒三角)は、腫瘍サイズが減少しなかったことを示すチャートである。点線は、最終投薬日を示す。n＝7、{部分寛解、完全寛解、治癒}としてコンジュゲート5{0,0,7}。 葉酸受容体に対するコンジュゲート5の相対的結合親和性を示すチャートである。実験は、コンジュゲート5の相対的結合親和性が葉酸の相対的結合親和性よりも〜1.9低かったことを示す。(■)葉酸(コントロール)；(●)コンジュゲート5。 無傷のコンジュゲート5は、DNAを架橋することができないが、還元型(DTTで処置)は、活性分子を放出し、次いで、DNAと架橋することができることを示すグラフである。(●)コンジュゲート5＋DTT；(■)DTTなしのコンジュゲート5。 0.1 μmol/kg SIWにて2週間投薬されたコンジュゲート5(■)および0.15 μmol/kg SIWにて2週間投薬されたコンジュゲート5(上向き黒三角)が、非処置コントロール(●)と比較して、テストラットのKB腫瘍サイズを減少させたを示すチャートである。点線は、最終投薬日を示す。 非処置コントロール(●)と比較した、0.1 μmol/kg コンジュゲート5 SIWにて2週間投薬されたテストラット(■)および0.15 μmol/kg コンジュゲート5 SIWにて2週間投薬されたテストマウス(上向き黒三角)の重量変化％を示すチャートである。 0.27 μmol/kg BIWにて2週間投薬されたコンジュゲート5(●)は、非処置コントロール(■)と比較して、テストマウスのTNBC PDX腫瘍サイズを減少させたが、1.0 μmol/kg SIWにて2週間投薬されたメシル酸エリブリン(上向き黒三角)は、TNBC PDX腫瘍サイズを減少させなかったことを示すチャートである。 0.27 μmol/kg BIWにて2週間投薬されたコンジュゲート5(●)は、非処置コントロール(■)と比較して、テストマウスの子宮内膜PDX腫瘍サイズにおいて部分寛解を引き起こしたが、15.0 mg/kg SIWにて2週間投薬されたパクリタキセル(上向き黒三角)は、部分寛解を引き起こさなかったことを示すチャートである。 コンジュゲート5で処置されたID8-CI15卵巣がん細胞における、〜0.52(72時間)、0.61(96時間)、および0.17(120時間)という相対的IC₅₀値を有する、細胞増殖の強力な用量依存性阻害を示すチャートである。 コンジュゲート5が、2時間の曝露および9日間の追跡後に、テストしたすべての濃度(1 nM、10 nMおよび100 nM)で強力な活性を実証したことを示すグラフである。コンジュゲート5の抗腫瘍活性は、濃度1 nMおよび10 nMという過剰量の葉酸の存在下で有意に減少した。 機能的FRレベルが、IGROV1ヒト卵巣がん細胞において測定されたことを示すグラフである：(a)hHLA+ CD45-腹水がん細胞[FR+＝6.04％；(b)腹水F480+ CD11+ macs [FR+＝52.6％]；(c)IGROV細胞株コントロール[FR+＝98.5％]。 マウス卵巣細胞株ID8-CL15のIP注射後7日間隔で免疫応答性C57BL6マウスの総腹膜細胞において定量されたCD4+およびCD8+ T細胞の存在を示すチャートである(図15A)。CD45+ CD3e+ CD8+ CD4- T細胞(■)の数は、移植後第7日から第42日までゆっくりと増加した。CD45+ CD3e+ CD4+ CD8- T細胞(上向き黒三角)の数もまた、第7日から第35日まで増加した ID8-CL15移植マウスからのCD45-非骨髄由来腹水細胞は、非常に少ない機能的FRしか発現しなかったが(図15B(■)参照)、腹水マクロファージは、有意な量の機能的FRを発現した(図15B(●)参照)ことを示すチャートである。 腹水マクロファージが、有意な量の機能的FRを発現したことを示すチャートである。 100 nmol/kg BIW、6回投薬、第7日に最初の投薬にて投薬されたコンジュゲート5(上向き黒三角)が、非処置コントロール(●)および250 μg/投薬 BIW、5回投薬にて投薬された抗CTLA-5単独と比較して、テストマウスの生存時間を増加させたことを示すチャートであり、コンジュゲート5は、2000nmol/kg BIW、6回投薬、第7日に最初の投薬にて投与された有意に高い投薬量の比較化合物EC1456(下向き黒三角)に匹敵する。図16Aはまた、第11日に開始され、抗CTLA-5とともに投薬されたコンジュゲート5(○)が、すべての他のテスト動物と比較して、テストマウスの生存時間を増加させたことを示す。点線は、最終投薬日を示す。 非処置コントロール(●)と比較した、コンジュゲート5(上向き黒三角)、コンジュゲート5 + 抗CTLA-5(■)、EC1456(下向き黒三角)および抗CTLA-5(○)を投薬されたテストマウスの重量変化％を示すチャートである。 最初の投薬が第7日であり、0.1 μmol/kg、BIW x 3、6回投薬にて投薬されたコンジュゲート5(○)が、最初の投薬が第7日であり、2 μmol/kg、BIW x 3、6回投薬にて投薬された有意に高い投薬量の比較化合物EC1456(下向き黒三角)および非処置コントロール(●)と比較して、テストマウスの生存時間を増加させたことを示すチャートである。 図17Aに記載のように、コンジュゲート5(○)、EC1456(下向き黒三角)、および非処置コントロール(●)を投薬されたテストマウスの重量変化％を示すチャートである。 第21日から投薬を開始して、0.1 μmol/kg、DO-2 x 3にて、n=5マウス(動物は軽度の運動失調を示した)に投薬されたコンジュゲート5(○)が、第21日から投薬を開始して、2 μmol/kg、DO-2 x 3にて、n=2マウス(3匹は重篤な皮膚炎のため第44日に安楽死させた)に投薬された有意に高い投薬量の比較化合物EC1456(下向き黒三角)および非処置コントロール(●)と比較して、テストマウスの生存時間を増加させたことを示すチャートである。 図18Aに記載のように、コンジュゲート5(○)、EC1456(下向き黒三角)、および非処置コントロール(●)を投薬されたテストマウスの重量変化％を示すチャートである。 0.3 μmol/kg、D35、D42、SIW x 2にて投薬されたコンジュゲート5(○)が、2 μmol/kg、DO-2 x 2にて投薬された有意に高い投薬量の比較化合物EC1456(下向き黒三角)および非処置コントロール(●)と比較して、テストマウスの生存時間を増加させたことを示すチャートである。 図19Aに記載のように、コンジュゲート5(○)、EC1456(下向き黒三角)、および非処置コントロール(●)を投薬されたテストマウスの重量変化％を示すチャートである。 0.3 μmol/kg、SIW x 2にて投薬されたコンジュゲート5(○)が、2 μmol/kg、DO-2 x 1にて投薬された有意に高い投薬量の比較化合物EC1456(下向き黒三角)および非処置コントロール(●)と比較して、テストマウスの生存時間を増加させたことを示すチャートである。 図20Aに記載のように、コンジュゲート5(○)、EC1456(下向き黒三角)、および非処置コントロール(●)を投薬されたテストマウスの重量変化％を示すチャートである。 ID8-Cl15担がんマウスのさまざまなステージに対するコンジュゲート5およびEC1456の比較である。 4T1-Cl2腫瘍細胞に対するコンジュゲート5のインビトロ活性の比較である。 4T1p腫瘍細胞に対するコンジュゲート5のインビトロ活性の比較である。 2時間の曝露および9日間の追跡後のヒトIGROV細胞に対するコンジュゲート5およびEC1456のインビトロ活性の比較である。 図24Aは、4T1pおよび4T1-Cl2腫瘍中の腫瘍関連マクロファージの評価である。図24Bは、4T1p腫瘍中に見出された腫瘍関連マクロファージはFRβを発現したが、他の非マクロファージ骨髄細胞(MDSC)はFRβネガティブであったことを示す。図24Cは、4T1-Cl2腫瘍中に見出された腫瘍関連マクロファージはFRβを発現したが、他の非マクロファージ骨髄細胞(MDSC)はFRβネガティブであったことを示す。 200 nmol/kg(BIW x 2)でのコンジュゲート5処置(A)および非処置コントロール(B)による、DOI 4/20/16 5x10⁵ 乳房腫瘍のP-1780 4T1P Balb/cマウス腫瘍体積を示すチャートである。 4Aに記載のように、コンジュゲート5(A)および非処置コントロールを投薬されたテストマウスの重量変化％を示すチャートである。 200 nmol/kg(BIW x 2)でのコンジュゲート5処置(A)および非処置コントロール(B)による、DOI 4/7/16 5x10⁵ 乳房腫瘍のP-1780 4T1P Balb/cマウス腫瘍体積を示すチャートである。 5Aに記載のように、コンジュゲート5(A)および非処置コントロールを投薬されたテストマウスの重量変化％を示すチャートである。 非処置コントロール(●)、コンジュゲート5(■)、コンジュゲート5 + EC0923(上向き黒三角)、およびEC0923(下向き黒三角)で処置した場合のアポトーシスCD163-CD11b-、CD163-CD11b+、およびCD163+CD11b+を実証するチャートを含む。

例示的実施態様の詳細な記載
本明細書に記載の本発明の各実施態様は、適用可能な場合、本明細書に記載の他の実施態様と組み合わせてもよいことを理解すべきである。たとえば、要約(Summary)の実施態様のいずれか、および／または本明細書に記載の列挙された条項、またはそれらの組み合わせは、詳細な説明に記載された実施態様のいずれかと組み合わせることができる。

出願人は、コンジュゲート5またはその薬学的に許容される塩をTAM標的化剤として使用して、TAM(たとえば、腫瘍促進性M2偏向TAM)を標的化することによる、がんの治療方法を発見した。出願人は、腫瘍形成促進性であるTAMのサブセットが、葉酸を標的化剤として使用して、コンジュゲート5またはその薬学的に許容される塩でTAMを標的化するのに有用な葉酸受容体βを発現することを発見した。1つの実施態様では、TAMを枯渇させるため、またはTAMの活性を阻害するために腫瘍形成促進性TAMを標的とすることが、腫瘍増殖の阻害、腫瘍の除去、または安定した疾患、および宿主動物に対する同様の治療効果をもたらす。本明細書に記載の方法は、葉酸受容体を発現しないがん、および葉酸受容体を発現するがんの治療に使用できる。

1つの実施態様では、本明細書に記載の腫瘍関連腫瘍は、腫瘍促進性およびM2偏向であり、枯渇させるか、または阻害されると、宿主動物の状態が改善される可能性がある。このようなTAMには、CD163(+)、IL10(+)、Arg1(+)、TGF-β(+)、VEGF(+)、CD206(+)、CD11b(+)、F480(+)、CD163(+)CD11b(+)、F480(+)CD11b(+)およびそれらの組み合わせから選択された1つ以上のマーカーの発現に起因する表現型を有することができる。もう1つの例示的態様では、腫瘍促進性およびM2偏向である本明細書に記載の腫瘍関連マクロファージは、CD163(+)表現型を有する。さらにもう1つの実施態様では、腫瘍促進性およびM2偏向である本明細書に記載の腫瘍関連マクロファージは、CD163(+)およびTGF-β(+)表現型を有する。もう1つの実施態様では、腫瘍促進性およびM2偏向である本明細書に記載の腫瘍関連マクロファージは、CD163(+)およびCD11b(+)表現型を有する。さらにもう1つの実施態様では、腫瘍促進性およびM2偏向である本明細書に記載の腫瘍関連マクロファージは、F480(+)およびCD11b(+)表現型を有する。もう1つの態様では、腫瘍促進性およびM2偏向である本明細書に記載の腫瘍関連マクロファージは、CD163(+)、IL10(+)、Arg1(+)、TGF-β(+)、VEGF(+)、CD206(+)、CD11b(+)、およびF480(+)マーカーの発現に起因する表現型を有する。もう1つの実施態様では、腫瘍促進性およびM2偏向である本明細書に記載の腫瘍関連マクロファージは、CD163(+)、IL10(+)、Arg1(+)、TGF-β(+)、VEGF(+)、およびCD206(+)、CD11b(+)、およびF480(+)からなる群から選択される1つ以上のマーカーの発現に起因する表現型を有する。1つの態様では、腫瘍中の腫瘍関連マクロファージ(たとえば、腫瘍促進性M2偏向TAM)の存在は、本明細書に記載の治療をしない宿主動物の予後不良を示す。

本明細書に記載のTAMを標的化することによるがんの治療方法の1つの実施態様では、方法は、宿主動物のがん中の腫瘍関連マクロファージ(たとえば、腫瘍促進性M2偏向TAM)の存在を特定し、治療有効量のコンジュゲート5またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与するステップを含む。

もう1つの実施態様では、TAM(たとえば、腫瘍促進性M2偏向TAM)を標的化することによるがんの治療方法が提供される。この方法は、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩、を宿主動物に投与するステップを含み、ここで、宿主動物が以前に葉酸造影剤コンジュゲートを投与されており、宿主動物の葉酸受容体状態が、陰性であると判断されている。

さらにもう1つの実施態様では、宿主動物において腫瘍関連マクロファージ(たとえば、腫瘍促進性M2偏向TAM)を阻害するか、または枯渇させることによる宿主動物のがんの治療方法が提供される。この方法は、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与するステップを含み、ここで、腫瘍関連マクロファージは、阻害されるか、または枯渇する。

もう1つの態様では、宿主動物において腫瘍関連マクロファージ(たとえば、腫瘍促進性M2偏向TAM)を標的化する方法が提供される。この方法は、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与するステップを含み、ここで、腫瘍関連マクロファージは、標的化される。

