JP2020115865A - C9orf72発現を調節するための組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、電子フォーマットの配列表とともに出願されている。配列表は、2014年10月11日に作成され、サイズが444kbでBIOL0235WOSEQ_ST25.txtと名付けられたファイルとして、提供される。配列表の電子フォーマットの情報は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。
動物におけるC9ORF72mRNA及びタンパク質の発現を低減させる組成物及びタンパク質を提供する。そのような方法は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭型痴呆(FTD)、大脳皮質基底核変性症症候群(CBD)、非定型パーキンソン症候群、及びオリーブ橋小脳変性症(OPCD)などの神経変性疾患の治療、予防、または改善に有用である。
の伸張である(Renton et al.,Neuron,2011,72,257−268;DeJesus−Hernandez et al.,Neuron,2011,72,245−256)。C9ORF72遺伝子をカバーする創設者ハプロタイプが、この領域に関係している大多数の症例で存在している(Renton et al.,Neuron,2011,72,257−268)。染色体9p21上にあるこの遺伝子座は、405人のフィンランド人患者の同齢集団における家族性ALSのほぼ半分と、すべてのALS症例のほぼ4分の1の原因を説明する(Laaksovirta et al, Lancet Neurol., 2010, 9, 978−985)。
定義
、MOE修飾糖部分を含むヌクレオシドを意味する。
20である(配列番号2、ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)。ある特定の実施形態において、C9ORF72病原性関連mRNA変異体のレベルを測定して、サンプル中のヘキサヌクレオチド反復を含有するC9ORF72mRNA前駆体のレベルを決定する。
O−2’)LNA、(B)β−D−メチレンオキシ(4’−CH2−O−2’)LNA,(C)エチレンオキシ(4’−(CH2)2−O−2’)LNA、(D)アミノオキシ(4’−CH2−O−N(R)−2’)LNA、及び(E)オキシアミノ(4’−CH2−N(R)−O−2’)LNAが挙げられる。
O−2’)もまた、本明細書では、LNAの定義内に包含される。
的核酸塩基は、その標的核酸の核酸塩基と塩基の対合ができる、アンチセンス化合物の核酸塩基のことをいう。例えば、アンチセンス化合物の特定の位置にある核酸塩基が標的核酸の特定の位置にある核酸塩基と水素結合ができる場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置をその核酸塩基対で相補的であると考えられる。
例えば、ある特定の実施形態において、C9ORF72を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬剤である。
学的組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び滅菌水溶液を含んでもよい。
オチドを意味する。
クレオチド(すなわち、β−D−デオキシリボヌクレオシド)である。
ある特定の実施形態は、全C9ORF72mRNA及びタンパク質の発現を減少させるための組成物及び方法を提供する。
少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む化合物が提供される。
少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む化合物が提供される。
合物が提供される。
含み、式中、Rが、独立して、H、C1〜C12アルキル、または保護基である。
オリゴマー化合物には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣体、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びsiRNAが含まれるが、これらに限定されない。オリゴマー化合物は、標的核酸に対して「アンチセンス」であってもよく、これは、水素結合を介して標的核酸へのハイブリダイゼーションを受けることができることを意味する。
71、72、73、74、75、76、77、78、79、または80個の結合したサブユニットであるか、または上述の値のうちのいずれか2つによって定義される範囲である。いくつかの実施形態において、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、結合したサブユニットは、ヌクレオシドである。
または42核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも控えめなレベルであるものの、単独で、翻訳を阻害することができた。
ある特定の実施形態において、C9ORF72核酸を標的にするアンチセンス化合物は、パターンまたはモチーフに配置された化学修飾サブユニットを有し、アンチセンス化合物に対して、特性、例えば、阻害活性の強化、標的核酸に対する結合親和性の増加、またはインビボでのヌクレアーゼによる分解に対する耐性を、付与する。
ば、5−10、8−4、4−12、12−4、3−14、16−2、18−1、10−3、2−10、1−10、8−2、2−13、5−13、5−8、または6−8が挙げられる。
C9ORF72をコードするヌクレオチド配列として、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる。すなわち、GENBANK受託番号NM_001256054.1の補体(配列番号1として本明細書に組み込まれる)、核酸塩基27535000〜27565000がトランケートされたGENBANK受託番号NT_008413.18(配列番号2として本明細書に組み込まれる)、GENBANK受託番号BQ068108.1(配列番号3として本明細書に組み込まれる)、GENBANK受託番号NM_018325.3(配列番号4として本明細書に組み込まれる)、GENBANK受託番号DN993522.1(配列番号5として本明細書に組み込まれる)、GENBANK受託番号NM_145005.5(配列番号6として本明細書に組み込まれる)、GENBANK受託番号DB079375.1(配列番号7として本明細書に組み込まれる)、GENBANK受託番号BU194591.1(配列番号8として本明細書に組み込まれる)、配列識別子4141_014_A(配列番号9として本明細書に組み込まれる)、配列識別子4008_73_A(配列番号10として本明細書に組み込まれる)、及びヌクレオシド8522000〜8552000がトランケートされたGENBANK受託番号NW_001101662.1(配列番号19として本明細書に組み込まれる)。
s番号(Isis No)によって記載されるアンチセンス化合物は、核酸塩基配列及びモチーフの組み合わせを示す。
現の阻害を示し得る。
ある特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションが、本明細書に開示されるアンチセンス化合物とC9ORF72核酸との間に生じる。ハイブリダイゼーションの最も一般的な作用は、核酸分子の相補的核酸塩基間での水素結合(例えば、ワトソンクリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン水素結合)を伴う。
アンチセンス化合物及び標的核酸は、アンチセンス化合物の十分な数の核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合しることができ、所望の効果(例えば、C9ORF72核酸等の標的核酸のアンチセンス阻害)が生じるようになる場合、互いに相補的である。
Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656)。パーセント相同性、配列同一性、または相補性は、例えば、初期設定を使用して、Smith及びWatermanのアルゴリズム(Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489)を用いるGapプログラム(Wisconsin
Sequence Analysis Package, Version 8 for
Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis)によって判定することができる。
定の実施形態において、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも12核酸塩基部分に相補的である。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも13核酸塩基部分に相補的である。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも14核酸塩基部分に相補的である。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも15核酸塩基部分に相補的である。標的セグメントの少なくとも9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、もしくはそれ以上、またはこれらの値のうちの任意の2つによって定義される範囲の核酸塩基部分に相補的である、アンチセンス化合物もまた企図される。
本明細書に提供されるアンチセンス化合物はまた、特定のヌクレオチド配列、配列番号、または特定のIsis番号によって表される化合物もしくはその部分に対して、一定の同一性パーセントを有し得る。本明細書に使用される際、アンチセンス化合物は、同じ核酸塩基対合能力を有する場合、本明細書に開示される配列と同一である。例えば、開示されるDNA配列において、チミジンの代わりにウラシルを含有するRNAは、ウラシルとチミジンのいずれもアデニンと対合するため、このDNA配列に同一であると見なされる。本明細書に記載されるアンチセンス化合物の短縮または延長されたバージョン、ならびに本明細書に提供されるアンチセンス化合物に対して非同一塩基を有する化合物もまた、企図される。非同一塩基は、互いに隣接していてもよく、またはアンチセンス化合物全体に分散していてもよい。アンチセンス化合物の同一性パーセントは、比較される配列に対して同一の塩基対合を有する塩基の数に従って計算される。
ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの核酸塩基(塩基としても知られる)部分は、通常、複素環式塩基部分である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドについては、リン酸基は、糖の2’、3’、または5’ヒドロキシル部分に結合し得る。オリゴヌクレオチドは、互いに隣接するヌクレオシドの共有結合を通じて形成され、線状のポリマーオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は、一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合を形成すると称される。
胞取り込みの強化、核酸標的に対する親和性の強化、ヌクレアーゼの存在下での安定性の増加、または阻害活性の増加といった、望ましい特性のため、天然の形態よりも好ましい。
RNA及びDNAの天然に存在するヌクレオシド間結合は、3’から5’のホスホジエステル結合である。1つまたは複数の修飾された、すなわち、天然に存在しない、ヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物は、多くの場合、例えば、細胞取り込みの強化、標的核酸に対する親和性の強化、及びヌクレアーゼの存在下での安定性の増加といった所望の特性のため、天然に存在するヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物よりも優先して、選択される。
アンチセンス化合物は、任意で、糖基が修飾されている1つまたは複数のヌクレオシドを含有し得る。そのような糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の強化、結合親和性の増加、または何らかの他の有益な生物学的特性を、アンチセンス化合物に付与し得る。ある特定の実施形態において、ヌクレオシドは、化学修飾リボフラノース環部分を含む。化学修飾リボフラノース環の例として、限定されるものではないが、置換基の付加(5’及び2’置換基を含む、二環式核酸(BNA)を形成するための非ジェミナル環原子の架橋、リボシル環酸素原子のS、N(R)、またはC(R1)(R2)との置き換え(R、R1、及びR2は、それぞれ独立して、H、C1〜C12アルキル、または保護基である)、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。化学修飾糖の例としては、2’−F−5’−メチル置換ヌクレオシド(他の開示された5’,2’−ビス置換ヌクレオシドについては、2008年8月21日公開のPCT国際出願WO2008/101157号を参
照されたい)、またはリボシル環酸素原子とSとの置き換えと2’位でのさらなる置換(2005年6月16日公開のU.S.特許出願US2005−0130923号を参照されたい)、または代替として、BNAの5’置換(2007年11月22日公開のPCT国際出願WO2007/134181号を参照されたく、ここで、LNAは、例えば5’−メチルまたは5’−ビニル基で置換される)が挙げられる。
,239−243、U.S.特許第6,268,490号、US6,525,191、US6,670,461、US6,770,748、US6,794,499、US7,034,133、US7,053,207、US7,399,845、US7,547,684、及びUS7,696,345、U.S.特許公開番号US2008−0039618、US2009−0012281、U.S.特許出願一連番号60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787、及び61/099,844、公開PCT国際出願WO1994/014226、WO2004/106356、WO2005/021570、WO2007/134181、WO2008/150729、WO2008/154401、及びWO2009/006478を参照されたい)。前述の二環式ヌクレオシドのそれぞれは、例えば、α−L−リボフラノース及びβ−D−リボフラノースを含む、1つまたは複数の立体化学糖構成を有するように調製することができる(WO99/14226として、1999年3月25日公開のPCT国際出願PCT/DK98/00393号を参照されたい)。
分、または支持媒体への共有結合である。
ある特定の実施形態において、式II:
ある特定の実施形態において、式III
または糖部分類似体は、任意の位置において修飾または置換されてもよい。ある特定の実施形態において、ヌクレオシドの糖部分または糖部分類似体は、任意の位置において、修飾または置換されてもよい。
つのテトラヒドロピランヌクレオシド類似体のそれぞれについて、独立して、式中、Bxは、複素環式塩基部分であり、Ta及びTbはそれぞれ、独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に結合するヌクレオシド間結合基であるか、あるいはTa及びTbのうちの1つが、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体とアンチセンス化合物とを結合するヌクレオシド間結合基であり、Ta及びTbのうちのもう1つが、H、ヒドロキシル保護基、結合複合基、または5’もしくは3’末端基であり、q1、q2、q3、q4、q5、q6、及びq7はそれぞれ、独立して、H、C1〜C6アルキル、置換C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、置換C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、または置換C2〜C6アルキニルであり、R1及びR2のそれぞれは、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、置換または非置換アルコキシ、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2、及びCNから選択され、式中、Xは、O、S、またはNJ1であり、各J1、J2、及びJ3は、独立して、HまたはC1〜C6アルキルである。
薬学的組成物または製剤を調製するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、薬学的に許容される活性または不活性物質と混合しもよい。薬学的組成物を製剤化するための組成物及び方法は、限定するものではないが、投与経路、疾患の範囲、及び投与される用量を含む、いくつかの基準に依存する。
