JP2020182481A

JP2020182481A - ３−ヒドロキシプロピオン酸によって発現が誘導されるプロモーターシステム及びそれを用いた３−ヒドロキシプロピオン酸の生物学的生産方法

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Publication number: JP2020182481A
Application number: JP2020122338A
Authority: JP
Inventors: ソンフンパク; Sung-Hoon Park; シェンファンシュウ; Shengfang Zhou; アショクソマスンダル; Ashok Somasundar; ユンヒソル; Eun Hee Seol; クマルアイナラサティシュ; Kumar Ainala Satish
Original assignee: Noroo R&c Co Ltd
Current assignee: Noroo R&c Co Ltd
Priority date: 2015-06-11
Filing date: 2020-07-16
Publication date: 2020-11-12
Anticipated expiration: 2036-06-13
Also published as: EP3321364A4; CN108291231B; JP2018518199A; KR101877303B1; EP3321364A1; KR20160146588A; US20200407730A1; CN108291231A; EP3321364B1; US10808255B2; MY194187A; SG11201802922QA; US10961539B2; JP7049408B2; US20180312852A1

Abstract

【課題】３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）によって発現が誘導されるプロモーターシステム及びそれを用いた３−ヒドロキシプロピオン酸の生物学的生産方法の提供。【解決手段】３−ヒドロキシプロピオン酸またはその類似体に反応するＬｙｓＲタンパク質との結合部位を含む３−ＨＰまたはその類似体誘導性プロモーター、該誘導性プロモーターを含む組換え発現ベクター、該組換え発現ベクターで形質転換された組換え微生物及び前記組換え微生物を培養する段階を含む３−ＨＰ生産方法。【選択図】図７

Description

本発明は、３−ヒドロキシプロピオン酸によって発現が誘導されるプロモーターシステ
ム及びそれを用いた３−ヒドロキシプロピオン酸の生物学的生産方法に関する。

３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ、３
−ＨＰ）は、多様な化学工程に使われる重要な合成中間体であって、アクリル酸、アクリ
ルアミド、１，３−プロパンジオール、マロン酸などの生産に原料として使われる。また
、生分解性高分子合成にも使われる。グリセロールを用いた３−ＨＰの生物学的生産は、
さまざまなバクテリアに３−ＨＰ生産経路に必要な主要酵素の遺伝子操作を通じて成功的
になされた。具体的に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、クレブシエラ・
ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シュードモナス・デニ
トリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）などのバクテ
リアに遺伝子操作を通じたコエンザイムＢ_１２依存性酵素であるグリセロールデヒドラタ
ーゼ、グリセロールデヒドラターゼ再活性化酵素であるＤｈａＢｒｅａｃｔｉｖａｓｅ
及びＮＡＤ^＋依存性酵素であるアルデヒドデヒドロゲナーゼなどの（過）発現を通じて３
−ＨＰ生産が確認された。Ｅ．ｃｏｌｉＷＤＵＢＧＫのような幾つかの組換え菌株の
場合、４８時間の間に４０ｇ／Ｌ以上の３−ＨＰを生産することができたが、それ以上に
３−ＨＰ生産量を増加させるのに難点があった。特に、３−ＨＰ生産のための発酵時間が
持続することによって、グリセロールデヒドラターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼのよ
うな酵素が不安定になるか、活性を失ってしまうという問題点が観察された。グリセロー
ルデヒドラターゼの活性が消失される１つの重要な原因は、自殺不活性化（ｓｕｉｃｉｄ
ａｌｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）というメカニズムのためである。これは、グリセロー
ルで３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）への脱水化反応の間にグリセロ
ールデヒドラターゼの助酵素であるコエンザイムＢ_１２が非可逆的に損傷するものであっ
て、このような不活性化反応は、酸素が存在する時に促進される。最近、このメカニズム
に基づいた不活性化を緩和するために、部位特異的突然変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅ
ｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いて突然変異グリセロールデヒドラターゼを開発した
。幾つかの突然変異酵素が向上した酵素安定性を有すると確認されたが、既存の酵素と比
較した時、酵素活性が非常に減少すると観察された。

第２の原因は、反応性が高い中間体である３−ＨＰＡの毒性のためである。グリセロー
ルデヒドラターゼあるいはアルデヒドデヒドロゲナーゼは、３−ＨＰＡと共に存在する時
、３−ＨＰＡの濃度によって、その活性が減少する。アルデヒドは、リジン、システイン
、ヒスチジンにそれぞれ存在するε−アミノ基（ＮＨ３^＋）、スルフヒドリル基（−Ｃ−
ＳＨ）、イミダゾール基のようなアミノ酸残基と反応すると知られている。部位特異的突
然変異及び任意突然変異誘発を用いてアルデヒドの存在下に多くの酵素の安定性を向上さ
せるための努力がなされたが、制限的な成功にとどまった。

このような酵素不安定性問題を解決するために、細胞培養がなされる全期間の間に活性
を有する新たな酵素を継続的に合成する方案がある。不活性化される酵素の量ほど新たな
酵素を供給することができるならば、理論的に細胞内のこれら酵素活性は一定に保持する
ことができる。特に、発酵後半細胞の成長が遅くなるか、停滞し、３−ＨＰの濃度が高く
て、細胞の全体的代謝活性が低下した時点で、これら酵素を持続的に発現させることが必
要である。

本発明の目的は、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）またはその類似体に反応す
るＬｙｓＲタンパク質との結合部位を含む３−ＨＰまたはその類似体誘導性プロモーター
を提供することである。

本発明の他の目的は、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）またはその類似体に反
応するＬｙｓＲタンパク質をコーディングするｌｙｓＲ遺伝子、前記ＬｙｓＲタンパク質
との結合部位を含むプロモーター及び発現目的タンパク質をコーディングする遺伝子を含
む３−ＨＰまたはその類似体反応性組換え遺伝子発現カセットを提供することである。

前記目的を果たすために、本発明は、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）または
その類似体に反応するＬｙｓＲタンパク質との結合部位を含む３−ＨＰまたはその類似体
誘導性プロモーターを提供する。

また、本発明は、前記３−ＨＰまたはその類似体誘導性プロモーターを含む組換え発現
ベクター、前記組換え発現ベクターで形質転換された組換え微生物及び前記組換え微生物
を培養する段階を含む３−ＨＰ生産方法を提供する。

また、本発明は、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）またはその類似体に反応す
るＬｙｓＲタンパク質をコーディングするｌｙｓＲ遺伝子、前記ＬｙｓＲタンパク質との
結合部位を含むプロモーター及び発現目的タンパク質をコーディングする遺伝子を含む３
−ＨＰまたはその類似体反応性組換え遺伝子発現カセットを提供する。

また、本発明は、前記３−ＨＰまたはその類似体反応性組換え遺伝子発現カセットを含
む組換え発現ベクター、前記組換え発現ベクターで形質転換された組換え微生物、３−Ｈ
Ｐまたはその類似体反応性組換え遺伝子発現カセットが宿主細胞の染色体内に挿入されて
いる組換え微生物及び前記組換え微生物を培養する段階を含む発現目的タンパク質生産方
法を提供する。

本発明は、３−ヒドロキシプロピオン酸によって発現が誘導されるプロモーターシステ
ム及びそれを用いた３−ヒドロキシプロピオン酸の生物学的生産方法に関するものであっ
て、生物学的に３−ＨＰ生産を向上させるためには、酵素活性を有する新たな酵素を継続
的に生産することが必要であるが、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉ
ｔｒｉｆｉｃａｎｓ）を含めた多様な微生物で３−ＨＰに反応する転写調節因子とプロモ
ーターとをスクリーニングした結果、ＬｙｓＲタンパク質と、このタンパク質に結合する
特定の遺伝子塩基配列からなっているということを明らかにした。したがって、本発明に
よる３−ＨＰ誘導性システムは、３−ＨＰ代謝経路の調節に効果的に使用可能であると期
待される。

増殖細胞での３−ＨＰ同化（Ａ）と休止細胞での３−ＨＰ分解（Ｂ）とを示す。シュードモナス・デニトリフィカンスの３−ＨＰ同化実験のために、菌株は、２５±２ｍｍｏｌ／Ｌの３−ＨＰを単独炭素源及びエネルギー源で供給するＭ９培地で培養された。シュードモナス・デニトリフィカンスの３−ＨＰ分解実験のために、休止細胞は、２５±２ｍｍｏｌ／Ｌの３−ＨＰを含むＭ９培地で培養して準備された。３−ＨＰ濃度測定に対する標準偏差は、１０％以下に計算された。記号：ｃｌｏｓｅｄｃｉｒｃｌｅ、３−ＨＰ；ｓｅｍｉ−ｃｉｒｃｌｅｌｅｆｔ、ｃｅｌｌｍａｓｓ；ｃｒｏｓｓ、ｐＨ。３−ＨＰの２つの代謝経路を示す（酸化及び還元経路）。略語：３−ＨＰＤＨ、３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）；３−ＨＩＢＤＨ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）；ＭＭＳＡＤＨ、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎａｔｅｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）；ＨＰＣＳ、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）。シュードモナス・デニトリフィカンスＡＴＣＣ１３８６７で３−ヒドロキシプロピオン酸異化遺伝子に対する相対的なｍＲＮＡレベル（Ａ）及び増加倍数（Ｂ）を示す。（Ａ）シュードモナス・デニトリフィカンスを２５ｍｍｏｌ／Ｌ３−ＨＰが供給されたＭ９培地で培養した時、結果（ｇｒｅｙｂａｒ）、及び３−ＨＰ供給なしにＭ９培地で培養した時、結果（ｂｌａｃｋｂａｒ）を示す。（Ｂ）３−ＨＰ供給によるｍＲＮＡレベルの差を増加倍数で示した結果（ｇｒｅｙｂａｒ）を示す。ｍＲＮＡレベル測定に対する標準偏差は、１０％以下に計算された。ｍＲＮＡレベルは、ｒｐｏＤ遺伝子を参照遺伝子として使用して比較された。ｍｍｓａｄｈ（黒色）及び３ｈｉｂｄｈＩＶ（灰色）遺伝子の発現を示す。３−ＨＰ以外３−ヒドロキシイソ酪酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅ；３−ＨＩＢ）、３−ヒドロキシ酪酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；３−ＨＢ）、Ｌ−バリン（Ｌ−ｖａｌｉｎｅ）なども誘導体（ｉｎｄｕｃｅｒ）として作用した。３ｈｐｄＨ遺伝子の発現を示す。３−ＨＰ以外３−ヒドロキシイソ酪酸（３−ＨＩＢ）、３−ヒドロキシ酪酸（３−ＨＢ）、Ｌ−バリンなども誘導体として作用した。図６Ａ及び図６Ｂは、シュードモナス・デニトリフィカンスで３−ＨＰによって誘導されるプロモーターシステム遺伝子配列及び構造を示す。図６Ａは、ｍｍｓａｄｈ及び３ｈｉｂｄｈ遺伝子、そして、この遺伝子の転写を調節するＬｙｓＲタンパク質（Ｃ４−ＬｙｓＲ）遺伝子配置。図６Ｂは、３ｈｐｄｈ遺伝子と、この遺伝子転写を調節するＬｙｓＲタンパク質（Ｃ３−ＬｙｓＲ）遺伝子の配置。Ｃ４ＬｙｓＲ誘導プロモーターに対する分析結果である。Ｃ４−ＬｙｓＲ（ｍｍｓＲで表記）ｍｍｓａｄｈ（ｍｍｓＡで表記）遺伝子の間に存在するＯ１及びＯ２ｏｐｅｒａｔｏｒは、それぞれｍｍｓａｄｈ転写開始サイト（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓｔａｒｔｓｉｔｅ）基準に−５８及び−９位置に存在し、逆反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔ）配列を有していた。Ｏ１、Ｏ２を構成する逆反復に対する分析結果、ＴＡＣＧＴＧＴＡＡ配列が保存されていた。ＬｙｓＲファミリー転写調節因子の調節機作を示す。ＬｙｓＲタンパク質に高く保存されたアミノ酸配列を示す。アミノ酸位置は、Ｃ４−ＬｙｓＲを中心に付けられた。しかし、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ）や基質結合ドメイン（ｓｕｂｓｔｒａｔｅｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ）で保存されたアミノ酸配列は、本発明で使われた菌株由来のあらゆるＬｙｓＲタンパク質に同様に表われた。Ｃ−ｈｉｓｔａｇＣ４−ＬｙｓＲの溶解度（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）分析のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。シャペロンプラスミド（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｐｌａｓｍｉｄ）ｐＧ−ＫＪＥ８（Ａ）、ｐＧｒｏ７（Ｂ）、ｐＫＪＥ７（Ｃ）、ｐＧ−Ｔｆ２（Ｄ）、ｐＴｆ１６（Ｅ）を使用した。遺伝子組換えＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１菌株は、ＬＢ培地、２５℃で培養され、０．１ｍＭＩＰＴＧで誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）した後、４時間あるいは１２時間目に収獲（ｈａｒｖｅｓｔ）した。青色矢印は、Ｃ４−ＬｙｓＲタンパク質であって、３４．４ｋＤａのサイズを示す。精製されたＣ４−ＬｙｓＲタンパク質のＳＤＳ−及びＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ分析結果を示す。（Ａ）ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じた精製過程。Ｌａｎｅ１、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ、ｃｒｕｄｅ）；ｌａｎｅ２、（−）ＩＰＴＧ；ｌａｎｅ３、４、５、７は、それぞれ無細胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）、水溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）、不溶性（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）及び精製分画（ｐｕｒｉｆｉｅｄｆｒａｃｔｉｏｎ）を示す。Ｌａｎｅ６は、タンパク質マーカー（ｍａｒｋｅｒ）、（Ｂ）ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ分析。Ｌａｎｅ８、１０、１２は、タンパク質マーカー；Ｌａｎｅ９、１１、１３は、精製Ｃ４−ＬｙｓＲタンパク質であって、それぞれ６５、２２０、５５０ｎＭの濃度でローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）された。図１２Ａないし図１２Ｃは、Ｃ４−ＬｙｓＲ濃度及び３−ＨＰがＣ４−ＬｙｓＲタンパク質とプロモーター部位のＤＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）との結合に及ぼす影響を示す。図１２Ａは、実験に使われたプロモーター部位のＤＮＡ断片配列であって、Ｆ１２は、Ｏ１、Ｏ２をいずれも含む断片であり、Ｆ１２Ｍは、Ｏ１ｏｐｅｒａｔｏｒ、そして、Ｆ１Ｍ２は、Ｏ２ｏｐｅｒａｔｏｒのみ含む断片である。また、Ｆ１Ｍ２Ｍは、Ｏ１、Ｏ２がいずれも除去された断片である。実験に使われたＤＮＡ断片の長さは、いずれも１３５ｂｐで同一であった。図１２Ｂは、Ｃ４−ＬｙｓＲタンパク質とプロモーター部位ＤＮＡ断片との結合をｉｎｖｉｔｒｏで調査した電気泳動移動距離変化分析（ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃＭｏｂｉｌｉｔｙＳｈｉｆｔＡｓｓａｙ、ＥＭＳＡ）結果であって、上端パネル（ｕｐｐｅｒｐａｎｅｌ）は、３−ＨＰのない条件で、そして、下端パネル（ｌｏｗｅｒｐａｎｅｌ）は、２５ｍＭの３−ＨＰが存在する条件で、電気泳動が進められた。Ｌａｎｅ１〜９：Ｃ４−ＬｙｓＲタンパク質の濃度を次第に増加させた（０、０．３６、０．７３、１．４５、２．９、５．８、１１．６、１４．５、２４．２ｎＭ）。Ｌａｎｅ１０〜１５：Ｃ４−ＬｙｓＲタンパク質の濃度を次のように次第に増加させた（０、２．９、５．８、１１．６、１４．５、２４．２ｎＭ）。Ｌａｎｅ１６〜２１：Ｃ４−ＬｙｓＲタンパク質の濃度を次のように次第に増加させた（０、２．９、１１．６、２４．２、７２．７ｎＭ）。図１２Ｃは、Ｃ４−ＬｙｓＲタンパク質とプロモーター部位ＤＮＡ断片との結合ａｆｆｉｎｉｔｙ分析の定量的結果であって、Ａｆｆｉｎｉｔｙは、分離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｋ_Ｄ）、すなわち、半分のＤＮＡ断片が、Ｃ４−ＬｙｓＲタンパク質と結合するのに必要なタンパク質の濃度で表示した。図１３Ａ及び１３Ｂは、シュードモナス・デニトリフィカンスＡＴＣＣ１３８６１と多様な微生物との間の３−ＨＰ分解経路に含まれた遺伝子集団の構造比較結果を示す。図１４Ａないし図１４Ｃは、ＬｙｓＲ領域に含まれたＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌＨＴＨの多重配列配置を示す。Ｃ４−ＬｙｓＲ（図１４Ａないし図１４Ｃ）、Ｃ３−ＬｙｓＲ（図１５Ａないし図１５Ｂ）。図１５Ａないし図１５Ｂは、ＬｙｓＲ領域に含まれたＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌＨＴＨの多重配列配置を示す。Ｃ４−ＬｙｓＲ（図１４Ａないし図１４Ｃ）、Ｃ３−ＬｙｓＲ（図１５Ａないし図１５Ｂ）。シュードモナス・デニトリフィカンスにグリセロール脱水酵素及びＫＧＳＡＤＨを発現のために開発されたｐＵＣＰＫ´／ＰＣ３−ｇｄｒＡＢ−ｄｈａＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨプラスミドを示す。Ｐｄ Δ３ｈｐｄｈΔ３ｈｉｂｄｈＩＶΔ３ｈｉｂｄｈＩ（ｐＵＣＰＫ’／ＰＣ３−ｄｈａＢ−ｇｄｒＡＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨ）菌株（Ｏ１、Ｏ２＆Ｏ３）とＰｄ Δ３ｈｐｄｈΔ３ｈｉｂｄｈＩＶΔ３ｈｉｂｄｈＩ（ｐＵＣＰＫ’／ＰＣ３−ｇｄｒＡＢ−ｄｈａＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨ）菌株（Ｓ１、Ｓ２＆Ｓ３）とによるグルコースとグリセロール消耗、細胞成長、３−ＨＰ生産、ｐＨ変化比較結果を示す（Ｏ１＆Ｓ１）、グリセロールなし；（Ｏ２＆Ｓ２）、２５ｍｇ／ＬＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏが培養培地に追加される；（Ｏ３＆Ｓ３）、１２μｍｏｌ／ＬコエンザイムＢ_１２が培養培地に追加される。３ｈに１００ｍＭのグリセロールが追加される。Ｐｄ Δ３ｈｐｄｈΔ３ｈｉｂｄｈＩＶΔ３ｈｉｂｄｈＩ（ｐＵＣＰＫ’／ＰＣ３−ｄｈａＢ−ｇｄｒＡＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨ）とＰｄ Δ３ｈｐｄｈΔ３ｈｉｂｄｈＩＶΔ３ｈｉｂｄｈＩ（ｐＵＣＰＫ’／ＰＣ３−ｇｄｒＡＢ−ｄｈａＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨ）との細胞破砕液を用いた経時的なグリセロール脱水酵素及びＫＧＳＡＤＨの不活性比較結果を示す。流加式バイオリアクター運転において、グリセロール、グルコースの消耗、バイオマス及び３−ＨＰ生産の経時的な変化結果を示す。（Ａ）組換えＰｄ Δ３ｈｐｄｈΔ３ｈｉｂｄｈＩＶΔ３ｈｉｂｄｈＩ（ｐＵＣＰＫ’／ＰＣ３−ｄｈａＢ−ｇｄｒＡＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨ）、（Ｂ）Ｐｄ Δ３ｈｐｄｈΔ３ｈｉｂｄｈＩＶΔ３ｈｉｂｄｈＩ（ｐＵＣＰＫ’／ＰＣ３−ｇｄｒＡＢ−ｄｈａＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨ）。

