JP2024012385A - Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 - Google Patents
Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024012385A JP2024012385A JP2023183882A JP2023183882A JP2024012385A JP 2024012385 A JP2024012385 A JP 2024012385A JP 2023183882 A JP2023183882 A JP 2023183882A JP 2023183882 A JP2023183882 A JP 2023183882A JP 2024012385 A JP2024012385 A JP 2024012385A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- poly
- pro
- repeat
- proteins
- als
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 325
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 299
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 97
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 63
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 63
- HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N Pro-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims abstract description 50
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 108010087782 poly(glycyl-alanyl) Proteins 0.000 claims abstract description 19
- -1 Poly(Gly-Ala) Polymers 0.000 claims description 172
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 152
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 49
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 44
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 24
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 24
- 238000002616 plasmapheresis Methods 0.000 claims description 23
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 15
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 claims description 11
- FTALBRSUTCGOEG-UHFFFAOYSA-N Riluzole Chemical compound C1=C(OC(F)(F)F)C=C2SC(N)=NC2=C1 FTALBRSUTCGOEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 6
- 229960004181 riluzole Drugs 0.000 claims description 6
- KPYSYYIEGFHWSV-UHFFFAOYSA-N Baclofen Chemical compound OC(=O)CC(CN)C1=CC=C(Cl)C=C1 KPYSYYIEGFHWSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N Phenytoin Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C1(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960000836 amitriptyline Drugs 0.000 claims description 5
- KRMDCWKBEZIMAB-UHFFFAOYSA-N amitriptyline Chemical compound C1CC2=CC=CC=C2C(=CCCN(C)C)C2=CC=CC=C21 KRMDCWKBEZIMAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960000794 baclofen Drugs 0.000 claims description 5
- 229960003529 diazepam Drugs 0.000 claims description 5
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960002036 phenytoin Drugs 0.000 claims description 5
- HWHLPVGTWGOCJO-UHFFFAOYSA-N Trihexyphenidyl Chemical group C1CCCCC1C(C=1C=CC=CC=1)(O)CCN1CCCCC1 HWHLPVGTWGOCJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960001032 trihexyphenidyl Drugs 0.000 claims description 4
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 abstract description 162
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 abstract description 106
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N glyclproline Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 abstract description 61
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 abstract description 56
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 55
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 4
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 abstract description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 168
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 117
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 101
- 108010005597 ran GTP Binding Protein Proteins 0.000 description 53
- 102000005912 ran GTP Binding Protein Human genes 0.000 description 53
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 51
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 50
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 46
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 44
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 42
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 42
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 38
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 37
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 37
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 35
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 35
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 33
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 31
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical group OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 28
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 28
- 210000005153 frontal cortex Anatomy 0.000 description 24
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 23
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 23
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 22
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 21
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 21
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 21
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 20
- 210000000337 motor cortex Anatomy 0.000 description 20
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 19
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 18
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 16
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 16
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 16
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 16
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 15
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 15
- 101100383812 Homo sapiens C9orf72 gene Proteins 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 101000611441 Solanum lycopersicum Pathogenesis-related leaf protein 6 Proteins 0.000 description 13
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 13
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 13
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 12
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 12
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 11
- 210000001947 dentate gyrus Anatomy 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 11
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 10
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 10
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 10
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 9
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 9
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 9
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 9
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 8
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 8
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 7
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 7
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 7
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 6
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 6
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 6
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 6
- 102000043334 C9orf72 Human genes 0.000 description 5
- 108700030955 C9orf72 Proteins 0.000 description 5
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 5
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 5
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 4
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 4
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100022887 GTP-binding nuclear protein Ran Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000774835 Heteractis crispa PI-stichotoxin-Hcr2o Proteins 0.000 description 3
- 101000620756 Homo sapiens GTP-binding nuclear protein Ran Proteins 0.000 description 3
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 3
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 3
- 101100393821 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GSP2 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 3
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 3
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 3
- 238000000339 bright-field microscopy Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 3
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000002314 neuroinflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 2
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 2
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 2
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700020471 RNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 2
- 201000003629 Spinocerebellar ataxia type 8 Diseases 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000013967 frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis 1 Diseases 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 201000009340 myotonic dystrophy type 1 Diseases 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000003058 plasma substitute Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 229940124834 selective serotonin reuptake inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 239000012896 selective serotonin reuptake inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- PHLBKPHSAVXXEF-UHFFFAOYSA-N trazodone Chemical compound ClC1=CC=CC(N2CCN(CCCN3C(N4C=CC=CC4=N3)=O)CC2)=C1 PHLBKPHSAVXXEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 206010002942 Apathy Diseases 0.000 description 1
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 208000032841 Bulimia Diseases 0.000 description 1
- 206010006550 Bulimia nervosa Diseases 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 101150014718 C9orf72 gene Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 206010010947 Coordination abnormal Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000019505 Deglutition disease Diseases 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 206010013142 Disinhibition Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010013887 Dysarthria Diseases 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010008177 Fd immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 208000002339 Frontotemporal Lobar Degeneration Diseases 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical group OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 208000024869 Goodpasture syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000035895 Guillain-Barré syndrome Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000583839 Homo sapiens Muscleblind-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001100327 Homo sapiens RNA-binding protein 45 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 231100000416 LDH assay Toxicity 0.000 description 1
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 1
- 208000002569 Machado-Joseph Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000026072 Motor neurone disease Diseases 0.000 description 1
- 208000008238 Muscle Spasticity Diseases 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 102100030965 Muscleblind-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010052904 Musculoskeletal stiffness Diseases 0.000 description 1
- 101000783419 Naja kaouthia Alpha-cobratoxin Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020003217 Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000043141 Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 208000035955 Proximal myotonic myopathy Diseases 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 238000010357 RNA editing Methods 0.000 description 1
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 description 1
- 102100038823 RNA-binding protein 45 Human genes 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010038687 Respiratory distress Diseases 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000712503 Sicyos pachycarpus Species 0.000 description 1
- 208000036834 Spinocerebellar ataxia type 3 Diseases 0.000 description 1
- 208000037140 Steinert myotonic dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 108700002718 TACI receptor-IgG Fc fragment fusion Proteins 0.000 description 1
- 201000007023 Thrombotic Thrombocytopenic Purpura Diseases 0.000 description 1
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 description 1
- 201000007201 aphasia Diseases 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229950009925 atacicept Drugs 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 description 1
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003270 belimumab Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 238000004159 blood analysis Methods 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000867 compulsive behavior Toxicity 0.000 description 1
- 238000011970 concomitant therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 229950009760 epratuzumab Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 210000001652 frontal lobe Anatomy 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036449 good health Effects 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000001981 hip bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 208000016290 incoordination Diseases 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000002843 lactate dehydrogenase assay Methods 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000009593 lumbar puncture Methods 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012775 microarray technology Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000020763 muscle atrophy Effects 0.000 description 1
- 238000001964 muscle biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000004118 muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000008709 myotonic dystrophy type 2 Diseases 0.000 description 1
- 238000010984 neurological examination Methods 0.000 description 1
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010855 neuropsychological testing Methods 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001584 occupational therapy Methods 0.000 description 1
- 229950005751 ocrelizumab Drugs 0.000 description 1
- 229940016084 oleptro Drugs 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000000554 physical therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012913 prioritisation Methods 0.000 description 1
- JBFULHOJGOVPTK-UHFFFAOYSA-N procainamide 4-hydroxylamine Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=CC=C(NO)C=C1 JBFULHOJGOVPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 208000026526 progressive weakness Diseases 0.000 description 1
