JP2020029468A - 細胞パターニング用材料 - Google Patents

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博巳 北野
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和義 松岡
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Abstract

【課題】簡便且つ安価な処理により細胞非接着性から細胞接着性へと改質される細胞培養用基材，特に位置特異的に１種又は２種以上の細胞を培養できる基材を提供すること。【解決手段】光改質性ポリマーであって，構成要素（Ａ）として式（１），【化１】〔式中，Ｒ１は水素又はメチル基，Ｒ２は炭素数１〜２２のアルキル基を，それぞれ表し，ｎは１〜３０の整数を表す。〕で示されるモノマーと，トリアルコキシシリル基を備えた構成要素（Ｂ）とを含んでなるものである，光改質性ポリマー，及びこれより形成された層を表面に有する細胞培養用基材。【選択図】なし

Description

本発明は，バイオマテリアルの分野，より具体的には基材表面にタンパク質や細胞等の生体物質を位置特異的に配列させるための技術に関し，特に，細胞パターニングを可能にする材料，細胞を基材上に位置特異的に接着させた状態で培養するための基材，及びその製造方法に関する。
現在，種々の動植物細胞の培養が行われるようになってきており，また，細胞の新たな培養法が開発されている。細胞培養の技術は，細胞の生化学的現象や性質の解明，有用な物質の生産などの目的で利用されている。
大半の細胞，特に多くの動物細胞（血球系細胞は除く）は，何かに接着して生育する，という接着依存性を有しており，生体外の浮遊状態では，長期間生存させることができない。このような接着依存性を有する細胞の培養には，細胞が接着するための担体が必要である。そのような担体として，一般に，コラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞接着性タンパク質を均一に塗布したプラスチック製のシャーレが用いられている。これらの細胞接着性タンパク質は，培養細胞に作用し，細胞の接着を容易にしたり，細胞の形態に影響を与えることが知られている。
一方，培養細胞を基材上の微小な部分にのみ接着させて配列させる技術が報告されている。そのような技術によれば，培養細胞を人工臓器やバイオセンサ，バイオリアクターなどに応用することが可能になる。培養細胞を配列させる方法としては，細胞の接着容易性を異にする領域がパターン化された表面を有する基材を用い，その表面で細胞を培養して，細胞が接着し易い表面領域だけに細胞を接着させることによって，基材上に所定の形で細胞を配列させる方法がとられている。
例えば，特許文献１には，回路状に神経細胞を増殖させる等の目的で，表面に静電荷パターンを形成させた電荷保持媒体を細胞培養に応用することが記載されている。また，特許文献２には，細胞非接着性及び細胞接着性の各光感受性親水性高分子を用いて，フォトリソグラフィ法でパターニングした表面上への培養細胞の配列の試みが記載されている。
更に，特許文献３には，細胞の接着率や形態に影響を与えるコラーゲンなどの物質が表面にパターニングされた細胞培養用基材と，この基材をフォトリソグラフィ法によって作製する方法が記載されており，そのような基材の上で細胞を培養することによって，コラーゲン等の物質がパターニングされた部分に他の部分より多くの細胞を接着させることで，細胞のパターニングが実現されている。