アンチセンス化合物は、結果として得られるアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを強化する、1つまたは複数の部分またはコンジュゲート
に共有結合されてもよい。典型的なコンジュゲート基には、コレステロール部分及び脂質部分が含まれる。追加のコンジュゲート基には、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素が含まれる。
C9ORF72核酸のレベル、活性、または発現に対するアンチセンス化合物の効果は、多様な細胞種において、インビトロで試験することができる。そのような分析に使用される細胞種は、市販の供給業者(例えば、American Type Culture
Collection,Manassus,VA、Zen−Bio,Inc.,Research Triangle Park,NC、Clonetics Corporation,Walkersville,MD)から入手可能であり、供給業者の説明書に従って、市販入手可能な試薬(例えば、Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)を使用して培養される。例示的な細胞種としては、HepG2細胞、Hep3B細胞、及び初代肝細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
アンチセンスオリゴヌクレオチドでの細胞の処理のための方法が本明細書に記載され、これは、他のアンチセンス化合物での処理のために適宜修正することができる。
TAMINE濃度を達成する。
特定の細胞系に最適なアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を決定する方法は、当該技術分野で周知である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的に、LIPOFECTAMINEを用いてトランスフェクトする場合、1nM〜300nMの範囲の濃度で使用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エレクトロポレーションを用いてトランスフェクトする場合、625〜20,000nMの範囲のより高い濃度で使用される。
RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAで実施することができる。RNA単離の方法は、当該技術分野において周知である。RNAは、当該技術分野で周知の方法を使用して、例えば、製造業者の推奨プロトコルに従って、TRIZOL試薬(Invitrogen,Carlsbad,CA)を用いて調製される。
C9ORF72核酸のレベルまたは発現の阻害は、当該技術分野で既知の様々な手段でアッセイすることができる。例えば、標的核酸レベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、または定量的リアルタイムPCRによって、定量化することができる。RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAで実施することができる。RNA単離の方法は、当該技術分野において周知である。ノーザンブロット分析もまた、当該技術分野では日常的である。定量的リアルタイムPCRは、簡便には、市販入手可能なABI PRISM7600、7700、または7900配列検
出システム(PE−Applied Biosystems,FosterCity,CAより入手可能)を使用して、製造業者の説明書に従って使用して達成することができる。
標的RNAレベルの定量化は、ABIPRISM7600、7700、または7900配列検出システム(PE−Applied Biosystems,FosterCity,CA)を製造業者の説明書に従って使用する、定量的リアルタイムPCRによって達成することができる。定量的リアルタイムPCRの方法は、当該技術分野において周知である。
施する。RT及びリアルタイムPCRの試薬は、Invitrogen(Carlsbad,CA)より入手される。RTリアルタイムPCR反応は、当業者に周知の方法によって行う。
stems,FosterCity,CA)等のソフトウェアの使用が含まれ得る。
C9ORF72核酸のアンチセンス阻害は、C9ORF72タンパク質レベルを測定することによって評価することができる。C9ORF72のタンパク質レベルは、免疫沈降、ウエスタンブロット分析(免疫ブロット法)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、定量的タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ(例えば、カスパーゼ活性アッセイ)、免疫組織化学、免疫細胞化学、または蛍光活性化細胞分類法(FACS)といった、当該技術分野で周知の多様な手段で評価または定量化することができる。標的を対象とする抗体は、抗体のMSRSカタログ(Aerie Corporation,BiRmingham,MI)等の多様な供給源から特定及び入手することができるか、または当該技術分野で周知の従来的なモノクローナルもしくはポリクローナル抗体生成方法によって調製することができる。マウス、ラット、サル、及びヒトC9ORF72の検出に有用な抗体は、市販入手可能である。
アンチセンス化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、それらがC9ORF72の発現を阻害し、表現型の変化、例えば運動機能及び呼吸の改善をもたらす能力を評価するために、動物において試験する。ある特定の実施形態において、運動機能は、動物においてロータロッド、握力、棒登り、オープンフィールド行動、バランスビーム、後肢足跡試験によって測定される。ある特定の実施形態において、呼吸は、動物において全身プレチスモグラフ、侵襲的抵抗(invasive resistance)、及びコンプライアンス測定によって、測定される。試験は、正常な動物において、または実験的な疾患モデルにおいて実施され得る。動物への投与のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝食塩水(PBS)または人工脳脊髄液(aCSF)等の薬学的に許容される希釈剤中に製剤化される。投与は、腹腔内、静脈内、及び皮下といった非経口の投与経路と、脳室内または髄腔内といった中枢投与経路とを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投薬量及び投与頻度の計算は、当業者の能力の範囲内であり、投与経路及び動物の体重といった要因に依存する。アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理期間の後、RNAを、CNS組織またはCSFから単離し、C9ORF72核酸発現における変化を測定する。
本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNAプロセシングの任意の段階においてC9ORF72核酸とハイブリダイズし得る。例えば、mRNA前駆体ま
たは成熟mRNAに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが、本明細書に記載される。さらに、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、C9ORF72核酸の任意の要素とハイブリダイズし得る。例えば、C9ORF72核酸のエクソン、イントロン、5’UTR、3’UTR、反復領域、ヘキサヌクレオチド反復伸長、スプライスジャンクション、エクソン:エクソンスプライスジャンクション、エクソンスプライシングサイレンサー(ESS)、エクソンスプライシングエンハンサー(ESE)、エクソン1a、エクソン1b、エクソン1c、エクソン1d、エクソン1e、エクソン2、エクソン3、エクソン4、エクソン5、エクソン6、エクソン7、エクソン8、エクソン9、エクソン10、エクソン11、イントロン1、イントロン2、イントロン3、イントロン4、イントロン5、イントロン6、イントロン7、イントロン8、イントロン9、またはイントロン10に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが、本明細書に記載される。
本明細書中のいくつかの例において、プライマープローブセットRTS3905は、ヘキサヌクレオチド反復を含むmRNA前駆体変異体からプロセッシングされたmRNA変異体(例えばNM_001256054.1)を検出する。ヘキサヌクレオチド反復を含
むmRNA前駆体からプロセッシングされたmRNA変異体(すなわち、「C9ORF72病原性関連mRNA変異体」)。mRNA前駆体は、mRNA前駆体の転写がエキソン1Aの開始部位からエキソン1Bの開始部位までの領域で開始される場合にヘキサヌクレオチド反復を含むもので、この領域は、例えば、ゲノム配列のヌクレオチド1107〜1520である(配列番号2、ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)。ヘキサヌクレオチド反復を含むmRNA前駆体変異体を選択的に標的にするために、この領域でオリゴヌクレオチドを設計した。RTS3905は、ヘキサヌクレオチド反復を含むmRNA前駆体変異体のmRNA産物(すなわちC9ORF72病原性関連mRNA変異体)を測定し、従って、ヘキサヌクレオチド反復を含むmRNA前駆体変異体の低減を測定する。
本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、C9ORF72遺伝子の任意の要素内の、任意のプロセッシング状態の、任意のC9ORF72変異体にハイブリダイズすることが可能である。例えば、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン、イントロン、5’ UTR、3’ UTR、反復領域、ヘキサヌクレオチド反復伸張、スプライス部位、エクソン:エクソンスプライス部位、エクソンのスプライシングサイレンサー(ESS)、エクソンのスプライシングサイレンサー(ESE)、エクソン1a、エクソン1b、エクソン1c、エクソン1d、エクソン1e、エクソン2、エクソン3、エクソン4、エクソン5、エクソン6、エクソン7、エクソン8、エクソン9、エクソン10、エクソン11、イントロン1、イントロン2、イントロン3、イントロン4、イントロン5、イントロン6、イントロン7、イントロン8、イントロン9、またはイントロン10にハイブリダイズすることが可能である。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、様々なC9ORF72変異体について、以下に特徴づけられた表1〜5エクソンのいずれかを標的にすることが可能である。本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、以下に特徴づけられていない標的変異体を標的にすることが可能であり、そのような変異体はGENBANKにおいて特徴づけられる。さらに、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン以外の要素を標的にすることも可能であり、そのような要素はGENBANKにおいて特徴づけられる。
表1
NM_001256054.1(配列番号1)の機能セグメント
NM_018325.3(配列番号4)の機能セグメント
NM_145005.5(配列番号6)の機能セグメント
DB079375.1(配列番号7)の機能セグメント
BU194591.1(配列番号8)の機能セグメント
生成物を投与することを含む、個体を処置する方法が提供される。ある特定の実施形態において、個体は神経変性疾患を有する。ある特定の実施形態において、個体は、神経変性疾患(限定されるものではないがALSまたはFTDを含む)を発症する危険性がある。ある特定の実施形態において、個体はC9ORF72関連疾患を有すると確認されている。ある特定の実施形態において、個体はC9ORF72ヘキサヌクレオチド反復伸張関連疾患を有するものとして、特定されている。ある特定の実施形態において、個体でのC9ORF72発現を予防的に減少させる方法である。ある特定の実施形態は、個々にC9ORF72核酸を標的とするアンチセンス化合物の治療有効量を個体に投与することによって、それを必要とする個体を処置することを含む。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される1つまたは複数の医薬組成物は、1つまたは複数の他の薬剤と同時投与される。ある特定の実施形態において、そのような1つまたは複数の他の薬剤は、本明細書に記載される1つまたは複数の医薬組成物と同様
の疾患、障害、または病態を処置するように、設計されている。ある特定の実施形態において、そのような1つまたは複数の他の薬剤は、本明細書に記載される1つまたは複数の医薬組成物と異なる疾患、障害、または病態を処置するように、設計されている。ある特定の実施形態において、そのような1つまたは複数の他の薬剤は、本明細書に記載される1つまたは複数の医薬組成物の望ましくない副作用を処置するように設計されている。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される1つまたは複数の医薬組成物は、その他の薬剤の望ましくない効果を処置するために、別の薬剤と同時投与される。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される1つまたは複数の医薬組成物は、併用効果を得るために、別の薬剤と同時投与される。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される1つまたは複数の医薬組成物は、相乗効果を得るために、別の薬剤と同時投与される。
本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、プライマープローブセットのアンプリコン領域を標的にすることが可能である。別のアッセイを用いて、これらの化合物の効力と有効性とを測定してもよい。
明細書に記載されるヒトC9ORF72アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに対する可能性のある療法としてここで評価されている。効力、有効性、及び/または耐容性の様々なパラメータが調べられている。そのようなパラメータとして、全C9ORF72RNA発現のインビトロ阻害、C9ORF72病原性関連RNA変異体発現のインビトロ阻害、インビトロ用量反応(IC50)、関連組織(例えば、脳及び/または脊髄)内にヒトC9ORF72導入遺伝子を含むトランスジェニック動物の全または病原性RNA及び/またはタンパク質のインビボ阻害、マウスにおける耐容性、ラットにおける耐容性、ならびに/あるいは霊長類における耐容性が挙げられる。測定することができる耐用性マーカーには、血液及び血清の化学パラメータ、CSF化学パラメータ、体及び臓器重量、一般的観察及び/または行動試験で測定可能な耐容性マーカー、ならびに/あるいはGFAP及び/またはAIF1等の生化学マーカーが挙げられる。急性または長期の耐容性を測定することができる。
1.配列番号2の核酸塩基1107〜1520
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)の核酸塩基1107〜1520を標的にするように、設計されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基1107〜1520はホットスポット領域である。ある特定の実施形態において、核酸塩基1107〜1520はアンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされる。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが17、18または、20核酸塩基である。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態において、ギャップマーは5−10−5 MOEギャップマーまたは5−8−5MOEギャップマーである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、17−mer Deoxy、MOE、及びcEtオリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートヌクレオシド間結合によって連結される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合によって連結される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートとホスホジエステルとのヌクレオチド間結合によって連結される(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、「混合主鎖(mixed backbone)」を持つ)。