もう1つの例示的態様では、腫瘍関連マクロファージが、がんの中にある、宿主動物のがんの治療方法が提供される。この方法は、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与するステップ、および腫瘍関連マクロファージ(たとえば、腫瘍促進性M2偏向TAM)を有するがんを治療するステップを含む。もう1つの実施態様では、コンジュゲート5には、葉酸受容体αおよび/または葉酸受容体βに結合する葉酸が含まれる。

一般に、本明細書で用いられる語句「ここで、腫瘍関連マクロファージは、がんの中にある」は、がん(たとえば、腫瘍)の微小環境中に存在するか、または、たとえば、がん組織(たとえば、腫瘍組織)中に見られる腫瘍関連マクロファージ(たとえば、腫瘍促進性M2偏向TAM)を意味する。

本明細書に記載の方法は、そのような治療を必要とする、がんを有する「宿主動物」を治療するために使用される。1つの実施態様では、本明細書に記載の方法は、ヒト臨床医薬および獣医学的適用の両方に使用することができる。したがって、「宿主動物」には、本明細書に記載のコンジュゲートまたは葉酸造影剤コンジュゲート(後述)を投与することができ、宿主動物は、ヒト(たとえば、ヒト患者)でありえ、あるいは獣医学的適用の場合、実験動物、農業動物、ペット、または野生動物でありうる。1つの態様では、宿主動物は、げっ歯類(たとえば、マウス、ラット、ハムスターなど)、ウサギ、サル、チンパンジーなどの実験動物、イヌ、ネコおよびウサギなどのペット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの農業動物、ならびにクマ、パンダ、ライオン、トラ、ヒョウ、ゾウ、シマウマ、キリン、ゴリラ、イルカおよびクジラなどの飼育下での野生動物でありうる。

さまざまな実施態様では、本明細書に記載のがんは、良性腫瘍および悪性腫瘍を含む、腫瘍形成性のがん細胞集団でありえるか、またはがんは非腫瘍形成性でありうる。もう1つの実施態様では、がんは自発的に、または宿主動物の生殖細胞系に存在する突然変異などのプロセスまたは体細胞変異によって発生する可能性があり、またはがんは化学的、ウイルス性、または放射線誘発性である可能性がある。本明細書に記載の発明に適用可能ながんとして、がん腫、肉腫、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、上咽頭がん、白血病、腺がん、および骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの態様では、がんは、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部がん、頸部がん、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、子宮内膜がん(endometrial cancer)、直腸がん、胃がん、結腸がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵管がん、子宮内膜がん(carcinoma of the endometrium)、子宮頸がん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺のがん、非小細胞肺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、前立腺がん、白血病、リンパ腫、胸膜中皮腫、膀胱がん、バーキットリンパ腫、尿管がん、腎臓がん、中枢神経系の新生物、脳腫瘍、下垂体腺腫、または胃食道接合部の腺がんでありうる。

いくつかの態様では、がんは、非小細胞肺がん、未分化甲状腺がん、膵管腺がん、頭頸部がん、上皮成長因子受容体陰性乳がん、中皮腫、成人古典的ホジキンリンパ腫、ブドウ膜黒色腫、膠芽腫、腎がん、平滑筋肉腫、および色素性絨毛結節性滑膜炎からなる群から選択されうる。腫瘍関連マクロファージ(たとえば、腫瘍促進性M2偏向TAM)を有するあらゆるがんは、本発明に従って治療することができる。

本明細書に記載のコンジュゲート5は、式：

を有する化合物であることを理解すべきである。

コンジュゲート5の薬学的に許容される塩も使用できる。

本発明の追加の例示的かつ非限定的な実施態様は、以下の列挙された条項に記載される。以下の条項のすべての組み合わせは、本明細書に記載される本発明の追加の実施態様であると理解される。

1．治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与することを含む、葉酸受容体陰性がんの治療方法であって、腫瘍関連マクロファージが阻害または枯渇される方法。
2．腫瘍関連マクロファージを枯渇させるために、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与することを含む、葉酸受容体陰性がんの治療方法。
3．治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与し、腫瘍関連マクロファージを有する葉酸受容体陰性がんを治療することを含む、葉酸受容体陰性がんの治療方法。
4．腫瘍関連マクロファージを標的化するために、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与することを含む、葉酸受容体陰性がんの治療方法。
5．宿主動物のがんにおける腫瘍関連マクロファージの存在を同定するステップ、および治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与するステップを含む、がんの治療方法。
6．腫瘍関連マクロファージを阻害または枯渇させるために、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与するステップを含む、宿主動物におけるがんの治療方法。
7．腫瘍関連マクロファージを標的化するために、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与するステップを含む、宿主動物における腫瘍関連マクロファージを標的化する方法。
8．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、および／または、組織もしくは腫瘍の一部を形成する宿主動物におけるがんの治療方法であって、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与するステップ、および腫瘍関連マクロファージを有する葉酸受容体陰性がんを治療するステップを含む方法。
9．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向CD163(+)表現型を有する、条項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
10．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向CD163(+)およびTGF-β(+)表現型を有する、条項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
11．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向CD11b(+)表現型を有する、条項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
12．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向CD163(+)およびCD11b(+)表現型を有する、条項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
13．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向F480(+)表現型を有する、条項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
14．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向F480(+)およびCD11b(+)表現型を有する、条項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
15．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向性であり、CD163(+)、IL10(+)、Arg1(+)、TGF-β(+)、VEGF(+)、CD206(+)、CD11b(+)、およびF480(+)表現型からなる群から選択される1つ以上のマーカーを発現する、条項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
16．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、および／または、組織もしくはがんの一部を形成し、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向性であり、CD163(+)、IL10(+)、Arg1(+)、TGF-β(+)、VEGF(+)、CD206(+)、CD11b(+)、およびF480(+)表現型からなる群から選択される1つ以上のマーカーを発現する、条項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
17．がんが、非小細胞肺がん、未分化甲状腺がん、膵管腺がん、頭頸部がん、表皮成長因子受容体陰性乳がん、中皮腫、成人古典的ホジキンリンパ腫、ブドウ膜黒色腫、膠芽腫、腎がん、平滑筋肉腫、および色素性絨毛結節性滑膜炎からなる群から選択される、条項1〜16のいずれか1つに記載の方法。
18．コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩が、宿主動物における腫瘍関連マクロファージを枯渇させる能力を有するか、または枯渇させる、条項1〜17のいずれか1つに記載の方法。
19．コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩が、宿主動物における腫瘍関連マクロファージの活性を阻害する能力を有するか、または阻害する、条項1〜18のいずれか1つに記載の方法。
20．コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩が、非経口剤形で宿主動物に投与される、条項1〜19のいずれか1つに記載の方法。
21．非経口剤形が、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、くも膜下投与剤形からなる群から選択される、条項20に記載の方法。
22．治療有効量が、約0.05 μmol/kg〜約6.0 μmol/宿主動物体重kgである、条項1〜21のいずれか1つに記載の方法。
23．治療有効量が、約0.05 μmol/kg〜約4.0 μmol/宿主動物体重kgである、条項1〜22のいずれか1つに記載の方法。
24．治療有効量が、約0.05 μmol/kg〜約2.0 μmol/宿主動物体重kgである、条項1〜23のいずれか1つに記載の方法。
25．治療有効量が、約0.05 μmol/kg〜約1.0 μmol/宿主動物体重kgである、条項1〜243のいずれか1つに記載の方法。
26．腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向CD163(+)、IL10(+)、Arg1(+)、TGF-β(+)、VEGF(+)、CD206(+)、CD11b(+)、およびF480(+)表現型を有する、条項1〜8のいずれか1つに記載の方法。

コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩の投薬量は、宿主動物の状態、治療されているがん、コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩の投与経路、および組織分布、および放射線療法などの他の治療法の併用のまたは併用療法における追加薬の可能性に応じて大幅に異なりうる。宿主動物に投与される治療有効量は、宿主動物の体表面積、質量、および状態の医師の評価に基づく。治療有効量は、たとえば、限定的ではないが、0.01 mg/kg、0.02 mg/kg、0.03 mg/kg、0.04 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.3 mg/kg、0.4 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、1.5 mg/kg、2.0 mg/kg、2.5 mg/kg、3.0 mg/kg、3.5 mg/kg、4.0 mg/kg、4.5 mg/kg、および5.0 mg/kg(すべての宿主動物の体重kg当たりである)などの約0.05 mg/宿主動物の体重kg〜約30.0 mg/宿主動物の体重kg、または約0.01 mg/宿主動物の体重kg〜約5.0 mg/宿主動物の体重の範囲でありうる。コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩の総治療有効量は、単回投与または分割投与で投与されてもよく、医師の裁量で、本書に記載されている典型的な範囲外になる場合がある。

もう1つの実施態様では、コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩は、約0.5 μg/m²〜約500 mg/m²、約0.5 μg/m² 〜約300 mg/m²、または約100 μg/m² 〜約200 mg/m²の治療有効量で投与されうる。他の実施態様では、この量は、約0.5 mg/m²〜約500 mg/m²、約0.5 mg/m²〜約300 mg/m²、約0.5 mg/m²〜約200 mg/m²、約0.5 mg/m²〜約100 mg/m²、約0.5 mg/m²〜約50 mg/m²、約0.5 mg/m²〜約600 mg/m²、約0.5 mg/m²〜約6.0 mg/m²、約0.5 mg/m²〜約4.0 mg/m²または約0.5 mg/m²〜約2.0 mg/m²でありうる。総量は、単回投与または分割投与で投与されてもよく、医師の裁量で、本書に記載されている典型的な範囲外になる場合がある。これらの量は、宿主動物の体表面積のm²に基づく。

もう1つの実施態様では、コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩は、約0.05 μmol/kg〜約6.0 μmol/kg、約0.05 μmol/kg〜約5.0 μmol/kg、約0.05 μmol/kg〜約4.0 μmol/kg、約0.05 μmol/kg〜約3.0 μmol/kg、約0.05 μmol/kg〜約2.0 μmol/kg、約0.05 μmol/kg〜約1.0 μmol/kg、約0.05 μmol/kg〜約0.5 μmol/kg、約0.05 μmol/kg〜約0.4 μmol/kg、約0.05 μmol/kg〜約0.3 μmol/kg、約0.05 μmol/kg〜約0.2 μmol/kg、または約0.05 μmol/kg〜約0.1 μmol/kgの治療有効量で投与されうる。コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩の総治療有効量は、単回投与または分割投与で投与されてもよく、医師の裁量で、本書に記載されている典型的な範囲外になる場合がある。いずれの場合でも、これらの量は、宿主動物体重の「kg」に基づく。

コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を投与するための任意の効果的なレジメンを使用することができる。たとえば、コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩は、単回投与として投与することができ、または分割して複数回投与の毎日のレジメンとして投与することができる。さらに、毎日の治療の代替として、たとえば、週に1〜3日、時間をずらしたレジメンを使用することができ、そのような断続的または時間をずらした毎日のレジメンは、毎日の治療と等価であり、本開示の範囲内であるとみなされる。1つの実施態様では、宿主動物は、複数回の注射の治療ゲート5、またはその薬学的に許容される塩で治療される。1つの実施態様では、たとえば、宿主動物は、コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を、たとえば12-72時間間隔または48-72時間間隔で複数回注射されてもよい。コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩の追加の注射は、最初の注射から数日または数ヶ月の間隔で宿主動物に投与することができ、その追加の注射は、病気の再発を防ぐ。

もう1つの実施態様では、コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩は、たとえば、少なくとも1時間、少なくとも4時間、少なくとも6時間、少なくとも8時間、少なくとも10時間、少なくとも12時間、または少なくとも24時間宿主動物に投与することができるか、あるいは、1日1回、1日2回、1日3回、毎日、隔日、毎週2回、毎週3回など、毎日または毎週投与することができ、あるいは、他の適切なレジメンを使用してもよい。

1つの実施態様では、葉酸に結合した造影剤を使用して、葉酸受容体の状態、および/または、がんが葉酸受容体を発現しているかどうか、および/または、がんに関連するTAMの存在を特定することができる。例示的な葉酸結合造影剤は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,128,893号および第9,731,035号に記載されている。

一般に、本明細書で使用される「腫瘍関連マクロファージ」(TAM)という用語は、がん、たとえば、腫瘍などの微小環境に存在し、TAMと一致する1つ以上のマーカーを持つマクロファージを示す。

一般に、本明細書で使用される「腫瘍関連マクロファージを抑制する」という用語は、TAMが腫瘍組織の血管新生を刺激する能力を低下または排除することにより、TAMの活性を低下または排除することを示す。

一般に、本明細書で使用される「腫瘍関連マクロファージを枯渇させる」という用語は、TAMをM2からM1表現型に移行させることを含めて、TAMの数を減らす、TAMを排除する、またはTAMを再分極させることを示す。

一般に、本明細書で使用される、TAMに関する「前腫瘍」という用語は、たとえば、Bおよび/またはT細胞活性化の阻害、腫瘍関連抗原提示の阻害、細胞傷害性顆粒放出の阻害、および/または、血管新生の増加などにより、腫瘍形成を増強させるTAMを示す。

一般に、本明細書で使用される「M2偏向」という用語は、M1であり、M1からM2表現型にシフトする可能性があるTAMを含む可能性がある腫瘍促進性TAMであるTAMを示す。

