JP2020055827A - Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 - Google Patents
Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020055827A JP2020055827A JP2019214553A JP2019214553A JP2020055827A JP 2020055827 A JP2020055827 A JP 2020055827A JP 2019214553 A JP2019214553 A JP 2019214553A JP 2019214553 A JP2019214553 A JP 2019214553A JP 2020055827 A JP2020055827 A JP 2020055827A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- poly
- pro
- repeat
- als
- subject
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D21/00—Separation of suspended solid particles from liquids by sedimentation
- B01D21/26—Separation of sediment aided by centrifugal force or centripetal force
- B01D21/262—Separation of sediment aided by centrifugal force or centripetal force by using a centrifuge
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/285—Demyelinating diseases; Multipel sclerosis
Abstract
Description
本願は、米国仮出願第61/786,258号、2013年3月14日出願の出願日の利益および米国仮出願第61/883,219号、2013年9月27日出願の出願日の利益を主張する。これらの参照された出願の両方の内容全体が、本明細書に参照により組み込まれる。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により授与されたPO1NS058901およびRO1NS040389の下での政府援助によりなされた。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本開示の態様は、対象からの血液試料中の1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルに基づく、ALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高い対象の同定に関する。いくつかの実施形態において、方法は、対象から得られる血液試料中の、ポリ(Gly−Ala)、ポリ(Gly−Pro)、ポリ(Gly−Arg)、ポリ(Pro−Ala)、ポリ(Pro−Arg)、Met...ポリ(Pro−Arg)またはMet...ポリ(Gly−Pro)タンパク質から選択される1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを決定することを含み、対照レベルと比較して上昇した1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルは、対象がALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルは、アッセイを実施することにより決定される。非限定的なアッセイを本明細書に記載する。
本明細書に記載のとおり、C9ORF72遺伝子のイントロン内の伸長GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート配列は、センスおよびアンチセンスの両方の方向にヘキサヌクレオチドリピートを含有するRNA転写物がもたらされるように転写されることが見出された。ヒトC9ORF72遺伝子のGenBank Gene IDは203228である。センスおよびアンチセンスヘキサヌクレオチドリピート含有転写物の両方が、AUG開始コドンから独立した翻訳[リピート関連非ATG(RAN)翻訳]を受け、結果として、読まれるヘキサヌクレオチドリピートのフレームに応じて(センス転写物上の5’−GGGGCC−3’、5’−GGGCCG−3’、および5’−GGCCGG−3’、ならびにアンチセンス転写物上の5’−GGCCCC−3’、5’−GCCCCG−3’、および5’−CCCCGG−3’、図1を参照のこと)、ポリ(Gly−Ala)、ポリ(Gly−Pro)、ポリ(Gly−Arg)、ポリ(Pro−Ala)、またはポリ(Pro−Arg)ジアミノ酸リピート含有タンパク質がもたらされることが見出された。加えて、アンチセンスヘキサヌクレオチドリピート含有転写物は、ATG開始翻訳を通じて翻訳され、Met...ポリ(Pro−Arg)およびMet...ポリ(Gly−Pro)タンパク質をもたらすことが見出された。
本開示の態様は、ALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高い対象、たとえばヒトの同定および処置に関する。いくつかの実施形態において、対象はALSを有していてもよい。いくつかの実施形態において、対象は、1つまたは複数のALSの症状、たとえば呼吸困難、嚥下困難、筋痙攣、筋収縮、筋衰弱、麻痺、会話障害、または体重減少を有していてもよい。いくつかの実施形態において、対象はALSの症状を一切有していなくてもよい。いくつかの実施形態において、対象はALSの家族歴を有していてもよい。
本開示の態様は、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質および/またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルの対照レベルとの比較に関する。いくつかの実施形態において、対照レベルは、健常対象または健常対象の集団から得られる試料、たとえば流体試料または組織試料中の1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質および/またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルである。いくつかの実施形態において、試料は血液試料である。本明細書において使用される健常対象は、一見疾患を有せず、ALSまたはFTD等の病歴を有しない対象である。いくつかの実施形態において、健常対象は、C9ORF72遺伝子内に25個以下のGGGGCCヘキサヌクレオチドリピートを有する対象である。
本開示の態様は、対象から得られた血液試料(たとえば、全血、血漿、または血清)中の1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを決定することに関する。血液試料は、当技術分野において知られている任意の方法により、たとえば、針または指穿刺装置を使用して得られる。血液は、本明細書に記載の方法における使用前に処理されてもよい。かかる処理には、抗凝固剤の添加、血液細胞の除去、および/または血液の冷凍が含まれる。しかしながら、他の試料、たとえば組織試料(たとえば脳組織)または他の流体試料、たとえば唾液もしくは尿を使用できることが認められるべきである。
本開示の態様は、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質および/またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルまたは存在/非存在を決定するためにアッセイを実施することに関する。タンパク質およびRNAを検出するための当技術分野において知られているアッセイ(たとえば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York.を参照のこと。マイクロアレイ技術は、Microarray Methods and Protocols, R. Matson, CRC Press, 2009, or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに記載されている。)を、単独でまたは本明細書に記載のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルを測定するための手法および組成物と組み合わせて使用できる。