なくとも99%、または少なくとも100%の低減を達成する。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)の核酸塩基1111〜1200を標的にするように、設計されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基1111〜1200は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態において、核酸塩基1111〜1200は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされる。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが20核酸塩基である。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態において、ギャップマーは、5−10−5MOEギャップマーである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートヌクレオシド間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホジエステル間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートとホスホジエステルヌクレオチド間結合によって結合される(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは「混合主鎖」を持つ)。
とも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の低減を達成する。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)の核酸塩基1211〜1318を標的にするように、設計されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基1211〜1318は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態において、核酸塩基1211〜1318は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされる。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが20核酸塩基である。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態において、ギャップマーは5−10−5MOEギャップマーである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートヌクレオシド間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホジエステル間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートとホスホジエステルヌクレオチド間結合によって結合される(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは「混合主鎖」を持つ)。
59によって標的にされる。
くとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の低減を達成する。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)の核酸塩基1326〜1540を標的にするように、設計されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基1326〜1540は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態において、核酸塩基1326〜1540は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされる。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、17、18、または20核酸塩基である。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態において、ギャップマーは5−10−5MOEギャップマーまたは5−8−5MOEギャップマーである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは17−merデオキシ、MOE、及びcEtオリゴ
ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートヌクレオシド間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホジエステル間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートとホスホジエステルヌクレオチド間結合によって結合される(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは「混合主鎖」を持つ)。
も49%、少なくとも50%、少なくとも51%、少なくとも52%、少なくとも53%、少なくとも54%、少なくとも55%、少なくとも56%、少なくとも57%、少なくとも58%、少なくとも59%、少なくとも60%、少なくとも61%、少なくとも62%、少なくとも63%、少なくとも64%、少なくとも65%、少なくとも66%、少なくとも67%、少なくとも68%、少なくとも69%、少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の低減を達成する。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)の核酸塩基1331〜1375を標的にするように、設計されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基1331〜1375は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態において、核酸塩基1331〜1375は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされる。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが20核酸塩基である。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態において、ギャップマーは5−10−5MOEギャップマーである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホ
スホロチオネートヌクレオシド間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホジエステル間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートとホスホジエステルヌクレオチド間結合によって結合される(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは「混合主鎖」を持つ)。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の糖の修飾パターン、すなわちsoooossssssssssoossを含む。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)の核酸塩基1368〜1391を標的にするように、設計されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基1368〜1391は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態において、核酸塩基1368〜1391、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされる。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが20核酸塩基である。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態において、ギャップマーは5−10−5MOEギャップマーである。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートヌクレオシド間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホジエステル間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートとホスホジエステルヌクレオチド間結合によって結合される(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは「混合主鎖」を持つ)。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の糖の修飾パターン、すなわちsoooossssssssssoossを含む。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)の核酸塩基1398〜1424を標的にするように、設計されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基1398〜1424は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態において、酸塩基1398〜1424は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされる。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが20核酸塩基である。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。
ある特定の実施形態において、ギャップマーは5−10−5MOEギャップマーである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートヌクレオシド間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホジエステル間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートとホスホジエステルヌクレオチド間結合によって結合される(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは「混合主鎖」を持つ)。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の糖の修飾パターン、すなわちsoooossssssssssoossを含む。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)の核酸塩基1411〜1440を標的にするように、設計されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基1411〜1440は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態において、核酸塩基1411〜1440は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされる。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが20核酸塩基である。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態において、ギャップマーは5−10−5MOEギャップマーである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートヌクレオシド間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホジエステル間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートとホスホジエステルヌクレオチド間結合によって結合される(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは「混合主鎖」を持つ)。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の糖の修飾パターン、すなわちsoooossssssssssoossを含む。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)の核酸塩基1429〜1481を標的にするように、設計されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基1429〜1481は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態において、核酸塩基1429〜1481は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされる。ある特定
の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが20核酸塩基である。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態において、ギャップマーは5−10−5MOEギャップマーである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートヌクレオシド間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホジエステル間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートとホスホジエステルヌクレオチド間結合によって結合される(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは「混合主鎖」を持つ)。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の糖の修飾パターン、すなわちsoooossssssssssoossを含む。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)の核酸塩基1502〜1539を標的にするように、設計されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基1502〜1539は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態において、核酸塩基1
502〜1539は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされる。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが20核酸塩基である。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態において、ギャップマーは5−10−5MOEギャップマーである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートヌクレオシド間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホジエステル間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートとホスホジエステルヌクレオチド間結合によって結合される(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは「混合主鎖」を持つ)。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の糖の修飾パターン、すなわちsoooossssssssssoossを含む。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)の核酸塩基1508〜1539を標的にするように、設計されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基150