一般に、本明細書で使用される「組成物」という用語は、複数の成分を含む製品を示す。本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載の単離されたコンジュゲート5またはその塩、溶液、水和物、溶媒和物、および本明細書に記載の他の形態のコンジュゲート5から製造されうることを理解すべきである。ヒドロキシ、アミノ、および同様の基などの特定の官能基は、コンジュゲート5のさまざまな物理的形態で、水および/またはさまざまな溶媒との複合体を形成する可能性があることが理解される。組成物は、本明細書に記載のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩のさまざまな非晶質、非非晶質、部分結晶、結晶、および/または、他の形態学的形態から製造されうることも理解されるべきである。また、組成物は、本明細書に記載のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩のさまざまな水和物および/または溶媒和物から製造されうることも理解されるべきである。したがって、本明細書に記載されるコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩に係るそのような医薬組成物は、本明細書に記載されるさまざまな形態学的形態および/または溶媒和物もしくは水和物形態のそれぞれ、またはそれらの任意の組み合わせを包含すると理解されるべきである

本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、治療中の疾患または障害の症状の緩和が含まれるがこれらに限定されない、研究者、獣医、医師、または他の臨床医が求めている、被験者(すなわち、組織系、動物、またはヒト)の生物学的または医学的反応を誘発するコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩の量を示す。1つの態様では、治療有効量とは、任意の医学的治療に適用可能な合理的な利益/リスク比で疾患または疾患の症状を治療または緩和できる活性物質の量である。もう1つの態様では、治療有効量は、コンジュゲート5の不活性プロドラッグの量であり、通常の代謝プロセスを通じて変換されて一定量の活性コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を生成する場合、求められている被験者の生物学的または医学的反応を誘発する能力がある量である。

単剤療法または併用療法を示すかどうかにかかわらず、コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩の用量は、本明細書に記載されるコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩の投与中に発生する可能性のある毒性、またはその他の望ましくない副作用を参照して有利に選択されることも理解される。さらに、本明細書に記載の併用療法により、そのような毒性、またはその他の望ましくない副作用を示すコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩の、より低い用量の投与が可能になる可能性があることは理解され、ここで、このようなより低い用量は、毒性の閾値を下回っているか、または他の方法で共療法なしで投与されるよりも治療域が低い。

本明細書で使用される「投与する」には、本明細書に記載のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に導入するすべての手段が包含され、経口(po)、静脈内(iv)、筋肉内(im)、皮下(sc)、経皮、吸入、頬、眼、舌下、膣、直腸などが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載のコンジュゲートおよび組成物は、従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、および/またはビヒクルを含む単位剤形および/または製剤で投与することができる。

本明細書で使用される「医薬組成物」または「組成物」は、本明細書に記載のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物と、薬学的に許容される賦形剤などの他の化学成分との混合物を示す。医薬組成物の目的は、宿主動物へのコンジュゲートの投与を促進することである。本明細書に記載のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩の送達に適した医薬組成物およびその製造方法は、当業者には容易に明らかであろう。そのような組成物およびそれらの製造方法は、たとえば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第19版(Mack Publishing Company、1995)に見出すことができる。

「薬学的に許容される賦形剤」とは、希釈剤または担体などの、コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を示す。

本明細書に記載のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩は、がん、肉腫、リンパ腫、ホジキン病、黒色腫、中皮腫、バーキットリンパ腫、上咽頭がん、白血病、および骨髄腫；治療薬などの治療法に耐性のある関連がんを含む；などのがんの治療に利用することができる。耐性がんとして、パクリタキセル耐性がん、およびシスプラチン、カルボプラチン、オキサプラチン、ネダプラチンなどのプラチナ製剤耐性がんなどのプラチナ耐性がんが挙げられるが、これらに限定されない。がん細胞集団として、口腔、甲状腺、内分泌、皮膚、胃、食道、喉頭、膵臓、結腸、膀胱、骨、卵巣、子宮頸部、子宮、乳房、精巣、前立腺、直腸、腎臓、肝臓、胃および肺がんが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、がん細胞集団は、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼内黒色腫、卵巣がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、結腸がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰部がん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系(CNS)の新生物、原発性CNSリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫および下垂体腺腫などのがんを生成する。

本明細書に記載のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩、あるいは組成物は、経口投与されてもよい。経口投与には、コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩、あるいは組成物が胃腸管に入るように、嚥下が含まれる場合があり、あるいは、コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩、あるいは組成物が口から直接血流に入るよ、口腔または舌下投与が採用される場合がある。

経口投与に適した製剤として、錠剤、微粒子を含むカプセルなどの固体製剤、液体、または粉末、ロゼンジ(液体充填を含む)、噛む薬(chews)、マルチおよびナノ微粒子、ゲル、固溶体、リポソーム、フィルム、腟坐薬、スプレーおよび液体製剤が挙げられる。

液体製剤として、懸濁液、溶液、シロップおよびエリキシル剤が挙げられる。そのような製剤は、軟カプセルまたは硬カプセルの充填剤として利用することができ、典型的には、担体、たとえば、水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、または適切な油、および1つ以上の乳化剤および/または懸濁剤を含む。液体製剤は、たとえば、小袋から固体を再構成することによって製造することもできる。

本明細書に記載のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩は、治療Liang and ChenによるExpert Opinion in Therapeutic Patents、11(6)、981-986(2001)に記載されたものなどの速溶性、速崩壊性の剤形にも使用できる。錠剤の剤形の場合、投与量に応じて、コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩は、剤形の1重量％〜80重量％、より典型的には剤形の5重量％〜60重量％を構成してもよい。本明細書に記載のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩、および組成物に加えて、一般に、錠剤は崩壊剤を含む。崩壊剤の例として、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、微結晶セルロース、低級アルキル置換ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、アルファ化デンプンおよびアルギン酸ナトリウムが挙げられる。一般に、崩壊剤は、剤形の1重量％〜25重量％、好ましくは5重量％〜20重量％を構成する。

一般に、結合剤は、錠剤製剤に粘着性を付与するために使用される。適切な結合剤として、微結晶性セルロース、ゼラチン、糖、ポリエチレングリコール、天然および合成ゴム、ポリビニルピロリドン、アルファ化デンプン、ヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられる。錠剤には、ラクトース(一水和物、噴霧乾燥一水和物、無水物など)、マンニトール、キシリトール、デキストロース、スクロース、ソルビトール、微結晶性セルロース、デンプンおよび二塩基性リン酸カルシウム二水和物などの希釈剤も含まれてもよい。

錠剤は、ラウリル硫酸ナトリウムおよびポリソルベート80などの界面活性剤、ならびに二酸化ケイ素およびタルクなどの流動促進剤を任意に含んでもよい。存在する場合、界面活性剤は、錠剤の0.2重量％〜5重量％を構成し、流動促進剤は、錠剤の0.2重量％〜1重量％を構成する。

一般に、錠剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリルフマル酸ナトリウム、およびステアリン酸マグネシウムとラウリル硫酸ナトリウムの混合物などの滑沢剤も含まれる。一般に、滑沢剤は、錠剤の0.25重量％〜10重量％、好ましくは0.5重量％〜3重量％を構成する。

他の可能な成分として、酸化防止剤、着色剤、香味剤、防腐剤および矯味剤が挙げられる。例示的な錠剤は、最大約80％の薬物、約10重量％〜25約90重量％の結合剤、約0重量％〜約85重量％の希釈剤、約2重量％〜約10重量％の崩壊剤、および約0.25重量％〜約10重量％の滑沢剤を含む 。

錠剤ブレンドは、直接圧縮するか、またはローラーで圧縮して錠剤を形成してもよい。あるいは、錠剤ブレンドまたはブレンドの一部は、打錠前に、湿式、乾式、または溶融造粒、溶融凝固、または押出成形されてもよい。最終製剤は、1つ以上の層を含んでもよく、コーティングされてもコーティングされなくてもよい；最終製剤は、カプセル化されてもよい。錠剤の製剤法については、H. LiebermanおよびL. Lachmanによる、Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets、Vol. 1(Marcel Dekker、New York、1980)に議論されている。

ヒトまたは獣医用の消耗品である経口フィルムは、典型的には、迅速に溶解または粘膜付着することができる柔軟な水溶性または水膨潤性の薄膜剤形であり、通常、本明細書に記載のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を含む、フィルム形成ポリマー、結合剤、溶媒、保湿剤、可塑剤、安定剤または乳化剤、粘度調整剤および溶媒を含む。製剤の一部の成分は、複数の機能を実行する場合がある。

経口投与用の固体製剤は、即時放出および/または調節放出となるように製剤化することができる。調節放出製剤として、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的放出およびプログラム放出が挙げられる。

したがって、本明細書に記載のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩は、活性化合物の調節放出を提供する埋め込みデポーとして投与するための固体、半固体、またはチキソトロピー液体として製剤化することができる。そのような製剤の例として、薬物被覆ステントおよびポリ(乳酸-グリコール酸)(PGLA)ミクロスフェアが挙げられる。本開示の目的のための他の適切な調節放出製剤は、米国特許第6,106,864号に記載されている。高エネルギー分散、浸透性および被覆粒子などの他の適切な放出技術の詳細は、Vermaら(2001)によるPharmaceutical Technology On-line、25(2)、1-14に見出される。制御放出を達成するためのチューインガムの使用は、WO 00/35298に記載されている。

本明細書に記載のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩は、血流、筋肉、または内臓に直接投与することもできる。非経口投与に適した手段として、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内および皮下が挙げられる。

非経口投与に適したデバイスとして、針(マイクロニードルを含む)インジェクター、無針インジェクターおよび注入技術が挙げられる。非経口製剤は、典型的には、塩、炭水化物および緩衝剤(pH3〜9であるのが好ましい)などの賦形剤を含む水溶液であるが、用途によっては、それらは、無菌の非水性溶液として、または無菌の発熱物質を含まない水などの適切なビヒクルと組み合わせて使用される乾燥形態として、より適切に製剤化されうる。

たとえば、凍結乾燥による無菌条件下での非経口製剤の製造は、当業者に周知の標準的な製薬技術を使用して容易に達成することができる。非経口液剤の製造に使用される本明細書に記載の溶解性のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩の溶解度は、溶解度増強剤の組み込みなどの適切な製剤技術の使用により増加する場合がある。

本明細書に記載のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩は、皮膚または粘膜に局所的に、すなわち、皮膚に、または経皮的に投与することもできる。この目的のための典型的な製剤として、ゲル、ヒドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟膏、散布剤、包帯(dressing)、フォーム、フィルム、皮膚パッチ、ウエハー、インプラント、スポンジ、繊維、包帯(bandage)およびマイクロエマルジョンが挙げられる。リポソームも使用することができる。典型的な担体として、アルコール、水、鉱物油、流動ワセリン、白色ワセリン、グリセリン、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールが挙げられる。浸透促進剤を組み込むことができる-たとえば、FinninおよびMorganによるJ. Pharm Sci、88(10)、955-958(October 1999)を参照。局所投与の他の手段として、エレクトロポレーション、イオン導入、フォノフォレシス、ソノフォレシスおよびマイクロニードルまたは無針(たとえば、Powderject(商標)、Bioject(商標)、など)注射による送達が挙げられる。

局所投与用の製剤は、即時放出および/または調節放出となるように製剤化することができる。放出調節製剤として、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的放出およびプログラム放出が挙げられる。本明細書に記載のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を、典型的には、鼻腔内に、または無水粉末吸入器からの無水粉末(単独で、たとえばラクトースとの無水ブレンドでの混合物として、またはホスファチジルコリンなどのリン脂質と混合された混合成分粒子のいずれか)の形態で、あるいは1,1,1,2-テトラフルオロエタンまたは1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパンなどの適切な高圧ガスの使用の有りまたは無しで、加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー(好ましくは電気流体力学を使用して細かいミストを生成するアトマイザー)またはネブライザーからのエアロゾルスプレーとして、吸入によって投与することもできる。鼻腔内使用の場合、粉末は、生体接着剤、たとえば、キトサンまたはシクロデキストリンを含んでもよい。加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザーまたはネブライザーは、たとえば、活性剤の分散、可溶化もしくは延長放出のためのエタノール、もしくは水性エタノールまたは適当な代替剤、溶剤としての高圧ガス、およびソルビタントリオレエート、オレイン酸、またはオリゴ乳酸などの任意の界面活性剤を含む本開示のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩の溶液あるいは懸濁液を含む。乾燥粉末または懸濁液製剤で使用する前に、コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を吸入による送達に適したサイズ(通常5ミクロン未満)に微粉化してもよい。これは、スパイラルジェットミリング、流動層ジェットミリング、ナノ粒子を形成するための超臨界流体処理、高圧均質化、または噴霧乾燥などの、任意の適切な粉砕方法によって達成することができる。吸入器または吹き入れ器で使用するカプセル(たとえば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース製)、ブリスターおよびカートリッジは、本明細書に記載のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩、乳糖またはデンプンなどの適切な粉末ベースおよびイソロイシン、マンニトールまたはステアリン酸マグネシウムなどの性能改良剤の粉末混合物を含むように製剤化することができる。

ラクトースは、無水または一水和物の形態であってもよく、後者が好ましい。他の適切な賦形剤として、デキストラン、グルコース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、フルクトース、スクロースおよびトレハロースが挙げられる。典型的な製剤は、本開示のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩、プロピレングリコール、滅菌水、エタノールおよび塩化ナトリウムを含んでもよい。プロピレングリコールの代わりに使用できる代替溶媒として、グリセロールおよびポリエチレングリコールが挙げられる。

本明細書に記載のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩は、上記の投与モードのいずれかで使用するために、それらの溶解度、溶解速度、矯味、バイオアベイラビリティおよび/または安定性を改善するために、シクロデキストリンおよびその適切な誘導体またはポリエチレングリコール含有ポリマーなどの可溶性高分子実体と組み合わせることができる。