このような細胞接着部位のパターニングは，用途によっては高精細であることが要求される。上述したような感光性材料を用いたフォトリソグラフィ法等によりパターニングを行う場合，高精細なパターンを得ることはできるが，細胞接着性材料が感光性を有する必要がある。生体高分子等には，このような感光性を付与するための化学的修飾を行うことが困難な場合が多く，細胞接着性材料の選択性の幅が極めて狭くなるといった問題があった。また，フォトレジストを用いたフォトリソグラフィ法では，現像液等による処理が必要であり，それらが細胞培養に際して悪影響を及ぼす場合があった。
加えて，タンパク質や細胞等（以下，あわせて「生体物質」ともいう。）を位置特異的に基材表面に配列させる技術は，再生医学や分子生物学，細胞生物学の研究及び新薬等の開発において，益々幅広い応用が期待されており，生体に準じた環境下で基材の表面を自在に改質できる技術が求められている。特に，細胞やタンパク質が存在する環境において，基材の一部表面をその場で（in situ）改質できる技術が特に必要とされており，中でも，様々な生体物質に対し比較的少ない影響で実施できる技術が最も求められている。しかしながら，様々な生体物質を，生体に準じた環境下に，位置特異的に制御御できる表面の作製は，依然として，非常に困難である。
そのような表面を作製して利用できれば，タンパク質−タンパク質間・細胞−細胞間・細胞−タンパク質間等，様々な相関関係を疑似的な生体系で評価することが可能となる。すべての細胞制御は，タンパク質やホルモンなど循環血流や体液により運ばれる生理活性分子（以下，「液性因子」という。）の作用だけではなく，細胞問での相互作用によっても行われているため，上記の評価系の構築が必墜となる。細胞−細胞間相互作用と液性因子による作用が協同して細胞の制御を行っていることは理解されているものの，それら２つの作用の程度，重要度の差等，理解されていないことが多い。特に，種類の異なる細胞問における「細胞−液性因子間相互作用」や「細胞−細胞間相互作用」の理解は，細胞生物学的に，更には，細胞や臓器・組織の制御を理解する上で非常に重要である。しかしながら，これらの相互作用の評価，特に，それぞれの相互作用を分離して個々に評価できるin vitro 実験系の構築が困難であったため，あまり理解が進んでいない。
本発明者らは，タンパク質や細胞といった生体分子と応答しないポリマーとして知られる双性イオン型ポリマーをグラフトした表面が，タンパク質の吸着や細胞の接着を強く抑制することを報告してきた（非特許文献１及び２）。また，双性イオン型ポリマー担持表面をイオンビーム照射や紫外線照射により改質することで，細胞を選択的にパターニング（配置固定）することが可能であることも見出している（非特許文献３）。
特開平２−２４５１８１号公報 特開平３−７５７６号公報 特開平５−１７６７５３号公報
Kitano，H.; Suzuki，H.; Matsuura，K.; Ohno，K., Langmuir 2010，26，6767. Suzuki，H.; Murou，M.; Kitano，H.; Ohno，K., Colloids Surfaces B: Biointerfaces 2011，84，111. Suzuki，H.; Li，L.; Nakaji-Hirabayashi，T.; Kitano，H.;Ohno，K.; Matsuoka K ;. Saruwatari，Y., Colloids Surfaces B: Biointerfaces 2012，94，107.
