JP6859954B2

JP6859954B2 - ジアミノヘテロ環カルボキサミド化合物を有効成分とするがん免疫治療用、及び／又は、免疫活性化用医薬組成物

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Publication number: JP6859954B2
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Description

本発明は、ジアミノヘテロ環カルボキサミド化合物又はその製薬学的に許容される塩を有効成分とする、がん免疫治療用、及び／又は、免疫活性化用医薬組成物に関する。

免疫系はがん発生初期には免疫監視機構（immunosurveillance）によって、がん顕在化後には抗腫瘍免疫応答（Anti-tumor immunity）によってがんを排除する。一方、がん微小環境においてがんは、PD-1（programmed cell death-1）/ PD-L1（programmed cell death-1 ligand-1）又はPD-L2経路や、CTLA-4（cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4）/CD80又は CD86経路などの免疫チェックポイント機構に作用し直接的に活性化T細胞を抑制する、または、制御性T細胞や骨髄由来制御細胞の誘導及び免疫抑制性の液性因子（IL-10、TGF-β、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)など）の産生を介し、間接的に活性化T細胞を抑制することにより免疫逃避機構を獲得している。これら免疫逃避機構を抑制するイムノモジュレーターを用いたがん免疫治療剤は、有望な治療薬として、単独あるいは他のイムノモジュレーター、あるいは既存抗癌剤との併用で、精力的に臨床開発が進められている。

PD-1はT細胞などに発現し、免疫チェックポイントを担うことが知られている（Pharmacogenomics and Personalized Medicine, 2014;7:357-365、Current Opinion in Immunology, 2014;27:89-97）。PD-1のリガンドであるPD-L1やPD-L2が結合するとT細胞の活性化は抑制され、免疫反応が妨げられる。例えば、活性化したエフェクターT細胞はがん細胞を認識し、インターフェロンガンマなどの炎症性サイトカインを産生する。一方、がん細胞は、炎症性サイトカインに反応してPD-L1の発現を上昇させ、PD-1陽性のエフェクターT細胞による免疫反応を抑制する。このようにがん細胞はPD-1/PD-L1経路を利用し、がんに対する免疫監視機構から逃避する特性を有している。よって、PD-1/PD-L1経路はがん微小環境における免疫抑制の主要な分子機構の一つであると考えられている（Pharmacogenomics and Personalized Medicine, 2014;7:357-365、Current Opinion in Immunology, 2014;27:89-97）。
PD-1とPD-L1との結合を阻害する抗体としては、現在までに抗PD-1抗体であるニボルマブ（nivolumab）が悪性黒色腫、非小細胞肺癌の治療剤として、またペンブロリズマブ（pembrolizumab）が悪性黒色腫の治療薬として、それぞれ上市されており、その他いくつかの抗PD-1抗体又は抗PD-L1抗体についても、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌、再発性膠芽腫、頭頚部癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌、メルケル細胞癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、又はC型慢性肝炎の治療薬として臨床開発が進められている。ニボルマブを悪性黒色腫に対する第1選択薬として用いた二重盲検の無作為化フェーズ3試験CheckMate-066において、ニボルマブ群の72.9%において全生存期間の延長を示すことが報告されたが、奏功しない患者の存在も認められている。

免疫療法に関しては、異なる機序を持つ薬剤を組み合わせた併用療法、例えば、悪性黒色腫に対する、抗PD-1抗体であるニボルマブ（nivolumab）と抗CTLA-4抗体であるイピリムマブ（ipilimumab）との併用療法の臨床試験結果が報告されている（Pharmacogenomics and Personalized Medicine, 2014;7:357-365、Current Opinion in Immunology, 2014;27:89-97）。

CTLA-4とCD80又はCD86との結合を阻害する抗体としては、現在までに抗CTLA-4抗体であるイピリムマブ（ipilimumab）が悪性黒色腫の治療薬として上市されており、また、現在、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、前立腺癌などの治療薬としても臨床開発が進められている。

