JP2020510648A - 家族性高コレステロール血症を処置するための遺伝子治療 - Google Patents

Abstract

家族性高コレステロール血症を有するヒト患者におけるアフェレーシスの頻度を低減するのに有用な投与計画が説明される。本方法は、複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の懸濁液の注入により末梢静脈を介してヒト被験者に投与することを含む。【選択図】なし

Description

１．緒言
本発明は家族性高コレステロール血症（ＦＨ）及び具体的にはホモ接合性ＦＨ（ＨｏＦＨ）を処置するための遺伝子治療に関する。

電子形式で提出する資料の引用による組み込み
出願人は、これとともに電子形式で申請する配列表資料を引用することによりここに組み込む。本ファイルは「１６−７７１７Ｃ１ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と表示する。

２．背景技術
家族性高コレステロール血症（ＦＨ）は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）機能に影響を及ぼす遺伝子中の突然変異が引き起こす、生命を脅かす障害である（非特許文献１）。分子的に確認されるＦＨを罹患している患者の９０％超がＬＤＬＲをコードする遺伝子（ＬＤＬＲ、ＭＩＭ ６０６９４５）中に突然変異を有すると推定される。患者の残りは、３種の付加的な遺伝子：アポリポタンパク質（ａｐｏ）ＢをコードするＡＰＯＢ（ＭＩＭ １０７７３０）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン・ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）をコードするＰＣＳＫ９（ＭＩＭ ６０７７８６）及びＬＤＬＲアダプタータンパク質１をコードするＬＤＬＲＡＰ１（ＭＩＭ ６９５７４７）に突然変異を有する。後者は劣性の形質と関連する唯一の遺伝子突然変異である。ホモ接合性は、通常、同一遺伝子の２個の対立遺伝子中の突然変異の存在が与える；しかしながら、二重ヘテロ接合性（２個の異なる遺伝子中に各１個の２個のヘテロ接合性突然変異）を罹患している患者の症例を報告している。ヘテロ接合性ＦＨについての５００人中１人と２００人中１人の間の罹患率（非特許文献２、非特許文献３）に基づけば、世界中で７，０００と４３，０００の間の人々がホモ接合性ＦＨ（ＨｏＦＨ）を有すると推定する。

変異体ＬＤＬＲ対立遺伝子の特徴付けは、欠失、挿入、ミスセンス突然変異及びナンセンス突然変異を含む多様な突然変異を明らかにした（非特許文献１）。１７００を超えるＬＤＬＲ突然変異を報告している。この遺伝子型不均一性は４個の一般的群に分類される前記受容体の生化学的機能のさまざまの結果につながる。クラス１突然変異は検出可能なタンパク質を伴わず、しばしば遺伝子欠失が引き起こす。クラス２突然変異は前記タンパク質の細胞内プロセシングの異常につながる。クラス３突然変異はリガンドＬＤＬ結合に特異的に影響を及ぼし、クラス４突然変異は被覆ピット中でクラスター形成しない受容体タンパク質をコードする。また、患者の培養線維芽細胞を使用して評価する残余のＬＤＬＲ活性に基づき、突然変異は、受容体陰性（ＬＤＬＲの残余の活性２％未満）又は受容体欠損（２〜２５％の残余の活性）とも分類する。受容体欠損である患者は平均してＬＤＬ−Ｃがより低レベルでより低悪性度の心血管系の経過を有する。

ＬＤＬ受容体機能低下の結果として、ＨｏＦＨを罹患している患者における未処置総血漿コレステロールレベルは、典型的に５００ｍｇ／ｄｌより高く、２０歳より前の心血管系疾患（ＣＶＤ）及び３０歳より前の死亡にしばしば至る早期の攻撃的な（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ａｎｄ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）粥状動脈硬化をもたらす（非特許文献４、非特許文献１）。従って、これら患者のための積極的処置の早期開始が不可欠である（非特許文献５）。利用可能な選択肢は限られる。スタチン類が薬理学的処置の第一選択と考える。最大用量においてさえ、ＬＤＬ−Ｃ血漿レベルのわずか１０〜２５％低下をほとんどの患者で観察する（非特許文献６；非特許文献７）。スタチン療法へのコレステロール吸収阻害剤エゼチミブの追加はＬＤＬ−Ｃレベルのさらなる１０〜２０％低下をもたらす場合
がある（非特許文献８）。胆汁酸捕捉剤、ナイアシン、フィブラート系薬剤及びプロブコールを含む他のコレステロール降下薬の使用をスタチン以前の時代に成功裏に使用しており、ＨｏＦＨにおけるさらなるＬＤＬ−Ｃ低下を達成するために考慮する場合がある；しかしながらそれらの使用を忍容性及び薬物の利用可能性が制限する。このアプローチはＣＶＤ及び総死亡率を低下することを示している（非特許文献９）。積極的な多剤療法アプローチの実施にもかかわらず、ＨｏＦＨ患者のＬＤＬ−Ｃレベルは上昇したままであり、彼らの平均余命はおよそ３２年のままである（非特許文献９）。いくつかの非薬理学的選択肢もまた長年にわたり試験している。門脈下大静脈吻合術（非特許文献１０；非特許文献１１）及び回腸バイパス（非特許文献１２）のような外科的介入は、部分的及び一時的ＬＤＬ−Ｃ低下をもたらすのみであり、並びに実行不可能なアプローチと現在考えている。局所性肝移植はＨｏＦＨ患者においてＬＤＬ−Ｃレベルを実質的に低下させることが示されている（非特許文献１３；非特許文献１４）が、しかし、移植後の手術合併症及び死亡の高い危険性、ドナーの希少性並びに免疫抑制療法を用いる生涯の処置の必要性（非特許文献１５；非特許文献１６）を含む欠点及び危険性がこのアプローチの使用を制限する。ＨｏＦＨにおける現在の標準治療は、リポ蛋白アフェレーシス、すなわちＬＤＬ−Ｃを５０％超一時的に低下させる場合があるＬＤＬ−Ｃを血漿から追い出す物理的方法を含む（非特許文献１７；非特許文献１８）。処置セッション後の血漿中のＬＤＬ−Ｃの急速な再蓄積（非特許文献１９）が週１回又は２週に１回のアフェレーシスを必要とする。この処置は粥状動脈硬化の発症を遅らせる場合がある（非特許文献２０；非特許文献１８）とはいえ、それは労力を要し、高価であり及び容易に利用可能ではない。さらに、それは一般に良好に耐えられる処置であるとはいえ、それが頻繁な反復及び静脈内到達を必要とするという事実が多くのＨｏＦＨ患者にとって大変な場合がある。

最近、３種の新薬をＨｏＦＨのためのアドオン療法と特定してＦＤＡが承認した。それらのうちの２種、すなわちロミタピド及びミポメルセンは、ａｐｏＢを含むリポタンパク質の集成及び分泌を阻害するとはいえ、それらは異なる分子機序を介して前記集成及び分泌を阻害する（非特許文献２１；、非特許文献２２）。このアプローチは、ロミタピドで平均約５０％（非特許文献２３）及びミポメルセンで約２５％（非特許文献２４）に達するＬＤＬ−Ｃの有意な低下をもたらす。しかしながら、それらの使用は、忍容性及び長期のアドヒアランスに影響を及ぼす場合があり並びにその長期の結果がまだ完全には解明していない肝脂肪蓄積を含む、多彩な有害事象を伴う。

第三は、新規分類の脂質降下薬の一部、すなわちヘテロ接合性ＦＨを罹患している患者において見かけ上好都合な安全性プロファイルを伴いＬＤＬ−Ｃレベルの低下において有効であることを示している（非特許文献２５、非特許文献２６；非特許文献２７）プロタンパク質転換酵素サブチリシン・ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）に対するモノクローナル抗体である。４週ごとに１２週間のＰＣＳＫ９阻害剤エボロクマブ４２０ｍｇを用いるＨｏＦＨの処置は、プラセボと比較してＬＤＬ−Ｃの約３０％低下を提供することを示している（非特許文献２６）。しかしながらＰＣＳＫ９阻害剤の有効性は残余のＬＤＬＲ活性に依存し、残余のＬＤＬＲ活性を伴わない患者において効果がない（非特許文献２６、非特許文献２７）。ＰＣＳＫ９阻害剤の追加がＦＨの標準治療となる場合があり、また、ＨｏＦＨ患者の１サブセットにおいてより低い高コレステロール血症への追加のさらなる低下を提供する場合があるとはいえ、それらはこの状態の臨床的対応に劇的に影響しない場合がある。

従って、ＨｏＦＨのための新たな医学療法に対し、満たされていない医学的ニーズが存続する。

Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら Ｆａｍｉｌｉａｌ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ、Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｃ．Ｒ．Ｓｃｒｉｖｅｒら編者。２００１、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ：ニューヨーク中。ｐ．２８６３−２９１３（２００１） Ｎｏｒｄｅｓｔｇａａｒｄら Ｅｕｒ Ｈｅａｒｔ Ｊ、２０１３．３４（４５）：ｐ．３４７８−９０ａ（２０１３） Ｓｊｏｕｋｅら Ｅｕｒ Ｈｅａｒｔ Ｊ、（２０１４） Ｃｕｃｈｅｌら Ｅｕｒ Ｈｅａｒｔ Ｊ、２０１４．３５（３２）：ｐ．２１４６−２１５７（２０１４） Ｋｏｌａｎｓｋｙら ２００８ Ｍａｒａｉｓら Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、２００８．１９７（１）：ｐ．４００−６（２００８） Ｒａａｌら Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、２０００．１５０（２）：ｐ．４２１−８（２０００） Ｇａｇｎｅら Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００２．１０５（２１）：ｐ．２４６９−２４７５（２００２） Ｒａａｌら Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２０１１．１２４（２０）：ｐ．２２０２−７ Ｂｉｌｈｅｉｍｅｒ Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、１９８９．９（１ Ｓｕｐｐｌ）：ｐ．Ｉ１５８−Ｉ１６３（１９８９） Ｆｏｒｍａｎら Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、１９８２．４１（２−３）：ｐ．３４９−３６１（１９８２） Ｄｅｃｋｅｌｂａｕｍら Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９７７；２９６：４６５−４７０ １９７７．２９６（９）：ｐ．４６５−４７０（１９７７） Ｉｂｒａｈｉｍら Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ、２０１２．５（３）：ｐ．３５１−８（２０１２） Ｋｕｃｕｋｋａｒｔａｌｌａｒら ２ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２０１１．１５（３）：ｐ．２８１−４（２０１１） Ｍａｌａｔａｃｋ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２０１１．１５（２）：ｐ．１２３−５（２０１１） Ｓｔａｒｚｌら Ｌａｎｃｅｔ、１９８４．１（８３９１）：ｐ．１３８２−１３８３（１９８４） Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、２００３．１６７（１）：ｐ．１−１３（２００３） Ｖｅｌｌａら Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ Ｐｒｏｃ、２００１．７６（１０）：ｐ．１０３９−４６（２００１） ＥｄｅｒとＲａｄｅｒ Ｔｏｄａｙ’ｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔｒｅｎｄｓ、１９９６．１４：ｐ．１６５−１７９（１９９６） Ｔｈｏｍｐｓｏｎら Ｌａｎｃｅｔ、１９９５．３４５：ｐ．８１１−８１６ Ｃｕｃｈｅｌら Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、２００７．３５６（２）：ｐ．１４８−１５６（２００７） Ｒａａｌら Ｌａｎｃｅｔ、２０１０．３７５（９７１９）：ｐ．９９８−１００６（２０１０） Ｃｕｃｈｅｌら ２０１３ Ｒａｌｌら ２０１０ Ｒａａｌら Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２０１２．１２６（２０）：ｐ．２４０８−１７（２０１２） Ｒａａｌら Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ、２０１５．３８５（９９６５）：ｐ．３４１−３５０（２０１５） Ｓｔｅｉｎら Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２０１３．１２８（１９）：ｐ．２１１３−２０（２０１２）

３．発明の要約
本発明は、ＨｏＦＨと診断された患者（ヒト被験者）の肝細胞にヒト低比重リポタンパク質受容体（ｈＬＤＬＲ）遺伝子を送達するための、複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用に関する。ＬＤＬＲ遺伝子を送達するために使用する組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）（「ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲ」）は肝に対する指向性を有するべきであり（例えばＡＡＶ８キャプシドを担持するｒＡＡＶ）、ｈＬＤＬＲトランスジーンは肝特異的発現調節エレメントにより制御するべきである。かかるｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲベクターは、肝中の治療的レベルのＬＤＬＲ発現を達成するために、２０ないし３０分の期間にわたる静脈内（ＩＶ）注入により投与する場合がある。ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲの治療上有効な用量は２．５×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇ患者体重から７．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ患者体重までの範囲にわたる。好ましい一態様において、ｒＡＡＶ懸濁液は、ＨｏＦＨの二重ノックアウトＬＤＬＲ−／−Ａｐｏｂｅｃ−／−マウスモデル（ＤＫＯマウス）に投与する５×１０^１１ＧＣ／ｋｇの用量がＤＫＯマウスにおけるベースラインコレステロールレベルを２５％ないし７５％低下するような効力を有する。

前記処置の目標は、この疾患を処置し及び現在の脂質降下処置に対する応答を改良するための実現可能なアプローチとしてのｒＡＡＶに基づく肝に向ける遺伝子治療を介して患者の欠損しているＬＤＬＲを機能的に置換することである。本発明は、部分的に、有効用量の安全な送達を可能にする治療組成物及び方法；並びにヒト被験者における有効な投与のための精製製造要件を満たすための改良した製造方法の開発に基づく。

治療の有効性は、患者におけるヒトＬＤＬＲトランスジーン発現についての代理バイオマーカーとしての血漿ＬＤＬ−Ｃレベルを使用して、処置後例えば投与後に評価する場合がある。例えば、遺伝子治療処置後の患者の血漿ＬＤＬ−Ｃレベルの低下は機能的ＬＤＬＲの成功裏の形質導入を示すとみられる。追加的に、又は、代替策として、監視することが可能である他のパラメータは、ベースラインと比較した総コレステロール（ＴＣ）、非高比重リポ蛋白コレステロール（ｎｏｎ−ＨＤＬ−Ｃ）、ＨＤＬ−Ｃ、空腹時トリグリセリド（ＴＧ）、超低比重リポタンパク質コレステロール（ＶＬＤＬ−Ｃ）、リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））、アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）及びアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ａｐｏＡ−Ｉ）ならびに、ベクター前及びベクター投与後のＬＤＬ動態研究（代謝機序評価）、又はそれらの組合せの変化を測定することを含むが、これらに限らない。

一部の態様では、治療の有効性は、患者に必要なアフェレーシスの頻度の減少によって測定される場合がある。一部の態様では、ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲ処置後、患者はアフェレーシスの必要性が２５％、５０％又はそれ以上減少する場合がある。例えば、ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲ処置前に毎週アフェレーシスを受けていた患者が隔週又は毎月のアフェレーシスしか必要でなくなる場合があり、他の態様では、さらに低い頻度のアフェレーシスしか必要でない場合や、あるいは、必要性がまったくなくなる場合がある。

一部の態様では、治療の有効性は、必要とするＰＣＳＫ９阻害剤の用量の低下か、ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲ処置後後の患者でのかかる治療の必要性が無くなることによって測定される場合がある。一部の態様では、治療の有効性は、必要とするスタチン又は胆汁酸捕捉剤の用量の低下で測定される。

一部の態様では、免疫抑制剤の同時療法が用いられる。例えばＡＡＶ８に対する望ましくない程高い中和抗体レベルが検出される場合には、ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲの送達前にか
かる免疫抑制剤の同時療法が開始される場合がある。一部の態様では、予防策として、同時療法がｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲの送達前に開始される場合もある。一部の態様では、例えば、望ましくない免疫応答が治療後に観察される場合に、免疫抑制剤の同時療法は、ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲの送達後に開始される。

かかる同時療法のための免疫抑制剤は、グルココルチコイドと、ステロイド類と、代謝拮抗薬と、Ｔ細胞阻害剤と、（例えばラパマイシン又はラパログのような）マクロライドと、アルキル化剤、代謝拮抗薬、細胞毒性抗生物質、抗体、又は、イムノフィリンに活性のある薬剤を含む細胞増殖抑制剤とを含むが、これらに限定されない。免疫抑制剤は、ナイトロジェン・マスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）又はＣＤ３に向けられた抗体、抗ＩＬ−２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、オピオイド、又は、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−アルファ）結合剤を含む場合がある。一部の態様では、免疫抑制療法は、遺伝子治療の投与前０、１、２、７日又はそれ以前か、遺伝子治療の投与後０、１、２、３、７日又はそれ以後かに開始される場合がある。かかる治療は、２種類又は３種類以上の薬剤（例えば、プレドニゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／又はシロリムス（すなわちラパマイシン））の同日投与を含む場合がある。これらの薬剤の１つ又は２つ以上は、同一の用量又は調整された用量で、遺伝子治療の投与後に継続される場合がある。かかる治療は、約１週間（７日間）、約６０日又はそれ以上長い期間必要に応じて継続される場合がある。一部の態様では、タクロリムスを含まない投与計画が選択される。

処置の候補である患者は、好ましくは、ＬＤＬＲ遺伝子中に２個の突然変異を有するＨｏＦＨと診断された成人（１８歳以上の男性又は女性）；すなわち、ＨｏＦＨと矛盾しない臨床像の状況で双方の対立遺伝子に分子的に定義されたＬＤＬＲ突然変異を有する患者であり、該ＨｏＦＨは、未処置ＬＤＬ−Ｃレベル例えば３００ｍｇ／ｄｌ超のＬＤＬ−Ｃレベル、処置ＬＤＬ−Ｃレベル例えば３００ｍｇ／ｄｌ未満のＬＤＬ−Ｃレベル及び／又は５００ｍｇ／ｄｌより高い総血漿コレステロールレベル、並びに早期の攻撃的な粥状動脈硬化を含む場合がある。処置の候補は、スタチン類、エゼチミブ、胆汁酸捕捉剤、ＰＳＣＫ９阻害剤のような脂質降下薬並びにＬＤＬ及び／又は血漿アフェレーシスを用いる処置を受けているＨｏＦＨ患者を含む。

処置前に、ＨｏＦＨ患者を、ｈＬＤＬＲ遺伝子を送達するために使用するＡＡＶ血清型に対する中和抗体（ＮＡｂ）について評価すべきである。こうしたＮＡｂは形質導入効率を妨害し及び治療的有効性を低下する場合がある。１：１０以下のベースライン血清ＮＡｂ力価を有するＨｏＦＨ患者がｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲ遺伝子治療プロトコルを用いる処置の良好な候補である。しかし、他のベースラインレベルの患者が選択される場合がある。１：５超の血清ＮＡｂの力価を伴うＨｏＦＨ患者の処置は、ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲベクター送達を用いる処置前及び／又は中の免疫抑制剤での一過性の同時処置のような併用療法を必要とする場合がある。又は追加的に、又は、代替策として、患者を肝酵素上昇について監視し、該肝酵素上昇は一過性の免疫抑制療法で処置する場合がある（例えばベースラインレベルの最低約２倍のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）又はアラニントランスアミラーゼ（ＡＬＴ）を観察する場合）。こうした同時療法のための免疫抑制剤は、ステロイド、代謝拮抗薬、Ｔ細胞阻害剤及びアルキル化薬を含むが、これらに限らない。

本発明は、ヒト被験者のＡＡＶ８．ＬＤＬＲ処置のプロトコル（第６節、実施例１）と、疾患の動物モデルにおける処置の有効性を示す前臨床動物データ（第７節、実施例２）と、治療的ＡＡＶ．ｈＬＤＬＲ組成物の製造及び製剤（第８．１ないし８．３節、実施例
３）と、ＡＡＶベクターの特徴付け方法（第８．４節、実施例３）とを説明する実施例によって具体的に説明される。

３．１ 定義
本明細書で使用する「ＡＡＶ８キャプシド」は、本明細書に引用により取り込まれ、配列番号５に再現されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション：ＹＰ＿０７７１８０のコードするアミノ酸配列を有するＡＡＶ８キャプシドを指す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション：ＹＰ＿０７７１８０；米国特許第７，２８２，１９９号明細書、同第７，７９０，４４９号明細書；同第８，３１９，４８０号明細書；同第８，９６２，３３０号明細書；第ＵＳ ８，９６２，３３２号明細書中の参照アミノ酸配列に対する約９９％の同一性、（すなわち参照配列から約１％未満の変動）を有する配列を含む場合がある、このコードする配列からの若干の変動が本発明に含まれる。別の態様において、ＡＡＶ８キャプシドは、第ＷＯ２０１４／１２４２８２号明細書（本明細書に引用することにより取り込まれる）に説明するＡＡＶ８バリアントのＶＰ１配列か、第ＵＳ ２０１３／００５９７３２Ａ１号明細書又は米国特許第７５８８７７２号明細書（本明細書に引用することにより取り込まれる）に説明するｄｊ配列かを有する場合がある。キャプシド、そのためのコーディング配列の生成方法、及びｒＡＡＶウイルスベクターの製造方法は説明されている。例えばＧａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０）、６０８１−６０８６（２００３）、第ＵＳ ２０１３／００４５１８６Ａ１号明細書及び第ＷＯ ２０１４／１２４２８２号明細書を参照されたい。

本明細書で使用する「ＮＡｂ力価」という用語は、その標的とするエピトープ（例えばＡＡＶ）の生理学的影響を中和する中和抗体（例えば抗ＡＡＶ ＮＡｂ）がどのくらい多く産生するかの程度を指す。抗ＡＡＶ ＮＡｂ力価は、例えばＣａｌｃｅｄｏ，Ｒ．ら、Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００９．１９９（３）：ｐ．３８１−３９０（本明細書に引用することにより取り込まれる）に説明するとおり測定する場合がある。

アミノ酸配列の文脈における「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」又は「同一のパーセント」という用語は、対応のため整列される場合に同一である２本の配列中の残基を指す。同一性パーセントは、タンパク質の完全長、ポリペプチド、約３２個のアミノ酸、約３３０個のアミノ酸若しくはそのペプチドフラグメントにわたるアミノ酸配列、又は対応する核酸配列コーディング配列について容易に決定される場合がある。適切なアミノ酸フラグメントは長さが最低約８個のアミノ酸である場合があり、約７００個のアミノ酸までである場合がある。一般に、２本の異なる配列間の「同一性」、「相同性」又は「類似性」を指す場合、「同一性」、「相同性」又は「類似性」は「整列された」配列に関して決定される。「整列された」配列又は「アライメント」は、参照配列と比較して欠落又は追加された塩基又はアミノ酸についての補正をしばしば含む、複数の核酸配列又はタンパク質（アミノ酸）配列を指す。アライメントは、公的に又は商業的に利用可能な多様な複数配列アライメントプログラム（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）のいずれかを使用して実施する。配列アライメントプログラム、例えば「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」及び「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」プログラムがアミノ酸配列に利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれもデフォルトの設定で使用されるとはいえ、当業者はこれらの設定を必要に応じて変える場合がある。あるいは、当業者は、参照するアルゴリズム及びプログラムにより提供されるもののような同一性又はアライメントのレベルを少なくとも提供する別のアルゴリズム又はコンピュータープログラムを利用する場合がある。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎら
、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”、２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照されたい。