上記背景において，本発明の一目的は，簡便且つ安価な処理により細胞非接着性から細胞接着性へと改質できる細胞培養用基材を提供することにある。本発明の更なる一目的は，そのような材料で表面が被覆された基材であって，細胞のパターニングを可能にする基材及びその製造方法を提供することにある。本発明の更なる一目的は，細胞に実質的な損傷を与えることなく種類の異なる複数の細胞集団のパターニングを容易にするものである基材，及びその製造方法を提供することにある。本発明の尚も更なる一目的は，そのような基材であって，細胞活動の制御における細胞−細胞間相互作用と細胞−液性因子間相互作用を分離して個々に評価することを可能とするよう，種類の異なる複数の細胞集団を相互に隣接させてパターニングすることを可能にする基材，及びその製造方法を提供することにある。
上記の目的に沿った検討において，本発明者らは，水中において生体物質対して比較的影響が少ない波長の紫外線により側鎖を改変できるようなポリマーがこの目的に合致する潜在的可能性，及びそのようなポリマーを用いた基材の表面改質を着想した。これに基づく更なる検討の結果，ポリエチレングリコール部分を有する（メタ）アクリレート系モノマーであって，特定波長の紫外線等の電磁波の照射により当該ポリエチレングリコール部分を脱離させることが可能なモノマーを材料に用いて形成されたポリマー層を表面に備えた基材により，その表面への細胞吸着やタンパク質の接着が，簡便な仕方で部位特異的に制御可能となることを見出し，更に検討を重ねて本発明を完成させた。即ち，本発明は以下を提供するものである。
１．光改質性ポリマーであって，構成要素（Ａ）として式（１），
〔式中，Ｒ１は水素又はメチル基，Ｒ２は炭素数１〜２２のアルキル基を，それぞれ表し，ｎは１〜３０の整数を表す。〕で示されるモノマーと，トリアルコキシシリル基を備えた構成要素（Ｂ）とを含んでなるものである，光改質性ポリマー。
２．該構成要素（Ｂ）におけるトリアルコキシシリル基を構成する各アルコキシ基が，それぞれ独立して，炭素数１〜４のものである，上記１の光改質性ポリマー。
３．該構成要素（Ａ）の複数が重合してなる部分を含むポリマー鎖の末端に，該構成要素（Ｂ）のトリアルコキシシリル基が位置しているものである，上記１又は２の光改質性ポリマー。
４．該構成要素（Ｂ）が，式（２），
〔式中，Ｒ３は水素又はメチル基，Ｒ４は炭素数１〜８のアルキレン基，Ｒ５，Ｒ６及びＲ７は，それぞれ独立して炭素数１〜４のアルキル基を，それぞれ表す。〕で示されるものである，上記１又は２の光改質性ポリマー。
５．式（１）で示される構成要素（Ａ）と式（２）で示される構成要素（Ｂ）とを含んでなり，それらモル比が，構成要素（Ａ）：構成要素（Ｂ）＝７５：２５〜９８：２である，上記４の光改質性ポリマー。
６．該ポリマーが次式（３），
〔式中，Ｒ８は，炭素数１〜４の飽和炭化水素基を有してよい芳香族基，Ｒ９は水素又はメチル基，Ｒ１０，Ｒ１１及びＲ１２は，互いに独立して炭素数１〜４個のアルコキシ基，そしてＺは，基−Ｓ−Ｃ（Ｓ）−Ｓ−Ｒ１３を表し，ここにＲ１３は，炭素数１〜６のアルキル基を表す。〕で示される構造を有するものである，上記３の光改質性ポリマー。
７．基材とその表面に形成されたポリマー層とを含んでなる細胞培養用基材であって，該ポリマー層が，上記１〜６の何れかの光改質性ポリマーであり，該構成要素（Ｂ）のトリアルコキシシリル基と該基材との反応で形成された結合により，該ポリマー層が該基材に保持されているものである，細胞培養用基材。
８．該基材が，ガラス，セラミック，金属，又はガラス系プライマーで処理された樹脂からなるものである，上記７の細胞培養用基材。
９．細胞培養用基材の製造方法であって，上記１〜５の何れかの光改質性ポリマーを基材表面に適用することを含むものである，製造方法。
１０．細胞培養用基材の製造方法であって，
構成要素（Ａ）として，式（１），
〔式中，Ｒ１は水素又はメチル基，Ｒ２は炭素数１〜２２のアルキル基を，それぞれ表し，ｎは１〜３０の整数を表す。〕で示されるモノマーと，
構成要素（Ｂ）として，式（２），