- 210000001176 projection neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229940070353 protamines Drugs 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 210000002763 pyramidal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002630 speech therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- YCUVUDODLRLVIC-VPHDGDOJSA-N sudan black b Chemical compound C1=CC(=C23)NC(C)(C)NC2=CC=CC3=C1\N=N\C(C1=CC=CC=C11)=CC=C1\N=N\C1=CC=CC=C1 YCUVUDODLRLVIC-VPHDGDOJSA-N 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003478 temporal lobe Anatomy 0.000 description 1
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 1
- 238000002723 toxicity assay Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 1
- 229960003991 trazodone Drugs 0.000 description 1
- 238000012762 unpaired Student’s t-test Methods 0.000 description 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D21/00—Separation of suspended solid particles from liquids by sedimentation
- B01D21/26—Separation of sediment aided by centrifugal force or centripetal force
- B01D21/262—Separation of sediment aided by centrifugal force or centripetal force by using a centrifuge
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/285—Demyelinating diseases; Multipel sclerosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
Abstract
【課題】筋萎縮性側索硬化症(ALS)または前頭側頭認知症(FTD)を有するかまたは有する可能性が高い対象を同定および/または処置するための方法および組成物を提供する。【解決手段】対象から得られる血液試料中の、ポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Gly-Arg)、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを決定することを含み、対照レベルと比較して上昇した1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルが、対象がALSを有するかまたはALSを発症する可能性が高いことを示す。【選択図】図1
Description
関連出願の相互参照
本願は、米国仮出願第61/786,258号、2013年3月14日出願の出願日の利益および米国仮出願第61/883,219号、2013年9月27日出願の出願日の利益を主張する。これらの参照された出願の両方の内容全体が、本明細書に参照により組み込まれる。
本願は、米国仮出願第61/786,258号、2013年3月14日出願の出願日の利益および米国仮出願第61/883,219号、2013年9月27日出願の出願日の利益を主張する。これらの参照された出願の両方の内容全体が、本明細書に参照により組み込まれる。
連邦支援研究または開発
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により授与されたPO1NS058901およびRO1NS040389の下での政府援助によりなされた。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により授与されたPO1NS058901およびRO1NS040389の下での政府援助によりなされた。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
ヒトC9ORF72遺伝子のイントロン内のGGGGCCヘキサヌクレオチド配列の伸長は、ヒトにおける筋萎縮性側索硬化症および前頭側頭認知症の両方と関連付けられる。筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、急速に進行する衰弱、筋萎縮、筋痙直、発話困難(構音障害)、嚥下困難(嚥下障害)、および呼吸困難(呼吸窮迫)を特徴とする様々な病因を有する消耗性疾患である。症状の順序および速度は人によって異なるとはいえ、最終的にほとんどの対象が、歩行すること、自力でベッドから出ること、または自身の手および腕を使用することができなくなる。ALSを有する対象のほとんどが、通常は症状の発症の3年から5年以内に最終的に呼吸不全により死亡する。リルゾール(リルテック)は、ALSの唯一現在利用可能な処置であり、進行を遅らせ、生存率を限定的な範囲で増加させるのみである。前頭側頭認知症(FTD)もまた破壊的な疾患群であり、脳の前頭葉および側頭葉の萎縮または縮化により生じる。この縮化または萎縮は、深刻な行動変化をもたらす。現在のところ、FTDの処置法は存在せず、FTDの症状を管理する限定的な薬物が存在するだけである。ALSおよび/またはFTDを診断および処置するための新規方法は、ALSおよびFTD対象に大きな利益をもたらすと考えられる。
ヒトC9ORF72遺伝子のイントロン内のGGGGCCヘキサヌクレオチド配列の伸長は、ヒトにおける筋萎縮性側索硬化症および前頭側頭認知症の両方と関連付けられる。本明細書に記載のとおり、C9ORF72遺伝子のイントロン内の伸長GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート配列は、センスおよびアンチセンスの両方の方向にヘキサヌクレオチドリピートを含有するRNA転写物がもたらされるように転写されることが見出された。これらのセンスおよびアンチセンス転写物は、翻訳されてジアミノ酸リピート含有タンパク質をもたらすことが見出された。センス転写物(5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピートを含有する)は、リピート関連非ATG(RAN)翻訳を通じて翻訳され、結果としてポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、およびポリ(Gly-Arg)タンパク質がもたらされることが見出された。アンチセンス転写物(5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピートを含有する)は、リピート関連非ATG(RAN)翻訳を通じて翻訳され、結果としてポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、ポリ(Gly-Pro)タンパク質がもたらされることが見出された。加えて、アンチセンス転写物は、ATG開始翻訳を通じて翻訳され、Met...ポリ(Pro-Arg)およびMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質をもたらすことが見出された。
これらのジアミノ酸リピート含有タンパク質は、ALS対象血液試料中に存在することが見出された。したがって、本開示の態様は、対象から得られる試料(たとえば血液)中のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルの検出方法に関し、この方法は、対象の試料中のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルを測定することを含む。いくつかの態様において、ジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルの検出は、ALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高い対象を同定(または診断)するかまたはその同定を補助(または診断を補助)してもよい。代わりにまたは加えて、たとえば対象の血液試料中のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルの検出は、対象をALSまたはFTDの危険因子、たとえば対象のジアミノ酸リピート含有タンパク質または脳脊髄液中のタンパク質レベルの上昇を有するものとして同定(または診断)するかまたはその同定を補助(または診断を補助)してもよい。本開示の態様はまた、対象の血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルを減少または安定化させることによる、ALSまたはFTDを有する対象の処置に関する。
加えて、アンチセンス転写物(5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピートを含有する)の発現は、対照と比較して、伸長GGGGCCヘキサヌクレオチドリピートを有する対象において大きく上昇することが見出された。C9ORF72遺伝子のイントロン内の伸長GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート配列を有する患者の脳および血液細胞における蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)を使用して、センスおよびアンチセンス転写物の凝集もまた検出可能であった。したがって、本開示の他の態様は、ヘキサヌクレオチドリピート含有転写物の検出方法に関し、この方法は、ヘキサヌクレオチドリピート含有転写物レベルを測定することおよび/またはヘキサヌクレオチドリピート含有転写物凝集の存在もしくは非存在を測定することを含む。いくつかの態様において、ヘキサヌクレオチドリピート含有転写物の検出は、対象をALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高いものとして同定(または診断)するかまたはその同定を補助(または診断を補助)してもよい。代わりにまたは加えて、たとえば対象の血液試料中のヘキサヌクレオチドリピート含有転写物の検出は、対象をALSまたはFTDの危険因子、たとえば対象のジアミノ酸リピート含有タンパク質または脳脊髄液中のタンパク質レベルの上昇を有するものとして同定(または診断)するかまたはその同定を補助(または診断を補助)してもよい。
いくつかの態様において、本開示は、対象をALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高いものとして同定するための方法に関し、この方法は、対象から得られる血液試料中の、ポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Gly-Arg)、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを決定することを含み、対照レベルと比較して上昇した1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルは、対象がALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルは、アッセイを実施することにより決定される。いくつかの実施形態において、アッセイは、免疫ベースアッセイを含む。いくつかの実施形態において、免疫ベースアッセイは、表1、2、または3に記載の配列を含む抗原に特異的な単離抗体を含む。いくつかの実施形態において、免疫ベースアッセイは、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のC末端に特異的な単離抗体を含む。
いくつかの実施形態において、この方法は、ジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルが対照レベルと比較して上昇した場合に、対象をALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高いものとして同定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高い対象を処置することをさらに含む。いくつかの実施形態において、処置することは、対象に、リルゾール、バクロフェン、ジアゼパム、フェニトイン、トリヘキシフェニジルまたはアミトリプチリンのうちの1つまたは複数を有効量投与することを含む。いくつかの実施形態において、処置することは、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植から選択される処置を実施することを含む。
いくつかの実施形態において、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質は、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される。いくつかの実施形態において、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質は、2つ以上のジアミノ酸リピート含有タンパク質である。
本開示の他の態様は、ALSまたはFTDを有する対象を処置するための方法に関し、この方法は、対象の血中のポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Gly-Arg)、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させることまたはその増加を予防することを含む。いくつかの実施形態において、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させることまたはその増加を予防することは、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質を対象の血液から除去することを含む。いくつかの実施形態において、対象の血液からの1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質は、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植から選択される処置を使用して除去される。いくつかの実施形態において、骨髄移植は、同種骨髄移植である。
また別の一態様において、本開示は、ポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Gly-Arg)、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される1つまたは複数のジアミノ酸リピートタンパク質に特異的な単離抗体に関する。いくつかの実施形態において、ジアミノ酸リピートタンパク質は、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される。いくつかの実施形態において、単離抗体は、表1、2、または3に記載の配列の配列または断片を含む抗原に特異的である。
本開示の他の態様は、対象をALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高いものとして同定するための方法に関し、この方法は、対象から得られる血液試料中の、5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAおよび/または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルを決定することを含み、対照レベルと比較して上昇した5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAおよび/または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルは、対象がALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、このレベルは、アッセイを実施することにより決定される。いくつかの実施形態において、アッセイは、核酸ベースアッセイ、たとえばインサイチューハイブリダイゼーション(たとえば、FISH)またはRT-PCR(たとえば、定量RT-PCRまたは鎖特異的定量RT-PCR)を含む。いくつかの実施形態において、この方法は、5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAおよび/または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルが対照レベルと比較して上昇した場合に、対象をALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高いものとして同定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高い対象を処置することをさらに含む。いくつかの実施形態において、処置することは、対象に、リルゾール、バクロフェン、ジアゼパム、フェニトイン、トリヘキシフェニジルまたはアミトリプチリンのうちの1つまたは複数を有効量投与することを含む。いくつかの実施形態において、処置することは、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植から選択される処置を実施することを含む。いくつかの実施形態において、5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAおよび/または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルは、5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルである。
本開示のまた他の態様は、対象をALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高いものとして同定するための方法に関し、この方法は、対象から得られる試料中の、5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有RNAおよび/または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有RNAを含有する凝集の存在または非存在を決定することを含み、5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有RNAおよび/または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有RNAの凝集の存在は、対象がALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、凝集の存在もしくは非存在または上昇したC9ORF72センスもしくはアンチセンスRNAレベルは、アッセイを実施することにより決定される。いくつかの実施形態において、アッセイは、核酸ベースアッセイ、たとえば鎖特異的RT-PCRまたはインサイチューハイブリダイゼーション(たとえば、FISH)を含む。
本開示のまた他の態様は、トランスジェニックマウスに関する。いくつかの実施形態において、トランスジェニックマウスは、ヒトC9ORF72遺伝子および適宜ヒトフランキング配列を含む。いくつかの実施形態において、トランスジェニックマウスは、配列番号63を含む。
これらおよび他の態様は、本明細書により詳細に記載され、非限定的な図面および実施例により例示される。
図面についてまず記載する。
よく確立された翻訳開始規則が、遺伝子発現を理解し、疾患を引き起こす突然変異の結果を予測するための、分子生物学における基礎として使用されてきた。一般に、予測されるコーディングおよび非コーディング領域に位置するマイクロサテライト伸長突然変異(たとえば、CAG、CTG)は、タンパク質機能獲得もしくは喪失またはRNA機能獲得機構により疾患を引き起こすものと考えられてきた。翻訳の標準的規則はCTG・CAGリピート伸長に適用されず、CAGおよびCUG伸長転写物が、AUG開始コドンなしに3つすべてのフレーム内でホモポリマー伸長タンパク質を発現させることが以前に報告されてきた(たとえば、T. Zu et al., Non-ATG-initiated translation directed by microsatellite expansions. PNAS 108, 260 (2011)を参照のこと)。AUG開始コドンから独立したこの翻訳は、リピート関連非ATG(RAN)翻訳と呼ばれる。RAN翻訳は、ヘアピン依存性であり、フレームシフトまたはRNAエディティングなしに生じる。RAN翻訳は、筋強直性ジストロフィー1型、筋強直性ジストロフィー2型、脊髄小脳失調症3型、脊髄小脳失調症8型およびハンチントン病と関連付けられるトリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、およびペンタヌクレオチドリピートから観察されてきた(PCT公開WO/2010/115033を参照のこと、これは本明細書に参照により組み込まれる)。
C9ORF72遺伝子のイントロン内のGGGGCCヘキサヌクレオチドリピートの伸長は、以前から筋萎縮性側索硬化症および前頭側頭認知症の両方と関連付けられてきた。本明細書に記載のとおり、この伸長ヘキサヌクレオチドリピートは、C9ORF72遺伝子座からセンスおよびアンチセンスの両方の方向に発現するRNA転写物内に含有されることが見出されてきた。これらのヘキサヌクレオチドリピート含有転写物はRAN翻訳を受け、結果として、RNAから読まれるヘキサヌクレオチドリピートのフレームに応じて(センス転写物上の5’-GGGGCC-3’、5’-GGGCCG-3’、および5’-GGCCGG-3’、ならびにアンチセンス転写物上の5’-GGCCCC-3’、5’-GCCCCG-3’、および5’-CCCCGG-3’、図1を参照のこと)、ポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Gly-Arg)、ポリ(Pro-Ala)、またはポリ(Pro-Arg)タンパク質がもたらされることが見出された。加えて、アンチセンス転写物は、ATG開始翻訳を通じて翻訳され、Met...ポリ(Pro-Arg)およびMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質をもたらすことが見出された。これらのRANおよびATG開始タンパク質は、本明細書においてジアミノ酸リピート含有タンパク質と呼ばれる。センスおよびアンチセンスヘキサヌクレオチドリピート含有転写物は、本明細書において、5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNA(センス)および5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNA(アンチセンス)と呼ばれる。
本明細書にさらに記載されるとおり、これらのジアミノ酸リピート含有タンパク質は、ALSを有する対象からの血液試料中に存在することが予想外にも見出された。加えて、アンチセンス5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNA転写物の発現は、伸長GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート配列を含有するC9ORF72遺伝子を有する対象において大きく上昇することが見出された。さらに、センスおよびアンチセンスヘキサヌクレオチドリピート伸長含有RNA転写物の両方の凝集が、伸長GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート配列を含有するC9ORF72遺伝子を有する対象に存在することが見出された。理論または機構に束縛されることを望まないが、ALSを有する対象の血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質が時間経過とともに脳実質内に蓄積し、神経炎症性変化、CNS機能障害、および神経細胞死をもたらすと考えられる。したがって、本開示の態様は、対象の血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルおよび/または対象からの試料中のヘキサヌクレオチドリピート含有RNAレベルを決定するための新規アッセイを提供することによる、ALSを有するかまたはALSを発症する可能性が高いものとしての対象の同定に関する。本開示の態様はまた、対象の血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルを減少または安定化させることによる、ALSまたはFTDを有する対象の処置に関する。
ALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高い対象の同定
本開示の態様は、対象からの血液試料中の1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルに基づく、ALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高い対象の同定に関する。いくつかの実施形態において、方法は、対象から得られる血液試料中の、ポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Gly-Arg)、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを決定することを含み、対照レベルと比較して上昇した1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルは、対象がALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルは、アッセイを実施することにより決定される。非限定的なアッセイを本明細書に記載する。
本開示の態様は、対象からの血液試料中の1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルに基づく、ALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高い対象の同定に関する。いくつかの実施形態において、方法は、対象から得られる血液試料中の、ポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Gly-Arg)、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを決定することを含み、対照レベルと比較して上昇した1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルは、対象がALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルは、アッセイを実施することにより決定される。非限定的なアッセイを本明細書に記載する。
本開示の他の態様は、対象からの試料中の5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAおよび/または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルに基づく、ALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高い対象の同定に関する。いくつかの実施形態において、ALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高い対象の同定は、対象からの試料中の5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルに基づく。試料は、たとえば、対象から得られる流体または組織試料であってもよい。いくつかの実施形態において、方法は、対象から得られる血液試料中の、5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAおよび/または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルを決定することを含み、対照レベルと比較して上昇したヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルは、対象がALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルは、アッセイを実施することにより決定される。非限定的なアッセイを本明細書に記載する。
本開示のまた他の態様は、対象から得られる試料中の、5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有RNAおよび/または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有RNAを含有するRNA凝集の存在または非存在に基づく、ALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高い対象の同定に関し、5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有RNAおよび/または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有RNAの凝集の存在は、対象がALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高いことを示す。本明細書において使用される5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有RNAおよび/または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有RNAの凝集は、5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有RNAおよび/または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有RNAの蓄積の面積を指し、これは核酸ベースアッセイ、たとえばFISHを使用して検出可能でありうる。いくつかの実施形態において、凝集は、たとえば、直径0.1から2マイクロメートル、直径0.1から1.5マイクロメートル、または直径0.1から1マイクロメートルであってもよい。いくつかの実施形態において、凝集は、少なくとも直径0.1マイクロメートルであってもよい。試料は2つ以上の凝集を含有していてもよいこと、ならびに、各凝集は異なるサイズであってもよいことが認められるべきである。たとえば、1つの凝集が直径0.2マイクロメートルであってもよく、一方で第2の凝集は直径1マイクロメートルであってもよい。凝集およびかかる凝集を検出する方法の非限定的な例は、実施例3に提供される。