本発明者らは、３−ＨＰ生産酵素の発現を効率的に保持するために、３−ＨＰによって
発現が誘導される特異な遺伝子転写プロモーターシステムを多様な微生物から見つけ、こ
れらの遺伝的、生化学的特徴を調査した。このプロモーターシステムは、まだ文献に一回
も報告されたことがない特異なシステムであって、３−ＨＰと結合する転写促進タンパク
質と、このタンパク質が特異的に結合するＤＮＡ配列からなっている。本発明者らは、こ
のプロモーターシステムを使用してＤｈａＢ、ＧｄｒＡＢ及びＫＧＳＡＤＨを過発現する
ことによって、グリセロールから３−ヒドロキシプロピオン酸を高濃度で生産することが
できる組換え菌株として開発し、本発明を完成した。

本発明は、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）またはその類似体に反応するＬｙ
ｓＲタンパク質との結合部位を含む３−ＨＰまたはその類似体誘導性プロモーターを提供
する。

また、本発明は、３−ＨＰまたはその類似体誘導性プロモーターを含む組換え発現ベク
ターを提供する。望ましくは、前記３−ＨＰまたはその類似体誘導性プロモーターに作動
可能に連結された外来タンパク質をコーディングする遺伝子をさらに含むこともある。よ
り望ましくは、前記外来タンパク質は、グリセロールデヒドラターゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ
ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ；ＤｈａＢ）、グリセロールデヒドラターゼ再活性化酵素（Ｄ
ｈａＢｒｅａｃｔｉｖａｓｅ；ＧｄｒＡＢ）またはα−ケトグルタル酸セミアルデヒド
デヒドロゲナーゼ（α−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒｉｃｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈ
ｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＫＧＳＡＤＨ）であり得るが、これらに制限されるものではない
。

また、本発明は、前記組換え発現ベクターで形質転換された組換え微生物を提供する。
望ましくは、前記微生物は、３−ＨＰ生産能を有した微生物であり、より望ましくは、前
記微生物は、シュードモナス・デニトリフィカンスであり、さらに望ましくは、微生物は
、シュードモナス・デニトリフィカンス菌株で３−ＨＰ分解に関連した３ｈｐｄｈ、３ｈ
ｉｂｄｈ及びｍｍｓａｄｈ遺伝子が欠失したシュードモナス・デニトリフィカンスΔ３ｈ
ｐｄｈΔ３ｈｉｂｄｈＩＶ△３ｈｉｂｄｈＩ菌株であり得るが、これらに制限されるもの
ではない。

また、本発明は、前記組換え微生物を培養する段階を含む３−ＨＰ生産方法を提供する
。

また、本発明は、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）またはその類似体に反応する
ＬｙｓＲタンパク質をコーディングするｌｙｓＲ遺伝子、前記ＬｙｓＲタンパク質との結
合部位を含むプロモーター及び発現目的タンパク質をコーディングする遺伝子を含む３−
ＨＰまたはその類似体反応性組換え遺伝子発現カセットを提供する。

また、本発明は、前記３−ＨＰまたはその類似体反応性組換え遺伝子発現カセットを含む
組換え発現ベクター及び前記組換えベクターで形質転換された組換え微生物を提供する。

また、本発明は、前記３−ＨＰまたはその類似体反応性組換え遺伝子発現カセットが宿主
細胞の染色体内に挿入されている組換え微生物を提供する。当業者において、前記組換え
遺伝子発現カセットを宿主細胞のゲノム染色体に挿入しても、前記のように組換えベクタ
ーを宿主細胞に導入した場合と同じ効果を有することは自明である。

本発明において、前記組換え遺伝子発現カセットを宿主細胞の染色体上に挿入する方法
としては、通常知られた遺伝子操作方法を使用し、一例としては、レトロウイルスベクタ
ー、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスベクター、ポ
ックスウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたは非ウイルス性ベクターを利用す
る方法が挙げられる。

また、本発明は、前記組換え微生物を培養する段階を含む発現目的タンパク質生産方法
を提供する。望ましくは、前記組換え微生物を培養する段階は、３−ＨＰを添加する段階
をさらに含みうる。

望ましくは、前記ＬｙｓＲタンパク質または前記プロモーターは、３−ＨＰ分解能を有
した微生物から由来したものであり、より望ましくは、アクロモバクター・デニトリフィ
カンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アシドボラック
ス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘａｖｅｎａｅ）ｓｕｂｓｐ．、アシドボラックス
（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘｓｐ．）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ
ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．
）、アルカリゲネス・フェーカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ）、ア
ルカニボラックス・ホンデンジェンシス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘｈｏｎｇｄｅｎｇｅ
ｎｓｉｓ）、アリシクリフィルス・デニトリフィカンス（Ａｌｉｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ
ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アルテロモナス・マリナ（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ
ｍａｒｉｎａ）、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｓｐ．）、アナエロ
ミクソバクター・デハロゲナンス（Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｄｅｈａｌｏｇ
ｅｎａｎｓ）、アゾスピリルム・ブラシレンセ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｂｒａｓｉ
ｌｅｎｓｅ）、アゾトバクター・ビネランジー（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｖｉｎｅｌａ
ｎｄｉｉ）、ベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａｉｎｄｉｃａ
）、ボルデテラ・アビウム（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａａｖｉｕｍ）、ブラディリゾビウム
・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、バークホルデ
リア・アンビファリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａａｍｂｉｆａｒｉａ）、カテヌリス
ポラ・アシジフィラ（Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａａｃｉｄｉｐｈｉｌｉａ）、カウロ
バクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒｓｐ．）、カステラニエラ・デフラグランス（Ｃａ
ｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａｄｅｆｒａｇｒａｎｓ）、クロモバクテリウム・ビオラセウ
ム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、コリモナス・アレネ（Ｃ
ｏｌｌｉｍｏｎａｓａｒｅｎａｅ）、コマモナス・テストステローニ（Ｃｏｍａｍｏｎ
ａｓｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、コリネバクテリウム・ビタエルミニス（Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｔａｅｒｕｍｉｎｉｓ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃ
ｕｐｒｉａｖｉｄｕｓｎｅｃａｔｏｒ）、カービバクター・グラシリス（Ｃｕｒｖｉｂ
ａｃｔｅｒｇｒａｃｉｌｕｓ）、デルフチア・アシドボランス（Ｄｅｌｆｔｉａａｃ
ｉｄｏｖｏｒａｎｓ）、フェリモナス・バレアリカ（Ｆｅｒｒｉｍｏｎａｓｂａｌｅａ
ｒｉｃａ）、グラシエコーラ・ニトラティレデューセンス（Ｇｌａｃｉｅｃｏｌａｎｉ
ｔｒａｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、ゴルドニア・ブロンキアリス（Ｇｏｒｄｏｎｉａｂｒ
ｏｎｃｈｉａｌｉｓ）、ハヘラ・チェジュエンシス（Ｈａｈｅｌｌａｃｈｉｊｕｅｎｓ
ｉｓ）、ハロモナス・エロンガータ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓｅｌｏｎｇａｔａ）、ヒルチ
ア・リトレア（Ｈｉｒｓｃｈｉａｌｉｔｏｒｅａ）、イディオマリナ（Ｉｄｉｏｍａｒ
ｉｎａｓｐ．）、ヤンシノバクテリウム・リビダム（Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｌｉｖｉｄｕｍ）、キタサトスポーラ・セタエ（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａｓ
ｅｔａｅ）、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａａｌｂｉｄａ）、メチロバク
テリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈ
ｙｌｏｃｙｓｔｉｓｓｐ．）、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕ
ｍｓｐ．）、オシアニモナス・スミルノビ（Ｏｃｅａｎｉｍｏｎａｓｓｍｉｒｎｏｖ
ｉｉ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、パルビバクラム・ラバメンテ
ィボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、フェニロ
バクテリウム・クンサネンシス（Ｐｈｅｎｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｋｕｎｓｈａｎｅ
ｎｓｉｓ）、フォトバクテリウム・ガエトブレダ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇａ
ｅｔｂｕｌｅｄａ）、ポリヌクレオバクター・ネセサリウスアシムビオティカス（Ｐｏｌ
ｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒｎｅｃｅｓｓａｒｉｕｓａｓｙｍｂｉｏｔｉｃｕｓ）、
シュードアルテロモナス・カーラゲーノボラ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｃ
ａｒｒａｇｅｅｎｏｖｏｒａ）、シュードグルベンキアニア（Ｐｓｅｕｄｏｇｕｌｂｅｎ
ｋｉａｎｉａｓｐ．）、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＡＴＣＣ１３８６７、シュードモナス・ナックムッシ
イ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｋｎａｃｋｍｕｓｓｉｉ）、シュードモナス・プロテゲン
ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｒｏｔｅｇｅｎｓ）、シュードモナス・フルオレッセン
ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードキサントモナス・ス
パディックス（Ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｓｐａｄｉｘ）、サイクロバクタ
ー・フェニルピルビクス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃｕ
ｓ）、ラルストニア・オキサラティカ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｏｘａｌａｔｉｃａ）、ロ
ドミクロビウム・バニエリ（Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍｖａｎｎｉｅｌｌｉ）、セ
グニリパルス・ロツンダス（Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒｕｓｒｏｔｕｎｄｕｓ）、シェワネ
ラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）、シミデュイア・
アガロボランス（Ｓｉｍｉｄｕｉａａｇａｒｏｖｏｒａｎｓ）、シノリゾビウム・メリ
ロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）、スフィンゴビウム・クロロ
フェノリカム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｍ）、スフィ
ンゴモナスウィッティチアィ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｗｉｔｔｉｃｈｉｉ）、スフ
ィンゴピキシス・アラスケンシス（Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓａｌａｓｋｅｎｓｉｓ）
、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌ
ｔｏｐｈｉｌｉａ）、ストレプトマイセス・ノドサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｎｏ
ｄｏｓｕｓ）、タトロキア・ミクダデイ（Ｔａｔｌｏｃｋｉａｍｉｃｄａｄｅｉ）、タ
ラソスピラ・シアメネンシス（Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａｘｉａｍｅｎｅｎｓｉｓ）
、バリオボラックス・パラドクサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘｐａｒａｄｏｘｕｓ）、ベ
ルミネフロバクター・エイセニエ（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒｅｉｓｅｎｉ
ａｅ）、ビブリオ・ファーニッシイ（Ｖｉｂｒｉｏｆｕｒｎｉｓｓｉｉ）、キサントバ
クター・オートトロフィカス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ
）、ザントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉ）、
及びザントモナス・オリゼ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅ）であり得るが、こ
れらに制限されるものではない。