〔式中，Ｒ３は水素又はメチル基，Ｒ４は炭素数１〜８のアルキレン基，Ｒ５，Ｒ６及びＲ７は，それぞれ独立して炭素数１〜４のアルキル基を，それぞれ表す。〕で示されるモノマーとを該基材上で共重合させることを含んでなる，製造方法。
１１．該基材が，ガラス，セラミック，金属，又はガラス系プライマーで処理された樹脂からなるものである，上記１０の製造方法。
１２．種類の異なる細胞集団を同一の基材上のそれぞれに対応する領域に接着させた状態で共培養する方法であって，上記７又は８の細胞培養用基材の第１の領域に紫外線を照射して改質した後，第１の種類の細胞を該基材上で培養して該第１の領域に該第１の種類の細胞の集団を接着させるステップと，該基材の該第１の領域以外の第２の領域に紫外線を照射して改質した後，第１の種類とは異なる第２の種類の細胞を該基材上で培養して該第２の領域に該第２の種類の細胞の集団を接着させるステップとを含むものである，方法。
上記構成になる本発明の細胞培養用基材の表面には，そのままでは，生体に準じた環境下において細胞が接着しない。しかしながら，これに紫外線を照射すると，表面のポリマーが変化し（ポリエチレングリコール部分の脱離），細胞接着可能な表面へと改質される。このため，フォトマスクを介する等により，基材表面のうち，細胞を接着させようとする特定領域にのみ予め紫外線を照射して改質しておくというごく簡便且つ安価な処理のみで，ある種類の細胞を，当該特定の領域のみに接着させた状態で培養することが可能となる。
またそのようにある種類の細胞を特定領域のみに接着させた状態において，他の領域（残りの領域の全部又は一部）に紫外線の照射を行うことで，当該新たな照射領域に新たな細胞（例えば，別の種類の細胞）を接着させた状態で培養することも可能となる。またこのとき，例えば，既に基板上に接着している細胞に大きな影響を及ぼさない波長の光（例えば，波長３６０〜３７０ｎｍの紫外線）を基材全体に照射することもできる。その場合，既存の細胞接着領域の周囲の基材表面のポリマーも改質されるから，その後に別の種類の細胞を播種し培養すれば，それらは基板の新たな改質領域に接着し伸展して，先行の接着細胞集団に接した新たな接着細胞集団を形成する。
また，必要に応じて基材表面の異なる領域の照射と細胞の播種及び培養とを，３段階以上に分けて順次行うことで，基材表面の３つ以上の領域に夫々異なった種類の細胞を接着させた状態で培養することも可能となる。
このようにして，本発明によれば，同一基材上のそれら相互に接している複数の細胞集団を利用して，細胞−細胞間相互作用と細胞−液性因子間相互作用を分離して個々に評価することが可能となり，またこれを新薬等の研究開発に利用することも可能となる。
図１は，細胞培養用基材の特定部位への紫外線照射による改質及び当該部位への細胞接着を示す概念図である。 図２は，細胞培養用基材の他の部位の紫外線による改質及び当該部位への他の追加の種類の細胞の接着を示す概念図である。 図３は，基材の紫外線照射の方法を示す概要図である。 図４は，特定部位に紫外線（３００〜４００ｎｍ）を照射した実施例１の細胞培養用基材上における，１日間の細胞培養後の，細胞の接着状態を示す顕微鏡写真である。左欄は照射領域，右欄は非照射領域，中央欄は両者の中間領域を示す。写真中のバーは，上から，５００μｍ，２００μｍ及び１００μｍを，それぞれ示す。 図５は，特定部位に紫外線（３００〜４００ｎｍ）を照射した実施例１の細胞培養用基材上における，３日間の細胞培養後の，細胞の接着状態を示す顕微鏡写真である。左欄は照射領域，右欄は非照射領域，中央欄は両者の中間領域を示す。写真中のバーは，２００μｍを示す。 図６は，特定部位に紫外線（３６０〜３７０ｎｍ）を照射した実施例１の細胞培養用基材上における，１日間の細胞培養後の，細胞の接着状態を示す顕微鏡写真である。