本明細書に開示されるすべての事例において、任意の変数の整数の範囲の記述は、記述された範囲、範囲内のあらゆる個々のメンバー、およびその変数のあらゆる可能な部分範囲を説明することを理解すべきである。たとえば、nが0〜8までの整数であるという記述は、その範囲、nが0であるか、またはnが1であるか、またはnが2であるなどの0、1、2、3、4、5、6、7、および8の個々の選択可能な値を記載する。さらに、nが0〜8までの整数であるという記述は、nが1〜8、1〜7、1〜6、2〜8、2〜7、1〜3、2〜4などの整数であるなどの、さらなる実施態様の基礎となりうるすべての部分範囲についても記載する。

本明細書に記載のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩は、非溶媒和形態ならびに水和形態を含む溶媒和形態で存在し得ることが理解される。一般に、溶媒和形態は、非溶媒和形態と等価であり、本発明の範囲内に含まれる。

もう1つの実施態様では、コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩の投与のための組成物および/または剤形は、少なくとも約90％、または約95％、または約96％、または約97％、または約98％、または約99％、または約99.5％の純度を有するコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩から製造される。もう1つの実施態様では、コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩の投与のための組成物および/または剤形は、少なくとも約90％、または約95％、または約96％、または約97％、または約98％、または約99％、または約99.5％の純度を有するコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩から製造される。

実施例
化学実施例
本明細書に記載のコンジュゲートおよび化合物は、本明細書に記載のプロセスおよび/または従来のプロセスに従って製造されたことを理解すべきである。例として、本明細書に記載のコンジュゲートの立体中心は、実質的に純粋(S)、実質的に純粋(R)、または任意の不斉炭素原子における(S)と(R)の任意の混合物であり、それぞれが、本明細書に記載のプロセスで使用されうる。同様に、これらの例示的な例に記載されたプロセスは、代替の出発物質および試薬の日常的な選択によって、本明細書に記載のプロセスのバリエーションを実施することにより、本明細書に記載の他のコンジュゲートを製造するために適合されうる。

化合物6の製造

ステップ1：化合物3の製造
THF(20 mL)中のバニリン酸メチル(2.18g、11.98 mmol)およびPh₃P(4.71 g、17.97 mmol)を0℃に冷却し、DIAD(2.59 mL、13.18 mmol)を滴下した。反応物を0℃にて1時間撹拌した。THF(20 mL)中の1,5-ペタンジオール(0.6 mL、5.75 mmol)を30分かけて添加した。反応物を一晩撹拌し、形成した沈殿物を、ろ過して収集した。ろ液を濃縮して、より多くの固体を形成させた。固体を合わせ、MeOH(5 mL)でトリチュレートして、他の物質が入っていない生成物である化合物3を70％の収率で1.74 g得た。¹H NMR(CDCl₃、δ in ppm)：7.66(m 2H)、7.62(m、2H)、6.87(m、2H)、4.10(m、4H)、3.89(m、12H)、1.95(m、4H)、1.69(m、2H)。¹³C NMR：166.88、152.50、148.86、132.12、132.04、131.88、128.52、128.42、123.50、122.55、112.35、111.46、68.67、56.03、51.93、28.73、22.52、21.92。

ステップ2：化合物4の製造
Ac₂O(1.2 mL)中の化合物3(201.2 mg、0.465 mmolを0℃に冷却し、次いで、Cu(NO₃)₂・3H₂O(280.3 mg、1.16 mmol)をゆっくりと添加し、1時間後、氷浴を除去した。反応物を室温にて4時間撹拌した。反応物に氷水を注ぎ入れ、黄色の沈殿が形成されるまで1時間撹拌し、ろ過して収集した。より冷たい水(2 mL、3 x)で固体を洗浄し、風乾した。198.4 mgの化合物4を収率82％で得た。LCMS：[M+NH₄]⁺ m/z =540。

ステップ3：化合物5の製造
化合物4(198.4 mg)をTHF(2 mL)に溶解させ、水性NaOH(2 mL、1 M)で処理し、40℃にて3時間加熱した。溶媒を減圧除去した。水相を濃HClでpH1に酸性化して、沈殿を形成させ、ろ過により収集し、H₂O(1 mL、3 x)で洗浄した。固体を風乾して、酸である187.7 mgの化合物5を定量的収率で得た。LCMS：[M+NH₄]⁺ m/z =512。

ステップ4：化合物6の製造
酸化合物5を0.5 M 水性NaOH(6 mL)に溶解させ、水素化parr反応器中、H₂(45 PSI)下、Pd/C(10％、4.82 mg)で水素化を行った。反応物を5時間振とうし、セライトパッドでろ過し、撹拌しながら、ろ液を濃HClでpH2-3に調節した。形成した沈殿をろ過により単離し、H₂O(1 mL、3 x)で洗浄した。高減圧下、P₂O₅の存在下で、固体をデシケーターで一晩乾燥させた。34.2 mgの化合物6を収率81％にて褐色固体で得た。LCMS：[M-H]^- m/z =433。

化合物8の製造

ステップ1：化合物7の製造
ウィッティッヒ反応により、(S)-1-tert-ブチル 2-メチル 4-オキソピロリジン-1,2-ジカルボキシレートを化合物7に変換した：THF(30 mL)中のPh₃PCH₃Br(917.8 mg、2.57 mmol)を0℃にてKO^tBu(1 MのTHF溶液、2.57 μL、2.57 mmol)を滴下することにより処理した。反応物を室温にて2時間保持した。撹拌溶液に、0-10℃にて、THF(20 mL)中のケトン(250 mg、1.028 mmol)を加えた。次いで、反応物を室温にて一晩撹拌した。大部分のTHFを真空除去した後、反応物にH₂O/EtOAc(1：1、40 mL)を加えて反応を停止した。水相をEtOAc(20 mL、3 x)で抽出し、有機相をH₂O、次いで塩水で洗浄し、無水Na₂SO₄上で乾燥させ、濃縮した。残渣を、0-50％ EtOAc/p-エーテルにてCombiFlashで精製して、77.2 mgの化合物7を収率31％で得た。LCMS：[M-Boc+H]⁺ m/z =142。

ステップ2：無水中間体の製造
DCM/トルエン(1：3、9.8 mL)中の(S)-1-tert-ブチル 2-メチル 4-メチレンピロリジン-1,2-ジカルボキシレート(353.2 mg、1.46 mmol)を、Dibal(1 Mトルエン溶液、2当量、2.92 mmol)で、アルゴン下-78℃にて滴下処理した。反応物を、-78℃にて約4時間撹拌した。次いで、反応物に、60 μLのMeOH、次いで5％ HCl(.5 mL)およびEtOAc(18 mL)を-78℃にて加えて反応を停止した。冷却浴を除去し、反応物を30分間撹拌した。EtOAc層を分離し、塩水で洗浄し、無水Na₂SO₄上で乾燥させ、濃縮して、粗アルデヒド中間体を得た。

ステップ3：化合物8の製造
粗アルデヒドを無水DCM(10 mL)に再溶解させ、アルゴン下で、無水MgSO₄(5 mmol、mg)の存在下、室温にてエタノールアミン(106 μL、1.75 mmol)で処理した。反応物を1時間撹拌した。次いで、この反応混合物に、FmocCl(755.4 mg、2.92 mmol)およびTEA(611 μL、4.38 mmol)を加え、反応物をアルゴン下、室温にて一晩撹拌した。反応物を0-50％ EtOAc/石油エーテルにてCombiFlashで精製して、334.2 mgの化合物8を収率46％(3ステップ)で得た。LCMS：[M+H]⁺ m/z =477。¹H NMR(CD₃OD、δ in ppm)：7.81(d、J=7.5Hz、2H)、7.60(d、J=7Hz、2H)、7.40(m、2H)、7.32(m、2H)、4.96(br、2H)、4.60(br,1H)、4.23(t、J=5.5 Hz、1H)、3.97(br、2H)、3.73(br、m、3H)、2.50(br、2H)、1.47(s、1H)、1.39(s、9H)。

化合物9の製造

化合物8をTFA/DCM(1：1)で室温にて30分間脱保護し、溶媒を減圧除去した。

化合物23の製造

ステップ1：3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸の製造
2,2’-ジピリジルジスルフィド(8.70 g、39.5 mmol)をMeOH(150 mL)に溶解させ、アルゴンで20分間パージした。3-メルカプトプロピオン酸(2.10 g、19.8 mmol)をMeOH(35 mL)に溶解させ、アルゴンで15分間パージした。3-メルカプトプロピオン酸溶液を、添加ロートを用いて、2,2’-ジピリジルジスルフィド溶液にゆっくりと加えた。LC/MSによって反応をモニターし、3-メルカプトプロピオン酸の消費が完了した後、反応混合物を濃縮し、120 gのC18カラムにロードした。MeCN/H₂O(0-100％)で精製を行った。LC/MSで画分を分析し、所望生成物を含有する画分を合わせ、減圧蒸発した。濃縮中、フラスコの底に油相が認められた。この油性残渣を水相から分離し、高減圧下で乾燥させて、所望生成物を無色固体(2.4 g)で得た。ｓらなる生成物を分離するために水相をEtOAcで抽出した。有機抽出物を塩水で洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させ、減圧濃縮して、所望生成物(0.5g)を得た。3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸を、白色固体(2.9 g、68％)として単離した；LC/MS(ESI-QMS)：m/z＝ 216.25(M + H)、¹H NMR(CD₃OD)：8.39(m、1H)、7.84(m、1H)、7.79(m、1H)、7.21(m、1H)、4.87(br、1H)、3.03(t、J＝6.8 Hz、2H)、2.70(t、J＝6.8 Hz、2H)。¹³C NMR(CD₃OD)：173.53、159.82、148.97、137.74、120.99、119.81、33.50、32.96。

ステップ2：化合物21の製造
DMF(7.85 mL)中のN-Fmoc-エチレンジアミン塩酸塩(500 mg、1.57 mmol)、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸(338 mg、1.57 mmol)、およびⁱPr₂NEt(839 uL、4.71 mmol)の溶液に、PyBOP(950 mg、1.57 mmol)を一度に加えた。反応混合物を、室温にて5分間撹拌し、次いで、高減圧濃縮した。粗混合物(50 mL)に水を加え、酢酸エチル(3 x 30 mL)で抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固して、淡黄色油状物を得た。生成物を、シリカクロマトグラフィー(0-80％ EtOAc/石油エーテル)でさらに精製した。生成物を、HPLCによる純度86％の白色固体として単離した(633 mg、84.1％)：LC/MS(ESI-QMS)：m/z＝480.56(M+H)、¹H NMR(500 MHz、CDCl₃)δ 8.44(d、J＝4.9、1H)、7.75(d、J＝7.3、2H)、7.59(m、3H)、7.40(t、J＝7.3、2H)、7.30(t、J＝7.3、2H)、7.09(t、J＝5.9、1H)、6.98(s、1H)、4.56(d、J＝6.8、2H)、4.17(t、J＝6.8、1H)、3.43(m、2H)、3.40(m、2H)、3.08(t、J＝6.4、2H)、2.60(t、J＝6.4、2H)。

ステップ3：化合物22の製造
乾燥フラスコにおいて、化合物21(318 mg、0.664 mmol、1.0当量)および2-メルカプト-2-メチル-プロパン-1-オール(92 mg、0.863 mmol、1.3当量)を、CHCl₃：MeOH(1：3、20 mL)に溶解させた。反応混合物を60℃にて4時間撹拌し、LC/MSによって完了までモニターした。溶媒を減圧除去して、油性残渣を得、次いで水を添加した後、EtOAc(3x)で抽出した。有機抽出物を合わせ、Na₂SO₄上で乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー(CH₂Cl₂/MeOH、0-4％)を用いて生成物をさらに精製して、化合物22(285 mg、90％)を得た：LC/MS(ESI-QMS)：m/z＝475.18(M+H)、¹H NMR(500 MHz CDCl₃)δ 7.78(d、J＝7.3 Hz、2H)、7.67(d、J＝7.3 Hz、2H)、7.40(dd、J＝14.7、7.9 Hz、2H)、7.32(dd、J＝14.7、7.9 Hz、2H)、6.38(s、1H)、5.35(s、1H)、4.40(d、J＝6.9 Hz、2H)、4.21(dd、J＝13.7、6.8 Hz、1H)、3.47(s、2H)、3.42-3.31(m、4H)、2.82(t、J＝6.9 Hz、2H)、2.58(t、J＝6.9 Hz、2H)、1.25(s、6H)。

ステップ4：化合物23の製造
無水MeCN(12 mL)中の化合物22(0.552 mg、1.16 mmol)の懸濁液に、アルゴン下、それぞれN,N’-ジスクシンイミジルカーボネート(0.358 g、1.40 mmol)およびピリジン(0.118 mL、1.45 mmol)を加えた。反応物を室温にて15分間撹拌すると反応物は、透明な溶液に変化した。LC/MS分析により反応が完了したことを確認した。反応混合物を濃縮し、シリカクロマトグラフィー(0-5％ CH₂Cl₂/MeOH)により精製して、化合物23(0.68 g、95％)を得た：LC/MS(ESI-QMS)：m/z＝616.24(M + H)、¹H NMR(500 MHz、CD3OD)δ 7.79(d、J1= 7.5 Hz、2H)、7.64(d、J1= 7.0 Hz、2H)、7.38(dd、J1= 8.0 Hz、J2= 7.5 Hz、2H)、7.30(dd、J1= 7.0 Hz、J2= 7.5 Hz、2H)、4.33(d、J1= 7.0 Hz、2H)、4.28(s、2H)、4.19(t、J1= 7.0 Hz、J2= 6.5 Hz、1H)、3.20-3.30(m、4H)、2.91(t、J1= 7.0 Hz、J2= 7.0 Hz、2H)、2.80(s、4H)、2.56(t、J1= 7.5 Hz、J2= 7.5 Hz、2H)、1.31(s、6H)；¹³C NMR(125 MHz、CD3OD)δ 172.41、169.81(2C)、157.60、151.59、143.92(2C)、141.19(2C)、127.37(2C)、126.74(2C)、124.79(2C)、119.53(2C)、75.90、66.40、48.39(2C)、39.83、39.05、35.58、35.12、24.98(2C)、23.05(2C)。