望ましくは、前記ＬｙｓＲタンパク質は、ヘリックスターンヘリックス（ｈｅｌｉｘ−
ｔｕｒｎ−ｈｅｌｉｘ）構造からなって、ＤＮＡと結合するＮ末端ドメイン、３−ＨＰま
たはその類似体と結合するＣ末端ドメイン及びＬｙｓＲタンパク質二量体安定化に寄与す
るＣ末端ドメインを含みうるが、これらに制限されるものではない。

より望ましくは、前記ヘリックスターンヘリックス構造からなって、ＤＮＡと結合する
Ｎ末端ドメインは、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、前記３
−ＨＰまたはその類似体と結合するＣ末端ドメインは、配列番号３で表されるアミノ酸配
列を含み、前記ＬｙｓＲタンパク質二量体安定化に寄与するＣ末端ドメインは、配列番号
４で表されるアミノ酸配列を含みうるが、これらに制限されるものではない。

前記配列番号１〜配列番号４に記載の“Ｘ”または“Ｘａａ”は、特定のアミノ酸では
なく、如何なるアミノ酸も含まれるということを意味する。さらに望ましくは、前記Ｌｙ
ｓＲタンパク質は、表４及び表５に記載のＧｅｎｅｂａｎｋＩＤを有したＬｙｓＲタン
パク質であり得るが、これに制限されるものではない。

望ましくは、前記ＬｙｓＲタンパク質との結合部位は、ＬｙｓＲタンパク質二量体（ｄ
ｉｍｅｒ）が２個結合し、配列番号５〜配列番号４３からなる群から選択された何れか１
つで表示された塩基配列を含み、前記配列番号５〜配列番号４３からなる群から選択され
た何れか１つで表示された塩基配列からなる逆反復配列及びそれと対を成す逆反復配列が
２回反復されうるが、これらに制限されるものではない。

より望ましくは、前記ＬｙｓＲタンパク質との結合部位は、配列番号４４または配列番
号４５で表される塩基配列からなりうる。

前記配列番号５〜配列番号４３に記載の“ｎ”は、特定の塩基ではなく、如何なる塩基
も含まれるということを意味する。

前記配列番号４４または配列番号４５は、シュードモナス・デニトリフィカンスＡＴＣ
Ｃ１３８６７から由来したプロモーター塩基配列である。

望ましくは、前記類似体は、３−ヒドロキシイソ酪酸（３−ＨＩＢ）または３−ヒドロ
キシ酪酸（３−ＨＢ）であり得るが、これらに制限されるものではない。

本発明において、“ベクター”は、クローン遺伝子（または、クローンＤＮＡの他の切
片）を運ぶのに使われる自ら複製されるＤＮＡ分子を意味する。

本発明において、“発現ベクター”は、目的したコーディング配列と、特定の宿主生物
で作動可能に連結されたコーディング配列と、の発現に必須的な適正核酸配列を含む組換
えＤＮＡ分子を意味する。発現ベクターは、望ましくは、１つ以上の選択性マーカーを含
みうる。前記マーカーは、通常の化学的な方法で選択されうる特性を有する核酸配列であ
って、形質転換された細胞を非形質転換細胞から区別することができるあらゆる遺伝子が
これに該当する。その例としては、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｉｎ）、カナマイシン
（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロ
マイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉ
ｃｏｌ）のような抗生剤耐性遺伝子があるが、これに限定されるものではなく、当業者に
よって適切に選択可能である。

以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実
施例は、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定され
るものではない。本発明の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供さ
れるものである。

＜実施例１＞３−ヒドロキシプロピオン酸による遺伝子発現システムの究明

１．材料

アクロモバクター・デニトリフィカンス、アシネトバクター・バウマニを含んだ多数の
菌株は、韓国微生物保存センターＫＣＣＭから獲得した。アシドボラックス・アベナエｓ
ｕｂｓｐ．、アグロバクテリウムを含んだ多数菌株に対しては、韓国微生物資源センター
ＫＣＴＣから購入した。アリシクリフィルス・デニトリフィカンス、アナエロミクソバク
ター・デハロゲナンスを含んだ多数の菌株は、ドイツのＤＳＭから獲得した。エロモナス
・ハイドロフィラ、シュードモナス・デニトリフィカンスＡＴＣＣ１３８６７を含んだ多
数の菌株は、米国のＡＴＣＣから購入した。プライマーは、Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ
（ソウル、韓国）から合成した。３−ＨＰは、日本の東京化成工業（ＴＣＩＡｍｅｒｉ
ｃａ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）から購入した。酵母抽出物（Ｃａｔ．２１２７５０）、
トリプトン（Ｃａｔ．２１１７０５）は、Ｄｉｆｃｏから購入した（ＢｅｃｔｏｎＤｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ；ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、ＮＪ）。言及していないあらゆる化学
物質及び酵素は、シグマアルドリッチから購入した（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。

２．増殖細胞での３−ＨＰ同化及び休止細胞での３−ＨＰ分解

Ｓｈａｋｅｆｌａｓｋ実験は、２５０ｍＬｎｏｎ−ｂａｆｆｌｅｄ三角フラスコに
３０ｍＬの体積で振盪培養器で温度３７℃、撹拌速度２００ｒｐｍの条件で行った。シュ
ードモナス・デニトリフィカンスによる３−ＨＰ同化に対する実験は、２５０ｍＬｎｏ
ｎ−ｂａｆｆｌｅｄ三角フラスコに３０ｍＬの体積で改良されたＭ９培地を入れ、振盪培
養器で温度３７℃、撹拌速度２００ｒｐｍの条件で行った。菌株を培養するために使用し
た改良されたＭ９培地の組成は、１００ｍＭリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．０）、ＭｇＳＯ
_４・７Ｈ_２Ｏ０．２５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１．０ｇ／Ｌ、ＮＨ_４Ｃｌ１．０ｇ／Ｌ、
３−ＨＰ２５ｍＭにした。

休止細胞実験は、シュードモナス・デニトリフィカンスを含む総６９種の微生物で３−
ＨＰ分解に対して調べるために行われ、この実験に使われたバクテリアは、表１に示した
。活性細胞を準備するために、各菌株によって明示された栄養強化培地に３−ＨＰを含ん
で２５０ｍＬｎｏｎ−ｂａｆｆｌｅｄ三角フラスコに５０ｍＬの体積で培養した。菌株
培養は、３７℃でなされ、細胞のＯＤ_６００が１〜１．５程度になった時、５０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離して細胞を収得した。沈殿された細胞は、１００ｍＭリン酸塩緩衝
溶液（ｐＨ７．０）を用いて洗浄した後、同じ緩衝溶液内に３−ＨＰ２５±２ｍｍｏｌ
／Ｌを入れ、再懸濁した。前述した細胞収得、洗浄及び再懸濁過程は、３−ＨＰ分解実験
前になされた。試料は、３−ＨＰ濃度を調査するために周期的に採取された。

３．ＲＮＡ抽出及び逆転写重合酵素連鎖反応

シュードモナス・デニトリフィカンスＡＴＣＣ１３５６７菌株培養には、Ｍ９培地が
使われ、表１に示した他の微生物の培養には、各菌株によって明示された栄養培地が使わ
れた。３−ＨＰによる影響を調査する時は、提示された培地内に２５ｍＭの３−ＨＰが添
加された。あらゆる菌株は、振盪培養器で温度３７℃、撹拌速度２００ｒｐｍで好気性条
件になるようにして培養され、培養細胞が指数成長期に到達した時、細胞を収得した。細
胞の量がほぼ５×１０^８になるように採取した後、５０００ｇで１０分間遠心分離を行っ
た。沈殿された細胞に即時ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Ａｍｂｉｏｎ、ＵＫ）５００μｌ入
れ、再懸濁した。ＲＮＡは、ｔｏｔａｌＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｍａｃ
ｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で抽出した。２０μｌｆｉｒｓｔ−ｓｔｒ
ａｎｄｃＤＮＡ合成のために、１μｇのｔｏｔａｌＲＮＡが使われ、ｃＤＮＡ合成の
ために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎで提供するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ III ｆｉｒｓｔ−
ｓｔｒａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｓｙｓｔｅｍが用いられた。

逆転写重合酵素連鎖反応は、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎｓｔｅｐを用いてＯｎｅＲｅａ
ｌＴｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ
）装備で行われた。逆転写重合酵素連鎖反応のための反応液２０μＬには、３００ｎｇ
ｃＤＮＡ、１０μＬ２×ＰｏｗｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）、５ｐｍｏｌｏｆｆｏｒｗ
ａｒｄａｎｄｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒｓ、ＤＥＰＣｔｒｅａｔｅｄｗａｔ
ｅｒが含まれた。逆転写重合酵素連鎖反応のための条件は、次のように決定した：ｄｅｎ
ａｔｕｒａｔｉｏｎ、１ｃｙｃｌｅｏｆ９５℃ ｆｏｒ３０ｓ；ａｍｐｌｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ、４０ｃｙｃｌｅｓｏｆ９５℃ ｆｏｒ１５ｓ、６２℃ ｆｏ
ｒ３０ｓ、ａｎｄ７２℃ ｆｏｒ３０ｓ。逆転写重合酵素連鎖反応を行う前、
正確なｍＲＮＡレベル測定のために実験に使われたプライマー効率確認は、ＰＣＲを通じ
てなされ、ｍＲＮＡレベルに対するｒｅｌａｔｉｖｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎは
、ΔΔＣＴ方法を使用して計算された。

４．ＬｙｓＲタンパク質の遺伝子クローニング、タンパク質生産、分離精製

シュードモナス・デニトリフィカンスの場合、３−ＨＰの分解に関与する２個のオペロ
ン（ｏｐｅｒｏｎ）、すなわち、３ＨＰＤＨ（以下、Ｃ３システム）及び３ＨＩＢＤＨ−
ＩＶ（以下、Ｃ４システム）が存在し、これらの転写を調節するＬｙｓＲタンパク質、Ｃ
３−ＬｙｓＲとＣ４−ＬｙｓＲとが存在した。そのうち、Ｃ４−ＬｙｓＲに対してタンパ
ク質生産を試みた。Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主（ｈｏｓｔ）で、そして、
プラスミドクローニング、保持などのためには、Ｅ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０を使用した。
Ｃ４ＬｙｓＲ遺伝子をＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓｇｅｎｏｍｅでＰＣＲで増幅
してｐＥＴ３０ｂ（＋）プラスミドにクローニングした後、Ｅ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０に
入れて塩基配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を確認し、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）に入
れた。タンパク質精製のために、Ｃ末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）部位にＨｉｓｔａｇ
を付けた。ＬｙｓＲタンパク質を活性がある水溶性形態で発現するために、ｐＧ−ＫＪＥ
８、ｐＧＲＯ７、ｐＧ−ＴＦ２、ｐＴＦ−１６など多様なシャペロンプラスミドと共に共
発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させた。培地としては、カナマイシン、クロラムフ
ェニコール、Ｌ−アラビノース（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ）などが適切に含まれたＬＢ培
地を使用し、好気的条件で培養した。細胞濃度が０．６ＯＤに至った時、０．１ｍＭのＩ
ＰＴＧを追加してＬｙｓＲタンパク質の生産を誘導した。タンパク質の水溶性発現のため
に、多様な培養条件を検討した後、最終的に２５℃、１５０ｒｐｍで１０時間培養した。
培養された細胞は、遠心分離して得て、１００ｍＭ（ｐＨ７）リン酸緩衝液（ｂｕｆｆｅ
ｒ）で洗浄した後、結合緩衝液（ｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）に再懸濁させ、フレン
チプレス（ＦｒｅｎｃｈＰｒｅｓｓ）で破砕した。以後、再び遠心分離して固形分と未
破砕細胞とを除去し、溶液部分をＮｉ−ａｆｆｉｎｉｔｙｃｏｌｕｍｎを用いて精製し
た。以後、２０％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）溶液で８０℃に保管した。

５．ｉｎｖｉｔｒｏ条件でタンパク質−ＤＮＡ結合調査のための電気泳動移動距離変化
測定（ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃＭｏｂｉｌｉｔｙＳｈｉｆｔＡｓｓａｙ；Ｅ
ＭＳＡ）

分離したＣ４−ＬｙｓＲとプロモーター部位の結合をｉｎｖｉｔｒｏで研究するため
に、プロモーター部位のＤＮＡ断片を合成した（図７）。３種の断片を合成したが、第１
に、Ｃ４−ＬｙｓＲ遺伝子とｍｍｓａｄｈ遺伝子との間の全体ＤＮＡ断片に転写調節タン
パク質が結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）すると予想されるＯ１及びＯ２ｏｐｅｒａｔｏｒ２
個がいずれも含まれたもの（Ｆ１２と名付ける）、第２に、Ｏ１ｏｐｅｒａｔｏｒ部分
のみ含む断片（Ｆ１２Ｍと名付ける）、第３に、Ｏ２ｏｐｅｒａｔｏｒ部分のみ含む断
片（Ｆ１Ｍ２と名付ける）などであった。ＥＭＳＡ実験は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄＭｏｂｉｌ
ｉｔｙＳｈｉｆｔＡｓｓａｙｋｉｔ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ＥＭＳＡ）を使
用して進められた。まず、プロモーター部位ＤＮＡ断片をｇｌａｓｓｆｉｂｅｒｃｏ
ｌｕｍｎで精製した後、結合緩衝液で精製したＬｙｓＲタンパク質と混合して３０分間常
温で反応させた。以後、６％ｎｏｎ−ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍ
ｉｄｅｇｅｌにローディングした後、３０分間２２０ＶでｐＨ８のＴＢＥ緩衝液で展開
した。以後、ｇｅｌをｆｉｘｉｎｇした後、ＤＮＡｂａｎｄを確認するために、ＳＹＢ
ＲＧｒｅｅｎＥＭＳＡで染色（ｓｔａｉｎｉｎｇ）し、ｇｅｌｄｏｃｕｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でｂａｎｄｉｎｔｅｎｓｉｔｙを定量した
。タンパク質を観察する場合、ＤＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎｂａｎｄをＳＹＰＲＯＲｕｂ
ｙＥＭＳＡ溶液で染色した。