IDO阻害剤としては、現在までにINCB-024360が、悪性黒色腫、卵管癌、卵巣癌、腹膜癌の治療薬として臨床開発が進められている。

血液中やリンパ組織に存在する樹状細胞は、炎症性サイトカインを介しT細胞を活性化することが知られている。樹状細胞において受容体型チロシンキナーゼのサブファミリーであるAXL、MER及びTYRO3はtype I IFN受容体(IFNAR)と結合しSuppressor of cytokine signaling１及び３(SOCS1/3)を誘導することでToll-like receptor 4 (TLR4)シグナルを阻害し、炎症性サイトカインの発現を抑制して、免疫反応を負に制御することが報告されている。また、AXLにより免疫機能が低下するとの報告もある（Cell. 2007 Dec 14;131(6):1124-36.）。

AXLは中央部に細胞膜貫通領域を有し、そのカルボキシル末端側にチロシンキナーゼ領域、アミノ末端側に細胞外領域を有するタンパク質である。これまでに、急性白血病、星状細胞腫、乳癌、大腸癌、食道癌、消化管間質腫瘍、胃癌、肝細胞癌、カポジ肉腫、肺癌、黒色腫、卵巣癌、骨肉腫、膵管腺癌、腎細胞癌、前立腺癌、甲状腺癌及び子宮内膜癌においてAXLの過剰発現が報告されている（Mol. Cancer Ther. 2011 Oct;10(10):1763-73.）。

MERは中央部に細胞膜貫通領域を有し、そのカルボキシル末端側にチロシンキナーゼ領域、アミノ末端側に細胞外領域を有するタンパク質である。これまでに、急性白血病、急性リンパ性白血病、神経膠腫、黒色腫、前立腺癌、神経鞘腫、マントル細胞リンパ腫及び横紋筋肉腫細胞においてMERの過剰発現が報告されている（Nat Rev Cancer. 2014 Dec;14(12):769-85.）

MERにより免疫機能が低下するとの報告がある（J Clin Invest. 2013 Aug 1;123(8):3231-42.）。MERは樹状細胞におけるIL-12等の炎症性サイトカイン産生を抑制し、CD4陽性(陽性については「+」と表すことがある。なお、陰性については「-」と表すことがある。）T細胞、CD8+ T細胞の活性化を抑制することが報告されている。野生型マウスに比較してMERノックアウトマウスでは腫瘍の移植により炎症性サイトカインであるIL-12の発現が誘導され、腫瘍の増殖、転移が抑制されることが報告されている。

6-エチル-3-({3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-5-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)ピラジン-2-カルボキサミド（以下、「化合物Ａ」と言うことがある。）又はその製薬学的に許容される塩は、AXLを含む各種キナーゼに対する阻害作用を有し、これらのキナーゼが関与する腫瘍細胞の増殖を阻害することから、がん治療用医薬組成物の有効成分として有用であることが知られている（特許文献１、特許文献２）。

国際公開第2010/128659号国際公開第2015/119122号

医薬組成物、例えば、がん免疫治療用医薬組成物の有効成分として有用な化合物、及び／又は、免疫活性化用医薬組成物の有効成分として有用な化合物を提供する。

本発明者らは、がん免疫治療用医薬組成物、及び／又は、免疫活性化用医薬組成物の創製を目的に鋭意検討した結果、化合物Ａ、即ち6-エチル-3-({3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-5-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)ピラジン-2-カルボキサミド又はその製薬学的に許容される塩に優れた免疫活性化作用があり、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物が、当該作用に基づき、がん免疫治療用医薬組成物、及び／又は、免疫活性化用医薬組成物としての使用が期待されることを知見して本発明を完成した。

即ち、本発明は、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するがん免疫治療用医薬組成物、ある態様としては、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、AXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対するがん免疫治療用医薬組成物、またある態様としては、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、免疫活性化用医薬組成物、またある態様としては、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、AXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対する免疫活性化用医薬組成物、またある態様としては、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、AXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対するCD8陽性細胞数の増加作用を介した免疫活性化用医薬組成物に関する。

本発明のある態様を以下に示す。

（１）化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するがん免疫治療用医薬組成物。ある態様としては、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するAXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対するがん免疫治療用医薬組成物。またある態様としては、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する免疫活性化用医薬組成物。またある態様としては、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するAXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対する免疫活性化用医薬組成物。またある態様としては、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するAXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対するCD8陽性細胞数の増加作用を介した免疫活性化用医薬組成物。

