TW202308681A - 用以治療神經退化性疾病的方法 - Google Patents
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Abstract
本揭示內容是關於利用修飾的EKLF多肽、修飾的核酸或修飾的骨髓細胞來預防或治療ALS的方法,其中修飾的核酸是用以編碼修飾的EKLF多肽,且修飾的骨髓細胞包含修飾的核酸。依據本揭示內容的實施方式,所述修飾的EKLF多肽包含一胺基酸修飾,其可降低野生型EKLF多肽的類小泛素化程度。
Description
本揭示內容是關於治療疾病的領域。更具體來說,本揭示內容是關於利用修飾的紅血球Kruppel樣因子(Erythroid Kruppel-like factor, EKLF)多肽來治療神經退化性疾病的方法,其中該修飾的EKLF多肽包含一胺基酸修飾,使其類小泛素化(sumoylation)程度低於一野生型(wild-type, WT) EKLF多肽的類小泛素化程度。
肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS;亦稱為路格裡克氏病(Lou Gehrig's disease))是一種漸進式的神經系統疾病,會影響腦部及脊髓中控制行走及說話等隨意肌運動的神經細胞。ALS是一種常見的運動神經元疾病。ALS早期的病症包含,肌肉僵硬、肌肉抽搐,以及日益惡化的肌肉無力及萎縮。隨著疾病的進展,ALS會引發呼吸問題、說話問題及飲食問題等各種併發症。半數ALS患者會產生輕微的思考及行為困難,且約15%的ALS病患會出現額顳葉失智症。ALS最終會導致癱瘓及因呼吸衰竭造成的過早死亡。
美國食品藥物管理局(U.S. Food and Drug Administration, FDA)已核准利魯唑(Riluzole)及依達拉奉(Edaravone)二種用以治療ALS的藥物。投予利魯唑可增加ALS病患3到6個月的預期壽命。依達拉奉可減緩早期ALS病患的日常功能下降。然而,二種藥物皆只能延緩ALS病症的進展,並預防與ALS相關的併發症,卻無法逆轉ALS造成的傷害。直至今日,ALS仍為一種無法治癒的疾病。
有鑑於此,相關領域仍致力研發一種新穎之用以治療ALS的方法,據以改善ALS病患的生活品質及壽命。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要,以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述,且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本揭示內容提供一種用以預防及/或治療一個體之神經退化性疾病的方法。本發明方法包含對個體投予一有效量之修飾的EKLF多肽、修飾的核酸或修飾的骨髓細胞,其中所述修飾的核酸是用以編碼所述修飾的EKLF多肽,且所述修飾的骨髓細胞包含所述修飾的核酸。依據本揭示內容某些實施方式,所述修飾的EKLF多肽包含一胺基酸修飾,以使其類小泛素化程度低於一野生型EKLF多肽的類小泛素化程度。
依據某些實施方式,個體是一人類,其中所述胺基酸修飾是將序列編號:3之野生型EKLF多肽上第54個胺基酸位置的離胺酸(lysine)殘基置換為精胺酸(arginine)殘基。在該些實施方式中,修飾的EKLF多肽包含序列編號:10的胺基酸序列。
依據某些實施方式,個體是一小鼠,其中所述胺基酸修飾是將序列編號:1的野生型EKLF多肽上第74個胺基酸位置的離胺酸殘基置換為精胺酸殘基。在該些實施方式中,修飾的EKLF多肽包含序列編號:11的胺基酸序列。
依據本揭示內容某些實施方式,所述修飾的骨髓細胞包含修飾的造血幹細胞(hematopoietic stem cells, HSCs)、修飾的造血幹細胞及前驅細胞(hematopoietic stem and progenitor cells, HSPCs),或是其組合。
依據某些實施方式,所述修飾的骨髓細胞是個體的自體(autologous)細胞。依據替代性的實施方式,所述修飾的骨髓細胞是個體的同種異體(allogeneic)或異種(xenogeneic)細胞;在該些實施方式中,本發明方法更包含在投予修飾的骨髓細胞之前,以伽馬射線(gamma irradiation)照射該個體,或是對該個體投予免疫抑制劑。
可藉由適當的路徑對個體投予本發明修飾的多肽、修飾的核酸或修飾的骨髓細胞;舉例來說,靜脈內、腹腔內、動脈內或脊髓內注射。較佳地,是以靜脈注射的方式對個體投予本發明修飾的多肽、修飾的核酸或修飾的骨髓細胞。
可利用本發明方法治療的神經退化性疾病包含,但不限於,肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、路易體失智症(Lewy Body Dementia, LBD)、帕金森氏症(Parkinson’s disease, PD)、阿茲海默症(Alzheimer’s disease, AD)、多發性硬化症(multiple sclerosis, MS)或杭丁頓氏症(Huntington's disease, HD)。依據某些例示性的實施方式,神經退化性疾病是ALS。
在參閱下文實施方式後,本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的,以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備,下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述;但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而,亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
I
.