６．分析方法

細胞濃度は、１０ｍｍ長さを有するキュベットを用いてダブルビーム分光光度計（Ｌａ
ｍｂｄａ２０、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）で測定した。３−
ＨＰ濃度は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して測定した（Ｒａｊ
ｅｔａｌ、２００８）。ＨＰＬＣ分析のために、採取した試料は、１０，０００×ｇで
１０分間遠心分離を通じて細胞沈殿物を除去し、ｔｕｆｆｒｙｎメンブレインフィルター
（Ａｃｒｏｄｉｓｃ；ＰａｌｌＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＰｏｒｔＷａｓｈｉｎ
ｇｔｏｎ、ＮＹ）を使用して試料内に残っている細胞を除去して準備された。ＨＰＬＣ分
析に使われたカラムは、３００ｍＭ×７．８ｍＭＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｈ（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）で６５℃で２．５ｍｍｏｌ／ＬのＨ_２ＳＯ_４を移動相として使用し
た。

７．結果

（１）シュードモナス・デニトリフィカンスで３−ＨＰ誘導性プロモーターのスクリーニ
ング

３−ヒドロキシプロピオン酸は、自然環境でほとんど存在しない炭素化合物であって
、炭素基質としての使用や生物学的分解に関する報告がほとんどない。最近、本発明者ら
は、シュードモナス・デニトリフィカンスが成長及び非成長状態で３−ＨＰを迅速に分解
することを見つけた。細胞成長の間に、シュードモナス・デニトリフィカンスは、３−Ｈ
Ｐを単独炭素源及びエネルギー源として使用することができた（図１Ａ）。細胞が成長し
ない間にも、シュードモナス・デニトリフィカンスは、３−ＨＰを酸素存在下に分解する
特性を示した（図１Ｂ）。生物学的に３−ＨＰの分解は、還元性経路あるいは酸化性経路
を利用すると知られている（図２）。誘電体分析とガスクロマトグラフィー−質量分析法
による代謝体分析とを通じてシュードモナス・デニトリフィカンスで３−ＨＰの分解は、
酸化経路を利用すると推定された。この経路によれば、３−ヒドロキシプロピオン酸デヒ
ドロゲナーゼ（３ＨＰＤＨ）と（メチル）マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ｍ
ＭＳＡＤＨ）と推定される２つの酵素が連続して３−ＨＰをメチルマロン酸セミアルデヒ
ドデヒドロ、そして、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドをアセチル−ＣｏＡに転換さ
せる（図２）。３ＨＰＤＨ以外にも、３−ＨＰ及び類似している３−ヒドロキシ酸を分解
することができると推定されるさまざまな３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼがシュー
ドモナス・デニトリフィカンスから確認された。３−ＨＰに対して活性を有するさまざま
な酵素の発現が、３−ＨＰによって誘導される可能性があった。３−ＨＰ異化作用遺伝子
と推定された３種の遺伝子（３ｈｐｄｈ、３ｈｉｂｄｈＩＶ、ｍｍｓａｄｈ）のｍＲＮＡ
レベルをＲＴ−ＰＣＲを通じて比較した（図３）。この際、シグマ因子７０を暗号化し、
恒存遺伝子として知られたｒｐｏＤを参照遺伝子として使用した。その結果、興味深くも
、３−ＨＰ分解に関連すると推定されたこれら遺伝子の発現が、３−ＨＰによって非常に
増加すると観察された。細胞が３−ＨＰに露出された時、３ｈｐｄｈの場合、４６倍増加
し、３ｈｉｂｄｈＩＶは、１４６倍、ｍｍｓａｄｈは、１３７倍まで増加した。このよう
な遺伝子の上向き調節は、３−ＨＰによって遺伝子のプロモーターが誘導される性質と説
明される。

３ｈｐｄｈ、３ｈｉｂｄｈＩＶ、ｍｍｓａｄｈ遺伝子の発現が３−ＨＰと類似している
サイズを有するが、しかし、構造的に他の化合物によって増幅される可能性に対して調査
した（図４及び図５）。これら遺伝子は、いずれも３−ＨＰ、３−ヒドロキシイソ酪酸（
３−ＨＩＢ）、３−ヒドロキシ酪酸（３−ＨＢ）によって増幅が誘導された。しかし、乳
酸（ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ）、酢酸（ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）、プロピオン酸（ｐｒ
ｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ）、１，３−プロパンジオール（１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉ
ｏｌ）、２，３−ブタンジオール（２，３−ｂｕｔａｎｄｉｏｌ）などによっては、増幅
が誘導されていない。特異にも、Ｌ−バリンによって増幅が誘導されたが、これは、Ｌ−
バリンが代謝される過程で３−ＨＩＢに転換されるためであると推定された。このことか
ら、転写調節タンパク質は、３−ＨＰ、３−ＨＩＢ、３−ＨＢなどに特異的に反応すると
判断された。

（２）３−ＨＰ誘導性遺伝子発現システム分析

ＬｙｓＲファミリー転写調節因子（ＬｙｓＲ−ｔｙｐｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ；ＬＴＴＲｓ）は、芳香族化合物の分解経路のような異化過
程を調節する転写活性因子として知られている。一般的に、ＬＴＴＲｓを暗号化する遺伝
子は、芳香族化合物分解に関連した遺伝子集団の前部に存在しながら、化合物分解作用を
調節する。３−ＨＰ分解経路を糾明するために、シュードモナス・デニトリフィカンスの
３ＨＰＤＨ及び３ＨＩＢＤＨ−ＩＶに関連したオペロンの遺伝子構造分析がなされた。そ
の結果、３−ＨＰ分解遺伝子の前部にＬＴＴＲｓが類似している遺伝子配列で位置してい
ることを確認した（図６）。これは、シュードモナス・デニトリフィカンスで３−ＨＰ分
解遺伝子の発現がＬｙｓＲタンパク質に関連している可能性を示す。特徴的に、ｌｙｓＲ
遺伝子とＬｙｓＲタンパク質（以下、Ｃ４化合物である３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロ
ゲナーゼ遺伝子と結合するＬｙｓＲをＣ４−ＬｙｓＲ、そして、Ｃ３化合物である３−Ｈ
Ｐデヒドロゲナーゼの遺伝子と結合するＬｙｓＲをＣ３−ＬｙｓＲと称する）とによって
転写が調節される遺伝子（ｍｍｓａｄｈ、３ｈｉｂｄｈ４、３ｈｐｄｈ）は、互いに反対
されるｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎに位置し、２つの特定結合部位、すなわち、保存的Ｔ−Ｎ
１１−Ａモチーフを有する調節結合位置（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｂｉｎｄｉｎｇｓｉ
ｔｅ；ＲＳ）と３５ＲＮＡ重合酵素結合位置（−３５ＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ）付近にある活性結合位置（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｂｉｎ
ｄｉｎｇｓｉｔｅ；ＡＳ）とが確認された（図６）。また、これらＲＳ及びＡＳは、Ｌ
ｙｓＲタンパク質をコーディング（ｃｏｄｉｎｇ）する遺伝子の１０、−３５部位と互い
にオーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐ）されることが確認された。このことから、ｌｙｓＲ
遺伝子の発現は、産物であるＬｙｓＲによって抑制（ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）されると推
定された。

Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓに存在するＣ４ＬｙｓＲ誘導プロモーターに対して
さらに詳しい分析を実施した。ＬｙｓＲ遺伝子とｍｍｓａｄｈ遺伝子との間に存在するＯ
１及びＯ２ｏｐｅｒａｔｏｒは、それぞれｍｍｓａｄｈ転写開始サイト基準に−５８及
び−９位置に存在し、逆反復配列を有していた（図７）。逆反復配列あるいはｐａｌｉｎ
ｄｒｏｍｉｃ構造は、原核細胞のｏｐｅｒａｔｏｒ部位に度々表われ、転写調節タンパク
質の結合部位になると知られている。Ｏ１及びＯ２ｓｉｔｅの距離は、約５０ｂｐ程度
であり、螺旋状ＤＮＡ５周に該当するので、ＬｙｓＲタンパク質がＯ１、Ｏ２部位に結
合する時、同じ方向で結合することができると推定された。Ｏ１ｓｉｔｅの一対（ｄｙ
ａｄ）は、１５ｂｐ距離を置いて９個の塩基で構成されるが、単に１個のｍｉｓｍａｔｃ
ｈのみがあって、高度に対称的（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ）であることが分かった。一方
、Ｏ２ｓｉｔｅの逆反復配列は、やはり９ｂｐずつ反復されて構成され、その間の間隔
は、１１ｂｐで多少短かった。９個のうち、６個がｍｉｓｍａｔｃｈである程度で、対称
（ｓｙｍｍｅｔｒｙ）程度は弱かった。一方、Ｏ１、Ｏ２ｏｐｅｒａｔｏｒに存在する
４個のｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｆｒａｇｍｅｎｔの相同性を調査した結果、ＴＡＣＧＴ
ＧＴＡＡで表われ、３、４、５番位置の塩基（太字）は、あらゆるｆｒａｇｍｅｎｔで保
存されており、２、８番位置の塩基（下線）は、３個のｆｒａｇｍｅｎｔで保存されてお
り、これら塩基が、Ｃ４ＬｙｓＲタンパク質との結合に重要な役割を行うと推定された
。

Ｏ１、Ｏ２ｏｐｅｒａｔｏｒが、Ｃ４−ＬｙｓＲタンパク質生合成とｍｍｓａｄｈ発
現に及ぼす影響を緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔ
ｅｉｎ；ＧＦＰ）をレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）として使用して調査した（表２）。
表２では、Ｃ４−ＬｙｓＲタンパク質及びＯ１、Ｏ２ｏｐｅｒａｔｏｒがＣ４−Ｌｙｓ
Ｒ及びｍｍｓａｄｈ発現に及ぼす影響を示した。ＧＦＰの相対的サイズを３−ＨＰ不在時
に、野生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）と比較して表示した。Ｃ４−ＬｙｓＲタンパク質は、最
初から存在しないか、恒常的プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｐｒｏｍｏｔｅ
ｒ）によって生産させ、ＧＦＰの発現は、Ｏ１、Ｏ２ｏｐｅｒａｔｏｒを有する元のプ
ロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）によって調節されるようにプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ
）を作り、このプラスミドをＣ４−ＬｙｓＲとｍｍｓａｄｈとの間の遺伝子が欠失したＰ
．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ宿主に挿入して実験を進行した。ＧＦＰの発現は、Ｃ４−
ＬｙｓＲタンパク質自身によって抑制された。すなわち、Ｃ４−ＬｙｓＲが発現される時
、ＧＦＰ発現は１０倍以上減少した。また、この発現調節は、３−ＨＰの存否と関係なく
一定に表われた。これを通じてＣ４−ＬｙｓＲｍＲＮＡの転写は、Ｃ４−ＬｙｓＲタン
パク質によって陰性的に（ｎｅｇａｔｉｖｅ）調節されることが分かった。この実験は、
Ｏ１、Ｏ２ｏｐｅｒａｔｏｒを任意抽出（ｒａｎｄｏｍｉｚｅ）して対称対（ｓｙｍｍ
ｅｔｒｉｃａｌｄｙａｄ）がなくなるようにしたプロモーターを用いて反復された。そ
の結果、Ｏ１やＯ２ｏｐｅｒａｔｏｒ部位が任意抽出された場合、ＧＦＰの発現がＣ４
−ＬｙｓＲタンパク質によって調節されないと表われた。この結果は、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒ
ｆｉｃａｎｓ菌株内でＣ４−ＬｙｓＲタンパク質は、自己自身によって陰性的に制御され
ることを示す。

一方、ｍｍｓａｄｈ遺伝子発現に及ぼすＯ１、Ｏ２ｏｐｅｒａｔｏｒの影響を類似し
ている方法で調査した。すなわち、Ｃ４−ＬｙｓＲタンパク質は、恒常的に（ｃｏｎｓｔ
ｉｔｕｔｉｖｅ）発現させ、Ｏ１、Ｏ２プロモーターを有するプロモーター後にＧＦＰが
位置するようにプラスミドを製作した。そして、この際、Ｏ１あるいはＯ２ｓｉｔｅの
対称対が任意抽出されるようにＯ１あるいはＯ２ｏｐｅｒａｔｏｒを突然変異（ｍｕｔ
ａｔｉｏｎ）させた。その結果、Ｏ１、あるいはＯ２部位が突然変異した場合、３−ＨＰ
によって転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）が上向き調節（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
）される現象がなくなった。すなわち、Ｏ１、Ｏ２ｏｐｅｒａｔｏｒいずれも３−ＨＰ
によって発現を上向き調節させるが、必須的な部位であるという意味である。これにより
、本プロモーターは、Ｏ１、Ｏ２ｏｐｅｒａｔｏｒ存在が必ず必要なプロモーターであ
ることが明かになった。

^１レポータータンパク質としてＧＦＰが使われた。すなわち、Ｃ４−ＬｙｓＲやｍｍｓ
ａｄｈ位置にＧＦＰ遺伝子を挿入したプラスミドを使用した。

^２３−ＨＰは、２５ｍＭの濃度で入れた。

^３Ｏ１、Ｏ２を任意抽出した場合、Ｃ４−ＬｙｓＲは弱いが、恒常的に発現されるプロ
モーターを使用した。

一方、ＬＴＴＲｓタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン（ｈｅｓｌｉｘ−ｔｕｒｎ−ｇｅ
ｌｉｘｍｏｔｉｆ）であるＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ、基質結合ドメインであるＣ−ｔｅｒ
ｍｉｎａｌ、そして、これらを連結するリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）からなっていると知ら
れている。ＬｙｓＲタンパク質は、ホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）を形成して、それ
ぞれＲＳとＡＳとに結合し、作動分子（ｅｆｆｅｃｔｏｒｍｏｌｅｃｕｌｅ）（本発明
の場合、３−ＨＰ）が、それぞれのＬｙｓＲタンパク質が結合する場合、２つのＬＴＴＲ
二量体の間にタンパク質−タンパク質相互作用によってＬＴＴＲが四量体（ｔｅｔｒａｍ
ｅｒ）を形成し、この際、ＬｙｓＲと結合したＤＮＡに構造的変化を起こす。ＬＴＴＲ四
量体に特定的に結合する誘導体は、ＬｙｓＲタンパク質の構造的変化を引き起こせ、引き
続きｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎＤＮＡの構造を変化させて、究極的にＲＮＡ重合
酵素がプロモーターに結合することを助けると知られている（図８）。