本明細書に記載のとおり、ジアミノ酸リピート含有タンパク質が、ALSを有する患者からの血液試料中に存在することが見出された。理論または機構に束縛されることを望まないが、ALSを有する対象の血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質が時間経過とともに脳実質内に蓄積し、神経炎症性変化、CNS機能障害、および神経細胞死をもたらすと考えられる。したがって、本開示の態様は、対象の血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルを減少または安定化させることによる、ALSまたはFTDを有する対象の処置に関する。
1)非連続フロー遠心分離:1本の静脈内カテーテルラインが使用される。典型的には、1度に血液の1つまたは複数のバッチが除去され、遠心分離されて血漿を血液細胞から分離する。次に血液細胞は、補液と組み合わされて対象に戻される。
2)連続フロー遠心分離:2本の静脈内ラインが使用される。血漿は連続的に血液から取り出され、分離された血液細胞は、対象に戻る前に補液を結合したラインを通じて供給される。
3)血漿濾過:2本の静脈内ラインが使用され。血漿は、標準的な血液透析器具、たとえば平行板または中空繊維フィルターを使用して濾過される。分離された血液細胞は、対象に戻る前に補液を結合したラインを通じて供給される。フィルターは通常、血漿の通過を可能にする一方で細胞を保持するのに十分な直径0.2〜0.6μmの細孔を有する。複数の膜血漿分離器が市販されている(たとえば、Asahi Medical Co.,Ltd.,Tokyo,Japan製Plasmaflo、Toray Industries,Tokyo,Japan製Plasmax、Baxter,Deerfield,IL,USA製CPS−10、Fresenius Medical Care AG,Bad Homburg,Germany製Plasmaflux、Hospal,Lyon,France製Prisma TPE 2000)。
本開示の態様は、ポリ(Gly−Ala)、ポリ(Gly−Pro)、ポリ(Gly−Arg)、ポリ(Pro−Ala)、ポリ(Pro−Arg)、Met...ポリ(Pro−Arg)またはMet...ポリ(Gly−Pro)タンパク質から選択されるジアミノ酸リピート含有タンパク質(たとえば、RANタンパク質)に特異的な単離抗体に関する。単離抗体は、ジアミノ酸リピート含有タンパク質の領域(たとえば、リピート配列またはC末端)を認識するかまたはジアミノ酸リピート含有タンパク質全体を認識してもよい。
[Bound]=[N][Free]/(Kd+[Free])
別の一態様において、本開示は、GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート配列を含むヒトC9ORF72遺伝子を含むトランスジェニックマウスに関する。いくつかの実施形態において、マウスは、GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート配列ならびにヒトC9ORF72遺伝子の5’および3’末端上のフランキングヒト配列を含むヒトC9ORF72遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、5’および3’末端上のフランキングヒト配列は、それぞれ独立に、長さが少なくとも1キロベース(kB)、少なくとも5kB、少なくとも10kB、少なくとも20kB、少なくとも30kB、少なくとも40kB、または少なくとも50kBである。いくつかの実施形態において、5’および3’末端上のフランキングヒト配列は、それぞれ独立に、ヒトC9ORF72遺伝子の転写をセンスおよびアンチセンス方向にそれぞれ駆動可能なプロモーターを含む。したがって、いくつかの実施形態において、トランスジェニックマウスは、センスおよびアンチセンス転写物の両方(たとえば、本明細書に記載の5’−GGGGCC−3’および5’GGCCCC−3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNA)を発現する。いくつかの実施形態において、ヒトC9ORF72遺伝子およびフランキング配列は、下の配列を含み、(GGGGCC)nは、GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート配列の位置を示す。
C9ORF72ファミリー(CNSA−1)からの遺伝子保持者、および、運動神経細胞疾患もしくは前頭側頭認知機能障害または両方の初期徴候を有する遺伝子陽性患者を含む通院患者について、詳細な評価が実施される。ジアミノ酸リピート含有タンパク質発現は、CNSAファミリー試料および医院において回収された追加試料におけるリピート長と相関する。血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質発現は、長期的に回収された試料において決定され、疾患発症および臨床的重症度と相関する。これらの方法は、C9ORF72陽性拡大研究対象におけるジアミノ酸リピート含有タンパク質発現を特徴付け、ジアミノ酸リピート含有タンパク質発現が一生を通じて生じるかまたは加齢とともに増加するかどうか、ならびに、ジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルが、疾患重症度と定量的に相関するかどうかを決定することが予測される。
これまで同定された家族性FTDおよびALSの最も一般的な原因である、ALS/FTDの染色体9p21関連形態は、染色体9オープンリーディングフレーム72(C90RF72)のイントロン1における伸長GGGGCC(G4C2)ヘキサヌクレオチドリピートにより引き起こされる(1、2)。C9ORF72突然変異は、家族性ALS症例の40%および散発性ALS症例の7%ならびに家族性FTD患者の21%および散発性FTD患者の5%に見出される(3)。C9ORF72伸長の発見は、かなりの興奮をもたらした。なぜならそれは、ALSおよびFTDを、マイクロサテライト伸長突然変異により引き起こされる大きな疾患群と関連付けるからである(4)。
C9ORF72伸長患者におけるアンチセンスRNA凝集
アンチセンス(AS)C9ORF72伸長転写物がAS G2C4RNA凝集を形成し、RAN翻訳によりまたは短いASオープンリーディングフレーム(AS−ORF)からASタンパク質を発現させるという仮説を試験するため、一連の実験が実施された。まず、イントロン1b、アンチセンスG2C4伸長の5’、およびエクソン1aにおけるセンスおよびアンチセンス転写物の発現を比較するために、リンカー(linkered)鎖特異的RT−PCR方略を使用して、C9ORF72アンチセンス転写物が発現することが確認された。イントロン1bにおけるアンチセンス鎖について、RT反応のためにLK−ASORF−RプライマーならびにアンチセンスcDNAを特異的に増幅するPCRのためにASORF−FおよびLKを使用して鎖特異的RT−PCRを実施した(図12A)。同様の方略を、イントロン1bの同じ領域からのセンス転写物ならびにエクソン1aにおけるセンスおよびアンチセンス転写物を増幅するために使用した。イントロン1bアンチセンス転写物が、C9(+)ALS/FTD患者からの前頭皮質においてRT−PCRにより検出されたが、C9(−)ALS/FTDまたは正常対照からは検出されず(図12B)、qRT−PCRは、これらの転写物が6つのC9(+)ALS/FTD症例の間で劇的に増加することを示す(図12C)。対照的に、イントロン1bセンス転写物は、前頭皮質においてRT−PCRにより検出されなかった(図12B)。