定義
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值,此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而,任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處,「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是,「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內,視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外,或除非另有明確的說明,當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此,除非另有相反的說明,本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值,且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處,將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間;除非另有說明,此處所述的數值範圍皆包含端點。
除非本說明書另有定義,此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外,在不和上下文衝突的情形下,本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型;而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
在本揭示內容中,「骨髓細胞」(bone marrow cells)一詞是指骨髓中處於不同分化階段的細胞,包含造血來源的細胞(例如,造血再生細胞(hematopoietic repopulating cells)、造血幹細胞(hematopoietic stem cells)及造血幹細胞及前驅細胞(hematopoietic stem and progenitor cells)),以及源自骨髓的細胞(例如內皮細胞、間質細胞、骨細胞、神經細胞及支持細胞(亦稱為基質細胞))。
「自體的」(autologous)一詞是指一種生物材料(例如,骨髓細胞)的來源。具體來說,「自體的」(autologous)一詞在本揭示內容是指由一個體取得生物材料(例如,骨髓細胞)後,將該生物材料重新投予(有或無修飾)至相同的個體。舉例來說,「自體移植」(autologous transplantation)一詞是指一種移植手術,其中移植物的供體及受體為相同個體。此種移植克服了會造成排斥反應的免疫屏障,因此具有治療優勢。
「同種異體的」(allogeneic)一詞在本揭示內容是指一種生物材料(例如,骨髓細胞),其係源自或分離自一個體,並投予(有或無修飾)至相同物種的另一個體。舉例來說,「同種異體移植」(allogeneic transplantation)一詞是指一種移植手術,其中供體與受體為相同物種的不同個體。
「異種的」(xenogeneic)一詞在本揭示內容是指一種生物材料(例如,骨髓細胞),其係源自或分離自一物種的個體,並投予(有或無修飾)至另一物種的個體。舉例來說,「異種移植」(allogeneic transplantation)一詞是指一種移植手術,其中供體與受體為不同的物種。
「野生型」(wild-type, WT)一詞是指一基因或基因產物所具備的特性,和從天然存在的來源中分離出來之該基因或基因產物的特性相同。一野生型基因或基因產物(例如,多肽)是一族群中出現頻率最高的,且因可將其定義為該基因的「正常型」(normal)或「野生型」形式。
「多肽」(polypeptide)一詞是指不限定特定長度的胺基酸聚合物;因此,「胜肽」( peptide)、「寡胜肽」(oligopeptide)及「蛋白」(protein)皆屬於此處定義的多肽,且在本揭示內容中可交互使用這些名詞。此一詞彙並未指明或排除對本發明多肽進行化學或表現後修飾,儘管本揭示內容可以特定實施方式包含或排除該些多肽的化學或表現後修飾。因此,舉例來說,多肽一詞可明確包含對多肽進行醣苷基(glycosyl group)、醯基(acetyl group)、磷酸基(phosphate group)或脂質基團(lipid group)等共價連接修飾。此外,具有該些修飾的多肽可為本發明包含或排除的單一下位發明概念。在本揭示內容中,多肽中胺基酸殘基的位置是由多肽的N端開始編號。除非特定指明為特定異構體,否則當未明確闡述胺基酸為D或L胺基酸時,所述胺基酸可以是L胺基酸,或可以是D或L胺基酸。此外,本揭示內容是以本發明技術領域慣常使用的縮寫來標示多肽的胺基酸殘基。
