JP2020525040A - カイコから改質シルクを生産する方法及びその生産のための飼料組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
クワ葉粉末及び水を含む混合物を加熱する工程;
前記混合物を加熱した後、前記混合物をプロトン性有機化合物と混合してプロトン性有機化合物を含む飼料組成物を形成する工程であって、前記プロトン性有機化合物はクワ葉粉末の1重量%未満である工程;
カイコに前記飼料組成物を供給して改質シルクを生成する工程;及び
カイコから前記改質シルクを抽出する工程であって、前記改質シルクは結晶子を含み、各結晶子は7nm以下の長さを有する工程
を含む。
第3の態様では、カイコから改質シルクを生産するための飼料組成物が提供され、前記改質シルクは結晶子を含み、各結晶子は7nm以下の長さを有し、前記試料組成物は:
クワ葉粉末;
水;及び
改質シルクの各結晶子の長さを7nm以下にするような変化を誘導するプロトン性有機化合物
を含み、前記プロトン性有機化合物はクワ葉粉末の1重量%未満である。
実施形態の文脈で説明される特徴は、他の実施形態の同じ又は類似の特徴に対応して適用可能であり得る。実施形態の文脈で説明される特徴は、これらの他の実施形態で明示的に説明されていなくても、他の実施形態に対応して適用可能であり得る。さらに、実施形態の文脈において特徴について説明する追加及び/又は組み合わせ及び/又は代替は、他の実施形態の同じ又は類似の特徴に対応して適用可能であり得る。
「実質的に」という語は「完全に」を除外しない。例えば、Yを「実質的に含まない」組成物は、Yを完全に含まなくてもよい。必要な場合、「実質的に」という言葉は、発明の定義から省略され得る。
様々な実施形態の文脈において、数値に適用される「約」又は「およそ」という用語は、正確な値と合理的な変動を包含する。
特に明記しない限り、用語「含む」及びその文法上の変形は、記載された要素を含むが、記載されていない追加の要素の包含も許容するような「オープン」又は「包括的」な言葉を表すことを意図している。
本開示では、カイコから改質シルクを生産する方法が提供される。この方法は、クワ葉粉末及び水を含む混合物を加熱する工程、前記混合物を加熱した後に前記混合物をプロトン性有機化合物と混合して、プロトン性有機化合物を含む飼料組成物を形成する工程であって、プロトン性有機化合物はクワ葉粉末の1重量%未満である工程、カイコに前記飼料組成物を与えて改質シルクを生成する工程、及び改質シルクをカイコから抽出する工程を含み、ここで、改質シルクは結晶子を含み、各結晶子は7nm以下、5nm以下、4nm以下、3nm以下、2nm以下、1nm以下などの長さを有する。
本開示は、カイコから改質シルクを生産する方法に関する。本明細書に開示される方法は、プロトン性有機化合物を含むように改変された飼料組成物、及び改質シルクを生成するためにその飼料組成物をカイコに供給することを含む。生成された改質シルクは、よりコンパクトな結晶子を持ち、改質シルクの機械的特性が大幅に向上する。本開示はまた、飼料組成物及びそのような方法から得られた改質シルクに関する。
実施例1:カイコの飼育及び飼料の調製
クワ葉粉末(100g、Recorp Inc.、カナダ)を水(300mL)と混合し、電子レンジにかけることにより、通常の飼料を調製した。改変飼料は、クワ葉粉末(100g)を水(300mL)と混合して電子レンジにかけ、その後、葉粉末の0.05重量%のクエン酸(CA)(50mg、Fisher)と混合することにより調製した。
CAの供給濃度を変えることで、所望の機械的特性を達成することができる。飼料に添加するCAの濃度を変えることにより、シルク中の結晶子の長さを4.69nm(βシートのβ鎖に沿って約13アミノ酸残基に相当)の長さまで調整することができ、これは対照シルクで観察された結晶子の長さ(8.84nm、βシートのβ鎖に沿った約25残基に相当)のたった半分程度である。
シルクの機械的特性を決定するために、引張試験のためにシルク繊維をそれぞれ20×5mmの窓を有するペーパーフレームに取り付けた。5Nロードセル(精度:±0.5%;ひずみ速度:2mm/分)を装備したユニバーサルテスター(Instron Double Column Universal Tester 5569)の2つのグリップに固定した後、試験中にシルク繊維に直接荷重が加えられるようにペーパーフレームを切断した。試験は、室温(24℃)で湿度60%の大気下で実施した。引張試験の各サンプルについて、テスターに接続されたコンピューターでBluehillソフトウェアを使用して、開始位置の2つのグリップ間の距離からゲージ長を個別に決定した。また、得られた応力−ひずみ曲線の「つま先」領域を削除するために、ソフトウェアでスラック補正を行った。応力−ひずみ曲線のつま先領域は、曲線の開始部分に存在する(この例ではつま先領域がすでに除去(すなわち先端補正)されているため、図1には存在しない)。試験前又は試験後に先端補正する方法は2つある(すなわち、それぞれプリロード又はスラック補正計算)。本願の研究では、すべての応力−ひずみ曲線を補正するアプローチとして後者を用いた。先端補正を実行する(すなわち、つま先領域を削除する)ことは、標準的な手順である。