血中では、イントロン1bセンスおよびアンチセンス転写物の両方が検出可能であり、イントロン1bアンチセンス転写物の劇的なC9(+)上昇は観察されなかった。5’RACEは、イントロン1b AS転写がG2C4リピートの251〜455塩基対(bp)上流の様々な部位で開始することを示した(図12A、図19B)。対照的に、G2C4リピートの40および90bp3’に位置する3’GSP1または3’GSP2プライマーを使用した3’RACEは、転写物を検出しなかった。これらのデータは、AS転写物の3’末端が、アンチセンスG2C4リピートの170bp3’に位置するセンスエクソン1a領域と重ならないことを示した。この結果と一致して、センス転写物は、エクソン1aと重なるプライマーを使用した鎖特異的リンカーRT−PCRにより検出されたが、アンチセンス転写物は検出されなかった(図12B)。アンチセンス転写物がG2C4リピート伸長を含むかどうかを決定するため、Cy3標識化(G4C2)4プローブを使用してRNA蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)を実施し、推定アンチセンスG2C4RNA凝集を検出する。結果は、核(図12D)の、そしてまれに細胞質(図19C)のG2C4RNA凝集が、C9(+)ALS前頭皮質において蓄積するが、C9(−)ALS前頭皮質には蓄積しないことを示した。細胞質内の凝集の検出は、アンチセンス伸長転写物が、タンパク質翻訳機構と同じ細胞内コンパートメントに見出されうることを示したのであり、おそらくそこでRAN翻訳は生じる。末梢組織におけるRNA凝集は、疾患のバイオマーカーを提供しうるので、末梢血白血球(PBL)を検査し、C9(+)PBLにおいてセンスおよびアンチセンスRNA凝集の両方が検出されたが、C9(−)PBLにおいては検出されなかった(図12D、図19D)。AS凝集を検出するCy3−G4C2プローブからのRNA−FISHシグナルが、過度の非標識化G4C2オリゴと競合しうるのであり、これらの凝集がDNase Iに耐性でありRNase I消化に感受性であることが発見された(図19E、F)。まとめると、これはC9ORF72アンチセンス転写物がC9(+)ALSにおいて前頭皮質内で上昇するが、C9(−)ALSまたは正常対照においては上昇しないことを示す。C9(+)前頭皮質において、核の、そしてまれに細胞質のRNA凝集において、G2C4伸長突然変異を含有するアンチセンス転写物が発現し、蓄積することもまた初めて示された。加えて、センスおよびアンチセンス凝集が血中に蓄積し、容易にアクセスできる組織においてC9ORF72 ALS/FTDの潜在的バイオマーカーを提供することが示された。
アンチセンスG2C4伸長がRAN翻訳を受けるかどうかを試験するため、40または70リピートのG2C4伸長およびすべてのリーディングフレームにおけるタンパク質発現[たとえば、3つのフレームにおいて翻訳されたG2C4EXP転写物は、Gly−Pro(GP)、Pro−Ala(PA)およびPro−Arg(PR)RANタンパク質をもたらす]をモニタリングするための3つの異なるC末端エピトープ8タグの上流に6X STOPコドンカセット(各フレームに2つの停止)を挿入することにより、ATG開始コドンを欠いている、三重タグ化G2C4ミニ遺伝子、(G2C4)EXP−3Tを生成した(図13A)。免疫ブロッティングは、2つのエピトープタグ化RANタンパク質、PR−MycおよびGP−Flagを検出したが、PAHAは検出しなかった(図13B)。(PR)40−および(PR)70−3xMycタンパク質は、それぞれ、およそ20および27kDaの予測サイズで移動した。対照的に、(GP)40−および(GP)70−3xFlagタンパク質は、予測サイズ(10〜15kDa)よりも実質的に高く、それぞれ、50および75kDaで移動した(図13B)。このブロット上のかすかな低い分子量バンドは、細菌培養中に見られるリピート収縮または翻訳開始位置の差異により生じうる。免疫蛍光(IF)は、アンチセンスRANタンパク質が、すべての3つのリーディングフレームにおいて発現することを示した(図13C)。ウエスタンブロッティングでは検出されなかったIFによるPA−HAの検出は、これらコンストラクトからRAN PA−HAを発現する細胞のより低い頻度により引き起こされうる。加えて、組換えGP−flagおよびPA−HAタンパク質は、細胞質に局在していた一方で、PR−Mycタンパク質は、核および細胞質の両方に分布していた。これらの局在の差異は、このエピトープタグ化コンストラクトにおいて見出されるリピートモチーフまたはC末端フランキング配列の異なる特性により生じうる。一連の追加実験においてまた、30、60および120リピートを含有するセンスG4C2伸長コンストラクトが、GP−Flag、GR−HAおよびGA−Myc RANタンパク質を発現させることが示された(図20)。要約すると、これらのデータは、組換えG2C4およびG4C2伸長転写物が、6つのすべてのリーディングフレームにおいてRANタンパク質を発現させることを示した。
アミノ酸リピートが様々な異なるタンパク質に見出されうるので、二重免疫学的方略を使用し、本明細書に記載の予測されるリピートモチーフまたはそれらに対応する固有のC末端領域を認識する抗体を開発した。8つの推定C9ORF72 RANタンパク質を示す概略図を、図13Dおよび図21に示す。予測されるタンパク質には、6つの推定RANタンパク質および追加のATG開始N末端を有する2つの推定タンパク質が含まれる。固有のC末端領域は、6つの予測されるリーディングフレームのうちの5つにおいて予測される。インビボでのこれらのタンパク質の蓄積について試験するため、予測されるリピートモチーフまたは利用可能な対応するC末端領域に対する一連のポリクローナル抗体を開発した(図13D、図21)。推定アンチセンスタンパク質[ウサギα−PA、α−PA−CT、α−PR、α−PR−CT、α−GP、α−GP−CT(センス)、およびマウスα−GP]について試験する抗体を生成し、それらの特異性が、ウエスタンブロットおよびIF検出により、エピトープタグ化組換えタンパク質を発現するコンストラクトをトランスフェクトした細胞内で実証された(図13E、図22)。センス方向に発現するリピートおよびC末端領域を検出する追加の抗体を、図23に特徴付ける。
複数のアプローチを、新規アンチセンス(AS)タンパク質がC9ORF72伸長陽性生検組織において発現するかどうかを決定するために使用した。凝集タンパク質がヒト脳から単離することが困難であるという障害を克服するため、冷凍C9(+)およびC9(−)ALS前頭皮質剖検試料上で連続的タンパク質抽出プロトコル(sequential protein extraction protocol)(23)を使用した。アンチセンスPAおよびPRタンパク質を、1%Triton−X100不溶性物質、2%SDS可溶性抽出物、免疫ドットブロット上のα−PA、α−PA−CT、α−PR、α−PR−CTで、C9(+)ALS患者のサブセットから検出したが、C9(−)ALS患者からは検出しなかった(図14A)。C9(+)ALS/FTD前頭皮質におけるセンスRANタンパク質(GP、GR、GA)10蓄積についての証拠を示す追加の免疫ドットブロットを図24に示す。α−PA、α−PRおよびα−GP抗体もまた、8%SDSを含有する試料緩衝液におけるペレットの再懸濁後に、C9(+)ALS前頭皮質試料からの2%SDS不溶性画分における高分子量スミアを検出した(23)(図3B)。1つまたは複数のバンドとして移動する組換えタンパク質について移動パターンの差異が見られ(図13B)、患者組織抽出物において観察されたスミア(図14B)は、患者試料および高度に不溶性の凝集体からのそれらの抽出物における、はるかに長いリピート領域によるRANタンパク質における差異を反映する。免疫組織化学(IHC)が、次に、タンパク凝集体が、リピートモチーフに対する抗体(α−PA、α−PR、α−GP)を、PAおよびPRリピート領域を越える予測されるC末端配列に対する抗体(α−PA−CTおよびα−PR−CT)とともに使用して、C9(+)ALS/FTD剖検組織からの海馬神経細胞の周核体において検出可能であるが、C9(−)ALS患者または対照対象において検出可能でないことを示すために使用された(図14C、図25)。