「投予」(administered或administering) 在本揭示內容係指一遞送模式,其包含,但不限於,靜脈內、腹腔內、動脈內或脊髓內遞送本揭示內容之藥劑(例如,修飾的EKLF多肽、修飾的核酸或修飾的骨髓細胞)。在某些實施方式中,是對有需要的個體(例如,罹患ALS或疑似罹患ALS的個體)靜脈投予修飾的骨髓細胞。
在本揭示內容中,「治療」(treat或treatment)一詞包含部份或完全改善、減輕及/或處理與ALS相關的症狀、次要疾病或病徵。「治療」(treat或treatment)一詞於此說明書中亦指應用或投予本揭示內容之修飾的EKLF多肽、修飾的核酸或修飾的骨髓細胞至一個體,其患有與ALS相關的症狀、次要疾病或病徵,以達到部份或完全減輕、減緩、治癒疾病、延遲發病、抑制病程發展、降低疾病嚴重性,及/或降低一或多個ALS相關的症狀、次要疾病或病徵的發生。與ALS相關之症狀、次要疾病或病徵包含,但不限於,肌肉僵硬、肌肉抽搐、肌肉無力、肌肉萎縮、行走困難、絆倒及跌倒、手部無力或笨拙、口齒不清、吞嚥困難、不當行為(例如,不當哭泣、大笑或呵欠)、認知問題及行為改變。當一或多症狀或臨床標記降低時,則該治療為「有效的」(effective)。或者是,當一症狀、次要疾病或病徵的進程減緩或中止時,則該治療為「有效的」(effective)。
「預防」(prevent或prevention)一詞在本揭示內容是指對一個體投予預防性治療,其中該個體具有罹患與ALS相關之病徵、次要病徵或症狀的風險,藉以降低該個發展與ALS相關之病徵、次要病徵及/或症狀的機率。具體來說,「預防」(prevent或prevention)一詞是指抑制與ALS感染相關之病徵、次要病徵或症狀的發生;意即,減少病徵、次要病徵或症狀發生的機率或頻率。在使用本發明修飾的EKLF多肽、修飾的核酸及/或修飾的骨髓細胞來進行「預防」(prevent或prevention)時,是指該修飾的EKLF多肽、修飾的核酸及/或修飾的骨髓細胞可抑制該病徵、次要病徵或症狀的發生,及減少該病徵、次要病徵或症狀發生的機率及/或頻率,而非指示或暗示使用該修飾的EKLF多肽、修飾的核酸及/或修飾的骨髓細胞後,保證該病徵、次要病徵或症狀不會再次發生。
「有效量」(effective amount) 在此處係指一藥劑的用量足以產生欲求的療效反應。有效量亦指一種化合物或組合物,其治療利益效果超越其毒性或有害影響。藥劑的有效量不必然能夠治癒疾病或病徵,但能夠延緩、阻礙或防止該疾病或病徵的發生,或是可緩減與疾病或病徵相關的病徵。可將治療有效量可分成一、二或更多劑,而以適當的劑型在指定期間內施用一次、二次或更多次。具體的治療有效量取決於多種因素,例如欲治療的特定狀況、個體的生理條件(如,個體重、年齡或性別)、接受治療的個體類型、治療持續時間、併行治療(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。舉例來說,可將治療有效量表示成活性成分的總重量,譬如以克、毫克或微克來表示;或表示成活性成分重量相對於體重的比例,譬如表示為每公斤體重多少毫克(mg/kg)。或者是,可將有效量表示為細胞相對於體重的比例,譬如表示為每公斤體重多少細胞數(cells/Kg)。習知技藝人士可依據動物模式的劑量來計算藥劑(例如,本揭示內容之修飾的EKLF多肽、修飾的核酸或修飾的骨髓細胞)的人體等效劑量(human equivalent dose, HED)。舉例來說,習知技藝人士可依據美國食品藥物管理局(US Food and Drug Administration, FDA)所公告之「估算成人健康志願者在初始臨床治療測式之最大安全起始劑量」(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)來估算人體使用之最高安全劑量。
「個體」(subject)一詞在本揭示內容是指包含人類等可接受本發明修飾的EKLF多肽、修飾的核酸、修飾的骨髓細胞及/或方法治療的動物。除非另有所指,否則「個體」(subject)一詞同時意指男性及女性。
II.
發明詳細說明
EKLF亦稱為KLF1,是一種會表現於不同血液細胞的Kruppel樣因子,所述血液細胞包含紅血球、巨核細胞(megakaryocyte)、T細胞、NK細胞,以及共同骨髓前驅細胞(common myeloid progenitor, CMP)、巨核細胞-紅血球之前驅細胞(megakaryocyte-erythroid progenitor, MEP)及顆粒性白血球-巨噬細胞之前驅細胞(granulocyte-macrophage progenitor, GMP)等各種造血前驅細胞。EKLF可利用其鋅指蛋白結構域(zinc finger domain)與不同基因之調控區域的CACCC域結構,據以正向或負向調控轉錄反應。已知EKLF會調控紅血球生成、MEP分化為巨核細胞及紅血球,以及單核球分化為巨噬細胞。近期,亦有文獻報導EKLF會表現於長期造血幹細胞(long-term hematopoietic stem cell, LT-HSC),並調控其分化反應。