8〜1539は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態において、核酸塩基1508〜1539は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされる。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが20核酸塩基である。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態において、ギャップマーは5−10−5MOEギャップマーである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートヌクレオシド間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホジエステル間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートとホスホジエステルヌクレオチド間結合によって結合される(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは「混合主鎖」を持つ)。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の糖の修飾パターン、すなわちsoooossssssssssoossを含む。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)の核酸塩基7860〜790
6を標的にするように、設計されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基7860〜7906は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態において、核酸塩基7860〜7906は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされる。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが20核酸塩基である。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態において、ギャップマーは5−10−5MOEギャップマーである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートヌクレオシド間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホジエステル間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートとホスホジエステルヌクレオシド間結合によって結合される(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは「混合主鎖」を持つ)。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)の核酸塩基7907〜7944を標的にするように、設計されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基7907〜7944は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態において、核酸塩基7907〜7944は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされる。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが20核酸塩基である。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態において、ギャップマーは5−10−5MOEギャップマーである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートヌクレオシド間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホジエステル間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートとホスホジエステルヌクレオシド間結合によって結合される(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは「混合主鎖」を持つ)。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)核酸塩基7989〜8038を標的にするように、設計されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基7989〜8038は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態において、核酸塩基7989〜8038は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされる。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが20核酸塩基である。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態において、ギャップマーは5−10−5MOEギャップマーである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートヌクレオシド間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホジエステル間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートとホスホジエステルヌクレオシド間結合によって結合される(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは「混合主鎖」を持つ)。
54%、少なくとも55%、少なくとも56%、少なくとも57%、少なくとも58%、少なくとも59%、少なくとも60%、少なくとも61%、少なくとも62%、少なくとも63%、少なくとも64%、少なくとも65%、少なくとも66%、少なくとも67%、少なくとも68%、少なくとも69%、少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、または少なくとも76%の低減を達成する。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)の核酸塩基8020〜8135を標的にするように、設計されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基8020〜8135は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態において、核酸塩基8020〜8135は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされる。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが20核酸塩基である。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態において、ギャップマーは5−10−5MOEギャップマーである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートヌクレオシド間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホジエステル間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートとホスホジエステルヌクレオシド間結合によって結合される(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは「混合主鎖」を持つ)。
%、少なくとも50%、少なくとも51%、少なくとも52%、少なくとも53%、または少なくとも54%の低減を達成する。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)の核酸塩基8136〜8161を標的にするように、設計されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基8136〜8161は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態において、核酸塩基8136〜8161は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされる。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが20核酸塩基である。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態において、ギャップマーは5−10−5MOEギャップマーである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートヌクレオシド間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホジエステル間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートとホスホジエステルヌクレオシド間結合によって結合される(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは「混合主鎖」を持つ)。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)の核酸塩基8174〜8211を標的にするように、設計されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基8174〜8211は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態において、核酸塩基8174〜8211は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされる。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが20核酸塩基である。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態において、ギャップマーは5−10−5MOEギャップマーである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートヌクレオシド間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホジエステル間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートとホスホジエステルヌクレオシド間結合によって結合される(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは「混合主鎖」を持つ)。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)の核酸塩基8213〜8325を標的にするように、設計されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基8213〜8325は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態において、核酸塩基8213〜8325は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的にされる。ある特定
の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが20核酸塩基である。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態において、ギャップマーは5−10−5MOEギャップマーである。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートヌクレオシド間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホジエステル間結合によって結合される。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオネートとホスホジエステルヌクレオシド間結合によって結合される(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは「混合主鎖」を持つ)。
本明細書に記載されるある特定の化合物、組成物、及び方法が、ある特定の実施形態に
従って特定的に記載されたが、以下の実施例は、本明細書に記載される化合物を例証するのみの役割を果たしており、それらを限定するようには意図されない。本出願に列挙される参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
C9ORF72核酸を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、インビトロでそれらがC9ORF72mRNAに及ぼす効果について試験した。ISIS576816(以前、2012年10月15日に出願のU.S.特許出願第61/714,132号で試験済み)をベンチマークオリゴヌクレオチドとして用いた。ISIS576816は、全体にわたってホスホロチオネート結合を有する5−10−5MOEギャップマーである。1ウェルあたり20,000細胞の密度で培養したHepG2細胞に、エレクトロポレーションを使用して4,000nMアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約24時間の処理期間の後、RNAを細胞から単離し、C9ORF72mRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3905(本明細書に配列番号13として指定される順方向プライマー配列GGGTCTAGCAAGAGCAGGTG、本明細書に配列番号14として指定される逆方向プライマー配列GTCTTGGCAACAGCTGGAGAT、本明細書に配列番号15として指定されるプローブ配列TGATGTCGACTCTTTGCCCACCGC、−TAQ−manプライマープローブセット)を使用した。プライマープローブセットRTS3905は、ヘキサヌクレオチド反復を含むmRNA前駆体変異体からプロセッシングされたmRNA変異体(例えばNM_001256054.1)を検出する。ヘキサヌクレオチド反復を含むmRNA前駆体からプロセッシングされたmRNA変異体は、本明細書では、「C9ORF72病原性関連mRNA変異体」である。mRNA前駆体は、mRNA前駆体の転写がエクソン1Aの開始部位からエクソン1Bの開始部位までの領域で始まる場合、ヘキサヌクレオチド反復を含む(概ね、配列番号2のゲノム配列のヌクレオチド1107〜1520、ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)。したがって、ヘキサヌクレオチド反復を含むmRNA前駆体変異体を選択的に標的にするために、この領域でオリゴヌクレオチドを設計した。RTS3905は、ヘキサヌクレオチド反復を含むmRNA前駆体変異体のmRNA産物(すなわちC9ORF72病原性関連mRNA変異体)を測定し、それにより、ヘキサヌクレオチドを含むmRNA前駆体変異体の低減を測定する。C9ORF72病原性関連mRNA変異体のレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定される細胞の全RNA含量に対して正規化した。結果を、未処理の対照細胞に対するC9ORF72の阻害パーセントとして提示する。アスタリスク(*)が記されたオリゴヌクレオチドは、プライマープローブセットの単位複製配列領域を標的にする。別のアッセイを用いて、これらのオリゴヌクレオチドの効力と有効性とを測定してもよい。
、5−メチルシトシンである。ギャップマーのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオネート結合とホスホジエステル結合とが混ざっている。各ギャップマーのヌクレオシド間結合を、結合の縦列に示す。ここで、『o』はホスホジエステル結合を示し、『s』はホスホロチオネートを示す。
