JP2020132611A - オートファジー調節剤 - Google Patents

Abstract

【課題】新たなオートファジー調節剤の提供。【解決手段】発酵ニンニク又はその抽出物を有効成分とするオートファジー調節剤。【選択図】なし

Description

本発明は、植物由来のオートファジー調節剤に関する。

細胞内のタンパク質や細胞内小器官（オルガネラ）は、不要となったら、あるいは必要に応じ、オートファジーによって分解され、その成分は細胞内で再利用される。オートファジーの活動は、通常状態の細胞では低レベルであるが、細胞が飢餓や低酸素等のストレス環境にさらされると、活発化する。オートファジーは、細胞質成分やオルガネラを包み込んだオートファゴソームと呼ばれる小胞が、リソソームと融合してオートリソソームを形成し、包み込んだ内容物を分解するプロセスで進行する。このようなオートファジーは癌、神経変性疾患、心血管疾患、肺疾患、感染症等の種々の疾患だけでなく、老化や運動機能にも関与していることが知られている。
かかる観点から、オートファジーを誘導又は抑制する成分の探索が行なわれ、梅肉エキス（特許文献１）、アマチャ、イチョウ、コガネバナ、テンニンカ、サクラ、ラン等の植物抽出物（特許文献２）、霊芝抽出物（特許文献３）、センダン抽出物（特許文献４）等にオートファジー誘導作用があることが報告されている。

特開２００７−１４３４５２号公報 特開２０１３−９９３０５号公報 特表２０１６−５０１８６１号公報 特開２０１８−１８８４８０号公報

しかしながら、前記のオートファジー調節剤の作用は十分でなく、医薬、食品、化粧料等に応用可能な新たなオートファジー調節剤の開発が望まれている。従って、本発明の課題は、新たなオートファジー調節剤を提供することにある。

そこで本発明者は、種々の植物由来成分のオートファジーに対する作用を検討してきたところ、ニンニク抽出物ではなく、発酵ニンニク又はその抽出物に優れたオートファジー調節作用があり、医薬、食品又は化粧料等として有用であることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、次の発明〔１〕〜〔５〕を提供するものである。

〔１〕発酵ニンニク又はその抽出物を有効成分とするオートファジー調節剤。
〔２〕発酵ニンニクが、乳酸菌発酵ニンニク又は酵母発酵ニンニクである〔１〕記載のオートファジー調節剤。
〔３〕発酵ニンニクが、酵母発酵ニンニクである〔１〕又は〔２〕記載のオートファジー誘導剤。
〔４〕発酵ニンニクが、乳酸菌発酵ニンニクである〔１〕又は〔２〕記載のオートファジー抑制剤。
〔５〕発酵ニンニク又はその抽出物を有効成分とする、オートファジー調節医薬組成物、オートファジー調節化粧料組成物又はオートファジー調節食品組成物。

本発明のオートファジー調節剤は、優れたオートファジー誘導又は抑制作用を有し、摂取性も良好であり、オートファジーが低下又は異常に活性化することによる種々の疾患の予防、治療や皮膚の各種の症状の改善を目的とする医薬、食品、化粧料として有用である。

オートファジーの模式図とプロセスを示す。 乳酸菌発酵ニンニク末のオートファジー抑制作用を示す。 酵母発酵ニンニク末のオートファジー誘導作用を示す。

本発明のオートファジー調節剤の有効成分は、発酵ニンニク又はその抽出物である。

原料として用いるニンニクは、アリウム・サチバム（Allium sativum）の全草・地上部又は鱗茎を用いるのが好ましく、鱗茎を用いるのがより好ましい。本発明においては、ニンニク又はその抽出物を直接用いるのではなく、発酵ニンニク又はその抽出物を用いるのが、優れたオートファジー調節効果を得る観点及び摂取性の観点から重要である。

発酵ニンニクとしては、乳酸菌発酵ニンニク及び酵母発酵ニンニクが挙げられるが、酵母発酵ニンニクを用いるのが、優れたオートファジー誘導効果を得る点から好ましい。一方、乳酸菌発酵ニンニクは、オートファジー抑制効果を得る点で好ましい。
ニンニクの発酵に用いられる乳酸菌としては、ラクトバシラス属(Lactobacillus)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、ペディオコッカス属(Pediococcus)、リューコノストック属(Leuconostoc)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)に属する乳酸菌が挙げられるが、ラクトバシラス属(Lactobacillus)に属する乳酸菌がより好ましい。また、ニンニクの発酵に用いられる酵母としては、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（シゾサッカロミケス属）、コウジカビとしてAspergillus oryzae、Aspergillus sojae、Aspergillus awamori、Aspergillus glaucus、Penicillium roqueforti、枯草菌としてBacillus属等が挙げられるが、Saccharomyces cerevisiaeがより好ましい。