左欄は照射領域，右欄は非照射領域，中央欄は両者の中間領域を示す。写真中のバーは，上から，５００μｍ，２００μｍ及び１００μｍを，それぞれ示す。 図７は，特定部位に紫外線（３６０〜３７０ｎｍ）を照射した実施例１の細胞培養用基材上における，３日間の細胞培養後の，細胞の接着状態を示す顕微鏡写真である。左欄は照射領域，右欄は非照射領域，中央欄は両者の中間領域を示す。写真中のバーは，２００μｍを示す。 図８は，特定部位に紫外線（３６０〜３７０ｎｍ）を照射した実施例２の細胞培養基剤における，非照射部位と照射部位での接触角の相違を示すグラフである。 図９は，特定部位に紫外線（３６０〜３７０ｎｍ）を照射した実施例２の細胞培養基剤における，非照射部位と照射部位でのタンパク質吸着の相違を示すグラフである。 図１０は，特定部位に紫外線（３６０〜３７０ｎｍ）を照射した実施例２（高分子量タイプ）の細胞培養用基材上における，１日間の細胞培養後の，細胞の接着状態を示す顕微鏡写真である。上段は紫外線非照射領域（UV(-)），下段は紫外線照射領域（UV(+)）のものである。写真中のバーは，２００μｍを示し，各写真の倍率は同一である。 図１１は，特定部位に紫外線（３６０〜３７０ｎｍ）を照射した実施例２（低分子量タイプ）の細胞培養用基材上における，３日間の細胞培養後の，細胞の接着状態を示す顕微鏡写真である。上段は紫外線非照射領域（UV(-)），下段は紫外線照射領域（UV(+)）のものである。写真中のバーは，２００μｍを示し，各写真の倍率は同一である。
本発明において，構成要素（Ａ）としての式（１）
〔式中，Ｒ１は水素又はメチル基，Ｒ２は炭素数１〜２２のアルキル基を，それぞれ表し，ｎは１〜３０の整数を表す。〕で示されるモノマーは，例えば，特許５４１００３４号公報，特許５４１９０２号公報，特許５１９８８４５号公報又は特開２０１２−１４４６８４号公報に記載されている方法で合成することできる。Ｒ２の炭素数は，例えば，１，２，３，４，６，１０，１８，２０，２２であることができる。整数ｎは好ましくは１ 〜２５，より好ましくは２〜２０，更に好ましくは３〜１０である。
本発明において，構成要素（Ｂ）が式（２），
〔式中，Ｒ３は水素又はメチル基，Ｒ４は炭素数１〜８，より好ましく１〜６，更に好ましくは１〜４のアルキレン基，Ｒ５，Ｒ６及びＲ７は，それぞれ独立して炭素数１〜４，より好ましくは１〜３のアルキル基を，それぞれ表す。〕で示されるものである場合，その好ましい具体例としは，（メタ）アクリル酸プロピルトリメトキシシラン，（メタ）アクリル酸プロピルトリエトキシシラン，（メタ）アクリル酸プロピルトリイソプロピルシラン，（メタ）アクリル酸エチルトリメトキシシラン，（メタ）アクリル酸エチルトリエトキシシラン，（メタ）アクリル酸エチルトリイソプロピルシラン等が挙げられるが，これらに限定されない。
本発明において，光改質性ポリマーが，式（１）で示される構成要素（Ａ）と式（２）で示される構成要素（Ｂ）とを含んでなるものである場合，それらのモル比，構成要素（Ａ）：構成要素（Ｂ）は，好ましくは７５：２５〜９８：２，より好ましくは８０：２０〜９８：２，更に好ましくは８５：１５〜９５：５である。
本発明において，光改質性ポリマーが適用される基材は，例えばガラス，セラミック，金属，又は表面がガラス系プライマーで処理された樹脂から選ばれる。基剤がガラスである場合，好ましいガラスの一例として，ケイ酸ガラス（ソーダ石灰ガラス，ホウケイ酸ガラス，石英ガラス等）が挙げられる。また，表面がガラス系プライマーで処理されている限り任意の樹脂を用いることができる。例えば，ポリエチレン，ポリプロピレン，ポリスチレン，ポリ塩化ビニル，ナイロン，ポリウレタン，ポリウレア，ポリ乳酸，ポリグリコール酸，ポリビニルアルコール，ポリ酢酸ビニル，ポリ（メタ）アクリル酸，ポリ（メタ）アクリル酸誘導体，ポリアクリロニトリル，ポリ（メタ）アクリルアミド，ポリ（メタ）アクリルアミド誘導体，ポリスルホン，ポリカーボネート，セルロース，セルロース誘導体，ポリシリコーン等であり，これらの樹脂は単独または組み合わせて使用してもよい。