（２）がん免疫治療用医薬組成物の製造のための、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩の使用。ある態様としては、AXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対するがん免疫治療用医薬組成物の製造のための、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩の使用。またある態様としては、免疫活性化用医薬組成物の製造のための、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩の使用。またある態様としては、AXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対する免疫活性化用医薬組成物の製造のための、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩の使用。またある態様としては、AXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対するCD8陽性細胞数の増加作用を介した免疫活性化用医薬組成物の製造のための、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩の使用。

（３）がん免疫治療のための、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩の使用。ある態様としては、AXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対するがん免疫治療のための、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩の使用。またある態様としては、免疫活性化のための、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩の使用。またある態様としては、AXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対する免疫活性化のための、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩の使用。またある態様としては、AXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対するCD8陽性細胞数の増加作用を介した免疫活性化のための、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩の使用。

（４）がん免疫治療のための、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩。ある態様としては、AXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対するがん免疫治療のための、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩。またある態様としては、免疫活性化のための、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩。またある態様としては、AXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対する免疫活性化のための、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩。またある態様としては、AXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対するCD8陽性細胞数の増加作用を介した免疫活性化のための、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩。

（５）化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩の有効量を対象に投与することからなる、がん免疫を介したがんの治療方法。ある態様としては、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩の有効量を対象に投与することからなる、AXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対するがん免疫を介したがんの治療方法。またある態様としては、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩の有効量を対象に投与することからなる、免疫活性化を介したがんの治療方法。またある態様としては、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩の有効量を対象に投与することからなる、AXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対する免疫活性化を介したがんの治療方法。またある態様としては、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩の有効量を対象に投与することからなる、AXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対するCD8陽性細胞数の増加作用を介した免疫活性化を介したがんの治療方法。

（６）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と組み合わせて投与されることを特徴とする、（１）の医薬組成物。

（７）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体が、ニボルマブ（nivolumab）、ペンブロリズマブ（pembrolizumab）、アテゾリズマブ（atezolizumab）、ピディリズマブ（pidilizumab）、アヴェルマブ（avelumab）及びデュルバルマブ（durvalumab）から選択される抗体である、（６）の医薬組成物。

（８）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と同時に、別々に、連続して、或いは、間隔をあけて投与されることを特徴とする、（７）の医薬組成物。

（９）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体との併用治療用である（６）〜（８）の医薬組成物。

（１０）悪性黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌、再発性膠芽腫、頭頚部癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌、メルケル細胞癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、又はC型慢性肝炎の治療用である（１）、（６）〜（９）の医薬組成物。

（１１）化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する、（１）、（６）〜（１０）に記載の医薬組成物。

（１２）化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩が化合物Ａヘミフマル酸塩である（１）、（６）〜（１１）の医薬組成物。

（１３）化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩が化合物Ａヘミフマル酸塩である（２）の使用。

（１４）化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩が化合物Ａヘミフマル酸塩である（３）の使用。

（１５）（４）において、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩が化合物Ａヘミフマル酸塩である（４）の化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩。

（１６）化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩が化合物Ａヘミフマル酸塩である（５）の治療方法。

また、本願発明は以下の発明にも関する。
（１７）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と組み合わせて投与されることを特徴とする、（２）又は（１３）の使用。
（１８）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、ピディリズマブ、アヴェルマブ及びデュルバルマブから選択される抗体である、（１７）の使用。
（１９）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と同時に、別々に、連続して、或いは、間隔をあけて投与されることを特徴とする、（１７）又は（１８）の使用。
（２０）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体の投与を受けている対象におけるがんの治療用である（１７）〜（１９）の使用。
（２１）悪性黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌、再発性膠芽腫、頭頚部癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌、メルケル細胞癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、又はC型慢性肝炎の治療用である（１７）〜（２０）の使用。

また、本願発明は以下の発明にも関する。
（２２）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と組み合わせて併用投与されることを特徴とする、（３）又は（１４）の使用。
（２３）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、ピディリズマブ、アヴェルマブ及びデュルバルマブから選択される抗体である、（２２）の使用。
（２４）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と同時に、別々に、連続して、或いは、間隔をあけて投与されることを特徴とする、（２２）又は（２３）の使用。
（２５）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体の投与を受けている対象におけるがんの治療用である（２２）〜（２４）の使用。
（２６）悪性黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌、再発性膠芽腫、頭頚部癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌、メルケル細胞癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、又はC型慢性肝炎の治療用である（２２）〜（２５）の使用。