クレオシドを示す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列においてギャップマーが標的とする、最も3'側のヌクレオシドを示す。下記の表に列挙されている各アンチセンスオレゴヌ
クレオチドは、本明細書に配列番号1(GENBANKアクセッション番号NM_001256054.1)として指定されるヒトC9ORF72mRNA配列もしくは本明細書に配列番号2(ヌクレオシド27535000〜27565000がトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)として指定されるヒトC9ORF72ゲノム配列のいずれか、またはその両方を標的にする。『n/a』は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、その特定の遺伝子配列を標的としなかったことを示す。
表6
配列番号1及び2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72病原性関連mRNA変異体の阻害パーセント
C9ORF72核酸を標的にする別のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、インビトロでそれらがC9ORF72mRNAに及ぼす効果について試験した。ISIS576816(以前、2012年10月15日に出願のU.S.特許出願第61/714,132号で試験済み)をベンチマークオリゴヌクレオチドとして用いた。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、類似の培養条件を有する一連の実験で試験した。各実験の結果を、以
下の別々の表に示す。1ウェルあたり20,000細胞の密度で培養したHepG2細胞に、エレクトロポレーションを使用して1,000nMアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約24時間の処理期間の後、RNAを細胞から単離し、C9ORF72mRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3905を用いて、ヘキサヌクレオチド反復を含むmRNA前駆体の産物であるC9ORF72病原性関連mRNA変異体を測定した。C9ORF72病原性関連mRNA変異体のレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定される細胞の全RNA含量に対して正規化した。結果を、未処理の対照細胞に対するC9ORF72の阻害パーセントとして提示する。アスタリスク(*)が記されたオリゴヌクレオチドは、プライマープローブセットの領域を標的にする。別のアッセイを用いて、これらのオリゴヌクレオチドの効力と有効性とを測定してもよい。『n.d.』は、その特定のオリゴヌクレオチドのアッセイにおける信号読み取りがなかったことを示す。
クレオシドを示す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列においてギャップマーが標的とする、最も3'側のヌクレオシドを示す。下記の表に列挙されているギャップマーは、本明細
書に配列番号1(GENBANKアクセッション番号NM_001256054.1)として指定されるヒトC9ORF72mRNA配列もしくは本明細書に配列番号2(ヌクレオシド27535000〜27565000がトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)として指定されるヒトC9ORF72ゲノム配列のいずれか、またはその両方を標的にする。表10のギャップマーのいくつかは、GENBANKアクセッション番号NM_145005.5(配列番号3として本明細書に組み込まれる)、GENBANKアクセッション番号DB079375.1(配列番号4として本明細書に組み込まれる)、またはGENBANKアクセッション番号BU194591.1(配列番号5として本明細書に組み込まれる)を標的にする。『n/a』は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、その特定の遺伝子配列を標的としなかったことを示す。
表7
配列番号1及び2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72病原性関連mRNA変異体の阻害パーセント
配列番号1及び2をアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72病原性関連mRNA変異体の阻害パーセント
配列番号1及び2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72病原性関連mRNA変異体の阻害パーセント
配列番号1〜5を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72病原性関連mRNA変異体の阻害パーセント
C9ORF72mRNAの有意なインビトロ阻害を示した上述の試験からアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、HepG2細胞において種々の用量で試験した。2012年10月15日に出願された米国特許出願第61/714,132号で既に試験されたISIS576816及びISIS577061を、ベンチマークオリゴヌクレオチドとして用いた。ISIS576816及びISIS577061は、全体にわたってホスホロチオネート結合を有する5−10−5MOEギャップマーである。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、類似の培養条件を有する一連の実験で試験した。各実験の結果を、以下の別々の表に示す。1ウェルあたり20,000細胞の密度で細胞を播種し、エレクトロポレーションを使用して、78.1nM、312.5nM、1,250.0nM、及び5,000.0nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約16時間の処理期間の後、RNAを細胞から単離し、C9ORF72mRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトC9ORF72プライマープローブセットRTS3905を用いて、C9ORF72病原性関連mRNA変異体を測定した。C9ORF72病原性関連mRNA変異体のレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定される細胞の全RNA含量に対して調整した。結果を、未処理の対照細胞に対する変異体C9ORF72レベルの阻害パーセントとして提示する。『n.d.』は、データが無いことを意味する。
表11
C9ORF72病原性関連mRNA変異体の用量依存的阻害
C9ORF72病原性関連mRNA変異体の用量依存的阻害
C9ORF72病原性関連mRNA変異体の用量依存的阻害
C9ORF72病原性関連mRNA変異体の用量依存的阻害
C9ORF72病原性関連mRNA変異体の用量依存的阻害
さらなる分析のために選択されたギャップマー
ヒトC9ORF72核酸を標的とし、かつアカゲザルC9ORF72核酸と完全に交差反応し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、インビトロでそれらがアカゲザルC9ORF72mRNAに及ぼす効果について試験した。ISIS576816(以前、2012年10月15日に出願のU.S.特許出願第61/714,132号で試験済み)をベンチマークオリゴヌクレオチドとして用いた。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、類似の培養条件を有する一連の実験で試験した。各実験の結果を、以下の表に示す。1ウェルあたり20,000細胞密度のアカゲザルLLC−MK2細胞に、エレクトロポレーションを使用して4,000nMアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約24時間の処理期間の後、RNAを細胞から単離し、C9ORF72mRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3750(配列番号16として本明細書に示される順方向配列TGTGACAGTTGGAATGCAGTGA、配列番号17として本明細書に示される逆方向配列GCCACTTAAAGCAATCTCTGTCTTG、配列番号18として本明細書に示されるプローブ配列TCGACTCTTTGCCCACCGCCA、TAQ manプライマープローブセット)を使用して全C9ORF72mRNAレベルを測定した。RTS3750は、mRNA転写産物のエキソン2を標的にすることで、全mRNA転写産物を測定する。RIBOGREEN(登録商標)で測定されるように、全RNA含有量に従ってC9
ORF72mRNAレベルを調整した。結果を、未処理の対照細胞に対するC9ORF72の阻害パーセントとして提示する。アスタリスク(*)が記されたオリゴヌクレオチドは、プライマープローブセットの単位複製配列領域を標的にする。別のアッセイを用いて、これらのオリゴヌクレオチドの効力と有効性とを測定してもよい。「n.d.」は、その特定のオリゴヌクレオチドのアッセイにおける信号読み取りがなかったことを示す。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、類似の培養条件を有する一連の実験で、HepG2細胞において試験した。各実験の結果もまた、以下に示される表に示す。1ウェルあたり20,000細胞の密度で培養したHepG2細胞に、エレクトロポレーションを使用して4,000nMアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約24時間の処理期間の後、RNAを細胞から単離し、C9ORF72mRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3905を用いて、ヘキサヌクレオチド反復を含むmRNA前駆体の産物であるC9ORF72病原性関連mRNA変異体を測定した。C9ORF72病原性関連mRNA変異体のレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定される細胞の全RNA含量に対して正規化した。結果を、未処理の対照細胞に対するC9ORF72の阻害パーセントとして提示する。『n.d.』は、データが無いことを意味する。
クレオシドを示す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列においてギャップマーが標的とする、最も3'側のヌクレオシドを示す。下記の表に列挙されている各アンチセンスオレゴヌ
クレオチドは、本明細書に配列番号1(GENBANKアクセッション番号NM_001256054.1)として指定されるヒトC9ORF72mRNA配列、本明細書に配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)として指定されるヒトC9ORF72ゲノム配列、GENBANKアクセッション番号NM_018325.3(本明細書に配列番号6として組み込まれる)、またはそれら3つを標的にする。『n/a』は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、その特定の遺伝子配列を標的としなかったことを示す。
表17
配列番号1、2,及び6を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のヒトC9ORF72の阻害パーセント
配列番号1、2,及び6を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のヒトC9ORF72の阻害パーセント
配列番号1、2、及び6を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のヒトC9ORF72の阻害パーセント
配列番号1、2,及び6を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のヒトC9ORF72の阻害パーセント
C9ORF72mRNAの有意なインビトロ阻害を示した上述の試験からのアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、LLC−MK2細胞において種々の用量で試験した。ISIS576816(以前、2012年10月15日に出願のU.S.特許出願第61/714,132号で試験済み)をベンチマークオリゴヌクレオチドとして用いた。1ウェルあたり20,000細胞の密度で細胞を播種し、エレクトロポレーションを使用して、0.33μM、1.00μM、3.00μM、または9.00μM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドをこれらの細胞にトランスフェクトした。約16時間の処理期間の後、RNAを細胞から単離し、C9ORF72mRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトC9ORF72プライマープローブセットRTS3750を用いて、全C9ORF72mRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)で測定されるように、全RNA含有量に従ってC9ORF72mRNAレベルを調整した。結果を、未処理の対照細胞に対するC9ORF72レベルの阻害パーセントとして提示する。
表21
LLC−MK2細胞における全C9ORF72mRNA転写産物レベルの用量依存的阻害
表22
HepG2細胞における全C9ORF72mRNA転写産物レベルの用量依存的阻害
C9ORF72核酸を標的にする別のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。下記の表のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを、5−8−5MOEギャップマー、5−10−5MOEギャップマー、またはデオキシ、MOE、及びcEtギャップマーとして、設計した。
されている。『o』はホスホジエステル結合を示し、また『s』はホスホロチオネート結合を示す。各ギャップマー全体にわたってシトシン残基はすべて、5−メチルシトシンである。
端の両方を、それぞれ5個のヌクレオシドを含むウイングセグメントがフランキングする。5'ウイングセグメントの各ヌクレオシド及び3'ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、2'−MOE基を有する。ヌクレオシド間の結合については、結合の縦列に説明され
ている。『o』はホスホジエステル結合を示し、また『s』はホスホロチオネート結合を示す。各ギャップマー全体にわたってシトシン残基はすべて、5−メチルシトシンである。
化学』の縦列で各オリゴヌクレオチドの糖の修飾を説明する。『k』は、cEtヌクレオシドを示す。『d』はデオキシリボヌクレオシドを示し、数字はデオキシリボヌクレオシドの数を示す。さらに、『e』は2’−MOEヌクレオシドを示す。各ギャップマー全体わたってヌクレオシド間結合は、ホスホロチオネート結合またはホスホジエステル結合である。ヌクレオシド間の結合については、結合の縦列に説明されている。『o』はホスホジエステル結合を示し、また『s』はホスホロチオネート結合を示す。各ギャップマー全体にわたってシトシン残基はすべて、5−メチルシトシンである。
センスオリゴヌクレオチドが標的とする、最も3'側のヌクレオシドを示す。下記の表2
3〜29に列挙されている各アンチセンスオレゴヌクレオチドは、本明細書に配列番号2(ヌクレオシド27535000〜27565000がトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の補体)として指定されるヒトC9ORF72ゲノム配列を標的にする。表30は、配列番号1(GENBANKアクセッション番号NM_001256054.1)であるC9ORF72mRNA配列を標的にする5−10−5ギャップマーを示す。
表23
配列番号2を標的にする5−8−5MOEギャップマー
配列番号2を標的にするデオキシ、MOE、及びcEtオリゴヌクレオチド
配列番号2を標的にするデオキシ、MOE、及びcEtオリゴヌクレオチド
配列番号2を標的にするデオキシ、MOE、及びcEtオリゴヌクレオチド
配列番号2を標的にするデオキシ、MOE、及びcEtオリゴヌクレオチド
配列番号2を標的にするデオキシ、MOE、及びcEtオリゴヌクレオチド
配列番号2を標的にする5−10−5MOEギャップマー
配列番号1を標的にする5−10−5MOEギャップマー
インビボにおけるC9ORF72発現の阻害の耐容性を評価するために、マウスのC9ORF72核酸を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、マウス及びラットモデルで評価した。