本揭示內容至少部分是基於發明人發現將位於EKLF類小泛素化位點之離胺酸(lysine, K)殘基單一置換為精胺酸(arginine, R)殘基後,得到的EKLF多肽(即,修飾的EKLF多肽)可改善或減緩小鼠模式中與ALS相關的病症。依據本揭示內容某些實施方式,相較於ALS對照小鼠(即,N390D/+小鼠),具有修飾之EKLF對偶基因(allele)的ALS小鼠(即,N390D/+/
Eklf(K74R)小鼠)展現出較佳的運動能力及學習記憶力。依據本揭示內容某些實施方式,將
Eklf(K74R)小鼠的骨髓移植至ALS小鼠後,可改善ALS小鼠的運動能力及學習記憶力。依據某些實施例,在受體小鼠周邊血中,低嵌合量(< 20%)的
Eklf(K74R)血液細胞(即,源自
Eklf(K74R)小鼠的血液細胞)即足以提供ALS的治療功效。因此,導入
Eklf(K74R)突變可用以預防及/或治療ALS。
II-(1)
利用修飾的
EKLF
多肽或用以編碼修飾的
EKLF
多肽的核酸來預防及
/
或治療
ALS
的方法
本揭示內容的第一態樣是關於一種用以預防及/或治療一個體之ALS的方法。本發明方法包含對個體投予一有效量之修飾的EKLF多肽、修飾的核酸或修飾的骨髓細胞,其中所述修飾的核酸是用以編碼修飾的EKLF多肽,且所述修飾的骨髓細胞包含修飾的核酸。依據本揭示內容某些實施方式,修飾的EKLF多肽包含一位於類小泛素化位點的胺基酸修飾,其可降低修飾的EKLF多肽的類小泛素化程度。
在某些實施方式中,相較於野生型小鼠(
Mus musculus) EKLF多肽(序列編號:1),此修飾的EKLF多肽包含一胺基酸修飾。在某些實施方式中,相較於野生型大鼠(
Rattus norvegicus) EKLF多肽(序列編號:2),此修飾的EKLF多肽包含一胺基酸修飾。在某些實施方式中,相較於野生型人類(智人,
Homo sapiens) EKLF多肽(序列編號:3),此修飾的EKLF多肽包含一胺基酸修飾。在某些實施方式中,相較於野生型黑猩猩(
Pan troglodytes) EKLF多肽(序列編號:4),此修飾的EKLF多肽包含一胺基酸修飾。在某些實施方式中,相較於野生型恆河獼猴(
Macaca mulatta) EKLF多肽(序列編號:5),此修飾的EKLF多肽包含一胺基酸修飾。在某些實施方式中,相較於野生型灰狼(
Canis lupus) EKLF多肽(序列編號:6),此修飾的EKLF多肽包含一胺基酸修飾。在某些實施方式中,相較於野生型家牛(
Bos Taurus) EKLF多肽(序列編號:7),此修飾的EKLF多肽包含一胺基酸修飾。
依據某些實施方式,個體是一人類,其具有序列編號:8的
Eklf基因,可用以編碼序列編號:3的野生型人類EKLF多肽。在該些實施方式中,修飾的EKLF多肽包含序列編號:10的胺基酸序列;相較於序列編號:3的野生型人類EKLF多肽,序列編號:10的胺基酸序列具有一胺基酸置換,其中是以精胺酸取代第54個殘基位置的離胺酸(即,K54R取代)。
依據某些實施方式,個體是一小鼠,其具有序列編號:9的
Eklf基因,可用以編碼序列編號:1的野生型小鼠EKLF多肽。在該些實施方式中,修飾的EKLF多肽包含序列編號:11的胺基酸序列;相較於序列編號:1的野生型小鼠EKLF多肽,序列編號:11的胺基酸序列具有一胺基酸置換,其中是以精胺酸取代第74個殘基位置的離胺酸(即,K74R取代)。
可依據預期目的之不同,藉由適當路徑對個體投予本發明修飾的EKLF多肽或用以編碼該多肽的核酸,舉例來說,靜脈內、腹腔內、動脈內或脊髓內注射。
可利用習知的重組技術來製備本發明修飾的EKLF多肽。舉例來說,可以PCR技術或任何一種習知技藝人士熟知的方法或流程來製備包含用以編碼修飾EKLF多肽之編碼序列的核酸。將得到的核酸分子插入適當的表現載體中,使編碼的重組蛋白可於適當的宿主細胞中表現。在某些實施方式中,表現載體可包含額外的序列,使該載體適合於原核或真核細胞中進行複製及整合。此外或亦或是,表現載體可包含轉錄及轉譯起始序列(例如,啟動子或增強子),以及轉錄及轉譯中止序列(例如,多腺苷酸化序列)。例示性之表現載體包含,但不限於,細菌表現載體、酵母菌表現載體、桿狀病毒表現載體及哺乳動物表現載體。本揭示內容的範疇因此亦包含任何用以編碼本發明修飾EKLF多肽的核酸、包含該核酸的載體(例如,表現載體),以及包含該載體的宿主細胞。
可利用各種原核或真核細胞作為宿主表現系統來表現本發明修飾的EKLF多肽。例示性之表現系統包含,但不限於,細菌等微生物、酵母菌、植物細胞及真核細胞(例如,哺乳動物細胞或CHO細胞)等。將表現載體轉入宿主表現系統的方法為習知技藝人士所知的技術,舉例來說,穩定或暫時轉染、脂轉染(lipofection)、電穿孔(electroporation)以及利用重組病毒載體進行感染。
II-(2).