また、本願発明は以下の発明にも関する。
（２７）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と組み合わせて併用投与されることを特徴とする、（４）又は（１５）の化合物又はその塩。
（２８）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、ピディリズマブ、アヴェルマブ及びデュルバルマブから選択される抗体である、（２７）の化合物又はその塩。
（２９）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と同時に、別々に、連続して、或いは、間隔をあけて投与されることを特徴とする、（２７）又は（２８）の化合物又はその塩。
（３０）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体の投与を受けている対象におけるがんの治療用である（２７）〜（２９）の化合物又はその塩。
（３１）悪性黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌、再発性膠芽腫、頭頚部癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌、メルケル細胞癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、又はC型慢性肝炎の治療用である（２７）〜（３０）の化合物又はその塩。

また、本願発明は以下の発明にも関する。
（３２）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体の併用治療に用いる場合の治療有効用量、並びに化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩を併用治療に用いる場合の治療有効用量とを組み合わせて、対象に投与することを特徴とするがん免疫治療方法。
（３３）化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩が化合物Ａヘミフマル酸塩である（３２）のがん免疫治療方法。
（３４）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、ピディリズマブ、アヴェルマブ及びデュルバルマブから選択される抗体である、（３２）又は（３３）の治療方法。
（３５）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と同時に、別々に、連続して、或いは、間隔をあけて投与されることを特徴とする、（３２）〜（３４）の治療方法。
（３６）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体の投与を受けている対象におけるがんの治療用である（３２）〜（３５）の治療方法。
（３７）悪性黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌、再発性膠芽腫、頭頚部癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌、メルケル細胞癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、又はC型慢性肝炎の治療用である（３２）〜（３６）の治療方法。

また、本願発明は以下の発明にも関する。
（３８）化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩を含有する免疫活性化によるがん治療剤。
（３９）（３８）の治療剤であって、PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と併用されることを特徴とする剤。
（４０）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、ピディリズマブ、アヴェルマブ及びデュルバルマブから選択される抗体である、（３９）の剤。
（４１）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と同時に、別々に、連続して、或いは、間隔をあけて投与されることを特徴とする、（３９）又は（４０）の剤。
（４２）PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体の投与を受けている対象におけるがんの治療用である（３９）〜（４１）の剤。
（４３）悪性黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌、再発性膠芽腫、頭頚部癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌、メルケル細胞癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、又はC型慢性肝炎の治療用である（３９）〜（４２）の剤。

なお、「対象」とは、その予防若しくは治療を必要とするヒト又はその他の動物であり、ある態様としては、その予防若しくは治療を必要とするヒトである。

本発明の医薬組成物の有効成分である化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩は、免疫活性化作用を有し、当該作用に基づき、がん免疫治療剤、及び／又は、免疫活性化剤としての使用が期待できる。