化合物26の製造

無水CH₂Cl₂(1 mL)中のN-Boc-4-メチレン-L-プロリナール(44.36 mg、0.2099 mmol)の溶液に、それぞれ無水CaSO₄(22 mg、0.16 mmol)およびエタノールアミン(10.56 μL、0.1750 mmol)を加えた。反応物を室温にて1時間撹拌した。別のフラスコにて、化合物23(108 mg、0.180 mmol)を無水CH₂Cl₂(1 mL)に溶解させた。先のピロリジン溶液をろ過し、化合物23溶液にゆっくりと加えた。反応混合物にEt₃N(0.037 mL、0.26 mmol)を加え、得られる混合物をLC/MSでモニターした。2時間撹拌した後、反応混合物をCH₂Cl₂で希釈し、飽和NH₄Cl_(水性)で洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させ、減圧濃縮した。残渣をシリカクロマトグラフィー(0-10％ CH₂Cl₂/MeOH)でさらに精製して、純粋な化合物26(83 mg、63％)を得た：LC/MS(ESI-QMS)：m/z＝755.38(M + H)、¹H NMR(500 MHz、CD₃OD)δ 7.79(d、J1= 8.0 Hz、2H)、7.64(d、J1= 7.5 Hz、2H)、7.38(dd、J1= 7.5 Hz、J2= 7.5 Hz、2H)、7.30(dd、J1= 7.5 Hz、J2= 7.5 Hz、2H)、5.13-5.20(m*、1H)、4.88-5.05(m*、2H)、4.36-4.60(m*、1H)、4.33(d、J1= 7.0 Hz、2H)、4.20(t、J1= 7.0 Hz、J2= 7.0 Hz、1H)、3.98-4.10(m*、3H)、3.72-3.94(m*、4H)、3.36-3.50(m*、1H)、3.18-3.30(m*、4H)、2.91(t、J1= 7.5 Hz、J2= 7.0 Hz、2H)、2.70-2.40(m*、2H)、2.54(t、J1= 7.0 Hz、J2= 7.0 Hz、2H)、1.40-1.50(m*、9H)、1.26-1.38(m*、6H)。
* 化合物のジアステレオマーおよび/または回転異性の性質のため。

［実施例１６］
化合物29の製造

化合物6(42.0 mg、0.097 mmol)、化合物9(0.053 mmol)、およびPyBOP(29.0 mg、0.056 mmol)をDMF/DCM(0.5 mL/0.5 mL)に溶解させ、アルゴン下、室温にてDIPEA(74 μL、0.43 mmol)で処理した。反応は1時間以内に完了し、次いで、反応物をCombiFlashカラムに0-20％ MeOH/DCMでロードして、純粋な生成物化合物29(25.5 mg、60％)を得た。LCMS：[M+H]⁺ m/z =793。

化合物32の製造

ステップ1：化合物32の製造
フラスコにおいて、化合物26(95.0 mg、0.126 mmol)を、0℃にて30％ TFA/CH₂Cl₂(10 mL)に溶解させた。反応混合物を室温に温め、1時間撹拌した。Boc保護基の除去が完了した後、溶媒を減圧除去し、粗残渣を高減圧下に3時間おいた。乾燥したフラスコにおいて、粗TFA塩および化合物29(100 mg、0.126 mmol)を、アルゴン下、無水DMF(2.5 mL)に溶解させた。反応混合物に、PyBOP(131 mg、0.252 mmol)およびⁱPr₂NEt(67 μl、0.378 mmol)を続いて加えた。3時間後、飽和NH₄Cl_(水性)の添加により、反応を停止し、EtOAc(3x)で抽出た。合わせた有機層をNa₂SO₄上で乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー(0-8％ MeOH/CH₂Cl₂)を用いて精製して、化合物32(153 mg、84.9％)を得た：LC/MS(ESI-QMS)：m/z＝1429.78(M + H)、¹H NMR(500 MHz CDCl₃)δ ピボット信号：δ 7.75-7.66(m、4H)、7.58-7.47(m、4H)、7.75-7.66(m、4H)、7.39-7.31(m、4H)、7.29-7.22(m、4H)、7.02-6.51(m、4H)、5.31-5.14(m、1H)、5.04-4.74(m、5H)、1.28-1.12(m、6H)。

［実施例２１］
コンジュゲート5の製造

化合物32(23 mg、0.016 mmol)およびジエチルアミン(0.25 mL、2.4 mmol)をCH₂Cl₂(0.6 mL)に溶解させ、反応混合物を、アルゴン下、室温にて3時間撹拌した。LC/MSにより反応をモニターし、化合物32の消費が完了した後、溶媒を減圧除去した。得られる残渣をCH₂Cl₂と2回共蒸発させ、15分間高減圧下で乾燥させる。得られる残渣をCH₂Cl₂(0.5 mL)に溶解させ、Mal-PEG4-NHSエステル(10.9mg、0.021 mmol)およびEt₃N(3.0 μL、0.021 mmol)を加えた。反応物を、アルゴン下、室温にて撹拌し、化合物34(m/z＝1323および662)の生成をLC/MSによりモニターした。1時間後、反応混合物を蒸発させ、得られる残渣をDMF(2 mL)に溶解させた。溶液をアルゴンでパージした。化合物16の製造のために参照により本願に組み込まれるPCT/US2011/037134(WO2011146707)に開示の方法で製造された化合物16(22 mg、0.021 mmol)を、pH7緩衝液(2 mL、50 mM NH₄HCO₃)に溶解させ、アルゴンでパージし、上記化合物34の溶液を加えた。反応物を、アルゴンでパージしながら室温にて撹拌した。コンジュゲート5の生成について反応をLC/MSによりモニターした(m/z＝791)。2時間後、プレパラティブPLC(10-100％ MeCN/50 mM NH₄HCO₃ pH7緩衝液)により精製して、2セットの異性体を得た：より短い保持時間の第一異性体セット1.9 mgおよびより長い保持時間の第二異性体セット7.4 mg。所望生成物を、3ステップでの収率24％で得た：LC/MS(ESI-QMS)：m/z＝791.25(M + 3H)、Major Product：¹H NMR(DMSO-D6、選択されたデータ)：8.61(s、1H)、7.72(d、NH)、7.55(d、J＝8.8 Hz、2H)、7.30(s、NH)、7.15(s、ArH)、7.01(s、ArH)、6.81(s、NH)、6.60(d、J＝8.8 Hz、2H+1H オーバーラップ)、6.54(s、ArH)、6.34(s、N=CH)、6.32(s、ArH)、5.11+5.06(m、2 H)、4.96 + 4.92 + 4.85(m、3H)、3.66 + 3.62(s+s、3 H)、3.61(s、3H)、3.55(t、3H)、3.35(t、3H)、1.21(s、br、6H)。Minor Product：¹H NMR(DMSO-D6、selected data)：8.61(s、1H)、7.72(d、NH)、7.55(d、J＝8.8 Hz、2H)、7.29(s、NH)、7.15(s、ArH)、7.01(s、ArH)、6.80(s、NH)、6.60(d、J＝8.8 Hz、2H+1H overlapped)、6.53(s、ArH)、6.32(s、N=CH)、6.31(s、ArH)、5.11+ 5.06(m、2H)、4.94-4.85(m、3 H)、3.66 + 3.62(s+s、3 H)、3.61(s、3H)、3.55(t、3H)、3.35(t、3H)、1.20(s、br、6H)。

生物学的実施例
総論
本明細書では次の略語を使用する：部分寛解(PR)、完全寛解(CR)、週1回(SIW)、隔週(M/F)(BIW)、週3回(M/W/F)(TIW)。本明細書で定義されるように、PRは、観察期間中に腫瘍の体積が以前の高い値から減少する場合に観察されるが、再増殖が発生する場合がある。本明細書で定義されるように、CRは、腫瘍体積が観察期間中にゼロまで減少する場合に観察されるが、再増殖が発生する場合がある。本明細書で定義されるように、腫瘍体積がゼロに減少し、観察期間中に再増殖しない場合、治癒が観察される。

方法1：細胞DNA合成の阻害
本明細書に記載のコンジュゲートは、限定的ではないが、以下に記載するような、対応する標的細胞の増殖を阻害する薬物の能力を予測するインビトロ細胞毒性アッセイを使用して評価された。

細胞型の選択は、コンジュゲートを形成する薬物に対する選択された細胞の感受性、および細胞表面受容体または標的抗原の相対的発現に基づいて行うことができることを理解すべきである。テストコンジュゲートは、本明細書に記載のように、細胞表面受容体または標的抗原結合化合物とPBDプロドラッグ、ポリPBDプロドラッグ、および混合PBDのコンジュゲートであった。細胞表面受容体または標的抗原に特異的である活性を評価するための競合研究のために、テスト細胞は、任意に、少なくとも100倍過剰の非コンジュゲート細胞表面受容体または標的抗原結合化合物の不在下または存在下で、さまざまな濃度のコンジュゲートに曝露される。

方法2：葉酸コンジュゲートのインビトロ葉酸受容体特異的活性アッセイ
KB細胞を個々の24ウェルファルコンプレートに播種し、葉酸を含まないロズウェルパーク記念研究所(FFRPMI)/熱不活化胎児ウシ血清(HIFCS)中で一晩、ほぼコンフルエントな単層を形成させた。葉酸コンジュゲートの添加の30分前に、使用済み培地をすべてのウェルから吸引し、新鮮なFFRPMIまたは100μM葉酸を補充したFFRPMIのいずれかで交換した。次いで、各ウェルに、葉酸コンジュゲートの濃度を増加させた1 mLの培地を入れた(サンプルあたり3ウェル)。細胞を37℃にて2時間パルスし、0.5mLの培地で4回すすぎ、次いで、72時間まで1mLの新鮮な培地中で追跡した。使用済みの培地をすべてのウェルから吸引し、5μCi/mLの³H-チミジンを含む新鮮な培地と交換した。37℃にて2時間インキュベートした後、細胞をPBS 0.5 mLで3回洗浄し、次いで、ウェル当たり0.5 mLの氷冷5％トリクロロ酢酸で処理した。15分後、トリクロロ酢酸を吸引し、0.5 mLの0.25 N水酸化ナトリウムを添加して、室温にて15分間細胞を可溶化した。450μLの各可溶化サンプルを、3 mLのEcolumeシンチレーションカクテルを含むシンチレーションバイアルに移し、液体シンチレーションカウンターでカウントした。最終結果は、非処置コントロールに対する³H-チミジンの取り込みのパーセンテージとして表した。本明細書に記載のコンジュゲートについては、用量依存性の細胞毒性は一般的に測定可能であり、ほとんどの場合、IC₅₀値(新たに合成されたDNAへの³H-チミジンの取り込みを50％まで減らすために必要な薬物コンジュゲートの濃度)は、ピコモルから低ナノモルの範囲であった。

実施例１：コンジュゲート5のインビトロ活性
図1では、コンジュゲート5(●)およびコンジュゲート5と過剰の葉酸(■)で処置されたKB細胞に取り込まれた³H-チミジンのパーセンテージが示される。

実施例２：相対的親和性アッセイ
FR陽性KB細胞を24ウェルFalconプレートに播種し、FFRPMI/HIFCSで一晩、接着単層(>90％コンフルエント)を形成させた。非標識FAまたはテストコンジュゲートの濃度の増加の不在または存在下で、使用済みインキュベーション培地を、10％HIFCSを補足し、100 nmol/Lの[³H]FAを含むFFRPMIで交換した。細胞を37℃にて1時間インキュベートした後、0.5mLのPBSで3回すすいだ。PBSに溶解した1％SDS 500マイクロリットルを各ウェルに加えた；5分後、細胞溶解液を収集し、5 mLのシンチレーションカクテルを含む個々のバイアルに移し、放射能についてカウントした。

FFRPMI中の[³H]FAのみに曝露された細胞(コンペティターなし)をネガティブコントロールに指定したが、[³H]FA＋1 mmol/Lの非標識FAに曝露された細胞はポジティブコントロールとして働いた。後者のサンプル中で測定された1分あたりの崩壊(DPM)(標識の非特異的結合を表す)は、すべてのサンプルのDPM値から差し引いた。特に、相対的親和性は、KB細胞上のFRに結合した[³H]FAの50％を置換するのに必要な化合物の逆モル比として定義され、FRに対するFAの相対的親和性は1に設定された。

コンジュゲート5の結果を図7に示す。結果は、大きな薬物分子の結合が、その受容体に対するビタミンの固有の結合親和性を根本的に変化させないことを示す。

実施例３：コンジュゲート5のDNA架橋アッセイ
仔牛胸腺DNA(CT-DNA)を、コンジュゲート5(1.1〜75μM)またはコンジュゲート5 +/- DTTの増加する濃度と組み合わせた。これらの溶液を37℃にて2時間インキュベートした。次いで、溶液をエチジウムブロマイドと混合し、室温にて2時間インキュベートした。これらのサンプルからの蛍光(Ex：535 nm、Em：605 nm)を、Fluoroskan II蛍光計で測定した。次いで、サンプルを104℃にて5分間加熱し、氷上で5分間冷却し、室温にて15分間保持し、蛍光を測定した。陽性および陰性コントロールからの蛍光値を使用して、各サンプルの架橋％を計算した。結果を図8に示す。