藉由骨髓移植來預防及
/
或治療
ALS
的方法
本揭示內容的第二態樣是關於一種用以預防及/或治療小鼠個體之ALS的方法。本發明方法包含以下步驟:
(a)由本揭示內容之
Eklf(K74R)小鼠分離其骨髓細胞;以及
(b)將步驟(a)的骨髓細胞轉移至該小鼠個體,據以改善或減緩與ALS相關的病症。
Eklf(K74R)小鼠是依據美國專利號:10,414,809所述之方法製備而得。為求簡潔,在此不再贅述詳細內容。
依據某些實施方式,骨髓細胞的轉移可改善小鼠個體的運動能力及學習記憶力。
依據本揭示內容某些實施方式,
Eklf(K74R)小鼠包含一修飾的
Eklf基因,其係用以編碼包含序列編號:11之胺基酸序列的修飾EKLF多肽。如上所述,序列編號:11之修飾EKLF多肽的特徵在於相對於序列編號:1的野生型小鼠EKLF多肽,此修飾的EKLF多肽具有一胺基酸置換,其中是以精胺酸取代第74個殘基位置的離胺酸(即,K74R取代)。
依據某些實施方式,是將約1×10
4到1×10
8個由本發明
Eklf(K74R)小鼠分離的骨髓細胞移植至小鼠個體。較佳地,是將約1×10
5到1×10
7個骨髓細胞移植至小鼠個體。更佳地,是將約5×10
5到5×10
6個骨髓細胞移植至小鼠個體。在一特定實施例中,移植約1×10
6個骨髓細胞即足以於小鼠個體產生保護及/或治療的功效。
當可想見,當小鼠個體與
Eklf(K74R)小鼠具有不同的基因背景(例如,不同的品系)時,本發明方法更包含在步驟(b)之前,以伽馬射線照射小鼠個體,或對小鼠個體投予一免疫抑制劑。依據一實施方式,是以10 Gy的伽馬射線照射小鼠個體,以抑制或降低其對修飾之骨髓細胞的免疫排斥反應。依據另一實施方式,是以5 Gy的伽馬射線照射小鼠個體,以達到抑制/降低免疫反應的目的。依據再另一實施方式,以2.5 Gy的伽馬射線照射小鼠個體即足以達到免疫抑制的目的。
II-(3).
利用骨髓細胞來預防及
/
或治療
ALS
的方法
本揭示內容的第三態樣是於一種用以預防及/或治療一個體(例如,人類、小鼠、大鼠、黑猩猩、恆河獼猴、灰狼或家牛)之ALS的方法。本發明方法包含對個體投予一有效量之修飾的骨髓細胞,其中所述修飾的骨髓細胞包含修飾的
Eklf基因,而該修飾的
Eklf基因則可編碼一包含胺基酸修飾之修飾的EKLF多肽,其中所述胺基酸修飾可降低野生型EKLF多肽的類小泛素化程度。
操作上,先分離並修飾骨髓細胞,使其包含修飾的
Eklf基因。依據預期目的之不同,可由欲進行治療/投予的個體取得其骨髓細胞(即,個體的自體骨髓細胞)、由相同物種之另一個體取得其骨髓細胞(即,個體的同種異體骨髓細胞),或是由不同物種之個體取得骨髓細胞(即,個體的異種骨髓細胞)。用以分離/製備骨髓細胞的方法為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的技藝。舉例來說,可藉由骨髓抽取(bone marrow aspiration)或骨髓穿刺(bone marrow biopsy)由人類個體取得骨髓細胞。或者是,可利用沖洗法、離心法、酵素切割或其組合由非人類個體(例如,小鼠)取得骨髓細胞。較佳地,骨髓細胞包含骨髓單核細胞(bone marrow mononuclear cells, BMMNCs),例如HSCs及/或HSPCs。
接著,修飾骨髓細胞的
Eklf基因。用以修飾標的基因(例如
, Eklf基因)的方法為習知技藝人士所熟知的技術,例如定點突變(site-directed mutagenesis或site-specific mutagenesis,又稱為寡核苷酸定點突變),以及同源重組(homologous recombination)。依據本揭示內容某些實施方式,是利用同源重組來修飾
Eklf基因。
修飾後得到的
Eklf基因可用以編碼本揭示內容
II-(1)所述之修飾的EKLF多肽。依據某些實施方式,個體是人類,其中修飾的EKLF多肽包含序列編號:10的胺基酸序列;相較於序列編號:3的野生型人類EKLF多肽,序列編號:10的胺基酸序列具有一胺基酸置換,其中是以精胺酸取代第54個殘基位置的離胺酸(即,K54R取代)。依據某些實施方式,個體是小鼠,其中修飾的EKLF多肽包含序列編號:11的胺基酸序列;相較於序列編號:1的野生型小鼠EKLF多肽,序列編號:11的胺基酸序列具有一胺基酸置換,其中是以精胺酸取代第74個殘基位置的離胺酸(即,K74R取代)。
當可想見,可藉由任何適當的路徑對個體投予修飾的骨髓細胞;舉例來說,靜脈內、腹腔內、動脈內或脊髓內注射。依據本揭示內容某些實施方式,是以靜脈注射方式對個體投予修飾的骨髓細胞。
依據某些實施方式,個體是小鼠,其中是將約1×10
4到1×10