1つもしくは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベル、ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有RNAのレベル、ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有RNAの存在もしくは非存在、またはそれらの任意の組合せに基づいて対象が同定されてもよいことが理解されるべきである。いくつかの実施形態において、この方法は、ジアミノ酸リピート含有タンパク質またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルが対照レベルと比較して上昇した場合に、対象をALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高いものとして同定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有RNAの凝集(focus or foci)が試料中に存在する場合に、対象をALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高いものとして同定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ジアミノ酸リピート含有タンパク質またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルが対照レベルと比較して減少したかまたは同じである場合に、対象をALSもしくはFTDを有しないかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が低いものとして同定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有RNAの凝集が試料中に存在しない場合に、対象をALSもしくはFTDを有しないかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が低いものとして同定することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、対象の1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルまたはアイデンティティが記録されてもよい。いくつかの実施形態において、記録には、対象のレベルまたはアイデンティティをコンピュータ、たとえば診療記録データベースに入力することが含まれる。
本開示の他の態様は、ALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高いものとして同定される対象の処置に関する。本明細書において使用される「処置する」または「処置」は、(a)ALSまたはFTDの発症を予防するかまたは遅延させること、(b)ALSまたはFTDの重症度を減少させること、(c)ALSまたはFTDに特徴的な症状の発症を減少させるかまたは予防すること、(d)ALSまたはFTD症状の悪化を予防すること、および/または(e)以前にALSまたはFTDの症状を示していた対象におけるALSまたはFTD症状の再発を減少させるかまたは予防することを指す。
いくつかの実施形態において、処置は、有効量の既知のALS治療薬、たとえばリルゾール(リルテック、Sanofi-Aventis)を、ALSを有するものとして同定される対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、処置は、有効量の既知のFTD治療薬、たとえばトラゾドン(デジレル、オレプトロ)または選択的セロトニン再取り込み阻害薬(SSRI)を、FTDを有するものとして同定される対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、処置は、ALSまたはFTDを有するものとして同定される対象における1つまたは複数のALSまたはFTDの症状を減少させる有効量の治療薬、たとえばバクロフェン、ジアゼパム、フェニトイン、トリヘキシフェニジルおよび/またはアミトリプチリンを投与することを含む。いくつかの実施形態において、処置は、理学療法、作業療法、または言語療法のうちの1つまたは複数を含む。いくつかの実施形態において、処置は、対象の血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルを減少または安定化させるための本明細書に記載の方法、たとえば骨髄移植またはプラズマフェレーシスを含む。いくつかの実施形態において、処置は、上述の処置の任意の組合せまたは本明細書に記載の任意の他の処置を含む。
有効量とは、医学的に所望される結果、たとえばALSまたはFTDの処置を提供するのに十分な治療薬の用量である。有効量は、処置される対象の年齢および健康状態、対象におけるALSまたはFTDの重症度、処置の持続期間、任意の併用療法の性質、具体的な投与経路等の保健従事者の知識および専門的意見の範囲内の要因とともに変化するであろう。
処置の投与は、当技術分野において知られている任意の方法により達成されてもよい(たとえば、Harrison’s Principle of Internal Medicine, McGraw Hill Inc.を参照のこと)。投与は局所または全身投与であってもよい。投与は、非経口(たとえば、静脈内、皮下、または皮内)または経口投与であってもよい。様々な投与経路のための組成物が、当技術分野においてよく知られている(たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinを参照のこと)。用量は、対象および投与経路次第であろう。用量は、当業者により決定されうる。
本開示の他の態様は、ALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを有すると疑われる対象において処置に対する応答性をモニタリングするための方法に関する。いくつかの実施形態において、この方法は、第1の時点で対象から得られる血液試料中の、ポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Gly-Arg)、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質の第1のレベルを決定すること、ならびに、第2の時点で対象から得られる血液試料中の、ポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Gly-Arg)、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質の第2のレベルを決定することを含み、第1のレベルと比較して上昇したかまたは同じである第2のレベルは、対象が処置に対して無応答性であるかまたは無応答性である可能性が高いことを示し、第1のレベルと比較して減少した第2のレベルは、対象が処置に対して応答性であるかまたは応答性である可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、第1の血液試料は対象の処置前に得られ、第2の血液試料は、対象の処置中または処置後に得られる。この方法はまた、ジアミノ酸タンパク質のレベルに加えてまたはその代わりに、ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルまたはヘキサヌクレオチドリピート伸長含有RNAの凝集の存在もしくは非存在を決定することにより実施されてもよい。
本明細書において使用される「上昇した」は、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルが、対照レベル、たとえば対照試料中の1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAの所定の閾値またはレベルを超えていることを意味する。対照および対照レベルは本明細書に詳細に記載されている。上昇したレベルは、たとえば、対照レベルを1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、400%、500%、またはそれ以上超えるレベルを含む。上昇したレベルはまた、現象をゼロ状態(たとえば、ジアミノ酸リピート含有タンパク質発現またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNA発現が存在しないかまたは検出不能である)から、非ゼロ状態(たとえば、ジアミノ酸リピート含有タンパク質発現またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAがある程度存在するかまたは検出可能である)まで増加させることを含む。
本明細書において使用される「減少した」は、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルが、対照レベル、たとえば対照試料中の1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAの所定の閾値またはレベルを下回ることを意味する。対照および対照レベルは本明細書に詳細に記載されている。減少したレベルは、たとえば、対照レベルを1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、400%、500%、またはそれ以上下回るレベルを含む。減少したレベルはまた、現象を非ゼロ状態(たとえば、ジアミノ酸リピート含有タンパク質発現またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAがある程度存在するかまたは検出可能である)から、ゼロ状態(たとえば、ジアミノ酸リピート含有タンパク質発現またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNA発現が存在しないかまたは検出不能である)まで減少させることを含む。
ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAおよびジアミノ酸リピート含有タンパク質
本明細書に記載のとおり、C9ORF72遺伝子のイントロン内の伸長GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート配列は、センスおよびアンチセンスの両方の方向にヘキサヌクレオチドリピートを含有するRNA転写物がもたらされるように転写されることが見出された。ヒトC9ORF72遺伝子のGenBank Gene IDは203228である。センスおよびアンチセンスヘキサヌクレオチドリピート含有転写物の両方が、AUG開始コドンから独立した翻訳[リピート関連非ATG(RAN)翻訳]を受け、結果として、読まれるヘキサヌクレオチドリピートのフレームに応じて(センス転写物上の5’-GGGGCC-3’、5’-GGGCCG-3’、および5’-GGCCGG-3’、ならびにアンチセンス転写物上の5’-GGCCCC-3’、5’-GCCCCG-3’、および5’-CCCCGG-3’、図1を参照のこと)、ポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Gly-Arg)、ポリ(Pro-Ala)、またはポリ(Pro-Arg)ジアミノ酸リピート含有タンパク質がもたらされることが見出された。加えて、アンチセンスヘキサヌクレオチドリピート含有転写物は、ATG開始翻訳を通じて翻訳され、Met...ポリ(Pro-Arg)およびMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質をもたらすことが見出された。
本明細書に記載のとおり、C9ORF72遺伝子のイントロン内の伸長GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート配列は、センスおよびアンチセンスの両方の方向にヘキサヌクレオチドリピートを含有するRNA転写物がもたらされるように転写されることが見出された。ヒトC9ORF72遺伝子のGenBank Gene IDは203228である。センスおよびアンチセンスヘキサヌクレオチドリピート含有転写物の両方が、AUG開始コドンから独立した翻訳[リピート関連非ATG(RAN)翻訳]を受け、結果として、読まれるヘキサヌクレオチドリピートのフレームに応じて(センス転写物上の5’-GGGGCC-3’、5’-GGGCCG-3’、および5’-GGCCGG-3’、ならびにアンチセンス転写物上の5’-GGCCCC-3’、5’-GCCCCG-3’、および5’-CCCCGG-3’、図1を参照のこと)、ポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Gly-Arg)、ポリ(Pro-Ala)、またはポリ(Pro-Arg)ジアミノ酸リピート含有タンパク質がもたらされることが見出された。加えて、アンチセンスヘキサヌクレオチドリピート含有転写物は、ATG開始翻訳を通じて翻訳され、Met...ポリ(Pro-Arg)およびMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質をもたらすことが見出された。
したがって、本発明の態様は、伸長ヘキサヌクレオチドリピートを含有するセンスおよびアンチセンスRNAならびにそれらの使用に関する。センスRNAは、5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAであり、アンチセンスRNAは、5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAである。
5’-GGGGCC-3’および5’GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAは、それぞれ式(GGGGCC)xまたは(GGCCCC)xのリピート核酸配列を含み、式中、Xは、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも25、もしくは少なくとも30、または10~100,000、10~50,000、10~5,000、20~1,000、20~100,000、20~50,000、20~5,000、20~1,000、25~100,000、25~50,000、25~5,000、もしくは25~1,000から選択される範囲であってもよい。ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAはさらに、追加のNおよび/またはC末端核酸を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、N末端核酸配列は、センス転写物のためのC9ORF72のイントロン内の5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピートの上流の核酸配列またはアンチセンス転写物のためのC9ORF72のイントロン内の5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピートの上流のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、C末端核酸配列は、センス転写物のためのC9ORF72のイントロン内の5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピートの下流のヌクレオチド配列またはアンチセンス転写物のためのC9ORF72のイントロン内の5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピートの下流のヌクレオチド配列を含む。
本発明の他の態様は、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質およびそれらの使用に関する。1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質は、ポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Gly-Arg)、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される。
センス5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAおよびアンチセンス5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAは両方ともポリ(Gly-Pro)タンパク質をコードする。したがって、ポリ(Gly-Pro)タンパク質は、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方から翻訳されたタンパク質を含んでいてもよい。センスおよびアンチセンス翻訳ポリ(Gly-Pro)タンパク質のC末端は、多様でありうることが予測される(表1を参照のこと)。したがって、センスポリ(Gly-Pro)タンパク質は、表1に記載のポリ(Gly-Pro)C末端配列を含んでいてもよい一方で、アンチセンスポリ(Gly-Pro)タンパク質は、追加のC末端配列を有しないリピート領域を含んでいてもよい。本明細書に記載の方法は、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方から翻訳されたポリ(Gly-Pro)タンパク質の使用を含んでいてもよい。本明細書に記載の抗体は、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方から翻訳されたポリ(Gly-Pro)タンパク質に特異的であってもよい。
各ジアミノ酸リピート含有タンパク質はリピートアミノ酸配列を含み、これは、式(YZ)xのジアミノ酸リピート単位を含有し、式中、Xは、2~10,000、5~10,000、2~5,000、5~5,000、2~1000、5~1000、5~500、5~300、5~200、10~500、10~300、または10~200でありうる。各ジアミノ酸リピート含有タンパク質のためのジアミノ酸リピート単位は、表1に提供される。
各ジアミノ酸リピート含有タンパク質は、さらに、非ジアミノ酸リピート配列を含むNおよび/またはC末端アミノ酸配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、N末端アミノ酸配列は、C9ORF72RNA転写物のヌクレオチド配列、たとえばセンス転写物のためのC9ORF72のイントロン内の5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピートの上流のヌクレオチド配列またはアンチセンス転写物のためのC9ORF72のイントロン内の5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピートの上流のヌクレオチド配列から翻訳されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、C末端アミノ酸配列は、C9ORF72RNA転写物のヌクレオチド配列、たとえばセンス転写物のためのC9ORF72のイントロン内の5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピートの下流のヌクレオチド配列またはアンチセンス転写物のためのC9ORF72のイントロン内の5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピートの下流のヌクレオチド配列から翻訳されたアミノ酸配列を含む。5’-GGGGCC-3’または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピートの下流のかかるヌクレオチド配列は、1つの終止コドンまたは複数の終止コドンに到達するまで翻訳されてもよい。
C9ORF72遺伝子配列の一部(センスおよびアンチセンス)を下に示す。5’-GGGGCC-3’または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピートは、下線を引いて太字にしてある。5’-GGGGCC-3’または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピートの上流のヌクレオチド配列は、下線を引き太字にした配列の前にある。5’-GGGGCC-3’または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピートの下流のヌクレオチド配列は、下線を引き太字にした配列の後にある。この5’-GGGGCC-3’または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピートは、これら配列にある回数を超えて反復されうることが理解されるべきである。
C9ORF72(部分配列、センス)
C9ORF72(部分配列、アンチセンス)
いくつかの実施形態において、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質は、N末端メチオニンを含むN末端アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Met...ポリ(Pro-Arg)タンパク質は、MQAIPPVARGESPTPSFGQRNERESKNASSSEESPRFYPRLFPAAEPQTATRQDAASSLTHSPPPAPPPPRAQAPQPQPRPGPAPGPAPTT (配列番号41)を含むN末端アミノ酸配列またはその断片を含み、この配列はポリ(Pro-Arg)リピートアミノ酸配列のN末端側にある。いくつかの実施形態において、Met...ポリ(Gly-Pro)タンパク質は、MRGKVKMRRALRRAPASTRASSRQPNPKQPPARMPPPHSPTRHRLRLRRRGRRHRNRSPAPGPPPGPPRPRP (配列番号42)、MRRALRRAPASTRASSRQPNPKQPPARMPPPHSPTRHRLRLRRRGRRHRNRSPAPGPPPGPPRPRP (配列番号43)、MPPPHSPTRHRLRLRRRGRRHRNRSPAPGPPPGPPRPRP (配列番号44)、を含むN末端アミノ酸配列またはその断片を含み、この配列はポリ(Gly-Pro)リピートアミノ酸配列のN末端側にある。
いくつかの実施形態において、C末端アミノ酸配列は、表1に示すC末端アミノ酸配列または表1に示すC末端アミノ酸配列の断片を含む。表1のもの以外のC末端アミノ酸配列もまた考慮されることが理解されるべきである。
例示的ジアミノ酸リピート含有タンパク質は、表2に提供される配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質は、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される。いくつかの実施形態において、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質は、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)タンパク質、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される。
いくつかの実施形態において、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質は、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上、または6つ以上、7つ以上、または8つのジアミノ酸リピート含有タンパク質である。
対象
本開示の態様は、ALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高い対象、たとえばヒトの同定および処置に関する。いくつかの実施形態において、対象はALSを有していてもよい。いくつかの実施形態において、対象は、1つまたは複数のALSの症状、たとえば呼吸困難、嚥下困難、筋痙攣、筋収縮、筋衰弱、麻痺、会話障害、または体重減少を有していてもよい。いくつかの実施形態において、対象はALSの症状を一切有していなくてもよい。いくつかの実施形態において、対象はALSの家族歴を有していてもよい。
本開示の態様は、ALSもしくはFTDを有するかまたはALSもしくはFTDを発症する可能性が高い対象、たとえばヒトの同定および処置に関する。いくつかの実施形態において、対象はALSを有していてもよい。いくつかの実施形態において、対象は、1つまたは複数のALSの症状、たとえば呼吸困難、嚥下困難、筋痙攣、筋収縮、筋衰弱、麻痺、会話障害、または体重減少を有していてもよい。いくつかの実施形態において、対象はALSの症状を一切有していなくてもよい。いくつかの実施形態において、対象はALSの家族歴を有していてもよい。
いくつかの実施形態において、対象は前頭側頭認知症(FTD)を有していてもよい。いくつかの実施形態において、対象は1つまたは複数のFTDの症状、たとえば嗜眠、自発性喪失、脱抑制、感情移入および他の対人能力の欠如、無感情、進行性非流暢性失語、意味性認知症、過食症、強迫行動、振戦、硬直、筋痙攣、協調運動不全、嚥下困難、および筋衰弱を有していてもよい。いくつかの実施形態において、対象はFTDの症状を一切有していなくてもよい。いくつかの実施形態において、対象はFTDの家族歴を有していてもよい。
いくつかの実施形態において、対象は、C9ORF72遺伝子(NCBI Entrez Gene ID: 203228)の対立遺伝子の一方または両方内にGGGGCCヘキサヌクレオチドリピートを有していてもよい。いくつかの実施形態において、GGGGCCヘキサヌクレオチドリピートは、C9ORF72遺伝子のプロモーターおよび/またはイントロン内にある。いくつかの実施形態において、GGGGCCヘキサヌクレオチドリピートの数は、25、50、100、150、200、250、300、500、5,000、10,000以上である。リピートの数は、当技術分野において知られている任意のアッセイを使用して、たとえば核酸ベースアッセイ、たとえばサザンブロットを使用して検出できる[たとえば、Dejesus-Hernandez et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron 72, 245 (2011)、Renton et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron 72, 257 (2011)、およびGijselink et al. A C9orf72 promoter repeat expansion in a Flanders-Belgian cohort with disorders of the frontotemporal lobar degeneration-amyotrophic lateral sclerosis spectrum: A gene identification study. Lancet Neurol. 11, 54 (2011)を参照のこと]。
対照および対照レベル
本開示の態様は、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質および/またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルの対照レベルとの比較に関する。いくつかの実施形態において、対照レベルは、健常対象または健常対象の集団から得られる試料、たとえば流体試料または組織試料中の1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質および/またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルである。いくつかの実施形態において、試料は血液試料である。本明細書において使用される健常対象は、一見疾患を有せず、ALSまたはFTD等の病歴を有しない対象である。いくつかの実施形態において、健常対象は、C9ORF72遺伝子内に25個以下のGGGGCCヘキサヌクレオチドリピートを有する対象である。
本開示の態様は、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質および/またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルの対照レベルとの比較に関する。いくつかの実施形態において、対照レベルは、健常対象または健常対象の集団から得られる試料、たとえば流体試料または組織試料中の1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質および/またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルである。いくつかの実施形態において、試料は血液試料である。本明細書において使用される健常対象は、一見疾患を有せず、ALSまたはFTD等の病歴を有しない対象である。いくつかの実施形態において、健常対象は、C9ORF72遺伝子内に25個以下のGGGGCCヘキサヌクレオチドリピートを有する対象である。
いくつかの実施形態において、対照レベルは、標準的検出方法(たとえば、ウエスタンブロット、qPCR、ノーザンブロット、または免疫組織化学)を使用して、検出不能であるかまたは得られたバックグラウンド/ノイズレベルを下回る、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質および/またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルである。かかるレベルは、たとえば、ジアミノ酸リピート含有タンパク質および/またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAを含まないことがわかっている試料中の1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質および/またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルを測定することにより得られる。
本開示はまた、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質および/またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルを、毎回対照レベルを測定する必要のないように、所定のレベルまたは値と比較することを伴う。所定のレベルまたは値は、様々な形態をとりうる。それは、単一のカットオフ値、たとえば中央値または平均値でありうる。それは、ある定義された群がALSまたはFTDを有さないことがわかっており、別の定義された群がALSまたはFTDを有することがわかっている場合等、比較群に基づいて確立できる。それは、たとえば、被験集団が均等(または不均等)に複数の群、たとえば25個以下のGGGGCCヘキサヌクレオチドリピートを有する対象、25個~50個のGGGGCCヘキサヌクレオチドリピートを有する対象、および50個以上のGGGGCCヘキサヌクレオチドリピートを有する対象に分割された場合に、一定の範囲でありうる。
試料
本開示の態様は、対象から得られた血液試料(たとえば、全血、血漿、または血清)中の1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを決定することに関する。血液試料は、当技術分野において知られている任意の方法により、たとえば、針または指穿刺装置を使用して得られる。血液は、本明細書に記載の方法における使用前に処理されてもよい。かかる処理には、抗凝固剤の添加、血液細胞の除去、および/または血液の冷凍が含まれる。しかしながら、他の試料、たとえば組織試料(たとえば脳組織)または他の流体試料、たとえば唾液もしくは尿を使用できることが認められるべきである。
本開示の態様は、対象から得られた血液試料(たとえば、全血、血漿、または血清)中の1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを決定することに関する。血液試料は、当技術分野において知られている任意の方法により、たとえば、針または指穿刺装置を使用して得られる。血液は、本明細書に記載の方法における使用前に処理されてもよい。かかる処理には、抗凝固剤の添加、血液細胞の除去、および/または血液の冷凍が含まれる。しかしながら、他の試料、たとえば組織試料(たとえば脳組織)または他の流体試料、たとえば唾液もしくは尿を使用できることが認められるべきである。