図１は実施例１に記載のMC38皮下担癌マウスに対する化合物Ａ(COMPOUND A)投与群の腫瘍体積を示す図である。COMPOUND A 30 mg/kg bidは化合物Ａヘミフマル酸塩をフリー体換算で30 mg/kgの用量で1日2回、１７日間経口投与した群を、COMPOUND A 60 mg/kg qdは化合物Ａヘミフマル酸塩をフリー体換算で60 mg/kgの用量で1日1回、１７日間経口投与した群を、controlは対照として化合物Ａを投与していない群を示す。また、縦軸は腫瘍体積 (Tumor Volume (mm³))を、横軸は投与後日数 (Days after administration)を示す。図２は実施例２に記載のMC38皮下担癌マウスに対する化合物Ａ(COMPOUND A)投与個体の腫瘍体積を示す図である。COMPOUND A 100mg/kg qd-1、COMPOUND A 100mg/kg qd-2、及びCOMPOUND A 100mg/kg qd-3は、化合物Ａヘミフマル酸塩をフリー体換算で100 mg/kgの用量で1日1回、7日間経口投与した後、化合物Ａ投与群から抽出した3例(COMPOUND A 100mg/kg qd)を示す。また、control-１、control-２及びcontrol-３は、対照として0.5% メチルセルロースを化合物Ａ(COMPOUND A)投与と同様の用法で1日1回、7日間経口投与した後、対照群から抽出した3例(control)を示す。また、縦軸は腫瘍体積(Tumor Volume (mm³))を、横軸は投与後日数(Days after administration)を示す。図３は実施例２に記載のMC38皮下担癌マウスに対する化合物Ａ(COMPOUND A)投与群の脾臓(spleen)中のCD4+ T細胞 (CD4+ in spleen)を解析した結果である。縦軸はCD3+、CD4+でかつCD8-の細胞数の割合(CD3+CD4+CD8-T cells (%))、つまり、CD4+の割合（％）を、横軸は図２の説明に記載の投与化合物(COMPOUND A 100mg/kg qd、及び、control)を示す。図４は実施例２に記載のMC38皮下担癌マウスに対する化合物Ａ(COMPOUND A)投与群の脾臓(spleen)中のCD8+ T細胞(CD8+ in spleen)を解析した結果である。縦軸はCD3+、CD4-でかつCD8+の細胞数の割合(CD3+CD4-CD8+T cells (%))、つまり、CD8+の割合（％）を、横軸は図２の説明に記載の投与化合物(COMPOUND A 100mg/kg qd、及び、control)を示す。図５は実施例２に記載のMC38皮下担癌マウスに対する化合物Ａ(COMPOUND A)投与群の腫瘍(tumor)中のCD8+ T細胞(CD8+ in tumor)を解析した結果である。縦軸はCD3+、CD4-でかつCD8+の細胞数の割合(CD3+CD4-CD8+ T cells (%))、つまり、CD8+の割合（％）を、横軸は図２の説明に記載の投与化合物(COMPOUND A 100mg/kg qd、及び、control)を示す。

以下、本発明を詳細に説明する。
上述の通り、化合物Ａの化学名は6-エチル-3-({3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-5-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)ピラジン-2-カルボキサミドであり、その化学構造は以下に示すとおりである。

がん微小環境とは、多くのがんではがん細胞のほかに「間質」と呼ばれる部分があり、線維芽細胞と呼ばれる細胞をはじめ、血管やリンパ管そして、これらの細胞の間に存在する結合組織が存在して特徴的な構造を作っている、その間質の部分を意味する。

免疫チェックポイントとは、免疫応答が過剰に働くことを抑制する体のチェック機構のことを意味する。

がん免疫治療とは、がん細胞の増殖を抑制し又はがん細胞の縮小若しくは消滅させる能力（以下、抗腫瘍活性）が低下した免疫細胞、特に活性化T細胞を再度活性化させること、及び／又は、免疫細胞、特に活性化T細胞数を増加させることで、抗がん治療を行うことを意味する。

がん免疫を介したがんの治療とは、体内の免疫を利用してがんを治療すること、特に活性化T細胞によりがんを治療することを意味する。

免疫活性化とは、がん細胞の増殖を抑制し又はがん細胞の縮小若しくは消滅させる能力（以下、抗腫瘍活性）が低下した免疫細胞、特に活性化T細胞を再度活性化させること、及び／又は、免疫細胞、特に活性化T細胞数を増加させることを意味する。

AXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんとは、AXL及び／又はMERが正常組織と比較して免疫細胞へ過剰発現することにより、免疫細胞、特に活性化T細胞によるがん細胞の増殖を抑制する能力又はがん細胞の縮小若しくは消滅させる能力が低下した結果、免疫逃避機構を獲得したがんを意味する。本発明が適用され得るがんは特に限定されないが、例えば、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌、再発性膠芽腫、頭頚部癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌、メルケル細胞癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、C型慢性肝炎、大腸癌、乳癌、卵管癌、卵巣癌、腹膜癌を挙げることができる。ある態様としては、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌、再発性膠芽腫、頭頚部癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌、メルケル細胞癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、C型慢性肝炎を挙げることができる。またある態様としては、非小細胞肺癌、大腸癌、乳癌を挙げることができる。また更にある態様としては、非小細胞肺癌、急性骨髄性白血病を挙げることができる。