GPリピートモチーフに対する抗体を使用する以前の研究は、センス鎖から発現すると仮定される凝集体を検出した(10、11)。GPリピート含有タンパク質が、センスおよびアンチセンス転写物の両方から発現すると予測されることが注目される(図13D)。センス方向に、予測されるRAN GPタンパク質は、固有のC末端(CT)配列を含有する。対照的に、アンチセンスGPタンパク質は、リピートの直後に停止コドンを有する。センスGP RANタンパク質をアンチセンスGPタンパク質と識別するため、ウサギα−GP−CTをセンスGPタンパク質のCT領域を検出するために、マウスα−GPをセンスおよびアンチセンスGP伸長タンパク質の両方を検出するために使用して、C9(+)ヒト海馬剖検切片上で二重標識IF実験を実施した。二重標識化は、2つのタイプの封入体を示した。すなわち、a)マウスα−GPおよびウサギα−GP−CTセンスで二重標識化された推定センス封入体ならびに、b)マウスα−GPで単一標識化された推定アンチセンス封入体(図14D)。およそ18%の封入体が、二重標識化でセンスパターンを示し、82% 11の封入体が、アンチセンスパターンを示し、α−GPについて陽性、α−GP−CTセンスについて陰性であった(図14E、F)。これらのデータは、リピートおよびC末端抗体の両方を有するタンパク質凝集体を特徴付けることの重要性を示した。まとめると、これらの結果は、不溶性、凝集体形成アンチセンスRANタンパク質が、3つのすべてのアンチセンスリーディングフレームから発現することを示す。
RAN翻訳により発現するアンチセンスGPおよびPR RANタンパク質に加えて、2つのアンチセンスリーディングフレームが、ATG開始GPおよびPRタンパク質(M−GPASおよびM−PRAS)の両方をもたらしうる上流ATG開始コドンを有する(図13D、図21)。ATG開始コドンの存在が、RAN翻訳が3つすべてのリーディングフレームにおいて生じることを阻害しないことが示された(9)。したがって、アンチセンスGPおよびPRタンパク質は、AUG開始および/またはRAN翻訳の両方により発現してもよい。ATG開始コドンがG2C4伸長に関してRANタンパク質発現に対して有する効果を探究するため、ATG開始コドンをG2C4リピートの前に置くことにより、追加のミニ遺伝子コンストラクトを生成した(図14G)。PRフレームを、解析のために選択した。なぜなら、ATG開始コドンはこのリーティングフレームにおいて天然で生じるからである。ウエスタンブロッティングは、(+)ATG−PR−3TをトランスフェクトしたHEK293T細胞が、(−)ATG−PR−3Tトランスフェクト細胞と比較して、実質的により高いレベルのPRタンパク質を発現することを示す(図14H)。対照的に、qRT−PCRおよびウエスタンブロッティングは、転写物レベル(図26A)およびRAN翻訳GPのレベル(図14H)が同等であることを示した。図13と同様に、RAN翻訳PAは、ウエスタンブロッティングにより検出可能ではなかった。次に、細胞生存率に対するこれらコンストラクトの効果を、相補性アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)検出およびメチルチアゾールテトラゾリウム(MTT)を使用して試験した。LDHアッセイについては、(−)ATG−PR−3Tまたは(+)ATG−PR−3Tコンストラクトをトランスフェクトした細胞は、ベクター対照細胞と比較して、それぞれ1.9および2.9倍の細胞死の増加を示した(p=0.008および0.001)。加えて、上昇したレベルのPRタンパク質を発現する(+)ATG−PR−3Tトランスフェクト細胞は、(−)ATG−PR−3Tコンストラクトをトランスフェクトした細胞と比較して1.5倍の細胞12死の増加を示した(p=0.034)。MTTアッセイは、同様の結果を示した。(−)ATG−PR−3Tおよび+ATG−PR−3Tコンストラクトをトランスフェクトした細胞は、代謝的に活性な細胞の数の劇的な減少を示し、未処置細胞または空ベクター対照と比較してそれぞれ33%(p<0.00001)および43%(p<0.00001)であった(図14J)。加えて、(+)ATG−PR−3Tをトランスフェクトした細胞内の上昇したPR発現は、(−)ATG−PR−3T細胞と比較して有意に低いレベルの代謝活性を有していた(p<0.05)。光学顕微鏡細胞分離により、対照細胞と比較して−ATG−PR−3Tにおける細胞形態の変化が明白であり、これらの表現型は、上昇したレベルのPRを発現する(+)ATG−PR−3T細胞において悪化した(図26B〜D)。まとめると、これらのデータは、以下のことを実証した。すなわち、1)G2C4伸長突然変異は、細胞に対して毒性を有し、この毒性は、DNA、G2C4RNAおよび/またはRAN翻訳PR、GPまたはPAタンパク質の効果により引き起こされうる、2)(+)ATG−PR−3Tコンストラクトをトランスフェクトした細胞内で発現する増加したPRタンパク質は、DNA、G2C4RNAおよびRANタンパク質効果により引き起こされるレベルを超えて細胞毒性および細胞死を増加させる。したがって、PRタンパク質は、本質的に細胞に対して毒性を有することが示された。
センスおよびアンチセンスRNA鎖の両方からの6つのすべてのRANタンパク質が、C9(+)ALS患者において発現するかどうかを決定するため、これらタンパク質のリピート伸長および/またはC末端配列に対する9つのポリクローナル抗体を使用して、パラフィン埋込み脳組織の切片上でIHC染色を実施した。C9(+)症例において、豊富な球状および不規則的形状の神経細胞細胞質封入体(NCI)が海馬に存在し、その大多数が歯状回およびCA領域の錐体細胞内に存在した。これらRAN封入体はまた、C9(+)運動皮質において検出された(図15)。α−GPを使用して、海馬において、運動皮質においてと同様に、GP陽性封入体がすべての検査されたC9(+)症例において検出されたが、C9(−)症例または正常対照切片においては検出されなかった。13海馬のCA領域および運動皮質において、凝集体のクラスターが、C9(+)症例において、>20%の神経細胞において凝集体を伴って、頻繁に見出された(図27)。より少ない凝集体が、α−GP−CTセンス抗体を使用して検出され、これは、ほとんどのGP凝集体がC9ORF72アンチセンス鎖から翻訳されたことを示した二重標識化実験と一致している(図14D〜F)。PA封入体が、6つのC9(+)症例のうち4つにおける海馬および2つの運動皮質試料のうち1つに検出された(図27)。C9(+)症例において、PA封入体の頻度は、GP封入体と比較して、海馬および運動皮質において有意に低かったが、>50%の神経細胞に見出される極度に大きなPA封入体を伴う高強度領域染色(high−intensity regional staining)が、1人の患者に見出された(図27)。PR陽性封入体がまた、検査されたすべてのC9(+)症例における海馬および試験された2つのC9(+)症例のうちの1つにおける運動皮質に見出された。PA染色と同様に、PR封入体は、頻度は低いが、強度の高い領域染色が時折観察された。センス方向に、GR陽性封入体が、検査されたすべてのC9(+)症例において、海馬および運動皮質に見出されたが、GP凝集体よりも頻度は低いようであった。GA封入体は、IHCにより小さな核周囲封入体として海馬および運動皮質において時折検出されたのみであった(図15、図27)。様々なタイプの凝集体の頻度の見かけ上の差異は、タンパク質コンフォメーションおよびエピトープ利用可能性の差異または異なるエピトープに対し設計されたこれら抗体の親和性の差異により生じうる。まとめると、このデータは、6つのすべてのRANタンパク質がC9(+)剖検脳内に凝集体を形成することを示した。