結晶子の寸法を決定するために、脱ガム繊維の束を厚紙フレームに取り付け、X線回折(XRD)パターンを、100μmのビームサイズ及び1.5418Åの放射波長を使用してBruker AXS X8 Proteum回折装置で収集した(CuKα)。サンプルから検出器までの距離は6cmで、露光時間は60秒であった。次に、赤道(5〜40°)軸又は経線(5〜37.5°)軸に沿って、得られたXRDパターンに対して放射積分を実行した。得られたスペクトルを、シルクフィブロインの特徴的な成分ピークにフィッティングさせた。a、b及びc方向に沿った結晶子サイズを、赤道スペクトルの(200)ピーク及び(120)ピークと経線スペクトルの(002)ピークのFWHM(半値全幅)から決定した。計算は、シェラー方程式、L=0.9λ/(FWHM×cosθ)を使用して実行し、ここで、L=a、b又はc方向に沿った結晶子サイズ、0.9=シェラー定数、λ=入射X線の波長(CuKα放射では1.5418Å)、θ=ピーク位置、及びFWHM=半値全幅である。具体的には、aはβシートの積み重ねに沿った方向(結晶子の厚さ)、bはβシートの鎖軸に垂直な方向(結晶子の幅)、cはβ鎖軸に沿った方向(結晶子の長さ)である。
5齢目の終わりに、128mM NaCl、1.8mM CaCl2・2H2O、1.3mM KCl及び50mM Tris(トリスアミノメタン)を含む昆虫リンガー溶液中でカイコを解剖した。次に、解剖したカイコから絹糸腺を取り出し、蒸留水で洗浄し、それらの腺上皮層を剥離してシルクドープを得た。乾燥後、シルクドープ中のセリシンを除去するために、シルクドープを、1gL−1NaHCO3溶液中サビナーゼ酵素(5mg)及びTriton(登録商標)−X(5mg)からなる脱ガム溶液(5mL)に加え、その後、55℃で1時間加熱した。各シルクドープから得られたフィブロインを乾燥させ、CAの含有量を定量化するために使用した。乾燥させたシルクフィブロイン(3mg)を、9.3M LiBr溶液100μL中、70℃で3時間加熱して溶解させた。シルクフィブロインが溶解したら、得られた溶液を、分光光度法を使用してCAの量を定量化するために分析した。シルクフィブロイン(N=3)中のCAの量を決定するために、溶液サンプル(100μL)を4mLのFe(NO3)3溶液及び1mLのHNO3の混合物に個別に添加し、ガラスバイアル中で25mLまで蒸留水を追加した。1000W/m2のソーラーシミュレータ(Newport Corporation USA、モデル66901)で10分間照光すると、クエン酸第二鉄錯体のフォトクロミズムにより、溶液は紫色になった。発色は、4℃の日陰で30分間安定した。溶液の520nmでのピーク吸光度を、UV−Vis(紫外可視)分光光度計(島津UV−3150)を使用して測定した。次に、一連の異なる濃度のCAを用いて同じ手順を使用して作成した検量線を参照して、CAの実際の量を計算した。データは、平均±標準偏差として提示された。一方、針注射器を使用して、解剖前にカイコから血リンパ(すなわち、血液)も抽出した。同じ方法を使用して、血リンパ中のCAの量を決定した(N=3)。
MDシミュレーションを実行して、シルクの構造に対するCAの影響を評価した。エネルギー分析により、CA分子のシルクへの結合が確認され、これによりチロシンの取り込みも防止され、シミュレーション結果は、CA分子が構造変化を誘発し、シルクの構造内容を変更できることを示した。CAの存在下で分子をフォールディングさせると、βシートの含有量が低下した(図3f)。つまり、チロシン−CA複合体の立体障害により、βシートの広範な形成が妨げられた。シミュレーションの結果は、シルクの構造内容に関する実験結果と一致していた。モデリング及びシミュレーションの詳細な方法を以下に詳しく説明する。
上記で実証されたように、本明細書に開示される方法は、シルク結晶子中の嵩高い残基を除去することにより、カイコシルクの結晶子を大幅に短縮し、本質的に最も強靭なシルクを生産するアプローチを提供する。
本明細書に開示される方法は、クモの牽引糸シルクよりも強力な、本質的に最も強靭なカイコシルクを生産するための、単純で環境的に持続可能かつスケーラブルな戦略に関する。カイコシルクを本質的に強化する方法は、シルクの構造及び機能を強化するために、シルクフィブロイン中に緊密な結晶子を形成することを伴う。具体的には、シルク中の結晶子は主成分としてシルクフィブロインを構成し、結晶子はシルクフィブロイン材料の強化された特性/機能性を達成するために調整することができる。