本明細書で使用する「作動可能に連結する」という用語は、目的の遺伝子と隣接する発現制御配列及び目的の遺伝子を制御するためにトランスで又は遠位で作用する発現制御配列の双方を指す。

「複製欠損ウイルス」又は「ウイルスベクター」は、目的の遺伝子を含む発現カセットをウイルスキャプシド又はエンベロープ中にパッケージングしている合成又は人工ウイルス粒子を指し、ここでウイルスキャプシド又はエンベロープ内にもまたパッケージングされているいかなるウイルスゲノム配列も複製欠損であり；すなわち、それらは子孫ビリオンを生成しない場合があるがしかし標的細胞を感染させる能力を保持する。一態様において、ウイルスベクターのゲノムは複製するために必要とする酵素をコードする遺伝子を含まない（前記ゲノムは「腹なし（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作される場合がある−人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とするシグナルに挟まれている目的のトランスジーンのみを含む）が、これら遺伝子は製造中に供給される場合がある。従って、それは遺伝子治療における使用に安全と判断される。子孫ビリオンによる複製及び感染が、複製のため必要とするウイルス酵素の存在下を除き起こらない場合があるためである。

「ある（ａ）」又は「ある（ａｎ）」という用語は１つ以上を指すことに注目するべきである。であるから、「ある（ａ）」（又は「ある（ａｎ）」）、「１つ又はそれ以上」及び「最低１つ」という用語を本明細書で互換性に使用する。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（こと）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、排他的というよりはむしろ包括的に解釈するべきである。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という語及びその変形は、包括的というよりはむしろ排他的に解釈するべきである。本明細書の多様な態様が「含む」という文言を使用して提示される一方、他の状況下で、関連する一態様は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という文言を使用して解釈及び説明することもまた意図されている。

本明細書で使用する「約」という用語は、別の方法で明記しない限り、所定の参照からの１０％の変動を意味している。

本明細書で別の方法で定義しない限り、本明細書で使用する技術および科学用語は、当業者により、及び本出願で使用する用語の多くに対する一般的指針を当業者に提供する公表されたテキストへの参照により普遍的に理解すると同一の意味を有する。

４．図面の簡単な説明
サル肝中のＥＧＦＰ発現レベルに対する既存のＡＡＶ８ ＮＡｂの影響。多様な種類及び年齢のサルに３×１０^１２ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＥＧＦＰが末梢静脈を介して注入され、７日後に屠殺し、肝細胞形質導入についていくつかの方法で分析した。図１Ａ−１Ｅは、ＡＡＶ８に対する多様なレベルの既存の中和抗体（それぞれ＜１：５、１：５、１：１０及び１：２０）を伴う動物からの肝の代表的切片を示す顕微鏡写真である。図１Ｆは肝細胞の形質導入パーセントに基づく形質導入効率の定量的形態計測分析を示す。図１Ｇは相対的ＥＧＦＰ強度に基づく形質導入効率の定量的形態計測分析を示す。図１ＨはＥＬＩＳＡによる肝ライセート中のＥＧＦＰタンパク質の定量を示す。成体カニクイザル（ｎ＝カニクイザル８匹、黒丸）、成体アカゲザル（ｎ＝アカゲザル８匹、白丸）、若齢アカゲザル（ｎ＝アカゲザル５匹、白正方形）。 ＤＫＯマウスにおけるｍＬＤＬＲの長期発現。ＤＫＯマウスに１０^１１ＧＣ／マウス（５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲ（ｎ＝マウス１０匹）又はＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｎＬａｃＺ（ｎ＝マウス１０匹）を投与した。血清中のコレステロールレベルを定期的に監視した。２群間の統計学的に有意の差違は早ければ第７日に認められ（ｐ＜０．００１）、実験の持続期間を通して存続していた。マウスをベクター投与後第１８０日に屠殺した。 ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲ後のＤＫＯマウスにおける粥状動脈硬化の退縮。図３Ａは正面ズダンＩＶ染色された３枚のパネルの一組である。マウス大動脈を固定し、中性脂質を染色するズダンＩＶで染色した。ベクター投与後第６０日（高脂肪食給餌第１２０日）の１０^１１ＧＣ／マウスのＡＡＶ８．ｎＬａｃＺ（５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）で処置した動物からの代表的大動脈（中）、１０^１１ＧＣ／マウスのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲ（５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）で処置した動物からの代表的大動脈（右）又はベースライン（高脂肪食給餌第６０日）（左）の動物からの代表的大動脈を示す。 ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲ後のＤＫＯマウスにおける粥状動脈硬化の退縮。図３Ｂは、形態計測分析の結果が大動脈の長さ全体に沿ってオイルレッドＯで染色した大動脈のパーセントを定量化したことを示す棒グラフである。 ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲ後のＤＫＯマウスにおける粥状動脈硬化の退縮。図３Ｃ−３Ｋは、これらのマウスからの大動脈基部がオイルレッドＯで染色したことを示す。 ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲ後のＤＫＯマウスにおける粥状動脈硬化の退縮。図３Ｌは、ベースライン（ｎ＝マウス１０匹）、ＡＡＶ．ＴＢＧ．ｎＬａｃＺ（ｎ＝マウス９匹）及びＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲ（ｎ＝マウス１０匹）における総大動脈表面のズダンＩＶ染色パーセントを測定したことを示す棒グラフである。定量はオイルレッドＯ病変上で実施した。粥状動脈硬化病変面積データを一元配置ＡＮＯＶＡにかけた。実験群はデュネット検定を使用することによりベースライン群と比較した。反復測定ＡＮＯＶＡを使用して、遺伝子導入後の時間にわたるマウスの多様な群間のコレステロールレベルを比較した。全部の比較についての統計学的有意性をＰ、０．０５で判定した。グラフは平均ＳＤ値を表す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、‡ｐ＜０．００１。 試験又は対照薬剤注入したＤＫＯマウスにおけるコレステロールレベル。ＤＫＯマウスに、７．５×１０^１１ＧＣ／ｋｇ、７．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ若しくは６．０×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲ又は６．０×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲ或いはベヒクル対照（１００μｌのＰＢＳ）を静脈内（ＩＶ）注入した。コレステロールレベルは平均±ＳＥＭとして表す。各群は、同一剖検時点からのＰＢＳ対照に対して血清コレステロールが統計学的に有意な低下を示した。 試験薬剤注入したＤＫＯマウスにおけるコレステロールレベル。図５Ａは第０日、第７日及び第３０日に測定した変動する用量のベクターで処置したマウスにおけるコレステロールレベル（ｍｇ／ｍＬ）を示す。値は平均±ＳＥＭとして表す。Ｐ＜０．０５。 ベクター注入したアカゲザルにおける末梢Ｔ細胞応答。提示するデータはサル１９４９８（図６Ａ）、０９０−０２８７（図６Ｂ）及び０９０−０２６３（図６Ｃ）についてのＴ細胞応答及びＡＳＴレベルの時間経過を示す。各試験日について、百万ＰＢＭＣあたりスポット形成単位（ＳＦＵ）として測定する刺激なし、ＡＡＶ８、及びｈＬＤＬＲに対するＴ細胞応答を、各図中の左から右へプロットした。サル１９４９８及び０９０−０２８７はｈＬＤＬＲトランスジーンに対する陽性の末梢Ｔ細胞応答及び／又はを発生した一方、０９０−０２６３はしなかった。^＊はバックグラウンドの有意に上であった陽性のキャプシド応答を示す。 ベクター注入したアカゲザルにおける末梢Ｔ細胞応答。提示するデータはサル１９４９８（図６Ａ）、０９０−０２８７（図６Ｂ）及び０９０−０２６３（図６Ｃ）についてのＴ細胞応答及びＡＳＴレベルの時間経過を示す。各試験日について、百万ＰＢＭＣあたりスポット形成単位（ＳＦＵ）として測定する刺激なし、ＡＡＶ８、及びｈＬＤＬＲに対するＴ細胞応答を、各図中の左から右へプロットした。サル１９４９８及び０９０−０２８７はｈＬＤＬＲトランスジーンに対する陽性の末梢Ｔ細胞応答及び／又はを発生した一方、０９０−０２６３はしなかった。^＊はバックグラウンドの有意に上であった陽性のキャプシド応答を示す。 ベクター注入したアカゲザルにおける末梢Ｔ細胞応答。提示するデータはサル１９４９８（図６Ａ）、０９０−０２８７（図６Ｂ）及び０９０−０２６３（図６Ｃ）についてのＴ細胞応答及びＡＳＴレベルの時間経過を示す。各試験日について、百万ＰＢＭＣあたりスポット形成単位（ＳＦＵ）として測定する刺激なし、ＡＡＶ８、及びｈＬＤＬＲに対するＴ細胞応答を、各図中の左から右へプロットした。サル１９４９８及び０９０−０２８７はｈＬＤＬＲトランスジーンに対する陽性の末梢Ｔ細胞応答及び／又はを発生した一方、０９０−０２６３はしなかった。^＊はバックグラウンドの有意に上であった陽性のキャプシド応答を示す。 ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲベクターの概念図。 ＡＡＶシスプラスミド構築物。Ａ）肝特異的ＴＢＧプロモーター、及びＡＡＶ２ ＩＴＲエレメントが隣接するキメライントロンを含む父シスクローニングプラスミドｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＴＢＧ．ＰＩの直線的表示。Ｂ）ヒトＬＤＬＲ ｃＤＮＡがイントロンとポリＡシグナルの間でｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＴＢＧ．ＰＩ中にクローン化し及びアンピシリン耐性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子により置換したヒトＬＤＬＲシスプラスミドｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＬＤＬＲ．ＲＢＧ．ＫａｎＲの直線的表示。 ＡＡＶトランスプラスミド。図９Ａはアンピシリン耐性遺伝子を伴うＡＡＶ８トランスパッケージングプラスミドｐ５Ｅ１８−ＶＤ２／８の直線的表示である。図９Ｂはカナマイシン耐性遺伝子を伴うＡＡＶ８トランスパッケージングプラスミドｐＡＡＶ２／８の直線的表示である。 アデノウイルスヘルパープラスミド。図１０Ａは、親プラスミドｐＢＨＧ１０から、中間体ｐＡｄΔＦ１及びｐＡｄΔＦ５を通して、ａｄヘルパープラスミドｐＡｄΔＦ６の派生を具体的に説明する。図１０Ｂは、ｐＡｄΔＦ６中のアンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子により置換して作成されたｐＡｄΔＦ６（Ｋａｎ）の直線的表示である。 ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲベクター製造工程を示す流れ図（１）。 ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲベクター製造工程を示す流れ図（２）。

５．発明の詳細な説明
複製欠損ｒＡＡＶを、ＨｏＦＨと診断された患者（ヒト被験者）の肝細胞にｈＬＤＬＲ遺伝子を送達するために使用する。前記ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲベクターは肝に対する指向性を有すべきであり（例えばＡＡＶ８キャプシドを担持するｒＡＡＶ）、ｈＬＤＬＲトランスジーンは肝特異的発現調節エレメントにより制御すべきである。

かかるｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲベクターは、肝における治療的レベルのＬＤＬＲ発現を達成するため約２０分ないし約３０分の期間にわたる静脈内（ＩＶ）注入により投与する場合がある。他の態様において、より短い（例えば１０分ないし２０分）又はより長い（例えば３０分ないし６０分、その時間内の時間、例えば約４５分以上）を選択する場合がある。ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲの治療上有効な用量は最低約２．５×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇ患者体重から７．５×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇ患者体重までの範囲にわたる。好ましい一態様において、ｒＡＡＶ懸濁液は、ＨｏＦＨの二重ノックアウトＬＤＬＲ−／−Ａｐｏｂｅｃ−／−マウスモデル（ＤＫＯマウス）に投与する５×１０^１１ＧＣ／ｋｇという用量がＤＫＯマウスにおけるベースラインコレステロールレベルを２５％ないし７５％低下させるような効力を有する。処置の有効性は、トランスジーン発
現の代替エンドポイントとして低比重リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベルを使用して評価する場合がある。主要有効性評価は処置後１ないし３か月（例えば第１２週）でのＬＤＬ−Ｃレベルを含み、効果の持続をその後最低約１年（約５２週）追跡する。トランスジーン発現の長期の安全性及び持続性を処置後に測定する場合がある。

一部の態様では、治療の有効性は、患者に必要なアフェレーシスの頻度の減少によって測定される場合がある。一部の態様では、ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲ処置後、患者はアフェレーシスの必要性が２５％、５０％又はそれ以上減少する場合がある。例えば、ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲ処置前に毎週アフェレーシスを受けていた患者が隔週又は毎月のアフェレーシスしか必要でなくなる場合があり、他の態様では、さらに低い頻度のアフェレーシスしか必要でない場合や、あるいは、必要性がまったくなくなる場合がある。

一部の態様では、治療の有効性は、必要とするＰＣＳＫ９阻害剤の用量の低下か、ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲ処置後後の患者でのかかる治療の必要性が無くなることによって測定される場合がある。一部の態様では、治療の有効性は、必要とするスタチン又は胆汁酸捕捉剤の用量の低下で測定される。

処置の候補である患者は、好ましくは、ＬＤＬＲ遺伝子中に２個の突然変異を有するＨｏＦＨと診断した成人（１８歳以上の男性又は女性）；すなわち、未処置ＬＤＬ−Ｃレベル例えば３００ｍｇ／ｄｌ超のＬＤＬ−Ｃレベル、処置ＬＤＬ−Ｃレベル例えば３００ｍｇ／ｄｌ未満のＬＤＬ−Ｃレベル及び／又は５００ｍｇ／ｄｌより高い総血漿コレステロールレベル、並びに早期の攻撃的な粥状動脈硬化を含む場合があるＨｏＦＨと矛盾しない臨床像の状況で双方の対立遺伝子に分子的に定義するＬＤＬＲ突然変異を有する患者である。処置の候補は、スタチン類、エゼチミブ、胆汁酸捕捉剤、ＰＳＣＫ９阻害剤のような脂質降下薬並びにＬＤＬ及び／又は血漿アフェレーシスを用いる処置を受けているＨｏＦＨ患者を含む。

処置前に、ＨｏＦＨ患者を、ｈＬＤＬＲ遺伝子を送達するために使用するＡＡＶ血清型に対する中和抗体（ＮＡｂ）について評価すべきである。こうしたＮＡｂは形質導入効率を妨害し治療的有効性を低下させる場合がある。１：１０以下のベースライン血清ＮＡｂ力価を有するＨｏＦＨ患者はｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲ遺伝子治療プロトコルを用いる処置の良好な候補である。１：５を超える血清ＮＡｂの力価をもつＨｏＦＨ患者の処置は、ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲを用いる処置前／中の免疫抑制剤での一過性の同時処置のような併用療法を必要とする場合があり、又は追加的に、又は、代替策として、患者を上昇した肝酵素について監視し、それらは一過性の免疫抑制療法で処置する場合がある（例えばベースラインレベルの最低約２倍のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）又はアラニントランスアミラーゼ（ＡＬＴ）を観察する場合）。

一部の態様では、免疫抑制剤の同時療法が用いられる。例えばＡＡＶ８に対する望ましくない程高い中和抗体レベルが検出される場合には、ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲの送達前にかかる免疫抑制剤の同時療法が開始される場合がある。一部の態様では、予防策として、同時療法がｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲの送達前に開始される場合もある。一部の態様では、例えば、望ましくない免疫応答が治療後に観察される場合に、免疫抑制剤の同時療法は、ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲの送達後に開始される。

かかる同時療法のための免疫抑制剤は、グルココルチコイドと、ステロイド類と、代謝拮抗薬と、Ｔ細胞阻害剤と、（例えばラパマイシン又はラパログのような）マクロライドと、アルキル化剤、代謝拮抗薬、細胞毒性抗生物質、抗体、又は、イムノフィリンに活性のある薬剤を含む細胞増殖抑制剤とを含むが、これらに限定されない。免疫抑制剤は、ナイトロジェン・マスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオ
プリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）又はＣＤ３に向けられた抗体、抗ＩＬ−２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、オピオイド、又は、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−アルファ）結合剤を含む場合がある。一部の態様では、免疫抑制療法は、遺伝子治療の投与前０、１、２、７日又はそれ以前か、遺伝子治療の投与後０、１、２、３、７日又はそれ以後かに開始される場合がある。かかる治療は、２種類又は３種類以上の薬剤（例えば、プレドニゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／又はシロリムス（すなわちラパマイシン））の同日投与を含む場合がある。これらの薬剤の１つ又は２つ以上は、同一の用量又は調整された用量で、遺伝子治療の投与後に継続される場合がある。かかる治療は、約１週間（７日間）、約６０日又はそれ以上長い期間必要に応じて継続される場合がある。一部の態様では、タクロリムスを含まない投与計画が選択される。

５．１ 遺伝子治療ベクター
ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲベクターは肝に対する指向性を有すべきであり（例えばＡＡＶ８キャプシドを担持するｒＡＡＶ）、及びｈＬＤＬＲトランスジーンは肝特異的発現調節エレメントにより制御すべきである。前記ベクターはヒト被験者中の注入に適切な緩衝液／担体中に配合する。前記緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが注入チューブに付着することを予防するがｉｎ ｖｉｖｏのｒＡＡＶの結合活性を妨害しない成分を含むべきである。

５．１．１．ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲベクター
肝向性をもつ多数のｒＡＡＶベクターのいずれも使用できる。ｒＡＡＶのキャプシドの供給源として選択できるＡＡＶの例は、例えば、ｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ｒｈ８［例えば米国公開特許出願第２００７−００３６７６０−Ａ１号明細書；米国公開特許出願第２００９−０１９７３３８−Ａ１号明細書；第ＥＰ １３１０５７１号明細書を参照されたい］を含む。第ＷＯ ２００３／０４２３９７号明細書（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号明細書及び米国特許第７２８２１９９号明細書（ＡＡＶ８）、第ＷＯ ２００５／０３３３２１号明細書並びに第ＵＳ
７，９０６，１１１号明細書（ＡＡＶ９）、第ＷＯ ２００６／１１０６８９号明細書及び第ＷＯ ２００３／０４２３９７号明細書（ｒｈ１０）、ＡＡＶ３Ｂ；第ＵＳ ２０１０／００４７１７４号明細書（ＡＡＶ−ＤＪ）もまた参照されたい。

ｈＬＤＬＲトランスジーンは、本明細書に引用することにより取り込まれる添付の配列表中に提供する配列番号１、配列番号２及び／又は配列番号４により提供される配列の１本又はそれ以上を含むが、これらに限らない。配列番号１を参照して、これら配列は、約塩基対１８８ないし約塩基対２５０に位置するシグナル配列を含み、バリアント１の成熟タンパク質は約塩基対２５１ないし約塩基対２７７０にわたる。配列番号１はエクソンもまた同定し、その最低１個はｈＬＤＬＲの既知の選択的スプライスバリアント中に存在しない。加えて、又は、場合によっては、他のｈＬＤＬＲアイソフォームの１つ又はそれ以上をコードする配列を選択する場合がある。例えば、それらの配列が例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０１１３０から入手可能であるアイソフォーム２、３、４、５及び６を参照されたい。例えば、共通のバリアントは配列番号１のエクソン４（ｂｐ（２５５）．．（３７７）又はエクソン１２（ｂｐ（１５４６）．．（１７７３））を欠く）。場合によっては、前記トランスジーンは異種シグナル配列を伴う成熟タンパク質のコーディング配列を含む場合がある。配列番号２はヒトＬＤＬＲのｃＤＮＡ及び翻訳したタンパク質（配列番号３）を提供する。配列番号４はヒトＬＤＬＲの改変されたｃＤＮＡを提供する。代替策として、又は、追加的に、ウェブに基づく又は商業的に入手可能なコンピュータープログラム、ならびにサービスに基づく会社（ｓｅｒｖｉｃｅ ｂａｓｅｄ ｃｏｍｐａｎｉｅｓ）を使用して、アミノ酸配列をＲＮＡ及び／又はｃＤＮＡ双方を含む核酸コーディング配列に戻し翻訳（ｂａｃｋ ｔｒａｎｓｌ
ａｔｅ）する場合がある。例えばＥＭＢＯＳＳによるｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／；Ｇｅｎｅ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ−／ｓｍｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）；ＥｘＰａｓｙ（ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）を参照されたい。

下記実施例に説明する特定の一態様において、遺伝子治療ベクターは、ｒＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲと称する、肝特異的プロモーター（チロキシン結合グロブリン、ＴＢＧ）の制御下にｈＬＤＬＲトランスジーンを発現するＡＡＶ８ベクターである（図６を参照されたい）。外的ＡＡＶベクター成分は、１：１：１８の比の６０コピーの３種のＡＡＶウイルスタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３からなる血清型８、Ｔ＝１の正二十面体キャプシドである。前記キャプシドは１本鎖ＤＮＡ ｒＡＡＶベクターゲノムを含む。

ｒＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲゲノムは、２個のＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）により隣接しているｈＬＤＬＲトランスジーンを含む。ｈＬＤＬＲトランスジーンは、エンハンサー、プロモーター、イントロン、ｈＬＤＬＲコーディング配列及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む。ＩＴＲはベクター製造中にゲノムの複製及びパッケージングを司る遺伝要素であり、ｒＡＡＶを生成するのに必要な唯一のウイルスシスエレメントである。ｈＬＤＬＲコーディング配列の発現は肝細胞特異的ＴＢＧプロモーターから駆動される。コピー２個のα１ミクログロブリン／ビクニンエンハンサーエレメントが、プロモーター活性を刺激するためにＴＢＧプロモーターの上流に配置される。キメライントロンが発現をさらに高めるために存在し、ウサギβグロビンポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを、ｈＬＤＬＲ ｍＲＮＡ転写物の終止を媒介するために含む。