本発明で重点的に扱われているＣ４−ＬｙｓＲタンパク質に対して構造を調査した結果
、やはりＤＮＡ結合ドメイン（ｈｅｌｉｘ−ｔｕｒｎ−ｈｅｌｉｘｍｏｔｉｆ）である
Ｎ末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）、基質結合ドメインであるＣ末端、そして、これらを連結す
るリンカーを確認することができた（図９）。ＤＮＡ結合ドメインには、Ｔｈｒ−３１、
Ａｒｇ−３４、Ｇｌｕ−４０、そして、Ｌｅｕ−４７など４個のアミノ酸が核心的な役割
を行うと把握され、基質結合ドメインでは、３−ＨＰと結合するのに重要なアミノ酸と二
量体形成などに重要な役割を行うアミノ酸などが確認された。そのうち、３−ＨＰと結合
するのに重要な役割を行うアミノ酸は、Ａｓｐ−１５９、Ｔｈｒ−１６０、Ｐｒｏ−２３
７、そして、Ｐｈｅ−２３９などであり、二量体形成などに重要な役割を行うアミノ酸は
、Ａｌａ−６０、Ｇｌｙ−９１、Ａｒｇ−９４、Ｐｒｏ−１１８、Ｇｌｕ−１３７などで
あった。特に、二量体形成などに重要な役割を行うアミノ酸は、Ｐｒｏ−１１８を除き、
いずれもタンパク質表面に位置した。

ＬｙｓＲタンパク質が転写調節因子であるか否かを確認するために、Ｃ３及びＣ４Ｌ
ｙｓＲタンパク質を暗号化する遺伝子をＰ．ｄｅｎｉｔｒｆｉｃａｎｓ染色体から除去し
、転写が調節される遺伝子（ｍｍｓａｄｈ、３ｈｉｂｄｈＩＶ、３ｈｐｄｈ）の転写誘導
有無を調査した。まず、Ｃ４ＬｙｓＲ遺伝子が除去された場合、３−ＨＰの存否に関係
なくｍｍｓａｄｈ、３ｈｉｂｄｈＩＶ遺伝子の発現は低く、３−ＨＰを入れても発現が増
大しなかった。また、Ｃ３ＬｙｓＲ遺伝子が除去された場合、３ｈｐｄｈ遺伝子の発現
が３−ＨＰの添加によって増幅されていない。一方、Ｃ３ＬｙｓＲあるいはＣ４Ｌｙ
ｓｒＲ遺伝子が除去された菌株に、これら遺伝子をプラスミドを用いて再び発現させた時
（補償実験；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）、野生菌株のよ
うなレベルに３−ＨＰによる発現増幅現象が再び回復された。これを通じてＣ３Ｌｙｓ
Ｒ及びＣ４ＬｙｓＲタンパク質が細胞内でそれぞれｍｍｓａｄｈ、３ｈｉｂｄｈＩＶ及
び３ｈｐｄｈ遺伝子の発現を制御する転写調節タンパク質であるということを確認するこ
とができた。

（３）Ｃ４−ＬｙｓＲタンパク質とＯ１、Ｏ２ｏｐｅｒａｔｏｒ部位の結合特性に対す
るｉｎｖｉｔｒｏ調査

Ｃ４−ＬｙｓＲタンパク質のｉｎｖｉｔｒｏ特性調査のために、Ｃ末端にヒスチジン
タグ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｔａｇ）を有するＣ４−ＬｙｓＲタンパク質を大腸菌で生産
して精製した。まず、Ｃ末端とＮ末端とにＨｉｓＴａｇを付け、前述した補償（ｃｏｍ
ｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）実験を進行した。その結果、２つの場合、いずれもＨｉｓ
ｔａｇを有さない野生型ＬｙｓＲと同じ性能を示した。したがって、２つの組換え（ｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ＬｙｓＲの中からＣ−ＨｉｓｔａｇＬｙｓＲのみを対象にして
生化学的（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）実験を進行した。組換えＬｙｓＲは、大腸菌内でほ
とんど不溶性形態で発現された。発現条件（温度、ｐＨ、培地組成、ＩＰＴＧ濃度）に対
して精密な最適化（ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）実験が進められた。また、各種のシャペ
ロンタンパク質（ｃｈａｐｅｒｏｎｅｐｒｏｔｅｉｎ）の影響も調査された。その結果
、比較的低い温度である２５℃、そして、０．１ＭＩＰＴＧ、ＬＢ培地、ＧｒｏＥＬ−
ＥＳシャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）共同発現条件で実験に必要な程度の水溶性Ｃ４−
ＬｙｓＲを大腸菌から生産することができた（図１０）。純粋分離されたタンパク質をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥを通じて確認した。Ｃ４−ＬｙｓＲのサイズは、約３３ｋＤａと推定され
、これは、遺伝子サイズから予測されたサイズとよく一致するものであった。一方、ｎａ
ｔｉｖｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓを実施した結果、タンパク質の濃度
が高い時、緩衝溶液内で二量体を形成することが分かった（図１１）。

遺伝子組換えＣ４−ＬｙｓＲとプロモーターＤＮＡとの結合をＥＭＳＡ実験を通じて調
査した（図１２）。そのために、３種のＤＮＡ断片を合成した。Ｆ１２（１３５ｂｐ）は
、Ｃ４−Ｌｙｓとｍｍｓａｄｈ遺伝子との間の全体プロモーター部位（ｐｒｏｍｏｔｅｒ
ｒｅｇｉｏｎ）であって、Ｏ１、Ｏ２ｏｐｅｒａｔｏｒをいずれも含むＤＮＡ断片；
Ｆ１２Ｍ（１３５ｂｐ）は、Ｏ１ｏｐｅｒａｔｏｒ部位（ｒｅｇｉｏｎ）のみ含むＤＮ
Ａ断片；そして、Ｆ１Ｍ２（１３５ｂｐ）は、Ｏ２ｏｐｅｒａｔｏｒ部位のみ含むＤＮ
Ａ断片であった。対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）として１個の断片を合成して使用したが、こ
れらは、Ｆ１２と同じサイズを有しているが、Ｏ１、Ｏ２部位がいずれも任意抽出されて
、ｐｌｉｎｄｒｏｍｅ構造を有さないように製作された断片であった。Ｃ４−ＬｙｓＲタ
ンパク質をＤＮＡ断片（Ｆ１２、Ｆ１２Ｍ、Ｆ１Ｍ２）と反応させて電気泳動を実施した
結果、ＤＮＡ断片の移動性（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）が減少することが観察された（図１２）
。これは、Ｃ４−ＬｙｓＲタンパク質がｉｎｖｉｔｒｏ条件でこれらＤＮＡ断片と結合
するという意味である。このような移動性の減少は、対照群断片（ｃｏｎｔｒｏｌｆｒ
ａｇｍｅｎｔ）では観察されていない。すなわち、Ｃ４−ＬｙｓＲとＤＮＡ断片（ｆｒａ
ｇｍｅｎｔ）との結合は、ＤＮＡ断片の塩基配列、より正確には、Ｏ１、Ｏ２ｏｐｅｒ
ａｔｏｒ配列があってこそ可能であるという意味である。３種の断片のうちからＦ１２が
最もＬｙｓＲタンパク質に対して親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）が高く、次がＦ１２Ｍ、Ｆ
１Ｍ２順であった。ＥＭＡＳＡ実験を３−ＨＰが存在する条件で繰り返した。３−ＨＰの
存在は、親和度を変化させた。Ｆ１２に対しては、親和度を向上させ、Ｆ１の場合には、
ほとんど変化がなく、一方、Ｆ２は、親和度がむしろ多少減少すると表われた。

Ｆ１２が、Ｆ１２ＭあるいはＦ１Ｍ２断片に比べて高い親和度を有するということは、
ＬｓｙＲタンパク質のＯ１、Ｏ２結合が互いに相互協同的（ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ）で
あることを意味する。すなわち、親和度が高いＯ１ｓｉｔｅにＬｙｓＲタンパク質が結
合すれば、Ｏ２ｓｉｔｅ結合を促進するという意味である。ＥＭＳＡ実験結果、Ｆ１２
は、Ｆ１２ＭあるいはＦ１Ｍ２断片に比べて常に低い移動性を示した。そして、低いＬｙ
ｓＲ濃度でも、単に１つのシフト（ｓｈｉｆｔ）されたバンド（ｂａｎｄ）のみを示した
。これは、Ｆ１２断片に常にさらに多いＬｙｓＲタンパク質が結合されているということ
を意味する。すなわち、ＬｙｓＲタンパク質がＦ１２断片に結合する時は、常にＯ１、Ｏ
２ｓｉｔｅ２ついずれもに結合するという意味である。Ｆ１２断片がＦ１２Ｍあるい
はＦ１Ｍ２よりも高い親和度を有し、また、Ｆ１２ＭやＦ１Ｍ２よりも低い移動性を有す
るということは、Ｆ１２断片内のＯ１、Ｏ２ｓｉｔｅに対するＬｙｓＲタンパク質の結
合が相互協同的であるという事実を示す。このようなＥＭＳＡ実験結果から３−ＨＰ誘導
性プロモーターの重要な性質を次のように整理することができた。（ｉ）プロモーターは
、それぞれ９個の塩基からなる逆反復配列対を２個あるいはそれ以上有することを特徴と
し、ＬｙｓＲタンパク質の結合部位を提供する。（ｉｉ）ＬｙｓＲタンパク質は、誘導性
分子（ｉｎｄｕｃｅｒｍｏｌｅｃｕｌｅ）との結合有無に関係なくプロモーターに結合
することができるが、転写効率の向上は、誘導性分子と結合したＬｙｓＲタンパク質によ
ってのみ表われ、誘導性分子としては、３−ＨＰ以外にも、３−ＨＰと構造的に類似した
３−ＨＩＢ、３−ＨＢなどが使われる。（ｉｉｉ）プロモーターは、ＬｙｓＲタンパク質
二量体が２個結合する部位を提供し、この結合は、互いに相互協同的である。（ｉｖ）プ
ロモーターは、ＲＮＡ重合酵素が結合する場合、ＬｙｓＲタンパク質と相互作用（ｉｎｔ
ｅｒａｃｔｉｏｎ）することができる構造を提供する。（ｖ）プロモーターには、Ｏ１、
Ｏ２ｏｐｅｒａｔｏｒが存在し、それぞれのｏｐｅｒａｔｏｒは、９個の塩基からなる
逆反復内の塩基配列がよく保存されている。

（４）３−ＨＰ誘導性遺伝子発現システムの仮想探索及び発現システムの特性分析

新たな３−ＨＰ誘導性遺伝子発現システムを探すために、シュードモナス・デニトリフ
ィカンス遺伝子相同性に基づいて推定的ＬｙｓＲ調節遺伝子及びｍｍｓａｄｈ、３ｈｉｐ
ｄｈ、３ｈｐｄｈなどを多様な微生物でスクリーニングした。ＢｌａｓｔＰ類似性調査結
果、他の多様な微生物でも類似している３−ＨＰ誘導性遺伝子発現システムが存在すると
表われ、よく知られた微生物のうちから３ＨＩＢＤＨ（Ｃ４システム）と３ＨＰＤＨ（Ｃ
３システム）と推定される遺伝子集団があると明かになった（図１３、表４及び表５）。
遺伝子の構造分析及び比較結果、微生物ごとに多様な遺伝的構造を有すると確認された。

総１５０余種以上の微生物で３−ＨＰ誘導性遺伝子発現システムが発見され、これらは
、Ｃ３−ＬｙｓＲとＣ４−ＬｙｓＲとの存否と遺伝子配列特徴によって総１６個のグルー
プに分けることができた。そのうち、９個のグループは、Ｃ４及びＣ３システムをいずれ
も有しており、７個のグループは、Ｃ４システムのみ有していた。Ｃ３システムのみ有す
るグループは、全く見つけられていない。また、Ｃ３システムの場合、ＬｙｓＲタンパク
質を暗号化する遺伝子とＬｙｓＲタンパク質によって発現が調節される遺伝子は、いずれ
も転写方向が反対であるという特徴があった。Ｃ４システムの場合にも、ＬｙｓＲタンパ
ク質を暗号化する遺伝子ＬｙｓＲタンパク質によって発現が調節される遺伝子は、ほとん
ど転写方向が反対であるという特徴があったが、Ｇｒｏｕｐ１５とＧｒｏｕｐ１６と
に属す微生物では、この方向が互いに同一であった。

Ｃ３及びＣ４ＬｙｓＲタンパク質に反応するプロモーターシーケンス特徴を分析した
。Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓの場合と同様に、２つのｔａｎｄｅｍｏｐｅｒａｔ
ｏｒｓｉｔｅｓ（Ｏ１及びＯ２と名付ける）がいずれも存在した。２つのｏｐｅｒａｔ
ｏｒは、一対の対称（ｄｙａｄｓｙｍｍｅｔｒｙ）構造を有しており、それぞれの逆反
復配列は、９個の塩基で構成されていた。一対の対称中心間の距離は、５０個塩基距離を
有しており、ＬｙｓＲタンパク質がＯ１及びＯ２ｏｐｅｒａｔｏｒｓｉｔｅに結合す
る時、同じ方向で結合するように間隔を保持した。また、逆反復配列内の９個塩基は、多
くの微生物でよく保存されていた。

３−ＨＰに反応するＬｙｓＲとの結合部位（Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ）は、多様な微生
物で保存されていたが、それぞれの種によって、Ｏ１ｏｐｅｒａｔｏｒ、すなわち、１
次／抑制結合サイト（Ｐｒｉｍａｒｙ／ＲｅｐｒｅｓｓｉｏｎＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔ
ｅ；ＰＢＳ／ＲＢＳ）のみが保存されていた（表３）。また、あらゆる種において、保存
されたＴ−Ｎ_{１１／１２}−Ａｍｏｔｉｆを含む高い親和度を示すＰＢＳは、転写開始サ
イト（ＴＳＳ）から−６５〜−７５部位付近に存在した。Ｏ２ｏｐｅｒａｔｏｒ、すな
わち、２次／活性結合サイト（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ／ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎＢｉｎｄｉ
ｎｇＳｉｔｅ；ＳＢＳ／ＡＢＳ）ｍｏｔｉｆでは、配列保存性が低いために、ＡＢＳ
ｍｏｔｉｆのｉｎｓｉｌｉｃｏ予測は複雑かつ難しい。ＲＢＳ及びＡＢＳサイトは、そ
れぞれ自己−抑制及び活性化において、核心的な役割を担当すると報告されている。３−
ＨＰに反応するタンパク質として共通の機能を有するにもかかわらず、３−ＨＰ−Ｌｙｓ
Ｒタンパク質は、他の属（ｇｅｎｕｓ）間には、低い配列類似性を有し、同一属内では、
高い配列類似性を有する。したがって、ＬｙｓＲタンパク質と結合するｏｐｅｒａｔｏｒ
部位ＤＮＡシーケンスが、他の属間に互いに異なることが論理的に間違っていないと判断
される。転写因子（Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ；−１０ａｎｄ −３５ｒｅｇｉｏｎｓ）は
、ＢＰＲＯＭ及びＢＤＧＰｔｏｏｌｓを使用して予測した。

下記の表３に記載した９個の塩基配列は、それぞれの種（ｇｅｎｕｓ）で３−ＨＰに反
応するＬｙｓＲとの結合部位に該当する保存領域であって、大文字は、確認対象いずれも
で保存されたものと表われる塩基である。

＃Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｔｉｖｅｓ：Ｇｅｎｕｓ内で同じＲｅｐｒｅｓｓｉｖｅＢｉ
ｎｄｉｎｇＳｉｔｅ（ＲＢＳ）を有すると確認された種の数字。