実施例４：腫瘍に対するコンジュゲート5のインビボ活性
図2Aに示すように、0.5 μmol/kg SIWにて2週間投薬されたコンジュゲート5(上向き黒三角)は、非処置コントロール(■)と比較して、テストマウスのKB腫瘍サイズを減少させた。1週間に1回で2週間の0.5μmol/kgのコンジュゲート5での治療も、100％の治癒という最大の抗腫瘍活性をもたらした。非処置コントロール(■)と比較して、0.5 μmol/kgのコンジュゲート5 SIWにて2週間投薬されたテストマウスの重量変化％を図2Bに示す。

実施例５：パクリタキセル耐性腫瘍に対するコンジュゲート5のインビボ活性
マウスは生命を維持され、腫瘍体積は方法3による測定値であった。
KB-PR10(パクリタキセル耐性)腫瘍細胞を各マウスの右側腹部に皮下接種した。200mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中、無菌条件下で外側尾静脈からマウスに投与した。

図3に示すように、で0.5 μmol/kg SIWにて2週間投薬されたコンジュゲート5(上向き黒三角)は、非処置コントロール(■)と比較して、テストマウスのパクリタキセル耐性KB腫瘍サイズを減少させた。

実施例６：プラチナ耐性腫瘍に対するコンジュゲート5のインビボ活性
マウスは生命を維持され、腫瘍体積は方法3による測定値であった。
KB-CR2000(プラチン耐性)腫瘍細胞を各マウスの右側腹部に皮下接種した。
200mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中、無菌条件下で外側尾静脈からマウスに投与した。

0.5 μmol/kg SIWにて2週間投薬されたコンジュゲート5および2.0 μmol/kg BIWにて2週間投薬されたEC1456((EC1456は、当該技術分野で公知であるツブリシンに結合した葉酸コンジュゲートである)(下向き黒三角)は、非処置コントロール(●)と比較して、テストマウスのパクリタキセル耐性KB腫瘍サイズを減少させた。

実施例７：トリプルネガティブ乳がんに対するコンジュゲート5のインビボ活性
マウスは生命を維持され、腫瘍体積は方法3による測定値であった。
原発ヒトTNBCモデルST502(直径2〜4mm)または原発ヒトTNBCモデルST738(直径2〜4mm)を、各マウスの右側腹部に皮下接種した。マウスを無作為に各7匹のマウスからなる実験グループに分け、被験物質を、200mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中、無菌条件下で外側尾静脈から注射した。

図5に示すように、0.3 μmol/kg BIWにて2週間投薬されたコンジュゲート5(上向き黒三角)は、非処置コントロール(■)と比較して、TNBC PDX腫瘍サイズを減少させたが、2.0 μmol/kg BIWにて2週間投薬されたEC1456(●)は、TNBC PDX腫瘍サイズを減少させなかった。

図10に示すように、0.27 μmol/kg BIWにて2週間投薬されたコンジュゲート5(●)は、非処置コントロール(■)と比較して、テストマウスのTNBC PDX腫瘍サイズを減少させたが、1.0 μmol/kg SIWにて2週間投薬されたメシル酸エリブリン(上向き黒三角)は、TNBC PDX腫瘍サイズを減少させなかった

実施例８：卵巣腫瘍に対するコンジュゲート5のインビボ活性
マウスは生命を維持され、腫瘍体積は方法3による測定値であった。
原発ヒト卵巣モデルST070断片(直径2〜4mm)を各マウスの右側腹部に皮下接種した。マウスを無作為に各7匹のマウスからなる実験グループに分け、被験物質を、200mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中、無菌条件下で外側尾静脈から注射した。

図6に示すように、0.5 μmol/kg SIWにて2週間投薬されたコンジュゲート5(●)は、非処置コントロール(■)と比較して、テストマウスの卵巣PDX腫瘍サイズを減少させたが、4.0 μmol/kg SIWにて2週間投薬されたEC1456(上向き黒三角)および15 mg/kg SIWにて2週間投薬されたパクリタキセル(下向き黒三角)は、卵巣PDX腫瘍サイズを減少させなかった。

実施例９：KBラット腫瘍モデルにおけるコンジュゲート5のインビボ活性
雌のBalb/c nu/nuラットに、実験期間中、葉酸欠乏飼料(Harlan diet＃TD01013)を自由に摂取させた。KB-腫瘍細胞を、各ラットの右側腹部に皮下接種した。ラットに、滅菌条件下、200 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を外側尾静脈から投与した。

各皮下腫瘍の増殖を、腫瘍を週2回測定することによって追跡した。腫瘍は、ノギスを使用して2つの垂直方向に測定され、その体積は0.5 x L x W²として計算された(ここで、L＝最長軸の測定値(mm)およびW＝Lに対して垂直な軸の測定値(mm))。腫瘍体積の結果を図9Aに示す。図9Bに示すように、動物の重量の増加または減少の関数として毒性を測定した。

実施例１０：子宮内膜腫瘍に対するコンジュゲート5のインビボ活性
雌のBalb/c nu/nuマウスに、実験期間中、葉酸欠乏飼料(Harlan diet＃TD01013)を自由に摂取させた。原発ヒト子宮内膜モデルST040断片(直径2〜4mm)を、各マウスの右側腹部に皮下接種した。マウスを無作為に各7匹のマウスからなる実験グループに分け、被験物質を、200mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中、無菌条件下で外側尾静脈から注射した。これらの研究は、South Texas Accelerated Research Therapeutics、4383 メディカル・ドライブ、サンアントニオ、TX 78229にて実施された。

1200 mm³の体積が達成されるまで、各皮下腫瘍の増殖を、腫瘍を週2回測定することによって追跡した。腫瘍は、ノギスを使用して2つの垂直方向に測定され、その体積は0.5 x L x W²として計算された(ここで、L＝最長軸の測定値(mm)およびW＝Lに対して垂直な軸の測定値(mm))。

図11は、15 mg/kg SIWのパクリタキセルでの2週間の治療で0％の部分寛解被験者が発生し、0.27 mmol/kg BIWでの2週間の化合物5の投与で43％の部分寛解被験者が発生したことを示す。

実施例１１：卵巣がん細胞株におけるコンジュゲート5のインビトロ研究
試薬
マウスおよびヒト葉酸結合タンパク質1(FBP1、FOLR1)PicoKine^TM ELSIAキットは、Boster Biological Technology(レザントン、CA)から購入した。表面マーカー染色に用いる抗体は、eBioscienceから購入した：PD-L1(クローンMIH5；カタログ番号25-5982)、F4/80(クローンBM8；カタログ番号12-4801)、CD11b(クローンM1/70；カタログ番号48-0112)、CD3ε(クローン145-2C11；カタログ番号25-0031)、CD4(クローンGK1.5；カタログ番号46-0041)、およびCD8β(クローンH3517.2；カタログ番号11-0083)。

細胞株
インビトロおよびエクスビボ研究でコンジュゲート5活性を評価するために利用されるFR-α発現細胞株は、(1)ID8-Cl15、マウスFR-αでトランスフェクトされた卵巣がん細胞株；および(2)IGROV1、ヒトFR-αを発現するヒト卵巣がん細胞株；であった。FR-α陰性ID8親(ID8p)細胞株をインビボコントロールとして使用した。ID8pおよびID8-Cl15細胞を、10％熱不活性化ウシ胎児血清(HIFCS)および抗生物質を含む、葉酸が豊富であるか、または葉酸を含まないRPMI1640培地(Gibco BRL)(FFRPMI)でそれぞれ増殖させ、標準的な細胞培養技術を使用して、5％CO₂雰囲気下で維持した。IGROV1細胞は、Corning(登録商標)の超低接着培養フラスコ(VWR、カタログ番号89089-878)を使用する以外は、ID8-Cl15と同じ培地で増殖させた。

ELISA分析
製造者の指示書に従って、標準物質およびテストサンプルを、ラット抗FOLR1モノクローナル抗体でプレコートした96ウェルELISAプレートに加えた。ビオチン化ヤギ抗FOLR1ポリクローナル抗体を加えた後、緩衝液で洗浄した。次いで、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体を添加し、結合していないコンジュゲートを洗い流した。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ基質、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンを添加し、触媒作用を及ぼして、青色の生成物を生成した。少なくとも2つの異なる時点で、マイクロプレートリーダーで375 nmの吸光度を読み取った。

クローン原性アッセイ
6ウェルプレートに播種したIGROV1細胞(1000細胞/ウェル)を1、10、および100 nMのコンジュゲート5に2時間曝露し、その後、薬物を含まない培地で9日間追跡した。その後、細胞をPBSで洗浄し、3：1のメタノール：酢酸溶液で5分間固定した。次いで、細胞を0.5％クリスタルバイオレット/メタノール溶液で15分間染色し、水道水で洗浄した。乾燥ステップの後、ImageJソフトウェアを使用して、コロニーの写真を撮り、カウントした。

フローサイトメトリー
腹水から調製した単細胞懸濁液を、フローサイトメトリー用の染色の前に、氷上でFACS染色液にて20分間ブロックした。FACS染色液は、PBS中の1％ウシ血清アルブミン画分V(Fisher Scientific、カタログ番号BP1600)、0.5 mg/mLのヒト免疫グロブリン(Equitech-Bio、カタログ番号SLH66)および0.05％アジ化ナトリウムで構成された。表面マーカーの検出(PD-L1、F4/80、CD11b、CD3、CD4、CD8)のために、腫瘍細胞を、最適化された濃度(0.4-2.5μg/mL)でeBioscienceから購入したさまざまな蛍光色素結合抗体を含むFACS染色液で染色した。氷上で20分後、腫瘍細胞をPBSで洗浄し、死細胞排除のために3μMヨウ化プロピジウムを含むPBSに再懸濁した。データをGalliosフローサイトメーター(Beckman Coulter)で集め、Kaluza v1.2 ソフトウェア(Beckman Coulter)を用いて分析した。葉酸をアレクサフルオル647にカップリングさせることによって、社内で合成した小分子を用いて、機能的葉酸受容体を測定した。

結果
ID8-Cl15腫瘍細胞に対するコンジュゲート5の活性を、XTT細胞生存率アッセイを使用して評価した。細胞を、コンジュゲート5の10倍連続希釈液(最大1μM)に2時間曝露し、次いで、薬物を含まない培地で72〜120時間追跡した。XTTアッセイで決定したように、コンジュゲート5は細胞増殖の強力な用量依存的阻害を示し、相対IC₅₀値は、〜0.52(72時間)、0.61(96時間)、および0.17(120時間)であった(図12)。重要なことは、最大の細胞死が96〜120時間の追跡後に観察され、このクラスのDNA架橋化合物の作用メカニズムを支持していることである。

増殖が遅いIGROV腫瘍細胞に対するコンジュゲート5の活性を、クローン原性アッセイを使用して評価した。2時間の曝露と9日間の追跡の後(図13)、コンジュゲート5は、テストしたすべての濃度(1〜100 nM)において強力な活性を示した。さらに重要なことは、1および10 nMの両方の濃度にて過剰量の葉酸が存在すると、コンジュゲート5の抗腫瘍活性が著しく低下したことである。

実施例１２：卵巣腫瘍モデルにおけるコンジュゲート5のインビボ研究
マウス
雌のC57BL/6(ID8p、ID8-Cl15)およびnu/nu(IGROV1)マウスを、Envigo(インディアナポリス、IN)から購入し、6〜8週齢に達したときに使用した。マウスには、到着日に葉酸欠乏食(TestDiet、セントルイス、MO)を与えた。

腫瘍移植
マウス腹水腫瘍を、C57BL/6(ID8p、ID8-Cl15)およびnu/nu(IGROV1)マウスに、それぞれ5 x 10⁶個の培養細胞を腹腔内移植することによって生成した。

担がんマウスからの単一細胞懸濁液の調製
5 mM EDTAを含む5 mLの冷PBSのI.P.注入によって腹水を収集し、次いで、腹水腫瘍細胞を含む腹腔内液を除去する。次いで、5分間の400 x gの遠心分離により細胞を収集し、RBC溶解ステップを行った後、次いで、冷PBSで洗浄し、最後に40μmのナイロンろ過で組織および大きな細胞凝集体を除去した。

腹水を保有するマウスからの無細胞腹水の調製
安楽死させた後、腹水腫瘍細胞を含む腹腔内液をI.P.洗浄により収集した。5分間の2200 x gの遠心分離によって、腹水液の無細胞画分を得、将来の使用まで-80℃にて保存した。

コンジュゲート5＋抗CTLA-4の組み合わせ研究
コンジュゲート5単独および抗CTLA-4抗体との組み合わせの効果をテストするために、ID8-Cl15腫瘍細胞(1％同系マウス血清/葉酸欠乏RPMI1640培地中の動物当たり5 x 10⁶個の細胞)を、到着日および葉酸欠乏食の開始日の後13日間腹腔内に接種した。比較のために、EC1456単独および同じ処方計画の抗CTLA-4抗体との併用も評価した。腫瘍移植の7日後に開始して、マウスに、0.1μmol/kgのコンジュゲート5または2μmol/kgのEC1456を、BIWで合計6回静脈内投与した。ストック溶液(BioXcell、Clone UC10-4F10-11)をPBS、pH 7.4で1.25 mg/mLに希釈することにより、抗CTLA-4抗体投与溶液を調製した。抗CTLA-4(250μg/用量)を、腫瘍移植後11日から開始して、合計5回BIWでi.p.投与した。コンジュゲート5＋抗CTLA-4およびEC1456＋抗CTLA-4の併用群では、すべての化合物について、単剤投与群と用量およびスケジュールを一致させた。マウスの体重を週に3回測定し、腹水の形成を示す腫れた腹部の臨床徴候、および呼吸困難、運動性、体重減少、下痢、円背位、摂食不良などの毒性の証拠について評価した。動物が腹水を発症したら、毎日モニターし、腹水が重篤になったとき(丸みを帯び、つま先で歩く)安楽死させた。マウスの同じコホートからの健康な動物を、正常な体重増加のコントロールとして使用した。