本明細書に説明する具体的に説明するプラスミド及びベクターは肝特異的プロモーターチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）を使用する。あるいは、他の肝特異的プロモーターを使用する場合がある［例えば、Ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ、コールドスプリングハーバー、ｈｔｔｐ：／／ｒｕｌａｉ．ｓｃｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤ、α１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）；ヒトアルブミン Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５１２４ ３２（１９９７）、ｈｕｍＡｌｂ；及びＢ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、３：１００２ ９（１９９６）を参照されたい］。ＴＴＲミニマルエンハンサー／プロモーター、αアンチトリプシンプロモーター、ＬＳＰ（８４５ｎｔ）２５（イントロンなしｓｃＡＡＶを必要とする）。あまり望ましくないとはいえ、ウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節可能なプロモーター［例えば第ＷＯ ２０１１／１２６８０８号明細書及び第ＷＯ ２０１３／０４９４３号明細書を参照されたい］、又は生理学的合図に応答性のプロモーターのような他のプロモーターを、本明細書に説明するベクター中で利用する場合がある。

プロモーターに加え、発現カセット及び／又はベクターは、他の適切な転写開始、終止、エンハンサー配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのような効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわちコサックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；並びに所望の場合はコードする産物の分泌を高める配列を含む場合がある。適切なポリＡ配列の例は、例えばＳＶ４０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）及びＴＫポリＡを含む。適切なエンハンサーの例は、例えば、とりわけ、αフェトプロテインエンハンサー、ＴＴＲミニマルプロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／α１ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）を含む。

これら制御配列はｈＬＤＬＲ遺伝子配列に「作動可能に連結して」いる。

発現カセットはウイルスベクターの産生に使用するプラスミド上で操作される場合がある。発現カセットをＡＡＶウイルス粒子中にパッケージングするのに必要とする最小配列はＡＡＶの５’及び３’ＩＴＲであり、それらはキャプシドと同一ＡＡＶ起源のものか、又は（ＡＡＶシュードタイプを産生するため）異なるＡＡＶ起源のものの場合がある。一態様において、ＡＡＶ２からのＩＴＲ配列又はその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）を便宜的上及び規制承認の時期を早めるために使用する。しかしながら他のＡＡＶ供給源からのＩＴＲを選択する場合がある。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２からであり、かつ、ＡＡＶキャプシドが別のＡＡＶ供給源からである場合、生じるベクターはシュードタイピングしていると呼ぶ場合がある。典型的に、ＡＡＶベクターのための発現カセットは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、ｈＬＤＬＲコーディング配列及びいずれかの制御配列、並びにＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。しかしながらこれら要素の他の構成が適切な場合がある。Ｄ配列及び末端解離部位（ｔｒｓ）が欠失しているΔＩＴＲと称する短縮バージョンの５’ＩＴＲが説明されている。他の態様において、完全長のＡＡＶ ５’及び３’ＩＴＲを使用する。

「ｓｃ」という略語は自己相補性を指す。「自己相補性ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列により運搬されるコーディング領域が分子内２本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するよう設計された発現カセットを有するプラスミド又はベクターを指す。感染に際して、細胞が媒介する第２鎖の合成を待つよりむしろ、ｓｃＡＡＶの２本の相補性の半分が会合して、即座に複製及び転写する準備ができている１本の２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成する場合がある。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙら、“Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ） ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、（Ａｕｇｕｓｔ ２００１）、Ｖｏｌ ８、Ｎｕｍｂｅｒ １６、１２４８−１２５４ページを参照されたい。自己相補性ＡＡＶは、例えば米国特許第６，５９６，５３５号明細書；同第７，１２５，７１７号明細書及び同第７，４５６，６８３号明細書（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用により本明細書に取り込まれる）に説明される。

５．１．２．ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲ製剤
ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲ製剤は、緩衝塩水、界面活性剤、及び約１００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）ないし約２５０ｍＭ塩化ナトリウムと同等のイオン強度に調節された生理学的に適合性の塩若しくは塩の混合物、又は同等のイオン濃度に調節される生理学的に適合性の塩を含む水性溶液中に懸濁している有効量のｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲベクターを含む懸濁液である。一態様において、前記製剤は、例えば、最適化したｑＰＣＲ（ｏｑＰＣＲ）、又は例えばＭ．Ｌｏｃｋら、Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５−２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４（引用により本明細書に取り込まれる）に説明するデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により測定される約１．５×１０^１１ＧＣ／ｋｇないし約６×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、又は約１×１０^１２ＧＣ／ｋｇないし約１．２５×１０^１３ＧＣ／ｋｇを含む場合がある。例えば、本明細書に提供する懸濁液はＮａＣｌ及びＫＣｌの双方を含む場合がある。ｐＨは６．５ないし８又は７ないし７．５の範囲の場合がある。適切な１種の界面活性剤又は界面活性剤の組合せは、ポロクサマー、すなわちポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２本の親水性鎖により隣接しているポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロック共重合体、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール−１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド（Ｐｏｌｙｏｘｙ ｃａｐｒｙｌｌｉｃ ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ））、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール及びポリエチレングリコールの
なかから選択する場合がある。一態様において、製剤はポロクサマーを含む。これらポロクサマーは、（ポロクサマーの）文字「Ｐ」、次いで３個の数字：最初の２個の数字×１００はポリオキシプロピレンコアのおよその分子質量を示し、最後の数字×１０はポリオキシエチレン含量パーセンテージを示す、で共通して命名される。一態様において、ポロクサマー１８８を選択する。界面活性剤は懸濁液の約０．０００５％ないし約０．００１％までの量で存在する場合がある。一態様において、ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲ製剤は、ｏｑＰＣＲ、又は例えばＭ．Ｌｏｃｋら、Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５−２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４
Ｆｅｂ １４（引用により本明細書に取り込まれる）に説明するデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により測定される最低１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ又はそれ以上を含む懸濁液である。一態様において、ベクターは、１８０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．００１％ポロクサマー１８８、ｐＨ７．３を含む水性溶液中に懸濁する。前記製剤はヒト被験者での使用に適し、静脈内に投与される。一態様において、前記製剤は２０分（±５分）にわたる注入により末梢静脈を介して送達する。しかしながらこの時間は必要又は所望のとおり調節される場合がある。

空のキャプシドが患者に投与するＡＡＶ．ｈＬＤＬＲの投与量から除かれていることを確実にするため、空のキャプシドを、例えば第８．３．２．５節で本明細書に詳細に論考される塩化セシウム勾配超遠心分離法を使用して、ベクター精製工程中にベクター粒子から分離される。一態様において、パッケージングしたゲノムを含むベクター粒子は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６５９７６号明細書、２０１６年１２月９日出願、米国特許出願第６２／３２２，０９３号明細書、２０１６年４月１３日出願、並びに２０１５年１２月１１日に出願し及び“Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ８（ＡＡＶ８のスケーラブル精製方法）”と題した米国特許出願第６２／２６６，３４１号明細書（本明細書に引用することにより取り込まれる）に説明する方法を使用して、空のキャプシドから精製する。簡潔には、ゲノムを含むｒＡＡＶベクター粒子がｒＡＡＶ産生細胞培養の澄明にした濃縮上清から選択的に捕捉及び単離される２段階精製スキームが説明されている。前記方法は、高塩濃度で実施する親和性捕捉法、次いでｒＡＡＶ中間体を実質的に含まないｒＡＡＶベクター粒子を提供するため高ｐＨで実施する陰イオン交換樹脂法を利用する。

一部の態様において、前記方法は薬理学的に活性のゲノム配列を含むＤＮＡを含む組換えＡＡＶ８ウイルス粒子をゲノム欠損（空）ＡＡＶキャプシド中間体から分離する。前記方法は：（ａ）組換えＡＡＶ８ウイルス粒子及び中間体を生成したＡＡＶ産生体細胞培養からＡＡＶ以外の物質を除去するために精製された前記粒子及び空のＡＡＶ８キャプシド中間体と、２０ｍＭビストリスプロパン（ＢＴＰ）及び約１０．２のｐＨを含む緩衝液Ａとを含む負荷懸濁液を形成すること、（ｂ）（ａ）の懸濁液を強陰イオン交換樹脂に負荷すること、（ｃ）負荷された前記陰イオン交換樹脂を、約１０．２のｐＨの１０ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ ＢＴＰを含む緩衝液１％Ｂで洗浄すること、（ｄ）負荷され及び洗浄された陰イオン交換樹脂に塩濃度上昇勾配を適用すること、（ｅ）ｒＡＡＶ粒子を溶離液から回収することを含み、前記樹脂は、懸濁液及び／又は溶液の流れの入口と、容器からの溶離液の流れを許容する出口とを有する容器中にあり、前記塩勾配は、両端を含む１０ｍＭ ＮａＣｌ又は同等物から約１９０ｍＭ ＮａＣｌ又は同等物までの範囲にわたり、前記ｒＡＡＶ粒子は中間体から精製される。

一態様において、使用するｐＨは１０から１０．４まで（約１０．２）であり、ｒＡＡＶ粒子はＡＡＶ８中間体から最低約５０％ないし約９０％精製するか、又は、１０．２のｐＨ及びＡＡＶ８中間体から約９０％ないし約９９％精製する。一態様において、これはゲノムコピーにより決定される。ｒＡＡＶ８粒子（パッケージングしたゲノム）のストッ
ク又は製剤は、ストック中のｒＡＡＶ８粒子が、ストック中のｒＡＡＶ８の最低約７５％ないし約１００％、最低約８０％、最低約８５％、最低約９０％、最低約９５％又は最低９９％であり、「空のキャプシド」が、ストック又は製剤中のｒＡＡＶ８の約１％未満、約５％未満、約１０％未満、約１５％未満である場合に、ＡＡＶ空キャプシド（及び他の中間体）を「実質的に含ま」ない。

一態様において、前記製剤は、１の比又はより少ない、好ましくは０．７５の比未満、より好ましくは０．５の比、好ましくは０．３の比未満の「中身のつまった（ｆｕｌｌ）」に対する「空」の比を有するｒＡＡＶストックを特徴とする。

さらなる一態様において、ｒＡＡＶ粒子の平均収率は最低約７０％である。これは、カラムに負荷した混合物中の力価（ゲノムコピー）及び最終溶離中の量の存在を測定することにより計算される場合がある。さらに、これらは、本明細書に説明するもの又は当前記技術分野で説明するもののようなｑ−ＰＣＲ分析及び／又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ技術に基づいて決定される場合がある。

例えば、空及び中身のつまった粒子の含量を計算するため、選択したサンプルについてのＶＰ３のバンド容量（例えばイオジキサノール勾配精製した製剤、ここでＧＣの数＝粒子の数）を、負荷したＧＣ粒子に対しプロットする。生じる一次方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を使用して、試験薬剤のピークのバンド容量中の粒子の数を計算する。負荷した２０μＬあたりの粒子（ｐｔ）の数をその後５０で乗算して粒子（ｐｔ）／ｍＬを与える。ＧＣ／ｍＬで除算するｐｔ／ｍＬがゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）を与える。ｐｔ／ｍＬ−ＧＣ／ｍＬが空のｐｔ／ｍＬを与える。ｐｔ／ｍＬで除算しかつ１００倍する空のｐｔ／ｍＬが空の粒子のパーセンテージを与える。

一般に、空のキャプシド及びパッケージングしたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子のアッセイ方法は当該技術分野で既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２−１３３０；Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２−１２８を参照されたい。変性したキャプシドについて試験するため、前記方法は、処理したＡＡＶストックを、前記３種のキャプシドタンパク質を分離することが可能ないずれかのゲル、例えば緩衝液中に３−８％トリス酢酸を含む勾配ゲルからなるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけること、その後サンプル物質が分離するまでゲルを泳動すること、及びゲルをナイロン又はニトロセルロースメンブレン、好ましくはナイロン上にブロッティングすることを含む。抗ＡＡＶキャプシド抗体をその後、変性したキャプシドタンパク質に結合する１次抗体、好ましくは抗ＡＡＶキャプシドモノクローナル抗体、最も好ましくはＢ１抗ＡＡＶ−２モノクローナル抗体（Ｗｏｂｕｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１−９２９３）として使用する。２次抗体、すなわち１次抗体に結合し及び１次抗体との結合を検出するための手段を含むもの、より好ましくはそれに共有結合した検出分子を含む抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくはワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体をその後使用する。結合の検出方法、好ましくは放射活性同位体の放射、電磁放射又は比色的変化を検出することが可能な検出法、最も好ましくは化学発光検出キットを使用して、１次及び２次抗体の間の結合を半定量的に測定する。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥについて、カラム画分からのサンプルを採取し、還元剤（例えばＤＴＴ）を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液中で加熱する場合があり、並びにキャプシドタンパク質をプレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えばＮｏｖｅｘ）上で分離した。銀染色を、製造元の説明書に従ってＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）を使用して実施する場合がある。一態様において、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度を定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により測定する場合がある。サンプルを希釈し、ＤＮアーゼＩ（又は別の適切なヌクレアーゼ）で消化して外因性ＤＮＡを除去する。ヌクレアーゼの不活性
化後に、サンプルをさらに希釈し、プライマーと、プライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ^ＴＭ蛍光発生プローブとを使用して増幅する。定義したレベルの蛍光に達するのに必要とするサイクルの数（閾値サイクル、Ｃｔ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出装置上で各サンプルについて測定する。ＡＡＶベクターに含むものに同一の配列を含むプラスミドＤＮＡを使用して、Ｑ−ＰＣＲ反応における標準曲線を生成する。サンプルから得るサイクル閾値（Ｃｔ）値を使用して、それをプラスミドの標準曲線のＣｔ値に対し正規化することによりベクターゲノム力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づく終点アッセイもまた使用する場合がある。

一局面において、広範囲のセリンプロテアーゼ例えばプロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能であるような）を利用する最適化されたｑ−ＰＣＲ法が本明細書に提供される。より具体的には、最適化したｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮアーゼＩ消化後にサンプルをプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈してプロテイナーゼＫで処理し次いで熱不活性化する点を除いて、標準アッセイと類似する。サンプルをサンプルの大きさに等しい量のプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈することが適する。プロテイナーゼＫ緩衝液は２倍又はそれ以上に濃縮される場合がある。典型的にプロテイナーゼＫ処理は約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、しかし０．１ｍｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬまで変動する場合がある。前記処理段階は一般に約５５℃で約１５分間実施されるが、しかしより低い温度（例えば約３７℃ないし約５０℃）でより長い時間の期間（例えば約２０分ないし約３０分）にわたり、又はより短い時間の期間（例えば約５ないし１０分）より高温（例えば約６０℃まで）で実施する場合がある。同様に、熱不活性化は一般に約９５℃で約１５分間であるが、しかし温度を低下させ（例えば約７０ないし約９０℃）及び時間を延長（例えば約２０分ないし約３０分）する場合がある。サンプルをその後希釈し（例えば１０００倍）、及び標準アッセイに説明するＴａｑＭａｎ分析にかける。

追加的に、又は、代替策として、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用する場合がある。例えば、ｄｄＰＣＲによる１本鎖及び自己相補性ＡＡＶベクターゲノム力価の測定方法を説明されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋら、Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５−２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。

５．１．３ 製造
ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲベクターは、図１１に示す流れ図に示すとおり製造する場合がある。簡潔には、細胞（例えばＨＥＫ ２９３細胞）を適切な細胞培養系中で増殖させ、ベクター産生のためトランスフェクトされる。ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲベクターをその後回収し、濃縮し、精製してバルクベクターを製造する場合があり、それをその後下流工程で充填し、仕上げる。

本明細書に説明する遺伝子治療ベクターの製造方法は、遺伝子治療ベクターの製造のため使用するプラスミドＤＮＡの生成、前記ベクターの生成、及び該ベクターの精製のような当該技術分野で公知の方法を含む。いくつかの態様において、遺伝子治療ベクターはＡＡＶベクターであり、生成するプラスミドは、ＡＡＶゲノム及び目的の遺伝子をコードするＡＡＶシスプラスミドと、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶトランスプラスミドと、アデノウイルスヘルパープラスミドとである。ベクター生成方法は、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡでの細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、並びにベクターを含む細胞及び培地の回収のような方法段階を含む場合がある。回収したベクターを含む細胞及び培地を本明細書で粗細胞回収物（ｃｒｕｄｅ ｃｅｌｌ ｈａｒｖｅｓｔ）と称する。

その後、前記粗細胞回収物をベクター回収物の濃縮、ベクター回収物の透析濾過、ベクター回収物の微小流動化、ベクター回収物のヌクレアーゼ消化、微小流動化した中間体の濾過、クロマトグラフィーによる精製、超遠心分離法による精製、接線流濾過による緩衝液交換、並びにバルクベクターを製造するための配合及び濾過のような方法段階に供することができる。

一部の態様において、図１１のものに類似の方法を他のＡＡＶ産生体細胞とともに使用する場合がある。トランスフェクションと、安定細胞株産生と、アデノウイルス−ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス−ＡＡＶハイブリッド及びバキュロウイルス−ＡＡＶハイブリッドを含む感染性ハイブリッドウイルス産生系とを含む多数の方法が、ｒＡＡＶベクターの製造のため当該技術分野で既知である。例えば、Ｇ Ｙｅら、Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ、２５：２１２−２１７（Ｄｅｃ ２０１４）；ＲＭ Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２０１１、Ｖｏｌ．２０、Ｒｅｖ Ｉｓｓｕｅ １、Ｒ２−Ｒ６；Ｍ．Ｍｉｅｔｚｓｃｈら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２５：２１２−２２２（Ｍａｒ ２０１４）；Ｔ Ｖｉｒａｇら、Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０：８０７−８１７（Ａｕｇｕｓｔ ２００９）；Ｎ．Ｃｌｅｍｅｎｔら、Ｈｕｍ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０：７９６−８０６（Ａｕｇ ２００９）；ＤＬ Ｔｈｏｍａｓら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２０：８６１−８７０（Ａｕｇ ２００９）を参照されたい。ｒＡＡＶウイルス粒子の製造のためのｒＡＡＶ産生培養は全部；１）例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９若しくは２９３細胞のようなヒト由来細胞株、又はバキュロウイルス産生系の場合にＳＦ−９のような昆虫由来細胞株を含む適切な宿主細胞；２）野生型若しくは変異体アデノウイルス（温度感受性アデノウイルスのような）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスにより提供する適切なヘルパーウイルス機能、又はトランス若しくはシスでヘルパー機能を提供する核酸構築物；３）機能的ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、機能的ｃａｐ遺伝子及び遺伝子産物；４）ＡＡＶ ＩＴＲ配列により隣接しているトランスジーン（治療的トランスジーンのような）；並びに５）ｒＡＡＶ産生を支援する適切な培地及び培地成分、を必要とする。

多様な適切な細胞及び細胞株がＡＡＶの製造における使用について説明されている。前記細胞それ自体は、原核生物（例えば細菌）細胞、並びに昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞を含む真核生物細胞を含むいずれかの生物学的生物体から選択する場合がある。とりわけ望ましい宿主細胞は、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ １、ＢＳＣ ４０、ＢＭＴ １０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、ＨＥＫ ２９３細胞（機能的アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、並びにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ及びハムスターを含む哺乳動物由来の初代線維芽細胞、肝細胞及び筋芽細胞のような細胞を含むが、これらに限定されない、いずれの哺乳動物種のなかから選択する。一部の態様において、前記細胞は懸濁に適合した細胞である。前記細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明を限定するものではなく；哺乳動物細胞のタイプすなわち線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞なども本発明を限定するものではない。

特定の一態様において、遺伝子治療ベクターを製造するために使用する方法を以下の第８節の実施例３に説明する。

５．２ 患者集団
処置の候補である患者は、好ましくは、ＬＤＬＲ遺伝子中に２個の突然変異を有するＨｏＦＨと診断した成人（１８歳以上の男性又は女性）、すなわち、未処置ＬＤＬ−Ｃレベル例えば３００ｍｇ／ｄｌ超のＬＤＬ−Ｃレベル、処置ＬＤＬ−Ｃレベル例えば３００ｍｇ／ｄｌ未満のＬＤＬ−Ｃレベル及び／又は５００ｍｇ／ｄｌより高い総血漿コレステロールレベル、並びに早期の攻撃的な粥状動脈硬化を含む場合があるＨｏＦＨと矛盾しない
臨床像の状況で双方の対立遺伝子に分子的に定義するＬＤＬＲ突然変異を有する患者である。いくつかの態様において、１８歳未満の患者を処置する場合がある。いくつかの態様において、処置する患者は１８歳以上の男性である。いくつかの態様において、処置する患者は１８歳以上の女性である。処置の候補は、スタチン類、エゼチミブ、胆汁酸捕捉剤、ＰＳＣＫ９阻害剤のような脂質降下薬並びにＬＤＬ及び／又は血漿アフェレーシスを用いる処置を受けているＨｏＦＨ患者を含む。

処置前に、ＨｏＦＨ患者を、ｈＬＤＬＲ遺伝子を送達するために使用するＡＡＶ血清型に対するＮＡｂについて評価すべきである。こうしたＮＡｂは形質導入効率を妨害し及び治療的有効性を低下させる場合がある。１：１０以下のベースライン血清ＮＡｂ力価を有するＨｏＦＨ患者はｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲ遺伝子治療プロトコルを用いる処置の良好な候補である。しかしある種の状況下では、より高い比の患者が選択される場合がある。１：５を超える血清ＮＡｂの力価を伴うＨｏＦＨ患者の処置は、免疫抑制剤での一過性の同時処置のような併用療法を必要とする場合がある。もっとも、かかる療法はより低い比の患者に選択される場合があるけれども。こうした同時療法の免疫抑制剤は、ステロイド、代謝拮抗薬、Ｔ細胞阻害剤及びアルキル化薬を含むが、これらに限らない。例えば、こうした一過性の処置は、約６０ｍｇで開始し及び１０ｍｇ／日減少する（第７日投与なし）量の減少する用量で１日１回７日間投与するステロイド（例えばプレドニゾール（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｅ））を含む場合がある。他の用量及び医薬を選択する場合がある。

被験者は、彼らを治療する医師の裁量で、遺伝子治療処置の前及びこれと同時に彼らの標準治療処置（１種又は複数）（例えばＬＤＬアフェレーシス及び／又は血漿交換並びに他の脂質降下処置）を継続することを許容する場合がある。代替策として、医師は、遺伝子治療処置を投与する前に標準治療の療法を停止し、場合によっては遺伝子治療の投与後同時療法として標準治療処置を再開することを好む場合がある。遺伝子治療投与計画の望ましいエンドポイントは、ベースラインから遺伝子治療処置の投与後１２週までの低比重リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）低下及びＬＤＬアポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）の分別異化率（ＦＣＲ）の変化である。他の望ましいエンドポイントは、例えば：総コレステロール（ＴＣ）、非高比重リポ蛋白コレステロール（ｎｏｎ−ＨＤＬ−Ｃ）の１種又はそれ以上の低下、空腹時トリグリセリド（ＴＧ）の減少、並びにＨＤＬ−Ｃ（例えばレベルの増大が望ましい）、超低比重リポタンパク質コレステロール（ＶＬＤＬ−Ｃ）、リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））、アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）及び／又はアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ａｐｏＡ−Ｉ）の変化を含む。