本開示の他の態様は、対象から得られる試料中のヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルを決定することに関する。試料は、流体または組織試料であってもよい。いくつかの実施形態において、組織試料は脳組織である。いくつかの実施形態において、流体試料は血液(たとえば、全血、血漿、または血清)、唾液、または尿である。いくつかの実施形態において、流体試料は血液試料(たとえば、全血、血漿、または血清)である。
アッセイ
本開示の態様は、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質および/またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルまたは存在/非存在を決定するためにアッセイを実施することに関する。タンパク質およびRNAを検出するための当技術分野において知られているアッセイ(たとえば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York.を参照のこと。マイクロアレイ技術は、Microarray Methods and Protocols, R. Matson, CRC Press, 2009, or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに記載されている。)を、単独でまたは本明細書に記載のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルを測定するための手法および組成物と組み合わせて使用できる。
本開示の態様は、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質および/またはヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルまたは存在/非存在を決定するためにアッセイを実施することに関する。タンパク質およびRNAを検出するための当技術分野において知られているアッセイ(たとえば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York.を参照のこと。マイクロアレイ技術は、Microarray Methods and Protocols, R. Matson, CRC Press, 2009, or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに記載されている。)を、単独でまたは本明細書に記載のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルを測定するための手法および組成物と組み合わせて使用できる。
タンパク質レベルを検出するためのアッセイには、イムノアッセイ[本明細書において免疫ベース(immune-based or immuno-based)アッセイとも呼ばれ、たとえば、ウエスタンブロット、免疫組織化学およびELISAアッセイ]、質量分析、およびマルチプレックスビーズベースアッセイが含まれるが、これに限られるものではない。タンパク質レベル検出のためのかかるアッセイは、当技術分野においてよく知られている。タンパク質検出および定量方法の他の例には、たとえば米国特許第6939720号および第8148171号、および公開米国特許出願第2008/0255766号に記載のマルチプレックスイムノアッセイ、ならびにたとえば公開米国特許出願第2009/0088329号に記載のタンパク質マイクロアレイが含まれ、これら文献のすべての全体が本明細書に参照により組み込まれる。
ジアミノ酸リピート含有タンパク質のための任意の好適な結合パートナーが、ジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルの検出のために考慮される。いくつかの実施形態において、結合パートナーは、本明細書に記載のジアミノ酸リピート含有タンパク質と特異的に結合する任意の分子である。本明細書に記載の「ジアミノ酸リピート含有タンパク質と特異的に結合する」は、分子が、非ジアミノ酸リピート含有タンパク質の一部または全部よりも、ジアミノ酸リピート含有タンパク質の一部または全部と結合する可能性が高いことを意味する。
いくつかの実施形態において、結合パートナーは、抗体またはその抗原結合性フラグメント、たとえばFab、F(ab)2、Fv、単鎖抗体、FabおよびsFabフラグメント、F(ab’)2、Fdフラグメント、scFv、またはdAbフラグメントである。抗体およびそれらの抗原結合性フラグメントを製造するための方法は、当技術分野においてよく知られている[たとえば、Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990)、およびRoitt et al., "Immunology" (2nd Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989)、WO2006/040153、WO2006/122786、およびWO2003/002609を参照のこと]。結合パートナーはまた、ジアミノ酸リピート含有タンパク質と特異的に結合する他のペプチド分子およびアプタマーを含む。ペプチド分子およびアプタマーを製造するための方法は、当技術分野においてよく知られている(たとえば、公開米国特許出願第2009/0075834号、米国特許第7435542、第7807351号、および第7239742号を参照のこと)。結合パートナーは、蛍光、酵素、親和性または同位体標識を含むが、これに限られない標識を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、アッセイは、免疫ベースアッセイを含む。いくつかの実施形態において、免疫ベースアッセイは、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的な単離抗体を含む。いくつかの実施形態において、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的な単離抗体は、本明細書にさらに詳細に記載されている単離抗体である。いくつかの実施形態において、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的な単離抗体は、表1、表2または表3に記載の抗原もしくは配列、または抗原もしくは配列の断片に特異的な単離抗体である。
したがって、ジアミノ酸リピート含有結合パートナー(たとえば、ジアミノ酸リピート含有特異抗体)を、検出可能な成分で標識化できる。
RNAを検出するためのアッセイには、ハイブリダイゼーションベースアッセイ、たとえばノーザンブロット解析、RT-PCR、シーケンシング技術、RNAインサイチューハイブリダイゼーション(たとえば、FISHにおけるように試料中に存在するRNA分子とハイブリダイズするDNAまたはRNAプローブを使用する)、インサイチューRT-PCR(たとえば、Nuovo GJ, et al. Am J Surg Pathol. 1993, 17: 683-90; Komminoth P, et al. Pathol Res Pract. 1994, 190: 1017-25に記載のもの)、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ[たとえば、試料に由来するポリヌクレオチド配列の、アドレス付け可能な位置(addressable locations)を有する固体表面(たとえば、ガラスウェハー)、たとえばAffymetrixマイクロアレイ[Affymetrix(登録商標)、Santa Clara、CA]に結合したオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによる]が含まれるが、これに限られるものではない。核酸結合パートナー、たとえばプローブを設計するための方法は、当技術分野においてよく知られている。いくつかの実施形態において、核酸結合パートナーは、本明細書において提供されるヘキサヌクレオチドリピート含有RNAの核酸配列の一部または全部と結合する。
処置
本明細書に記載のとおり、ジアミノ酸リピート含有タンパク質が、ALSを有する患者からの血液試料中に存在することが見出された。理論または機構に束縛されることを望まないが、ALSを有する対象の血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質が時間経過とともに脳実質内に蓄積し、神経炎症性変化、CNS機能障害、および神経細胞死をもたらすと考えられる。したがって、本開示の態様は、対象の血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルを減少または安定化させることによる、ALSまたはFTDを有する対象の処置に関する。
本明細書に記載のとおり、ジアミノ酸リピート含有タンパク質が、ALSを有する患者からの血液試料中に存在することが見出された。理論または機構に束縛されることを望まないが、ALSを有する対象の血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質が時間経過とともに脳実質内に蓄積し、神経炎症性変化、CNS機能障害、および神経細胞死をもたらすと考えられる。したがって、本開示の態様は、対象の血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルを減少または安定化させることによる、ALSまたはFTDを有する対象の処置に関する。
いくつかの実施形態において、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させることまたはその増加を予防することは、1つまたは複数(たとえば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたは8つ)のジアミノ酸リピート含有タンパク質を対象の血液から除去することを含む。いくつかの実施形態において、対象の血液からの1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質は、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植から選択される処置を使用して除去される。いくつかの実施形態において、対象が発現するすべてのジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させるかまたはその増加を予防することは、有利でありうる。したがって、いくつかの実施形態において、方法は、対象が発現するすべての形態のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させることまたはその増加を予防することを含む。
いくつかの実施形態において、対象の血液からの1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有は、造血幹細胞(HSC)移植を使用して除去される。HSC移植は、骨髄、末梢血、または臍帯血に通常は由来する造血幹細胞の、対象への移植である。造血幹細胞のソースは、同種(たとえば、健常対象等のドナーから)であってもよい。HSC移植の方法は、当技術分野においてよく知られている(たとえば、Bishop MR, Pavletic SZ. Hematopoietic stem cell transplantation. In: Abeloff MD, Armitage JO, Niederhuber JE, Kastan MB, McKena WG, eds. Clinical Oncology. 4th ed. Philadelphia, Pa: Elsevier Churchill Livingstone; 2008:chap 32、およびVose JM, Pavletic SZ. Hematopoietic stem cell transplantation. In: Goldman L, Schafer AI. Cecil Medicine. 24th ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2011:chap 181を参照のこと)。
対象のHSC移植を準備するために、対象に存在するHSCを除去または消耗させてもよく、結果として移植細胞は、対象において支配的なHSC集団となりうる。対象のHSC細胞がアポトーシスまたは細胞周期停止となるようにするため、対象におけるHSCを、たとえば、化学療法、照射、または両方で対象を処置することにより消耗させてもよい。
同種HSC移植において、HSCはドナーから得られる。ドナーは好ましくは健常対象、たとえば一見疾患を有せず、ALSまたはFTD等の病歴を有しない対象である。ドナーは、移植片対宿主病の危険性を減少させるために、移植を受ける対象とHLA適合性であることが好ましい。HLA適合性は、たとえば、HLAタイピングを使用して決定できる。HLAタイピングは一般に、少なくとも8つのHLAマーカー、すなわち2つのA、2つのB、2つのC、および2つのDRB1マーカー、ならびにまた適宜2つのDQマーカーの検査を伴う。HLAタイピングは、たとえば血液検査を通じて達成できる。HLA対立遺伝子同一性は、血清学または核酸ベースアッセイを使用して決定できる。一般に、ホストとドナーとの間で4つ~6つのマーカーの一致が好ましい。いくつかの実施形態において、ドナーは、C9ORF72遺伝子内に25個以下のGGGGCCヘキサヌクレオチドリピートを有する対象である。
HSCは、当技術分野において知られている任意の方法を使用してドナーから得られる。例示的方法には、骨髄採取および白血球除去が含まれる[たとえば、Transfusion. 2003 Feb;43(2):259-64. Leukapheresis after high-dose chemotherapy and autologous peripheral blood progenitor cell transplantation: a novel approach to harvest a second autograft. Schwella N, Braun A, Ahrens N, Rick O, Salama Aを参照のこと]。骨髄採取において、骨髄は典型的には、ドナーの一方または両方の寛骨の背部から除去される。白血球除去は、たとえば、連続フロー遠心分離または濾過を使用した、ドナーから得られる血液からのHSCの分離を伴う。新しいHSCの増殖を刺激し、結果としてより多くのHSCが血中に存在するようにするため、増殖因子G-CSFがドナーに投与されてもよい。HSCが得られると、次に同種HSCが移植を受ける対象に投与される。当技術分野において知られている任意の好適な投与方法、たとえば中心静脈カテーテルによるものが考慮される。
いくつかの実施形態において、HSC移植中またはその後に、HSC移植を受ける対象は、追加の処置および/または療法、たとえば抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、輸血および/または免疫抑制療法を受けてもよい。かかる処置および/または療法は、HSC移植回復期間中に感染および/または移植片対宿主病を予防するのに役立ちうる。
いくつかの実施形態において、HSC移植は、骨髄移植である。いくつかの実施形態において、骨髄移植は、同種骨髄移植である。
プラズマフェレーシスは、体外で生じる医療処置(「体外処置」)であり、血液循環からの血漿(の成分)の除去、処置、および返還を指す。プラズマフェレーシスは、当技術分野においてよく知られており、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、ギラン-バレー症候群、狼瘡、および血栓性血小板減少性紫斑病を含む複数の疾患を処置するために使用されてきた(たとえば、Madore, Plasmapheresis Technical aspects and indications, Crit Care Clin 18: 375-392. 2002を参照のこと)。プラズマフェレーシス中に血液は最初に、たとえば、針または以前に埋め込まれたカテーテルを通じて体外に取り出される。次に血漿は、たとえば、血液成分分離装置を使用することにより、血液細胞から分離される。血漿分離後、血液細胞は補液と組み合わされ、対象に再投与される。補液は、疾患関連成分を除去するよう処理された分離血漿または代替血漿(血漿交換とも呼ばれる)のいずれかであってもよい。
血漿を血液細胞から分離するために使用される例示的処置は、以下を含む。すなわち、
1)非連続フロー遠心分離:1本の静脈内カテーテルラインが使用される。典型的には、1度に血液の1つまたは複数のバッチが除去され、遠心分離されて血漿を血液細胞から分離する。次に血液細胞は、補液と組み合わされて対象に戻される。
2)連続フロー遠心分離:2本の静脈内ラインが使用される。血漿は連続的に血液から取り出され、分離された血液細胞は、対象に戻る前に補液を結合したラインを通じて供給される。
3)血漿濾過:2本の静脈内ラインが使用され。血漿は、標準的な血液透析器具、たとえば平行板または中空繊維フィルターを使用して濾過される。分離された血液細胞は、対象に戻る前に補液を結合したラインを通じて供給される。フィルターは通常、血漿の通過を可能にする一方で細胞を保持するのに十分な直径0.2~0.6μmの細孔を有する。複数の膜血漿分離器が市販されている(たとえば、Asahi Medical Co.,Ltd.,Tokyo,Japan製Plasmaflo、Toray Industries,Tokyo,Japan製Plasmax、Baxter,Deerfield,IL,USA製CPS-10、Fresenius Medical Care AG,Bad Homburg,Germany製Plasmaflux、Hospal,Lyon,France製Prisma TPE 2000)。
1)非連続フロー遠心分離:1本の静脈内カテーテルラインが使用される。典型的には、1度に血液の1つまたは複数のバッチが除去され、遠心分離されて血漿を血液細胞から分離する。次に血液細胞は、補液と組み合わされて対象に戻される。
2)連続フロー遠心分離:2本の静脈内ラインが使用される。血漿は連続的に血液から取り出され、分離された血液細胞は、対象に戻る前に補液を結合したラインを通じて供給される。
3)血漿濾過:2本の静脈内ラインが使用され。血漿は、標準的な血液透析器具、たとえば平行板または中空繊維フィルターを使用して濾過される。分離された血液細胞は、対象に戻る前に補液を結合したラインを通じて供給される。フィルターは通常、血漿の通過を可能にする一方で細胞を保持するのに十分な直径0.2~0.6μmの細孔を有する。複数の膜血漿分離器が市販されている(たとえば、Asahi Medical Co.,Ltd.,Tokyo,Japan製Plasmaflo、Toray Industries,Tokyo,Japan製Plasmax、Baxter,Deerfield,IL,USA製CPS-10、Fresenius Medical Care AG,Bad Homburg,Germany製Plasmaflux、Hospal,Lyon,France製Prisma TPE 2000)。
分離血漿が補液として使用される場合、分離血漿はまず、分離血漿中に存在するジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させるよう処理される。いくつかの実施形態において、分離血漿中に存在するジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させることは、本明細書に記載のとおり、分離血漿をジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的な1つまたは複数の単離抗体と接触させることを含み、そのことにより分離血漿中に存在するジアミノ酸リピート含有タンパク質は、1つまたは複数の単離抗体と結合する。いくつかの実施形態において、1つまたは複数の単離抗体のための結合パートナーを分離血漿と接触させる。1つまたは複数の単離抗体のための結合パートナーは、たとえば、捕捉成分、たとえばビオチンもしくはストレプトアビジン、プロテインA、または1つもしくは複数の単離抗体に特異的な二次抗体であってもよい。かかる結合パートナーは、1つまたは複数の単離抗体が、分離血漿から除去されるのを可能にする。
いくつかの実施形態において、1つまたは複数の単離抗体は、フィルター、カラム、および/または固体支持体に結合される。かかる実施形態において、分離血漿は、フィルター、カラム、および/または固体支持体と接触させられ、そのことによりジアミノ酸リピート含有タンパク質は、フィルター、カラムおよび/または固体支持体に結合された単離抗体と結合する。
理論に束縛されることは望まないが、ジアミノ酸リピート含有タンパク質は血中で凝集体を形成しうると考えられる。したがって、ジアミノ酸リピート含有タンパク質は、凝集体が分離血漿から単離されるように、フィルターを使用して分離血漿から除去されてもよい。
いくつかの実施形態において、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質を発現する対象は、自己抗体を形成してもよい。いくつかの実施形態において、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質に対する自己抗体は、分離血漿から除去されてもよい。自己抗体は、当技術分野において知られている任意の方法、たとえば、自己抗体を認識する結合パートナー(たとえば、固体支持体に結合されるかまたはタグに結合される)を使用して除去されてもよい。いくつかの実施形態において、結合パートナーは、本明細書に記載の1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質であってもよい。
血漿交換が使用される場合、対象は、代替血漿を受ける。代替血漿は、たとえば、ドナー血漿またはアルブミン溶液(たとえば、生理食塩水中5~70%アルブミン)であってもよい。例示的代替血漿は、50%:50%(vol:vol)溶液中で0.9%生理食塩水と組み合わされた5%アルブミンである。血液が凝固しないように維持する薬物(たとえば、抗凝固剤、たとえばクエン酸、クエン酸デキストロースまたはヘパリン)は、処置中に対象に与えられるかまたは対象の血液と接触させられてもよい。
いくつかの実施形態において、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させることまたはその増加を防止することは、ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルを減少させることを含む。ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルを減少させることは、ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAを標的にする有効量の抑制性核酸分子、たとえばshRNA、siRNA、miRNA、またはアンチセンス核酸分子の投与を含んでいてもよい。
shRNA、siRNA、miRNA、およびアンチセンス核酸分子を製造するための方法は、当技術分野においてよく知られている[たとえば、Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, (Current Edition)、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. eds., (Current Edition))、Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition)、Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition)、Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition)を参照のこと]。いくつかの実施形態において、核酸抑制因子は、標的ヘキサヌクレオチドリピート含有RNA配列の少なくとも一部を含むかもしくはそれに相当するか、または標的ヘキサヌクレオチドリピート含有RNA配列と相補的な配列の少なくとも一部を含む。
いくつかの実施形態において、処置は、対象において1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質に対する自己抗体のレベルを減少または安定化させることを含んでいてもよい。自己抗体のレベルは、当技術分野において知られている任意の方法を使用して減少または安定化させられてもよい。いくつかの実施形態において、自己抗体のレベルを減少または安定化させることは、有効量のアタシセプト、ベリムマブ、ブリシビモド、BR3-Fc、リツキシマブ、オクレリズマブ、アツムマブ(atumumab)、エプラツズマブ、コルチコステロイド(たとえば、プレドニゾン)、ミコフェノール酸、メトトレキセート、シクロホスファミド、アザチオプリン、および/またはシクロスポリンの投与を含む。いくつかの実施形態において、自己抗体のレベルを減少または安定化させることは、プラズマフェレーシスを含む。
抗体
本開示の態様は、ポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Gly-Arg)、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択されるジアミノ酸リピート含有タンパク質(たとえば、RANタンパク質)に特異的な単離抗体に関する。単離抗体は、ジアミノ酸リピート含有タンパク質の領域(たとえば、リピート配列またはC末端)を認識するかまたはジアミノ酸リピート含有タンパク質全体を認識してもよい。
本開示の態様は、ポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Gly-Arg)、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択されるジアミノ酸リピート含有タンパク質(たとえば、RANタンパク質)に特異的な単離抗体に関する。単離抗体は、ジアミノ酸リピート含有タンパク質の領域(たとえば、リピート配列またはC末端)を認識するかまたはジアミノ酸リピート含有タンパク質全体を認識してもよい。
標的またはエピトープに「特異的に結合する」抗体は、当技術分野において理解されている用語であり、かかる特異的結合を決定する方法もまた、当技術分野において知られている。分子は、それが代替的標的よりも、頻繁に、迅速に、長時間、および/または大きな親和性で、特定の標的抗原と反応または結合する場合に、「特異的結合」を示すと言われている。抗体は、それが他の物質に結合するよりも大きな親和性、結合力で、容易に、および/または長期間結合する場合に、標的抗原と「特異的に結合する」。たとえば、ポリ(Gly-Ala)タンパク質またはそのエピトープに特異的に結合する抗体は、それが他の抗原または同じ抗原の他のエピトープに結合するよりも大きな親和性、結合力で、容易に、および/または長期間、この標的抗原に結合する抗体である。この定義を読むことにより、たとえば、第1の標的抗原に特異的に結合する抗体が、第2の標的抗原に特異的に結合してもしなくてもよいこともまた理解される。かかるものとして、「特異的結合」は、排他的結合を(それを含みうるとはいえ)必ずしも要しない。必ずではないが一般に、結合への言及は特異的結合を意味する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ジアミノ酸リピート含有タンパク質(たとえば、RANタンパク質)との好適な結合親和性を有する。本明細書において使用される「結合親和性」は、見かけの結合定数またはKAを指す。KAは、解離定数(KD)の逆数である。本明細書に記載の抗体は、少なくとも10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10M以下の結合親和性(KD)を有していてもよい。増加した結合親和性は、減少したKDに相当する。第2の標的と比較して第1の標的に対する、抗体のより高い親和性の結合は、第2の標的との結合についてのKA(または数値KD)より高い第1の標的との結合についてのKA(またはより小さい数値KD)により示されうる。かかる場合には、抗体は、第1の標的(たとえば、第1のコンフォメーンョンのタンパク質またはその模倣物)について第2の標的(たとえば、第2のコンフォメーションの同じタンパク質もしくはその模倣物、または第2のタンパク質)と比較して特異性を有する。結合親和性の差(たとえば、特異性または他の比較について)は、少なくとも1.5、2、3、4、5、10、15、20、37.5、50、70、80、91、100、500、1000、10,000または105倍でありうる。
結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ELISA、表面プラズモン共鳴、または分光法を含む様々な方法により(たとえば、蛍光アッセイを使用して)決定されうる。結合親和性を評価するための例示的条件は、たとえば、トリス緩衝液(pH7.5で50mMトリス、150mM NaCl、5mM CaCl2)中である。これらの手法は、結合された結合タンパク質の濃度を標的タンパク質の濃度の関数として測定するために使用できる。結合された結合タンパク質([Bound])の濃度は、遊離標的タンパク質([Free])の濃度および結合タンパク質のための標的上の結合部位の濃度と関係付けられ、(N)は、以下の式による1標的分子当たりの結合部位の数である。すなわち、
[Bound]=[N][Free]/(Kd+[Free])
[Bound]=[N][Free]/(Kd+[Free])
とはいえ、KAを正確に決定することは必ずしも必要ない。なぜなら、KAに比例し、したがって、たとえば、より高い親和性が2倍高いのかどうかを決定することなどの比較に使用できる、ELISAまたはFACS解析等の方法を使用して決定される親和性の定量的測定値を得ること、親和性の定性的測定を得ること、または、機能的アッセイ、たとえばインビトロまたはインビボアッセイにおける活性により、親和性の推定を得ることだけで十分であることもあるからである。
いくつかの実施形態において、単離抗体は、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的である。
いくつかの実施形態において、単離抗体は、表1に定義されるジアミノ酸リピートおよび/またはC末端配列またはそれらの断片を含む抗原に特異的である。いくつかの実施形態において、単離抗体は、表2に定義される配列の配列またはその断片を含む抗原に特異的である。
いくつかの実施形態において、単離抗体は、表3または図28の抗原に特異的である。いくつかの実施形態において、表3の抗原は、Nおよび/またはC末端修飾を含有しない。
単離抗体は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、またはそれらの抗原結合性フラグメントであってもよい。それらの抗原結合性フラグメントは、たとえば、Fab、F(ab)2、F(ab’)2、Fv、単鎖抗体、Fabフラグメント、sFabフラグメント、Fdフラグメント、scFv、またはdAbフラグメントを含む。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにそれらの抗原結合性フラグメントを製造するための方法は、当技術分野においてよく知られている[たとえば、Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990)、およびRoitt et al., "Immunology" (2nd Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989)、WO2006/040153、WO2006/122786、およびWO2003/002609を参照のこと]。また包含されるのは、組換え手段により製造される抗体、たとえばキメラ抗体(可変領域および定常領域が異なる種に由来)およびCDRグラフト化抗体(相補性決定領域が異なる種に由来)であり、これらは米国特許第4,816,567号および第5,225,539号に記載されており、これら文献はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。また包含されるのは、典型的には組換え方法により製造される、ヒト化抗体であり、ヒト配列は抗体の一部または全部を含む。また含まれるのは、完全ヒト抗体、たとえば遺伝的改変マウスにおいて製造されたものである(PCT出願番号93/12227を参照のこと、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