発酵ニンニクは、例えばニンニクを８０℃以上に加熱処理した後、乳酸菌又は酵母を用いて発酵することにより得ることができる。まず、加熱処理としては、８０℃以上であれば雑菌の増殖を抑制できるが、８５℃以上が好ましく、８０℃〜１２０℃がより好ましい。また加熱処理時間は、５分〜１時間が好ましく、５分〜３０分で十分である。発酵は、乳酸菌又は酵母を添加し、３０〜４０℃で２日〜５日行うのが好ましい。なお、発酵には、グルコース等の糖類を添加して行うのが好ましい。発酵の進行は、ニンニク特有の臭いの変化及びｐＨの低下（ｐＨ６以下への低下）によって確認することができる。

得られた発酵ニンニクは、そのままでも使用できるが、粉砕処理して粉末として使用することもでき、抽出物として使用することもできる。発酵ニンニク抽出物としては、発酵ニンニクから水、熱水、アルコール等の有機溶媒で抽出した抽出物が挙げられる。抽出手段は、特に限定されず、発酵ニンニク又はその粉砕物に、水等の溶媒を添加して溶媒中に溶解した成分を採取すればよい。溶媒抽出にあたって、加熱等を行ってもよく、ソックスレー抽出等を採用してもよい。

発酵ニンニク又はその抽出物は、後記実施例に示すように、優れたオートファジー調節作用を有し、オートファジー活性が低下又は異常に活性化することに起因する疾患や症状に対する予防又は改善剤として有用である。ここで、オートファジー活性が低下することに起因する疾患としては癌、神経変性疾患、心血管疾患、肺疾患、感染症等が挙げられる。また、オートファジー活性が低下することに起因する症状については、肌荒れ、しわ形成等が挙げられる。一方、オートファジー活性が異常に活性化している疾患としては、感染症、癌、膵炎等との関連が挙げられる。
従って、本発明のオートファジー調節剤は、オートファジー調節医薬組成物、オートファジー調節化粧料組成物又はオートファジー調節食品組成物として使用することができる。

これらのオートファジー調節剤及び組成物中に、発酵ニンニク又は抽出物は、乾燥固形分量として０．００１〜５０質量％含有させるのが好ましく、０．００１〜２０質量％含有させるのがより好ましい。

本発明のオートファジー調節剤又はその組成物の製剤化にあたっては、通常の食品、医薬品、化粧料などの製剤化で使用される任意成分を含有することができる。この様な任意成分としては、経口投与組成物であれば、例えば、乳糖や白糖などの賦形剤、デンプン、セルロ−ス、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロ−スなどの結合剤、カルボキシメチルセルロ−スナトリウム、カルボキシメチルセルロ−スカルシウムなどの崩壊剤、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステルなどの界面活性剤、マルチト−ルやソルビト−ルなどの甘味剤、クエン酸などの酸味剤、リン酸塩などの緩衝剤、シェラックやツェインなどの皮膜形成剤、タルク、ロウ類などの滑沢剤、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲルなどの流動促進剤、生理食塩水、ブドウ糖水溶液などの希釈剤、矯味矯臭剤、着色剤、殺菌剤、防腐剤、香料など好適に例示出来る。経皮投与組成物であれば、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリ−ブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、オレイルアルコ−ル、ステアリルアルコ−ル、オクチルドデカノ−ル等の高級アルコ−ル、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤類、ポリエチレングリコ−ル、グリセリン、１，３−ブタンジオ−ル等の多価アルコ−ル類、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を含有することができる。製造は、常法に従い、各種の製剤化に適した手段により行うことができる。また、本発明のオートファジー調節剤の形態としては、錠剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、顆粒、ドリンク剤、乳液、化粧水、クリーム、育毛剤等が好ましい。

次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

製造例１（ニンニク粉末）
生ニンニクの剥き身１００ｇを、ミキサーを用いてペースト化し、次いで７５〜８５℃に３０分加熱した。次いで、凍結乾燥機で４８時間凍結乾燥し、粉末を得た（収量３０％）。

製造例２（乳酸菌発酵ニンニク末）
生ニンニクの剥き身１００ｇを、ミキサーを用いてペースト化し、次いで７５〜８５℃に３０分加熱した。次いで、乳酸菌（bacillus coagulans）を白金耳で植菌し、グルコースを添加し、３５℃で約３日間発酵させた。８５℃に３０分加熱して発酵停止した後、凍結乾燥機で４８時間凍結乾燥し、乳酸菌発酵ニンニク末を得た（収量約３０ｇ）。