一態様において、患者は、試験の持続時間にわたる単独及び／又は補助的処置の使用と組合せのＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲでの処置後に、所望のＬＤＬ−Ｃ閾値（例えば２００未満、１３０未満又は１００ｍ／ｄｌ未満のＬＤＬ−Ｃ）を達成する。

一部の態様では、患者は、ＬＤＬ及び／又は血漿のアフェレーシスの頻度を含む、脂質低減療法の必要性が減少するであろう。

さらに別の態様では、ベースラインと比較して、評価可能な黄色腫の数、大きさ又は程度が減少するであろう。

にもかかわらず、以下の特徴の１つ以上を有する患者は、彼らの治療する医師の裁量で処置から除外する場合がある：
・ベースライン来院の１２週以内の入院歴（１若しくは複数）を伴う機能分類ＩＩＩ度又は機能分類ＩＶ度とＮＹＨＡ分類により定義される心不全。
・ベースライン来院の１２週以内の心筋梗塞（ＭＩ）、入院に至る不安定型狭心症、冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）、経皮的冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）、コントロール
不能の不整脈、頸動脈手術若しくはステント術、卒中、一過性虚血発作、頸動脈血行再建術、血管内手術又は外科的介入歴。
・１８０ｍｍＨｇ超の収縮期血圧、９５ｍｍＨｇ超の拡張期血圧と定義するコントロール不能の高血圧。
・文書化された組織学的評価又は非侵襲的画像検査若しくは検査に基づく肝硬変又は慢性肝疾患歴。
・以下の肝疾患：非アルコール性脂肪性肝炎（生検で証明する）；アルコール性肝疾患；自己免疫性肝炎；肝癌；原発性胆汁性肝硬変；原発性硬化性胆嚢炎；ウィルソン病；ヘモクロマトーシス；α_１アンチトリプシン欠乏症のいずれかの文書化された診断。
・スクリーニング時の異常なＬＦＴ（患者がジルベール症候群による非抱合型高ビリルビン血症を有しない限り、正常の上限（ＵＬＮ）の２倍超のＡＳＴ若しくはＡＬＴ及び／又はＵＬＮの１．５倍超の総ビリルビン）。
・ＨｅｐＢ ＳＡｇ若しくはＨｅｐ ＢコアＡｂ、及び／又はウイルスＤＮＡについて陽性により定義するＢ型肝炎、或いはＨＣＶ Ａｂ及びウイルスＲＮＡについて陽性により定義する慢性活動性Ｃ型肝炎。
・５２週以内のアルコール乱用歴。
・潜在的に肝毒性であることが既知のある種の禁止されている医薬、とりわけ小滴性又は大滴性脂肪過多症を誘発する場合がある医薬の服用。これらは：アキュテイン（ａｃｕｔａｎｅ）、アミオダロン、ＨＡＡＲＴ薬、大量のアセトアミノフェン使用（３×ｑ週超２ｇ／日）、イソニアジド、メトトレキサート、テトラサイクリン、タモキシフェン、バルプロ酸を含むが、これらに限られない。
・全身性コルチコステロイドの現在の使用、又は活動性結核、全身性真菌性疾患若しくは他の慢性感染症。
・陽性のＨＩＶ検査結果を含む免疫不全疾患歴。
・推定ＧＲＦが３０ｍＬ／分未満と定義される慢性腎不全。
・適切に処置した基底細胞皮膚癌、扁平上皮細胞皮膚癌又は子宮頸部上皮内癌（ｉｎ ｓｉｔｕ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）を除く、過去５年以内の癌の病歴。
・臓器移植の既往歴。
・ベースライン及び／又は処置の決定前３か月未満に発生したいずれかの大外科的処置。

１：１０超のベースライン血清ＡＡＶ８ ＮＡｂ力価。他の態様において、治療する医師は、これら身体的特徴（病歴）の１件又はそれ以上の存在が本明細書に提供する処置を妨げるべきでないことを確認する場合がある。

５．３．投与及び投与経路
患者は例えば約２０分ないし約３０分にわたる注入により末梢静脈を介して投与するｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲの単回投与を投与する。患者に投与するｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲの用量は、最低２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ若しくは７．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、又は最低５×１０^１１ＧＣ／ｋｇないし約７．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ（ｏｑＰＣＲ又はｄｄＰＣＲにより測定）である。しかしながら他の用量を選択する場合がある。好ましい一態様において、使用するｒＡＡＶ懸濁液は、ＨｏＦＨの二重ノックアウトＬＤＬＲ−／−Ａｐｏｂｅｃ−／−マウスモデル（ＤＫＯマウス）に投与する５×１０^１１ＧＣ／ｋｇの１回の用量がＤＫＯマウスにおけるベースラインコレステロールレベルを２５％ないし７５％低下させるような効力を有する。

いくつかの態様において、患者に投与するｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲの用量は２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇないし７．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇの範囲にある。好ましくは、使用するｒＡＡＶ懸濁液は、ＨｏＦＨの二重ノックアウトＬＤＬＲ−／−Ａｐｏｂｅｃ−／−マウスモデル（ＤＫＯマウス）に投与する５×１０^１１ＧＣ／ｋｇの用量がＤＫＯマウスにおけるベースラインコレステロールレベルを２５％ないし７５％低下させるような効力を有
する。特定の態様において、患者に投与するｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲの用量は、最低５×１０^１１ＧＣ／ｋｇ ２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、３．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、３．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、４．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、４．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、５．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、５．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、６．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、６．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、７．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ又は７．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇである。

いくつかの態様において、ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲはＨｏＦＨの処置ための１種又はそれ以上の治療と組合せで投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲは、スタチン、エゼチミブ、エゼディア（ｅｚｅｄｉａ）、胆汁酸捕捉剤、ＬＤＬアフェレーシス、血漿アフェレーシス、血漿交換、ロミタピド、ミポメルセン及び／又はＰＣＳＫ９阻害剤を含むが、これらに限らない、ＨｏＦＨを処置するのに使用する標準的脂質降下療法と組合せで投与する。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲはナイアシンと組合せで投与する。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲはフィブラートと組合せで投与される。

５．４．臨床的目標の評価
投与後の遺伝子治療ベクターの安全性は、有害事象の数、身体検査で認められる変化、及び／又はベクター投与後約５２週までの複数の時点で評価される臨床検査パラメータにより評価される場合がある。生理学的影響はより早期に例えば約１日ないし１週で観察する場合があるとはいえ、一態様において、定常状態レベルの発現レベルは約１２週までに到達する。

ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲ投与で達成されるＬＤＬ−Ｃ低下は、約１２週又は他の所望の時点でのベースラインと比較したＬＤＬ−Ｃの所定の変化パーセントとして評価される場合がある。

他の脂質パラメータ、とりわけ総コレステロール（ＴＣ）、非高比重リポ蛋白コレステロール（ｎｏｎ−ＨＤＬ−Ｃ）、ＨＤＬ−Ｃ、空腹時トリグリセリド（ＴＧ）、超低比重リポタンパク質コレステロール（ＶＬＤＬ−Ｃ）、リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））、アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）及びアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ａｐｏＡ−Ｉ）の変化パーセントもまた、約１２週で又は他の所望の時点ベースライン値と比較して評価される場合がある。ＬＤＬ−Ｃが低下する代謝機序は、ｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲ投与の前及び投与１２週後に再度ＬＤＬの動態研究を実施することにより評価される場合がある。評価すべき主要パラメータはＬＤＬ ａｐｏＢの分別異化率（ＦＣＲ）である。

本明細書で使用されるｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲベクターは、患者がこれらの臨床エンドポイントの最低１つを達成するのに十分なレベルのＬＤＬＲを発現する場合に、患者の欠陥のあるＬＤＬＲを活性のＬＤＬＲで「機能的に置換する」又は「機能的に補充する」。ＦＨ患者以外において正常な野生型の臨床エンドポイントレベルの最低約１０％ないし１００％未満を達成するｈＬＤＬＲの発現レベルが機能的置換を提供する場合がある。

一態様において、発現を投与後早ければ約８時間ないし約２４時間で観察する場合がある。上に説明する所望の臨床効果の１つ以上を投与後数日ないし数週以内に観察する場合がある。

長期（２６０週まで）安全性及び有効性をｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲ投与後に評価する場合がある。

標準的臨床検査評価、及び以下の第６．４．１節ないし６．７節に説明する他の臨床ア
ッセイを使用して、有害事象、脂質パラメータ、薬力学的評価、リポタンパク質動態、ＡｐｏＢ−１００濃度の変化パーセント、及びｒＡＡＶ．ｈＬＤＬＲベクターに対する免疫応答を評価する有効性評価項目を監視する場合がある。

以下の実施例は例示のみであり、本発明を限定することを意図していない。

実施例
６．実施例１：ヒト被験者を処置するためのプロトコル
本実施例は、低比重リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子中の突然変異による遺伝学的に確認されたホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）を罹患している患者の遺伝子治療処置に関する。本実施例において、遺伝子治療ベクターＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲすなわちｈＬＤＬＲを発現する複製欠損アデノ随伴ウイルスベクター８（ＡＡＶ８）を、ＨｏＦＨを罹患している患者に投与する。処置の有効性は、トランスジーン発現の代替エンドポイントとして低比重リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベルを使用して評価する場合がある。主要有効性評価は処置後約１２週でのＬＤＬ−Ｃレベルを含み、効果の持続をその後最低５２週間追跡する。トランスジーン発現の長期安全性及び持続性を肝生検サンプル中で処置後に測定する場合がある。

６．１．遺伝子治療ベクター
遺伝子治療ベクターは、肝特異的プロモーター（チロキシン結合グロブリン、ＴＢＧ）の制御下にトランスジーンヒト低比重リポタンパク質受容体（ｈＬＤＬＲ）を発現するＡＡＶ８ベクターであり、本実施例でＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲと称する（図７を参照されたい）。ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲベクターはＡＡＶベクター有効成分及び製剤緩衝液からなる。ＡＡＶベクターの外部成分は、１：１：１８の比の６０コピーの３種のＡＡＶウイルスタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３からなる血清型８、Ｔ＝１の正二十面体キャプシドである。該キャプシドは１本鎖ＤＮＡ組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターゲノムを含む。該ゲノムは、２個のＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）に挟まれたｈＬＤＬＲトランスジーンを含む。エンハンサー、プロモーター、イントロン、ｈＬＤＬＲコーディング配列及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを、前記ｈＬＤＬＲトランスジーンは含む。前記ＩＴＲはベクター産生中のゲノムの複製及びパッケージングを司る遺伝要素であり、ｒＡＡＶを生成するのに必要な唯一のウイルスシスエレメントである。ｈＬＤＬＲコーディング配列の発現は肝細胞特異的ＴＢＧプロモーターから駆動される。２コピーのα１ミクログロブリン／ビクニンエンハンサーエレメントが、プロモーター活性を刺激するためにＴＢＧプロモーターの上流に配置される。キメライントロンが発現をさらに高めるために存在し、ウサギβグロビンポリアデニル化（ポリＡ）シグナルが、ｈＬＤＬＲのｍＲＮＡ転写物の終止を媒介するために含まれる。本ベクターを製造するのに使用したｐＡＡＶ．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＬＤＬＲｃｏ．ＲＧＢの配列を配列番号６に提供する。

治験薬の製剤は、１８０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．００１％ポロクサマー１８８、ｐＨ７．３を含む水性溶液中の最低１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬであり、２０分（±５分）にわたる注入により末梢静脈を介して投与する。

６．２．患者集団
処置する患者は、ＬＤＬＲ遺伝子中に２個の突然変異を有するホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）を罹患している成人である。患者は１８歳又はそれより高齢である男性又は女性である場合がある。患者は、未処置ＬＤＬ−Ｃレベル例えば３００ｍｇ／ｄｌ超のＬＤＬ−Ｃレベル、処置ＬＤＬ−Ｃレベル例えば３００ｍｇ／ｄｌ未満のＬＤＬ−Ｃレベル及び／又は５００ｍｇ／ｄｌより高い総血漿コレステロールレベル、並びに早期の攻撃的な粥状動脈硬化を含む場合があるＨｏＦＨと矛盾しない臨床像の状況で双
方の対立遺伝子に分子的に定義されるＬＤＬＲ突然変異を有する。処置する患者は、スタチン類、エゼチミブ、胆汁酸捕捉剤、ＰＳＣＫ９阻害剤のような脂質降下薬並びにＬＤＬアフェレーシス及び／又は血漿アフェレーシスを用いる処置を同時に受けている場合がある。

処置する患者は、１：１０以下のベースライン血清ＡＡＶ８中和抗体（ＮＡｂ）力価を有する場合がある。患者が１：１０以下のベースライン血清ＡＡＶ８中和抗体（ＮＡｂ）力価を有しない場合、前記患者は形質導入期間中に免疫抑制剤で一時的に同時処置される場合がある。一部の態様では、ＡＡＶ８中和抗体の力価を有する患者は、より高い（例えば、１：５以下ないし１：１５以下、又は、１：２０以下）か、より低い（例えば、１：２以下ないし１：５以下）の場合がある。同時療法のための免疫抑制剤は、ステロイド、代謝拮抗薬、Ｔ細胞阻害剤及びアルキル化薬を含むが、これらに限らない。

被験者は、彼らの治療する医師の裁量で、遺伝子治療処置の前及びこれと同時に彼らの標準治療処置（１種又は複数）（例えばＬＤＬアフェレーシス及び／又は血漿交換並びに他の脂質降下処置）を継続することを許容される場合がある。代替策として、医師は、遺伝子治療処置を投与する前に標準治療の療法を停止し及び場合によっては遺伝子治療の投与後に同時療法として標準治療処置を再開することを好む場合がある。遺伝子治療投与計画の望ましいエンドポイントは、ベースラインから遺伝子治療処置の投与後約１２週までの低比重リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）低下及びＬＤＬアポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）の分別異化率（ＦＣＲ）の変化である。

さらに他の態様では、望ましいエンドポイントは、ＬＤＬアフェレーシス及び／又は血漿アフェレーシスの必要性の減少を含む。ＬＤＬアフェレーシス及び／又は血漿アフェレーシスの必要性の減少は望ましいエンドポイントである。「ＬＤＬアフェレーシス」という用語は、透析と類似の工程を用いてＬＤＬが血流から除去される工程である、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）アフェレーシスを指すのに用いられる。ＬＤＬアフェレーシスは、患者の血液からＬＤＬコレステロールを除去する処置である。ＬＤＬアフェレーシスの処置中に、血液細胞は血漿から分離される。特殊なフィルターが血漿からＬＤＬコレステロールを除去するのに用いられ、濾過された血液は患者に戻される。１回のＬＤＬアフェレーシス処置は、血液から有害なＬＤＬコレステロールの６０〜７０％を除去できる。米国で食品医薬品局により承認された装置が現在２種類ある。リポソルバー（Ｌｉｐｏｓｏｒｂｅｒ）はデキストランで覆われたフィルターを用いるが、該フィルターはＬＤＬに付着してこれを血液循環から除去する。他方の装置はＨＥＬＰとよばれ、ＬＤＬの除去にヘパリンを用いる。これらの装置のいずれも、ＨＤＬ（善玉）コレステロールの量には有意な変化を起こさない。現在これらは、冠状動脈疾患の既往歴を有する２０００ｎｇ／ｍｄｌ以上のＬＤＬコレステロールの患者と、冠状動脈疾患の既往歴を有しない３００ｍｇ／ｄｌ以上のＬＤＬコレステロールレベルの患者とについて承認されている。例えば、米国アフェレーシス学会、ｗｗｗ．ａｐｈｅｒｅｓｉｓ．ｃｏｍ、及び、ｈｔｔｐ：／／ｃ．ｙｍｃｄｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅｓ／ｗｗｗ．ａｐｈｅｒｅｓｉｓ．ｏｒｇ／ｒｅｓｏｕｒｃｅ／ｒｅｓｍｇｒ／−ｆａｃｔ＿ｓｈｅｅｔｓ＿ｆｉｌｅ／ｌｄｌ＿ａｐｈｅｒｅｓｉｓ．ｐｄｆを参照せよ。世界アフェレーシス協会［ｈｔｔｐ：／／ｗｏｒｌｄａｐｈｅｒｅｓｉｓ．ｏｒｇ／］及び米国脂質協会（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｐｉｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ （ＵＳＡ））［ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｉｐｉｄ．ｏｒｇ／］も参照せよ。一部の態様では、ＬＤＬについて選択的でない血漿アフェレーシス（血漿交換）が遺伝子治療処置の前に使用される場合もあったが、ＬＤＬアフェレーシスについて本明細書で説明するとおり、かかる処置の必要性は減ったかもしれない。本明細書で用いるアフェレーシスの「低減」とは、患者がアフェレーシスを行うのに必要な１年及び／又は１月あたりの回数の減少をさす。かかる低減は、ｒＡＡＶ８−ｈＬＤＬ治療の前に用いられたアフェレーシスのレヴェルと比較して、治療後１０％、２５％、５０％、７５％又
は１００％（例えば必要がなくなる）アフェレーシス処置が少なくなる場合がある。例えば、ｒＡＡＶ８−ｈＬＤＬ治療前に毎週アフェレーシスを受けていた選択された患者が、治療後に、２週間ごと、毎月、又はさらに低い頻度のアフェレーシスしか必要でなくなる場合がある。他の例では、ｒＡＡＶ８−ｈＬＤＬ治療前に月に２回アフェレーシスを受けていた選択された患者が治療後に、月に１回、２月に１回、年に４回、又は、さらに少ない頻度しか必要でなくなる場合がある。さらに他の

一部の態様では、望ましいエンドポイントは、患者を治療するのに用いるＰＣＳＫ９阻害剤の用量の低減を含む。患者を治療するのに用いるＰＣＳＫ９阻害剤の用量の低減が望ましいエンドポイントである。本明細書で用いるアフェレーシスの「低減」とは、患者がアフェレーシスを行うのに必要な１年及び／又は１月あたりの回数の減少をさす。かかる低減は、ｒＡＡＶ８−ｈＬＤＬ治療の前に用いられたＰＣＳＫ９阻害剤のレヴェルと比較して、治療後１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％（例えば必要がなくなる）ＰＣＳＫ９阻害剤が少なくなる場合がある。例えば、ｒＡＡＶ８−ｈＬＤＬ治療前に毎月点滴でＰＣＳＫ９阻害剤の処置を受けていたＨｏＦＨ患者（３００ｍｇ〜５００ｍｇの用量）が、ＨｅＦＨ患者につじつまの合った処置レベルにまでＰＣＳＫ９阻害剤での処置を減らすことができるようになる場合がある。これは患者がより侵襲性の低い治療を受ける（例えば、高用量の点滴の必要性がなくなる）ことが可能になる結果の場合がある。例えば、毎月４２０ｍｇの点滴ではなく、患者が、月１回、２週間ごと（ＨｅＦＨ用量）、又はさらに低い頻度の注射器又は自己注射器を用いるより低用量（例えば、１００〜１４０ｎｇ／ｍＬ）の投与に選ばれる場合がある。

６．３．投与及び投与経路
患者は注入により末梢静脈を介して投与するＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの単回投与を投与される。患者に投与するＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの用量は、約２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ又は７．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇである。空のキャプシドを患者に投与するＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの用量から除去していることを確実にするため、空のキャプシドを、第８．３．２．５節で論考するベクター精製工程中の塩化セシウム勾配超遠心分離法又はイオン交換クロマトグラフィーによりベクター粒子から分離する。

６．４．臨床的目的の測定
・ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲ投与で達成するＬＤＬ−Ｃ低下は、ベースラインと比較した約１２週でのＬＤＬ−Ｃの定義した変化パーセントとして評価する場合がある。
・他の脂質パラメータ、具体的には総コレステロール（ＴＣ）、非高比重リポ蛋白コレステロール（ｎｏｎ−ＨＤＬ−Ｃ）、ＨＤＬ−Ｃ、空腹時トリグリセリド（ＴＧ）、超低比重リポタンパク質コレステロール（ＶＬＤＬ−Ｃ）、リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））、アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）及びアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ａｐｏＡ−Ｉ）の変化パーセントを、ベースライン値と比較して約１２週に評価する場合がある。
・ＬＤＬ−Ｃが低下する代謝機序を、ベクター投与前と投与約１２週後とに再度ＬＤＬ動態研究を実施することにより評価する場合がある。評価すべき主要パラメータはＬＤＬ ａｐｏＢの分別異化率（ＦＣＲ）である。
・ 長期（５２週まで又は２６０週まで）安全性及び有効性をＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲ投与後に評価する場合がある。

６．４．１．実施可能な標準的臨床検査評価：
以下の臨床プロファイルを処置前及び後に試験する場合がある：
・生化学的プロファイル：ナトリウム、カリウム、塩素、二酸化炭素、グルコース、血中尿素窒素、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）クレアチニン、クレアチニンホスホキナーゼ、カルシウム、総タンパク質量、アルブミン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ、総ビリ
ルビン、ＧＧＴ。
・ＣＢＣ：白血球（ＷＢＣ）数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、血小板数、赤血球分布幅、平均血球容積、平均血球ヘモグロビン及び平均血球ヘモグロビン濃度。
・凝固：ＰＴ、ＩＮＲ、ＰＴＴ（スクリーニング及びベースライン時、並びに必要時。
・尿分析：尿色調、濁度、ｐＨ、グルコース、ビリルビン、ケトン、血液、タンパク質、ＷＢＣ。

６．４．２．関心のある有害事象
以下の臨床アッセイを使用して毒性を監視できる：
・肝傷害
・ビリルビン又は肝酵素（ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡｌｋＰｈｏｓ）についてのＣＴＣＡＥ ｖ４．０のグレード３又はより高い臨床検査結果。
・ビリルビン及びＡｌｋＰｈｏｓのＣＴＣＡＥ ｖ４．０のグレード２（ビリルビン＞１．５×ＵＬＮ；アルカリホスファターゼ＞２．５×ＵＬＮ）。
・肝毒性（すなわち「Ｈｙの法則」の基準を満足する）
・ＡＳＴ又はＡＬＴについてＵＬＮ（正常の上限）の３倍以上、及び
・上昇したアルカリホスファターゼを伴わないＵＬＮの２倍を超える血清総ビリルビン、並びに
・総ビリルビンの増大とトランスアミナーゼレベルの増大との組み合わせを説明するための他の理由を見出せない。