ALSの中心的な特徴は、運動皮質における上位運動神経細胞および脳幹および脊髄における下位運動神経細胞の漸進的な縮退および死である。上位および下位運動神経細胞にRANタンパク質が蓄積するかどうかを試験するため、センスおよびアンチセンスの両方の方向の予測されるタンパク質に対する9つのすべての抗体を使用してIHCを実施した。C9(+)症例において、豊富なGP陽性神経細胞細胞質封入体が、運動皮質のすべての層において見られ、第III層の錐体神経細胞および第V層全体において頻度の高いGP凝集体を伴っていた(図16A)。細胞死および萎縮が第V層の運動神経細胞の同定を困難にするとはいえ、残りの上位運動神経細胞におけるGP封入体が見出された(図16B)。加えて、PA、PR、GRおよびGA陽性封入体もまた、運動皮質に見出された(図15、図27)。脊髄切片において実施された同様の一連の実験を使用して、検査された3つすべての症例におけるGP凝集体および3人のC9(+)患者のうち2人における下位運動神経細胞の凝集体が検出されたが、C9(−)ALS症例または正常対照においては検出されなかった(図16C)。これが、運動神経細胞内のRANタンパク質蓄積の最初の報告である。上位および下位運動神経細胞の両方におけるGP凝集体の発見は、C9 RANタンパク質蓄積を、ALSにおいて選択的に脆弱な神経細胞と結び付ける。
センスおよびアンチセンスタンパク質の両方が、C9ORF72剖検脳の神経細胞内に蓄積した。一般に2つのタイプの凝集パターンが観察された。すなわち、1)単離細胞質凝集体および2)約10から50%を超える神経細胞が陽性であった高密度クラスター化細胞質凝集体クラスター化凝集体は、GPについて最も頻度が高く検出され、歯状回(DG)および海馬のCA1〜4に見出された(図16D、E)。DGにおけるクラスター化GP凝集体は、CA領域の大きな細胞質凝集体よりも小さく頻度が低かった。追加のクラスター化GP凝集体が、海馬の海馬台および前海馬台において、15運動皮質におけるのと同様に頻繁に見出された。連続切片の免疫染色は、複数のタンパク質が多くの場合同じ領域に見出されることを示した。たとえば、PA、PR、GP、GAおよびGRタンパク質についての強度の高いクラスター化染色は、1人のC9(+)患者からの連続切片において前海馬台の同じ領域に見出された(図16F、Gを参照のこと)。PAについての免疫染色は、いくつかの脳領域が豊富な凝集体を有する一方で、同じ切片の他の領域には相対的に変化がないことを示した。たとえば、図17Aは、1人の患者の単一の切片の海馬領域全体にわたるPA封入体の勾配(前海馬台>海馬台>CA1)を示す。この患者におけるPA封入体は、前海馬台(I)において数が多く(>50%の神経細胞)、(II)海馬台において中程度であり、CA1海馬領域(IIIおよびIV)においてはまれである。この切片に見られる限局的な領域染色と一致して、PA染色は、同じ患者から採取された海馬組織の別個のブロックからの切片においては検出されなかった。これらのデータは、PA RANタンパク質の発現が細胞によって可変的であること、または、パーキンソン病のモデルマウスにおいて提案されてきたように、1つの細胞内のPAの凝集が隣接する細胞内の凝集をトリガーすることを示す(24)。次に、このC9(+)症例からの連続切片を、リピートモチーフ(α−PA、α−PR、α−GP、α−GR)および対応するC末端領域(α−PA−CT、α−PR−CT、α−GP−CT、α−GR−CT、α−GA−CT)の両方に対する抗体が、前海馬台の同じ濃い染色領域(領域I)において凝集体を検出することを示すために使用した(図17B)。これらの結果は、センスおよびアンチセンスRANタンパク質凝集体の両方が、この領域に蓄積することを示した。リピートモチーフまたは特異的C末端領域のいずれかを認識する抗体を使用した同様の凝集体の検出は、これらの抗体が、G2C4およびG4C2伸長転写物の両方にわたって発現するタンパク質を認識していることを確認し、C9ORF72 ALS/FTDにおけるRAN翻訳の生物学的影響を理解するための新規ツールを提供する。
C9ORF72におけるイントロンマイクロサテライト伸長突然変異が、一般的な形態の家族性および散発性ALS/FTDの両方を引き起こすことの発見については、かなりの興奮があった(1、2)。この疾患について検討されている3つの主要な病理学的機構には、ハプロ不全(1、2)、RNA機能獲得(5〜8)、およびRAN翻訳(9、11〜13)が含まれる。これまでのところ、この疾患の分子機構を理解しようとする努力は、センス方向のC9ORF72伸長突然変異の結果の理解にのみ焦点を当ててきた。本明細書において報告された結果は、C9ORF72伸長突然変異がまた、アンチセンス方向に発現することを示し、アンチセンスRNA凝集およびアンチセンスRANタンパク質がC9ORF72 ALS/FTDに寄与することを示す。本発明者らは、以下のことを初めて示す。すなわち、1)アンチセンスC9ORF72はC9(+)剖検組織において上昇するが、センス転写物は上昇しない、2)アンチセンスG2C4伸長転写物は、C9+脳内および血中に蓄積するRNA凝集を形成する、3)RAN翻訳が、細胞培養においてアンチセンスG2G4伸長コンストラクト全体にわたり生じる、4)センスおよびアンチセンスRANタンパク質は、リピートおよびC末端抗体の両方に二重免疫学的アプローチを使用して、C9(+)剖検脳内に蓄積する、5)RANタンパク質凝集体は、上位および下位運動神経細胞に蓄積し、RAN翻訳をALSの重要な病理学的特徴に直接結び付ける。G4C2RNA凝集がC9ORF72 ALS/FTD患者組織において蓄積するという初期の報告(1、2)以来、主たる仮説は、G4C2センス転写物が、DM1、DM2およびSCA8におけるMBNLタンパク質の隔離と同様に、RNA結合タンパク質を隔離して調節不全にするというものである(4)。複数のグループが、G4C2結合タンパク質をすでに報告しており、疾患におけるそれらの潜在的役割を試験している(5〜8)。アンチセンスG2C4凝集がまた患者細胞内に蓄積するという発見は、G2C4アンチセンスRNAおよび結合タンパク質が、役割を果たしうることを示す。加えて、C9(+)末梢血におけるセンスおよびアンチセンス凝集の発見は、容易にアクセス可能なC9ORF72 ALS/FTDのバイオマーカーとして有用となりうる。センスおよびアンチセンス転写物の両方をモニタリングするバイオマーカーが、特に重要でありうる。なぜなら、一方の鎖の発現を減少させる処置法は、他方の鎖の発現を減少させうるからである。二重免疫学的アプローチを使用して、G2C4アンチセンス転写物が、RAN翻訳によりおよび/または2つの短いORF(Met−AS−PRおよびMet−AS−GP)から新規アンチセンスタンパク質(PA、PR、GP)を発現させることが示された。
cDNAコンストラクト。上流6×Stopコドンを含有するCCCGGGGCC(GGGGCC)2GGGGCCC(配列番号64)およびCCCGGGGCC(GGGGCC)28GGGGCCC(配列番号65)断片が、合成され、Integrated DNA TechnologiesによるpIDTSmartベクターへとクローニングされた。6×Stops−(GGGGCC)4−3Tおよび6×Stops−(GGGGCC)30−3Tコンストラクトが、NheI/XhoI断片を、三重エピトープを含有するpcDNA3.1ベクターへとサブクローニングすることにより生成された。GGGGCCリピートのサイズを伸長させるため、SmaI/XhoI断片を、pcDNA−6×Stops−(GGGGCC)EXP−3TのT4 DNAポリメラーゼ/XhoIで平滑末端化したPspOMIへとサブクローニングした。pcDNA−6×Stop−3Tコンストラクト内のGGGGCCリピートの配向を逆転させるため、SmalI/ClaI断片をpBluescript SK+へとサブクローニングし、pBluescript−(GGGGCC)EXPを生成した。AfeI/XhoI断片pBluescript−(GGGGCC)EXPを、pcDNA−6×Stop−3Tへとサブクローニングし、pcDNA−6×Stop−(GGCCCC)EXP−3Tコンストラクトを製造した。
原理:センスおよびアンチセンス転写物を再現するC9ORF72 ALS/FTDモデルマウスは、この疾患のモデリングのために決定的に重要である。BACクローンを、約800G4C2リピートを含有するヒト患者から単離した。これらのBACクローンは、8つの樹立系統を生成するために使用した。これらのマウスはたとえば、以下の問いに答えるために有用である。すなわち、RANタンパク質発現およびRNA機能獲得の両方がC9ORF72 ALS/FTDに寄与するのか?センスおよびアンチセンス機構の両方がC9ORF72病原性において重要であるのか?