ＬｙｓＲタンパク質に対する分析も、同様に実施した。ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ
ＮＣＢＩデータベースからＣ４ＬｙｓＲとＣ３ＬｙｓＲシーケンスに対してＢＬＡＳ
Ｔ検索結果、ＤＮＡ結合ヘリックスターンヘリックス領域と相同性を有するシーケンスが
、それぞれ１２６個、１３２個で存在することを確認した。図１４及び図１５に、このシ
ーケンスに対する多重配列配置（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅ
ｎｔ）を示した。シーケンスアライメント（ｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔ）結
果、ＬｙｓＲシーケンスの相当部分が高く保存されていると確認され、この分析に使われ
た他の微生物でも、ＬｙｓＲシーケンスが高いレベルに保存されていると表われた。これ
は、ほとんどの微生物が細胞内でＬｙｓＲを利用しているということを言う。また、あら
ゆるＣ４ＬｙｓＲとＣ３ＬｙｓＲシーケンスでプロモーター３−ＨＰ発現プロモータ
ー内のｏｐｅｒａｔｏｒ部位の逆反復配列（ＩｎｖｅｒｔｅｄＲｅｐｅａｔｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ）と強く結合すると推定されるヘリックスターンヘリックス領域が見つけられ、
この領域では、Ｔｈｒ−３１、Ａｒｇ−３４、Ｇｌｕ−４０、そして、Ｌｅｕ−４７など
４個の残基がよく保存されていた。保存されたアミノ酸残基は、ＬｙｓＲタンパク質がＤ
ＮＡと結合する時、強く相互作用するのに重要な部分であると考えられる（図９）。

ＬｙｓＲと３−ＨＰとの間の相互作用（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｇａｎｄｉｎｔｅｒａ
ｃｔｉｏｎ）をさらに詳細に調べるために、ホモロジーモデリング（ｈｏｍｏｌｏｇｙ
ｍｏｄｅｌ）とドッキング（ｄｏｃｋｉｎｇ）実験を行った。まず、ＰＤＢデータベース
で利用可能な構造を用いてシュードモナス・デニトリフィカンスでのＣ４−ＬｙｓＲとＣ
３−ＬｙｓＲとのシーケンス類似性を比較した結果、３５％以下の低い類似性を示した（
ＰＤＢＩＤ：３ＳＺＰ、２４％ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）。したがって、Ｃ４−ＬｙｓＲ
とＣ３−ＬｙｓＲとのモデリングは、ＭＵＳＴＥＲとＬＯＭＥＴｓｅｒｖｅｒを用いた
ｔｈｒｅａｄｉｎｇ方法で行った。その結果、予測されたＣ４−ＬｙｓＲとＣ３−Ｌｙｓ
ＲとのモデルをＲＡＭＰＡＧＥを用いて精製及び検証し、このモデルのアミノ酸残基９８
％が適した領域にあることをＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎｐｌｏｔを通じて確認した。Ｃ
４−ＬｙｓＲとＣ３−ＬｙｓＲで３−ＨＰが結合する活性部位がＣＯＡＣＨを用いて予測
された。有効なモデルと予測された活性部位残基は、ＳＣＨＲＯＤＩＮＧＥＲＴＭにある
Ｍａｅｓｔｒｏプログラムでドッキング実験を行うのに使われた。目標タンパク質（Ｃ４
−ＬｙｓＲ、Ｃ３−ＬｙｓＲ）とリガンド（３−ＨＰ）は、それぞれＰｒｏｔｅｉｎＰ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎＷｉｚａｒｄとＬｉｇＰｒｅｐＷｉｚａｒｄとを使用して調査
された。Ｇｒｉｄｂｏｘを生成するために、ＲｅｃｅｐｔｏｒＧｒｉｄＧｅｎｅｒ
ａｔｉｏｎツールを使用し、生成されたｇｒｉｄｂｏｘ内でＳＰ（Ｓｔａｎｄａｒｄ
Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）及びＸＰ（ｅＸｔｒａＰｒｅｃｉｓｉｏｎ）ドッキングセッティ
ング（ｓｅｔｔｉｎｇ）を用いてリガンドドッキングを行った。ドッキング結果、Ｃ４−
ＬｙｓＲに対しては、５．０１、Ｃ３−ＬｙｓＲに対しては、３．７４のドッキング点数
を有する時、最も優れたドッキングポーズ（ｐｏｓｅ）を示した。Ｃ４−ＬｙｓＲ及びＣ
３−ＬｙｓＲが、３−ＨＰとさまざまな分子との間の相互作用を有すると確認された。Ｃ
４−ＬｙｓＲのアミノ酸残基のうち、Ａｓｐ−１５９、Ｔｈｒ−１６０、Ｐｒｏ−２３７
及びＰｈｅ−２３９などは、３−ＨＰと水素結合をなし、ＡＲＧ２４は、３−ＨＰと疎水
性相互作用を成すと調査された（図９）。Ｃ３−ＬｙｓＲのアミノ酸残基のうち、ＬＥＵ
７４、ＴＨＲ１９０、ＴＨＲ２８は、水素結合をなし、ＴＨＲ７３、ＶＡＬ１５０、ＰＲ
Ｏ１６７、ＰＨＥ１２７、ＰＨＥ１６９の場合、疎水性相互作用を成すと調査された。３
−ＨＰとＬｙｓＲとの間の相互作用がないという予測とは異なって、ドッキング結果、注
目すべき点は、３−ＨＰがＣ４−ＬｙｓＲに存在する基質結合ドメイン（ＡＲＧ９４、Ｌ
ＹＳ９６、ＧＬＵ１３７）とヘリックスターンヘリックスドメイン（ＡＲＧ２４）との間
で強い相互作用することを示したものである。これと類似しているように、Ｃ３−Ｌｙｓ
ＲのＴＨＲ２８（ｈｅｌｉｘ−ｔｕｒｎ−ｈｅｌｉｘｄｏｍａｉｎ）が、３−ＨＰと強
く相互作用すると明かになった。特に、基質結合ドメインでは、３−ＨＰと結合以外にも
、二量体形成などに重要な役割を行うアミノ酸が確認された。これらは、アミノ酸は、Ａ
ｌａ−６０、Ｇｌｙ−９１、Ａｒｇ−９４、Ｐｒｏ−１１８、Ｇｌｕ−１３７などであっ
た。特に、二量体形成などに重要な役割を行うアミノ酸は、Ｐｒｏ−１１８を除き、いず
れもタンパク質表面に位置した。このことから、３−ＨＰがＬｙｓＲに直接に影響を及ぼ
してＬｙｓＲを二量体化反応が起こるようにすれば、二合体反応が起こったＬｙｓＲは、
ＤＮＡと結合してＬｙｓＲ遺伝子下側に位置する３−ＨＰ分解遺伝子の転写を高いレベル
に調節することである。

（５）３−ＨＰ誘導性遺伝子を有する微生物による３−ＨＰ分解及び３−ＨＰ誘導性遺伝
子の発現

遺伝子構造分析で、３−ＨＰ分解経路が多様な微生物で存在すると明かになった。多様
な微生物の３−ＨＰ分解能を評価するために、２５ｍｍｏｌ／Ｌの３−ＨＰが含まれた１
００ｍＭリン酸塩溶液に細胞を懸濁し、２４時間の間に３−ＨＰを分解させた（表６）。
その結果、微生物によって３−ＨＰ分解速度は差があったが、いずれも効果的に３−ＨＰ
を分解すると表われた。３−ＨＰ分解遺伝子（３ｈｐｄｈ、３ｈｉｂｄｈ、ｍｍｓａｄｈ
）の転写レベルを３−ＨＰ存否によって評価した（表７）。表７から見るように、３−Ｈ
Ｐは、これら微生物で３ｈｐｄｈ、３ｈｉｂｄｈ、ｍｍｓａｄｈ遺伝子の発現をそれぞれ
６倍、１４倍、１６倍以上に高く向上させた。この結果は、多様な微生物内に３−ＨＰ誘
導性システムが共通して存在するということを意味する。一方、シュードモナス・デニト
リフィカンスと比較して、他の微生物では、転写増加比率が１０倍程度相対的に低いが、
これは、培養条件の差に起因すると判断される。すなわち、シュードモナス・デニトリフ
ィカンスを除き、他の微生物では、成長を良くするために、複合窒素源が多量含有された
培地で微生物を培養したが、この場合、３−ＨＰ以外に複合窒素源に含まれたアミノ酸や
これらアミノ酸分解産物が３−ＨＰが存在しない条件でも、一定部分３ｈｐｄｈ、３ｈｉ
ｂｄｈ、ｍｍｓａｄｈの転写を活性化させて３−ＨＰが存在しない条件で転写量を高く保
持させたためである。

^ａＴｈｅａｍｏｕｎｔｏｆ３−ＨＰｄｅｇｒａｄｅｄｗａｓｃａｌｃｕｌａ
ｔｅｄｂｅｔｗｅｅｎ０ａｎｄ２４ｈ。

これら微生物で３−ＨＰ誘導性プロモーターに対する分析を実施した。前記Ｐ．ｄｅｎ
ｉｔｒｉｆｉｃａｎｓの場合と同様に、あらゆるプロモーターは、Ｏ１、Ｏ２ｏｐｅｒ
ａｔｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅを有していた。この配列の存在は、それぞれ９個の塩基から
なるｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅと確認された。これら配列についての
追加的な研究が進められていないが、これらいずれもＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓの
場合のように、ＬｙｓＲタンパク質と結合すると予想された。

結論的に、生物学的に３−ＨＰ生産を向上させるためには、酵素活性を有する新たな酵
素を継続的に生産することが必要である。本発明では、シュードモナス・デニトリフィカ
ンスを含めた多様な微生物で３−ＨＰに反応する転写調節因子とプロモーターとをスクリ
ーニングした。これらは、ＬｙｓＲタンパク質と、このタンパク質に結合する特定の遺伝
子塩基配列からなっている。また、ＬｙｓＲｆａｍｉｌｙｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ
ｎａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒは、３−ＨＰが存在する時、当該遺伝子の発現を上向き調節
すると確認された。分子モデリングとドッキング実験は、Ｃ４−ＬｙｓＲ（ＡＲＧ９４、
ＬＹＳ９６、ＧＬＵ１３７、ＡＲＧ２４）とＣ３−ＬｙｓＲ（ＬＥＵ７４、ＴＨＲ１９０
、ＴＨＲ２８、ＴＨＲ７３、ＶＡＬ１５０、ＰＲＯ１６７、ＰＨＥ１２７、ＰＨＥ１６９
）とに重要な残基が存在することを示した。３−ＨＰ誘導性システムは、３−ＨＰ代謝経
路の調節に効果的に使用可能であると期待される。

＜実施例２＞シュードモナス・デニトリフィカンスで３−ヒドロキシプロピオン酸生産経
路の最適化

１．菌株、プラスミド及び実験材料

この研究で使われたバクテリア種とプラスミドは、表８のようである。大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）は、韓国微生物資源センター（ＫＣＴＣ）から、シュードモナス・デニトリフィ
カンス菌株は、ＡＴＣＣから分譲された。Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅは、プラスミ
ド複製と保持とに使われた。ゲノムのＤＮＡ分離キットとｐＧＥＭ−Ｔベクターは、Ｐｒ
ｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）から、高性能ｐｆｘｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ソウル、大韓民国）から、ＤＮＡ変形酵素は、ＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄＢｉｏ−Ｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）から、Ｍｉｎｉｐｒ
ｅｐとＤＮＡｇｅｌ抽出キットは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ
）から購入した。そして、プライマーは、ＣｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈＣｏ．Ｌｔｄ．
（ソウル、大韓民国）、Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅと酵母エキス（ｙｅａｓｔｅｘ
ｔｒａｃｔ）は、Ｄｉｆｃｏ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ
Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）から、その他の化学物質と酵素は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉ
ｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。

２．シュードモナス・デニトリフィカンス△３ｈｐｄｈ△３ｈｉｂｄｈＩＶ△３ｈｉｂｄ
ｈＩ欠失突然変異菌株の開発

３−ＨＰ分解遺伝子の役割を把握するために、３ｈｉｂｄｈＩがシュードモナス・デニ
トリフィカンス△３ｈｐｄｈ△３ｈｉｂｄｈＩＶの染色体から除去された。目的遺伝子は
、ｓａｃＢｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎシステムに基づい
て欠失した。ｐＱＥ−８０ＬベクターのＮｄｅＩとＸｂａＩ制限部位にｓａｃＢ−Ｋｍカ
セットを導入してｐＱＳＡＫプラスミドが作られ、これは、目的遺伝子の除去に使われた
。シュードモナス・デニトリフィカンスゲノムＤＮＡを使用して目的遺伝子の〜７００ｂ
ｐ上部と下部とを含むＤＮＡ断片がＰＣＲを通じて得られ、この部分は、ＤＮＡシーケン
ス確認後、ｐＧＥＭ−Ｔベクターでクローニングされた。その後、ｐＱＳＡＫプラスミド
内に再びサブクローニング（ｓｕｂ−ｃｌｏｎｉｎｇ）され、二回の組換えを通じてシュ
ードモナス・デニトリフィカンス突然変異株が開発された。このような突然変異菌株は、
ＰＣＲ及びシーケンス確認を通じて再確認された。そのように確保された突然変異菌株を
シュードモナス・デニトリフィカンス△３ｈｐｄｈ△３ｈｉｂｄｈＩＶ△３ｈｉｂｄｈＩ
と名付けた。

３．プラスミドの開発

グリセロール脱水酵素と再活性化酵素とを暗号化する遺伝子は、ｐＵＣＰＫ´／ＰＣ３
−ｄｈａＢ−ｇｄｒＡＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨプラスミドを用いて増幅され、発現カセ
ットは、ｇｄｒＡＢとｄｈａｂ１２３遺伝子先端側面の５´と３´とにＣ３プロモーター
とＣ３ターミネーターとをそれぞれクローニングしながら開発された。この発現カセット
は、ｐＵＣＰＫ´／ＰＣ３−ｄｈａＢ−ｇｄｒＡＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨプラスミドの
ＸｂａＩとＳａｃＩ制限部位で複製され、ｐＵＣＰＫ´／ＰＣ３−ｇｄｒＡＢ−ｄｈａＢ
、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨと名付けられた。このように開発されたプラスミドｐＵＣＰＫ´
／ＰＣ３−ｇｄｒＡＢ−ｄｈａＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨは、シュードモナス・デニトリ
フィカンス△３ｈｐｄｈ△３ｈｉｂｄｈＩＶ△３ｈｉｂｄｈＩに形質転換され、最終的に
Ｐｄ △３ｈｐｄｈ△３ｈｉｂｄｈＩＶ△３ｈｉｂｄｈＩ（ｐＵＣＰＫ´／ＰＣ３−ｇｄ
ｒＡＢ−ｄｈａＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨ）が開発された（図１６）。