さらに、Ｔ細胞の介在が推定される（ｐｒｅｓｕｍｅｄ Ｔ−ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ）高トランスアミナーゼ血症（ｔｒａｎｓａｍｉｎｉｔｉｓ、ベースラインの２倍かつＵＬＮの１倍を超える）のためのコルチコステロイド療法の引き金となる場合があるＡＬＴ又はＡＳＴ上昇はフラッグを上げ報告されるであろう。

６．５．有効性エンドポイント
ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの投与後約１２週の脂質パラメータの変化パーセントの評価を評価し、ベースラインと比較する場合がある。これは：
・直接測定するＬＤＬ−Ｃの変化パーセント（主要有効性評価項目）。
・総コレステロール、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、計算したＨＤＬコレステロール以外の変化パーセント、トリグリセリド、ａｐｏＡ−Ｉ、ａｐｏＢ及びＬｐ（ａ）の変化
を含む。

ベースラインＬＤＬ−Ｃ値は、検査室及び生物学的ばらつきについて制御し並びに確実な有効性評価を確保するため、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの投与前の２度の別個の機会に絶食条件下で得たＬＤＬ−Ｃレベルの平均として計算する場合がある。

６．５．１．薬力学／有効性評価
以下の有効性臨床検査を絶食条件下で評価する場合がある：
・直接測定されたＬＤＬ−Ｃ
・脂質パネル：総コレステロール、ＬＤＬ−Ｃ、ｎｏｎ−ＨＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、ＴＧ、Ｌｐ（ａ）
・アポリポタンパク質Ｂ：ａｐｏＢ及びａｐｏＡ−Ｉ。

加えて、任意のＬＤＬ ａｐｏＢ動態を処置前及び１２週後に測定する場合がある。脂質降下の有効性はベクター投与後約１２、２４及び５２週のベースラインからの変化パーセントとして評価する場合がある。ベースラインＬＤＬ−Ｃ値は、投与前の２度の別個の機会に絶食条件下で得たＬＤＬ−Ｃレベルを平均することにより計算する。ベクター投与後１２週のＬＤＬ−Ｃのベースラインからの変化パーセントは遺伝子導入の有効性の主要
尺度である。

・ベクター投与１２週後までのＬＤＬ−ａｐｏＢの分別異化率のベースラインからの変化。更なるａｐｏＢ動態パラメーターも考慮されるであろう。
・ＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲ投与後２４週と、５２週と、２６０週までの毎年とのＬＤＬ−Ｃレベルの絶対値。
・ＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲ投与後２４週と、５２週と、２６０週までの毎年とのＬＤＬ−Ｃその他の脂質パラメーターのベースラインからの変化の百分率。
・ＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲ投与後１２週と、２４週と、５２週とでの２００ｍｇ／ｄｌ未満のＬＤＬ−Ｃレベルの絶対値を達成する被験者の百分率。
・ＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲ投与後１２週と、２４週と、３６週と、５２週とで、以前受けていた脂質低下処置を再開しなかった、あるいは、いかなる新規な脂質低下処置を開始しなかった被験者の数。
・スクリーニング前に脂質アフェレーシスを受けていた被験者について、試験期間内のいずれかの時点でアフェレーシス処置の頻度の変化を経験した被験者の数。
・ＰＣＳＫ９阻害剤を受けた被験者について、ＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲ投与前にＰＣＳＫ９阻害剤を受けている間に達成したＬＤＬ−Ｃと比較した、ＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲ投与後に達成したＬＤＬ−Ｃ。
・ベースラインで説明容易な黄色腫を有する被験者について、ＡＡＶ８．ｈＬＤＬＲ投与後１２週及び５２週で、臨床所見の数、大きさ又は程度の改善が記録されている数。

６．６．リポタンパク質の動態
リポタンパク質の動態研究を、ＬＤＬ−Ｃが低下する代謝機序を評価するためにベクター投与前及び１２週後に再度実施する場合がある。評価すべき主要パラメータはＬＤＬ−ａｐｏＢの分別異化率（ＦＣＲ）である。ａｐｏＢの内因性標識は、重水素化
ロイシンの静脈内注入、次いで４８時間の期間にわたる血液サンプリングにより達される。

６．６．１．ａｐｏＢ−１００の単離
ＶＬＤＬ、ＩＤＬ及びＬＤＬは、Ｄ３−ロイシン注入後引き抜く間隔を決められたサンプルの連続超遠心分離法により単離する。ａｐｏＢ−１００は、トリス−グリシン緩衝系を使用する調製用ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）によりこれらリポタンパク質から単離される。個々のａｐｏＢ種内のａｐｏＢ濃度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により測定する。総ａｐｏＢ濃度は自動化免疫比濁アッセイを使用して測定する。

６．６．２．同位体濃縮測定
ａｐｏＢ−１００のバンドをポリアクリルミドゲルから切り出す。切り出したバンドを１２Ｎ ＨＣｌ中１００℃で２４時間加水分解する。アミノ酸を、ガスクロマトグラフ／質量分析計を使用する分析の前にＮ−イソブチルエステル及びＮ−ヘプタフルオロブチルアミド誘導体に変換する。同位体濃縮率（パーセンテージ）を、観察したイオン電流比から計算する。この形式のデータは放射性トレーサー実験における比放射能に対応する。各被験者は、ａｐｏＢ−１００代謝に関してこの処置中定常状態に留まることが想定される。

６．７．ＡＡＶ８に対する薬物動態及び免疫応答の評価
以下の試験を使用して、薬物動態、ＡＡＶベクターに対する免疫前状態及びＡＡＶベクターに対する免疫応答を評価する場合がある：
・免疫応答モニタリング：ＡＡＶ８ ＮＡｂ力価；ＡＡＶ８ベクターに対するＴ細胞応答；ｈＬＤＬＲに対するＴ細胞応答。
・ベクター濃度：ＰＣＲによりベクターゲノムとして測定する血漿中ＡＡＶ８濃度。
・ヒト白血球抗原型分類（ＨＬＡ型）：ＨＬＡ型は、クラスＩについてＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、並びにクラスＩＩについてＨＬＡ ＤＲＢ１／ＤＲＢ３４５、ＤＱＢ１及びＤＰＢ１の高分解能評価により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）で評価する。この情報は、潜在的Ｔ細胞免疫応答のＡＡＶ８キャプシド又は特殊なＨＬＡ対立遺伝子を伴うＬＤＬＲトランスジーンとの相関を可能にし、Ｔ細胞応答の強度及びタイミングの個別のばらつきを説明するのに役立つ。

６．８ 黄色腫評価
身体検査はあらゆる黄色腫の同定、検査及び説明を含む。黄色腫の位置及びタイプすなわち皮膚、眼瞼（眼）、結節型、及び／又は腱の文書記録が測定される。可能な場合、目盛付き物差し又はカリパスを使用して、身体検査中に黄色腫の大きさ（最大及び最小の範囲）を文書で記録する。可能な場合は、最も広範囲及び容易に特定可能である黄色腫のデジタル写真を、巻き尺（ミリメートルを伴うメートル法の）の病変の隣に配置して撮影する。

７．実施例２：前臨床データ
非臨床研究を、ＨｏＦＨの動物モデル及び既存の液性免疫に対するＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの効果を研究するために実施した。複数の単回投与薬理試験を、コレステロールの低下を測定する小型及び大型動物モデルで実施した。加えて、粥状動脈硬化の退縮を、ＬＤＬＲ及びＡｐｏｂｅｃ１双方を欠損しており、固形飼料食（ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ）給餌であってもａｐｏＢ−１００を含むＬＤＬの上昇により重度高コレステロール血症を発症し、広範囲の粥状動脈硬化を発症する二重ノックアウトＬＤＬＲ−／−Ａｐｏｂｅｃ１−／−マウスモデル（ＤＫＯ）にて測定した。これらデータを使用して、最小有効量を決定しヒト試験のための用量選択を十分に正当化した。ヒト試験のための適切な用量をさらに特徴付けし潜在的安全性徴候を特定するため、毒性試験をＨｏＦＨのヒト以外の霊長類（ＮＨＰ）及びマウスモデルで実施した。

７．１ 既存の液性免疫：肝へのＡＡＶ媒介遺伝子導入に対する影響
本研究の目標は、アカゲザル及びカニクイザルにおけるＡＡＶ８被包化ベクターを使用する肝に向けた遺伝子導入についてＡＡＶに対する既存の液性免疫が与える影響を評価することであった。２１匹のアカゲザル及びカニクイザルを、ＡＡＶ８に対する既存の免疫のレベルについて前スクリーニングした動物のより大きい集団から選択した。動物は広範な齢分布を代表し全部がオスであった。これら研究は、１：１６０までのＡＡＶ８中和抗体（ＮＡｂ）力価を伴うより制限した数を含む一方で、低レベルないし検出不可能なレベルのＮＡｂを伴う動物に焦点を当てた。動物に、肝特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターから高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現する３×１０^１２ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８ベクターを末梢静脈注入で注入した。動物を７日後に剖検し、組織をＥＧＦＰ発現及びＡＡＶ８ベクターゲノムの肝ターゲッティングについて評価した（図１）。ＮＨＰ血清中のＡＡＶ８に対する既存のＮＡｂを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入阻害アッセイを使用し、受身移入実験（Ｗａｎｇら、２０１０ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １８（１）：１２６−１３４）の状況で評価したが、前記実験では、ｉｎ ｖｉｖｏの肝に向けた遺伝子導入に対する既存のＡＡＶ８ ＮＡｂの影響を評価するためにベクター投与の前とベクター投与時点でＮＨＰからの血清がマウスに注入された。

ＡＡＶ８に対する検出不可能なレベルないし低レベルの既存のＮＡｂを伴う動物は、蛍光顕微鏡検査（図１）及びＥＬＩＳＡによるＥＧＦＰ検出ならびに肝中のベクターＤＮＡ定量による証拠のとおり、肝における高レベルの形質導入を示した。ＨｏＦＨにおける有効性に関する形質導入の最も有用な尺度は形質導入した肝細胞のパーセントであり、それ
は既存のＮＡｂの非存在下で１７％（４．４％ないし４０％の範囲）であった。これは同一用量のベクターでマウスにおいて観察する効率に非常に近い。肝細胞の形質導入に大きく影響する既存のＮＡｂのＴ閾値力価は１：５以下であった（すなわち１：１０以上の力価は形質導入を実質的に低下させた）。肝形質導入の抗体が媒介する阻害は肝中のＡＡＶゲノム減少と直接相関した。ヒト血清をＡＡＶ８に対する既存のＮＡｂの証拠についてスクリーニングしたところ、結果は、成体の約１５％が１：５以下の過剰の抗ＡＡＶ８ＮＡｂを有することを示唆する。また、より高レベルのＮＡｂが前記ベクターの体内分布の変化と関連し、その結果、ＮＡｂは脾形質導入を増大させずに脾中へのベクターゲノムの蓄積を増大させる一方で肝遺伝子導入を低下させることを示した。

７．２ ＨｏＦＨのマウスモデルにおける血清コレステロールに対するＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲの影響
ＤＫＯマウス（６ないし１２週齢オス）にＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲを静脈内（ＩＶ）注入し、代謝矯正及び既存の粥状動脈硬化病変の好転について追跡した。動物はまた全体的臨床毒性及び血清トランスアミナーゼの異常についても評価した。ＬＤＬＲのマウスバージョンをＤＫＯマウス中へのベクター投与のため利用した。

１０^１１ＧＣ／マウス（５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）を投与したマウスは高コレステロール血症の完全に近い正常化を示し、これは１８０日間安定であった（図２）。ＡＬＴレベルの上昇又は異常な肝生化学検査結果は、げっ歯類における最高用量でベクター注入後６か月までの間観察されなかった（Ｋａｓｓｉｍら、２０１０、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（１０）：ｅ１３４２４）。

７．３ 高脂肪食給餌のＨｏＦＨのマウスモデルにおける粥状動脈硬化病変に対するＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲの影響
ＬＤＬＲのＡＡＶ８の媒介する送達が総コレステロールの有意の低下を誘発したことを考慮して、ｍＬＤＬＲのＡＡＶ８の媒介する発現を、それが粥状動脈硬化病変に対する影響を有したかどうかを確認するために概念実証研究で調べた（Ｋａｓｓｉｍら、２０１０、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（１０）：ｅ１３４２４）。３個の群のオスＤＫＯマウスに粥状動脈硬化の進行を促進させるため高脂肪食を給餌した。２か月後にマウスの１つの群は５×１０^１２ＧＣ／ｋｇの対照ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｎＬａｃＺベクターの単回静脈内（ＩＶ）注入を投与し、１つの群は５×１０^１２ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲベクターの単回静脈内（ＩＶ）注入を投与し、第三の非介入群は粥状動脈硬化病変の定量化のため剖検した。ベクターを投与したマウスは高脂肪食給餌でさらに６０日間維持し、その時点でそれらを剖検した。

ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲベクターを投与した動物は、ベースラインでの１５５５±３４３ｍｇ／ｄｌから処置後第７日の２６６±７８ｍｇ／ｄｌ、第６０日までに６７±１３ｍｇ／ｄｌへと総コレステロールの急速な下落を実現した。対照的に、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｎＬａｃＺ処置したマウスの血漿コレステロールレベルは、ベースラインでの１５６６±２７６ｍｇ／ｄｌからベクター６０日後に測定した場合の１５２７±６７ｍｇ／ｄｌまで事実上変化しないままであった。全部の動物が高脂肪食給餌で２か月後に血清トランスアミナーゼでのわずかな増大を発生し、これはＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｎＬａｃＺベクターでの処置後上昇したままであったが、しかしＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲベクターでの処置後正常レベルの３分の１に減少した。

既存の粥状動脈硬化病変の進行を２種の独立した方法により評価した。第１の方法において、大動脈を弓から腸骨分岐部（ｉｌｉａｃ ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ）まで開放し、オイルレッドＯで染色し（図３Ａ）；形態計測分析が、大動脈の長さ全体に沿ってオイルレッドＯで染色した大動脈のパーセントを定量した（図３Ｂ）。オイルレッドＯは凍結切
片上の中性トリグリセリド及び脂質の染色のため使用される溶解色素（脂溶性染料）ジアゾ染料である。この色素での大動脈の染色は脂肪沈着斑の可視化を可能にする。図３に見るとおり、２か月の高脂肪食はベクター投与時点でベースライン疾患を反映する大動脈の２０％を覆う広範囲の粥状動脈硬化をもたらし；これはＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｎＬａｃＺベクターでの処置後さらに２か月の期間にわたり３３％に増大し、粥状動脈硬化の６５％のさらなる進行を表す。対照的に、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲベクターでの処置は、ベースラインで粥状動脈硬化により覆う大動脈の２０％からベクター投与６０日後の粥状動脈硬化により覆う大動脈のわずか２．６％まで、２か月にわたり８７％の粥状動脈硬化の退縮に至った。

第２の方法において、総病変面積を大動脈根で定量した（図３Ｃ−Ｆ）。この分析は同一の全体的傾向を示し、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｎＬａｃＺ注入したマウスがベースラインマウスと比較して２か月にわたり４４％進行を示した一方、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲ注入したマウスはベースラインマウスと比較して病変の６４％退縮を示した。まとめると、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲの注入を介するＬＤＬＲの発現は、大動脈内の２個の異なる部位で２種の独立した定量方法により評価する２か月にわたるコレステロールの顕著な低下及び粥状動脈硬化の実質的退縮を誘発した。

７．４ ＨｏＦＨのマウスモデルにおける最小有効量の評価
ＨｏＦＨ集団における表現型と遺伝子型との間の相関の広範な研究は、わずか２５〜３０％のＬＤＬ及び総コレステロールの差違が臨床転帰の実質的差違に移行することを示している（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉら ２０１３、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２２７（２）：３４２−３４８；Ｋｏｌａｎｓｋｙら ２００８、Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ １０２（１１）：１４３８−１４４３；Ｍｏｏｒｊａｎｉら １９９３、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３４１（８８５６）：１３０３−１３０６）。さらに、３０％未満のＬＤＬ−Ｃ低下を伴う脂質降下処置は、ＨｏＦＨを罹患している患者における心血管系イベントの遅延と生存の延長とにつながる（Ｒａａｌら ２０１１、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １２４（２０）：２２０２−２２０７）。最近、ＦＤＡは、主要評価項目がベースラインからの２０ないし２５％のＬＤＬ−Ｃの低下であったＨｏＦＨの処置のための薬物ミポメルセンを承認した（Ｒａａｌら ２０１０、Ｌａｎｃｅｔ ３７５（９７１９）：９９８−１００６）。

この背景に対し、以下で論考する遺伝子治療マウス試験における最小有効量（ＭＥＤ）を、ベースラインより最低３０％より低い血清中の総コレステロールの統計学的に有意かつ安定な低下につながるベクターの最低用量と定義した。前記ＭＥＤは多数の多様な試験で評価しており、各実験の簡潔な説明を以下に提供する。

７．４．１．ＤＫＯマウスにおけるＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲのＰＯＣ用量範囲決定試験
ＤＫＯマウスにおけるＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲ及びＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの概念実証用量範囲決定試験を実施して、さらなる試験のための適切な用量を特定した。これら試験において、ＤＫＯオスマウスに、１．５×１０^１１ＧＣ／ｋｇから５００×１０^１１ＧＣ／ｋｇまでの範囲にわたる多様な用量のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲを静脈内（ＩＶ）注入し、血漿コレステロールの低下について追跡した（Ｋａｓｓｉｍら、２０１０、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（１０）：ｅ１３４２４）。これら研究実験で使用したＧＣ用量（１．５ないし５００×１０^１１）は定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）力価に基づいた。３０％までの血漿コレステロールの統計学的に有意の低下がＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲの１．５×１０^１１ＧＣ／ｋｇの用量で第２１日に観察され、より有意な低下はベクターのより大用量に比例して達成された（Ｋａｓｓｉｍら、２０１０、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（１０）：ｅ１３４２４）。代謝矯正後に回収した肝組織の分析は、ベクターの用量に
比例したマウスＬＤＬＲトランスジーン及びタンパク質のレベルを示した。従って、用量反応相関が観察された。

７．４．２．ＤＫＯ及びＬＡＨＢマウスにおけるＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの用量範囲決定試験
ＤＫＯマウスにおける同様の概念実証試験を、マウスＬＤＬＲ遺伝子ではなくヒトＬＤＬ受容体（ｈＬＤＬＲ）遺伝子を含むベクターを用いて実施した。ｈＬＤＬＲベクターでの結果は、ベクターの用量がトランスジーンの発現及び肝中のベクターゲノムの蓄積に比例した（Ｋａｓｓｉｍら ２０１３、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２４（１）：１９−２６）点で、ｍＬＤＬＲで観察した結果に非常に類似した。主要な差違はその有効性においてであった−ヒトＬＤＬＲベクターはこのモデルにおいてより弱かった。最低３０％に近いコレステロールの低下は５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ及び５×１０^１１ＧＣ／ｋｇで達成されたが、（ｑＰＣＲ力価に基づく用量）統計学的有意性はより高用量でのみ達成された。

観察した有効性の低下は、マウスＡｐｏＢに対するヒトＬＤＬＲの親和性低下に起因した。この問題を迂回するため、試験を、ヒトＡｐｏＢ１００を発現し及び従ってヒト試験に適切なヒトＬＤＬＲとのヒトａｐｏＢ１００の相互作用をより真正にモデル化するＬＡＨＢマウスモデルを使用して反復した。双方の系統（ＤＫＯ対ＬＡＨＢ）のオスマウスは、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの３種類のベクター用量（ｑＰＣＲ力価に基づき０．５×１０^１１ＧＣ／ｋｇ、１．５×１０^１１ＧＣ／ｋｇ及び５．０×１０^１１ＧＣ／ｋｇ）の１種を尾静脈注入で投与した。各コホートからの動物を第０日（ベクター投与前）、第７日及び第２１日に採血し、血清コレステロールレベルの評価を実施した。ヒトＬＤＬＲはＤＫＯマウスにおけるｍＬＤＬＲと比較してＬＡＨＢマウスにおいてはるかにより有効であった：血清コレステロールの３０％低下が１．５×１０^１１ＧＣ／ｋｇの用量で達成し、これはＤＫＯ動物におけるマウスＬＤＬＲ構築物の以前の研究（Ｋａｓｓｉｍら ２０１３、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２４（１）：１９−２６）で達成されたのと同一の有効性である。

７．４．３．ＨｏＦＨのマウスモデルにおけるＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲおよびＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの非臨床薬理／毒性試験
６〜２２週齢オス及びメスＤＫＯマウス（ｎ＝マウス２８０匹、１４０匹のオス及び１４０匹のメス）は、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲの３種のベクター用量（７．５×１０^１１ＧＣ／ｋｇ、７．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、６．０×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）の１種、又は意図する遺伝子治療ベクターＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの１種の用量（６．０×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）の尾静脈注入を投与した。動物に、本明細書第８．４．１節で説明するｏｑＰＣＲ力価測定法を使用して体重キログラムあたりゲノムコピー（ＧＣ）に基づき投与した。さらに１つのコホートの動物にＰＢＳをベヒクル対照として投与した。各コホートからの動物を第３日、第１４日、第９０日及び第１８０日に屠殺し、血液を血清コレステロールレベルの評価のため回収した（図４）。

処置したマウスの全部の群において全部の剖検時点でのコレステロールの迅速かつ有意の低下が観察された。この低下は早期の時点で低用量のベクターではオスよりメスがより少ないようであったとはいえ、この差違は時間とともに減少し、ついには雌雄間で検出可能な差違は存在しなかった。各群は同一の剖検の時点でＰＢＳ対照に関して最低３０％の血清コレステロールの統計学的に有意の低下を示した。従って、本試験に基づくＭＥＤの決定は７．５×１０^１１ＧＣ／ｋｇ以下である。

７．４．４．ホモ接合性家族性高コレステロール血症のマウスモデルにおけるＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの有効性試験
１２〜１６週齢オスＤＫＯマウス（ｎ＝マウス４０匹）に、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの４種の用量（１．５×１０^１１ＧＣ／ｋｇ、５．０×１０^１１ＧＣ／ｋｇ、１．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、５．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）（ｏｑＰＣＲ力価測定法に基づく用量）の１種を静脈内（ＩＶ）投与した。動物を第０日（ベクター投与前）、第７日及び第３０日に採血し、血清コレステロールが評価された（図５）。コレステロールの迅速かつ有意の低下を５．０×１０^１１ＧＣ／ｋｇ以上で処置したマウスの群で第７及び３０日に観察した。この試験に基づくＭＥＤの決定は１．５×１０^１１ＧＣ／ｋｇと５．０×１０^１１ＧＣ／ｋｇの間である。