ある態様として、本発明の医薬組成物はPD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と組み合わせて投与されることを特徴とし、当該PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体としては、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、ピディリズマブ、アヴェルマブ及びデュルバルマブから選択される抗体を挙げることができる。

また、本発明の医薬組成物はPD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と同時に、別々に、連続して、或いは、間隔をあけて投与されてもよい。

ある態様として、本発明の医薬組成物はPD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と組み合わせて投与されることを特徴とし、当該PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体が効果を奏するがんに対しても併用効果を奏することが期待される。当該PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体が効果を奏するがんとして、例えば、固形癌を挙げることが出来る。そのような固形癌としては、例えば、悪性黒色腫（例えば、転移性悪性メラノーマ）、腎癌（例えば、腎細胞癌、透明細胞カルシノーマ）、前立腺癌（例えば、ホルモン難治性前立腺アデノカルシノーマ）、乳癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、膵癌、大腸癌、肝細胞癌、胆道癌、胃癌、卵巣癌、食道癌、尿路上皮癌、結腸癌、骨癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚若しくは眼窩内悪性メラノーマ、子宮癌、直腸癌、肛門部癌、精巣癌、子宮癌、卵管のカルシノーマ、子宮内膜カルシノーマ、子宮頚部カルシノーマ、膣カルシノーマ、外陰部カルシノーマ、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、柔組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形癌、膀胱癌、腎臓若しくは尿管の癌、腎盂カルシノーマ、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、腫瘍新脈管形成、脊椎腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体アデノーマ、カポシ肉腫、扁平上皮癌、扁平細胞癌、アスベスト誘発癌を含む環境誘発がんおよび上記がんの組み合わせが挙げられる。より適用が期待できる固形癌としては、悪性黒色腫（例えば、転移性悪性メラノーマ）、腎癌（例えば、腎細胞癌、透明細胞カルシノーマ）、前立腺癌（例えば、ホルモン難治性前立腺アデノカルシノーマ）、乳癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、膵癌、大腸癌、肝細胞癌、胆道癌、胃癌、卵巣癌、食道癌、尿路上皮癌および上記癌の組み合わせであり、さらに期待できるのは、悪性黒色腫（例えば、転移性悪性メラノーマ）、腎癌（例えば、腎細胞癌、透明細胞カルシノーマ）、前立腺癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、大腸癌、肝細胞癌、胆道癌、および上記癌の組み合わせである。

固形癌の患者以外にも血液がんの患者に対しても効果が期待できる。そのような血液がんとしては、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、小リンパ球性リンパ腫、多発性骨髄腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫、B細胞前リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、組織球性リンパ腫、急性骨髄性白血病、急性巨核芽球性白血病、未分化大細胞リンパ腫、急性Ｔ細胞性リンパ腫、リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、および上記がんの組み合わせである。

化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩は、上記特許文献１（国際公開第 2010/128659号）に記載の方法に従って、あるいはその変法によって入手することができる。

また、「化合物Ａの製薬学的に許容される塩」とは、化合物Ａの酸付加塩を意味し、具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩が挙げられる。
なお、「化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩」のある態様としては、化合物Ａが挙げられ、またある態様としては、化合物Ａのフマル酸との酸付加塩が挙げられる。またある態様としては、化合物Ａヘミフマル酸塩が挙げられる。

また、本発明の医薬組成物の有効成分としては、化合物Ａの溶媒和物、具体的には、例えば水和物やエタノール和物であってもよく、さらに、化合物Ａの酸付加塩の溶媒和物であってもよい。

化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩を含有する医薬組成物は、当分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用されている方法によって調製することができる。
投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、又は、関節内、静脈内、筋肉内等の注射剤、坐剤、経皮用液剤、軟膏剤、経皮用貼付剤、経粘膜液剤、経粘膜貼付剤、吸入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。

経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては、１種又は２種以上の有効成分が、少なくとも１種の不活性な賦形剤と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な添加剤、例えば滑沢剤や崩壊剤、安定化剤、溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよい。

経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水又はエタノールを含む。当該液体組成物は不活性な希釈剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。