Claims (20)
- カイコから改質シルクを生産する方法であって、
クワ葉粉末及び水を含む混合物を加熱する工程;
前記混合物を加熱した後、前記混合物をプロトン性有機化合物と混合してプロトン性有機化合物を含む飼料組成物を形成する工程であって、前記プロトン性有機化合物はクワ葉粉末の1重量%未満である工程;
カイコに前記飼料組成物を供給して改質シルクを生成する工程;及び
カイコから前記改質シルクを抽出する工程であって、前記改質シルクは結晶子を含み、各結晶子は7nm以下の長さを有する工程
を含む方法。 - 前記混合物を加熱する前に、クワ葉粉末及び水を、1:1〜1:10の重量対体積比で混合することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 加熱は、前記混合物をマイクロ波にさらすことを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記混合物に混合されるプロトン性有機化合物は、クワ葉粉末の0.001〜0.9重量%である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 改質シルクを生成することは、チロシンが改質シルクの結晶子に組み込まれるのを防ぐ複合体を、チロシン及び前記プロトン性有機化合物から形成することを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロトン性有機化合物は、単プロトン性又は多プロトン性有機化合物である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロトン性有機化合物は、カルボン酸基(−COOH)、スルホン酸基(−SO2OH)、ヒドロキシル基(−OH)、チオール基(−SH)、及びそれらの組合せからなる群から選択される官能基を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロトン性有機化合物は有機酸である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有機酸は、クエン酸(HOC(COOH)(CH2COOH)2)、酢酸(CH3COOH)、ギ酸(HCOOH)、安息香酸(C6H5COOH)、グリコール酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、マロン酸、ニトリロ三酢酸、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記有機酸はクエン酸である、請求項8又は9に記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法によって生産された改質シルク。
- カイコから改質シルクを生産するための飼料組成物であって、前記改質シルクは結晶子を含み、各結晶子は7nm以下の長さを有し、前記試料組成物は、
クワ葉粉末;
水;及び
改質シルクの各結晶子の長さを7nm以下にするような変化を誘導するプロトン性有機化合物
を含み、前記プロトン性有機化合物はクワ葉粉末の1重量%未満である飼料組成物。 - 前記プロトン性有機化合物は、クワ葉粉末の0.001〜0.9重量%である、請求項12に記載の飼料組成物。
- クワ葉粉末及び水は、1:1〜1:10の重量対体積比で存在する、請求項12又は13に記載の飼料組成物。
- 前記プロトン性有機化合物がチロシンと相互作用して、チロシンが改質シルクの結晶子に取り込まれるのを防ぐ複合体を形成する、請求項12〜14のいずれか一項に記載の食物組成物。
- 前記プロトン性有機化合物は、単プロトン性又は多プロトン性有機化合物である、請求項12〜15のいずれか一項に記載の飼料組成物。
- 前記プロトン性有機化合物は、カルボン酸基(−COOH)、スルホン酸基(−SO2OH)、ヒドロキシル基(−OH)、チオール基(−SH)、及びそれらの組合せからなる群から選択される官能基を含む、請求項12〜16のいずれか一項に記載の飼料組成物。
- 前記プロトン性有機化合物は有機酸である、請求項12〜17のいずれか一項に記載の飼料組成物。
- 前記有機酸は、クエン酸(HOC(COOH)(CH2COOH)2)、酢酸(CH3COOH)、ギ酸(HCOOH)、安息香酸(C6H5COOH)、グリコール酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、マロン酸、ニトリロ三酢酸、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項18に記載の飼料組成物。
- 前記有機酸はクエン酸である、請求項18又は19に記載の飼料組成物。
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