本明細書に開示の特徴のすべてが、任意の組合せで組み合わせられてもよい。本明細書に開示の各特徴は、同じ、等価な、または類似の目的に資する代替的特徴により置き換えられてもよい。したがって、そうでないことが明示的に述べられない限り、開示の各特徴は包括的な一連の等価なまたは類似の特徴の一例にすぎない。
Claims (24)
- 対象から得られる血液試料中の、ポリ(Gly−Ala)、ポリ(Gly−Pro)、ポリ(Gly−Arg)、ポリ(Pro−Ala)、ポリ(Pro−Arg)、Met...ポリ(Pro−Arg)またはMet...ポリ(Gly−Pro)タンパク質から選択される1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを決定することを含み、対照レベルと比較して上昇した1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルが、対象がALSを有するかまたはALSを発症する可能性が高いことを示す、
対象を、ALSを有するかまたはALSを発症する可能性が高いものとして同定するための方法。 - 1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルが、アッセイを実施することにより決定される、請求項1に記載の方法。
- アッセイが、免疫ベースアッセイを含む、請求項2に記載の方法。
- 免疫ベースアッセイが、表1、2、または3に記載の配列を含む抗原に特異的な単離抗体を含む、請求項3に記載の方法。
- 免疫ベースアッセイが、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のC末端に特異的な単離抗体を含む、請求項3または4に記載の方法。
- ジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルが対照レベルと比較して上昇した場合に、対象を、ALSを有するかまたはALSを発症する可能性が高いものとして同定すること、
をさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。 - ALSを有するかまたはALSを発症する可能性が高い対象を処置すること、
をさらに含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。 - 処置することが、対象に、リルゾール、バクロフェン、ジアゼパム、フェニトイン、トリヘキシフェニジルまたはアミトリプチリンのうちの1つまたは複数を有効量投与することを含む、請求項7に記載の方法。
- 処置することが、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植から選択される処置を実施することを含む、請求項7に記載の方法。
- 1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質が、ポリ(Pro−Ala)、ポリ(Pro−Arg)、Met...ポリ(Pro−Arg)またはMet...ポリ(Gly−Pro)タンパク質から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質が、2つ以上のジアミノ酸リピート含有タンパク質である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 対象の血中のポリ(Gly−Ala)、ポリ(Gly−Pro)、ポリ(Gly−Arg)、ポリ(Pro−Ala)、ポリ(Pro−Arg)、Met...ポリ(Pro−Arg)またはMet...ポリ(Gly−Pro)タンパク質から選択される1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させることまたはその増加を予防すること
を含む、ALSを有する対象を処置するための方法。 - 1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させることまたはその増加を予防することが、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質を対象の血液から除去することを含む、請求項12に記載の方法。
- 対象の血液からの1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質が、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植から選択される処置を使用して除去される、請求項13に記載の方法。
- 骨髄移植が、同種骨髄移植である、請求項14に記載の方法。
- ポリ(Gly−Ala)、ポリ(Gly−Pro)、ポリ(Gly−Arg)、ポリ(Pro−Ala)、ポリ(Pro−Arg)、Met...ポリ(Pro−Arg)またはMet...ポリ(Gly−Pro)タンパク質から選択される1つまたは複数のジアミノ酸リピートタンパク質に特異的な単離抗体。
- ジアミノ酸リピートタンパク質が、ポリ(Pro−Ala)、ポリ(Pro−Arg)、Met...ポリ(Pro−Arg)またはMet...ポリ(Gly−Pro)タンパク質から選択される、請求項16に記載の単離抗体。
- 単離抗体が、表1、2、または3に記載の配列の配列または断片を含む抗原に特異的である、請求項16または17に記載の単離抗体。
- 対象から得られる試料中の、5’−GGGGCC−3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAおよび/または5’−GGCCCC−3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルを決定することを含み、対照レベルと比較して上昇した5’−GGGGCC−3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAおよび/または5’−GGCCCC−3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルは、対象がALSを有するかまたはALSを発症する可能性が高いことを示す、
対象を、ALSを有するかまたはALSを発症する可能性が高いものとして同定するための方法。 - 5’−GGGGCC−3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAおよび/または5’−GGCCCC−3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルが対照レベルと比較して上昇した場合に、対象を、ALSを有するかまたはALSを発症する可能性が高いものとして同定すること、
をさらに含む、請求項19に記載の方法。 - ALSを有するかまたはALSを発症する可能性が高い対象を処置すること、
をさらに含む、請求項19または20に記載の方法。 - 処置することが、対象に、リルゾール、バクロフェン、ジアゼパム、フェニトイン、トリヘキシフェニジルまたはアミトリプチリンのうちの1つまたは複数を有効量投与することを含む、請求項21に記載の方法。
- 処置することが、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植から選択される処置を実施することを含む、請求項21に記載の方法。
- 5’−GGGGCC−3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAおよび/または5’−GGCCCC−3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルが、5’−GGCCCC−3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルである、
請求項19から23のいずれか一項に記載の方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2021125018A JP2021192036A (ja) | 2013-03-14 | 2021-07-30 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
JP2023183882A JP2024012385A (ja) | 2013-03-14 | 2023-10-26 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361786258P | 2013-03-14 | 2013-03-14 | |
US61/786,258 | 2013-03-14 | ||
US201361883219P | 2013-09-27 | 2013-09-27 | |
US61/883,219 | 2013-09-27 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016501032A Division JP6628285B2 (ja) | 2013-03-14 | 2014-03-10 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021125018A Division JP2021192036A (ja) | 2013-03-14 | 2021-07-30 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020055827A true JP2020055827A (ja) | 2020-04-09 |
Family
ID=51625132
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016501032A Active JP6628285B2 (ja) | 2013-03-14 | 2014-03-10 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
JP2019214553A Withdrawn JP2020055827A (ja) | 2013-03-14 | 2019-11-27 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
JP2021125018A Pending JP2021192036A (ja) | 2013-03-14 | 2021-07-30 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
JP2023183882A Pending JP2024012385A (ja) | 2013-03-14 | 2023-10-26 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016501032A Active JP6628285B2 (ja) | 2013-03-14 | 2014-03-10 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021125018A Pending JP2021192036A (ja) | 2013-03-14 | 2021-07-30 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
JP2023183882A Pending JP2024012385A (ja) | 2013-03-14 | 2023-10-26 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US10295547B2 (ja) |
EP (1) | EP2970884A4 (ja) |
JP (4) | JP6628285B2 (ja) |
AU (3) | AU2014241078B2 (ja) |
CA (1) | CA2904960A1 (ja) |
HK (1) | HK1220227A1 (ja) |
WO (1) | WO2014159247A1 (ja) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2904960A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-10-02 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Di-amino acid repeat-containing proteins associated with als |
US11162096B2 (en) | 2013-10-14 | 2021-11-02 | Ionis Pharmaceuticals, Inc | Methods for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript |
AU2015326911B2 (en) | 2014-09-30 | 2021-07-08 | Neurimmune Holding Ag | Human-derived anti-dipeptide repeats (DPRs) antibody |
US10793855B2 (en) | 2015-01-06 | 2020-10-06 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript |
ES2535579B1 (es) * | 2015-01-21 | 2016-02-17 | Grifols Worldwide Operations Limited | Composición que comprende albúmina para su utilización en el tratamiento de Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) mediante recambio plasmático |