8個修飾的骨髓細胞移植至個體體內。較佳地,將約1×10
5到1×10
7個修飾的骨髓細胞移植至個體體內。更佳地,將約5×10
5到5×10
6個修飾的骨髓細胞移植至小鼠個體。在一特定實施例中,移植約1×10
6個修飾的骨髓細胞即足以於小鼠個體產生保護及/或治療的效果。
一般來說,在進行人類骨髓移植時,每次移植劑量約為每公斤個體體重1×10
7到1×10
8個骨髓細胞。每次移植劑量的最少數量為每公斤個體體重1×10
7到2×10
7個骨髓細胞。依據本揭示內容某些實施方式,以本發明修飾的骨髓細胞進行部分的(20%-50%)血液置換即可於受體產生治療功效(例如,改善或治療與ALS相關的病症)。換句話說,20%-50% 的血液置換(例如,每次移植劑量約為每公斤個體體重2×10
6到5×10
7個本發明修飾的骨髓細胞)即足以於ALS病患產生治療功效,據以大幅降低移植需要的細胞數量及照射的輻射劑量,進而減少骨髓移植及伽馬射線造成的副作用。當可想見,移植至人類個體之修飾的骨髓細胞數量可隨著個體年齡、性別、存在的疾病、治療方案、血紅素、血清白蛋白、Karnofsky功能評估量表(Karnofsky performance status)、調理療法(conditioning regimen)及感染等臨床因素而有所調整。習知技藝人士或臨床醫療人員可依據特定目的來調整或最佳化修飾之骨髓細胞的移植數量。
依據某些實施方式,投予修飾的骨髓細胞可改善個體的運動行為及學習記憶力。
當骨髓細胞是個體的同種異體或異種骨髓細胞時,本發明方法更包含於投予修飾的骨髓細胞之前、同時或之後,對個體投予一免疫抑劑治療,據以抑制個體產生對抗同種異體或異種骨髓細胞的免疫反應。可利用習知技藝人士所熟知的藥劑及/或方法來達到免疫抑制的目的,據以預防移植排斥;舉例來說,投予伽馬射線照射或免疫抑制劑。依據本揭示內容某些實施方式,是於投予本發明修飾的骨髓細胞之前,對個體投予免疫抑制處理。
依據欲求目的之不同,免疫抑制劑可以是醣皮質素(例如,普賴蘇(prednisone)、亞丁皮質醇(budesonide)、普賴蘇穠(prednisolone)、地塞松(dexamethasone)或氫皮質酮(hydrocortisone))、JAK抑制劑(例如,托法替尼(tofacitinib))、鈣調磷酸酶抑制劑(calcineurin inhibitor;例如環孢素(cyclosporine)或他克莫司(tacrolimus))、mTOR抑制劑(例如,西羅莫司(sirolimus)或依維莫司(everolimus))、肌苷單磷酸去氫酶(inosine monophosphate dehydrogenase, IMDH)抑制劑(例如,硫唑嘌呤(azathioprine)、來氟米特(leflunomide)或黴酚酸(mycophenolate))、生物製劑或單株抗體(例如,阿巴西普(abatacept)、阿達木單抗(adalimumab)、阿那白滯素(anakinra)、塞妥珠單抗(certolizumab)、依那西普(etanercept)、戈利木單抗(golimumab)、英利昔單抗(infliximab)、依奇珠單抗(ixekizumab)、那他珠單抗(natalizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、司庫奇尤單抗(secukinumab)、托珠單抗(tocilizumab)、烏司奴單抗(ustekinumab)、維得利珠單抗(vedolizumab)、巴利昔單抗(basiliximab)或達利珠單抗(daclizumab)),或是任何已知可用以抑制或降低免疫反應的藥劑,例如胺甲喋呤(methotrexate)或巰醇嘌呤(mercaptopurine)。臨床醫療人員或習知技藝人士可依據個體的生理狀況來決定免疫抑制劑的種類及治療療程。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣,以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明,且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後,可在不需過度解讀的情形下,完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻,其全文皆視為本說明書的一部分。
實施例
材料及方法
製備
Eklf (K74R) 小鼠
建立具有C57BL/6 (B6)背景的
Eklf(K74R)小鼠。簡單來說,以包含構建體loxP-PGK-gb2-neo-loxP-E2 (K74R)的重組反轉錄病毒藉由同源重組將K74R突變導入B6小鼠之