び3'ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、MOE修飾を有する。ヌクレオシド間結
合は、ホスホロチオネート結合またはリン酸エステル結合である(GsAoCoCoGsCsTsTsGsAsGsTsTsTsGsCoCoAoCsA、式中、『s』は、ホスホロチオネートヌクレオシド間結合を示し、『o』は、リン酸エステル結合を示し、A、G、C、Tは関連したヌクレオシドを示す)。各ギャップマー全体にわたってシトシン残基はすべて、5−メチルシトシンである。ISIS603538は、ラットC9ORF72mRNA配列上にヌクレオシド2872の標的開始部位を持ち、これが本明細書で配列番号12(GENBANKアクセッション番号NM_001007702.1)として指定される。
C57BL/6マウス4匹からなる複数の群の各々に対して、50μg、100μg、300μg、500μg、または700μgのISIS571883を脳室内大量瞬時投与により投与した。C57/BL6マウス4匹からなる複数の対照群に対しても、PBSによる同様の処置を施した。動物を3%イソフランで麻酔し、定位フレームに入れた。手術部位を滅菌した後、各マウスに対して、ブレグマから前後方向−0.2mmかつブレグマから背腹側3mmに、Hamiltonシリンジを用いて、上記用量のISIS571883を注射した。切開部分を縫合して閉じた。ラットを14日間にわたり回復させ、その後、動物を、Institutional Animal Care and Use
Committeeによって承認された人道的なプロトコルに従って安楽死させた。脳及び脊髄組織を回収し、液体窒素で瞬間凍結した。凍結前に、マウス用 ブレインマトリックスを用いて、脳組織を横断方向に切断して5つの切片にした。
RNA分析
表31
PBS対照と比較したC9ORF72mRNA発現の阻害パーセント
PBS対照と比較したAIF−1mRNAのパーセント発現
上記のものと類似の手順により、C57BL/6マウス4匹からなる複数の群の各々に対して、500μgのISIS571883を脳室内大量瞬時投与により投与した。C57/BL6マウス4匹からなる複数の対照群に対しても、PBSによる同様の処置を施した。マウスをICV投与後の一定間隔の時点で試験した。
運動行動を評価する2つの標準アッセイ、すなわちロータロッド検定と握力検定とを用いた。ロータロッドアッセイの場合、落下するまでの時間を測定した。このアッセイのデータを表33及び34に示す。結果は、ISIS571883のアンチセンス阻害の結果として、または、ICV注射の結果として、運動行動の有意な結果は見られなかったことを示す。したがって、このモデルではC9ORF72のアンチセンス阻害に対して耐容性があると判断した。
表33
ロータロッドアッセイにおける落下するまでの時間(秒)
握力アッセイの平均後肢握力(g)
Sprague−Dawleyラット4匹からなる複数の群の各々に対して、700μg、1,000μg、または3,000μgのISIS603538を髄腔内大量瞬時投与により投与した。Sprague−Dawleyマウス4匹からなる複数の対照群に対して、PBSによる同様の処置を施した。動物を3%イソフランで麻酔し、定位フレームに入れた。手術部位を滅菌した後に、50μLのフラッシュとともに、脊柱管内2cmに8cm髄腔内カテーテルを介する投与により、30μLのASO溶液を注射した。ラットを4日間にわたり回復させ、その後、動物を、Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認された人道的なプロトコルに従って安楽死させた。
C9ORF72mRNAを分析するために、RNAを、注射部位の後ろの2〜3mm脳切片から、脳前頭皮質から、及び脊髄組織の頸椎部及び腰椎部から、抽出した。C9ORF72mRNAの発現を、RT−PCRによって測定した。データを表35に示す。結果は、ISIS603538の用量増加による処置によってC9ORF72mRNAが用量依存的に阻害されたことを示している。
表35
PBS対照と比較したC9ORF72mRNA発現の阻害パーセント
PBS対照と比較したAIF−1mRNA発現の阻害パーセント
ラットの体重を一定の時間間隔ごとに測定した。データを表37に示す。結果は、ISIS603538の用量増加による処置ではラットの体重になんら有意な増加はなかったことを示している。
表37
ラットの体重(初期体重の%)
本明細書で既に示した実施例6に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチド(本明細書で既に示した表23及び表24を参照)を、類似の培養条件を有する一連の実験で、HepG2細胞において試験した。PCT/US2013/065073(2012年10月15日出願の米国特許出願第61/714,132号の優先権を主張)で既に試験したISIS576816を、デオキシ、MOE、及びcEtアンチセンスオリゴヌクレオチドによる試験のためのベンチマークオリゴヌクレオチドとして、使用した。各実験の結果を、以下に示される表に示す。1ウェルあたり20,000細胞の密度で培養したHepG2細胞に、エレクトロポレーションを使用して500nMアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約24時間の処理期間の後、RNAを細胞から単離し、C9ORF72mRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3905を用いて、ヘキサヌクレオチド反復を含むmRNA前駆体の産物であるC9ORF72病原性関連mRNA変異体を測定した。C9ORF72病原性関連mRNA変異体のレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定される細胞の全RNA含量に対して正規化した。結果を、未処理の対照細胞に対するC9ORF72の阻害パーセントとして提示する。
表38
配列番号2を標的にする混合主鎖を有する5-8-5MOEギャップマーによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72病原性関連mRNA変異体の阻害パーセント
配列番号2を標的にする混合主鎖を有するデオキシ、MOE、及びcEtアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72病原性関連mRNA変異体の阻害パーセント
本明細書で既に示された実施例8に記載した試験から、C9ORF72mRNAの有意なインビトロ阻害を示すアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、HepG2細胞において種々の用量で試験した。ISIS576816は、PCT/US2013/065073(以前、2012年10月15日に出願のU.S.特許出願第61/714,132号で試験済み)で既に試験されたもので、これをベンチマークオリゴヌクレオチドとして用いた。1ウェルあたり20,000細胞の密度で細胞を播種し、エレクトロポレーションを使用して、0.11μM、0.33μM、1.00μM、または3.00μM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドをこれらの細胞にトランスフェクトした。約16時間の処理期間の後、RNAを細胞から単離し、C9ORF72mRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3905を用いて、ヘキサヌクレオチド反復を含むmRNA前駆体の産物であるC9ORF72病原性関連mRNA変異体を測定した。RIBOGREEN(登録商標)で測定されるように、全RNA含有量に従ってC9ORF72mRNAレベルを調整した。結果を、未処理の対照
細胞に対するC9ORF72レベルの阻害パーセントとして提示する。
表39
HepG2細胞におけるC9ORF72病原性関連mRNA変異体転写産物レベルの用量依存的阻害
HepG2細胞におけるC9ORF72病原性関連mRNA変異体転写産物レベルの用量依存的阻害
本明細書で既に示した実施例6に記載された混合主鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド(本明細書で既に示した表25〜28を参照)を、類似の培養条件を有する一連の実験で、HepG2細胞において試験した。PCT/US2013/065073(2012年10月15日出願の米国特許出願第61/714,132号の優先権を主張)で既に試験したISIS576816を、デオキシ、MOE、及びcEtアンチセンスオリゴヌクレオチドによる試験のためのベンチマークオリゴヌクレオチドとして、使用した。各実験の結果を、以下に示される表に示す。1ウェルあたり20,000細胞の密度で培養したHepG2細胞に、エレクトロポレーションを使用して700nMアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約24時間の処理期間の後、RNAを細胞から単離し、C9ORF72mRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3905を用いて、ヘキサヌクレオチド反復を含むmRNA前駆体の産物であるC9ORF72病原性関連mRNA変異体を測定した。C9ORF72病原性関連mRNA変異体のレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定される細胞の全RNA含量に対して正規化した。結果を、未処理の対照細胞に対するC9ORF72の阻害パーセントとして提示する。
表41
配列番号2を標的にする混合主鎖を有するデオキシ、MOE、及びcEtアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72病原性関連mRNA変異体の阻害パーセント
配列番号2を標的にする混合主鎖を有するデオキシ、MOE、及びcEtアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72病原性関連mRNA変異体の阻害パーセント
配列番号2を標的にする混合主鎖を有するデオキシ、MOE、及びcEtアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72病原性関連mRNA変異体の阻害パーセント
配列番号2を標的にする混合主鎖を有するデオキシ、MOE、及びcEtアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72病原性関連mRNA変異体の阻害パーセント
表45
HepG2細胞におけるC9ORF72病原性関連mRNA変異体転写産物レベルの用量依存的阻害
HepG2細胞におけるC9ORF72病原性関連mRNA変異体転写産物レベルの用量依存的阻害
HepG2細胞におけるC9ORF72病原性関連mRNA変異体転写産物レベルの用量依存的阻害
HepG2細胞におけるC9ORF72病原性関連mRNA変異体転写産物レベルの用量依存的阻害
HepG2細胞におけるC9ORF72病原性関連mRNA変異体転写産物レベルの用量依存的阻害
HepG2細胞におけるC9ORF72病原性関連mRNA変異体転写産物レベルの用量依存的阻害
HepG2細胞におけるC9ORF72病原性関連mRNA変異体転写産物レベルの用量依存的阻害
HepG2細胞におけるC9ORF72病原性関連mRNA変異体転写産物レベルの用量依存的阻害
ヒトC9ORF72核酸を標的とし、かつアカゲザルC9ORF72核酸と交差反応するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、インビトロでそれらがアカゲザルC9ORF72mRNAに及ぼす効果について試験した。ISIS576816(以前、2012年10月15日に出願のU.S.特許出願第61/714,132号で試験済み)をベンチマークオリゴヌクレオチドとして用いた。本明細書で既に示された実施例2に記載されるISIS576816の混合主鎖バージョンであるISIS619420もまた試験した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、類似の培養条件を有する一連の実験で試験した。各実験の結果を、以下の別々の表に示す。1ウェルあたり20,000細胞密度の培養LLC−MK2細胞に、エレクトロポレーションを使用して3,500nMアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約24時間の処理期間の後、RNAを細胞から単離し、C9ORF72mRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3750(TAQ−manプライマープローブセット)を用いて、全C9ORF72mRNAレベルを測定した。RTS3750は、mRNA転写産物のエキソン2を標的にすることで、全mRNA転写産物を測定する。オリゴヌクレオチドがプライマープローブセットRTS3750(表53参照)の単位複製配列に重なる場合、ヒトプライマープローブセットRTS3760_MGB(本明細書に配列番号1546として指定される順方向配列TTCCAATGCTTACTGGAGAAGTGA、配列番号1547として本明細書に示される逆方向配列GGAACACTGTGTGATTTCATAGATGA、配列番号1548(TACQ−manプライマープローブセット)として本明細書に示されるプローブ配列TCCTGTAATGGAACTGCを、全mRNA転写産物の測定に用いた。C9ORF72mRNAのレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定される細胞の全RNA含量に対して正規化した。結果を、未処理の対照細胞に対するアカゲザルC9ORF72mRNA発現の阻害パ
ーセントとして提示する。アスタリスク(*)が記されたオリゴヌクレオチドは、プライマープローブセットの単位複製配列領域を標的にする。別のアッセイを用いて、これらのオリゴヌクレオチドの効力と有効性とを測定してもよい。『n.d.』は、その特定のオリゴヌクレオチドのアッセイにおける信号読み取りがなかったことを示す。
両方を、それぞれ5個のヌクレオシドを含むウイングセグメントがフランキングする。5'ウイングセグメントの各ヌクレオシド及び3'ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、2'−MOE基を有する。各ギャップマー全体にわたってシトシン残基はすべて、5−メ
チルシトシンである。ギャップマーのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオネート結合とホスホジエステル結合とが混ざっている。各ギャップマーのヌクレオシド間結合を、結合の縦列に示す。ここで、『o』はホスホジエステル結合を示し、『s』はホスホロチオネートを示す。
はすべて、5−メチルシトシンである。ギャップマーのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオネート結合とホスホジエステル結合とが混ざっている。各ギャップマーのヌクレオシド間結合を、結合の縦列に示す。ここで、『o』はホスホジエステル結合を示し、「s」はホスホロチオネートを示す。
オシドを示す。「終止部位」は、遺伝子配列においてギャップマーが標的とする、最も3'側のヌクレオシドを示す。下記の表に列挙されている各ギャップマーは、本明細書に配
列番号1(GENBANKアクセッション番号NM_001256054.1)として指定されるヒトC9ORF72mRNA配列、本明細書に配列番号2(ヌクレオシド27535000から27565000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NT_008413.18の相補鎖)として指定されるヒトC9ORF72ゲノム配列、本明細書に配列番号19(ヌクレオシド8522000から8552000までがトランケートされたGENBANKアクセッション番号NW_001101662.1)として指定されるアカゲザルC9ORF72ゲノム配列の、1つまたは複数を標的にする。「不一致」の縦列は、ヒトアンチセンスオリゴヌクレオチドが有する、アカゲザルゲノム配列との不一致の数を示す。アカゲザルの配列の縦列において、『n/a』はアカゲザルのゲノム配列と3を上回る数の不一致がヒトオリゴヌクレオチドにあることを示す。「不一致」の縦列が表に設けられていない場合には、表のヒトオリゴヌクレオチドがアカゲザルゲノム配列と完全に、相互に反応を起こし得るものと理解される。
表53
配列番号1、2、及び19を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72mRNAレベルの阻害パーセント
配列番号1、2、及び19を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72mRNAレベルの阻害パーセント