US10407678B2 (en) | 2015-04-16 | 2019-09-10 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript |
WO2016196324A1 (en) | 2015-05-29 | 2016-12-08 | University Of Floridia Research Foundation, Inc. | Methods for diagnosing huntington's disease |
JP2019515894A (ja) * | 2016-04-04 | 2019-06-13 | ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファンデーション インコーポレーティッド | 反復関連非atg(ran)翻訳を調節するためのeif3の操作 |
WO2018064600A1 (en) * | 2016-09-30 | 2018-04-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a hexanucleotide repeat expansion in a c9orf72 locus |
US11382832B2 (en) | 2017-01-18 | 2022-07-12 | Novartis Ag | Dip tube |
AU2018255293B2 (en) | 2017-04-17 | 2024-03-07 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Regulation of RAN translation by PKR and eIF2a-P pathways |
US20200232925A1 (en) * | 2017-09-25 | 2020-07-23 | University of Florida Research Foundation,Incorporation | Immunoassays for detection of ran proteins |
WO2019067587A1 (en) | 2017-09-26 | 2019-04-04 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | USE OF METFORMIN AND ANALOGUES THEREOF TO REDUCE RAN PROTEIN RATES DURING TREATMENT OF NEUROLOGICAL DISORDERS |
EP3826650A4 (en) * | 2018-07-23 | 2022-07-27 | Enclear Therapies, Inc. | METHODS OF TREATMENT OF NEUROLOGICAL DISEASES |
CN113164563A (zh) | 2018-07-23 | 2021-07-23 | 因柯利尔疗法公司 | 神经性病症的治疗方法 |
JP2022526671A (ja) | 2019-04-11 | 2022-05-25 | エンクリアー セラピーズ, インク. | 脳脊髄液の改善の方法ならびにそのためのデバイスおよびシステム |
WO2020221937A1 (en) * | 2019-05-02 | 2020-11-05 | Deutsches Zentrum Für Neurodegenerative Erkrankungen E.V. (Dzne) | Immunogen for preventing or treating familial frontotemporal dementia (ftd) and/or amyotrophic lateral sclerosis (als) |
EP3994159A4 (en) * | 2019-07-05 | 2023-08-09 | University of Florida Research Foundation, Incorporated | METHODS OF TREATING NEUROLOGICAL DISEASES ASSOCIATED WITH THE RAN PROTEIN |
EP3906938A1 (en) * | 2020-05-07 | 2021-11-10 | Grifols Worldwide Operations Limited | Composition comprising albumin for use in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als) by plasma exchange |
WO2021231887A1 (en) * | 2020-05-15 | 2021-11-18 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Compositions and methods of detection of pre-symptomatic als |
TW202308681A (zh) * | 2021-08-27 | 2023-03-01 | 中央研究院 | 用以治療神經退化性疾病的方法 |
Family Cites Families (36)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5011912A (en) * | 1986-12-19 | 1991-04-30 | Immunex Corporation | Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system |
CZ321497A3 (cs) * | 1995-04-11 | 1998-06-17 | Merck And Co., Inc. | Způsob vhodný pro produkci látek, jejichž základ tvoří dipeptid |
EP1000084A4 (en) * | 1997-07-08 | 2003-03-26 | Human Genome Sciences Inc | 123 PROTEIN SEPARATED BY HUMAN |
US6362007B1 (en) * | 1997-08-29 | 2002-03-26 | Innogenetics N.V. | Methylated, SMD homologous peptides, reactive with the antibodies from sera of living beings affected with systemic lupus erythematosus |
US6436703B1 (en) * | 2000-03-31 | 2002-08-20 | Hyseq, Inc. | Nucleic acids and polypeptides |
WO2001081581A2 (en) * | 2000-04-21 | 2001-11-01 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of acne vulgaris |
EP1385861A2 (en) * | 2000-10-25 | 2004-02-04 | Diadexus, Inc. | Compositions and methods relating to lung specific genes and proteins |
WO2002040672A2 (en) * | 2000-11-20 | 2002-05-23 | Diadexus, Inc. | Compositions and methods relating to breast specific genes and proteins |
US7528227B2 (en) | 2004-03-23 | 2009-05-05 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Histone H2A peptide derivatives and uses thereof |
US7163943B2 (en) | 2001-09-21 | 2007-01-16 | Reddy Us Therapeutics, Inc. | Methods and compositions of novel triazine compounds |
US7314974B2 (en) * | 2002-02-21 | 2008-01-01 | Monsanto Technology, Llc | Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties |
ES2648241T3 (es) | 2003-09-30 | 2017-12-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Clados de virus adenoasociados (AAV), secuencias, vectores que contienen el mismo, y usos de los mismos |
CA2552508A1 (en) * | 2003-12-31 | 2005-09-29 | Pharmexa Inc. | Inducing cellular immune responses to human papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions |
US7481997B1 (en) | 2004-02-12 | 2009-01-27 | Montana State University | Snow mountain virus genome sequence, virus-like particles and methods of use |
JP4878551B2 (ja) | 2004-04-08 | 2012-02-15 | 貞和 相磯 | 運動ニューロン疾患治療薬 |
EP1844148A2 (en) | 2005-01-31 | 2007-10-17 | University of Iowa Research Foundation | Nucleic acid silencing of huntington's disease gene |
DK2082225T3 (da) | 2006-09-20 | 2014-04-07 | Univ Belfast | Fremgangsmåde til bestemmelse af, om en tumorcelle har invasivt og/eller metastatisk potentiale, og midler tilmodulering af malign transformation |
JP5698151B2 (ja) | 2008-12-30 | 2015-04-08 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | エアゾール及びエアゾール接着剤用のアクリル系ブロックコポリマー |
TW201034684A (en) | 2009-02-18 | 2010-10-01 | Genentech Inc | Method for inhibiting neurodegeneration |
CA2757354A1 (en) | 2009-04-02 | 2010-10-07 | Laura P.W. Ranum | Nucleotide repeat expansion-associated polypeptides and uses thereof |
EP2432761A4 (en) | 2009-05-18 | 2012-12-12 | Ottawa Hospital Res Inst | METHOD FOR TREATING MUSCLE DISEASES MARKED BY INSULIN RESISTANCE |
WO2011028912A2 (en) | 2009-09-03 | 2011-03-10 | University Of Tennessee Research Foundation | A biomarker for neurodegeneration in neurological disease |
WO2013030588A1 (en) * | 2011-08-31 | 2013-03-07 | The University Of Manchester | Method for diagnosing a neurodegenerative disease |
JP6490426B2 (ja) | 2012-02-29 | 2019-03-27 | サンガモ セラピューティクス, インコーポレイテッド | ハンチントン病を治療するための方法および組成物 |
WO2014114303A1 (en) | 2013-01-22 | 2014-07-31 | Deutsches Zentrum Für Neurodegenerative Erkrankungen | Dipeptide-repeat proteins as therapeutic target in neurodegenerative diseases with hexanucleotide repeat expansion |
US10066007B2 (en) | 2013-01-22 | 2018-09-04 | Deutsches Zentrum Für Neurodegenerative Erkrankungen E.V. (Dzne) | Dipeptide-repeat proteins as therapeutic target in neurodegenerative diseases with hexanucleotide repeat expansion |