４．酵素活性の決定

ＤｈａＢ活性は、ＫＧＳＡＤＨ酵素の活性測定を通じて測定が可能である。１Ｕｎｉｔ
のＤｈａＢ活性は、１分間１μｍｏｌのＮＡＤ＋をＮＡＤＨへの還元に必要な酵素の量と
定義される。要約するが、まず、１ｍＭＤＴＴ、１５ｕＭコエンザイムＢ_１２、３ｍ
ＭＭｇＣｌ_２、１．５ｍＭＡＴＰを含んでいる５０ｍＭリン酸カリウム（ｐｏｔａ
ｓｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ｐＨ８．０）緩衝溶液（総体積１ｍＬ）に２０ｕｌ
の２６Ｕ／ｍｇＮＡＤ＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＫＧＳＡＤＨを３７℃で５分間培養す
る。この際、ＫＧＳＡＤＨは、２５％グリセロールを含有している。反応は、１．５ｍＭ
ＮＡＤ＋と３７℃で予熱されたＤｈａＢとを含む適切な量の細胞抽出物を追加すること
で始まり、ＮＡＤＨの吸光度変化を通じて観察された。ＫＧＳＡＤＨ活性は、Ｒａｊ博士
によって報告された方法を使用して３４０ｎｍでＮＡＤ＋がＮＡＤＨへの還元を測定して
明かになった。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ８．０）、１ｍＭＤＴＴ、適
量の酵素抽出物を含んだ反応混合物が３７℃で５分間培養され、２．０ｍＭ３−ＨＰＡ
と２．０ｍＭＮＡＤ＋とを追加することで反応が始まった。ＮＡＤＨの量は、６．２２
×１０^３Ｍ^−１ｃｍ^−１のｍｏｌａｒｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
（△ε３４０）を使用して決定された。ＫＧＳＡＤＨの１Ｕｎｉｔ活性は、１分に１μｍ
ｏｌのＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元させるのに必要な酵素の必要量によって定義された。あ
らゆる酵素活性は、原料細胞抽出物で測定された。

５．培養培地と培養条件

別途に明示されない限り、振盪培養は、２０ｍＬの培養液を含んだ２５０ｍＬｎｏｎ
−ｂａｆｆｌｅｄＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコを用いて２００ｒｐｍ、３０℃で進め
られた。リットル当たりＭｇＳＯ_４、０．２５ｇ；ＮａＣｌ、１．０ｇ；ＮＨ４Ｃｌ、１
．０ｇ；酵母エキス、１ｇ；グリセロール、１００ｍＭｏｌ；Ｌ−グルタメート（ｇｌｕ
ｔａｍａｔｅ）、５ｇ；トリプトン（ｔｒｙｐｔｏｎｅ）、２ｇ；グルコース（ｇｌｕｃ
ｏｓｅ）２．５ｇを含むＭ９培養培地が使われた。培地は、１００ｍＭリン酸カリウム
緩衝溶液（ｐＨ７．０）が含まれた。必要時に、１２μｍｏｌ／ＬのコエンザイムＢ_１２
がさらに注入され、酸素透過スポンジプラグでフラスコを塞いだ。細胞量、残留基質、代
謝産物の測定のために定期的にサンプリングされ、あらゆる振盪培養実験は、３回反復さ
れ、バイオマスと代謝産物との標準偏差は、１０％未満であった。バイオリアクター実験
は、１．５−Ｌ容量Ｂｉｏｔｒｏｎ−ＬｉＦｌｕｓＧＭバイオリアクター（Ｂｉｏｔｒ
ｏｎ、ソウル、大韓民国）で１Ｌ作業量で行われた。

バイオリアクター実験のためのＭ９培養培地は、リットル当たりＭｇＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ、
０．２５ｇ；ＮａＣｌ、１．０ｇ；ＮＨ_４Ｃｌ、１．０ｇ；酵母エキス、１ｇ；Ｌ−グル
タメート、５ｇ；トリプトン、２ｇ；カザミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏａｃｉｄｓ）、２
ｇ；グルコース２．５ｇ、ｔｒａｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎ、１０ｍＬ／
Ｌを含んでおり、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．０）を含む。培養は、
３０℃流加式培養モードで濃縮されたグリセロール（１０Ｍ）と７ｍＭグルコースとを周
期的に注入しながら行われた。ｐＨは、５ＮＮａＯＨと２．５ＮＨＣｌとを使用して
７．０±０．１に保持された。空気は、ａｇｉｔａｔｉｏｎ速度６５０ｒｐｍに１ｖｖｍ
で供給し続けた。培養中には、トリプトン、２ｇ／Ｌ；カザミノ酸、２ｇ／Ｌ；Ｌ−グル
タメート、５．０ｇ／Ｌ；酵母エキス、１ｇ／Ｌを含む培地が６時間ごとにバイオリアク
ターに追加された。サンプルは、細胞量、残留基質、代謝産物の測定のために定期的に分
析された。

６．分析方法

細胞濃度は、分光光度計（Ｌａｍｂｄａ２０、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；Ｎｏｒｗ
ａｌｋ、ＣＴ、ＵＳＡ）を使用して１０−ｍｍ長さのキュベットで測定された。６００ｎ
Ｍ（ＯＤ６００）吸光度の１ｕｎｉｔは、リットル当たり０．３ｇの乾燥細胞量と一致す
る。タンパク質濃度は、牛血清アルブミンを基準にしてブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏ
ｒｄ）方法でマイクロプレートリーダー（１４２０、ＷａｌｌａｃＶｉｃｔｏｒ２；
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって分析された。グリセロール、３−ＨＰ及び他の代謝
産物の濃度は、ＨＰＬＣによって測定されたが、１０分間１０，０００×ｇで培養サンプ
ルの遠心分離によって得られた上澄み液をＴｕｆｆｒｙｎ−ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａｃｒｏ
ｄｉｓｃ、ＰａｌｌＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）によって濾過し、３００ｍＭ×７．
８ｍＭＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｈ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）ｃｏｌｕｍｎによっ
て６５℃で２．５ｍＭＨ_２ＳＯ_４を移動相として使用して溶出される。

７．結果

（１）組換えＰｄ Δ３ｈｐｄｈΔ３ｈｉｂｄｈＩＶ△３ｈｉｂｄｈＩ（ｐＵＣＰＫ’／
ＰＣ３−ｇｄｒＡＢ−ｄｈａＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨ）の振盪フラスコ培養

本発明者らは、以前研究でグリセロール転換が起こる時、ＤｈａＢによる自滅的な触媒
反応によってＤｈａＢ活性が非常に減少することを観察した。これは、ＤｈａＢを再活性
化させるＧｄｒＡＢの発現程度が低かった可能性がある。また、ＰＣ３プロモーター真下
にＧｄｒＡＢとＤｈａＢとを順次に配列することによって、ＧｄｒＡＢの発現が向上する
と予想した。このような仮説に基づいて、プラスミドｐＵＣＰＫ’／ＰＣ３−ｇｄｒＡＢ
−ｄｈａＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨが開発され、プラスミドは、再びシュードモナス・デ
ニトリフィカンス（以後、Ｐｄと表記する）Δ３ｈｐｄｈΔ３ｈｉｂｄｈＩＶ△３ｈｉｂ
ｄｈＩ菌株に導入された後、３−ＨＰ生産に使われた。グリセロールから３−ＨＰ生産に
対するＧｄｒＡＢとＤｈａＢとの配列順序変更に対する効果は、Ｐｄ Δ３ｈｐｄｈΔ３
ｈｉｂｄｈＩＶ△３ｈｉｂｄｈＩ（ｐＵＣＰＫ’／ＰＣ３−ｇｄｒＡＢ−ｄｈａＢ、ＰＣ
４−ＫＧＳＡＤＨ）で測定された。コエンザイムＢ_１２の供給効果は、０ｈに１２μＭを
供給することで調査された。Ｐｄ Δ３ｈｐｄｈΔ３ｈｉｂｄｈＩＶ△３ｈｉｂｄｈＩ（
ｐＵＣＰＫ’／ＰＣ３−ｄｈａＢ−ｇｄｒＡＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨ）は、対照群とし
て使われた。図１７のＳ１〜Ｓ３は、組換えＰｄ Δ３ｈｐｄｈΔ３ｈｉｂｄｈＩＶ△３
ｈｉｂｄｈＩ（ｐＵＣＰＫ’／ＰＣ３−ｇｄｒＡＢ−ｄｈａＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨ）
によるグリセロールから３−ＨＰの生産を示し、図１７のＯ１〜Ｏ３は、組換えＰｄ Δ
３ｈｐｄｈΔ３ｈｉｂｄｈＩＶ△３ｈｉｂｄｈＩ（ｐＵＣＰＫ’／ＰＣ３−ｄｈａＢ−ｇ
ｄｒＡＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨ）によるグリセロールから３−ＨＰの生産を示す。図１
７のＳ１とＯ１は、グリセロール供給のない場合の結果を示しており、図１７のＳ２とＯ
２は、コエンザイムＢ_１２の供給のない場合の結果を示す。一方、図１７のＳ３とＯ３は
、コエンザイムＢ_１２が供給された結果である。２つの菌株の間に細胞成長には大きな差
がなかった。しかし、コバルト（ｃｏｂａｌｔ）とコエンザイムＢ_１２とが供給されたＰ
ｄ Δ３ｈｐｄｈΔ３ｈｉｂｄｈＩＶ△３ｈｉｂｄｈＩ（ｐＵＣＰＫ’／ＰＣ３−ｇｄｒ
ＡＢ−ｄｈａＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨ）菌株による３−ＨＰ生産は、１２ｈ後、それぞ
れ４１％、２９％に増加した。このような結果は、ＤｈａＢ反応速度がコエンザイムある
いはコバルト量に影響を受けるということを意味する。

コバルトの追加時に、１２ｈに３−ＨＰＡと１，３−ＰＤＯとが生産されることを観察
したが、対照菌株では、３−ＨＰＡが（コバルトある）蓄積されないことが分かった（表
９）。グリセロールから３−ＨＰ生産収率は、〜１であり、これは、供給されたグリセロ
ールが完全に３−ＨＰ生産に使われ、また、生産された３−ＨＰは、再び分解されていな
いということを意味する。

（２）酵素活性

経時的なＤｈａＢとＫＧＳＡＤＨとのｉｎｖｉｔｒｏ酵素活性が測定された（図１８
）。ＤｈａＢ酵素活性は、ＫＧＳＡＤＨ酵素の活性を用いて調査され、ＫＧＳＡＤＨ酵素
活性は、プロピオンアルデヒドを基質として使用して測定された。ＤｈａＢとＧｄｒＡＢ
遺伝子順序が変わる時、ＤｈａＢ活性が低くなると観察された。一方、グリセロール、コ
バルトまたはコエンザイムＢ_１２の追加は、むしろＤｈａＢ酵素の深刻な活性低下を起こ
すと観察された。３−ＨＰＡの蓄積による効果であるか、あるいは他の要因によることで
あるかの追加的な実験が必要である。しかし、１つの明らかな事実は、ｇｄｒＡＢとＤｈ
ａＢ順序を変えることだけではＤｈａＢの酵素活性を十分に向上させることができないこ
とである。現在使用した組換え菌株でｇｄｒＢ発現が向上したか、その有無は確実ではな
い。ｇｄｒＢｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎにクレブシエラ・ニューモニエのＲＢＳが使われ
、今後、この部分に対する検証が必要である。

（３）ＧｄｒＡＢ、ＤｈａＢ、ＫＧＳＡＤＨ過発現組換えＰｄ Δ３ｈｐｄｈΔ３ｈｉｂ
ｄｈＩＶΔ３ｈｉｂｄｈＩ（ｐＵＣＰＫ’／ＰＣ３−ｇｄｒＡＢ−ｄｈａＢ、ＰＣ４−Ｋ
ＧＳＡＤＨ）のバイオリアクター培養

Ｐｄ Δ３ｈｐｄｈΔ３ｈｉｂｄｈＩＶΔ３ｈｉｂｄｈＩ（ｐＵＣＰＫ’／ＰＣ３−ｇ
ｄｒＡＢ−ｄｈａＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨ）とＰｄ Δ３ｈｐｄｈΔ３ｈｉｂｄｈＩＶ
Δ３ｈｉｂｄｈＩ（ｐＵＣＰＫ’／ＰＣ３−ｄｈａＢ−ｇｄｒＡＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤ
Ｈ）との菌株を用いたグリセロールとグルコース流加式バイオリアクター運転が行われた
。バイオリアクター実験で、グルコースとグリセロール濃度は、それぞれ１０、１５０ｍ
Ｍよりも低く保持された。６時間ごとにグルタメートが細胞成長のために供給された。培
養結果、２つのバイオリアクターいずれもで類似している細胞成長が観察された。２つの
培養いずれも成長が９時間後、減少し、その後、細胞成長は反応終了まで持続した。バイ
オリアクターＡでは、Ｐｄ Δ３ｈｐｄｈΔ３ｈｉｂｄｈＩＶΔ３ｈｉｂｄｈＩ（ｐＵＣ
ＰＫ’／ＰＣ３−ｄｈａＢ−ｇｄｒＡＢ、ＰＣ４−ＫＧＳＡＤＨ）菌株が使われた（図１
９）。３−ＨＰ生産は、３６時間までおよそ増加して、５８±２ｇ／Ｌ以上、生産率１．
２ｇ／Ｌ／ｈ、グリセロールから０．９ｍｏｌ／ｍｏｌ以上の３−ＨＰ収率が得られた。
３−ＨＰ生産速度は、３６時間後、減少した。３６ｈから４８ｈの間では、単に２±０．
５ｇ／Ｌの３−ＨＰ生産にとどまった。全体として４８ｈの間に、１．０ｇ／Ｌ／ｈの生
産性、グリセロールから３−ＨＰ収率０．９３ｍｏｌ／ｍｏｌで６０±２ｇ／Ｌの３−Ｈ
Ｐが生産された。以前実験、すなわち、３ｈｉｂｄｈＩが欠失していない菌株の発酵実験
と比較する時、３−ＨＰ生産収率が大きく向上したが、これは、３ｈｉｂｄｈＩが３−Ｈ
Ｐの分解に重要な役割を行っていることを確認させる。３ｈｉｂｄｈＩの影響は、発酵時
間が短いフラスコ実験では全く観察されていない。

バイオリアクターＢで遺伝子（ｄｈａＢとｇｄｒＡＢ）順序が変わった菌株を利用し、
その結果、３−ＨＰ生産が発酵後半により向上した。１．３ｇ／Ｌ／ｈの生産性、グリセ
ロールから３−ＨＰ収率０．９５ｍｏｌ／ｍｏｌで約６３±２ｇ／Ｌの３−ＨＰが生産さ
れた。バイオリアクターＡに比べて、３−ＨＰ生産が５％増加した。たとえ酵素活性分析
やフラスコ実験では、その結果が表われなかったが、ＧｄｒＡＢ発現程度が３−ＨＰ生産
で非常に重要であるということを意味する。