いくつかの実施形態において、ジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的な単離抗体は、表4に列挙されたウサギポリクローナル抗体である。
抗体は、細菌細胞、たとえば、大腸菌、または真核細胞、たとえば、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞において製造できる。一実施形態において、抗体は、哺乳動物細胞において製造される。抗体またはその抗原結合性フラグメントを発現させるための哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)(たとえば、Kaufman and Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601 621に記載のとおり、DHFR選択可能マーカーとともに使用された、Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載のdhfr-CHO細胞を含む)、リンパ球細胞株、たとえば、NS0骨髄腫細胞およびSP2細胞、COS細胞、ならびにトランスジェニック動物、たとえば、トランスジェニック哺乳動物からの細胞が含まれる。抗体はまた、トランスジェニック動物により製造できる。たとえば、米国特許第5,849,992号は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺における抗体の発現方法を記載する。
本開示の単離抗体はまた、それに結合された検出可能な標識を有していてもよい。標識は、たとえば、蛍光、酵素、親和性または同位体標識であってもよい。例には、蛍光による検出のためのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)、発色性基質の切断による検出を可能にする西洋ワサビペルオキシダーゼ、放射性同位体、たとえばオートラジオグラフィーによる検出のためのI125、ならびに抗原および抗原保持細胞の抗体検出および親和性精製のためのアビジン/ビオチンが含まれる。
本開示によりまた包含されるのは、ポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Gly-Arg)、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)タンパク質、Met...ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Gly-Pro)、本明細書に記載のジアミノ酸リピート含有タンパク質のC末端ペプチド、および/またはそれらの2つ以上の組合せから選択されるジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を製造するハイブリドーマ細胞株である。
いくつかの実施形態において、単離抗体は、ALSを有する対象から得られる単離自己抗体であり、単離自己抗体は、本明細書に記載の1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離抗体は、緩衝液中に含有される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離抗体は、固体支持体(たとえば、プレートまたはビーズの表面)に結合される。
トランスジェニックマウス
別の一態様において、本開示は、GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート配列を含むヒトC9ORF72遺伝子を含むトランスジェニックマウスに関する。いくつかの実施形態において、マウスは、GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート配列ならびにヒトC9ORF72遺伝子の5’および3’末端上のフランキングヒト配列を含むヒトC9ORF72遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、5’および3’末端上のフランキングヒト配列は、それぞれ独立に、長さが少なくとも1キロベース(kB)、少なくとも5kB、少なくとも10kB、少なくとも20kB、少なくとも30kB、少なくとも40kB、または少なくとも50kBである。いくつかの実施形態において、5’および3’末端上のフランキングヒト配列は、それぞれ独立に、ヒトC9ORF72遺伝子の転写をセンスおよびアンチセンス方向にそれぞれ駆動可能なプロモーターを含む。したがって、いくつかの実施形態において、トランスジェニックマウスは、センスおよびアンチセンス転写物の両方(たとえば、本明細書に記載の5’-GGGGCC-3’および5’GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNA)を発現する。いくつかの実施形態において、ヒトC9ORF72遺伝子およびフランキング配列は、下の配列を含み、(GGGGCC)nは、GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート配列の位置を示す。
別の一態様において、本開示は、GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート配列を含むヒトC9ORF72遺伝子を含むトランスジェニックマウスに関する。いくつかの実施形態において、マウスは、GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート配列ならびにヒトC9ORF72遺伝子の5’および3’末端上のフランキングヒト配列を含むヒトC9ORF72遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、5’および3’末端上のフランキングヒト配列は、それぞれ独立に、長さが少なくとも1キロベース(kB)、少なくとも5kB、少なくとも10kB、少なくとも20kB、少なくとも30kB、少なくとも40kB、または少なくとも50kBである。いくつかの実施形態において、5’および3’末端上のフランキングヒト配列は、それぞれ独立に、ヒトC9ORF72遺伝子の転写をセンスおよびアンチセンス方向にそれぞれ駆動可能なプロモーターを含む。したがって、いくつかの実施形態において、トランスジェニックマウスは、センスおよびアンチセンス転写物の両方(たとえば、本明細書に記載の5’-GGGGCC-3’および5’GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNA)を発現する。いくつかの実施形態において、ヒトC9ORF72遺伝子およびフランキング配列は、下の配列を含み、(GGGGCC)nは、GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート配列の位置を示す。
Chr9:27,527,137~27,625,470(逆相補)
いくつかの実施形態において、ヒトC9ORF72遺伝子およびフランキング配列は、たとえば、上の配列と少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、または99%同一である配列を含む。本明細書において使用される「パーセント配列同一性」または「パーセント同一性」または「%同一性」は、同一性分率に100を掛けたものである。基準配列と最適にアラインされた配列の「同一性分率」は、最適アラインメントにおけるヌクレオチド一致数を、基準配列のヌクレオチド総数、たとえば基準配列全体の全長のヌクレオチド総数で割ったものである。
いくつかの実施形態において、GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート[たとえば、配列番号63における(GGGGCC)n]の数は、300~800、300~700、400~600、または500~600である。いくつかの実施形態において、GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート[たとえば、配列番号63における(GGGGCC)n]の数は、500~600である。いくつかの実施形態において、GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート[たとえば、配列番号63における(GGGGCC)n]の数は、300、400、500、600、700または800である。いくつかの実施形態において、GGGGCCヘキサヌクレオチドリピート[たとえば、配列番号63における(GGGGCC)n]の数は、500を超える。いくつかの実施形態において、トランスジェニックマウスは、FVB、balb-CまたはC57B/6系統マウスである。いくつかの実施形態において、トランスジェニックマウスは、FVB系統マウスである。いくつかの実施形態において、マウスは、ALSまたはFTDの処置のための処置法、たとえば本明細書に記載の処置法または候補治療薬をスクリーニングするために使用できる。
本明細書に記載のトランスジェニックマウスは、当技術分野において知られているかまたは本明細書、たとえば実施例4に記載されている任意の方法を使用して製造できる(たとえば、PCT公開番号WO2001010199およびWO2013022715、米国公開番号US20110113496および20060031954も参照のこと、これら各文献は本明細書に参照により組み込まれる)。たとえば、本明細書に記載のトランスジェニックマウスは、導入遺伝子(たとえば、適宜フランキング配列を有する、ヒトC9ORF72遺伝子)をマウスの生殖系列に導入することにより製造できる。様々な発生段階の胚性標的細胞を、導入遺伝子を導入するために使用できる。胚性標的細胞の発生段階に応じて、異なる方法が使用される。本開示を実施するために使用される任意の動物の特定の系統は、概して良好な健康状態、良好な胚産生、胚における良好な前核可視性、および良好な生殖適応度について選択される。加えて、ハプロタイプは重要な因子である。たとえば、トランスジェニックマウスが製造されるとき、C57BL/6またはFVB系統等の系統が使用されることが多い(Jackson Laboratory、Bar Harbor、Me.)。系統はそれ自体トランスジェニックであってもよく、且つ/またはノックアウト(たとえば、部分的または完全に抑制されている1つまたは複数の遺伝子を有する動物から得られる)であってもよい。導入遺伝子コンストラクトは、単一の段階の胚に導入されてもよい。接合体が、マイクロインジェクションの好ましい標的である。遺伝子導入のための標的としての接合体の使用は、ほとんどの場合注入されたDNAが第一卵割の前に宿主遺伝子に組み込まれる点において、大きな利点を有する[Brinster et al. (1985) PNAS 82:4438-4442]。通常は、受精胚は、前核が現れるまで好適な培地においてインキュベートされる。この頃には、導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、下に記載するとおり雌性または雄性前核導入されている。いくつかの種、たとえばマウスにおいて、雄性前核が好ましい。外来性遺伝物質が、卵核または接合体雌性前核により処理される前に、接合体の雄性DNA相補体に付加されることが最も好ましい。卵核または雌性前核は、おそらくは雄性DNAのプロタミンをヒストンに置き換えることにより、雄性DNA相補体に影響を及ぼす分子を放出し、そのことにより雌性および雄性DNA相補体の結合を促進し、二倍体接合体を形成すると考えられている。したがって、外来性遺伝物質は、それが雌性前核の影響を受ける前に、DNAの雄性相補体またはDNAの任意の他の相補体に付加されるべきである。たとえば、外来性遺伝物質は、雄性前核の形成後にできるだけ早く初期雄性前核に付加され、これは、雄性および雌性前核が十分に分離し、両方が細胞膜に近接して位置するときである。
あるいは、外来性遺伝物質は、脱凝縮を受けるよう誘導された後の精子核に付加されうる。次に、外来性遺伝物質を含有する精子が卵子に付加されうるか、または脱凝縮された精子が卵子に付加され、その後できるだけ早く導入遺伝子コンストラクトが付加されうる。外来性遺伝物質の核遺伝物質への付加を可能にする任意の手法を、それが細胞、核膜、または他の存在する細胞性もしくは遺伝的構造を破壊しない限り、利用できる。胚への導入遺伝子ヌクレオチド配列の導入は、当技術分野において知られている任意の手段、たとえばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはリポフェクションにより達成されてもよい。外来性遺伝物質は、優先的には、マイクロインジェクションにより核遺伝物質内に挿入される。細胞および細胞構造のマイクロインジェクションは、当技術分野において知られており、使用されている。マウスにおいて、雄性前核は、直径およそ20マイクロメートルのサイズに到達し、これは、1~2plのDNA溶液の再現性のある注入を可能にする。胚への導入遺伝子ヌクレオチド配列の導入後、胚は、インビトロで様々な時間インキュベートされてもよく、または代理宿主内に再移入されてもよく、またはその両方でもよい。成熟するまでのインビトロインキュベーションは、本発明の範囲内である。常法の1つは、種に応じて、胚をインビトロで約1~7日間インキュベートするものであり、次にそれらを代理宿主に再移入する。
代理宿主のトランスジェニック仔は、任意の好適な方法により、導入遺伝子の存在および/または発現についてスクリーニングされてもよい。スクリーニングは多くの場合、導入遺伝子の少なくとも一部と相補的なプローブを使用したサザンブロットまたはノーザンブロット解析により達成される。導入遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体を使用したウエスタンブロット解析が、導入遺伝子産物の存在のスクリーニングの代替的または追加的方法として用いられてもよい。典型的には、DNAは尾部組織から調製され、サザン解析またはPCRにより導入遺伝子について解析される。あるいは、導入遺伝子を最高レベルで発現すると考えられる組織または細胞が、導入遺伝子の存在および発現について、サザン解析またはPCRを使用して試験されるが、任意の組織または細胞タイプをこの解析について使用できる。
導入遺伝子の存在を評価するための代替または追加の方法には、好適な生化学的アッセイ、たとえば酵素および/または免疫学的アッセイ、特定のマーカーまたは酵素活性のための組織染色、フローサイトメトリー解析等が含まれるが、これに限られるものではない。血液の解析もまた、血中の導入遺伝子産物の存在を検出するため、ならびに導入遺伝子が様々なタイプの血液細胞および他の血液成分のレベルに与える影響を評価するために有用であってもよい。
トランスジェニック動物の後代は、トランスジェニック動物を好適なパートナーと交配させることにより、またはトランスジェニック動物から得られる卵および/もしくは精子の体外受精により得られてもよい。パートナーとの交配が実施される場合、パートナーは、トランスジェニックおよび/またはノックアウトであってもなくてもよく、トランスジェニックである場合には、それは同じかもしくは異なる導入遺伝子、または両方を含有していてもよい。あるいは、パートナーは親系統であってもよい。体外受精が使用される場合、受精胚は、代理宿主内に移入されるかもしくはインビトロでインキュベートされるか、またはその両方であってもよい。いずれかの方法を使用して、後代が、上述の方法、または他の適切な方法を使用して導入遺伝子の存在について評価されてもよい。
本開示の態様はまた、配列番号63を含むポリヌクレオチド、たとえば細菌人工染色体(BAC)ベクターに関する。
さらなる詳述なしに、当業者は上の記載に基づいて、本開示をその最大限の範囲まで利用すると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示的なものとして解釈されるべきであり、本開示の他の部分をいかなる仕方であっても限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての出版物が、本明細書において参照される目的または主題のため、参照により組み込まれる。
CMVプロモーター、GGGGCCの4、30、60、または120リピートのいずれかを含有する(GGGGCC)伸長モチーフ、およびHA、FLAG、またはMYCタグを含有するコンストラクトを、細胞にトランスフェクトした(図2A)。ポリ(GR)およびポリ(GP)タンパク質が、GGGGCCの30、60または120リピートを含有するコンストラクトをトランスフェクトした細胞内で生成されることが、ウエスタンブロットにより示された(図2B)。GGGGCCの30、60または120リピートを含有するコンストラクトをトランスフェクトした細胞内でGP-flag、GR-HA、およびGA-Mycタンパク質が発現することが、細胞の免疫蛍光を使用してさらに示された(図3)。これらの結果は、GGGGCCリピート領域が、AUG開始コドンから独立に翻訳を開始可能であること(リピート関連非ATG(RAN)翻訳)、ならびに、ポリ(GP)、ポリ(GR)、およびポリ(GA)リピートタンパク質が生成されることを示す。
ポリ(GR)配列またはポリ(GR)リピートタンパク質のC末端に対する抗体が生成された。これらの抗体を使用した蛍光染色は、これらの抗体がポリ(GR)リピートタンパク質を検出可能であることを示した(図4)。
ポリ(GP)配列およびポリ(GA)リピートタンパク質のC末端に対する抗体がさらに生成された。次に、抗ポリ(GR)、抗ポリ(GP)、および抗ポリ(GA)C末端抗体を、C9ORF72 ALSを有する患者または対照からの脳組織の断面を染色するために使用した(図5)。
次に、C9ORF72の転写物が、センスおよびアンチセンスの両方の方向に生成されうることが仮定された(図1を参照のこと)。これらのアンチセンス転写物がまた、アンチセンス転写物に存在する5’-GGCCCC-3’リピートからさらなるリピートタンパク質を生成するRAN翻訳を受けうることがさらに仮定された。図6に示すとおり、ポリ(PA)およびポリ(PR)タンパク質の両方が、C9ORF72 ALSを有する患者からの脳組織試料において検出可能だったが、対照においては検出可能でなかった。これらの結果は、ジアミノ酸リピート含有タンパク質、たとえばRANタンパク質が、C9ORF72遺伝子座から生成するセンスおよびアンチセンス転写物の両方から生成することを示す。
図7は、抗GP抗体(GP)で検出された凝集体のおよそ20%がまた、センスGPタンパク質の固有のC末端に対する抗体(GP-C)と共局在化することを示す。罹患した脳に見られるアンチセンス転写物の増加レベルと一貫して、これらの共局在データは、GPジペプチド凝集体の約80%超がC9ORF72アンチセンス転写物から発現することを示唆する。
加えて、アンチセンス転写物が、対照と比較してALSを有する対象において劇的に上昇したことが見出された(図12)。アンチセンス転写物レベルを検出するためのqPCRアッセイのためのプライマーが、下の表に示される。
さらに、ジアミノ酸リピート含有タンパク質は、ALSを有する対象の血中(血清および血漿を含む)および脳に存在することが見出された(図9および図10)が、対照対象には見出されなかった。
本開示のいくつかの態様によれば、血中および脳脊髄液(CSF)中のジアミノ酸リピート含有タンパク質(たとえばRANタンパク質)蓄積は、C9ORF72 ALS/FTDに実質的に寄与し、プラズマフェレーシスおよび骨髄移植は疾患の進行を止めるであろう。本開示のいくつかの態様によれば、血中および循環CSF中のジアミノ酸リピート含有タンパク質蓄積は、脳実質に浸潤し、タンパク質蓄積、神経炎症性変化、CNS機能障害および神経細胞死をもたらす。本開示の態様は、以下に部分的に基づく。第一に、血液脳関門(BBB)障害がALS患者における疾患の初期の特徴であり(4、5)、より高率のALSおよび他の神経疾患が、外傷性脳損傷を有する患者に見出される(6)。いくつかの実施形態において、理論に束縛されることは望まないが、ALSは部分的には、ALS/FTDを促進する免疫細胞および他の有害な物質のCNS侵入を可能にするBBB破壊により引き起こされる。第二に、本明細書に記載のとおり、ジアミノ酸リピート含有タンパク質が、ALS患者血液試料において蓄積することが見出された(図8および図9)。
プラズマフェレーシスおよび骨髄移植が、過去にALSのための治療戦略として試験されてきたとはいえ、これらのケースのいずれがC9ORF72陽性であったか、または処置が有効であるのに十分な程度早期であったかは明らかではない。したがって、いくつかの実施形態において、ALS処置(たとえば、プラズマフェレーシスまたはBMT)は、対象の血中に正常レベルを超える1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質が検出されるときに開始される。
C9ORF72 ALS患者組織および血液におけるジアミノ酸リピート含有タンパク質蓄積に関して本明細書において提示されたデータは、血中(およびおそらくまたCSF中)ジアミノ酸リピート含有タンパク質の量の減少が、C9ORF72 ALS患者においてALSの処置に役立ちうることを示す。本開示のいくつかの態様によれば、減少はたとえば、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植を使用して達成されてもよい。
方法
C9ORF72ファミリー(CNSA-1)からの遺伝子保持者、および、運動神経細胞疾患もしくは前頭側頭認知機能障害または両方の初期徴候を有する遺伝子陽性患者を含む通院患者について、詳細な評価が実施される。ジアミノ酸リピート含有タンパク質発現は、CNSAファミリー試料および医院において回収された追加試料におけるリピート長と相関する。血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質発現は、長期的に回収された試料において決定され、疾患発症および臨床的重症度と相関する。これらの方法は、C9ORF72陽性拡大研究対象におけるジアミノ酸リピート含有タンパク質発現を特徴付け、ジアミノ酸リピート含有タンパク質発現が一生を通じて生じるかまたは加齢とともに増加するかどうか、ならびに、ジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルが、疾患重症度と定量的に相関するかどうかを決定することが予測される。
C9ORF72ファミリー(CNSA-1)からの遺伝子保持者、および、運動神経細胞疾患もしくは前頭側頭認知機能障害または両方の初期徴候を有する遺伝子陽性患者を含む通院患者について、詳細な評価が実施される。ジアミノ酸リピート含有タンパク質発現は、CNSAファミリー試料および医院において回収された追加試料におけるリピート長と相関する。血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質発現は、長期的に回収された試料において決定され、疾患発症および臨床的重症度と相関する。これらの方法は、C9ORF72陽性拡大研究対象におけるジアミノ酸リピート含有タンパク質発現を特徴付け、ジアミノ酸リピート含有タンパク質発現が一生を通じて生じるかまたは加齢とともに増加するかどうか、ならびに、ジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルが、疾患重症度と定量的に相関するかどうかを決定することが予測される。
プラズマフェレーシスは、血中およびCSF中のより低いジアミノ酸リピート含有タンパク質の量が、疾患の徴候を止めるかどうかを決定するために試験される。プラズマフェレーシスは、疾患の初期徴候を有する5人のC9ORF72陽性の個人に対して実施される。各回2リットルの正常ヒトアルブミンとの交換を伴う6回のプラズマフェレーシスを、2週間にわたり実施し、次の6カ月間、毎週1回のプラズマフェレーシスを実施する。この研究は、必要であれば延長できる。一次的な結果尺度は、Appel ALS Rating Scale(AALSRS)である。神経学的検査、発話評価、神経心理学的試験、ALS Functional Rating Scale(ALSFRS)、EMG、および外側広筋の免疫組織病理学的評価のための針筋生検を含む臨床評価を、疾患進行を評価するために処置期間の直前および直後に実施する。RAN翻訳およびATG翻訳産物の血清の濃度およびCSFレベルを評価するため、6カ月の処置期間の前後に(または適用可能であれば、延長期間後にも)、静脈穿刺および腰椎穿刺もまた実施する。
モデル動物における骨髄移植が、血中および脳内のBMTがジアミノ酸リピート含有タンパク質蓄積を予防するかどうかを決定するために試験される。動物の第1のコホートにおいて、脳内のタンパク質凝集体の量が減少するかどうかを試験するため、RANT陽性マウスからの骨髄が除去され、野生型ドナー骨髄と置き換えられる。実験の並行セットにおいて、CNSタンパク質蓄積が造血細胞においてのみ導入遺伝子を発現する動物において生じるかどうかを試験するため、RANT陰性動物に、RANT陽性骨髄が移植される。処置動物の両方の群が、行動的、機能的および神経病理学的評価の組合せを使用して、野生型および未処置RANT対照動物と比較される。
RAN翻訳モデルマウスが生成された。6つの終止コドン(各リーディングフレームに2つ)をCAG伸長突然変異のすぐ上流に含有し、各リーディングフレームにおける3つの別個のエピトープタグが続くコンストラクトを使用して、トランスジェニックマウスが生成された(図10)。CAGリピートは、ポリGln RANタンパク質を生成し、これは以前はヒトにおける疾患、たとえば脆弱X染色体症候群と関連付けられていた。RANTモデルマウスはポリGln RANタンパク質をもたらし、これは、脳脊髄液に曝露されている脳内の軟膜表面下で高レベルに局在化することが見出された(図11)。このRANTモデルマウスは、実施例2に要約さいた研究において使用される。したがって、ポリアミノ酸リピート含有タンパク質(たとえば、モノまたはジアミノ酸リピート含有タンパク質)の検出は、ポリアミノ酸リピート含有タンパク質と関連付けられる脳障害の危険性の指標でありうる。したがって、本明細書に記載の方法は、他の神経疾患を検出または処置するために使用できる。
イントロダクション
これまで同定された家族性FTDおよびALSの最も一般的な原因である、ALS/FTDの染色体9p21関連形態は、染色体9オープンリーディングフレーム72(C90RF72)のイントロン1における伸長GGGGCC(G4C2)ヘキサヌクレオチドリピートにより引き起こされる(1、2)。C9ORF72突然変異は、家族性ALS症例の40%および散発性ALS症例の7%ならびに家族性FTD患者の21%および散発性FTD患者の5%に見出される(3)。C9ORF72伸長の発見は、かなりの興奮をもたらした。なぜならそれは、ALSおよびFTDを、マイクロサテライト伸長突然変異により引き起こされる大きな疾患群と関連付けるからである(4)。
これまで同定された家族性FTDおよびALSの最も一般的な原因である、ALS/FTDの染色体9p21関連形態は、染色体9オープンリーディングフレーム72(C90RF72)のイントロン1における伸長GGGGCC(G4C2)ヘキサヌクレオチドリピートにより引き起こされる(1、2)。C9ORF72突然変異は、家族性ALS症例の40%および散発性ALS症例の7%ならびに家族性FTD患者の21%および散発性FTD患者の5%に見出される(3)。C9ORF72伸長の発見は、かなりの興奮をもたらした。なぜならそれは、ALSおよびFTDを、マイクロサテライト伸長突然変異により引き起こされる大きな疾患群と関連付けるからである(4)。
従来、予測されるコーディングおよび非コーディング領域に位置するマイクロサテライト伸長突然変異は、タンパク質機能獲得もしくは喪失またはRNA機能獲得機構により疾患を引き起こすものと考えられていた(4)。タンパク質機能喪失は、C90RF72起因ALS/FTDの基礎をなすと提案されてきた。なぜなら、伸長突然変異が、変異体1転写物のレベルの減少およびC9ORF72タンパク質発現の潜在的減少をもたらすからである(1、2)。加えて、C9ORF72 G4C2伸長突然変異はイントロンに位置するので、C9関連ALS-FTDは、G4C2伸長RNAが核RNA凝集における重要な細胞因子を隔離する毒性RNA機能獲得機構の結果であるという仮説を、複数の研究が追求してきた。複数のG4C2RNA結合タンパク質が同定されてきたが、これまでのところ、これらの候補のいずれかが、内在性伸長転写物に直接結合するかまたは患者細胞もしくは生検組織内で観察されるRNA凝集と共局在化することは実証されていない(5~8)。
この機構において、ヘアピン形成マイクロサテライト伸長転写物が、AUG開始コドンなしに1つまたは複数のリーディングフレームにおいてタンパク質を発現させる(9)。近年様々な名称がこれらのRAN翻訳タンパク質に帰されてきた(たとえば、ホモポリマー性、ジペプチド、RANT)一方で、混乱を防止するため、ATG開始コドンの非存在下でマイクロサテライト伸長突然変異を通じて発現するすべてのタンパク質を、RANタンパク質と呼ぶことが提案される。なぜなら、RAN翻訳を受ける追加の伸長突然変異が同定されるからである。
ここで、GGCCCC(G2C4)伸長を含有するC9ORF72 ALS/FTDアンチセンス転写物が、核の、そしてまれに細胞質の凝集として、患者の脳内に蓄積したことが示される。加えて、リピートモチーフおよび特異C末端領域の両方に対する新規な一群の抗体が開発され、センスおよびアンチセンスRANタンパク質の両方が、C9ORF72患者CNS生検組織に蓄積することが実証された。C9ORF72患者脳内のアンチセンスG2C4RNA凝集および3つの新規アンチセンスRANタンパク質の発見は、双方向的転写およびRAN翻訳が、C9ORF72 ALS/FTDの基本的な病理学的特徴であることを示唆する。
結果
C9ORF72伸長患者におけるアンチセンスRNA凝集