製造例３（酵母発酵ニンニク末）
生ニンニクの剥き身１００ｇを、ミキサーを用いてペースト化し、次いで７５〜８５℃に３０分加熱した。次いで、酵母（saccharomyces cerevijiae）を白金耳で植菌しグルコースを添加し、３５℃で約３日間発酵させた。８５℃に３０分加熱して発酵停止した後、凍結乾燥機で４８時間凍結乾燥し、酵母ニンニク末を得た（収量３０ｇ）。

試験例（オートファジー調節効果）
（方法）オートファジーはリソソームにより細胞質内のタンパク質や細胞内小器官を分解するシステムである。オートファジーのプロセスは、（１）オートファジーの誘導と隔離膜の形成、（２）オートファゴソームの形成、（３）リソソームとの融合、（４）内容物の分解のステップにより進行する。オートファゴソーム形成に関わるＬＣ３は翻訳後プロセシングされてＬＣ３−Ｉとして細胞質に拡散する。ＬＣ３−Ｉが、リン脂質分子の１つフォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）に共有結合するとＬＣ３−ＩＩとなり、隔離膜／オートファゴソーム膜に繋ぎ止められる。そのため、オートファゴソーム量と相関するＬＣ３−ＩＩ量の測定が世界中で使われている。ＬＣ３−ＩＩ量の測定がオートファジーの誘導や分解の評価に用いられている。オートファジーが誘導されオートファゴソームが形成されると、ＬＣ３−ＩＩ量は増加する。一方、オートファジーによる分解が進むと、オートファゴソーム内のＬＣ３−ＩＩが分解されるため、ＬＣ３−ＩＩ量は減少する。そのため、オートファジー誘導と分解を正確に評価するために、リソソーム阻害処理の有無でのＬＣ３−ＩＩ量の比較によりオートファジーの誘導と分解への影響を判断する。ＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎＡ１はオートファゴソームとリソソームの融合を阻害することで、オートファゴソームからオートリソソームへの進行を阻害することで、内容物の分解を抑制する。阻害剤処理によりＬＣ３−ＩＩ量が増加する場合には、オートファジーによる分解が促進していると判断できる。阻害剤処理によりＬＣ３−ＩＩ量に影響が見られない場合は、オートファジーによる分解が促進していないと判断できる。また、ある成分がオートファジー分解を阻害する場合にもＬＣ３−ＩＩ量は増加するが、オートファゴソームからオートリソソームへの分解が阻害されているため、リソソーム阻害剤処理によってＬＣ３−ＩＩ量がさらに増加することはない。図１にオートファジーの模式図とプロセスを示す。

試料粉末１ｇを滅菌水５ｍｌにて４℃、２４時間水抽出し、遠心分離及びフィルター滅菌した後、ニンニク発酵エキスとして用いた。ヒト線維芽細胞であるＯＵＭＳ３６Ｔ−１細胞は１０％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭを用いて３７℃、５％ＣＯ₂存在下で培養した。ニンニク発酵エキスを終濃度１％、５％、１０％となるように添加し、ＯＵＭＳ３６Ｔ−１細胞をＶ型ＡＴＰａｓｅ特異的阻害剤（リソソームの酸性化を阻害することでリソソームとオートファゴソームの融合やリソソーム酵素による分解を阻害する）の有無で４時間培養した。その細胞抽出液の抗ＬＣ３抗体を用いたイムノブロット法によりＬＣ３の動態を検討した。

（結果）
ＬＣ３−Ｉ，−ＩＩ量を抗ＬＣ３抗体を用いたイムノブロットにより検討した結果を図２に示す。
Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃｔｒｌ，ｌａｎｅ１）は１０％ＦＣＳ ＤＭＥＭで培養した細胞のライセートである。
ヒト線維芽細胞ＯＵＭＳ３６Ｔ−１のオートファジー誘導・分解の典型的なパターンを確認するために、オートファジーを誘導することが分かっているＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、アミノ酸飢餓条件に相当する）で処理を行いＬＣ３の動態に及ぼす影響を検討した（Ｌａｎｅ３，４）。
オートファジー誘導と分解への影響を評価するために、各サンプルとリソソーム阻害剤としてＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎＡ１を同時に添加して培養した（Ｌａｎｅ２，４，８，９，１０）。
Ｌａｎｅ１−４に、細胞のリソソーム阻害剤処理やアミノ酸飢餓によるＬＣ３の動態を検討した結果を示す。
Ｌａｎｅ１，２：細胞をリソソーム阻害剤で処理した結果。オートファジーによる分解行程であるオートリソソーム形成が阻害されることによりオートファゴソームが蓄積するためＬＣ−ＩＩ量が増加する。
Ｌａｎｅ１，３：ＨＢＳＳ処理によりオートファジーが誘導した結果、ＬＣ３−ＩからＬＣ３−ＩＩへの転換が起こり、ＬＣ３−Ｉの減少とＬＣ３−ＩＩのわずかな増加が観察される。Ｌａｎｅ３のＬＣ３−ＩＩの増加がＬａｎｅ２ほど顕著ではない理由は、ＨＢＳＳ処理ではオートファジー分解によりＬＣ−ＩＩが分解されていると考えられる。
Ｌａｎｅ３，４：アミノ酸飢餓処理におけるオートファジー分解を評価した結果。リソソーム阻害剤処理によりＬＣ３−ＩＩが増加することから、オートファジーによる分解が促進していると評価できる。
Ｌａｎｅ５，６，７：細胞をニンニク乳酸菌発酵水抽出産物で処理した結果。濃度依存的なＬＣ３−ＩＩ量の増加が認められる。
オートファジーの誘導もしくは分解の抑制の可能性が考えられる。
Ｌａｎｅ７，８−１０：Ｌａｎｅ７で認められたＬＣ３−ＩＩの増加は、リソソーム阻害剤処理によって影響が認められない。よって、ニンニク乳酸菌発酵水抽出産物はヒト線維芽細胞ＯＵＭＳ３６Ｔ−１のオートファジーを阻害していると評価できる。