結果
マウス腹水中のFBP1の定量
安楽死時にID8p、ID8-Cl15およびIGROV1腫瘍を有するマウスから収集した無細胞腹水サンプルを、可溶性マウス(ID8p、ID8-Cl15)およびヒト(IGROV1)FBP1レベルについてアッセイした。マウスFBP1を、0.93〜4.6 nMのID8-Cl15腫瘍細胞を腹腔内に移植したマウスに由来する腹水で検出した(表1)。同様に、ヒトFBP1を、0.70〜2.8 nMでIGROV1腫瘍細胞を腹腔内に移植したマウスに由来する腹水で検出した(表1)。対象的に、無視できる量のマウスFBP1が、ID8p腫瘍を有するマウスに由来する腹水中に見出された(表1)。これは、悪性腹水微小環境が、がん細胞からFOLR1を脱落させることを示唆する。

卵巣がんのマウスモデルにおける機能的FRの評価
機能的FRレベルを、葉酸-フルオロフォアコンジュゲートを使用して、nu/nuマウスの腹腔内で成長させたIGROV1ヒト卵巣がん細胞(図14； HLA + CD45-；符号a)上で測定し、腹腔マクロファージ(F480+ CD11b+；符号b)およびインビトロ培養物から新たに収穫したIGROV1細胞(符号c)上のレベルと比較した。FA-アレクサフルオルで陽性に染色されたマウス腹腔腹水IGROV1細胞は、ごく少数(〜6％)しか存在せず、このことは、脱落またはダウンレギュレーションまたは両方の組み合わせのいずれかによるFR-αの損失を示唆する。IGROV1およびID8-Cl15腹水細胞によるFR-αの脱落は、可溶性ヒトおよびマウスFR-α(FBP1、FOLR1)がELISA分析により無細胞腹水で検出されたために発生した可能性が高い(表1)。腹水に由来するID8p細胞株をFRα陰性コントロールとして使用し、実際、非常にわずかな可溶性ネズミFR-αしか、ELISAによって検出されなかった(表1)。

表1

CD4+およびCD8+T細胞の存在も、マウス卵巣細胞株、ID8-CL15のIP注射後7日間隔で免疫適格C57BL6マウスの総腹膜細胞において定量した(図15A)。CD45+ CD3e+ CD8+ CD4-T細胞(■)は、移植後7日目から42日目まで徐々に数が増加した。CD45+ CD3e+ CD4+ CD8-T細胞(上向き黒三角)の数も7日目から35日目まで増加し、移植後35日目から42日目まではより有意に増加し、卵巣がん細胞に対する免疫応答が発生したことを示唆する。さらに、ID8-CL15移植マウスのCD45非骨髄由来腹水細胞は、機能的FRをほとんど発現しなかったが(図15B(■)を参照)、一方、腹水マクロファージ(図15B(●)および15C(挿入ボックス)を参照)は、相当な量の機能的FR(おそらく、FRβ)を発現した。これらは、腹水マクロファージなどのFR-β+卵巣がん間質細胞の標的化が、コンジュゲート5などの化合物の代替作用機序となり得ることを示唆する。

単独および抗CTLA-4と組み合わせたコンジュゲート5のインビボ活性
CTLA-4(CD152)は、免疫応答をダウンレギュレートする免疫チェックポイントとして機能するタンパク質受容体である。CTLA-4は、T細胞の活性化を停止するために、抗原提示細胞上のB7への結合をCD28と競合する。最近の研究は、CTLA4拮抗薬が特定の腫瘍タイプで化学療法の活性を高めることができることを示した。コンジュゲート5単独および抗CTLA-4抗体との併用の抗腫瘍効果を調べるために、同系の腹腔内ID8-Cl15担がんマウスを利用した(図16A)。比較のために、EC1456は、単剤としても、または抗CTLA-4抗体と組み合わせてもテストした。ここでは、非治療のコントロールマウスの生存期間の中央値は、腫瘍移植後〜46日であった。EC1456単独(i.v. 2 μmol/kg、BIW x 6用量)とコンジュゲート5単独(i.v. 0.1 μmol/kg、BIW x 6用量)の両方が、各グループ5匹の動物で有意な抗腫瘍効果をもたらし、生存期間の中央値は、〜67％増加した(腫瘍移植後、〜77日、P＝0.0018、ログランク検定)。抗CTLA-4抗体単独(i.p. 250μg/用量、BIW x 5用量)は、5匹の動物で有意な抗腫瘍効果を示さず、生存期間の中央値は、〜11％増加した(腫瘍移植後、〜51日)。EC1456(i.v. 2 μmol/kg、BIW x 6用量)＋抗CTLA-4抗体(i.v. 2 μmol/kg、BIW x 6用量)は、腫瘍移植後、〜81日の生存期間の中央値を有する5匹の動物において追加の利点を示さなかった。一方、コンジュゲート5(i.v. 0.1 μmol/kg、BIW x 6用量)および抗CTLA-4抗体(i.p. 250 μg/用量、BIW x 5用量)は、腫瘍移植後、〜102日の生存期間の中央値5匹を有する動物において追加の治療効果を示した。

実施例１３：ID8-Cl15のさまざまな段階に対するコンジュゲート5とEC1456の比較
腹水腫瘍を有するマウス
材料
コンジュゲート5(分子量2369)およびEC1456(分子量2626)は、社内で合成した。

インビボ法
細胞株
ID8-Cl15細胞を、10％の熱不活性化ウシ胎児血清(HIFCS)と抗生物質とを含む葉酸を含まないRPMI1640培地(Gibco BRL)(FFRPMI)で増殖させ、標準的な細胞培養技術を使用して5％ CO₂雰囲気下で維持した。

マウス
雌のC57BL/6マウスは、Envigo(インディアナポリス、IN)から購入し、6〜8週齢に達したときに使用した。マウスには、到着日に葉酸欠乏食(TestDiet、セントルイス、MO)を与えた。

腫瘍移植
マウス腹水腫瘍を、C57BL/6マウスへの5 x 10⁶個の培養細胞の腹腔内移植によって生成させた。

インビボでのID8-Cl15腹水腫瘍に対するコンジュゲート5対EC1456の活性
第1の実験(P-1836)では、すべての治療は腫瘍の移植から7日後に開始された。マウスには、コンジュゲート5を週2回、0.1μmol/kgで合計6回(BIW x 3)静脈内投与した。比較のために、EC1456を週2回、2μmol/kgで合計6回投与した(BIW x 3)。第2の実験(P-1846)では、コンジュゲート5治療は腫瘍の移植から21日後に開始された。マウスに、コンジュゲート5を0.1μmol/kgで、3週間、毎週3日間連続して静脈内投与した(D0-2 x 3、9回投与)。比較のために、EC1456を2μmol/kgで、3週間(D0-2 x 3、9回投与)毎週3日間連続して投与した。第3の実験(P-1861)では、コンジュゲート5の治療は腫瘍の移植から35日後に開始された。マウスに、コンジュゲート5を0.3μmol/kgで、2週間連続して週1回静脈内投与した(SIW x 2、2回投与)。比較のために、EC1456を2μmol/kgで、2週間、毎週3日間連続して、2週間投与した(D0-2 x 2、6回投与)。第4番の実験(P-1836)では、コンジュゲート5の治療は腫瘍の移植から43日後に開始された。マウスに、コンジュゲート5を0.3μmol/kgで、2週間連続して週1回静脈内投与した(SIW x 2、2投与)。病気の進行した段階のために、EC1456処理マウスは、2μmol/kgのみを、1週間、週3日間連続して処置された(D0-2 x 1、3回投与)。すべてのマウスの体重を週に3回測定し、腹水の形成を示す腫れた腹部の臨床徴候、および呼吸困難、運動性、体重減少、下痢、円背位、および摂食不良などの毒性の証拠について評価した。動物が腹水を発症したら、毎日モニターし、腹水が重篤になった(丸みを帯び、つま先で歩く)ときに、安楽死させた。

データおよび結果
ID8-Cl15腹水腫瘍を有する7日齢のマウスにおけるコンジュゲート5活性
図17Aおよび17Bに示すように、非処置のコントロールマウスの生存期間の中央値は、腫瘍移植後、〜46日であった。コンジュゲート5(0.1μmol/kg、BIW x 6回投与)およびEC1456(2μmol/kg、BIW x 6回投与)の両方が、各グループ5匹の動物において同様の抗腫瘍効果を生み出し、生存期間の中央値を、〜67％増加させた(腫瘍移植後、〜77日)。

ID8-Cl15腹水腫瘍を有する21日齢のマウスにおけるコンジュゲート5活性
図18Aおよび18Bに示すように、非処置のコントロールマウスの生存期間の中央値は、腫瘍移植後、〜46日であった。コンジュゲート5(0.1μmol kg、D0-2 x 3、9回投与)は、各グループ5匹の動物において有意な抗腫瘍効果を生み出し、生存期間の中央値を、〜65％増加させた(腫瘍移植後、〜76日)。特に、Conjugate 5で処理した動物はすべて、研究の終了時に軽度の運動失調しか示さず、1匹の動物は腹水を発生しなかった(外れ値)。EC1456(2μmol/kg、D0-2 x、9回投与)で処置したマウスは重篤な皮膚炎を発症し、2匹の動物は皮膚の状態により44日目に安楽死させた。残りの2匹の動物は腹水を発症し、生存期間の中央値は59日間であり、非処置コントロールから、〜28％増加させた。

ID8-Cl15腹水腫瘍を有する35日齢のマウスにおけるコンジュゲート5活性
図19Aおよび19Bに示すように、非処置のコントロールマウスの生存期間の中央値は、腫瘍移植後、〜42日であった。コンジュゲート5(0.3μmol/kg、SIW x 2、2回投与)は、各グループ5匹の動物において有意な抗腫瘍効果を生み出し、生存期間の中央値を、〜52％増加させた(腫瘍移植後、〜64日)。EC1456(2μmol/kg、D0-2 x 2、4回投与)は、抗腫瘍効果をもたらさず、腫瘍移植後の生存期間の中央値は、〜44日であり、非処置コントロールと同様であった。

ID8-Cl15腹水腫瘍を有する43日齢のマウスにおけるコンジュゲート5活性
図20Aおよび20Bに示すように、非処置のコントロールマウスの生存期間の中央値は、腫瘍移植後、〜46日であった。コンジュゲート5(0.3μmol/kg、SIW x 2、2回投与)は、各グループ5匹の動物において有意な抗腫瘍効果をもたらし、生存期間の中央値を、〜24％増加させた(腫瘍移植後、〜57日)。EC1456(2μmol/kg、D0-2 x 1、3回投与)は、生存期間の中央値(腫瘍移植後、〜52日)を、〜13％増加させたが、これは非処置コントロールに対しの有意差ではなかった。

ID8-Cl15のさまざまな段階に対するコンジュゲート5とEC1456の比較
図21は、疾患のさまざまな段階にあるID8-Cl15腫瘍を有するマウスが、それぞれの投与計画においてコンジュゲート5およびEC1456で処置される各実験の結果をまとめたものである(上記のようにいくつかの毒性が観察された)。しかしながら、EC1456は、ID8-Cl15腹水腫瘍の進行した段階で徐々にその強度を失ったが、コンジュゲート5は一貫してより活性であった。腹水症の発症(35日目)から非処置動物の安楽死を必要とする疾患の末期(43日目)まで、EC1456が完全に不活性であった一方で、コンジュゲート5は治療効果をもたらしたことは、さらに重要である。

実施例１４：インビトロおよびインビボアッセイ
材料
試薬
EC1456(分子量2626)およびコンジュゲート5(分子量2369)は、社内で合成した。表面マーカーの染色に使用される抗体は、eBioscienceから購入した：F4/80(クローンBM8；カタログ番号12-4801)、CD11b(クローンM1/70；カタログ番号48-0112)。

インビトロ法
細胞株
インビトロおよび／またはエクスビボ研究でのコンジュゲート5の活性の評価に使用されるFRα-およびFRα+発現細胞株は、(1)4T1p、ヒトのトリプルネガティブ乳がんに似たマウス乳がん細胞株；(2)4T1-Cl2、マウスFRαで安定的にトランスフェクトされた4T1p；(3)IGROV1、ヒトFRαを発現するヒト卵巣がん細胞株であった。4T1pおよび4T1-Cl2細胞を、10％熱不活性化ウシ胎児血清(HIFCS)および抗生物質を含む、葉酸が豊富であるか、または葉酸を含まないRPMI1640培地(Gibco BRL)(FFRPMI)でそれぞれ増殖させ、標準的な細胞培養技術を使用して5％CO₂雰囲気下で維持した。IGROV1細胞を、4T1-Cl2と同じ培地で増殖させた。

細胞生存率アッセイ
96ウェルプレート内の4T1pおよび4T1-Cl2腫瘍細胞(20,000細胞/ウェル)を、FFRPMI培地中のコンジュゲート5の10倍連続希釈(≦100nM)で処理した。2時間の曝露後、薬物含有培地を交換し、細胞を洗浄し、さらに96時間インキュベートした。XTT(2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホ-フェニル)-2H-テトラゾリウム-5-カルボキサニリド)を製造業者の指示書に従って2時間培養培地に加えることにより、胞生存率を評価した。すべての結果は、非処置コントロール細胞に対する吸光度％(バックグラウンドを引く)として表した。