７．５．高脂肪食給餌のＬＤＬＲ＋／−アカゲザルにおけるＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｒｈＬＤＬＲの影響
ＦＨサルにおけるＡＡＶ８−ＬＤＬＲ遺伝子導入を評価するようデザインした試験を実施した。脂肪を給餌したか、又は固形飼料を給餌したかのいずれかの野生型アカゲザル中に１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｒｈＡＦＰ（対照ベクター；ｑＰＣＲ力価測定法に基づく用量）を投与後、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）又はアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）値の上昇は見なかった。これは、ＡＡＶ８キャプシドそれ自身が炎症性又は傷害性の肝の過程を誘発する原因でないことを示唆する。

７．６．ＨｏＦＨのマウスモデルにおけるＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲのパイロット体内分布試験
ＨｏＦＨのための遺伝子治療の安全性及び薬力学特性を評価するため、パイロット体内分布（ＢＤ）試験をＤＫＯマウスで実施した。これら試験は、２種の経路：１）尾静脈中への静脈内（ＩＶ）注入又は２）門脈内注入の１種を介して５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ（ｑＰＣＲ力価測定法に基づく用量）のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲベクターを全身投与した５匹のメスＤＫＯマウスにおいてベクター分布及び持続性を調べた。２個の異なる時点（第３日及び第２８日）に、組織の一団を回収し、回収した組織から総細胞ＤＮＡを抽出した。これらパイロット試験において、静脈内（ＩＶ）及び門脈内双方の経路が比較可能な生体内分布（ＢＤ）プロファイルをもたらし、末梢静脈を介して患者及び動物に遺伝子治療ベクターを注入することの理論的根拠を裏付ける。

７．７．毒性
ＨｏＦＨのための遺伝子治療の潜在的毒性を評価するため、薬理／毒性試験をＤＫＯマウス（ＨｏＦＨのマウスモデル）並びに野生型及びＬＤＬＲ＋／−アカゲザルで実施した。前記試験は、固形飼料を給餌した野生型及びＬＤＬＲ＋／−アカゲザルでのベクター関連毒性におけるＬＤＬＲトランスジーン発現の役割の検査、ＨｏＦＨのマウスモデルにおけるＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲ及びＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの薬理／毒性試験、ＨｏＦＨのマウスモデルにおけるＡＡＶ８．ＴＧＢ．ｈＬＤＬＲの非臨床体内分布の検査を含む。これら試験を以下に詳細に説明する。

７．８．固形飼料を給餌した野生型及びＬＤＬＲ＋／−アカゲザルでのベクター関連毒性におけるＬＤＬＲトランスジーン発現の役割を調べる非臨床研究
４匹の野生型及び４匹のＬＤＬＲ＋／−アカゲザルに、１．２５×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲ（ｏｑＰＣＲ力価測定法に基づく用量）を静脈内（ＩＶ）投与し、ヒト以外の霊長類（ＮＨＰ）をベクター投与１年後までの間監視した。４匹の動物（２匹の野生型及び２匹のＬＤＬＲ＋／−）をベクター投与後第２８日に剖検して急性ベクター関連毒性及びベクター分布を評価し、４匹の動物（２匹の野生型及び２匹のＬＤＬＲ＋／−）をベクター投与後第３６４／３６５日に剖検して長期のベクター関連病態及びベクター分布を評価した。野生型及びＬＤＬＲ＋／−アカゲザルの各コホートは２匹のオス及び２匹のメスをであった。

動物は長期又は短期の臨床的後遺症を伴わずベクターの注入を良好に耐えた。体内分布研究は、時間とともに減少したはるかにより少ないがなお検出可能な肝外分布を伴う肝の高レベルかつ安定なターゲッティングを示した。これらデータは、有効性の標的臓器すなわち肝が潜在的毒性の最もありそうな発生源でもまたあることを示唆した。ベクター投与２８及び３６４／３６５日後に実施した剖検で回収した組織の詳細な精査は、ＬＤＬＲ＋／−アカゲザルにおいて肝における若干の最低限ないし軽度所見及び粥状動脈硬化の若干の証拠を示した。肝の病態の性質、及び同様の病態を２匹の未処置野生型動物の１匹で観察したという事実は、それらが前記試験薬剤に無関係であったことを病理学者に示唆した。

１匹の動物はベクター投与前にアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）が持続的に上昇し、それは５８Ｕ／Ｌから１６９Ｕ／Ｌまでの範囲にわたるレベルでベクター投与後に継続した。残りの動物は、トランスアミナーゼの上昇を示さなかったか、又は、決して１０３Ｕ／Ｌを超えないアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びＡＬＴの一過性かつ低レベルの増加のみを示したかのいずれかであった。最も一致した異常はベクター注入後に見出され、それらが試験薬剤に関係したことを示唆する。ヒトＬＤＬＲ又はＡＡＶ８キャプシドに対するＴ細胞の活性化をＡＳＴ／ＡＬＴ増加との相関について評価した。図６は関連した所見を示した３匹の選択された動物におけるＡＡＶキャプシドのＥＬＩＳＰＯＴデータ及び血清ＡＳＴレベルを提示する。１匹の動物のみが、１０３Ｕ／ＬへのＡＳＴの増加がキャプシドに対するＴ細胞の出現と対応した相関を示し（図６、動物０９０−０２６３）；キャプシドＴ細胞応答は持続した一方、ＡＳＴは正常範囲に速やかに戻った。

キャプシド及びトランスジーン特異的Ｔ細胞の存在についての組織由来Ｔ細胞の分析は、肝由来のＴ細胞が遅い時点までに双方の遺伝子型（野生型及びＬＤＬＲ＋／−）からのキャプシドに応答性となった一方、ヒトＬＤＬＲに対するＴ細胞をこの遅い時点でＬＤＬＲ＋／−動物で検出したことを示した。これはＰＢＭＣが標的組織中のＴ細胞コンパートメントを反映しないことを示唆する。第２８及び３６４／３６５日に回収した肝組織をＲＴ−ＰＣＲによりトランスジーンの発現について分析したが、臨床病理の異常又はＴ細胞の出現が影響したようであった。

野生型もＬＤＬＲ＋／−動物もどちらも固形飼料食給餌で高コレステロール血症を発症しなかった。用量制限毒性（ＤＬＴ）は１．２５×１０^１３ＧＣ／ｋｇの用量（ｏｑＰＣＲに基づく）で観察されず、最大耐用量（ＭＴＤ）がこの用量に等しいか又はより大きいとみられることを意味している。トランスアミナーゼの試験薬剤関連の上昇が観察され、これは低くかつ一過性であったがそれにもかかわらず存在した。従って、無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は本明細書の実施例１で評価した単一高用量未満である。

７．９．ＨｏＦＨのマウスモデルにおけるＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲ及びＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの非臨床薬理／毒性試験
本試験はＤＫＯマウスで実施した。この系統を使用することが、１）毒性と同時の概念実証有効性の評価、並びに２）ＬＤＬＲの欠損と関連するいずれかの病態並びに関連する脂質異常症及び脂肪肝のようなその後遺症の状況でのベクター関連毒性の評価を可能にするとみられるためである。

本試験は、実施例１に示すＨｏＦＨを罹患しているヒト被験者への投与のための最高用量より８倍高い最高用量のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲを試験するようデザインされた。マウスＬＤＬＲを発現するベクターの１つのバージョンを、毒性パラメータならびにコレステロールの低下に対する用量の影響の評価を提供するため、この高用量ならびに２種
のより低用量で試験した。用量反応実験を、ヒトＬＤＬＲベクターを使用してヒトで観察するであろう毒性及び有効性をより反映するために、マウスＬＤＬＲを発現するベクターを用いて実施した。

本試験において、６〜２２週齢のオス及びメスＤＫＯマウスに、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｍＬＤＬＲの用量（７．５×１０^１１ＧＣ／ｋｇ、７．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ及び６．０×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）の１種又は６．０×１０^１３ＧＣ／ｋｇのベクター（ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲ）（ｏｑＰＣＲ力価測定法に基づく用量）を投与した。動物をベクター投与後第３日、第１４日、第９０日及び第１８０日に剖検し；これら時間は試験薬剤のベクター発現プロファイルならびに急性及び慢性毒性を捕捉するため選択された。トランスジーン発現の有効性を血清コレステロールレベルの測定により監視した。動物は包括的臨床病理、ベクターに対する免疫反応（サイトカイン、ＡＡＶ８キャプシドに対するＮＡｂ、キャプシド及びトランスジーン双方に対するＴ細胞応答）について評価し、組織を剖検の時点で包括的組織病身体検査のため回収した。

本試験からの重要な毒性所見は後に続くとおりである：
・臨床的後遺症は処置した群で観察されなかった
・臨床病理：
・トランスアミナーゼ：異常は、ＵＬＮの１〜４倍からの範囲にわたった肝機能検査ＡＳＴ及びＡＬＴの上昇に限定され、マウスＬＤＬＲベクターの全用量の第９０日で主に見出された。数匹のオス動物におけるＵＬＮの２倍未満のＡＬＴを除き、高用量のヒトＬＤＬＲベクターを投与した群でトランスアミナーゼの上昇は存在しなかった。マウスベクターに関連する異常は軽度であり、用量依存性でなく、従ってベクターに関連するとは考えられなかった。高用量ヒトベクターと関連する所見は本質的に存在しなかった。これら所見に基づく処置関連毒性の証拠は存在せず、これら基準に基づく無毒性量（ＮＯＡＥＬ）が６．０×１０^１３ＧＣ／ｋｇであることを意味している。
・病理学：肉眼所見は存在しなかった。組織病理学は後に続く肝における最低限ないし軽度所見に限定した：
・ＰＢＳを投与した動物は評価した全基準に従って最低限及び／又は軽度の異常の証拠を有した。処置関連病態の評価において、われわれは、ＰＢＳ注入した動物で見出すものより上であった軽度と分類するいずれの所見にも焦点を当てた。
・軽度胆管過形成及び類洞細胞過形成をマウス及びヒトＬＤＬＲベクターを投与した高用量メスマウスで観察した。これは高用量でのみ観察されるベクター関連の影響を表す場合がある。
・小葉中心性肥大は、軽度、オスにおいてのみであり、かつ高用量のベクターには認められず、それがベクター関連でないことを主張する。
・最低限の壊死が高用量ヒトＬＤＬＲベクターにおいて第１８０日に１／７オス及び３／７メスで見出された。
・高用量のベクターでの軽度胆管及び類洞細胞過形成の所見並びに高用量ヒトＬＤＬＲベクターにおける最低限の壊死の数例に基づき、これら基準に基づくＮＯＡＥＬが７．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇと６．０×１０^１３ＧＣ／ｋｇの間であること。
・他の所見：動物は、高用量のヒトＬＤＬＲベクターの投与後に、ＡＡＶ８に対するＮＡｂの増加と、キャプシド及びＬＤＬＲに対するＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴに基づく非常に低いＴ細胞応答の証拠とを発症した。ベクター３及び１４日後の血清の分析に基づく急性炎症応答の証拠はほとんど存在せず；数種のサイトカインが控えめかつ一過性の上昇を示したとはいえ、ＩＬ６の増加はなかった。

１件の注目すべき所見は、マウスＬＤＬＲベクターで処置したＤＫＯマウスでの毒性がヒトＬＤＬＲベクターで処置したＤＫＯマウスよりもより悪くなかったことであり、これはヒトＬＤＬＲがＴ細胞に関してマウストランスジーンよりも免疫原性があった場合に真
実であり得た。ＥＬＩＳＰＯＴ試験は、ヒトトランスジーンを発現する高用量ベクターを投与したマウスにおいてＬＤＬＲ特異的Ｔ細胞の若干の活性化を示したとはいえ、それらは低くかつ限られた数の動物においてであり、宿主応答のこの機序安全性の懸念に寄与することはありそうにないとみることを示唆した毒性データを裏付ける。

結論として、用量制限毒性は存在せず、最大耐用量が６．０×１０^１３ＧＣ／ｋｇという試験された最高用量より高かったことを意味する。最高用量での肝の病態における軽度かつ可逆性の所見に基づき、ＮＯＡＥＬは、肝において軽度の可逆性の病態を観察した６．０×１０^１３ＧＣ／ｋｇから、ベクター関連所見の明確な表記が存在しなかった７．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇまでの間のどこかである。

７．１０．ＨｏＦＨのマウスモデルにおけるＡＡＶ８．ＴＧＢ．ｈＬＤＬＲの非臨床体内分布
６〜２２週齢オス及びメスＤＫＯマウスに７．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ（ｏｑＰＣＲ力価測定法により測定する用量）のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲ、すなわち実施例１ｆにおけるヒト被験者を処置するための最高用量をＩＶ投与した。動物をベクター投与後第３日、第１４日、第９０日及び第１８０日に体内分布評価のため剖検した。血液に加え２０種類の器官を回収した。器官中のベクターゲノムの分布を、回収した全ゲノムＤＮＡの定量的高感度ＰＣＲ分析により評価した。各組織の１個のサンプルは、ＰＣＲアッセイ反応の妥当性を評価するため、既知量のベクター配列を含む対照ＤＮＡの添加を含んだ。

肝中のベクターＧＣ数は他の器官／組織中より肝中で実質的により高く、それはＡＡＶ８キャプシドの高い肝指向性と矛盾しない。例えば、肝中のベクターゲノムコピーは、第９０日にいずれかの他の組織で見出したものより最低１００倍より多かった。最初の３つの時点でオス又はメスマウスの間に有意の差違は存在しなかった。ＧＣ数は第９０日までに肝中で経時的に減少し、そこでＧＣ数はその後安定した。減少という類似の傾向は全部の組織で観察されたが、しかしベクターコピー数の減少はより高い細胞回転率を伴う組織中でより迅速であった。低いがしかし検出可能なレベルのベクターゲノムコピーが双方の性の生殖腺及び脳中に存在した。

ＤＫＯマウスにおけるＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの体内分布はＡＡＶ８を用いた報告した結果と矛盾しない。肝は静脈内（ＩＶ）注入後の遺伝子導入の標的主要標的であり、及び肝中のゲノムコピーは経時的に有意に減少しない。他の器官をベクター送達のため標的化するとはいえ、これら肝以外の組織中の遺伝子導入のレベルは実質的により低く、経時的に減少する。従って、ここに提示するデータは、評価するべき主要器官系が肝であることを示唆する。

７．１１．非臨床安全性試験からの結論
アカゲザル及びＤＫＯマウスの試験は、高用量ベクターが、ＮＨＰにおいてトランスアミナーゼの一過性上昇と、マウスにおける軽度の胆管及び類洞細胞過形成の一過性の出現とにより明らかな、低レベル、一過性かつ無症候性の肝の病態と関連することを確認した。前記ベクターによることを感じる他の毒性は観察しなかった。

サルにおいて１．２５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ及びＤＫＯマウスにおいて６×１０^１３ＧＣ／ｋｇと同じくらい高い用量で観察されるＤＬＴは存在しなかった。ＮＯＡＥＬの決定は、主にサルにおけるトランスアミナーゼの上昇と、ＤＫＯマウスにおける組織病理学とを反映する肝毒性に集中する。これは、サルにおいて１．２５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ未満、ＤＫＯマウスにおいて６×１０^１３ＧＣ／ｋｇ未満しかし７．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇを超えるＮＯＡＥＬにつながる。前記用量はｏｑＰＣＲ力価測定法に基づいた。

７．１２．ヒト処置を裏付けるための非臨床データの全体的評価
臨床試験のための用量選択及びデザインの情報を与えた薬理及び毒性試験から得られた重要な知見は以下のとおりである：
・最小有効量（ＭＥＤ）：ＭＥＤは、血清コレステロールの３０％低下をもたらしたＧＣ／ｋｇ用量と非臨床試験で定義された。２件のＩＮＤを可能にする非臨床試験が、ＭＥＤが１．５ないし５．０×１０^１１ＧＣ／ｋｇの間であることを確立した。マウスの薬理／毒性試験は、ＰＢＳ対照に関して最低３０％の血清コレステロールの統計学的に有意の低下を示し、７．５×１０^１１ＧＣ／ｋｇ以下のＭＥＤの推定を可能にする。観察した用量反応関係は、ｏｑＰＣＲにより測定する１．５ないし５．０×１０^１１ＧＣ／ｋｇの間であることのＭＥＤの決定を可能にした。
・最大耐用量（ＭＴＤ）：ＭＴＤは、用量制限毒性（ＤＬＴ）をもたらさなかったＧＣ／ｋｇ用量と非臨床試験で定義された。ＤＬＴは、ｏｑＰＣＲにより測定されるＤＫＯマウスにおいて６．０×１０^１３ＧＣ／ｋｇと、サルにおいて１．２５×１０^１３ＧＣ／ｋｇという試験された最高用量での毒性試験で観察されなかった。われわれの結果は、実際のＭＴＤがこれら用量より高いことを示唆した。
・無毒性量（ＮＯＡＥＬ）：これはＤＫＯマウスにおいて７．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇであることが決定された。これは、より高用量のヒトＬＤＬＲ（ｈＬＤＬＲ）トランスジーンで観察された、主に肝における最低限ないし軽度の組織病理学的所見（胆管及び類洞細胞過形成、最低限の壊死）に基づいた。１種類の用量のみサルで試験されたが、１．２５×１０^１３ＧＣ／ｋｇでの毒性は軽度であり、ＡＳＴ及びＡＬＴの一過性かつ低レベルの増加を含み、真のＮＯＡＥＬは試験した用量より低い用量で達成するであろうことを示唆する。

これらデータに基づき、われわれは２種類の用量：２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇの単回投与又は７．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇの単回投与（ｏｑＰＣＲ力価測定法に基づく用量）に到達した。臨床で試験することを提案する最高用量は、サル毒性試験で試験した最高用量より低く、ＤＫＯマウスで試験した最高用量より８倍より低いが、それらのいずれもＭＴＤであるとみなされなかった。ＭＥＤより最低５倍高い用量を提案し、低用量コホートに参加する患者が若干の利益を潜在的に得ることができるであろうことを示唆する。前記より低い用量はまた、ＤＫＯマウスにおけるＮＯＡＥＬ用量よりおよそ３倍低く、サルで試験した用量より５倍低い。

８．実施例３：ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの製造
ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲベクターはＡＡＶベクター有効成分及び製剤緩衝液からなる。外的ＡＡＶベクター成分は、１：１：１８の比の６０コピーの３種のＡＡＶウイルスタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３からなる血清型８、Ｔ＝１の正二十面体キャプシドである。前記キャプシドは１本鎖ＤＮＡ組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターゲノムを含む（図７）。前記ゲノムは、２個のＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）に挟まれたヒト低比重リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）トランスジーンを含む。エンハンサー、プロモーター、イントロン、ヒトＬＤＬＲコーディング配列及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを、前記ヒトＬＤＬＲトランスジーンは含む。前記ＩＴＲはベクター産生中にゲノムの複製及びパッケージングを司る遺伝要素であり、ｒＡＡＶを生成するのに必要とする唯一のウイルスシスエレメントである。ヒトＬＤＬＲコーディング配列の発現は肝細胞特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターから駆動する。２コピーのα１ミクログロブリン／ビクニンエンハンサーエレメントが、プロモーター活性を刺激するためにＴＢＧプロモーターの上流に配置される。キメライントロンが発現をさらに高めるために存在し、ウサギβグロビンポリＡシグナルを、ヒトＬＤＬＲ ｍＲＮＡ転写物の終止を媒介するために含む。前記ベクターは製剤緩衝液中のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲベクターの懸濁液として供給する。製剤緩衝液は１８０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、
０．００１％ポロクサマー１８８、ｐＨ７．３である。

ベクター製造及びベクターの特徴付けの詳細を以下の節に説明する。

８．１．ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲを製造するのに使用するプラスミド
ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの製造のため使用するプラスミドは以下のとおりである：

８．１．１ シスプラスミド（ベクターゲノム発現構築物）：
ヒトＬＤＬＲ発現カセットを含むｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲ．ＲＢＧ．ＫａｎＲ（図８）。本プラスミドはｒＡＡＶベクターゲノムをコードする。前記発現カセットのポリＡシグナルはウサギβグロビン遺伝子由来である。２コピーのα１ミクログロブリン／ビクニンエンハンサーエレメントがＴＢＧプロモーターの上流に配置される。

ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲの製造のため使用するシスプラスミドを作成するため、ヒトＬＤＬＲ ｃＤＮＡを、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む構築物ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＴＢＧ．ＰＩ中にクローン化して、ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲ．ＲＢＧを作出した。ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＴＢＧ．ＰＩ中のプラスミドバックボーンは、元はｐＫＳＳに基づく１プラスミドｐＺａｃ２．１由来であった。ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲ．ＲＢＧ中のアンピシリン耐性遺伝子を切り出し、カナマイシン遺伝子で置換してｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲ．ＲＢＧ．ＫａｎＲを作出した。ヒトＬＤＬＲ ｃＤＮＡの発現はキメライントロン（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州マディソン）を伴うＴＢＧプロモーターから駆動する。発現カセットのポリＡシグナルはウサギβグロビン遺伝子由来である。２コピーのα１ミクログロブリン／ビクニンエンハンサーエレメントがＴＢＧプロモーターの上流に配置される。