非経口投与のための注射剤は、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤又は乳濁剤を含有する。水性の溶剤としては、例えば注射用蒸留水又は生理食塩液が含まれる。非水性の溶剤としては、例えばエタノールのようなアルコール類がある。このような組成物は、さらに等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、又は溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解又は懸濁して使用することもできる。

通常経口投与の場合、1日の投与量は、体重当たり約0.001〜100 mg/kg、好ましくは0.01〜30 mg/kg、更に好ましくは0.1〜10 mg/kgが適当であり、これを1回であるいは2回〜4回に分けて投与する。静脈内投与される場合は、1日の投与量は、体重当たり約0.0001〜10 mg/kgが適当で、1日1回〜複数回に分けて投与する。また、経粘膜剤としては、体重当たり約0.001〜100 mg/kgを1日1回〜複数回に分けて投与する。投与量は症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。

投与経路、剤形、投与部位、賦形剤や添加剤の種類によって異なるが、本発明の医薬組成物は0.01〜99重量%、ある態様としては0.01〜50重量%の化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する。

本発明の医薬組成物は、種々の治療剤と併用することができる。当該併用は、同時投与、あるいは別個に連続して、若しくは所望の時間間隔をおいて投与してもよい。同時投与の場合には、配合剤であっても別個に製剤化されていてもよい。特に併用することができる薬剤として、シスプラチン、カルボプラチンなどのプラチナ製剤、ゲムシタビン、ペメトレキセド、5-フルオロウラシル、カペシタビン、ベンダムスチンなどの代謝拮抗剤、パクリタキセル、ビノレルビンなどの微小管重合阻害剤、ベバシズマブなどの血管新生阻害剤、イリノテカン、エトポシドなどのトポイソメラーゼ阻害剤、インターフェロンのようなサイトカイン製剤、スニチニブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、アキシチニブなどのキナーゼ阻害剤、エンザルタミドなどの抗アンドロゲン剤、テモゾロミド、ダカルバジン、シクロホスファミドやイホスファミドなどのアルキル化剤が挙げられる。

本発明の医薬組成物の薬理的効果は、以下の実施例により確認した。

実施例１大腸癌細胞株MC38担癌モデルに対する化合物Ａの抗腫瘍評価(in vivo)
大腸癌細胞株MC38細胞（National Cancer Institute）を10% Fetal Bovine Serum(FBS)を添加したダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地（DMEM）にて培養した。その後、C57BL/6Jマウス（雌、日本チャ−ルスリバー）の背部にMC38細胞を皮下移植することでMC38皮下担癌マウスを作製した。腫瘍の生着を確認した後、0.5% メチルセルロースにて溶解した被験化合物である化合物Ａヘミフマル酸塩をフリー体換算で30 mg/kgの用量で1日2回、１７日間経口投与した群（COMPOUND A 30 mg/kg bid）、及び化合物Ａヘミフマル酸塩をフリー体換算で60 mg/kgの用量で1日1回、１７日間経口投与した群（COMPOUND A 60 mg/kg qd）、及び対照として化合物Ａを投与していない群（control)について、それぞれの、腫瘍体積の変化を週2回の頻度で測定した。

結果を図１に示す。被験化合物を投与した群（COMPOUND A 30 mg/kg bid、及びCOMPOUND A 60 mg/kg qd）はcontrol群に比べて強い腫瘍体積の増加抑制作用を示した。

以上から、化合物Ａは大腸癌細胞株MC38を正常な免疫機能を有するC57BL/6Jマウスに移植した同系モデルにおいて、抗腫瘍効果を示すことが確認された。

実施例２大腸癌細胞株MC38担癌モデルに対する化合物Ａの免疫活性化評価
C57BL/6Jマウス（雌、日本チャ−ルスリバー）の背部にMC38細胞を皮下移植することでMC38皮下担癌マウスを作製した。腫瘍の生着を確認した後、被験化合物である化合物Ａヘミフマル酸塩をフリー体換算で100 mg/kgの用量で1日1回、7日間、7例のマウスそれぞれへ経口投与した。また対照として0.5% メチルセルロースも100 mg/kg投与と同様の用法で1日1回、7日間、7例のマウスそれぞれへ経口投与した。投与後４日目、７日目の腫瘍体積の変化を測定した後、対照群から抽出した3例（control-１、control-２及びcontrol-３）および化合物Ａ投与群から抽出した3例（COMPOUND A 100mg/kg qd-1、同qd-2、及び同qd-3）の計6例のマウスから脾臓及び腫瘍を回収し、抗CD3抗体（eBioscience）、抗CD4抗体（Biolegend）、抗CD8抗体（eBioscience）、抗CD45抗体（Biolegend）にて染色を実施し、フローサイトメーター（BD FACSVerse）を用いて各抗原の陽性細胞の数を測定した。