Eklf基因的外顯子2 (exon 2, E2)中,之後與Ella-Cre小鼠進行交配以切除新黴素(neomycin, neo)篩選標記。使異型組合的(heterozygous)
Eklf(K74R/+)小鼠交配以得到同型組合的(homozygous)突變
Eklf(K74R/K74R)小鼠,以下稱為
Eklf(K74R)小鼠。
製備
ALS (N390D/+) 小鼠
依據標準流程來製備帶有
Tardbp(TDP-43)突變的小鼠。利用反淘汰(counter-selection) BAC修飾套組將於
Tardbp外顯子6帶有一突變(N390D)的標的載體轉殖到BAC殖株RP23-364 M1中,其中N390D是以核苷酸G取代1168位置的核苷酸A。將具有loxP序列組合的neo抗性基因(PGK-neo基因組)插入
Tardbp的內含子4 (intron 4)中,以篩選ES細胞。擴增二個獨立的標的ES細胞株(#108及#361)後,將細胞株微注射到C57BL/6 J胚囊中,以製備嵌合體小鼠。確認於TDP-43中帶有N390D突變的基因敲入(knock-in) ES細胞。為由標的
Tardbp對偶基因中移除PGK-neo基因組,將生殖系傳遞的(germline-transmitting) F1子代與全身會表現Cre重組酶的Ella-Cre小鼠(Tg (EIIa-cre) C5379Lmgd)交配。對cDNA及基因組DNA進行定序分析,以確認A315T/+或N390D/+小鼠的基因型。由工作人員照料生病的小鼠,包含餵食軟性食物、於籠壁上噴灑飲用水,以及使用軟性材料等。利用正向引子5’-GACCTCAACTGCTCTGCTTCTACC-3’ (序列編號:12)及反向引子5’-AACGGAATCAATCCTCTCCAGG-3’ (序列編號:13)以PCR來分析基因敲入小鼠的基因型。
製備
N390D/+/Eklf (K74R)
小鼠
將
Eklf(K74R)小鼠與ALS (N390D/+)小鼠進行交配,以製備N390D/+/
Eklf(K74R)小鼠
。所有動物皆依據中央研究院動物照護及使用委員會(Institute Animal Care and Use Committee, IACUC)的規定,於標準實驗室條件下,飼養於特定無菌的環境中。
骨髓移植
(Bone marrow transplantation, BMT)
將源自3.5個月大之CD45.1供體小鼠的骨髓細胞移植到3.5個月大之CD45.2受體ALS小鼠。具體來說,犠牲
Eklf(K74R)供體小鼠(CD45.1)後,移除其股骨。利用27號針頭及注射器以RPM I1640細胞培養液沖洗股骨,以得到骨髓細胞。將細胞培養於包含抗B細胞、T細胞及NK細胞之抗體的小鼠補體緩衝液中,於37°C放置30分鐘,之後以PBS洗滌細胞二次,再注入FICOLL
®梯度離心,以收集骨髓單核細胞(bone marrow mononuclear cell, BMMNC)。將源自供體小鼠之BMMNC (1×10
6細胞/小鼠)注入受體ALS小鼠(CD45.2)的尾靜脈中,其中該受體ALS小鼠(CD45.2)是先以10、5或2.5 Gy的伽馬射線照射全身。骨髓移植12週後,以流式細胞儀來分析受體ALS小鼠中CD45.1及CD45.2細胞的血液成分,並利用滾輪運動測試及水迷宮(water maze)來測量小鼠的運動能力。
統計分析
以平均值±標準差(mean ± standard deviation, SD)或平均值的標準誤差(standard error of the mean, SEM)來表示分析數據。利用軟體來比對不同實驗條件的數據。除非另有所指,否則各誤差槓代表SEM。藉由司徒頓t檢驗(Student’s t test)來評估小鼠的運動能力是否有顯著差異。當p值小於0.05時,實驗組間的差異視為具有統計意義。
實施例
1
Eklf(K74R)
突變對
ALS
的功效
本實施例利用二種動物模式(包含基因交配模式及骨髓移植模式)來分析
Eklf(K74R)突變對ALS的功效。
在基因交配模式中,將N390D/+/
Eklf(K74R)小鼠(即,具有
Eklf(K74R)對偶基因的ALS小鼠)於滾輪運動測試的運動能力與ALS對照小鼠(即,N390D/+小鼠)的運動能力進行分析比對。如第1A圖的結果所示,即使一開始N390D/+/
Eklf(K74R)小鼠與ALS對照組皆出現運動功能障礙,N390D/+/
Eklf(K74R)小鼠於8個月大時的行為能力會顯著優於同齡N390D/+小鼠的行為能力。
在骨髓移植模式中,將
Eklf(K74R)供體小鼠的BMMNC靜脈投予至ALS受體小鼠。第1B圖的數據指出,骨髓移植4個月後,相較於對照組,接受