配列要素の説明
１．末端逆位配列（ＩＴＲ）：ＡＡＶ ＩＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ ＃ＮＣ００１４０１）は、両端で同一であるがしかし逆の配向の配列である。ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ及びアデノウイルス（ａｄ）ヘルパー機能をトランスで提供する場合にベクターＤＮＡ複製開始点及びベクターゲノムのパッケージングシグナルの双方として機能する。であるから、ＩＴＲ配列はベクターゲノム複製及びパッケージングに必要なシスに作用する唯一の配列を表す。
２．ヒトα１ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー（２コピー；０．１Ｋｂ）；Ｇｅｎｂａｎｋ ＃Ｘ６７０８２）この肝特異的エンハンサーエレメントは肝特異性を与え、ＴＢＧプロモーターからの発現を高めるようにはたらく。
３．ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター（０．４６Ｋｂ；Ｇｅｎ ｂａｎｋ ＃Ｌ１３４７０）この肝細胞特異的プロモーターがヒトＬＤＬＲコーディング配列の発現を駆動する
４．ヒトＬＤＬＲ ｃＤＮＡ（２．５８Ｋｂ；Ｇｅｎｂａｎｋ ＃ＮＭ０００５２７、完全なＣＤＳ）。本ヒトＬＤＬＲ ｃＤＮＡは、９５ｋＤの予測分子量及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる１３０ｋＤの見かけの分子量を有するアミノ酸８６０個の低比重リポタンパク質受容体をコードする。
５．キメライントロン（０．１３Ｋｂ；Ｇｅｎｂａｎｋ ＃Ｕ４７１２１；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州マディソン）本キメライントロンは、ヒトβグロビン遺伝子の第１イントロン由来の５’ドナー部位と、免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のリーダーと本体の間に配置するイントロン由来の分枝及び３’アクセプター部位とからなる。発現カセット中のイントロンの存在は核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送を促進することが示しており、従って翻訳のためのｍＲＮＡの定常レベルの蓄積を高める。これは高レベルの遺伝子発現を媒介することを意図している遺伝子ベクター中の共通の
特徴である。
６．ウサギβグロビンポリアデニル化シグナル（０．１３Ｋｂ；ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｖ００８８２．１）ウサギβグロビンポリアデニル化シグナルは抗体ｍＲＮＡの効率的ポリアデニル化のためのシス配列を提供する。本エレメントは、転写終止、新生転写物の３’端の特異的切断事象、次いで長いポリアデニル尾の付加のためのシグナルとして機能する。

８．１．２ トランスプラミド（パッケージング構築物）：ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子を含むｐＡＡＶ２／８（Ｋａｎ）（図９）。
ＡＡＶ８トランスプラミドｐＡＡＶ２／８（Ｋａｎ）は、ＡＡＶ２複製酵素（ｒｅｐ）遺伝子と、ビリオンタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードするＡＡＶ８キャプシド（ｃａｐ）遺伝子とを発現する。ＡＡＶ８キャプシド遺伝子配列は、元はアカゲザルの心ＤＮＡから単離された（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＦ５１３８５２）。キメラパッケージング構築物を作出するため、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むプラスミドｐ５Ｅ１８をＸｂａＩ及びＸｈｏＩで消化してＡＡＶ２ ｃａｐ遺伝子を除去した。該ＡＡＶ２ ｃａｐ遺伝子をその後、ＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子の２．２７ＫｂのＳｐｅＩ／ＸｈｏＩ ＰＣＲフラグメントで置換してプラスミドｐ５Ｅ１８ＶＤ２／８（図９ａ）を作出した。通常ｒｅｐ発現を駆動するＡＡＶ ｐ５プロモーターを、本構築物中でｒｅｐ遺伝子の５’端からｃａｐ遺伝子の３’端に再配置する。この配置はベクター収量を増大させるためｒｅｐの発現を下向き調節するようにはたらく。ｐ５Ｅ１８中のプラスミドバックボーンはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ由来である。最終段階として、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置換してｐＡＡＶ２／８（Ｋａｎ）（図９Ｂ）を作出した。ｐＡＡＶ２／８（Ｋａｎ）トランスプラミド全体は直接配列決定により確認されている。

８．１．３ アデノウイルスヘルパープラスミド：ｐＡｄΔＦ６（Ｋａｎ）
プラスミドｐＡｄΔＦ６（Ｋａｎ）はサイズが１５．７Ｋｂであり、ＡＡＶ複製に重要なアデノウイルスゲノムの領域すなわちＥ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡを含む。ｐＡｄΔＦ６（Ｋａｎ）はいかなる追加のアデノウイルス複製又は構造遺伝子もコードせず、複製のために必要であるアデノウイルスＩＴＲのようなシスエレメントを含まず、従って感染性アデノウイルスを産生することは期待されない。アデノウイルスＥ１の必須の遺伝子機能はｒＡＡＶベクターが産生するＨＥＫ２９３細胞により供給される。ｐＡｄΔＦ６（Ｋａｎ）はＡｄ５のＥ１、Ｅ３欠失分子クローン（ｐＢＨＧ１０、ｐＢＲ３２２に基づくプラスミド）由来であった。欠失をＡｄ５ ＤＮＡ中に導入して、不要なアデノウイルスコーディング領域を除去し、得られたａｄヘルパープラスミド中のアデノウイルスＤＮＡの量を３２Ｋｂから１２Ｋｂまで減らした。最後に、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置換してｐＡｄΔＦ６（Ｋａｎ）（図１０）を作出した。ＤＮＡプラスミド配列決定をＱｉａｇｅｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ドイツにより実施し、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）の参照配列と以下のアデノウイルスエレメント：ｐ１７０７ＦＨ−Ｑ：Ｅ４ ＯＲＦ６ ３．６９−２．８１Ｋｂ；Ｅ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質 １１．８−１０．２Ｋｂ；ＶＡ ＲＮＡ領域 １２．４−１３．４Ｋｂの間の１００％相同性を示した。

上に説明したシス、トランス及びａｄヘルパープラスミドのそれぞれはカナマイシン耐性カセットを含み、従ってβ−ラクタム抗生物質はそれらの製造において使用されない。

８．１．４ プラスミド製造
ベクターの製造のため使用する全部のプラスミドがＰｕｒｅｓｙｎ Ｉｎｃ．（ペンシルバニア州モルバーン）により製造された。前記方法で使用する全部の増殖培地は動物質を含まない。醗酵フラスコ、容器、メンブレン、樹脂、カラム、チューブ、及びプラスミ
ドと接触するいかなる成分も含む、前記方法で使用する全部の部品は、単一プラスミド専用であり、ＢＳＥフリー（ＢＳＥ−ｆｒｅｅ）と証明されている。共有する部品は存在せず、使い捨て用品を適切な場合は使用する。

８．２．細胞バンク
ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲベクターは、完全に特徴付けられたマスター細胞バンク由来のＨＥＫ２９３作業細胞バンクから製造された。双方の細胞バンクの製造及び試験の詳細が以下に示される。

８．２．１ ＨＥＫ２９３マスター細胞バンク
ＨＥＫ２９３マスター細胞バンク（ＭＣＢ）は初代ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ）２９３の派生物である。ＨＥＫ２９３細胞株は剪断されたヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）ＤＮＡにより形質転換された永久株である（Ｇｒａｈａｍら、１９７７、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３６（１）：５９−７２）。ＨＥＫ２９３ＭＣＢは微生物及びウイルス汚染について広範囲に試験されている。ＨＥＫ２９３ＭＣＢは現在液体窒素中で保存されている。追加の試験を、ヒト、サル、ウシ及びブタ起源の特定の病原体の非存在を示すためＨＥＫ２９３ＭＣＢで実施した。ＨＥＫ２９３ＭＣＢのヒト起源をイソ酵素分析により示した。

腫瘍原性試験もまた、細胞懸濁液の皮下注入後のヌード（ｎｕ／ｎｕ）無胸腺マウスにおける腫瘍形成を評価することによりＨＥＫ２９３ＭＣＢで実施した。本試験において、線維肉腫が１０匹の陽性対照マウスの１０匹において注入部位で診断され、癌腫を１０匹の試験薬剤マウスの１０匹において注入部位で診断された。新生物は陰性対照マウスのいずれでも診断されなかった。ＨＥＫ２９３ＭＣＢ Ｌ／Ｎ ３００６−１０５６７９はブタサーコウイルス（ＰＣＶ）１及び２型の存在についてもまた試験された。前記ＭＣＢはＰＣＶ１及び２型について陰性であった。

８．２．２ ＨＥＫ２９３作業細胞バンク
ＨＥＫ２９３作業細胞バンク（ＷＣＢ）は、欧州薬局方モノグラフに従って適合性について証明されたニュージーランド起源のウシ胎児血清すなわちＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＰＮ ＳＨ３０４０６．０２）を使用して製造された。前記ＨＥＫ２９３ＷＣＢは種物質として１バイアル（１ｍＬ）のＭＣＢを使用して樹立された。特徴付け試験を実施し、試験結果を表４．１に列挙する。

８．３．ベクター製造
ベクター製造方法の全般的説明を以下に示し、また図１１中の流れ図にも反映される。

８．３．１ ベクター生成工程（上流工程）
８．３．１．１ Ｔ−フラスコ（７５ｃｍ^２）中へのＨＥＫ２９３ＷＣＢ細胞培養の開始
１ｍＬ中に１０^７個の細胞を含むＷＢＣからのＨＥＫ２９３細胞の１バイアルを３７℃で融解し、１０％ウシ胎児血清補充したＤＭＥＭ高グルコース（ＤＭＥＭ ＨＧ／１０％ＦＢＳ）を含む７５ｃｍ^２組織培養フラスコ中に播種する。細胞をその後３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中に置き、細胞増殖を評価するための毎日の直接の視覚的及び顕微鏡検査を伴い約７０％コンフルエンスまで増殖させる。これら細胞を継代１と呼称し、以下に説明するとおり約１０週までの間ベクター生合成のための細胞種列（ｃｅｌｌ ｓｅｅｄ ｔｒａｉｎ）を生成するため継代する。継代数を各継代で記録し、細胞を継代２０後に中止する。追加の細胞をベクター生合成のため必要とする場合は、新たなＨＥＫ２９３細胞種列をＨＥＫ２９３ＷＣＢの別のバイアルから開始する。

８．３．１．２ 約２個のＴ−フラスコ（２２５ｃｍ^２）中への細胞の継代
Ｔ７５フラスコ中で増殖するＨＥＫ２９３細胞が約７０％コンフルエントとなる場合に、細胞を組換えトリプシン（ＴｒｙｐＬＥ）を使用してフラスコの表面からはがし、ＤＭＥＭ ＨＧ／１０％ＦＢＳを含む２個のＴ２２５フラスコ中に播種する。細胞をインキュベーター中に置き約７０％コンフルエンスまで増殖させる。細胞を、目視検査により及び顕微鏡を使用して細胞増殖、汚染の非存在及び一貫性について監視する。

８．３．１．３ 約１０個のＴ−フラスコ（２２５ｃｍ^２）中への細胞の継代
２個のＴ２２５フラスコ中で増殖するＨＥＫ２９３細胞が約７０％コンフルエントとなる場合に、細胞を組換えトリプシン（ＴｒｙｐＬＥ）を使用してはがし、ＤＭＥＭ ＨＧ／１０％ＦＢＳを含む１０個の２２５ｃｍ２Ｔ−フラスコ中でフラスコあたり約３×１０^６個の細胞の比重で播種する。細胞を３７℃／５％ＣＯ_２インキュベーター中に置き、約７０％コンフルエンスまで増殖させる。細胞を、直接目視検査により及び顕微鏡を使用して細胞増殖、汚染の非存在及び一貫性について監視する。細胞を、細胞種列を維持し及び後のベクターバッチの製造を支援するための増殖のための細胞を提供するためにＴ２２５フラスコ中で連続継代することにより維持する。

８．３．１．４ 約１０個のローラーボトル中への細胞の継代
１０個のＴ２２５フラスコ中で増殖するＨＥＫ２９３細胞が約７０％コンフルエントとなる場合に、細胞を組換えトリプシン（ＴｒｙｐＬＥ）を使用してはがし、計数し、ＤＭＥＭ ＨＧ／１０％ＦＢＳを含む８５０ｃｍ^２ローラーボトル（ＲＢ）中に播種する。ＲＢをその後ＲＢインキュベーター中に置き、細胞を約７０％コンフルエンスまで増殖させる。ＲＢを、直接目視検査により及び顕微鏡を使用して細胞増殖、汚染の非存在及び一貫性について監視する。

８．３．１．５ 約１００個のローラーボトル中への細胞の継代
前の工程段階で説明したとおり製造したＲＢ中で増殖するＨＥＫ２９３細胞が約７０％コンフルエントとなる場合に、それらを組換えトリプシン（ＴｒｙｐＬＥ）を使用してはがし、計数し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳを含む１００個のＲＢ中に播種する。ＲＢをその後ＲＢインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中に置き、約７０％コンフルエンスまで増殖させる。細胞を、直接目視検査により及び顕微鏡を使用して細胞増殖、汚染の非存在及び一貫性について監視する。

８．３．１．６ プラスミドＤＮＡでの細胞のトランスフェクション
１００個のＲＢ中で増殖するＨＥＫ２９３細胞が約７０％コンフルエントとなる場合に、細胞を３種のプラスミド：ＡＡＶ血清型特異的パッケージング（トランス）プラスミド、ａｄヘルパープラスミド、及びＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）により隣接しているヒトＬＤＬＲ遺伝子の発現カセットを含むベクターシスプラスミのそれぞれでトランスフェクトする。トランスフェクションはリン酸カルシウム法を使用して実施する（プラスミドの詳細については第４．１．１節を参照されたい）。ＲＢをＲＢインキュベーター（３７℃
、５％ＣＯ_２）中に一夜置く。

８．３．１．７．無血清培地への培地交換
トランスフェクション後の１００個のＲＢの一夜インキュベーション後に、トランスフェクション試薬を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地を吸引により各ＲＢから除去し、ＤＭＥＭ−ＨＧ（ＦＢＳを含まない）で置換する。ＲＢをＲＢインキュベーターに戻し、回収するまで３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートする。

８．３．１．８．ベクター回収
ＲＢをインキュベーターから取り出し、トランスフェクションの証拠（細胞形態のトランスフェクションが誘発する変化、細胞単層の剥離）及び汚染のいずれかの証拠について検査する。細胞を各ＲＢの撹拌によりＲＢ表面からはがし、その後ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ容器（ＢＰＣ）に接続した無菌使い捨て漏斗中にデカンテーションすることにより回収する。ＢＰＣ中の混合された回収物質に「Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ：Ｃｒｕｄｅ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔ（生成物中間体：粗細胞回収物）」と表示し、サンプルを（１）工程内バイオバーデン試験並びに（２）バイオバーデン、マイコプラズマ、外来性物質生成物放出試験のため採取する。粗細胞回収物（ＣＨ）と表示する前記生成物中間体バッチはさらに処理するまで２〜８℃で保存する。

８．３．２ ベクター精製工程（下流工程）
共通の「プラットフォーム」精製工程をＡＡＶ血清型の全部について使用する（すなわち段階の同一の連続及び順序を取り入れる）一方、各血清型は、クロマトグラフィー段階の独特の条件、すなわちクロマトグラフィー樹脂に適用する澄明にした細胞ライセートを調製するために使用する段階のいくつかの詳細（緩衝液組成及びｐＨ）にもまた影響する要件を必要とする。

８．３．２．１ ＡＡＶ８ベクター回収物の濃縮及びＴＦＦによる透析濾過
粗ＣＨを含むＢＰＣを、リン酸緩衝生理食塩水で平衡化した中空ファイバー（１００ｋ
ＭＷカットオフ）ＴＦＦ装置の消毒されたリザーバの入口に接続する。粗ＣＨは蠕動ポンプを使用してＴＦＦ装置に適用し、１〜２Ｌに濃縮する。ベクターを保持する（保持液）一方、小分子量部分及び緩衝剤はＴＦＦフィルター孔を通過し及び廃棄する。回収物をその後ＡＡＶ８透析濾過緩衝液を使用して透析濾過する。透析濾過後に、濃縮したベクターを５ＬのＢＰＣ中に回収する。前記物質に「Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ：Ｐｏｓｔ Ｈａｒｖｅｓｔ ＴＦＦ（生成物中間体：回収物ＴＦＦ後）」と表示し、サンプルを工程内バイオバーデン試験のため採取する。濃縮した回収物を速やかにさらに処理するか、又はさらなる処理まで２〜８Ｃで保存する。

８．３．２．２ 回収の微小流動化及びヌクレアーゼ消化
濃縮かつ透析濾過した回収物を、微小流動化を使用して無傷のＨＥＫ２９３細胞を壊して開ける（ｂｒｅａｋ ｏｐｅｎ）剪断にかける。マイクロフルイダイザーは各使用後に１Ｎ ＮａＯＨで最低１ｈの間消毒し、次の運転まで２０％エチルアルコール中に保存し、各使用前にＷＦＩですすぐ。ＢＰＣ中に含む粗ベクターをマイクロフルイダイザーの消毒した入口に取り付け、無菌の空ＢＰＣを出口に取り付ける。マイクロフルイダイザーにより生成する空気圧を使用して、ベクターを含む細胞を、マイクロフルイダイザー相互作用チャンバー（回旋状の３００μｍ直径の経路）を通過させて細胞を溶解しベクターを放出させる。微小流動化工程を反復して細胞の完全な溶解及びベクターの高回収を確保する。マイクロフルイダイザーの生成物中間体の反復通過後に、流路を約５００ｍＬのＡＡＶ８ベンゾナーゼ緩衝液ですすぐ。微小流動化したベクターを含む５ＬのＢＰＣをマイクロフルイダイザーの出口から取りはずす。前記物質は「Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ：Ｆｉｎａｌ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｄ（生成物中間体：最終微小流動化
済み）」と表示し、サンプルを工程内バイオバーデン試験のため採取する。微小流動化した生成物中間体は速やかにさらに処理するか、又はさらなる処理まで２〜８℃で保存する。核酸不純物を１００Ｕ／ｍＬ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）の添加によりＡＡＶ８粒子から除去する。ＢＰＣの内容物を混合し、室温で最低１時間インキュベートする。ヌクレアーゼ消化した生成物中間体をさらに処理する。

８．３．２．３ 微小流動化した中間体の濾過
微小流動化及び消化した生成物中間体を含むＢＰＣを、３μｍで開始し０．４５μｍまで行く勾配孔径を伴うカートリッジフィルターに接続する。前記フィルターをＡＡＶベンゾナーゼ緩衝液で調整する。蠕動ポンプを使用して、微小流動化した生成物中間体はカートリッジフィルターを通過し、フィルター出口に接続したＢＰＣ中に回収する。無菌ＡＡＶ８ベンゾナーゼ緩衝液はフィルターカートリッジを通してポンプで送りフィルターをすすぐ。濾過した生成物中間体をその後、ＡＡＶ８ベンゾナーゼ緩衝液で調整した０．２μｍ最終孔径のカプセルフィルターに接続する。蠕動ポンプを使用して、濾過した中間体にカートリッジフィルターを通過させ、フィルター出口に接続したＢＰＣ中に回収する。ある容積の無菌ＡＡＶ８ベンゾナーゼ緩衝液をフィルターカートリッジを通してポンプで送りフィルターをすすぐ。前記物質に「Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ：Ｐｏｓｔ ＭＦ ０．２μｍ Ｆｉｌｔｅｒｅｄ（生成物中間体：ＭＦ後０．２μｍ濾過済み）」と表示し、サンプルを工程内バイオバーデン試験のため採取する。前記物質をさらなる処理まで２〜８℃で一夜保存する。追加の濾過段階を、澄明にした細胞ライセートのクロマトグラフィーカラムへの適用前にクロマトグラフィーの日に実施する場合がある。

８．３．２．４ 陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製
０．２μｍ濾過した生成物中間体を、希釈緩衝液ＡＡＶ８を添加することによりＮａＣｌ濃度について調節する。ベクターを含む細胞ライセートを、次に、イオン交換樹脂を使用するイオン交換クロマトグラフィーにより精製する。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＡＫＴＡ Ｐｉｌｏｔクロマトグラフィー系に、およそ１Ｌの樹脂床容量を含むＢＰＧカラムを取り付ける。前記カラムは連続流条件を使用して充填し、確立した非対称仕様を満たす。前記系を確立したプロトコルに従って消毒し、次の運転まで２０％エチルアルコール中で保存する。使用直前に前記系を無菌ＡＡＶ８洗浄緩衝液で平衡化する。無菌技術並びに無菌物質及び部品を使用して、澄明にした細胞ライセートを含むＢＰＣを消毒したサンプル入口に接続し、以下に列挙するバイオプロセシング緩衝液を含むＢＰＣをＡＫＴＡ Ｐｉｌｏｔの消毒した入口に接続する。クロマトグラフィー処置中の全部の接続は無菌的に実施する。澄明にした細胞ライセートをカラムに適用し、ＡＡＶ８洗浄緩衝液を使用してすすぐ。これら条件下でベクターはカラムに結合し、不純物を樹脂からすすぐ。ＡＡＶ８粒子を、ＡＡＶ８溶離緩衝液の適用によりカラムから溶離し無菌プラスチック製ボトル中に回収する。前記物質に「Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ（生成物中間体）と表示し、サンプルを工程内バイオバーデン試験のため採取する。前記物質を速やかにさらに処理する。

８．３．２．５ ＣｓＣｌ勾配超遠心分離法による精製
上に説明した陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製したＡＡＶ８粒子は空のキャプシド及び他の生成物関連不純物を含む。空のキャプシドは塩化セシウム勾配超遠心分離法によりベクター粒子から分離する。無菌技術を使用して、塩化セシウムを、１．３５ｇ／ｍＬの比重に対応する最終濃度まで穏やかに混合しつつベクター「Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ（生成物中間体）」に添加する。前記溶液を０．２μｍフィルターで濾過し、超遠心管中に分配し、Ｔｉ５０ローター中１５℃でおよそ２４ｈ超遠心分離にかける。遠心分離後に管をローターから取り出し、Ｓｅｐｔｉｈｏｌで拭い、ＢＳＣ中に運ぶ。各管をスタンドにクランプ止めし、バンドの可視化を補助するため集光照射にかける。２本の主要なバンドを典型的に観察し、上のバンドは空のキャプシドに対応
し、下のバンドはベクター粒子に対応する。下のバンドを無菌シリンジに取り付けた無菌針で各管から回収する。各管から回収したベクターを合わせ、サンプルを工程内バイオバーデン、エンドトキシン及びベクター力価のため採取する。プールされた物質を、「Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ：Ｐｏｓｔ ＣｓＣｌ Ｇｒａｄｉｅｎｔ（生成物中間体：ＣｓＣｌ勾配後）」と表示した無菌５０ｍＬポリプロピレン製コニカルチューブ中に分配し、次の工程段階まで−８０℃で速やかに保存する。

８．３．２．６ 接線流濾過による緩衝液交換
プールするための試験及び放出後に、ＣｓＣｌバンド形成工程段階により精製したベクターのバッチを合体し、ＴＦＦによる透析濾過にかけてバルクベクターを製造する。個別のバッチから得られるサンプルの力価測定に基づき、プールされたベクターの容量を、計算した容量の無菌透析濾過緩衝液を使用して調節する。利用可能な容量に依存して、プールされた濃度調節したベクターのアリコートを、単回使用ＴＦＦ装置を用いるＴＦＦにかける。装置は使用前に消毒し、その後透析濾過緩衝液で平衡化する。透析濾過工程が一旦完了すれば、ベクターをＴＦＦ装置から無菌ボトル中に回収する。前記物質は「Ｐｒｅ−０．２μｍ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｂｕｌｋ（０．２μｍ濾過前バルク）」と表示する。前記物質を速やかにさらに処理する。