配列番号1、2、及び19を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72mRNAレベルの阻害パーセント
配列番号1、2、及び19を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72mRNAレベルの阻害パーセント
配列番号1、2、及び19を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72mRNAレベルの阻害パーセント
配列番号1、2、及び19を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72mRNAレベルの阻害パーセント
配列番号1、2、及び19を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72mRNAレベルの阻害パーセント
配列番号1、2、及び19を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、PBS対照と比較した場合のC9ORF72mRNAレベルの阻害パーセント
C9ORF72mRNAの有意なインビトロ阻害を示した上述の試験からのアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、HepG2細胞において種々の用量で試験した。本明細書で先に実施例2で述べられたISIS619420も、試験した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、類似の培養条件を有する一連の実験で試験した。各実験の結果を、以下の別々の表に示す。1ウェルあたり20,000細胞の密度で細胞を播種し、エレクトロポレーションを使用して、0.33μM、1.00μM、3.00μM、または9.00μM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドをこれらの細胞にトランスフェクトした。約16時間の処理期間の後、RNAを細胞から単離し、C9ORF72mRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3750を用いて、全C9ORF72mRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)で測定されるように、全RNA含有量に従ってC9ORF72mRNAレベルを調整した。結果を、未処理の対照細胞に対するC9ORF72レベルの阻害パーセントとして提示する。
表61
HepG2細胞における全C9ORF72mRNAレベルの用量依存的阻害
HepG2細胞における全C9ORF72mRNAレベルの用量依存的阻害
HepG2細胞における全C9ORF72mRNAレベルの用量依存的阻害
上記実施例のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、標準マウスモデルで試験することで、オリゴヌクレオチドに対する耐容性を評価した。齧歯動物を、標準FOBアッセイとGFAP及び/またはAIF発現レベルの測定とによって、評価した。
注射後3時間目、1週目、2週目、4週目、6週目、及び8週目に、各マウスを7種類の基準に従って評価した。7つの基準とは、(1)マウスは、利口で警戒心があり、敏感であったこと、(2)マウスは、刺激無しで、立位または円背位であったこと、(3)マウスは、刺激無しで、なんらかの動作を示したこと、(4)マウスは、持ち上げられた後に前進動作を示したこと、(5)マウスは、持ち上げられた後に何らかの動作を示したこと、(6)マウスは、尾部つねりに応答したこと、(7)通常呼吸であること、である。7つの異なる基準の各々について、各マウスに対して、基準に合致した場合には0、基準に合致しない場合には1のサブスコアを与えた。7つの基準すべてについて評価をおこなった後、各マウスについてサブスコアを合計し、各群の平均値を求めた。例えば、700μgICV投与後3時間、マウスが利口で警戒心があり、敏感であり、さらに他のすべての基準を満たした場合、合計されたスコアは0となる。別のマウスが、700μgICV投与後3時間、利口でもなく、警戒心があるわけでもなく、敏感でもないが、ほかの基準はすべて満たしていた場合、スコア1を与えられる。
本試験で調べられたオリゴヌクレオチドを下記の表に示す。FOBスコアを以下に示す。
表64
配列番号2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド
C57/Bl6マウスにおけるFOBスコア
本試験で調べられたオリゴヌクレオチドを下記の表に示す。FOBスコアを以下に示す。
表66
配列番号2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド
C57/Bl6マウスにおけるFOBスコア
本試験で調べられたオリゴヌクレオチドを下記の表に示す。FOBスコアを以下に示す。
表68
配列番号2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド
C57/Bl6マウスにおけるFOBスコア
本試験で調べられたオリゴヌクレオチドを下記の表に示す。FOBスコアを以下に示す。
表70
配列番号2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド
C57/Bl6マウスにおけるFOBスコア
本試験で調べられたオリゴヌクレオチドを下記の表に示す。FOBスコアを以下に示す。
表72
配列番号2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド
C57/Bl6マウスにおけるFOBスコア
本試験で調べられたオリゴヌクレオチドを下記の表に示す。FOBスコアを以下に示す。
表74
配列番号2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド
C57/Bl6マウスにおけるFOBスコア
本試験で調べられたオリゴヌクレオチドを下記の表に示す。FOBスコアを以下に示す。
表76
配列番号2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド
C57/Bl6マウスにおけるFOBスコア
本試験で調べられたオリゴヌクレオチドを下記の表に示す。FOBスコアを以下に示す
。
表78
配列番号2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド
C57/Bl6マウスにおけるFOBスコア
オチドの耐容性
上記実施例のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、標準ラットモデルで試験することで、オリゴヌクレオチドに対する耐容性を評価した。齧歯動物を、標準FOBアッセイとGFAP及び/またはAIF発現レベルの測定とによって、評価した。SDラットの複数の群に対して、以下の表に特定されるように2,000μgまたは3,000μgのISISオリゴヌクレオチドを髄腔内投与した。
ラットFOBアッセイ
本試験で調べられたオリゴヌクレオチドを下記の表に示す。FOBスコアを以下に示す。
表80
配列番号2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド
Sprague−DawleyラットにおけるFOBスコア
本試験で調べられたオリゴヌクレオチドを下記の表に示す。FOBスコアを以下に示す。
表82
配列番号2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド
Sprague−DawleyラットにおけるFOBスコア
本試験で調べられたオリゴヌクレオチドを下記の表に示す。FOBスコアを以下に示す。
表84
配列番号2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド
Sprague−DawleyラットにおけるFOBスコア
本試験で調べられたオリゴヌクレオチドを下記の表に示す。FOBスコアを以下に示す。
表86
配列番号2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド
Sprague−DawleyラットにおけるFOBスコア
本試験で調べられたオリゴヌクレオチドを下記の表に示す。FOBスコアは、以下のとおりであり、このモデルではいくつかのオリゴヌクレオチドに対して耐容性があることが示された。
表88
配列番号2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド
Sprague−DawleyラットにおけるFOBスコア
本試験で調べられたオリゴヌクレオチドを下記の表に示す。FOBスコアは、以下のとおりであり、このモデルではいくつかのオリゴヌクレオチドに対して耐容性があることが示された。
表90
配列番号2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド
Sprague−DawleyラットにおけるFOBスコア
本試験で調べられたオリゴヌクレオチドを下記の表に示す。FOBスコアは、以下のとおりであり、このモデルではいくつかのオリゴヌクレオチドに対して耐容性があることが示された。
表92
配列番号2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド
Sprague−DawleyラットにおけるFOBスコア
WO2014/062691に記載のオリゴヌクレオチドを、マウスにける耐容性の検討で試験した。試験したオリゴヌクレオチドには、完全ホスホロチオネート主鎖を有する5−10−5MOEギャップマーであり、かつ各シトシンが5'−メチルトキシンである
、ISIS576816、ISIS576974、ISIS577061、ISIS577065、及びISIS577083が含まれる。配列を以下の表に示す。マウスを3匹または4匹からなる複数の群に分けた。各々のマウス群の各マウスに対して、用量700μgのオリゴヌクレオチドをICV単回投与した。注射後3時間で、7種類の基準に従って各マウスを評価した。7つの基準とは、(1)マウスは、利口で警戒心があり、敏感であったこと、(2)マウスは、刺激無しで、立位または円背位であったこと、(3)マウスは、刺激無しで、なんらかの動作を示すこと、(4)マウスは、持ち上げられた後に、前進動作を示すこと、(5)マウスは、持ち上げられた後に何らかの動作を示すこと、(7)マウスは、尾部つねりに応答すること、(7)通常呼吸であること、である。7つの異なる基準の各々について、各マウスに対して、基準に合致した場合には0、基準に合致しない場合には1のサブスコアを与えた。7つの基準すべてについて評価をおこなった後、各マウスについてサブスコアを合計し、各群の平均値を求めた。例えば、ICV投与後
3時間、マウスが利口で警戒心があり、敏感であり、さらに他のすべての基準を満たした場合、合計されたスコアは0となる。別のマウスが、ICV投与後3時間、利口でもなく、警戒心があるわけでもなく、敏感でもないが、ほかの基準はすべて満たしていた場合、スコア1を与えられる。塩類処理ラットには、概ね、0のスコアを与える。以下の表において、各々の処置群についての平均スコアとして、結果を示す。これらの結果は、ISIS576816、ISIS576974、ISIS577061、ISIS577065、及びISIS577083に対する耐容性が不十分であることを示している。
表94
WO2014/062691のアンチセンスオリゴヌクレオチド
マウスにおけるFOBスコア
SIS619342(本明細書で先に示された実施例14を参照)は、マウスの急性耐容性スコアが6、6、6、6(動物4匹)であり、ラットの急性耐容性スコアが6、6、6(動物3匹)であった(本明細書で先に示した実施例15を参照)。両化合物に対する急性耐容性が劣ると考えられる。したがって、WO2014/062691に前に開示された化合物ISIS576816、ISIS576974、ISIS577061、ISIS577065、及びISIS577083は、マウスで見られたように、ラットでも高いFOBスコアが示されると思われる。したがって、化合物は、マウスで見られたように、ラットでも高いFOBスコアが示されると思われる。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
[態様1]12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号20〜401及び441〜1545の核酸塩基配列のいずれかの、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、化合物。
[態様2]12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1107〜1520の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
[態様3]12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1111〜1200の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
[態様4]12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1211〜1318の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
[態様5]12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1326〜1540の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む塩基核酸配列を含む、化合物。
[態様6]12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1331〜1375の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
[態様7]12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1368〜1391の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
[態様8]12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1398〜1424の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
[態様9]12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1411〜1440の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
[態様10]12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1429〜1481の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
[態様11]12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1502〜1539の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
[態様12]12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1508〜1539の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、前記化合物。
[態様13]前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、配列番号1に対して、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%相補性を有する、態様2〜5に記載の前記化合物。
[態様14]一本鎖の修飾オリゴヌクレオチドからなる、前記いずれかの態様に記載の前記化合物。
[態様15]少なくとも1つのヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合である、前記いずれかの態様に記載の前記化合物。
[態様16]少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオネートヌクレオシド間結合である、態様8に記載の前記化合物。
[態様17]各修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオネートヌクレオシド間結合である、態様8に記載の前記化合物。
[態様18]少なくとも1つのヌクレオシド間結合がホスホジエステルヌクレオシド間結合である、前記いずれかの態様に記載の前記化合物。