Eklf(K74R)小鼠之骨髓的ALS小鼠具有顯著較佳的運動能力。
總結上述,本揭示內容的數據證實
Eklf(K74R)突變於治療ALS的功效。基於此發現,本揭示內容提供了利用
Eklf(K74R)核酸、EKLF (K74)多肽或是包含
Eklf(K74R)基因之骨髓細胞來治療ALS的方法,據以改善或減緩與ALS相關的病症。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例,然其並非用以限定本發明,本發明所屬技術領域中具有通常知識者,在不悖離本發明之原理與精神的情形下,當可對其進行各種更動與修飾,因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂,所附圖式之說明如下:
第1A圖之柱狀圖闡述基因交配(genetic-crossed)小鼠於滾輪運動測試(rotarod test)的行為比對數據;N>5;*, p<0.05;**, p<0.01;TDP-43(+/+);
Eklf(+/+):具有野生型
Eklf基因及野生型TAR DNA結合蛋白(TAR DNA binding protein,
Tardbp)基因的野生型小鼠;TDP-43(
N390D/+);
Eklf(+/+):具有突變(N390D)
Tardbp基因及野生型
Eklf基因的ALS小鼠;TDP-43(+/+);
Eklf(K74R/K74R):具有野生型
Tardbp基因及突變
Eklf(K74R)基因的
Eklf(K74R)小鼠;TDP-43(
N390D/+);
Eklf(K74R/K74R):具有突變(N390D)
Tardbp基因及突變
Eklf(K74R)基因的
N390D/+/Eklf (K74R)小鼠。
第1B圖之柱狀圖闡述在接受特定的骨髓移植後,小鼠於滾輪運動測試的分析結果;N>5;*, p<0.05;**, p<0.01;WT:具有野生型
Eklf基因及野生型
Tardbp基因的野生型小鼠;ALS:具有突變(N390D)
Tardbp基因及野生型
Eklf基因的ALS小鼠;
Eklf(K74R):具有野生型
Tardbp基因及突變
Eklf(K74R)基因的
Eklf(K74R)小鼠。
無
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Claims (11)
- 一種修飾的紅血球Kruppel樣因子(Erythroid Kruppel-like factor, EKLF)多肽、修飾的核酸或修飾的骨髓細胞於製備一用以預防或治療一個體之神經退化性疾病的藥物的用途,其中該修飾的核酸是用以編碼該修飾的EKLF多肽,且該修飾的骨髓細胞包含該修飾的核酸,其中該修飾的EKLF多肽包含一胺基酸修飾,以使其類小泛素化(sumoylation)程度低於一野生型EKLF多肽的類小泛素化程度。
- 如請求項1所述之用途,其中該個體是一人類,且該胺基酸修飾是將序列編號:3之野生型EKLF多肽上第54個胺基酸位置的離胺酸殘基置換為精胺酸殘基。
- 如請求項2所述之用途,其中該修飾的EKLF多肽包含序列編號:10的胺基酸序列。
- 如請求項1所述之用途,其中該個體是一小鼠,且該胺基酸修飾是將序列編號:1的野生型EKLF多肽上第74個胺基酸位置的離胺酸殘基置換為精胺酸殘基。
- 如請求項4所述之用途,其中該修飾的EKLF多肽包含序列編號:11的胺基酸序列。
- 如請求項1所述之用途,其中該修飾的骨髓細胞包含修飾的造血幹細胞(hematopoietic stem cells, HSCs),或是修飾的造血幹細胞及前驅細胞(hematopoietic stem and progenitor cells, HSPCs)。
- 如請求項1所述之用途,其中該修飾的骨髓細胞是該個體的自體細胞。
- 如請求項1所述之用途,其中該修飾的骨髓細胞是該個體的同種異體或異種細胞。
- 如請求項8所述之用途,其中該個體是經伽馬射線照射或投予一免疫抑制劑。
- 如請求項1所述之用途,其中是對該個體靜脈投予該藥物。
- 如請求項1所述之用途,其中該神經退化性疾病是肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、路易體失智症(Lewy Body Dementia, LBD)、帕金森氏症(Parkinson’s disease, PD)、阿茲海默症(Alzheimer’s disease, AD)、多發性硬化症(multiple sclerosis, MS)或杭丁頓氏症(Huntington's disease, HD)。
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