８．３．２．７ バルクベクターを製造するための配合及び０．２μｍ濾過
個別のＴＦＦ単位により調製されたバッチをプールし、５００ｍＬ無菌ボトル中でおだやかに旋回することにより混合する。プールされた物質にその後０．２２μｍフィルターを通過させてバルクベクターを製造する。プールされた物質をバルクベクター及び予備のＱＣ試験のためサンプリングし、その後無菌５０ｍＬポリプロピレン製管中に分注し、「Ｂｕｌｋ Ｖｅｃｔｏｒ（バルクベクター）」と表示し、次の段階まで−８０℃で保存する。

８．４ ベクターの試験
血清型同一性、空の粒子の内容物及びトランスジーン産物の同一性を含む特徴づけアッセイを実施する。全部のアッセイの説明が以下に現れる。

８．４．１ ゲノムコピー（ＧＣ）力価
最適化した定量的ＰＣＲ（ｏｑＰＣＲ）アッセイを使用して、同族プラスミド標準との比較によりゲノムコピー力価を決定する。ｏｑＰＣＲアッセイは、ＤＮアーゼＩ及びプロテイナーゼＫでの連続消化、次いで被包化したベクターのゲノムコピーを測定するためのｑＰＣＲ分析を利用する。ＤＮＡ検出は、この同一領域にハイブリダイズする蛍光タグを付けたプローブと、ＲＢＧポリＡ領域を標的とする配列特異的プライマーとの組み合わせを使用して遂行する。プラスミドＤＮＡ標準曲線との比較は、いかなるＰＣＲ後サンプル操作の必要も伴わない力価決定を可能にする。多数の標準、検証サンプル並びに対照（バックグラウンド及びＤＮＡ汚染について）は前記アッセイに導入されている。本アッセイは、感度、検出限界、適格性範囲、並びにアッセイ内及び間の精度を含むアッセイパラメータを確立及び定義することにより適格化されている。内部ＡＡＶ８参照ロットを確立し、適格性試験を実施するために使用した。

８．４．２ 効力アッセイ
ｉｎ ｖｉｖｏ効力アッセイを、ＨｏＦＨの二重ノックアウト（ＤＫＯ）ＬＤＬＲ−／−Ａｐｏｂｅｃ−／−マウスモデルの血清中の総コレステロールレベルのヒトＬＤＬＲベクター媒介する低下を検出するよう設計した。前記ｉｎ ｖｉｖｏ効力アッセイの開発の基礎は第４．３．５．１１節に説明している。ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲベクターの効力を確認するため、６〜２０週齢ＤＫＯマウスに、マウスあたり５×１０^１１ＧＣ／ｋｇのＰＢＳで希釈したベクターを静脈内（ＩＶ）（尾静脈を介して）注入する。動物は後
眼窩出血により採血し、血清総コレステロールレベルを投与前及び後（第１４及び３０日）にＡｎｔｅｃｈ ＧＬＰにより評価する。ベクター投与した動物における総コレステロールレベルは、この用量のベクター投与を用いる以前の経験に基づき第１４日までにベースラインの２５％〜７５％減少することが期待される。マウス投与あたり５×１０^１１ＧＣ／ｋｇを、安定性試験の経過にわたるベクター効力の変化の評価を可能にするであろう総コレステロール低下の予期される範囲に基づき、臨床アッセイのため選んだ。

８．４．３ ベクターキャプシドの同一性：ＶＰ３のＡＡＶキャプシド質量分析
前記ベクターのＡＡＶ２／８血清型の確認を、質量分析（ＭＳ）によるＶＰ３キャプシドタンパク質のペプチドの分析に基づくアッセイにより達成する。前記方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出したＶＰ３タンパク質バンドの多酵素消化（トリプシン、キモトリプシン及びエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）、次いでキャプシドタンパク質を配列決定するためのＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計でのＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳでの特徴づけを含む。質量スペクトルからのある種の汚染物タンパク質及び派生するペプチドの配列の同定を可能にするタンデム質量スペクトル（ＭＳ）法を開発した。

８．４．４ 空の粒子対中身のつまった（Ｆｕｌｌ）粒子の比
分析的超遠心機中で測定される分析的超遠心分離（ＡＵＣ）沈降速度を使用するベクター粒子プロファイルは、巨大分子構造の不均一性、コンホメーションの差違及び会合又は凝集の状態についての情報を得るための優れた方法である。サンプルをセル中に負荷し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｅｌａｂ ＸＬ−Ｉ分析的超遠心機中１２０００ＲＰＭで沈降させた。屈折率スキャンを２分ごとに３．３時間記録した。データは、ｃ（ｓ）モデル（Ｓｅｄｆｉｔプログラム）、及び正規化したｃ（ｓ）値に対しプロットした沈降係数計算値により解析される。単量体ベクターを表す主ピークを観察するはずである。主要単量体ピークより遅く移動するピークの出現は空の粒子／誤って集成した（ｍｉｓａｓｓｅｍｂｌｅｄ）粒子を示す。空の粒子ピークの沈降係数を空のＡＡＶ８粒子調製物を使用して確立する。主要単量体ピーク及び先行するピークの直接定量は空対中身のつまった粒子比の決定を可能にする。

８．４．５ 感染力価
感染単位（ＩＵ）アッセイを使用して、ＲＣ３２細胞（ｒｅｐ２を発現するＨｅＬａ細胞）でのベクターの生産的取り込み及び複製を測定する。簡潔には、９６ウェルプレート中のＲＣ３２細胞を、ｒＡＡＶの各希釈の１２複製物を用いるベクターの連続希釈及びＡｄ５の均一希釈により同時感染させる。感染７２時間後に細胞を溶解し、ｑＰＣＲを実施して入力に対するｒＡＡＶベクター増幅を検出する。エンドポイント希釈ＴＣＩＤ５０計算（Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ）を実施してＩＵ／ｍｌとして表現する複製力価を決定する。「感染性」値は細胞と接触する粒子、受容体結合、内部移行、核への輸送及びゲノム複製に依存するため、それらはアッセイの幾何学（ａｓｓａｙ ｇｅｏｍｅｔｒｙ）、並びに使用する細胞株中の適切な受容体及び結合後経路の存在が影響する。ＡＡＶベクター移入に決定的に重要な受容体及び結合後経路は、通常は不死化細胞株で維持されており、従って感染性アッセイの力価は存在する「感染性」粒子の数の絶対的尺度でない。しかしながら、「感染単位」に対する被包化したＧＣの比（ＧＣ／ＩＵ比として説明する）を、ロットからロットへの生成物の一貫性の尺度として使用する場合がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏのＡＡＶ８ベクターの感染性が低い可能性があるため、本ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイのばらつきは高い（３０〜６０％ＣＶ）。

８．４．６ トランスジーン発現アッセイ
トランスジーン発現を、１×１０^１０ＧＣ（５×１０^１１ＧＣ／ｋｇ）のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲベクターを投与されるＬＤＬＲ−／−Ａｐｏｂｅｃ−／−マウスから回収した肝で評価する。ベクターを３０日前に投与した動物を安楽死させ、肝を回収しＲＩ
ＰＡ緩衝液中でホモジナイズする。２５〜１００μｇの総肝ホモジェネートを４−１２％変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、ヒトＬＤＬＲに対する抗体を使用してプロービングしてトランスジーン発現を確認する。ベクターを投与しないか無関係のベクターを投与された動物を前記アッセイのための対照として使用する。ベクターで処置された動物は翻訳後修飾により９０〜１６０ｋＤａのどこかで移動するバンドを示すことをが期待される。相対発現レベルを、バンドの積分強度を定量化することにより決定する。

以下の情報を、数字見出し＜２２３＞の下でフリーテキストを含む配列について提供する。

本明細書で引用する全部の刊行物は、米国出願第６２／４６１，０１５号、２０１７年２月２０日出願、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６５９８４号、２０１６年１２月６日出願、米国仮出願第６２／２６９，４４０号、２０１５年１２月１８日出願及び米国仮出願第６２／２６６，３８３号、２０１５年１２月１１日出願がそうであるように、そっくりそのまま引用により本明細書に取り込まれる。同様に、本明細書で参照し及び付属する配列表中に現れる配列番号は引用により取り込まれる。本発明は特定の態様を参照して説明
されたが、改変は本発明の技術思想から離れることなく行われる場合があることを認識することができる。こうした改変は本明細書に付属する特許請求の範囲内にあることが意図されている。

Claims (38)

1. 家族性高コレステロール血症を有する患者におけるアフェレーシスの必要を減少させるための方法であって、
   製剤緩衝液中の複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の懸濁液を含む、ヒト被験者の末梢静脈注入に適する医薬組成物を患者に投与することを含み、
   （ａ）前記ｒＡＡＶはＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターゲノムを含み、ある核酸配列が肝特異的プロモーターに作動可能に連結しているヒトＬＤＬ受容体（ｈＬＤＬＲ）をコードし、前記ベクターゲノムはＡＡＶ８キャプシド中にパッケージングされており、
   （ｂ）前記製剤緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水及びポロクサマーの水性溶液を含み、並びに
   （ｃ）
   （ｉ）前記ｒＡＡＶのゲノムコピー（ＧＣ）力価が最低１×１０^１３ＧＣ／ｍｌであること、
   （ｉｉ）前記ｒＡＡＶがｏｑＰＣＲ又はｄｄＰＣＲにより測定される空のキャプシドを最低約９５％含まないこと、
   （ｉｉｉ）空の粒子：中身のつまった粒子の比が０：４ないし１：４の間であること、及び
   （ｉｖ）前記ｒＡＡＶ懸濁液の５×１０^１１ＧＣ／ｋｇの用量が、ホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）の二重ノックアウト（ＤＫＯ）ＬＤＬＲ−／−Ａｐｏｂｅｃ−／−マウスモデルにおいてベースラインコレステロールレベルを２５％ないし７５％低下させること、
   の１つ以上である、方法。
2. 前記患者はＡＡＶ８キャプシドに対して１：１０以下の中和抗体力価を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記患者は免疫抑制投与計画で同時処置される、請求項２に記載の方法。
4. 前記患者は、前記免疫抑制投与計画の同時処置の前に、少なくとも約１：５の中和抗体力価を有する、請求項３に記載の方法。
5. 前記患者はＡＡＶ８キャプシドに対して１：５以下の中和抗体力価を有する、請求項１に記載の方法。
6. 前記ｒＡＡＶはＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲである、請求項１に記載の方法。
7. 前記製剤緩衝液は、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸Ｎａ、０．００１％ポロクサマー１８８、ｐＨ７．３である、請求項１に記載の方法。
8. 前記組成物は、ｏｑＰＣＲ又はｄｄＰＣＲにより測定される（ａ）最低約５×１０^１１ゲノムコピー／ｋｇヒト被験者体重又は（ｂ）２．５×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇないし７．５×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇヒト被験者体重の用量の複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の懸濁液の注入により末梢静脈を介してヒト被験者に投与可能である、請求項１に記載の方法。
9. 家族性高コレステロール血症を有する患者におけるアフェレーシスの必要を減少させるのに使用するのに適する、製剤緩衝液中の複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の懸濁液を含むのに適する、医薬組成物であって、
   （ａ）前記ｒＡＡＶはＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターゲノムを含み、ある核酸配列が肝特
   異的プロモーターに作動可能に連結しているヒトＬＤＬ受容体（ｈＬＤＬＲ）をコードし、前記ベクターゲノムはＡＡＶ８キャプシド中にパッケージングされており、
   （ｂ）前記製剤緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水及びポロクサマーの水性溶液を含み、並びに
   （ｃ）
   （ｉ）前記ｒＡＡＶのゲノムコピー（ＧＣ）力価が最低１×１０^１３ＧＣ／ｍｌであること、
   （ｉｉ）前記ｒＡＡＶがｏｑＰＣＲ又はｄｄＰＣＲにより測定される空のキャプシドを最低約９５％含まないこと、
   （ｉｉｉ）空の粒子：中身のつまった粒子の比が０：４ないし１：４の間であること、及び
   （ｉｖ）前記ｒＡＡＶ懸濁液の５×１０^１１ＧＣ／ｋｇの用量が、ホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）の二重ノックアウト（ＤＫＯ）ＬＤＬＲ−／−Ａｐｏｂｅｃ−／−マウスモデルにおいてベースラインコレステロールレベルを２５％ないし７５％低下させること、
   の１つ以上である、医薬組成物。
10. 家族性高コレステロール血症を有する患者におけるアフェレーシスの必要を減少させるのに使用するのに適する、製剤緩衝液中の複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の懸濁液を含む医薬組成物の使用であって、
    （ａ）前記ｒＡＡＶはＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターゲノムを含み、ある核酸配列が肝特異的プロモーターに作動可能に連結しているヒトＬＤＬ受容体（ｈＬＤＬＲ）をコードし、前記ベクターゲノムはＡＡＶ８キャプシド中にパッケージングされており、
    （ｂ）前記製剤緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水及びポロクサマーの水性溶液を含み、並びに
    （ｃ）
    （ｉ）前記ｒＡＡＶのゲノムコピー（ＧＣ）力価が最低１×１０^１３ＧＣ／ｍｌであること、
    （ｉｉ）前記ｒＡＡＶがｏｑＰＣＲ又はｄｄＰＣＲにより測定される空のキャプシドを最低約９５％含まないこと、
    （ｉｉｉ）空の粒子：中身のつまった粒子の比が０：４ないし１：４の間であること、及び
    （ｉｖ）前記ｒＡＡＶ懸濁液の５×１０^１１ＧＣ／ｋｇの用量が、ホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）の二重ノックアウト（ＤＫＯ）ＬＤＬＲ−／−Ａｐｏｂｅｃ−／−マウスモデルにおいてベースラインコレステロールレベルを２５％ないし７５％低下させること、
    の１つ以上である、
    使用。
11. 前記患者はＡＡＶ８キャプシドに対して１：１０以下の中和抗体力価を有する、請求項９又は１０に記載の医薬組成物又は使用。
12. 前記患者は免疫抑制投与計画で同時処置される、請求項９ないし１１のいずれか１つに記載の医薬組成物又は使用。
13. 前記患者は、前記免疫抑制投与計画の同時処置の前に、少なくとも約１：５の中和抗体力価を有する、請求項９ないし１２のいずれか１つに記載の医薬組成物又は使用。
14. 前記患者はＡＡＶ８キャプシドに対して１：５以下の中和抗体力価を有する、請求項９
    ないし１２のいずれか１つに記載の医薬組成物又は使用。
15. 前記ｒＡＡＶはＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲである、請求項９ないし１２のいずれか１つに記載の医薬組成物又は使用。
16. 前記製剤緩衝液は、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸Ｎａ、０．００１％ポロクサマー１８８、ｐＨ７．３である、請求項９ないし１５のいずれか１つに記載の医薬組成物又は使用。
17. 前記組成物は、ｏｑＰＣＲ又はｄｄＰＣＲにより測定される（ａ）最低約５×１０^１１ゲノムコピー／ｋｇヒト被験者体重又は（ｂ）２．５×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇヒト被験者体重ないし７．５×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇヒト被験者体重の用量の複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の懸濁液の注入により末梢静脈を介してヒト被験者に投与可能である、請求項９ないし１６のいずれか１つに記載の医薬組成物又は使用。
18. 前記患者はホモ接合性ＦＨ（ＨｏＦＨ）と診断されている、請求項９ないし１７のいずれか１つに記載の医薬組成物又は使用。
19. 前記患者はヘテロ接合性ＦＨ（ＨｅＦＨ）と診断されている、請求項９ないし１７のいずれか１つに記載の医薬組成物又は使用。
20. ｏｑＰＣＲ又はｄｄＰＣＲにより測定される（ａ）最低約５×１０^１１ゲノムコピー／ｋｇヒト被験者体重又は（ｂ）２．５×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇないし７．５×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇヒト被験者体重の用量の複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の懸濁液の注入により末梢静脈を介してヒト被験者に投与することを含む、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）と診断されたヒト被験者におけるＰＣＳＫ９阻害剤での処置の必要を減少させる方法であって、
    （ａ）前記ｒＡＡＶはＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターゲノムを含み、ある核酸配列が肝特異的プロモーターに作動可能に連結している野生型ヒトＬＤＬ受容体（ｈＬＤＬＲ）をコードし、前記ベクターゲノムがＡＡＶ８キャプシド中にパッケージングされており、並びに
    （ｂ）前記ｒＡＡＶ懸濁液は、ＨｏＦＨの二重ノックアウトＬＤＬＲ−／−Ａｐｏｂｅｃ−／−マウスモデル（ＤＫＯマウス）に投与する５×１０^１１ＧＣ／ｋｇの用量がＤＫＯマウスにおけるベースラインコレステロールレベルを２５％ないし７５％低下させる効力を有し、並びに
    （ｃ）
    （ｉ）前記ｒＡＡＶはｏｑＰＣＲ又はｄｄＰＣＲにより測定される空のキャプシドを最低約９５％含まないこと、及び
    （ｉｉ）前記ｒＡＡＶの空の粒子：中身のつまった粒子の比が０：４ないし１：４の間であること、
    の１つ以上である、方法。
21. 前記患者はＡＡＶ８キャプシドに対して１：１０以下の中和抗体力価を有する、請求項２０に記載の方法。
22. 前記患者は免疫抑制投与計画で同時処置される、請求項２０に記載の方法。
23. 前記患者は、前記免疫抑制投与計画の同時処置の前に、少なくとも約１：５の中和抗体力価を有する、請求項２０に記載の方法。
24. 前記患者はＡＡＶ８キャプシドに対して１：５以下の中和抗体力価を有する、請求項２０に記載の方法。
25. 前記ｒＡＡＶはＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲである、請求項２０に記載の方法。
26. 前記製剤緩衝液は、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸Ｎａ、０．００１％ポロクサマー１８８、ｐＨ７．３である、請求項２０に記載の方法。
27. 前記被験者をホモ接合性ＦＨ（ＨｏＦＨ）と診断されている、請求項２０に記載の方法。
28. 前記被験者はヘテロ接合性ＦＨ（ＨｅＦＨ）と診断されている、請求項２０に記載の方法。
29. 家族性高コレステロール血症（ＦＨ）と診断されたヒト被験者におけるＰＣＳＫ９阻害剤での処置の必要を減少させるために有用な、ｏｑＰＣＲ又はｄｄＰＣＲにより測定される（ａ）最低約５×１０^１１ゲノムコピー／ｋｇヒト被験者体重又は（ｂ）２．５×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇないし７．５×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇヒト被験者体重の用量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、複製欠損ｒＡＡＶの懸濁液の注入により末梢静脈を介してヒト被験者に投与することを含み、
    （ａ）前記ｒＡＡＶはＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターゲノムを含み、ある核酸配列が肝特異的プロモーターに作動可能に連結している野生型ヒトＬＤＬ受容体（ｈＬＤＬＲ）をコードし、前記ベクターゲノムがＡＡＶ８キャプシド中にパッケージングされており、並びに
    （ｂ）前記ｒＡＡＶ懸濁液は、ＨｏＦＨの二重ノックアウトＬＤＬＲ−／−Ａｐｏｂｅｃ−／−マウスモデル（ＤＫＯマウス）に投与する５×１０^１１ＧＣ／ｋｇの用量がＤＫＯマウスにおけるベースラインコレステロールレベルを２５％ないし７５％低下させる効力を有し、並びに
    （ｃ）
    （ｉ）前記ｒＡＡＶはｏｑＰＣＲ又はｄｄＰＣＲにより測定される空のキャプシドを最低約９５％含まないこと、及び
    （ｉｉ）前記ｒＡＡＶの空の粒子：中身のつまった粒子の比が０：４ないし１：４の間であること、
    の１つ以上である、ｒＡＡＶ。
30. 家族性高コレステロール血症（ＦＨ）と診断されたヒト被験者におけるＰＣＳＫ９阻害剤での処置の必要を減少させるための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用であって、
    前記ｒＡＡＶは、ｏｑＰＣＲ又はｄｄＰＣＲにより測定される（ａ）最低約５×１０^１１ゲノムコピー／ｋｇヒト被験者体重又は（ｂ）２．５×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇないし７．５×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇヒト被験者体重の用量であって、
    複製欠損ｒＡＡＶの懸濁液の注入により末梢静脈を介してヒト被験者に投与することを含み、
    （ａ）前記ｒＡＡＶはＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターゲノムを含み、ある核酸配列が肝特異的プロモーターに作動可能に連結している野生型ヒトＬＤＬ受容体（ｈＬＤＬＲ）をコードし、前記ベクターゲノムがＡＡＶ８キャプシド中にパッケージングされており、並びに
    （ｂ）前記ｒＡＡＶ懸濁液は、ＨｏＦＨの二重ノックアウトＬＤＬＲ−／−Ａｐｏｂｅｃ
    −／−マウスモデル（ＤＫＯマウス）に投与する５×１０^１１ＧＣ／ｋｇの用量がＤＫＯマウスにおけるベースラインコレステロールレベルを２５％ないし７５％低下させる効力を有し、並びに
    （ｃ）
    （ｉ）前記ｒＡＡＶはｏｑＰＣＲ又はｄｄＰＣＲにより測定される空のキャプシドを最低約９５％含まないこと、及び
    （ｉｉ）前記ｒＡＡＶの空の粒子：中身のつまった粒子の比が０：４ないし１：４の間であること、
    の１つ以上である、
    ｒＡＡＶの使用。
31. 前記患者はＡＡＶ８キャプシドに対して１：１０以下の中和抗体力価を有する、請求項３０に記載のｒＡＡＶ又は使用。
32. 前記患者は免疫抑制投与計画で同時処置される、請求項３０又は３１に記載のｒＡＡＶ又は使用。
33. 前記患者は、前記免疫抑制投与計画の同時処置の前に、少なくとも約１：５の中和抗体力価を有する、請求項３０ないし３２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ又は使用。
34. 前記患者はＡＡＶ８キャプシドに対して１：５以下の中和抗体力価を有する、請求項３０ないし３２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ又は使用。
35. 前記ｒＡＡＶはＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲである、請求項３０ないし３４のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ又は使用。
36. 前記製剤緩衝液は、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸Ｎａ、０．００１％ポロクサマー１８８、ｐＨ７．３である、請求項３０ないし３５のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ又は使用。
37. 前記被験者をホモ接合性ＦＨ（ＨｏＦＨ）と診断されている、請求項３０ないし３６のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ又は使用。
38. 前記被験者はヘテロ接合性ＦＨ（ＨｅＦＨ）と診断されている、請求項３０ないし３６のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ又は使用。