ＬＣ３−Ｉ，−ＩＩ量を抗ＬＣ３抗体を用いたイムノブロットにより検討した結果を図３に示す。
Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃｔｒｌ，ｌａｎｅ１）は１０％ＦＣＳ ＤＭＥＭで培養した細胞のライセートである。
ヒト線維芽細胞ＯＵＭＳ３６Ｔ−１のオートファジー誘導・分解の典型的なパターンを確認するために、オートファジーを誘導することが分かっているＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、アミノ酸飢餓条件に相当する）で処理を行いＬＣ３の動態に及ぼす影響を検討した（Ｌａｎｅ３，４）。
オートファジー誘導と分解への影響を評価するために、各サンプルとリソソーム阻害剤としてＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎＡ１を同時に添加して培養した（Ｌａｎｅ２，４，８，９，１０）。
Ｌａｎｅ１−４に、細胞のリソソーム阻害剤処理やアミノ酸飢餓によるＬＣ３の動態を検討した結果を示す。
Ｌａｎｅ１，２：細胞をリソソーム阻害剤で処理した結果。オートファジーによる分解行程であるオートリソソーム形成が阻害されることによりオートファゴソームが蓄積するためＬＣ−ＩＩ量が増加する。
Ｌａｎｅ１，３：ＨＢＳＳ処理によりオートファジーが誘導した結果、ＬＣ３−ＩからＬＣ３−ＩＩへの転換が起こり、ＬＣ３−Ｉの減少とＬＣ３−ＩＩのわずかな増加が観察される。Ｌａｎｅ３のＬＣ３−ＩＩの増加がＬａｎｅ２ほど顕著ではない理由は、ＨＢＳＳ処理ではオートファジー分解によりＬＣ−ＩＩが分解されていると考えられる。
Ｌａｎｅ３，４：アミノ酸飢餓処理におけるオートファジー分解を評価した結果。リソソーム阻害剤処理によりＬＣ３−ＩＩが増加することから、オートファジーによる分解が促進していると評価できる。
Ｌａｎｅ５，６，７：細胞をニンニク酵母発酵水抽出産物で処理した結果。ＬＣ３−ＩＩ量の増加は認められない。
Ｌａｎｅ５−１０：ニンニク酵母発酵水抽出産物のＬＣ−ＩＩ量（Ｌａｎｅ５−７）がリソソーム阻害剤処理によって増加した（Ｌａｎｅ８−１０）。その増加量は、飢餓時のリソソーム阻害処理に匹敵するものであった（Ｌａｎｅ４との比較）。よって、ニンニク酵母発酵水抽出産物はヒト線維芽細胞ＯＵＭＳ３６Ｔ−１のオートファジー分解を促進していると評価できる。Ｌａｎｅ５−７でＬＣ−ＩＩ量がｌａｎｅ１の通常培養条件の細胞に比べ減少している原因は、オートファジーによる分解が促進していることによる可能性が示唆される。

Claims (5)

1. 発酵ニンニク又はその抽出物を有効成分とするオートファジー調節剤。
2. 発酵ニンニクが、乳酸菌発酵ニンニク又は酵母発酵ニンニクである請求項１記載のオートファジー調節剤。
3. 発酵ニンニクが、酵母発酵ニンニクである請求項１又は２記載のオートファジー誘導剤。
4. 発酵ニンニクが、乳酸発酵ニンニクである請求項１又は２記載のオートファジー抑制剤。
5. 発酵ニンニク又はその抽出物を有効成分とする、オートファジー調節医薬組成物、オートファジー調節化粧料組成物又はオートファジー調節食品組成物。