アンチセンス(AS)C9ORF72伸長転写物がAS G2C4RNA凝集を形成し、RAN翻訳によりまたは短いASオープンリーディングフレーム(AS-ORF)からASタンパク質を発現させるという仮説を試験するため、一連の実験が実施された。まず、イントロン1b、アンチセンスG2C4伸長の5’、およびエクソン1aにおけるセンスおよびアンチセンス転写物の発現を比較するために、リンカー(linkered)鎖特異的RT-PCR方略を使用して、C9ORF72アンチセンス転写物が発現することが確認された。イントロン1bにおけるアンチセンス鎖について、RT反応のためにLK-ASORF-RプライマーならびにアンチセンスcDNAを特異的に増幅するPCRのためにASORF-FおよびLKを使用して鎖特異的RT-PCRを実施した(図12A)。同様の方略を、イントロン1bの同じ領域からのセンス転写物ならびにエクソン1aにおけるセンスおよびアンチセンス転写物を増幅するために使用した。イントロン1bアンチセンス転写物が、C9(+)ALS/FTD患者からの前頭皮質においてRT-PCRにより検出されたが、C9(-)ALS/FTDまたは正常対照からは検出されず(図12B)、qRT-PCRは、これらの転写物が6つのC9(+)ALS/FTD症例の間で劇的に増加することを示す(図12C)。対照的に、イントロン1bセンス転写物は、前頭皮質においてRT-PCRにより検出されなかった(図12B)。血中では、イントロン1bセンスおよびアンチセンス転写物の両方が検出可能であり、イントロン1bアンチセンス転写物の劇的なC9(+)上昇は観察されなかった。5’RACEは、イントロン1b AS転写がG2C4リピートの251~455塩基対(bp)上流の様々な部位で開始することを示した(図12A、図19B)。対照的に、G2C4リピートの40および90bp3’に位置する3’GSP1または3’GSP2プライマーを使用した3’RACEは、転写物を検出しなかった。これらのデータは、AS転写物の3’末端が、アンチセンスG2C4リピートの170bp3’に位置するセンスエクソン1a領域と重ならないことを示した。この結果と一致して、センス転写物は、エクソン1aと重なるプライマーを使用した鎖特異的リンカーRT-PCRにより検出されたが、アンチセンス転写物は検出されなかった(図12B)。アンチセンス転写物がG2C4リピート伸長を含むかどうかを決定するため、Cy3標識化(G4C2)4プローブを使用してRNA蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)を実施し、推定アンチセンスG2C4RNA凝集を検出する。結果は、核(図12D)の、そしてまれに細胞質(図19C)のG2C4RNA凝集が、C9(+)ALS前頭皮質において蓄積するが、C9(-)ALS前頭皮質には蓄積しないことを示した。細胞質内の凝集の検出は、アンチセンス伸長転写物が、タンパク質翻訳機構と同じ細胞内コンパートメントに見出されうることを示したのであり、おそらくそこでRAN翻訳は生じる。末梢組織におけるRNA凝集は、疾患のバイオマーカーを提供しうるので、末梢血白血球(PBL)を検査し、C9(+)PBLにおいてセンスおよびアンチセンスRNA凝集の両方が検出されたが、C9(-)PBLにおいては検出されなかった(図12D、図19D)。AS凝集を検出するCy3-G4C2プローブからのRNA-FISHシグナルが、過度の非標識化G4C2オリゴと競合しうるのであり、これらの凝集がDNase Iに耐性でありRNase I消化に感受性であることが発見された(図19E、F)。まとめると、これはC9ORF72アンチセンス転写物がC9(+)ALSにおいて前頭皮質内で上昇するが、C9(-)ALSまたは正常対照においては上昇しないことを示す。C9(+)前頭皮質において、核の、そしてまれに細胞質のRNA凝集において、G2C4伸長突然変異を含有するアンチセンス転写物が発現し、蓄積することもまた初めて示された。加えて、センスおよびアンチセンス凝集が血中に蓄積し、容易にアクセスできる組織においてC9ORF72 ALS/FTDの潜在的バイオマーカーを提供することが示された。
C9ORF72伸長患者におけるアンチセンスRNA凝集
アンチセンス(AS)C9ORF72伸長転写物がAS G2C4RNA凝集を形成し、RAN翻訳によりまたは短いASオープンリーディングフレーム(AS-ORF)からASタンパク質を発現させるという仮説を試験するため、一連の実験が実施された。まず、イントロン1b、アンチセンスG2C4伸長の5’、およびエクソン1aにおけるセンスおよびアンチセンス転写物の発現を比較するために、リンカー(linkered)鎖特異的RT-PCR方略を使用して、C9ORF72アンチセンス転写物が発現することが確認された。イントロン1bにおけるアンチセンス鎖について、RT反応のためにLK-ASORF-RプライマーならびにアンチセンスcDNAを特異的に増幅するPCRのためにASORF-FおよびLKを使用して鎖特異的RT-PCRを実施した(図12A)。同様の方略を、イントロン1bの同じ領域からのセンス転写物ならびにエクソン1aにおけるセンスおよびアンチセンス転写物を増幅するために使用した。イントロン1bアンチセンス転写物が、C9(+)ALS/FTD患者からの前頭皮質においてRT-PCRにより検出されたが、C9(-)ALS/FTDまたは正常対照からは検出されず(図12B)、qRT-PCRは、これらの転写物が6つのC9(+)ALS/FTD症例の間で劇的に増加することを示す(図12C)。対照的に、イントロン1bセンス転写物は、前頭皮質においてRT-PCRにより検出されなかった(図12B)。血中では、イントロン1bセンスおよびアンチセンス転写物の両方が検出可能であり、イントロン1bアンチセンス転写物の劇的なC9(+)上昇は観察されなかった。5’RACEは、イントロン1b AS転写がG2C4リピートの251~455塩基対(bp)上流の様々な部位で開始することを示した(図12A、図19B)。対照的に、G2C4リピートの40および90bp3’に位置する3’GSP1または3’GSP2プライマーを使用した3’RACEは、転写物を検出しなかった。これらのデータは、AS転写物の3’末端が、アンチセンスG2C4リピートの170bp3’に位置するセンスエクソン1a領域と重ならないことを示した。この結果と一致して、センス転写物は、エクソン1aと重なるプライマーを使用した鎖特異的リンカーRT-PCRにより検出されたが、アンチセンス転写物は検出されなかった(図12B)。アンチセンス転写物がG2C4リピート伸長を含むかどうかを決定するため、Cy3標識化(G4C2)4プローブを使用してRNA蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)を実施し、推定アンチセンスG2C4RNA凝集を検出する。結果は、核(図12D)の、そしてまれに細胞質(図19C)のG2C4RNA凝集が、C9(+)ALS前頭皮質において蓄積するが、C9(-)ALS前頭皮質には蓄積しないことを示した。細胞質内の凝集の検出は、アンチセンス伸長転写物が、タンパク質翻訳機構と同じ細胞内コンパートメントに見出されうることを示したのであり、おそらくそこでRAN翻訳は生じる。末梢組織におけるRNA凝集は、疾患のバイオマーカーを提供しうるので、末梢血白血球(PBL)を検査し、C9(+)PBLにおいてセンスおよびアンチセンスRNA凝集の両方が検出されたが、C9(-)PBLにおいては検出されなかった(図12D、図19D)。AS凝集を検出するCy3-G4C2プローブからのRNA-FISHシグナルが、過度の非標識化G4C2オリゴと競合しうるのであり、これらの凝集がDNase Iに耐性でありRNase I消化に感受性であることが発見された(図19E、F)。まとめると、これはC9ORF72アンチセンス転写物がC9(+)ALSにおいて前頭皮質内で上昇するが、C9(-)ALSまたは正常対照においては上昇しないことを示す。C9(+)前頭皮質において、核の、そしてまれに細胞質のRNA凝集において、G2C4伸長突然変異を含有するアンチセンス転写物が発現し、蓄積することもまた初めて示された。加えて、センスおよびアンチセンス凝集が血中に蓄積し、容易にアクセスできる組織においてC9ORF72 ALS/FTDの潜在的バイオマーカーを提供することが示された。
インビトロでのGGCCCCリピート伸長のRAN翻訳
アンチセンスG2C4伸長がRAN翻訳を受けるかどうかを試験するため、40または70リピートのG2C4伸長およびすべてのリーディングフレームにおけるタンパク質発現[たとえば、3つのフレームにおいて翻訳されたG2C4EXP転写物は、Gly-Pro(GP)、Pro-Ala(PA)およびPro-Arg(PR)RANタンパク質をもたらす]をモニタリングするための3つの異なるC末端エピトープ8タグの上流に6X STOPコドンカセット(各フレームに2つの停止)を挿入することにより、ATG開始コドンを欠いている、三重タグ化G2C4ミニ遺伝子、(G2C4)EXP-3Tを生成した(図13A)。免疫ブロッティングは、2つのエピトープタグ化RANタンパク質、PR-MycおよびGP-Flagを検出したが、PAHAは検出しなかった(図13B)。(PR)40-および(PR)70-3xMycタンパク質は、それぞれ、およそ20および27kDaの予測サイズで移動した。対照的に、(GP)40-および(GP)70-3xFlagタンパク質は、予測サイズ(10~15kDa)よりも実質的に高く、それぞれ、50および75kDaで移動した(図13B)。このブロット上のかすかな低い分子量バンドは、細菌培養中に見られるリピート収縮または翻訳開始位置の差異により生じうる。免疫蛍光(IF)は、アンチセンスRANタンパク質が、すべての3つのリーディングフレームにおいて発現することを示した(図13C)。ウエスタンブロッティングでは検出されなかったIFによるPA-HAの検出は、これらコンストラクトからRAN PA-HAを発現する細胞のより低い頻度により引き起こされうる。加えて、組換えGP-flagおよびPA-HAタンパク質は、細胞質に局在していた一方で、PR-Mycタンパク質は、核および細胞質の両方に分布していた。これらの局在の差異は、このエピトープタグ化コンストラクトにおいて見出されるリピートモチーフまたはC末端フランキング配列の異なる特性により生じうる。一連の追加実験においてまた、30、60および120リピートを含有するセンスG4C2伸長コンストラクトが、GP-Flag、GR-HAおよびGA-Myc RANタンパク質を発現させることが示された(図20)。要約すると、これらのデータは、組換えG2C4およびG4C2伸長転写物が、6つのすべてのリーディングフレームにおいてRANタンパク質を発現させることを示した。
アンチセンスG2C4伸長がRAN翻訳を受けるかどうかを試験するため、40または70リピートのG2C4伸長およびすべてのリーディングフレームにおけるタンパク質発現[たとえば、3つのフレームにおいて翻訳されたG2C4EXP転写物は、Gly-Pro(GP)、Pro-Ala(PA)およびPro-Arg(PR)RANタンパク質をもたらす]をモニタリングするための3つの異なるC末端エピトープ8タグの上流に6X STOPコドンカセット(各フレームに2つの停止)を挿入することにより、ATG開始コドンを欠いている、三重タグ化G2C4ミニ遺伝子、(G2C4)EXP-3Tを生成した(図13A)。免疫ブロッティングは、2つのエピトープタグ化RANタンパク質、PR-MycおよびGP-Flagを検出したが、PAHAは検出しなかった(図13B)。(PR)40-および(PR)70-3xMycタンパク質は、それぞれ、およそ20および27kDaの予測サイズで移動した。対照的に、(GP)40-および(GP)70-3xFlagタンパク質は、予測サイズ(10~15kDa)よりも実質的に高く、それぞれ、50および75kDaで移動した(図13B)。このブロット上のかすかな低い分子量バンドは、細菌培養中に見られるリピート収縮または翻訳開始位置の差異により生じうる。免疫蛍光(IF)は、アンチセンスRANタンパク質が、すべての3つのリーディングフレームにおいて発現することを示した(図13C)。ウエスタンブロッティングでは検出されなかったIFによるPA-HAの検出は、これらコンストラクトからRAN PA-HAを発現する細胞のより低い頻度により引き起こされうる。加えて、組換えGP-flagおよびPA-HAタンパク質は、細胞質に局在していた一方で、PR-Mycタンパク質は、核および細胞質の両方に分布していた。これらの局在の差異は、このエピトープタグ化コンストラクトにおいて見出されるリピートモチーフまたはC末端フランキング配列の異なる特性により生じうる。一連の追加実験においてまた、30、60および120リピートを含有するセンスG4C2伸長コンストラクトが、GP-Flag、GR-HAおよびGA-Myc RANタンパク質を発現させることが示された(図20)。要約すると、これらのデータは、組換えG2C4およびG4C2伸長転写物が、6つのすべてのリーディングフレームにおいてRANタンパク質を発現させることを示した。
RANタンパク質を検出するための二重免疫学的方略
アミノ酸リピートが様々な異なるタンパク質に見出されうるので、二重免疫学的方略を使用し、本明細書に記載の予測されるリピートモチーフまたはそれらに対応する固有のC末端領域を認識する抗体を開発した。8つの推定C9ORF72 RANタンパク質を示す概略図を、図13Dおよび図21に示す。予測されるタンパク質には、6つの推定RANタンパク質および追加のATG開始N末端を有する2つの推定タンパク質が含まれる。固有のC末端領域は、6つの予測されるリーディングフレームのうちの5つにおいて予測される。インビボでのこれらのタンパク質の蓄積について試験するため、予測されるリピートモチーフまたは利用可能な対応するC末端領域に対する一連のポリクローナル抗体を開発した(図13D、図21)。推定アンチセンスタンパク質[ウサギα-PA、α-PA-CT、α-PR、α-PR-CT、α-GP、α-GP-CT(センス)、およびマウスα-GP]について試験する抗体を生成し、それらの特異性が、ウエスタンブロットおよびIF検出により、エピトープタグ化組換えタンパク質を発現するコンストラクトをトランスフェクトした細胞内で実証された(図13E、図22)。センス方向に発現するリピートおよびC末端領域を検出する追加の抗体を、図23に特徴付ける。
アミノ酸リピートが様々な異なるタンパク質に見出されうるので、二重免疫学的方略を使用し、本明細書に記載の予測されるリピートモチーフまたはそれらに対応する固有のC末端領域を認識する抗体を開発した。8つの推定C9ORF72 RANタンパク質を示す概略図を、図13Dおよび図21に示す。予測されるタンパク質には、6つの推定RANタンパク質および追加のATG開始N末端を有する2つの推定タンパク質が含まれる。固有のC末端領域は、6つの予測されるリーディングフレームのうちの5つにおいて予測される。インビボでのこれらのタンパク質の蓄積について試験するため、予測されるリピートモチーフまたは利用可能な対応するC末端領域に対する一連のポリクローナル抗体を開発した(図13D、図21)。推定アンチセンスタンパク質[ウサギα-PA、α-PA-CT、α-PR、α-PR-CT、α-GP、α-GP-CT(センス)、およびマウスα-GP]について試験する抗体を生成し、それらの特異性が、ウエスタンブロットおよびIF検出により、エピトープタグ化組換えタンパク質を発現するコンストラクトをトランスフェクトした細胞内で実証された(図13E、図22)。センス方向に発現するリピートおよびC末端領域を検出する追加の抗体を、図23に特徴付ける。
アンチセンスG2C4RANタンパク質は脳内に蓄積する
複数のアプローチを、新規アンチセンス(AS)タンパク質がC9ORF72伸長陽性生検組織において発現するかどうかを決定するために使用した。凝集タンパク質がヒト脳から単離することが困難であるという障害を克服するため、冷凍C9(+)およびC9(-)ALS前頭皮質剖検試料上で連続的タンパク質抽出プロトコル(sequential protein extraction protocol)(23)を使用した。アンチセンスPAおよびPRタンパク質を、1%Triton-X100不溶性物質、2%SDS可溶性抽出物、免疫ドットブロット上のα-PA、α-PA-CT、α-PR、α-PR-CTで、C9(+)ALS患者のサブセットから検出したが、C9(-)ALS患者からは検出しなかった(図14A)。C9(+)ALS/FTD前頭皮質におけるセンスRANタンパク質(GP、GR、GA)10蓄積についての証拠を示す追加の免疫ドットブロットを図24に示す。α-PA、α-PRおよびα-GP抗体もまた、8%SDSを含有する試料緩衝液におけるペレットの再懸濁後に、C9(+)ALS前頭皮質試料からの2%SDS不溶性画分における高分子量スミアを検出した(23)(図3B)。1つまたは複数のバンドとして移動する組換えタンパク質について移動パターンの差異が見られ(図13B)、患者組織抽出物において観察されたスミア(図14B)は、患者試料および高度に不溶性の凝集体からのそれらの抽出物における、はるかに長いリピート領域によるRANタンパク質における差異を反映する。免疫組織化学(IHC)が、次に、タンパク凝集体が、リピートモチーフに対する抗体(α-PA、α-PR、α-GP)を、PAおよびPRリピート領域を越える予測されるC末端配列に対する抗体(α-PA-CTおよびα-PR-CT)とともに使用して、C9(+)ALS/FTD剖検組織からの海馬神経細胞の周核体において検出可能であるが、C9(-)ALS患者または対照対象において検出可能でないことを示すために使用された(図14C、図25)。GPリピートモチーフに対する抗体を使用する以前の研究は、センス鎖から発現すると仮定される凝集体を検出した(10、11)。GPリピート含有タンパク質が、センスおよびアンチセンス転写物の両方から発現すると予測されることが注目される(図13D)。センス方向に、予測されるRAN GPタンパク質は、固有のC末端(CT)配列を含有する。対照的に、アンチセンスGPタンパク質は、リピートの直後に停止コドンを有する。センスGP RANタンパク質をアンチセンスGPタンパク質と識別するため、ウサギα-GP-CTをセンスGPタンパク質のCT領域を検出するために、マウスα-GPをセンスおよびアンチセンスGP伸長タンパク質の両方を検出するために使用して、C9(+)ヒト海馬剖検切片上で二重標識IF実験を実施した。二重標識化は、2つのタイプの封入体を示した。すなわち、a)マウスα-GPおよびウサギα-GP-CTセンスで二重標識化された推定センス封入体ならびに、b)マウスα-GPで単一標識化された推定アンチセンス封入体(図14D)。およそ18%の封入体が、二重標識化でセンスパターンを示し、82% 11の封入体が、アンチセンスパターンを示し、α-GPについて陽性、α-GP-CTセンスについて陰性であった(図14E、F)。これらのデータは、リピートおよびC末端抗体の両方を有するタンパク質凝集体を特徴付けることの重要性を示した。まとめると、これらの結果は、不溶性、凝集体形成アンチセンスRANタンパク質が、3つのすべてのアンチセンスリーディングフレームから発現することを示す。
複数のアプローチを、新規アンチセンス(AS)タンパク質がC9ORF72伸長陽性生検組織において発現するかどうかを決定するために使用した。凝集タンパク質がヒト脳から単離することが困難であるという障害を克服するため、冷凍C9(+)およびC9(-)ALS前頭皮質剖検試料上で連続的タンパク質抽出プロトコル(sequential protein extraction protocol)(23)を使用した。アンチセンスPAおよびPRタンパク質を、1%Triton-X100不溶性物質、2%SDS可溶性抽出物、免疫ドットブロット上のα-PA、α-PA-CT、α-PR、α-PR-CTで、C9(+)ALS患者のサブセットから検出したが、C9(-)ALS患者からは検出しなかった(図14A)。C9(+)ALS/FTD前頭皮質におけるセンスRANタンパク質(GP、GR、GA)10蓄積についての証拠を示す追加の免疫ドットブロットを図24に示す。α-PA、α-PRおよびα-GP抗体もまた、8%SDSを含有する試料緩衝液におけるペレットの再懸濁後に、C9(+)ALS前頭皮質試料からの2%SDS不溶性画分における高分子量スミアを検出した(23)(図3B)。1つまたは複数のバンドとして移動する組換えタンパク質について移動パターンの差異が見られ(図13B)、患者組織抽出物において観察されたスミア(図14B)は、患者試料および高度に不溶性の凝集体からのそれらの抽出物における、はるかに長いリピート領域によるRANタンパク質における差異を反映する。免疫組織化学(IHC)が、次に、タンパク凝集体が、リピートモチーフに対する抗体(α-PA、α-PR、α-GP)を、PAおよびPRリピート領域を越える予測されるC末端配列に対する抗体(α-PA-CTおよびα-PR-CT)とともに使用して、C9(+)ALS/FTD剖検組織からの海馬神経細胞の周核体において検出可能であるが、C9(-)ALS患者または対照対象において検出可能でないことを示すために使用された(図14C、図25)。GPリピートモチーフに対する抗体を使用する以前の研究は、センス鎖から発現すると仮定される凝集体を検出した(10、11)。GPリピート含有タンパク質が、センスおよびアンチセンス転写物の両方から発現すると予測されることが注目される(図13D)。センス方向に、予測されるRAN GPタンパク質は、固有のC末端(CT)配列を含有する。対照的に、アンチセンスGPタンパク質は、リピートの直後に停止コドンを有する。センスGP RANタンパク質をアンチセンスGPタンパク質と識別するため、ウサギα-GP-CTをセンスGPタンパク質のCT領域を検出するために、マウスα-GPをセンスおよびアンチセンスGP伸長タンパク質の両方を検出するために使用して、C9(+)ヒト海馬剖検切片上で二重標識IF実験を実施した。二重標識化は、2つのタイプの封入体を示した。すなわち、a)マウスα-GPおよびウサギα-GP-CTセンスで二重標識化された推定センス封入体ならびに、b)マウスα-GPで単一標識化された推定アンチセンス封入体(図14D)。およそ18%の封入体が、二重標識化でセンスパターンを示し、82% 11の封入体が、アンチセンスパターンを示し、α-GPについて陽性、α-GP-CTセンスについて陰性であった(図14E、F)。これらのデータは、リピートおよびC末端抗体の両方を有するタンパク質凝集体を特徴付けることの重要性を示した。まとめると、これらの結果は、不溶性、凝集体形成アンチセンスRANタンパク質が、3つのすべてのアンチセンスリーディングフレームから発現することを示す。
G2C4伸長およびRANタンパク質は、細胞に対して毒性を有する
RAN翻訳により発現するアンチセンスGPおよびPR RANタンパク質に加えて、2つのアンチセンスリーディングフレームが、ATG開始GPおよびPRタンパク質(M-GPASおよびM-PRAS)の両方をもたらしうる上流ATG開始コドンを有する(図13D、図21)。ATG開始コドンの存在が、RAN翻訳が3つすべてのリーディングフレームにおいて生じることを阻害しないことが示された(9)。したがって、アンチセンスGPおよびPRタンパク質は、AUG開始および/またはRAN翻訳の両方により発現してもよい。ATG開始コドンがG2C4伸長に関してRANタンパク質発現に対して有する効果を探究するため、ATG開始コドンをG2C4リピートの前に置くことにより、追加のミニ遺伝子コンストラクトを生成した(図14G)。PRフレームを、解析のために選択した。なぜなら、ATG開始コドンはこのリーティングフレームにおいて天然で生じるからである。ウエスタンブロッティングは、(+)ATG-PR-3TをトランスフェクトしたHEK293T細胞が、(-)ATG-PR-3Tトランスフェクト細胞と比較して、実質的により高いレベルのPRタンパク質を発現することを示す(図14H)。対照的に、qRT-PCRおよびウエスタンブロッティングは、転写物レベル(図26A)およびRAN翻訳GPのレベル(図14H)が同等であることを示した。図13と同様に、RAN翻訳PAは、ウエスタンブロッティングにより検出可能ではなかった。次に、細胞生存率に対するこれらコンストラクトの効果を、相補性アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)検出およびメチルチアゾールテトラゾリウム(MTT)を使用して試験した。LDHアッセイについては、(-)ATG-PR-3Tまたは(+)ATG-PR-3Tコンストラクトをトランスフェクトした細胞は、ベクター対照細胞と比較して、それぞれ1.9および2.9倍の細胞死の増加を示した(p=0.008および0.001)。加えて、上昇したレベルのPRタンパク質を発現する(+)ATG-PR-3Tトランスフェクト細胞は、(-)ATG-PR-3Tコンストラクトをトランスフェクトした細胞と比較して1.5倍の細胞12死の増加を示した(p=0.034)。MTTアッセイは、同様の結果を示した。(-)ATG-PR-3Tおよび+ATG-PR-3Tコンストラクトをトランスフェクトした細胞は、代謝的に活性な細胞の数の劇的な減少を示し、未処置細胞または空ベクター対照と比較してそれぞれ33%(p<0.00001)および43%(p<0.00001)であった(図14J)。加えて、(+)ATG-PR-3Tをトランスフェクトした細胞内の上昇したPR発現は、(-)ATG-PR-3T細胞と比較して有意に低いレベルの代謝活性を有していた(p<0.05)。光学顕微鏡細胞分離により、対照細胞と比較して-ATG-PR-3Tにおける細胞形態の変化が明白であり、これらの表現型は、上昇したレベルのPRを発現する(+)ATG-PR-3T細胞において悪化した(図26B~D)。まとめると、これらのデータは、以下のことを実証した。すなわち、1)G2C4伸長突然変異は、細胞に対して毒性を有し、この毒性は、DNA、G2C4RNAおよび/またはRAN翻訳PR、GPまたはPAタンパク質の効果により引き起こされうる、2)(+)ATG-PR-3Tコンストラクトをトランスフェクトした細胞内で発現する増加したPRタンパク質は、DNA、G2C4RNAおよびRANタンパク質効果により引き起こされるレベルを超えて細胞毒性および細胞死を増加させる。したがって、PRタンパク質は、本質的に細胞に対して毒性を有することが示された。
RAN翻訳により発現するアンチセンスGPおよびPR RANタンパク質に加えて、2つのアンチセンスリーディングフレームが、ATG開始GPおよびPRタンパク質(M-GPASおよびM-PRAS)の両方をもたらしうる上流ATG開始コドンを有する(図13D、図21)。ATG開始コドンの存在が、RAN翻訳が3つすべてのリーディングフレームにおいて生じることを阻害しないことが示された(9)。したがって、アンチセンスGPおよびPRタンパク質は、AUG開始および/またはRAN翻訳の両方により発現してもよい。ATG開始コドンがG2C4伸長に関してRANタンパク質発現に対して有する効果を探究するため、ATG開始コドンをG2C4リピートの前に置くことにより、追加のミニ遺伝子コンストラクトを生成した(図14G)。PRフレームを、解析のために選択した。なぜなら、ATG開始コドンはこのリーティングフレームにおいて天然で生じるからである。ウエスタンブロッティングは、(+)ATG-PR-3TをトランスフェクトしたHEK293T細胞が、(-)ATG-PR-3Tトランスフェクト細胞と比較して、実質的により高いレベルのPRタンパク質を発現することを示す(図14H)。対照的に、qRT-PCRおよびウエスタンブロッティングは、転写物レベル(図26A)およびRAN翻訳GPのレベル(図14H)が同等であることを示した。図13と同様に、RAN翻訳PAは、ウエスタンブロッティングにより検出可能ではなかった。次に、細胞生存率に対するこれらコンストラクトの効果を、相補性アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)検出およびメチルチアゾールテトラゾリウム(MTT)を使用して試験した。LDHアッセイについては、(-)ATG-PR-3Tまたは(+)ATG-PR-3Tコンストラクトをトランスフェクトした細胞は、ベクター対照細胞と比較して、それぞれ1.9および2.9倍の細胞死の増加を示した(p=0.008および0.001)。加えて、上昇したレベルのPRタンパク質を発現する(+)ATG-PR-3Tトランスフェクト細胞は、(-)ATG-PR-3Tコンストラクトをトランスフェクトした細胞と比較して1.5倍の細胞12死の増加を示した(p=0.034)。MTTアッセイは、同様の結果を示した。(-)ATG-PR-3Tおよび+ATG-PR-3Tコンストラクトをトランスフェクトした細胞は、代謝的に活性な細胞の数の劇的な減少を示し、未処置細胞または空ベクター対照と比較してそれぞれ33%(p<0.00001)および43%(p<0.00001)であった(図14J)。加えて、(+)ATG-PR-3Tをトランスフェクトした細胞内の上昇したPR発現は、(-)ATG-PR-3T細胞と比較して有意に低いレベルの代謝活性を有していた(p<0.05)。光学顕微鏡細胞分離により、対照細胞と比較して-ATG-PR-3Tにおける細胞形態の変化が明白であり、これらの表現型は、上昇したレベルのPRを発現する(+)ATG-PR-3T細胞において悪化した(図26B~D)。まとめると、これらのデータは、以下のことを実証した。すなわち、1)G2C4伸長突然変異は、細胞に対して毒性を有し、この毒性は、DNA、G2C4RNAおよび/またはRAN翻訳PR、GPまたはPAタンパク質の効果により引き起こされうる、2)(+)ATG-PR-3Tコンストラクトをトランスフェクトした細胞内で発現する増加したPRタンパク質は、DNA、G2C4RNAおよびRANタンパク質効果により引き起こされるレベルを超えて細胞毒性および細胞死を増加させる。したがって、PRタンパク質は、本質的に細胞に対して毒性を有することが示された。
6つのすべてのRANタンパク質が脳内に凝集体を形成する
センスおよびアンチセンスRNA鎖の両方からの6つのすべてのRANタンパク質が、C9(+)ALS患者において発現するかどうかを決定するため、これらタンパク質のリピート伸長および/またはC末端配列に対する9つのポリクローナル抗体を使用して、パラフィン埋込み脳組織の切片上でIHC染色を実施した。C9(+)症例において、豊富な球状および不規則的形状の神経細胞細胞質封入体(NCI)が海馬に存在し、その大多数が歯状回およびCA領域の錐体細胞内に存在した。これらRAN封入体はまた、C9(+)運動皮質において検出された(図15)。α-GPを使用して、海馬において、運動皮質においてと同様に、GP陽性封入体がすべての検査されたC9(+)症例において検出されたが、C9(-)症例または正常対照切片においては検出されなかった。13海馬のCA領域および運動皮質において、凝集体のクラスターが、C9(+)症例において、>20%の神経細胞において凝集体を伴って、頻繁に見出された(図27)。より少ない凝集体が、α-GP-CTセンス抗体を使用して検出され、これは、ほとんどのGP凝集体がC9ORF72アンチセンス鎖から翻訳されたことを示した二重標識化実験と一致している(図14D~F)。PA封入体が、6つのC9(+)症例のうち4つにおける海馬および2つの運動皮質試料のうち1つに検出された(図27)。C9(+)症例において、PA封入体の頻度は、GP封入体と比較して、海馬および運動皮質において有意に低かったが、>50%の神経細胞に見出される極度に大きなPA封入体を伴う高強度領域染色(high-intensity regional staining)が、1人の患者に見出された(図27)。PR陽性封入体がまた、検査されたすべてのC9(+)症例における海馬および試験された2つのC9(+)症例のうちの1つにおける運動皮質に見出された。PA染色と同様に、PR封入体は、頻度は低いが、強度の高い領域染色が時折観察された。センス方向に、GR陽性封入体が、検査されたすべてのC9(+)症例において、海馬および運動皮質に見出されたが、GP凝集体よりも頻度は低いようであった。GA封入体は、IHCにより小さな核周囲封入体として海馬および運動皮質において時折検出されたのみであった(図15、図27)。様々なタイプの凝集体の頻度の見かけ上の差異は、タンパク質コンフォメーションおよびエピトープ利用可能性の差異または異なるエピトープに対し設計されたこれら抗体の親和性の差異により生じうる。まとめると、このデータは、6つのすべてのRANタンパク質がC9(+)剖検脳内に凝集体を形成することを示した。
センスおよびアンチセンスRNA鎖の両方からの6つのすべてのRANタンパク質が、C9(+)ALS患者において発現するかどうかを決定するため、これらタンパク質のリピート伸長および/またはC末端配列に対する9つのポリクローナル抗体を使用して、パラフィン埋込み脳組織の切片上でIHC染色を実施した。C9(+)症例において、豊富な球状および不規則的形状の神経細胞細胞質封入体(NCI)が海馬に存在し、その大多数が歯状回およびCA領域の錐体細胞内に存在した。これらRAN封入体はまた、C9(+)運動皮質において検出された(図15)。α-GPを使用して、海馬において、運動皮質においてと同様に、GP陽性封入体がすべての検査されたC9(+)症例において検出されたが、C9(-)症例または正常対照切片においては検出されなかった。13海馬のCA領域および運動皮質において、凝集体のクラスターが、C9(+)症例において、>20%の神経細胞において凝集体を伴って、頻繁に見出された(図27)。より少ない凝集体が、α-GP-CTセンス抗体を使用して検出され、これは、ほとんどのGP凝集体がC9ORF72アンチセンス鎖から翻訳されたことを示した二重標識化実験と一致している(図14D~F)。PA封入体が、6つのC9(+)症例のうち4つにおける海馬および2つの運動皮質試料のうち1つに検出された(図27)。C9(+)症例において、PA封入体の頻度は、GP封入体と比較して、海馬および運動皮質において有意に低かったが、>50%の神経細胞に見出される極度に大きなPA封入体を伴う高強度領域染色(high-intensity regional staining)が、1人の患者に見出された(図27)。PR陽性封入体がまた、検査されたすべてのC9(+)症例における海馬および試験された2つのC9(+)症例のうちの1つにおける運動皮質に見出された。PA染色と同様に、PR封入体は、頻度は低いが、強度の高い領域染色が時折観察された。センス方向に、GR陽性封入体が、検査されたすべてのC9(+)症例において、海馬および運動皮質に見出されたが、GP凝集体よりも頻度は低いようであった。GA封入体は、IHCにより小さな核周囲封入体として海馬および運動皮質において時折検出されたのみであった(図15、図27)。様々なタイプの凝集体の頻度の見かけ上の差異は、タンパク質コンフォメーションおよびエピトープ利用可能性の差異または異なるエピトープに対し設計されたこれら抗体の親和性の差異により生じうる。まとめると、このデータは、6つのすべてのRANタンパク質がC9(+)剖検脳内に凝集体を形成することを示した。