US9448232B2 (en) | 2013-01-24 | 2016-09-20 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Methods and materials for detecting C9ORF72 hexanucleotide repeat expansion positive frontotemporal lobar degeneration or C9ORF72 hexanucleotide repeat expansion positive amyotrophic lateral sclerosis |
CA2904960A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Di-amino acid repeat-containing proteins associated with als |
JP6806562B2 (ja) | 2013-03-15 | 2021-01-06 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | eIF2α経路の調節因子 |
EP2837390A1 (en) | 2013-08-15 | 2015-02-18 | Universitäts-Kinderspital beider Basel | Combined Pharmaceutical Preparation for Use in Treating Neuromuscular Disorders |
WO2016196324A1 (en) | 2015-05-29 | 2016-12-08 | University Of Floridia Research Foundation, Inc. | Methods for diagnosing huntington's disease |
JP2019515894A (ja) | 2016-04-04 | 2019-06-13 | ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファンデーション インコーポレーティッド | 反復関連非atg(ran)翻訳を調節するためのeif3の操作 |
CN109715144A (zh) | 2016-08-18 | 2019-05-03 | 奥维德医疗公司 | 使用双胍类治疗发育障碍的方法 |
AU2018255293B2 (en) | 2017-04-17 | 2024-03-07 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Regulation of RAN translation by PKR and eIF2a-P pathways |
US20200232925A1 (en) | 2017-09-25 | 2020-07-23 | University of Florida Research Foundation,Incorporation | Immunoassays for detection of ran proteins |
WO2019067587A1 (en) | 2017-09-26 | 2019-04-04 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | USE OF METFORMIN AND ANALOGUES THEREOF TO REDUCE RAN PROTEIN RATES DURING TREATMENT OF NEUROLOGICAL DISORDERS |
-
2014
- 2014-03-10 CA CA2904960A patent/CA2904960A1/en active Pending
- 2014-03-10 US US14/775,278 patent/US10295547B2/en active Active
- 2014-03-10 JP JP2016501032A patent/JP6628285B2/ja active Active
- 2014-03-10 EP EP14776090.4A patent/EP2970884A4/en active Pending
- 2014-03-10 AU AU2014241078A patent/AU2014241078B2/en active Active
- 2014-03-10 WO PCT/US2014/022670 patent/WO2014159247A1/en active Application Filing
-
2016
- 2016-07-14 HK HK16108282.2A patent/HK1220227A1/zh unknown
-
2019
- 2019-03-25 US US16/362,908 patent/US10663475B2/en active Active
- 2019-11-27 JP JP2019214553A patent/JP2020055827A/ja not_active Withdrawn
-
2020
- 2020-04-17 US US16/851,690 patent/US11035867B2/en active Active
- 2020-04-30 AU AU2020202852A patent/AU2020202852B2/en active Active
-
2021
- 2021-05-17 US US17/322,604 patent/US20210285970A1/en active Pending
- 2021-07-30 JP JP2021125018A patent/JP2021192036A/ja active Pending
-
2022
- 2022-12-05 AU AU2022283622A patent/AU2022283622A1/en active Pending
-
2023
- 2023-10-26 JP JP2023183882A patent/JP2024012385A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20160025747A1 (en) | 2016-01-28 |
WO2014159247A1 (en) | 2014-10-02 |
JP6628285B2 (ja) | 2020-01-08 |
AU2014241078B2 (en) | 2020-03-12 |
HK1220227A1 (zh) | 2017-04-28 |
EP2970884A4 (en) | 2016-11-02 |
US20190285652A1 (en) | 2019-09-19 |
US20210285970A1 (en) | 2021-09-16 |
AU2014241078A1 (en) | 2015-10-08 |
AU2020202852A1 (en) | 2020-05-21 |
JP2016515208A (ja) | 2016-05-26 |
US11035867B2 (en) | 2021-06-15 |
CA2904960A1 (en) | 2014-10-02 |
US10663475B2 (en) | 2020-05-26 |
US10295547B2 (en) | 2019-05-21 |
AU2022283622A1 (en) | 2023-02-02 |
JP2021192036A (ja) | 2021-12-16 |
AU2020202852B2 (en) | 2022-09-08 |
EP2970884A1 (en) | 2016-01-20 |
US20200341012A1 (en) | 2020-10-29 |
JP2024012385A (ja) | 2024-01-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6628285B2 (ja) | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 | |
Alsema et al. | Profiling microglia from Alzheimer’s disease donors and non-demented elderly in acute human postmortem cortical tissue | |
Lue et al. | TREM 2 Protein Expression Changes Correlate with A lzheimer's Disease Neurodegenerative Pathologies in Post‐Mortem Temporal Cortices | |
EP2057466B1 (en) | Methods and compositions for treatment and diagnosis of autoimmune encephalitis or epilepsy | |
KR20180030965A (ko) | 노화 관련 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물 | |
JP2014518624A (ja) | ニューログラニン診断キットのためのアッセイ試薬 | |
US9957576B2 (en) | Methods for determining responsiveness to an anti-CD47 agent | |
US11740243B2 (en) | Early and non invasive method for assessing a subject's risk of having pancreatic ductal adenocarcinoma and methods of treatment of such disease | |
EP3782647A1 (en) | Antifibrotic agent and biomarker for fibrosis | |
WO2014038622A1 (ja) | 自己免疫疾患のバイオマーカー | |
US20080187917A1 (en) | Compositions and methods for repressing the Ink4a and Arf senescence pathways | |
US20200103397A1 (en) | Compositions and methods for detecting and treating pathological fibroblast cells | |
US11958885B2 (en) | Methods for determining a rapid progression rate of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and restoring phagocytic function of microglia thereof using a NCK-associated protein 1 (NCKAP1) protein or an mRNA thereof | |
KR102597964B1 (ko) | 구개편도선에서 알츠하이머병 유발 인자로서 베타아밀로이드 단백질 검출 및 이의 이용 | |
Rodríguez-Lorenzo et al. | PERIVENTRICULAR CD56BRIGHT NK CELL | |
US20240159759A1 (en) | Early and Non Invasive Method for Assessing a Subject's Risk of Having Pancreatic Ductal Adenocarcinoma and Methods of Treatement of Such Disease | |
WO2021172315A1 (ja) | Lamc2-nr6a1スプライシングバリアント及びその翻訳産物 | |
Zou et al. | Long non‐coding RNA CASC15 enhances learning and memory in mice by promoting synaptic plasticity in hippocampal neurons | |
Mohan | Search for age-dependent transcriptomic and epigenetic changes in murine cerebral endothelial cells | |
WO2017061125A1 (ja) | Card14を用いた治療、診断およびスクリーニング | |
Dwork et al. | Consistent loss of subicular dendritic spines in schizophrenia and mood disorders | |
Carassiti | Role of meningeal inflammation in cortical pathology and disease progression of multiple sclerosis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191127 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191127 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201104 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20210330 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210730 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20210730 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20210803 |