腫瘍体積の変化の結果を図２に示す。対照群（control-１、control-２及びcontrol-３）では時間の経過とともに腫瘍体積の増大が観察された一方、化合物Ａ投与群であるCOMPOUND A 100mg/kg qd-2及び同qd-3において、ほとんど腫瘍体積の増加は見られなかった。

脾臓中のCD45+でかつCD3+細胞中におけるCD4+の細胞数の割合を図３に、CD45+でかつCD3+細胞中におけるCD8+の細胞数の割合を図４に示す。対照群（control）に比べて化合物Ａ投与マウス群（COMPOUND A 100mg/kg qd-1、同qd-2、及び同qd-3）は脾臓中のCD4+細胞及びCD8+細胞の増加がそれぞれ見られた。

腫瘍中のCD45+かつCD3+細胞中におけるCD8+細胞数の割合を図５に示す。腫瘍中のCD8+細胞数に関しては、化合物Ａ投与により腫瘍増殖が抑制されている個体（COMPOUND A 100mg/kg qd-2、及び同qd-3）において、CD8+細胞が増加するという関係が見られた。

以上から、化合物ＡはCD4陽性細胞及びCD8陽性細胞の増加を促進し、免疫機能を活性化すること、並びに免疫機能が活性化された個体において腫瘍増殖が抑制されることが示された。この結果から、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩はAXL及び／又は MERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用できることが期待される。

実施例３ PD-1/PD-L1抗体との併用によるマウス同系担癌モデルに対する抗腫瘍評価
本発明の被験化合物である化合物Ａヘミフマル酸塩と抗PD-1抗体、又は被験化合物である化合物Ａヘミフマル酸塩と抗PD-L1抗体との併用による効果は、マウス同系担癌モデルに投与した際の抗腫瘍作用と延命作用を評価することにより確認することができる。マウスの腫瘍由来の細胞としては、例えばCT26、A20、 J558、4T1、MC38が挙げられる。

本発明の医薬組成物の有効成分である、化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩は優れた免疫活性化作用があり、当該作用に基づき化合物Ａ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物が、がん免疫治療剤、及び／又は、免疫活性化剤として使用できることが期待される。

Claims

6-エチル-3-({3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-5-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)ピラジン-2-カルボキサミド又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、がん免疫治療用医薬組成物（但し、AXL に関連するがんに対するがん免疫治療用医薬組成物は除く）。
がん免疫治療用医薬組成物が、AXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対するがん免疫治療用医薬組成物である、請求項１に記載の医薬組成物。
6-エチル-3-({3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-5-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)ピラジン-2-カルボキサミド又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、免疫活性化用医薬組成物（但し、AXL に関連するがんに対する免疫活性化用医薬組成物は除く）。
免疫活性化用医薬組成物が、AXL及び／又はMERの発現により免疫逃避機構を獲得したがんに対する免疫活性化用医薬組成物である、請求項３に記載の医薬組成物。
免疫活性化が、CD8陽性細胞数の増加作用を介した免疫活性化である、請求項４に記載の医薬組成物。
PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項１乃至５に記載の医薬組成物。
PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、ピディリズマブ、アヴェルマブ及びデュルバルマブから選択される抗体である、請求項６に記載の医薬組成物。
PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と同時に、別々に、連続して、或いは、間隔をあけて投与されることを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
6-エチル-3-({3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-5-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)ピラジン-2-カルボキサミド又はその製薬学的に許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する、請求項１乃至８に記載の医薬組成物。
6-エチル-3-({3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-5-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)ピラジン-2-カルボキサミド又はその製薬学的に許容される塩が、6-エチル-3-({3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-5-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)ピラジン-2-カルボキサミドヘミフマル酸塩である、請求項１乃至９に記載の医薬組成物。