上位および下位運動神経細胞におけるRANタンパク質の封入体
ALSの中心的な特徴は、運動皮質における上位運動神経細胞および脳幹および脊髄における下位運動神経細胞の漸進的な縮退および死である。上位および下位運動神経細胞にRANタンパク質が蓄積するかどうかを試験するため、センスおよびアンチセンスの両方の方向の予測されるタンパク質に対する9つのすべての抗体を使用してIHCを実施した。C9(+)症例において、豊富なGP陽性神経細胞細胞質封入体が、運動皮質のすべての層において見られ、第III層の錐体神経細胞および第V層全体において頻度の高いGP凝集体を伴っていた(図16A)。細胞死および萎縮が第V層の運動神経細胞の同定を困難にするとはいえ、残りの上位運動神経細胞におけるGP封入体が見出された(図16B)。加えて、PA、PR、GRおよびGA陽性封入体もまた、運動皮質に見出された(図15、図27)。脊髄切片において実施された同様の一連の実験を使用して、検査された3つすべての症例におけるGP凝集体および3人のC9(+)患者のうち2人における下位運動神経細胞の凝集体が検出されたが、C9(-)ALS症例または正常対照においては検出されなかった(図16C)。これが、運動神経細胞内のRANタンパク質蓄積の最初の報告である。上位および下位運動神経細胞の両方におけるGP凝集体の発見は、C9 RANタンパク質蓄積を、ALSにおいて選択的に脆弱な神経細胞と結び付ける。
ALSの中心的な特徴は、運動皮質における上位運動神経細胞および脳幹および脊髄における下位運動神経細胞の漸進的な縮退および死である。上位および下位運動神経細胞にRANタンパク質が蓄積するかどうかを試験するため、センスおよびアンチセンスの両方の方向の予測されるタンパク質に対する9つのすべての抗体を使用してIHCを実施した。C9(+)症例において、豊富なGP陽性神経細胞細胞質封入体が、運動皮質のすべての層において見られ、第III層の錐体神経細胞および第V層全体において頻度の高いGP凝集体を伴っていた(図16A)。細胞死および萎縮が第V層の運動神経細胞の同定を困難にするとはいえ、残りの上位運動神経細胞におけるGP封入体が見出された(図16B)。加えて、PA、PR、GRおよびGA陽性封入体もまた、運動皮質に見出された(図15、図27)。脊髄切片において実施された同様の一連の実験を使用して、検査された3つすべての症例におけるGP凝集体および3人のC9(+)患者のうち2人における下位運動神経細胞の凝集体が検出されたが、C9(-)ALS症例または正常対照においては検出されなかった(図16C)。これが、運動神経細胞内のRANタンパク質蓄積の最初の報告である。上位および下位運動神経細胞の両方におけるGP凝集体の発見は、C9 RANタンパク質蓄積を、ALSにおいて選択的に脆弱な神経細胞と結び付ける。
RANタンパク質凝集体の高密度クラスター化
センスおよびアンチセンスタンパク質の両方が、C9ORF72剖検脳の神経細胞内に蓄積した。一般に2つのタイプの凝集パターンが観察された。すなわち、1)単離細胞質凝集体および2)約10から50%を超える神経細胞が陽性であった高密度クラスター化細胞質凝集体クラスター化凝集体は、GPについて最も頻度が高く検出され、歯状回(DG)および海馬のCA1~4に見出された(図16D、E)。DGにおけるクラスター化GP凝集体は、CA領域の大きな細胞質凝集体よりも小さく頻度が低かった。追加のクラスター化GP凝集体が、海馬の海馬台および前海馬台において、15運動皮質におけるのと同様に頻繁に見出された。連続切片の免疫染色は、複数のタンパク質が多くの場合同じ領域に見出されることを示した。たとえば、PA、PR、GP、GAおよびGRタンパク質についての強度の高いクラスター化染色は、1人のC9(+)患者からの連続切片において前海馬台の同じ領域に見出された(図16F、Gを参照のこと)。PAについての免疫染色は、いくつかの脳領域が豊富な凝集体を有する一方で、同じ切片の他の領域には相対的に変化がないことを示した。たとえば、図17Aは、1人の患者の単一の切片の海馬領域全体にわたるPA封入体の勾配(前海馬台>海馬台>CA1)を示す。この患者におけるPA封入体は、前海馬台(I)において数が多く(>50%の神経細胞)、(II)海馬台において中程度であり、CA1海馬領域(IIIおよびIV)においてはまれである。この切片に見られる限局的な領域染色と一致して、PA染色は、同じ患者から採取された海馬組織の別個のブロックからの切片においては検出されなかった。これらのデータは、PA RANタンパク質の発現が細胞によって可変的であること、または、パーキンソン病のモデルマウスにおいて提案されてきたように、1つの細胞内のPAの凝集が隣接する細胞内の凝集をトリガーすることを示す(24)。次に、このC9(+)症例からの連続切片を、リピートモチーフ(α-PA、α-PR、α-GP、α-GR)および対応するC末端領域(α-PA-CT、α-PR-CT、α-GP-CT、α-GR-CT、α-GA-CT)の両方に対する抗体が、前海馬台の同じ濃い染色領域(領域I)において凝集体を検出することを示すために使用した(図17B)。これらの結果は、センスおよびアンチセンスRANタンパク質凝集体の両方が、この領域に蓄積することを示した。リピートモチーフまたは特異的C末端領域のいずれかを認識する抗体を使用した同様の凝集体の検出は、これらの抗体が、G2C4およびG4C2伸長転写物の両方にわたって発現するタンパク質を認識していることを確認し、C9ORF72 ALS/FTDにおけるRAN翻訳の生物学的影響を理解するための新規ツールを提供する。
センスおよびアンチセンスタンパク質の両方が、C9ORF72剖検脳の神経細胞内に蓄積した。一般に2つのタイプの凝集パターンが観察された。すなわち、1)単離細胞質凝集体および2)約10から50%を超える神経細胞が陽性であった高密度クラスター化細胞質凝集体クラスター化凝集体は、GPについて最も頻度が高く検出され、歯状回(DG)および海馬のCA1~4に見出された(図16D、E)。DGにおけるクラスター化GP凝集体は、CA領域の大きな細胞質凝集体よりも小さく頻度が低かった。追加のクラスター化GP凝集体が、海馬の海馬台および前海馬台において、15運動皮質におけるのと同様に頻繁に見出された。連続切片の免疫染色は、複数のタンパク質が多くの場合同じ領域に見出されることを示した。たとえば、PA、PR、GP、GAおよびGRタンパク質についての強度の高いクラスター化染色は、1人のC9(+)患者からの連続切片において前海馬台の同じ領域に見出された(図16F、Gを参照のこと)。PAについての免疫染色は、いくつかの脳領域が豊富な凝集体を有する一方で、同じ切片の他の領域には相対的に変化がないことを示した。たとえば、図17Aは、1人の患者の単一の切片の海馬領域全体にわたるPA封入体の勾配(前海馬台>海馬台>CA1)を示す。この患者におけるPA封入体は、前海馬台(I)において数が多く(>50%の神経細胞)、(II)海馬台において中程度であり、CA1海馬領域(IIIおよびIV)においてはまれである。この切片に見られる限局的な領域染色と一致して、PA染色は、同じ患者から採取された海馬組織の別個のブロックからの切片においては検出されなかった。これらのデータは、PA RANタンパク質の発現が細胞によって可変的であること、または、パーキンソン病のモデルマウスにおいて提案されてきたように、1つの細胞内のPAの凝集が隣接する細胞内の凝集をトリガーすることを示す(24)。次に、このC9(+)症例からの連続切片を、リピートモチーフ(α-PA、α-PR、α-GP、α-GR)および対応するC末端領域(α-PA-CT、α-PR-CT、α-GP-CT、α-GR-CT、α-GA-CT)の両方に対する抗体が、前海馬台の同じ濃い染色領域(領域I)において凝集体を検出することを示すために使用した(図17B)。これらの結果は、センスおよびアンチセンスRANタンパク質凝集体の両方が、この領域に蓄積することを示した。リピートモチーフまたは特異的C末端領域のいずれかを認識する抗体を使用した同様の凝集体の検出は、これらの抗体が、G2C4およびG4C2伸長転写物の両方にわたって発現するタンパク質を認識していることを確認し、C9ORF72 ALS/FTDにおけるRAN翻訳の生物学的影響を理解するための新規ツールを提供する。
論述
C9ORF72におけるイントロンマイクロサテライト伸長突然変異が、一般的な形態の家族性および散発性ALS/FTDの両方を引き起こすことの発見については、かなりの興奮があった(1、2)。この疾患について検討されている3つの主要な病理学的機構には、ハプロ不全(1、2)、RNA機能獲得(5~8)、およびRAN翻訳(9、11~13)が含まれる。これまでのところ、この疾患の分子機構を理解しようとする努力は、センス方向のC9ORF72伸長突然変異の結果の理解にのみ焦点を当ててきた。本明細書において報告された結果は、C9ORF72伸長突然変異がまた、アンチセンス方向に発現することを示し、アンチセンスRNA凝集およびアンチセンスRANタンパク質がC9ORF72 ALS/FTDに寄与することを示す。本発明者らは、以下のことを初めて示す。すなわち、1)アンチセンスC9ORF72はC9(+)剖検組織において上昇するが、センス転写物は上昇しない、2)アンチセンスG2C4伸長転写物は、C9+脳内および血中に蓄積するRNA凝集を形成する、3)RAN翻訳が、細胞培養においてアンチセンスG2G4伸長コンストラクト全体にわたり生じる、4)センスおよびアンチセンスRANタンパク質は、リピートおよびC末端抗体の両方に二重免疫学的アプローチを使用して、C9(+)剖検脳内に蓄積する、5)RANタンパク質凝集体は、上位および下位運動神経細胞に蓄積し、RAN翻訳をALSの重要な病理学的特徴に直接結び付ける。G4C2RNA凝集がC9ORF72 ALS/FTD患者組織において蓄積するという初期の報告(1、2)以来、主たる仮説は、G4C2センス転写物が、DM1、DM2およびSCA8におけるMBNLタンパク質の隔離と同様に、RNA結合タンパク質を隔離して調節不全にするというものである(4)。複数のグループが、G4C2結合タンパク質をすでに報告しており、疾患におけるそれらの潜在的役割を試験している(5~8)。アンチセンスG2C4凝集がまた患者細胞内に蓄積するという発見は、G2C4アンチセンスRNAおよび結合タンパク質が、役割を果たしうることを示す。加えて、C9(+)末梢血におけるセンスおよびアンチセンス凝集の発見は、容易にアクセス可能なC9ORF72 ALS/FTDのバイオマーカーとして有用となりうる。センスおよびアンチセンス転写物の両方をモニタリングするバイオマーカーが、特に重要でありうる。なぜなら、一方の鎖の発現を減少させる処置法は、他方の鎖の発現を減少させうるからである。二重免疫学的アプローチを使用して、G2C4アンチセンス転写物が、RAN翻訳によりおよび/または2つの短いORF(Met-AS-PRおよびMet-AS-GP)から新規アンチセンスタンパク質(PA、PR、GP)を発現させることが示された。
C9ORF72におけるイントロンマイクロサテライト伸長突然変異が、一般的な形態の家族性および散発性ALS/FTDの両方を引き起こすことの発見については、かなりの興奮があった(1、2)。この疾患について検討されている3つの主要な病理学的機構には、ハプロ不全(1、2)、RNA機能獲得(5~8)、およびRAN翻訳(9、11~13)が含まれる。これまでのところ、この疾患の分子機構を理解しようとする努力は、センス方向のC9ORF72伸長突然変異の結果の理解にのみ焦点を当ててきた。本明細書において報告された結果は、C9ORF72伸長突然変異がまた、アンチセンス方向に発現することを示し、アンチセンスRNA凝集およびアンチセンスRANタンパク質がC9ORF72 ALS/FTDに寄与することを示す。本発明者らは、以下のことを初めて示す。すなわち、1)アンチセンスC9ORF72はC9(+)剖検組織において上昇するが、センス転写物は上昇しない、2)アンチセンスG2C4伸長転写物は、C9+脳内および血中に蓄積するRNA凝集を形成する、3)RAN翻訳が、細胞培養においてアンチセンスG2G4伸長コンストラクト全体にわたり生じる、4)センスおよびアンチセンスRANタンパク質は、リピートおよびC末端抗体の両方に二重免疫学的アプローチを使用して、C9(+)剖検脳内に蓄積する、5)RANタンパク質凝集体は、上位および下位運動神経細胞に蓄積し、RAN翻訳をALSの重要な病理学的特徴に直接結び付ける。G4C2RNA凝集がC9ORF72 ALS/FTD患者組織において蓄積するという初期の報告(1、2)以来、主たる仮説は、G4C2センス転写物が、DM1、DM2およびSCA8におけるMBNLタンパク質の隔離と同様に、RNA結合タンパク質を隔離して調節不全にするというものである(4)。複数のグループが、G4C2結合タンパク質をすでに報告しており、疾患におけるそれらの潜在的役割を試験している(5~8)。アンチセンスG2C4凝集がまた患者細胞内に蓄積するという発見は、G2C4アンチセンスRNAおよび結合タンパク質が、役割を果たしうることを示す。加えて、C9(+)末梢血におけるセンスおよびアンチセンス凝集の発見は、容易にアクセス可能なC9ORF72 ALS/FTDのバイオマーカーとして有用となりうる。センスおよびアンチセンス転写物の両方をモニタリングするバイオマーカーが、特に重要でありうる。なぜなら、一方の鎖の発現を減少させる処置法は、他方の鎖の発現を減少させうるからである。二重免疫学的アプローチを使用して、G2C4アンチセンス転写物が、RAN翻訳によりおよび/または2つの短いORF(Met-AS-PRおよびMet-AS-GP)から新規アンチセンスタンパク質(PA、PR、GP)を発現させることが示された。
材料および方法
cDNAコンストラクト。上流6×Stopコドンを含有するCCCGGGGCC(GGGGCC)2GGGGCCC(配列番号64)およびCCCGGGGCC(GGGGCC)28GGGGCCC(配列番号65)断片が、合成され、Integrated DNA TechnologiesによるpIDTSmartベクターへとクローニングされた。6×Stops-(GGGGCC)4-3Tおよび6×Stops-(GGGGCC)30-3Tコンストラクトが、NheI/XhoI断片を、三重エピトープを含有するpcDNA3.1ベクターへとサブクローニングすることにより生成された。GGGGCCリピートのサイズを伸長させるため、SmaI/XhoI断片を、pcDNA-6×Stops-(GGGGCC)EXP-3TのT4 DNAポリメラーゼ/XhoIで平滑末端化したPspOMIへとサブクローニングした。pcDNA-6×Stop-3Tコンストラクト内のGGGGCCリピートの配向を逆転させるため、SmalI/ClaI断片をpBluescript SK+へとサブクローニングし、pBluescript-(GGGGCC)EXPを生成した。AfeI/XhoI断片pBluescript-(GGGGCC)EXPを、pcDNA-6×Stop-3Tへとサブクローニングし、pcDNA-6×Stop-(GGCCCC)EXP-3Tコンストラクトを製造した。
cDNAコンストラクト。上流6×Stopコドンを含有するCCCGGGGCC(GGGGCC)2GGGGCCC(配列番号64)およびCCCGGGGCC(GGGGCC)28GGGGCCC(配列番号65)断片が、合成され、Integrated DNA TechnologiesによるpIDTSmartベクターへとクローニングされた。6×Stops-(GGGGCC)4-3Tおよび6×Stops-(GGGGCC)30-3Tコンストラクトが、NheI/XhoI断片を、三重エピトープを含有するpcDNA3.1ベクターへとサブクローニングすることにより生成された。GGGGCCリピートのサイズを伸長させるため、SmaI/XhoI断片を、pcDNA-6×Stops-(GGGGCC)EXP-3TのT4 DNAポリメラーゼ/XhoIで平滑末端化したPspOMIへとサブクローニングした。pcDNA-6×Stop-3Tコンストラクト内のGGGGCCリピートの配向を逆転させるため、SmalI/ClaI断片をpBluescript SK+へとサブクローニングし、pBluescript-(GGGGCC)EXPを生成した。AfeI/XhoI断片pBluescript-(GGGGCC)EXPを、pcDNA-6×Stop-3Tへとサブクローニングし、pcDNA-6×Stop-(GGCCCC)EXP-3Tコンストラクトを製造した。
RT-PCR。1)剖検組織における鎖特異的RT-PCR:総RNAが、TRIzol(Invitrogen)を使用して、ALS患者および健常対照の前頭皮質剖検組織および末梢血リンパ球(PBL)から単離される両方の鎖から転写物を検出するため、0.25μgの総RNAから、リンカー鎖特異的リバースプライマーを用いたSuperScript IIIシステム(Invitrogen)ならびに鎖特異的フォワードおよびリンカー(LK)プライマーを用いたPCRを使用して、cDNAを生成した。PCR反応は、以下のとおり実施された。すなわち、94℃で3分間、次に、94℃で45秒間、58℃で45秒間および72℃で1分間を35サイクル、続いて72℃で6分。PCR増幅の特異性を検証するため、バンドをクローニングしてシーケンシングした。2)293T細胞における毒性アッセイのためのRT-PCR:miRNeasy Miniキット(Qiagen)を製造者のプロトコルに従って使用して、細胞からの総RNAを抽出した。総RNAを、Superscript III RTキット(Invitrogen)およびランダムヘキサマープライマーを使用して逆転写した。異なるG4C2-3XTagコンストラクトの発現を、3xTag-Fwおよび3xTag-Rvのプライマーセットを使用してRT-PCRおよびqPCRにより解析した。β-アクチン発現を、プライマーセットACTB3およびACTB4を用いて増幅される参照遺伝子として使用した。プライマー配列は、図27に列挙される。
リアルタイムRT-PCR。MyCycler Thermal Cyclerシステム(Bio-Rad)上で、SYBER Green PCR Master Mix(Bio-Rad)およびASORF鎖特異的cDNAおよびプライマーセットを使用して、2ステップ定量PCRを実施した。ヒトベータアクチンプライマーACTB3およびATCB4を用い、オリゴdT合成総cDNAを鋳型として使用して、対照反応を実施した。2段階PCRを、三重にされた各試料cDNA/プライマーペアを有する光学96ウェルプレートにおいて40サイクル(95℃30秒、60℃30秒)実施した。最初に各実験Ct値を、それらのベータアクチンCt値に標準化し、次に健常対象アンチセンスΔΔCtに標準化することにより、相対フォールド変化(relative fold changes)を生成した。プライマー配列は、図28に列挙される。
5’および3’cDNA末端の急速増幅(5’および3’RACE)。2人のC9(+)ALS患者および2人のC9(-)ALS患者の前頭皮質剖検組織からの4μgの総RNAを、5’および3’RACEのために使用した(5’RACEシステムおよび3’RACE、Life Technologies)。5’RACEにおいて、プライマーASORF Rを、遺伝子特異的第1鎖cDNA合成のために使用し、ネスト化リバースプライマーは5’GSP1および5’GSP2である。3’RACEにおいて、ネスト化フォワードプライマーは3’GSP1および3’GSP2である。3’RACEおよび5’RACE産物をゲル抽出し、TOPO TA Cloning(Invitrogen)を用いてクローニングし、シーケンシングした。プライマー配列は、図28に列挙される。
ポリクローナル抗体の産生。ポリクローナルウサギ抗体を、New England Peptideにより生成し、ポリクローナルマウス抗体を、University of FloridaのInterdisciplinary Center for Biotechnology Research(ICBR)により生成した。センス鎖(GGGGCC)において、抗血清を、合成ポリ(GP)、ポリ(GR)ペプチドおよび予測されるGP、GRおよびGA RANタンパク質のC末端領域に対して産生させた(図21)。アンチセンス鎖(GGCCCC)において、抗血清を、合成ポリ(PA)、ポリ(PR)ペプチドおよび予測されるPAおよびPR RANタンパク質のC末端領域に対して産生させた。アンチセンスおよびセンスタンパク質の両方に対する抗体を生成するために使用されるペプチドならびにウエスタンブロット、免疫蛍光(IF)および免疫組織化学(IHC)のためのそれらの使用は、表S3に要約される。
細胞培養およびトランスフェクション。HEK293T細胞を、10%胎仔ウシ血清を添加したDMEM培地中で培養し、5% CO2を含有する湿気のある大気中において37℃でインキュベートした。Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を製造者の指示に従い使用して、DNAトランスフェクションを実施した。
ヒト試料。6人のC9(+)ALS、5人のC9(-)ALS対照および1人の正常対照からの試料が含まれる、生化学的および組織学的解析のための冷凍前頭皮質組織試料を、本研究において使用した。加えて、C9(+)ALS/FTDおよびC9(-)ALS/FTD症例ならびに正常対照からのパラフィン埋込み固定組織。末梢血リンパ球(PBL)を、2000×gでの短い遠心分離後の新しく回収された全血の軟膜から単離した。赤血球(RBC)を、優先的には、RBC Lysis Buffer(Roche)を使用して溶解し除去し、PBLを遠心分離し、PBSで一度洗浄し、スライド上で乾燥させた。本研究は、ヘルシンキ宣言を遵守して実施された。University of FloridaおよびJohns Hopkins Universityの施設内審査委員会が本件球を認可した。筆記されたインフォームドコンセントを参加者または関係者から登録時に得た。
免疫蛍光。高分子タンパク質の細胞内分布を、トランスフェクトHEK293T細胞内で免疫蛍光により評価した。細胞を8ウェル組織培養チャンバー上にプレートし、翌日プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクション48時間後、PBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で30分間細胞を固定し、PBS中の0.5%triton X-100中において15分間氷上で透過処理した。細胞をPBS中の1%正常ヤギ血清中で30分間ブロッキングした。ブロッキング後、細胞を1時間室温で、ウサギ抗Myc(Abcam)、マウス抗HA(Covance)、マウス抗Flag(Sigma)、ウサギ抗GRおよびウサギ抗GR-CT一次抗体を、1:400の希釈度で含有するブロッキング溶液中でインキュベートした。スライドをPBS中で3回洗浄し、1時間室温で、Cy3にコンジュゲートされたヤギ抗ウサギ(Jackson ImmunoResearch、PA)およびAlexa Fluor 488(Invitrogen)にコンジュゲートされたヤギ抗マウス二次抗体を1:200の希釈度で含有するブロッキング溶液中でインキュベートした。スライドをPBS中で3回洗浄し、DAPIを含有する封入剤(Invitrogen)を用いて封入した。
RNA-FISH。細胞を有するスライドを、PBS中の4%PFA中で10分間固定し、前もって冷蔵した70%エタノール中において30分間氷上でインキュベートした。2XSSC中の40%ホルムアミド中での10分間の再水和後、スライドを、ハイブリダイゼーション溶液(40%ホルムアミド、2XSSC、10mg/ml BSA、100mg/ml硫酸デキストランおよび10mg/ml酵母tRNA)を用いて10分間55℃でブロッキングし、次に200ng/ml変性RNAプローブとともにハイブリダイゼーション溶液中において55℃で2時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、スライドを2XSSC中の40%ホルムアミドで3回洗浄し、PBS中で1回簡単に洗浄した。リポフスチンの自己蛍光を、70%エタノール中の0.25%のスーダンブラックBにより消光させ、スライドを、DAPIを含有する封入剤(Invitrogen)で封入した。RNA凝集の特異性を、FISH検出前にRNAse(2×SSC中100μg/mL)、DNase(DNaseI緩衝液中1U/μl)またはプロテアーゼK(2mM CaCl2、20mMトリス中120μg/mL、pH7.5)を用いて細胞を処理することにより決定した。処理細胞を、37℃で30分間インキュベートし、PBSで3回、次に2×SSCで3回洗浄した。続くFISH検出は、上述のとおり実施した。アンチセンス凝集特異性を、最初にスライドを10倍過量非標識化(G4C2)4オリゴとハイブリダイズさせ、その後G4C2-cy3(アンチセンスプローブ)またはG2C4-cy3(センスプローブ)とハイブリダイズさせる、標準的FISH検出を使用して決定した。続く処理および検出は、上述のとおり実施した。
ウエスタンブロッティング。6ウェル組織培養プレートの各ウェルのトランスフェクト細胞をPBSですすぎ、プロテアーゼ阻害剤カクテルを伴う300μLのRIPA緩衝液中において45分間氷上で溶解させた。21ゲージ針を通過させることによりDNAを剪断した。細胞溶解物を16,000×gで15分間、4℃で遠心分離し、上清を回収した。細胞溶解物のタンパク質濃度を、タンパク質アッセイ染料試薬(Bio-Rad)を使用して決定した。20マイクログラムのタンパク質を4~12%NuPAGE Bis-Trisゲル(Invitrogen)中で分離し、ニトロセルロース膜(Amersham)に移した。膜を、0.05%Tween-20を含有するPBS(PBS-T)中の5%粉乳中でブロッキングし、ブロッキング溶液中で抗Flag(1:2000)、抗Myc(1:1000)、抗HA(1:1000)、またはウサギポリクローナル抗体(1:1000)を用いてプローブした。膜を抗ウサギまたは抗マウスHRPコンジュゲート二次抗体(Amersham)とともにインキュベートした後に、バンドをECLプラスWestern Blotting Detection System(Amersham)により視覚化した。患者前頭皮質剖検組織の連続抽出を以下のとおり実施した。すなわち、組織を1%Triton-X100、15mM MgCl2、0.2mg/mlDNase Iおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するPBS中で均質化し、16,000×gで15分間、4℃で遠心分離した。上清を回収した。ペレットを2%SDS中に再懸濁させ、室温で1時間インキュベートし、次に16,000×gで15分間、4℃で遠心分離した。上清を回収し、タンパク質ブロッティングのため、2%SDS不溶性ペレットを8%SDS、62.5mM トリスHCl pH6.8、10%グリセロールおよび20% 2-メルカプトエタノール中に再懸濁させた(25)。
タンパク質スロットブロット。連続抽出からの1%Triton-X100可溶性画分および2%SDS可溶性画分をニトロセルロース膜上に、Bio-Dot96ウェル精密濾過システム(Bio-Rad)を用いて真空下で固定化した。膜をPBS-Tにおいて洗浄し、ウエスタンブロッティングと同じプロトコルを使用して、各ウサギポリクローナル抗体(1:2000)を用いてブロットした。
免疫組織化学。10マイクロメートル切片を、キシレン中で脱パラフィンし、等級アルコールにより再水和し、95~100%ギ酸とともに5分間インキュベートし、蒸留水を用いて10分間洗浄した。クエン酸緩衝液、pH6.0中において90℃で30分間切片を蒸気処理することによりHIERを実施した。非特異的免疫グロブリンをブロッキングするため、無血清ブロック(Biocare Medical)を30分間適用した。ウサギポリクローナル抗体を、無血清ブロック(Biocare Medical)中1:5000から1:15,000の希釈度で適用し、一晩4℃でインキュベートした。結合試薬(ストレプトアビジンおよび/またはアルカリホスファターゼ、Covance)を30分間室温で適用した。これらの切片を、3%H2O2中で15分間インキュベートし、内在性ペルオキシダーゼ活性をブリーチした。次に、標識化試薬(HRP、Covance)を30分間室温で適用した。ペルオキシダーゼ活性をNovaRed基質(Vector)を用いて発達させ、切片をヘマトキシリンで対比染色した。
細胞毒性アッセイ。すべてのトランスフェクション実験を、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を製造者の指示に従い、60%細胞コンフルエンスで使用して実施した。500ngの各ベクターを35mmウェル中でトランスフェクトさせた。細胞死を、CytoTox 96非放射性細胞毒性アッセイ(Promega)を製造者の指示に従い使用して、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)細胞放出を測定することにより決定した。吸光度は490nmで記録され、総LDH放出を1%Triton X-100を用いて細胞を溶解させることにより測定した。各実験において、決定は、各実験条件について五重に実施し、平均データを計算した。単一比較のために両側独立スチューデントt検定(p<0.05)および複数の対になった条件が比較されるときには分散分析(ANOVA)を使用して、統計学的有意性を決定した。
細胞生存率アッセイ。HEK293T細胞に96ウェルプレート中でトランスフェクトし、トランスフェクション42時間後に、3-(4,5-ジメチチアゾル-.2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイを用いて細胞生存率を決定した。MTTを細胞培養培地に0.5mg/mL最終濃度で添加し、45分間37℃でインキュベートした。次に、培地除去の際に細胞を100μLのDMSOを用いて溶解し、吸光度を595nmで測定した。各実験において、決定は五重に実施される。スチューデントt検定(p<0.05)を使用して統計学的有意性を決定した。
センスおよびアンチセンス転写物の両方がALS/FTDに寄与するという仮説を試験するためのC9ORF72 ALSのBACトランスジェニックマウスモデル。
原理:センスおよびアンチセンス転写物を再現するC9ORF72 ALS/FTDモデルマウスは、この疾患のモデリングのために決定的に重要である。BACクローンを、約800G4C2リピートを含有するヒト患者から単離した。これらのBACクローンは、8つの樹立系統を生成するために使用した。これらのマウスはたとえば、以下の問いに答えるために有用である。すなわち、RANタンパク質発現およびRNA機能獲得の両方がC9ORF72 ALS/FTDに寄与するのか?センスおよびアンチセンス機構の両方がC9ORF72病原性において重要であるのか?
原理:センスおよびアンチセンス転写物を再現するC9ORF72 ALS/FTDモデルマウスは、この疾患のモデリングのために決定的に重要である。BACクローンを、約800G4C2リピートを含有するヒト患者から単離した。これらのBACクローンは、8つの樹立系統を生成するために使用した。これらのマウスはたとえば、以下の問いに答えるために有用である。すなわち、RANタンパク質発現およびRNA機能獲得の両方がC9ORF72 ALS/FTDに寄与するのか?センスおよびアンチセンス機構の両方がC9ORF72病原性において重要であるのか?