クローン原性アッセイ
6ウェルプレートに播種したIGROV1細胞(1000細胞/ウェル)を、1、10、100、および1000 nMのコンジュゲート5およびEC1456に2時間曝露し、その後、薬物を含まない培地で9日間追跡した。その後、細胞をPBSで洗浄し、3：1のメタノール：酢酸溶液で5分間固定した。次いで、細胞を0.5％クリスタルバイオレット/メタノール溶液で15分間染色し、水道水で洗浄した。乾燥ステップの後、ImageJソフトウェアを使用してコロニーの写真を撮り、カウントした。

フローサイトメトリー
フローサイトメトリーのための染色の前に、4T1pおよび4T1-Cl2腫瘍から調製された単一細胞懸濁液を、氷上のFACS染色溶液で20分間ブロックした。FACS染色溶液は、PBS中の1％ウシ血清アルブミン画分V(Fisher Scientific、カタログ番号BP1600)、0.5 mg/mLヒト免疫グロブリン(Equitech-Bio、カタログ番号SLH66)および0.05％アジ化ナトリウムから構成された。表面マーカーの検出(F4 /80、CD11b)のために、腫瘍細胞を、最適化された濃度(0.4〜2.5μg/mL)でeBioscienceから購入したさまざまなフルオロフォア結合抗体を含むFACS染色液で染色した。氷上で20分後、腫瘍細胞をPBSで洗浄し、死細胞排除のために3μMヨウ化プロピジウムを含むPBSに再懸濁した。Galliosフローサイトメーター(Beckman Coulter)でデータを収集し、Kaluza v1.2ソフトウェア(Beckman Coulter)を使用して分析した。

インビボ法
マウス
雌のBalb/cマウス(4T1p、4T1-Cl2)は、Envigo(インディアナポリス、IN)から購入し、6〜8週齢に達したときに使用した。マウスには、到着日に葉酸欠乏食(TestDiet、セントルイス、MO)を与えた。

腫瘍移植
Balb/cマウスの固形腫瘍は、乳腺領域における、動物当たり5 x 10⁵個の(4T1p)および2 x 10⁶個の(4T1-Cl2)の培養細胞の皮下移植によって生成された。

担がんマウスからの単一細胞懸濁液の調製
腫瘍消化溶液を、血清および葉酸を含まないRPMI1640中のIV型コラゲナーゼ(最終濃度0.5 mg/mL、Sigmaカタログ番号C5138)、ヒアルロニダーゼ(最終濃度0.5 mg/mL、Sigmaカタログ番号H3506)およびDNアーゼI(最終濃度0.1 mg/mL、Sigmaカタログ番号DN25)を添加することによって調製し、次いで、37℃に温めた。4T1および4T1-CL2同所性腫瘍の単一細胞調製物を、Balb/cマウスからの各腫瘍の切除および冷PBSでの洗浄により調製した。冷PBSで洗浄した後、切除された腫瘍の表面に皮下脂肪が見えるようになり、それを腫瘍消化の前に注意深く剥がした。目に見える脂肪を除去した後、固形腫瘍を細かく刻み、激しく振とうしながら37℃にて1時間、10mLの腫瘍消化溶液中でインキュベートした。消化後、単一細胞調製物を400 X gで5分間ペレット化し、上清を捨てた。ペレットを5 mLの室温滅菌した1X RBC細胞溶解液(VWRカタログ番号420301-BL)で5分間処理し、赤血球を溶解した。溶液に、等量の冷PBSを加え、腫瘍細胞を再び5分間の400 x gでペレット化し、上清を捨てた。最終ペレットを10mLの冷PBSに再懸濁した後、40μmのFalcon(登録商標)セルストレーナー、滅菌、Corning(VWRカタログ番号21008-949)を使用してろ過し、組織の破片や未消化の腫瘍を除去した。ろ過した細胞溶液を再度ペレット化し、FACS染色液に再懸濁した後、フローサイトメトリー分析のために蛍光標識抗体を加えた。

コンジュゲート5のインビボ単剤活性
0日目から開始して、乳腺4T1p(〜78.3 ± 12.1 mm³)および4T1-Cl2(〜70.1 ± 14.1 mm³)を有するマウスは、コンジュゲート5を200 nmol/kgで2週間、隔週で受ける予定であった。4T1p担がんマウスは、合計3回のみ投与され、4T1-Cl2担がんマウスは計画通り合計4回投与された。マウスの体重を量り、週に3回腫瘍サイズを測定した。腫瘍の体積を次の式で計算した：V＝0.5 x a x b²(ここで、aは腫瘍を横切る最長の軸であり、bは、aに垂直な短い軸である)。腫瘍体積が〜1500 mm³に達したときに動物を安楽死させた。マウスはまた、呼吸困難、運動性、体重減少、下痢、円背位、および摂食不良などの毒性の証拠についても注意深くモニターされた。4T1p腫瘍を有するマウスにおける最後のコンジュゲート5投与は、体重減少のため省かれた。

データおよび結果
4T1-Cl2および4T1p腫瘍細胞に対するコンジュゲート5のインビトロ活性
4T1-Cl2および4T1p腫瘍細胞に対するコンジュゲート5の活性を、XTT細胞生存率アッセイを使用して評価した。細胞をコンジュゲート5の10倍連続希釈液(最大100 nM)に2時間曝露し、次いで、薬物を含まない培地で96時間追跡した。FRα陽性 4T1- Cl2腫瘍細胞株において、コンジュゲート5は、細胞増殖の用量依存的阻害を示し、相対IC₅₀値は、〜8.7 nMであった(図22Aおよび22B)。4T1-Cl2に対する活性は、この試験条件下で過剰の葉酸の存在下において部分的に可逆的であった。対照的に、コンジュゲート5は、インビトロでFRα陰性4T1p腫瘍細胞に対して完全に不活性であることがわかった。

ヒトIGROV細胞に対するコンジュゲート5およびEC1456のインビトロ活性
増殖が遅いIGROV腫瘍細胞に対するコンジュゲート5の活性を、標準のクローン原性アッセイでEC1456の活性と比較した。2時間の暴露と9日間の追跡の後(図23)、コンジュゲート5は、テストしたすべての濃度において強力な活性を示した(1〜1000 nM)。一方、有意なEC1456活性は1 μMでのみ観察された。

4T1pおよび4T1-Cl2腫瘍における腫瘍関連マクロファージの評価
図24A-Cに示すように、4T1マウス乳がん細胞株由来の正所性腫瘍(A)(白四角)は、検出可能な機能的FRをほとんど有さないが、FRα形質導入4T1サブクローン(4T1-Cl2；黒四角)から増殖した腫瘍は、有意なレベルを含んでいた。4T1親(B、〜16％)腫瘍および4T1-Cl2(C、〜24％)腫瘍で見いだされた腫瘍関連マクロファージ(TAM)は、FRβを発現するが、他の非マクロファージ骨髄細胞(MDSC)は、FRβ陰性であった。

コンジュゲート5のインビボ抗TAMおよび抗腫瘍活性
コンジュゲート5の活性単独をFRα陰性4T1p腫瘍モデルで評価した。コンジュゲート5の抗腫瘍および抗TAM二重活性を、FRα陽性4T1-Cl2腫瘍モデルで評価した。フローサイトメトリー分析により、Balb/cマウスで確立された4T1pおよび4T1-Cl2乳腺腫瘍の両方において、同様のTAM含有量が示された。インビトロでの活性の欠如にもかかわらず(図22A)、4T1p腫瘍は、0.2μmol/kg(i.v.、BIW x 3回投与)でのコンジュゲート5に対して部分的な感受性を示し、有意な腫瘍増殖遅延を示した(図25Aおよび25B)。しかしながら、このFRα陰性モデルには完全寛解動物は存在しなかった。一方、コンジュゲート5は、0.2 μmol/kg(i.v.、BIW x 4回投与)で、FRα陽性4T1-Cl2腫瘍モデルにおいて、5人のうち3人の完全寛解動物をもたらした(図26Aおよび26B)。いずれの場合も、コンジュゲート5による処置により、動物の体重は有意に減少した。しかしながら、データは、FRα陽性腫瘍モデルに対するコンジュゲート5の活性が、FRβ陽性TAMの存在によって増強される可能性があることを示唆した。

実施例１５：インビボにおける4T1 TAMに対するコンジュゲート5の活性
葉酸欠乏食を与えている雌のFoxn1^nuヌードラット(Harlan、Inc.、インディアナポリス、IN)の乳房部に、1 x 10⁶個の 4T1腫瘍細胞を皮下移植した。腫瘍が〜1088 mm³に達したとき、動物(n＝3)に、無(コントロール)、254 nmol/kgのコンジュゲート5、254 nmol/kgのコンジュゲート5＋127 μmol/kgのEC0923、または127 μmol/kgのEC0923を静脈内投与した。4日後、腫瘍全体を採取し、酵素消化し、FACS分析に付した。腫瘍細胞懸濁液を、マクロファージマーカー(CD163、CD11b)、細胞生存率(ヨウ化プロピジウム)、および後期および初期アポトーシス(アネキシンV)について染色した。

コンジュゲート5は、FR- 4T1腫瘍細胞よりもFR+ 4T1 TAMに対してインビボ選択性を示した(図27)。単回投与で、コンジュゲート5は、これらの4T1腫瘍のCD163+CD11b+ TAM集団を有意に減少させることが示された。葉酸のコンペティターであるEC0923(薬剤にリンクされていない葉酸)単独では4T1 TAMに影響を与えなかったが、コンジュゲート5抗TAM活性もまた、500倍過剰のEC0923によってブロックされなかった。さらなる分析により、コンジュゲート5は、CD163-CD11b + 4T1 TAMおよび4T1腫瘍細胞自体を含むFR-細胞集団に対して効果がないことが明らかにされた。これらのデータは、TAMの最大アポトーシス(死滅)がコンジュゲート5処置で発生したことを示している。

Claims (26)

1. 治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与することを含む、葉酸受容体陰性がんの治療方法であって、腫瘍関連マクロファージが阻害または枯渇される方法。
2. 腫瘍関連マクロファージを枯渇させるために、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与することを含む、葉酸受容体陰性がんの治療方法。
3. 治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与し、腫瘍関連マクロファージを有する葉酸受容体陰性がんを治療することを含む、葉酸受容体陰性がんの治療方法。
4. 腫瘍関連マクロファージを標的化するために、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与することを含む、葉酸受容体陰性がんの治療方法。
5. 宿主動物のがんにおける腫瘍関連マクロファージの存在を同定するステップ、および治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与するステップを含む、がんの治療方法。
6. 腫瘍関連マクロファージを阻害または枯渇させるために、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与するステップを含む、宿主動物におけるがんの治療方法。
7. 腫瘍関連マクロファージを標的化するために、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与するステップを含む、宿主動物における腫瘍関連マクロファージを標的化する方法。
8. 腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、および／または、組織もしくは腫瘍の一部を形成する宿主動物におけるがんの治療方法であって、治療有効量のコンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩を宿主動物に投与するステップ、および腫瘍関連マクロファージを有する葉酸受容体陰性がんを治療するステップを含む方法。
9. 腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向CD163(+)表現型を有する、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
10. 腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向CD163(+)およびTGF-β(+)表現型を有する、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
11. 腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向CD11b(+)表現型を有する、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
12. 腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向CD163(+)およびCD11b(+)表現型を有する、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
13. 腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向F480(+)表現型を有する、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
14. 腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向F480(+)およびCD11b(+)表現型を有する、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
15. 腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向性であり、CD163(+)、IL10(+)、Arg1(+)、TGF-β(+)、VEGF(+)、CD206(+)、CD11b(+)、およびF480(+)表現型からなる群から選択される1つ以上のマーカーを発現する、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
16. 腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、および／または、組織もしくはがんの一部を形成し、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向性であり、CD163(+)、IL10(+)、Arg1(+)、TGF-β(+)、VEGF(+)、CD206(+)、CD11b(+)、およびF480(+)表現型からなる群から選択される1つ以上のマーカーを発現する、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
17. がんが、非小細胞肺がん、未分化甲状腺がん、膵管腺がん、頭頸部がん、表皮成長因子受容体陰性乳がん、中皮腫、成人古典的ホジキンリンパ腫、ブドウ膜黒色腫、膠芽腫、腎がん、平滑筋肉腫、および色素性絨毛結節性滑膜炎からなる群から選択される、請求項1〜16のいずれか1つに記載の方法。
18. コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩が、宿主動物における腫瘍関連マクロファージを枯渇させる能力を有するか、または枯渇させる、請求項1〜17のいずれか1つに記載の方法。
19. コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩が、宿主動物における腫瘍関連マクロファージの活性を阻害する能力を有するか、または阻害する、請求項1〜18のいずれか1つに記載の方法。
20. コンジュゲート5、またはその薬学的に許容される塩が、非経口剤形で宿主動物に投与される、請求項1〜19のいずれか1つに記載の方法。
21. 非経口剤形が、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、くも膜下投与剤形からなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
22. 治療有効量が、約0.05 μmol/kg〜約6.0 μmol/宿主動物体重kgである、請求項1〜21のいずれか1つに記載の方法。
23. 治療有効量が、約0.05 μmol/kg〜約4.0 μmol/宿主動物体重kgである、請求項1〜22のいずれか1つに記載の方法。
24. 治療有効量が、約0.05 μmol/kg〜約2.0 μmol/宿主動物体重kgである、請求項1〜23のいずれか1つに記載の方法。
25. 治療有効量が、約0.05 μmol/kg〜約1.0 μmol/宿主動物体重kgである、請求項1〜24のいずれか1つに記載の方法。
26. 腫瘍関連マクロファージが、がんの中にあり、腫瘍関連マクロファージが、腫瘍促進性M2偏向CD163(+)、IL10(+)、Arg1(+)、TGF-β(+)、VEGF(+)、CD206(+)、CD11b(+)、およびF480(+)表現型を有する、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。

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