結論的に、３−ＨＰ生産経路酵素であるＤｈａＢ、ＧｄｒＡＢとＫＧＳＡＤＨとが発現
される時、シュードモナス・デニトリフィカンスは、グリセロールから３−ＨＰを生産す
ることができた。組換えプラスミドは、ＰＣ３とＰＣ４という２つのの強力な誘導プロモ
ーターを使用して開発され、３個の遺伝子が欠失したＰｄ Δ３ｈｐｄｈΔ３ｈｉｂｄｈ
ＩＶΔ３ｈｉｂｄｈＩが宿主として使われた。ＤｈａＢの不活性化程度を緩和させるため
に、ｇｄｒＡＢをｄｈａＢ前に位置させ、これにより、ｇｄｒＡＢの発現が強化されるこ
とができた。酵素活性分析とＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じたタンパク質発現分析は、このよう
な位置変化を通じてＤｈａＢの活性が低くなることを示した。しかし、減少したＤｈａＢ
の活性にもかかわらず、３−ＨＰ生産は向上した。また、新たな組換え菌株を用いた流加
式バイオリアクターの運転結果、さらに高い濃度、生産性及び収率が得られた。

Claims

３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）またはその類似体に反応するＬｙｓＲタンパ
ク質との結合部位を含む３−ＨＰまたはその類似体誘導性プロモーター。
前記プロモーターは、３−ＨＰ分解能を有した微生物から由来したことを特徴とする請
求項１に記載の３−ＨＰまたはその類似体誘導性プロモーター。
前記３−ＨＰ分解能を有した微生物は、アクロモバクター・デニトリフィカンス、アシ
ドボラックス・アベナエｓｕｂｓｐ．、アシドボラックス、アシネトバクター・バウマニ
、エロモナス・ハイドロフィラ、アグロバクテリウム、アルカリゲネス・フェーカリス、
アルカニボラックス・ホンデンジェンシス、アリシクリフィルス・デニトリフィカンス、
アルテロモナス・マリナ、アミコラトプシス、アナエロミクソバクター・デハロゲナンス
、アゾスピリルム・ブラシレンセ、アゾトバクター・ビネランジー、ベイジェリンキア・
インディカ、ボルデテラ・アビウム、ブラディリゾビウム・ジャポニクム、バークホルデ
リア・アンビファリア、カテヌリスポラ・アシジフィラ、カウロバクター、カステラニエ
ラ・デフラグランス、クロモバクテリウム・ビオラセウム、コリモナス・アレネ、コマモ
ナス・テストステローニ、コリネバクテリウム・ビタエルミニス、カプリアビダス・ネカ
トール、カービバクター・グラシリス、デルフチア・アシドボランス、フェリモナス・バ
レアリカ、グラシエコーラ・ニトラティレデューセンス、ゴルドニア・ブロンキアリス、
ハヘラ・チェジュエンシス、ハロモナス・エロンガータ、ヒルチア・リトレア、イディオ
マリナ、ヤンシノバクテリウム・リビダム、キタサトスポーラ・セタエ、クツネリア・ア
ルビダ、メチロバクテリウム、メチロシスティス、ノボスフィンゴビウム、オシアニモナ
ス・スミルノビ、パラコッカス、パルビバクラム・ラバメンティボランス、フェニロバク
テリウム・クンサネンシス、フォトバクテリウム・ガエトブレダ、ポリヌクレオバクター
・ネセサリウスアシムビオティカス、シュードアルテロモナス・カーラゲーノボラ、シュ
ードグルベンキアニア、シュードモナス・デニトリフィカンスＡＴＣＣ１３８６７、シュ
ードモナス・ナックムッシイ、シュードモナス・プロテゲンス、シュードモナス・フル
オレッセンス、シュードキサントモナス・スパディックス、サイクロバクター・フェニル
ピルビクス、ラルストニア・オキサラティカ、ロドミクロビウム・バニエリ、セグニリパ
ルス・ロツンダス、シェワネラ・オネイデンシス、シミデュイア・アガロボランス、シノ
リゾビウム・メリロティ、スフィンゴビウム・クロロフェノリカム、スフィンゴモナスウ
ィッティチアィ、スフィンゴピキシス・アラスケンシス、ステノトロフォモナス・マルト
フィリア、ストレプトマイセス・ノドサス、タトロキア・ミクダデイ、タラソスピラ・シ
アメネンシス、バリオボラックス・パラドクサス、ベルミネフロバクター・エイセニエ、
ビブリオ・ファーニッシイ、キサントバクター・オートトロフィカス、ザントモナス・カ
ンペストリス、及びザントモナス・オリゼからなる群から選択された何れか１つの微生物
であることを特徴とする請求項２に記載の３−ＨＰまたはその類似体誘導性プロモーター
。
前記ＬｙｓＲタンパク質は、ヘリックスターンヘリックス構造からなって、ＤＮＡと結
合するＮ末端ドメイン、３−ＨＰまたはその類似体と結合するＣ末端ドメイン及びＬｙｓ
Ｒタンパク質二量体安定化に寄与するＣ末端ドメインを含むことを特徴とする請求項１に
記載の３−ＨＰまたはその類似体誘導性プロモーター。
前記ヘリックスターンヘリックス構造からなって、ＤＮＡと結合するＮ末端ドメインは
、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項４
に記載の３−ＨＰまたはその類似体誘導性プロモーター。
前記３−ＨＰまたはその類似体と結合するＣ末端ドメインは、配列番号３で表されるア
ミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項４に記載の３−ＨＰまたはその類似体誘導性プ
ロモーター。
前記ＬｙｓＲタンパク質二量体安定化に寄与するＣ末端ドメインは、配列番号４で表さ
れるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項４に記載の３−ＨＰまたはその類似体誘
導性プロモーター。
前記ＬｙｓＲタンパク質との結合部位は、ＬｙｓＲタンパク質二量体が２個結合するこ
とを特徴とする請求項１に記載の３−ＨＰまたはその類似体誘導性プロモーター。
前記ＬｙｓＲタンパク質との結合部位は、配列番号５〜配列番号４３からなる群から選
択された何れか１つで表示された塩基配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の３−
ＨＰまたはその類似体誘導性プロモーター。
前記ＬｙｓＲタンパク質との結合部位は、前記配列番号５〜配列番号４３からなる群か
ら選択された何れか１つで表示された塩基配列からなる逆反復配列及びそれと対を成す逆
反復配列が２回反復されることを特徴とする請求項９に記載の３−ＨＰまたはその類似体
誘導性プロモーター。
前記ＬｙｓＲタンパク質との結合部位は、配列番号４４または配列番号４５で表される
塩基配列からなることを特徴とする請求項１０に記載の３−ＨＰまたはこれの類似体誘導
性プロモーター。
前記類似体は、
３−ヒドロキシイソ酪酸（３−ＨＩＢ）または３−ヒドロキシ酪酸（３−ＨＢ）である
ことを特徴とする請求項１に記載の３−ＨＰまたはその類似体誘導性プロモーター。
請求項１ないし請求項１２のうち何れか一項に記載の３−ＨＰまたはその類似体誘導性
プロモーターを含む組換え発現ベクター。
前記３−ＨＰまたはその類似体誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来タンパ
ク質をコーディングする遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の組換え
発現ベクター。
前記外来タンパク質は、グリセロールデヒドラターゼ（ＤｈａＢ）、グリセロールデヒ
ドラターゼ再活性化酵素（ＧｄｒＡＢ）及びα−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼ（ＫＧＳＡＤＨ）であることを特徴とする請求項１４に記載の組換え発現ベクタ
ー。
請求項１３に記載の組換え発現ベクターで形質転換された組換え微生物。
前記微生物は、３−ＨＰ生産能を有したことを特徴とする請求項１６に記載の組換え微
生物。
前記微生物は、シュードモナス・デニトリフィカンスであることを特徴とする請求項１
７に記載の組換え微生物。
前記微生物は、シュードモナス・デニトリフィカンス菌株で３−ＨＰ分解に関連した３
ｈｐｄｈ、３ｈｉｂｄｈ及びｍｍｓａｄｈ遺伝子が欠失したシュードモナス・デニトリフ
ィカンスΔ３ｈｐｄｈΔ３ｈｉｂｄｈＩＶ△３ｈｉｂｄｈＩ菌株であることを特徴とする
請求項１７に記載の組換え微生物。
請求項１６に記載の組換え微生物を培養する段階を含む３−ＨＰ生産方法。
３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）またはその類似体に反応するＬｙｓＲタンパ
ク質をコーディングするｌｙｓＲ遺伝子、前記ＬｙｓＲタンパク質との結合部位を含むプ
ロモーター及び発現目的タンパク質をコーディングする遺伝子を含む３−ＨＰまたはその
類似体反応性組換え遺伝子発現カセット。
前記ＬｙｓＲタンパク質または前記プロモーターは、３−ＨＰ分解能を有した微生物か
ら由来したことを特徴とする請求項２１に記載の３−ＨＰまたはその類似体反応性組換え
遺伝子発現カセット。
前記３−ＨＰ分解能を有した微生物は、アクロモバクター・デニトリフィカンス、アシ
ドボラックス・アベナエｓｕｂｓｐ．、アシドボラックス、アシネトバクター・バウマニ
、エロモナス・ハイドロフィラ、アグロバクテリウム、アルカリゲネス・フェーカリス、
アルカニボラックス・ホンデンジェンシス、アリシクリフィルス・デニトリフィカンス、
アルテロモナス・マリナ、アミコラトプシス、アナエロミクソバクター・デハロゲナンス
、アゾスピリルム・ブラシレンセ、アゾトバクター・ビネランジー、ベイジェリンキア・
インディカ、ボルデテラ・アビウム、ブラディリゾビウム・ジャポニクム、バークホルデ
リア・アンビファリア、カテヌリスポラ・アシジフィラ、カウロバクター、カステラニエ
ラ・デフラグランス、クロモバクテリウム・ビオラセウム、コリモナス・アレネ、コマモ
ナス・テストステローニ、コリネバクテリウム・ビタエルミニス、カプリアビダス・ネカ
トール、カービバクター・グラシリス、デルフチア・アシドボランス、フェリモナス・バ
レアリカ、グラシエコーラ・ニトラティレデューセンス、ゴルドニア・ブロンキアリス、
ハヘラ・チェジュエンシス、ハロモナス・エロンガータ、ヒルチア・リトレア、イディオ
マリナ、ヤンシノバクテリウム・リビダム、キタサトスポーラ・セタエ、クツネリア・ア
ルビダ、メチロバクテリウム、メチロシスティス、ノボスフィンゴビウム、オシアニモナ
ス・スミルノビ、パラコッカス、パルビバクラム・ラバメンティボランス、フェニロバク
テリウム・クンサネンシス、フォトバクテリウム・ガエトブレダ、ポリヌクレオバクター
・ネセサリウスアシムビオティカス、シュードアルテロモナス・カーラゲーノボラ、シュ
ードグルベンキアニア、シュードモナス・デニトリフィカンスＡＴＣＣ１３８６７、シュ
ードモナス・ナックムッシイ、シュードモナス・プロテゲンス、シュードモナス・フル
オレッセンス、シュードキサントモナス・スパディックス、サイクロバクター・フェニル
ピルビクス、ラルストニア・オキサラティカ、ロドミクロビウム・バニエリ、セグニリパ
ルス・ロツンダス、シェワネラ・オネイデンシス、シミデュイア・アガロボランス、シノ
リゾビウム・メリロティ、スフィンゴビウム・クロロフェノリカム、スフィンゴモナスウ
ィッティチアィ、スフィンゴピキシス・アラスケンシス、ステノトロフォモナス・マルト
フィリア、ストレプトマイセス・ノドサス、タトロキア・ミクダデイ、タラソスピラ・シ
アメネンシス、バリオボラックス・パラドクサス、ベルミネフロバクター・エイセニエ、
ビブリオ・ファーニッシイ、キサントバクター・オートトロフィカス、ザントモナス・カ
ンペストリス、及びザントモナス・オリゼからなる群から選択された何れか１つの微生物
であることを特徴とする請求項２２に記載の３−ＨＰまたはその類似体反応性組換え遺伝
子発現カセット。
前記ＬｙｓＲタンパク質は、ヘリックスターンヘリックス構造からなって、ＤＮＡと結
合するＮ末端ドメイン、３−ＨＰまたはその類似体と結合するＣ末端ドメイン及びＬｙｓ
Ｒタンパク質二量体安定化に寄与するＣ末端ドメインを含むことを特徴とする請求項２１
に記載の３−ＨＰまたはその類似体反応性組換え遺伝子発現カセット。
前記ヘリックスターンヘリックス構造からなって、ＤＮＡと結合するＮ末端ドメインは
、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２
４に記載の３−ＨＰまたはその類似体反応性組換え遺伝子発現カセット。
前記３−ＨＰまたはその類似体と結合するＣ末端ドメインは、配列番号３で表されるア
ミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２４に記載の３−ＨＰまたはその類似体反応性
組換え遺伝子発現カセット。
前記ＬｙｓＲタンパク質二量体安定化に寄与するＣ末端ドメインは、配列番号４で表さ
れるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２４に記載の３−ＨＰまたはその類似体
反応性組換え遺伝子発現カセット。
前記ＬｙｓＲタンパク質との結合部位は、配列番号５〜配列番号４３からなる群から選
択された何れか１つで表示された塩基配列を含むことを特徴とする請求項２１に記載の３
−ＨＰまたはその類似体反応性組換え遺伝子発現カセット。
前記ＬｙｓＲタンパク質との結合部位は、前記配列番号５〜配列番号４３からなる群か
ら選択された何れか１つで表示された塩基配列からなる逆反復配列及びそれと対を成す逆
反復配列が２回反復されることを特徴とする請求項２８に記載の３−ＨＰまたはその類似
体反応性組換え遺伝子発現カセット。
前記ＬｙｓＲタンパク質との結合部位は、配列番号４４または配列番号４５で表される
塩基配列からなることを特徴とする請求項２９に記載の３−ＨＰまたはその類似体反応性
組換え遺伝子発現カセット。
前記類似体は、
３−ヒドロキシイソ酪酸（３−ＨＩＢ）または３−ヒドロキシ酪酸（３−ＨＢ）である
ことを特徴とする請求項２１に記載の３−ＨＰまたはその類似体反応性組換え遺伝子発現
カセット。
請求項２１ないし請求項３１のうち何れか一項に記載の３−ＨＰまたはその類似体反応
性組換え遺伝子発現カセットを含む組換え発現ベクター。
請求項３２に記載の組換え発現ベクターで形質転換された組換え微生物。
請求項２１ないし請求項３１のうち何れか一項に記載の３−ＨＰまたはその類似体反応
性組換え遺伝子発現カセットが宿主細胞の染色体内に挿入されている組換え微生物。
請求項３３に記載の組換え微生物を培養する段階を含む発現目的タンパク質生産方法。
前記組換え微生物を培養する段階は、３−ＨＰを添加する段階をさらに含むことを特徴
とする請求項３５に記載の発現目的タンパク質生産方法。