アプローチ:約800GGGGCCリピートを有する完全ヒトC9ORF72遺伝子プラスフランキング配列を含有するBACクローンを、ヒト患者から単離し、pCC1BAC(商標)プラスミド[Epicentre(登録商標)]内に挿入した。マウスにおける使用のために選択されたBACインサートは、第9染色体上のヒトゲノム参照配列のbp27,625,470から27,527,137まで伸長した(図29)。上の座標は、この患者からの余分なリピートを含まない。BACインサートDNAが、いくつかのクローン調製物において約800リピートを含有することが見出されたが、非常に不安定だった。前核注入を実施し、8つのFVB樹立系統を生成した。2つの独立系統は伸長突然変異が確認された。マウスにおけるBACリピートサイズは、約500リピートであるが、後代間で変化し、マウスコロニーが拡張し、追加のマウス世代が実験室において繁殖すると、サイズが伸びたり縮んだりしうる。BAC伸長マウスは、C9ORF72遺伝子のセンスおよびアンチセンスバージョンの両方を発現した。センスおよびアンチセンスGGGGCCRNA凝集が、GGGGCCリピートを有するマウスに存在したが、対照マウスには存在しなかった(図30~図31)。
少なくとも2つの伸長および2つの対照系統が、詳細な特徴付けのために選択される。行動的特徴付けには、ロータロッド解析、握力、平均台およびオープンフィールド評価が含まれる。センスおよびアンチセンス転写物ならびにRANタンパク質の分子的特徴付けが、RT-PCR、RACE、免疫ブロット、免疫組織化学および免疫蛍光により実施される。免疫組織化学、免疫蛍光およびFISH研究は、RNA凝集およびC9-RANタンパク質蓄積の部位を病理学的変化と相関させるために実施される。CNS、CSF、筋肉、血液および他の組織におけるRANタンパク質蓄積が、発達中に様々な時点で検査される。
関連性:これら研究からの結果は、RAN翻訳がC9ORF72 ALS/FTDにおいて果たす役割のよりよい理解をもたらすであろう。加えて、これらの研究は、剖検組織においてどのタンパク質が最も頻繁に見出されるのかを決定し、個別のRANタンパク質の毒性における明白な差異を同定することにより、個別のタンパク質標的の優先順位の決定に役立つであろう。モデル細胞およびマウスからの情報はまた、様々な処置方略の有効性に関する将来の研究について教えてくれるであろう。
参考文献
さらなる詳述なしに、当業者は上の記載に基づいて、本開示をその最大限の範囲まで利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示的なものとして解釈されるべきであり、本開示の残りの部分をいかなる仕方であっても限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての出版物が、本明細書において参照される目的または主題のため、参照により組み込まれる。
他の実施形態
本明細書に開示の特徴のすべてが、任意の組合せで組み合わせられてもよい。本明細書に開示の各特徴は、同じ、等価な、または類似の目的に資する代替的特徴により置き換えられてもよい。したがって、そうでないことが明示的に述べられない限り、開示の各特徴は包括的な一連の等価なまたは類似の特徴の一例にすぎない。
本明細書に開示の特徴のすべてが、任意の組合せで組み合わせられてもよい。本明細書に開示の各特徴は、同じ、等価な、または類似の目的に資する代替的特徴により置き換えられてもよい。したがって、そうでないことが明示的に述べられない限り、開示の各特徴は包括的な一連の等価なまたは類似の特徴の一例にすぎない。
上の記載から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確認でき、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本開示に様々な変更および修正を、それが様々な用途および条件に適合するように加えることができる。したがって、他の実施形態もまた特許請求の範囲内である。
Claims (24)
- 対象から得られる血液試料中の、ポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Gly-Arg)、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを決定することを含み、対照レベルと比較して上昇した1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルが、対象がALSを有するかまたはALSを発症する可能性が高いことを示す、
対象を、ALSを有するかまたはALSを発症する可能性が高いものとして同定するための方法。 - 1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルが、アッセイを実施することにより決定される、請求項1に記載の方法。
- アッセイが、免疫ベースアッセイを含む、請求項2に記載の方法。
- 免疫ベースアッセイが、表1、2、または3に記載の配列を含む抗原に特異的な単離抗体を含む、請求項3に記載の方法。
- 免疫ベースアッセイが、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のC末端に特異的な単離抗体を含む、請求項3または4に記載の方法。
- ジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルが対照レベルと比較して上昇した場合に、対象を、ALSを有するかまたはALSを発症する可能性が高いものとして同定すること、
をさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。 - ALSを有するかまたはALSを発症する可能性が高い対象を処置すること、
をさらに含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。 - 処置することが、対象に、リルゾール、バクロフェン、ジアゼパム、フェニトイン、トリヘキシフェニジルまたはアミトリプチリンのうちの1つまたは複数を有効量投与することを含む、請求項7に記載の方法。
- 処置することが、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植から選択される処置を実施することを含む、請求項7に記載の方法。
- 1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質が、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質が、2つ以上のジアミノ酸リピート含有タンパク質である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 対象の血中のポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Gly-Arg)、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させることまたはその増加を予防すること
を含む、ALSを有する対象を処置するための方法。 - 1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させることまたはその増加を予防することが、1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質を対象の血液から除去することを含む、請求項12に記載の方法。
- 対象の血液からの1つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質が、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植から選択される処置を使用して除去される、請求項13に記載の方法。
- 骨髄移植が、同種骨髄移植である、請求項14に記載の方法。
- ポリ(Gly-Ala)、ポリ(Gly-Pro)、ポリ(Gly-Arg)、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される1つまたは複数のジアミノ酸リピートタンパク質に特異的な単離抗体。
- ジアミノ酸リピートタンパク質が、ポリ(Pro-Ala)、ポリ(Pro-Arg)、Met...ポリ(Pro-Arg)またはMet...ポリ(Gly-Pro)タンパク質から選択される、請求項16に記載の単離抗体。
- 単離抗体が、表1、2、または3に記載の配列の配列または断片を含む抗原に特異的である、請求項16または17に記載の単離抗体。
- 対象から得られる試料中の、5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAおよび/または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルを決定することを含み、対照レベルと比較して上昇した5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAおよび/または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルは、対象がALSを有するかまたはALSを発症する可能性が高いことを示す、
対象を、ALSを有するかまたはALSを発症する可能性が高いものとして同定するための方法。 - 5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAおよび/または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルが対照レベルと比較して上昇した場合に、対象を、ALSを有するかまたはALSを発症する可能性が高いものとして同定すること、
をさらに含む、請求項19に記載の方法。 - ALSを有するかまたはALSを発症する可能性が高い対象を処置すること、
をさらに含む、請求項19または20に記載の方法。 - 処置することが、対象に、リルゾール、バクロフェン、ジアゼパム、フェニトイン、トリヘキシフェニジルまたはアミトリプチリンのうちの1つまたは複数を有効量投与することを含む、請求項21に記載の方法。
- 処置することが、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植から選択される処置を実施することを含む、請求項21に記載の方法。
- 5’-GGGGCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAおよび/または5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルが、5’-GGCCCC-3’ヘキサヌクレオチドリピート含有RNAのレベルである、
請求項19から23のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361786258P | 2013-03-14 | 2013-03-14 | |
US61/786,258 | 2013-03-14 | ||
US201361883219P | 2013-09-27 | 2013-09-27 | |
US61/883,219 | 2013-09-27 | ||
JP2019214553A JP2020055827A (ja) | 2013-03-14 | 2019-11-27 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
JP2021125018A JP2021192036A (ja) | 2013-03-14 | 2021-07-30 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021125018A Division JP2021192036A (ja) | 2013-03-14 | 2021-07-30 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2024012385A true JP2024012385A (ja) | 2024-01-30 |
Family
ID=51625132
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016501032A Active JP6628285B2 (ja) | 2013-03-14 | 2014-03-10 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
JP2019214553A Withdrawn JP2020055827A (ja) | 2013-03-14 | 2019-11-27 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
JP2021125018A Pending JP2021192036A (ja) | 2013-03-14 | 2021-07-30 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
JP2023183882A Pending JP2024012385A (ja) | 2013-03-14 | 2023-10-26 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
Family Applications Before (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016501032A Active JP6628285B2 (ja) | 2013-03-14 | 2014-03-10 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
JP2019214553A Withdrawn JP2020055827A (ja) | 2013-03-14 | 2019-11-27 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
JP2021125018A Pending JP2021192036A (ja) | 2013-03-14 | 2021-07-30 | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US10295547B2 (ja) |
EP (1) | EP2970884A4 (ja) |
JP (4) | JP6628285B2 (ja) |
AU (3) | AU2014241078B2 (ja) |
CA (1) | CA2904960A1 (ja) |
HK (1) | HK1220227A1 (ja) |
WO (1) | WO2014159247A1 (ja) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014159247A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Di-amino acid repeat-containing proteins associated with als |
US11162096B2 (en) | 2013-10-14 | 2021-11-02 | Ionis Pharmaceuticals, Inc | Methods for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript |
SG11201701925XA (en) | 2014-09-30 | 2017-04-27 | Neurimmune Holding Ag | Human-derived anti-dipeptide repeats (dprs) antibody |
US10793855B2 (en) | 2015-01-06 | 2020-10-06 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript |
ES2535579B1 (es) * | 2015-01-21 | 2016-02-17 | Grifols Worldwide Operations Limited | Composición que comprende albúmina para su utilización en el tratamiento de Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) mediante recambio plasmático |
WO2016167780A1 (en) | 2015-04-16 | 2016-10-20 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions for modulating expression of c9orf72 antisense transcript |
WO2016196324A1 (en) | 2015-05-29 | 2016-12-08 | University Of Floridia Research Foundation, Inc. | Methods for diagnosing huntington's disease |
AU2017246643B2 (en) * | 2016-04-04 | 2022-08-04 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Manipulation of eIF3 to modulate repeat associated non-ATG (RAN) translation |
KR102527979B1 (ko) * | 2016-09-30 | 2023-04-28 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | C9orf72 유전자좌에서 헥사뉴클레오티드 반복 확장을 갖는 비인간 동물 |
EP3570808A1 (en) | 2017-01-18 | 2019-11-27 | Novartis AG | Dip tube |
WO2018195110A1 (en) | 2017-04-17 | 2018-10-25 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Regolation of ran translation by pkr and eif2a-p pathways |
US20200232925A1 (en) * | 2017-09-25 | 2020-07-23 | University of Florida Research Foundation,Incorporation | Immunoassays for detection of ran proteins |
CA3076214A1 (en) | 2017-09-26 | 2019-04-04 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Use of metformin and analogs thereof to reduce ran protein levels in the treatment of neurological disorders |
JP2022510573A (ja) | 2018-07-23 | 2022-01-27 | エンクリアー セラピーズ, インク. | 神経障害の治療方法 |
EP3826650A4 (en) * | 2018-07-23 | 2022-07-27 | Enclear Therapies, Inc. | METHODS OF TREATMENT OF NEUROLOGICAL DISEASES |
CA3136648A1 (en) | 2019-04-11 | 2020-10-15 | Enclear Therapies, Inc. | Methods of amelioration of cerebrospinal fluid and devices and systems therefor |
EP3962518A1 (en) * | 2019-05-02 | 2022-03-09 | Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen e.V. (DZNE) | Immunogen for preventing or treating familial frontotemporal dementia (ftd) and/or amyotrophic lateral sclerosis (als) |
EP3994159A4 (en) * | 2019-07-05 | 2023-08-09 | University of Florida Research Foundation, Incorporated | METHODS OF TREATING NEUROLOGICAL DISEASES ASSOCIATED WITH THE RAN PROTEIN |
EP3906938A1 (en) * | 2020-05-07 | 2021-11-10 | Grifols Worldwide Operations Limited | Composition comprising albumin for use in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als) by plasma exchange |
WO2021231887A1 (en) * | 2020-05-15 | 2021-11-18 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Compositions and methods of detection of pre-symptomatic als |
WO2023028294A1 (en) * | 2021-08-27 | 2023-03-02 | Academia Sinica | Methods of treating neurodegenerative diseases |
Family Cites Families (42)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5011912A (en) * | 1986-12-19 | 1991-04-30 | Immunex Corporation | Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system |
CZ321497A3 (cs) * | 1995-04-11 | 1998-06-17 | Merck And Co., Inc. | Způsob vhodný pro produkci látek, jejichž základ tvoří dipeptid |
CA2295474A1 (en) * | 1997-07-08 | 1999-01-21 | Human Genome Sciences, Inc. | 123 human secreted proteins |
ES2276474T3 (es) * | 1997-08-29 | 2007-06-16 | Innogenetics N.V. | Peptidos metilados, homologos del smd, que reaccionan con los anticuerpos de los sueros de seres vivos afectados con lupus eritematoso sistemico. |
US6436703B1 (en) | 2000-03-31 | 2002-08-20 | Hyseq, Inc. | Nucleic acids and polypeptides |
JP2004520803A (ja) * | 2000-04-21 | 2004-07-15 | コリクサ コーポレイション | 尋常性挫瘡の治療および診断のための組成物および方法 |
JP2004518437A (ja) * | 2000-10-25 | 2004-06-24 | ディアデクサス インコーポレーテッド | 肺特異的遺伝子およびタンパク質に関する組成物および方法 |
US6855517B2 (en) * | 2000-11-20 | 2005-02-15 | Diadexus, Inc. | Compositions and methods relating to breast specific genes and proteins |
US7528227B2 (en) | 2004-03-23 | 2009-05-05 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Histone H2A peptide derivatives and uses thereof |
US7163943B2 (en) | 2001-09-21 | 2007-01-16 | Reddy Us Therapeutics, Inc. | Methods and compositions of novel triazine compounds |
US7314974B2 (en) * | 2002-02-21 | 2008-01-01 | Monsanto Technology, Llc | Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties |
PT2292780T (pt) | 2003-09-30 | 2017-11-28 | Univ Pennsylvania | Clados de vírus adenoassociados (aav), sequências, vetores que as contêm, e suas utilizações |
WO2005089164A2 (en) * | 2003-12-31 | 2005-09-29 | Pharmexa Inc. | Inducing cellular immune responses to human papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions |
US7481997B1 (en) * | 2004-02-12 | 2009-01-27 | Montana State University | Snow mountain virus genome sequence, virus-like particles and methods of use |
WO2005099741A1 (ja) * | 2004-04-08 | 2005-10-27 | Noevir Co., Ltd. | 運動ニューロン疾患治療薬 |
US20060068434A1 (en) | 2004-09-21 | 2006-03-30 | Jay Stoerker | Methods and compositions for detecting cancer using components of the U2 spliceosomal particle |
AU2006210973A1 (en) | 2005-01-31 | 2006-08-10 | University Of Iowa Research Foundation | Nucleic acid silencing of Huntington's Disease gene |
US20090074721A1 (en) | 2005-06-06 | 2009-03-19 | Vgx Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating viral infection with oral or injectibel drug solution |
ES2453374T3 (es) | 2006-09-20 | 2014-04-07 | The Queen's University Of Belfast | Método para determinar si una célula tumoral presenta potencial invasivo y/o metastásico, y agentes moduladores de la transformación maligna |
US20090143418A1 (en) | 2007-11-30 | 2009-06-04 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and Methods for Preventing and Treating Hair Growth Cycle-Related Conditions |
WO2010077720A2 (en) | 2008-12-30 | 2010-07-08 | 3M Innovative Properties Company | Acrylic block copolymers for aerosols and aerosol adhesives |
TW201034684A (en) | 2009-02-18 | 2010-10-01 | Genentech Inc | Method for inhibiting neurodegeneration |
CA2757354A1 (en) | 2009-04-02 | 2010-10-07 | Laura P.W. Ranum | Nucleotide repeat expansion-associated polypeptides and uses thereof |
EP2419144B1 (en) | 2009-04-17 | 2019-08-07 | Oxford University Innovation Limited | Composition for delivery of genetic material |
CA2762351A1 (en) | 2009-05-18 | 2010-11-25 | Ottawa Hospital Research Institute | Treatment of muscle disease characterized by insulin resistance |
WO2011028912A2 (en) * | 2009-09-03 | 2011-03-10 | University Of Tennessee Research Foundation | A biomarker for neurodegeneration in neurological disease |
EP2751284B1 (en) * | 2011-08-31 | 2017-01-11 | The University Of Manchester | Method for diagnosing a neurodegenerative disease. |
JP6490426B2 (ja) | 2012-02-29 | 2019-03-27 | サンガモ セラピューティクス, インコーポレイテッド | ハンチントン病を治療するための方法および組成物 |
EP2948777B1 (en) * | 2013-01-22 | 2019-06-26 | Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen e.V. | Dipeptide-repeat proteins as therapeutic target in neurodegenerative diseases with hexanucleotide repeat expansion |
WO2014114303A1 (en) | 2013-01-22 | 2014-07-31 | Deutsches Zentrum Für Neurodegenerative Erkrankungen | Dipeptide-repeat proteins as therapeutic target in neurodegenerative diseases with hexanucleotide repeat expansion |
US9448232B2 (en) | 2013-01-24 | 2016-09-20 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Methods and materials for detecting C9ORF72 hexanucleotide repeat expansion positive frontotemporal lobar degeneration or C9ORF72 hexanucleotide repeat expansion positive amyotrophic lateral sclerosis |
WO2014159247A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Di-amino acid repeat-containing proteins associated with als |
CA2904794C (en) | 2013-03-15 | 2021-11-23 | Peter Walter | Modulators of the eif2alpha pathway |
WO2014186746A1 (en) | 2013-05-16 | 2014-11-20 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | HAIRPIN mRNA ELEMENTS AND METHODS FOR THE REGULATION OF PROTEIN TRANSLATION |
EP2837390A1 (en) | 2013-08-15 | 2015-02-18 | Universitäts-Kinderspital beider Basel | Combined Pharmaceutical Preparation for Use in Treating Neuromuscular Disorders |
WO2016025692A1 (en) | 2014-08-13 | 2016-02-18 | The Scripps Research Institute | Treatment of c9ftd/als by targeting rna expanded repeat sequences |
WO2016196324A1 (en) | 2015-05-29 | 2016-12-08 | University Of Floridia Research Foundation, Inc. | Methods for diagnosing huntington's disease |
AU2017246643B2 (en) | 2016-04-04 | 2022-08-04 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Manipulation of eIF3 to modulate repeat associated non-ATG (RAN) translation |
JP2019524834A (ja) | 2016-08-18 | 2019-09-05 | オービッド・セラピューティクス・インコーポレイテッドOvid Therapeutics, Inc. | ビグアナイド系による発達障害の治療方法 |
WO2018195110A1 (en) | 2017-04-17 | 2018-10-25 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Regolation of ran translation by pkr and eif2a-p pathways |
US20200232925A1 (en) | 2017-09-25 | 2020-07-23 | University of Florida Research Foundation,Incorporation | Immunoassays for detection of ran proteins |
CA3076214A1 (en) | 2017-09-26 | 2019-04-04 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Use of metformin and analogs thereof to reduce ran protein levels in the treatment of neurological disorders |
-
2014
- 2014-03-10 WO PCT/US2014/022670 patent/WO2014159247A1/en active Application Filing
- 2014-03-10 AU AU2014241078A patent/AU2014241078B2/en active Active
- 2014-03-10 CA CA2904960A patent/CA2904960A1/en active Pending
- 2014-03-10 US US14/775,278 patent/US10295547B2/en active Active
- 2014-03-10 JP JP2016501032A patent/JP6628285B2/ja active Active
- 2014-03-10 EP EP14776090.4A patent/EP2970884A4/en active Pending
-
2016
- 2016-07-14 HK HK16108282.2A patent/HK1220227A1/zh unknown
-
2019
- 2019-03-25 US US16/362,908 patent/US10663475B2/en active Active
- 2019-11-27 JP JP2019214553A patent/JP2020055827A/ja not_active Withdrawn
-
2020
- 2020-04-17 US US16/851,690 patent/US11035867B2/en active Active
- 2020-04-30 AU AU2020202852A patent/AU2020202852B2/en active Active
-
2021
- 2021-05-17 US US17/322,604 patent/US12025622B2/en active Active
- 2021-07-30 JP JP2021125018A patent/JP2021192036A/ja active Pending
-
2022
- 2022-12-05 AU AU2022283622A patent/AU2022283622A1/en active Pending
-
2023
- 2023-10-26 JP JP2023183882A patent/JP2024012385A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6628285B2 (ja) | 2020-01-08 |
CA2904960A1 (en) | 2014-10-02 |
EP2970884A1 (en) | 2016-01-20 |
US11035867B2 (en) | 2021-06-15 |
US10295547B2 (en) | 2019-05-21 |
JP2016515208A (ja) | 2016-05-26 |
US20160025747A1 (en) | 2016-01-28 |
US10663475B2 (en) | 2020-05-26 |
JP2021192036A (ja) | 2021-12-16 |
AU2014241078A1 (en) | 2015-10-08 |
US20190285652A1 (en) | 2019-09-19 |
AU2020202852B2 (en) | 2022-09-08 |
AU2020202852A1 (en) | 2020-05-21 |
AU2022283622A1 (en) | 2023-02-02 |
EP2970884A4 (en) | 2016-11-02 |
US20210285970A1 (en) | 2021-09-16 |
US20200341012A1 (en) | 2020-10-29 |
AU2014241078B2 (en) | 2020-03-12 |
HK1220227A1 (zh) | 2017-04-28 |
JP2020055827A (ja) | 2020-04-09 |
WO2014159247A1 (en) | 2014-10-02 |
US12025622B2 (en) | 2024-07-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2024012385A (ja) | Als関連ジアミノ酸リピート含有タンパク質 | |
Alsema et al. | Profiling microglia from Alzheimer’s disease donors and non-demented elderly in acute human postmortem cortical tissue | |
JP6247253B2 (ja) | 白血病幹細胞マーカー | |
JP2021073264A (ja) | 老化に関連した障害を処置するための方法及び組成物 | |
US9957576B2 (en) | Methods for determining responsiveness to an anti-CD47 agent | |
EP2492687A1 (en) | MYH10 as a new diagnostic marker of pathologies resulting from RUNX1 inactivation | |
EP3782647A1 (en) | Antifibrotic agent and biomarker for fibrosis | |
JP7175526B2 (ja) | 細胞遊走調節に関する疾患の予防・治療剤および肺間質の疾患の疾患活動性判定・予後評価 | |
US20080187917A1 (en) | Compositions and methods for repressing the Ink4a and Arf senescence pathways | |
US20240255520A1 (en) | Hla-deleted glomerular endothelial cells and diagnostic method using thereof | |
US11958885B2 (en) | Methods for determining a rapid progression rate of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and restoring phagocytic function of microglia thereof using a NCK-associated protein 1 (NCKAP1) protein or an mRNA thereof | |
Rodríguez-Lorenzo et al. | PERIVENTRICULAR CD56BRIGHT NK CELL | |
WO2017061125A1 (ja) | Card14を用いた治療、診断およびスクリーニング | |
Dwork et al. | Consistent loss of subicular dendritic spines in schizophrenia and mood disorders | |
JP2007135581A (ja) | 自己免疫性血小板減少性紫斑病(itp)患者の血液細胞特異的遺伝子群 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231124 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20231124 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20240502 |