[態様19]少なくとも1つのヌクレオシド間結合がホスホロチオネート結合であり、かつ少1つのヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合である、前記いずれかの態様に記載の前記化合物。
[態様20]少なくとも1つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む、前記いずれかの態様に記載の前記化合物。
[態様21]前記修飾核酸塩基が5−メチルシトシンである、態様13に記載の前記化合物。
[態様22]前記修飾オリゴヌクレオチド化合物の少なくとも1つのヌクレオシドが修飾糖を含む、前記いずれかの態様に記載の前記化合物。
[態様23]前記少なくとも1つの修飾糖が二環式糖である、態様15に記載の前記化合物。
[態様24]前記二環式糖が、糖4’−CH2−N(R)−O−2’架橋の2'及び4'位の間に化学結合を含み、式中、Rが独立してH、C1〜C12アルキル、または保護基である態様16に記載の前記化合物。
[態様25]前記二環式糖が、4’−CH2−N(R)−O−2’架橋を含み、式中、Rが独立してH、C1〜C12アルキル、または保護基である態様16に記載の前記化合物。
[態様26]少なくとも1つの修飾糖が2’−O−メトオキシエチル基を含む、態様15に記載の前記化合物。
[態様27]前記修飾糖が2’−O(CH2)2−OCH3基を含む、態様15に記載の前記化合物。
[態様28]前記修飾オリゴヌクレオチドが、
10個の結合デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
5つの結合ヌクレオシドからなる5'ウイングセグメントと、
5つの結合ヌクレオシドからなる3'ウイングセグメントとを含み、
前記ギャップセグメントが前記5'ウイングセグメントと前記3'ウイングセグメントとの間に位置し、
各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む、前記いずれかの態様に記載の前記化合物。
[態様29]前記修飾オリゴヌクレオチドが、
8個の結合デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
5つの結合ヌクレオシドからなる5'ウイングセグメントと、
5つの結合ヌクレオシドからなる3'ウイングセグメントとを含み、
前記ギャップセグメントが前記5'ウイングセグメントと前記3'ウイングセグメントとの間に位置し、
各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む、前記いずれかの態様に記載の前記化合物。
[態様30]前記修飾オリゴヌクレオチドが、eeekkdddddddkkeee、eekkddddddddkkeee、ekddddddddekekeee、kekeddddddddekeke、及びekekddddddddkekeeのいずれかのパターンで、糖の修飾を含み、式中、
e=2’−O−メトキシエチル修飾ヌクレオシド、
d=2’−デオキシヌクレオシド、及び
k=cEtヌクレオシドである、前記いずれかの態様に記載の前記化合物。
[態様31]前記修飾オリゴヌクレオチドが、soooossssssssssooss、sooosssssssssooss、soosssssssssooss、及びsosssssssssooossのいずれかのパターンで、ヌクレオシド間結合を含み、式中、
s=ホスホロチオネート結合、及び
o=ホスホジエステル結合である、前記いずれかの態様に記載の前記化合物。
[態様32]前記修飾オリゴヌクレオチドが20個の結合ヌクレオシドからなる、前記いずれかの態様に記載の前記化合物。
[態様33]前記修飾オリゴヌクレオチドが19個の結合ヌクレオシドからなる、前記いずれかの態様に記載の前記化合物。
[態様34]前記修飾オリゴヌクレオチドが18個の結合ヌクレオシドからなる、前記いずれかの態様に記載の前記化合物。
[態様35]前記修飾オリゴヌクレオチドが17個の結合ヌクレオシドからなる、前記いずれかの態様に記載の前記化合物。
[態様36]前記いずれかの態様に記載の前記化合物またはその塩と、少なくとも1つの薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、組成物。
[態様37]前記いずれかの態様に記載の前記化合物または組成物を動物に投与することを含む、方法。
[態様38]前記動物がヒトである、態様37に記載の前記方法。
[態様39]前記化合物の投与が、C9ORF72に関連する疾患、障害、または状態を予防し、治療し、緩和し、または進行を遅らせる、態様38に記載の方法。
[態様40]前記化合物の投与が、C9ORF72ヘキサヌクレオチド反復伸長に関連する疾患、障害、または状態を予防し、治療し、緩和し、または進行を遅らせる、態様38に記載の方法。
[態様41]前記疾患、障害、または状態が、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭型痴呆(FTD)、大脳皮質基底核変性症症候群(CBD)、非定型パーキンソン症候群、及びオリーブ橋小脳変性症(OPCD)である、態様39または40に記載の方法。
[態様42]前記投与が核内フォーカスを減少させる、態様37に記載の方法。
[態様43]前記投与がC9ORF72関連RAN翻訳生成物の発現を減少させる、態様37に記載の方法。
[態様44]前記C9ORF72関連RAN翻訳生成物が、ポリ(グリシン−プロリン)、ポリ(グリシン−アラニン)、及びポリ(グリシン−アルギニン)のいずれかである、態様43に記載の方法。
[態様45]神経変性障害を処置する薬物の製造のために、前記いずれかの態様に記載の前記化合物または組成物の使用。
[態様46]C9ORF72mRNA前駆体のエクソン1Aの開始部位から始まってエクソン1Bの開始部位までを標的にするアンチセンス化合物を投与することによって、C9ORF72病原性関連mRNA変異体を選択的に阻害する、方法。
Claims (46)
- 12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号20〜401及び441〜1545の核酸塩基配列のいずれかの、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、化合物。
- 12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1107〜1520の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、
化合物。 - 12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1111〜1200の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、
化合物。 - 12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1211〜1318の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、
化合物。 - 12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1326〜1540の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む塩基核酸配列を含む、
化合物。 - 12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1331〜1375の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、
化合物。 - 12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1368〜1391の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、
化合物。 - 12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1398〜1424の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、
化合物。 - 12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1411〜1440の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、
化合物。 - 12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1429〜1481の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、
化合物。 - 12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1502〜1539の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、
化合物。 - 12〜30の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、配列番号2の核酸塩基1508〜1539の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20の連続した核酸塩基連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、前記化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、配列番号1に対して、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%相補性を有する、請求項2〜5に記載の前記化合物。
- 一本鎖の修飾オリゴヌクレオチドからなる、前記いずれかの請求項に記載の前記化合物。
- 少なくとも1つのヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合である、前記いずれかの請求項に記載の前記化合物。
- 少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオネートヌクレオシド間結合で
ある、請求項8に記載の前記化合物。 - 各修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオネートヌクレオシド間結合である、請求項8に記載の前記化合物。
- 少なくとも1つのヌクレオシド間結合がホスホジエステルヌクレオシド間結合である、前記いずれかの請求項に記載の前記化合物。
- 少なくとも1つのヌクレオシド間結合がホスホロチオネート結合であり、かつ少1つのヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合である、前記いずれかの請求項に記載の前記化合物。
- 少なくとも1つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む、前記いずれかの請求項に記載の前記化合物。
- 前記修飾核酸塩基が5−メチルシトシンである、請求項13に記載の前記化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチド化合物の少なくとも1つのヌクレオシドが修飾糖を含む、前記いずれかの請求項に記載の前記化合物。
- 前記少なくとも1つの修飾糖が二環式糖である、請求項15に記載の前記化合物。
- 前記二環式糖が、糖4’−CH2−N(R)−O−2’架橋の2'及び4'位の間に化学結合を含み、式中、Rが独立してH、C1〜C12アルキル、または保護基である請求項16に記載の前記化合物。
- 前記二環式糖が、4’−CH2−N(R)−O−2’架橋を含み、式中、Rが独立してH、C1〜C12アルキル、または保護基である請求項16に記載の前記化合物。
- 少なくとも1つの修飾糖が2’−O−メトオキシエチル基を含む、請求項15に記載の前記化合物。
- 前記修飾糖が2’−O(CH2)2−OCH3基を含む、請求項15に記載の前記化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、
10個の結合デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
5つの結合ヌクレオシドからなる5'ウイングセグメントと、
5つの結合ヌクレオシドからなる3'ウイングセグメントとを含み、
前記ギャップセグメントが前記5'ウイングセグメントと前記3'ウイングセグメントとの間に位置し、
各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む、前記いずれかの請求項に記載の前記化合物。 - 前記修飾オリゴヌクレオチドが、
8個の結合デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
5つの結合ヌクレオシドからなる5'ウイングセグメントと、
5つの結合ヌクレオシドからなる3'ウイングセグメントとを含み、
前記ギャップセグメントが前記5'ウイングセグメントと前記3'ウイングセグメントとの間に位置し、
各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む、前記いずれかの請求項に記載の前記化合物。 - 前記修飾オリゴヌクレオチドが、eeekkdddddddkkeee、eekkddddddddkkeee、ekddddddddekekeee、kekeddddddddekeke、及びekekddddddddkekeeのいずれかのパターンで、糖の修飾を含み、式中、
e=2’−O−メトキシエチル修飾ヌクレオシド、
d=2’−デオキシヌクレオシド、及び
k=cEtヌクレオシドである、前記いずれかの請求項に記載の前記化合物。 - 前記修飾オリゴヌクレオチドが、soooossssssssssooss、sooosssssssssooss、soosssssssssooss、及びsosssssssssooossのいずれかのパターンで、ヌクレオシド間結合を含み、式中、
s=ホスホロチオネート結合、及び
o=ホスホジエステル結合である、前記いずれかの請求項に記載の前記化合物。 - 前記修飾オリゴヌクレオチドが20個の結合ヌクレオシドからなる、前記いずれかの請求項に記載の前記化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが19個の結合ヌクレオシドからなる、前記いずれかの請求項に記載の前記化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが18個の結合ヌクレオシドからなる、前記いずれかの請求項に記載の前記化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが17個の結合ヌクレオシドからなる、前記いずれかの請求項に記載の前記化合物。
- 前記いずれかの請求項に記載の前記化合物またはその塩と、少なくとも1つの薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、組成物。
- 前記いずれかの請求項に記載の前記化合物または組成物を動物に投与することを含む、方法。
- 前記動物がヒトである、請求項37に記載の前記方法。
- 前記化合物の投与が、C9ORF72に関連する疾患、障害、または状態を予防し、治療し、緩和し、または進行を遅らせる、請求項38に記載の方法。
- 前記化合物の投与が、C9ORF72ヘキサヌクレオチド反復伸長に関連する疾患、障害、または状態を予防し、治療し、緩和し、または進行を遅らせる、請求項38に記載の方法。
- 前記疾患、障害、または状態が、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭型痴呆(FTD)、大脳皮質基底核変性症症候群(CBD)、非定型パーキンソン症候群、及びオリーブ橋小脳変性症(OPCD)である、請求項39または40に記載の方法。
- 前記投与が核内フォーカスを減少させる、請求項37に記載の方法。
- 前記投与がC9ORF72関連RAN翻訳生成物の発現を減少させる、請求項37に記載の方法。
- 前記C9ORF72関連RAN翻訳生成物が、ポリ(グリシン−プロリン)、ポリ(グリシン−アラニン)、及びポリ(グリシン−アルギニン)のいずれかである、請求項43に記載の方法。
- 神経変性障害を処置する薬物の製造のために、前記いずれかの請求項に記載の前記化合物または組成物の使用。
- C9ORF72mRNA前駆体のエクソン1Aの開始部位から始まってエクソン1Bの開始部位までを標的にするアンチセンス化合物を投与することによって、C9ORF72病原性関連mRNA変異体を選択的に阻害する、方法。
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