本発明において，基材表面への光改質性ポリマー層の形成方法は特に限定されない。例えば，先ず重合体を得て，これを基材表面に塗布，噴霧等適宜の方法で適用して被膜形成することができるほか，各モノマーと開始剤とを含有する液を基材表面に塗布し，熱や光で重合させて，被膜形成することもできる。
本発明の光改質性ポリマーは，例えば，構成要素（Ａ）及び（Ｂ）としてそれぞれ選ばれたモノマーを含む重合成分を，水溶液中又は有機溶剤中で共重合させることにより得ることができる。即ち，所望量の各モノマーを精製水または有機溶剤に充分に溶解させ，これを攪拌しながら重合開始剤を添加し，不活性ガス雰囲気下で共重合を行う等すればよい。また必要に応じて，連鎖移動剤を用いることができる。モノマーと開始剤とを含む液体を調製するに際し，モノマーの選択に応じて溶剤としての水溶液や有機溶剤は，用いても用いなくてもよい。
有機溶剤には特に限定はなく，例えばメチルアルコール，エチルアルコール，イソプロピルアルコール，エチレングリコール，プロピレングリコール等のアルコール類；アセトン，メチルエチルケトン等のケトン類；ジエチルエーテル，テトラヒドロフラン等のアルキルエーテル類；ベンゼン，トルエン，キシレン等の芳香族類；n−ヘキサン，シクロヘキサン等の炭化水素；酢酸メチル，酢酸エチル等の酢酸エステル；及び水等，通常の溶液重合用いられるものを適宜用いることができる。
なお，水溶液や有機溶剤中で共重合を行わせる場合，重合性成分の濃度が１０〜８０重量％程度となるように調整することが好ましい。
本発明において使用できる重合開始剤にも特に限定はない。例えば，アゾイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ），アゾイソ酪酸メチル，アゾビスジメチルバレロニトリル，過酸化ベンゾイル，過硫酸カリウム，過硫酸アンモニウムなどの通常のアゾ系重合開始剤や，過酸化物系重合開始剤を，適宜選択して用いることができる。また，光重合開始剤としては，ベンゾフェノン誘導体，ホスフィンオキサイド誘導体，ベンゾケトン誘導体，フェニルチオエーテル誘導体，アジド誘導体，ジアゾ誘導体，ジスルフィド誘導体などの光重合開始剤を用いることができる。
重合開始剤の量は，通常重合性成分１００重量部に対して，通常は０．０１〜５重量部程度であればよいが，これに限定されない。
本発明において使用できる前記連鎖移動剤についても，特に限定はない。例えばラウリルメルカプタン，ドデシルメルカプタン，チオグリセロールなどのメルカプタン基を有する化合物や次亜リン酸ナトリウム，亜硫酸水素ナトリウムなどの無機塩などが使用できる。そのような連鎖移動剤の量は，通常，通常重合性成分１００重量部に対し０．０１〜１０重量部程度であればよいが，これに限定されない。
本発明において，具体的には，図１〜２に示すように，表面にポリマー層を構築した基材に対し，最初に一部の領域にのみ紫外線を照射し，当該領域のみを細胞接着が可能な表面へと改質し，そこに１種類の細胞接着を促す。次に，接着している細胞に実質的な傷害を与えない仕方で２回目の紫外線照射を行えば，細胞の非接着領域のポリマー層を細胞接着が可能な表面へと改質されるため，２種類目の細胞をその新たな細胞接着可能表面に接触させて接着させることができる。細胞に実質的な傷害を与えずに第２の紫外線照射を行うには，例えば，そのような波長の紫外線選択（例えば，３６０〜３７０ｎｍ）を選択して，細胞が接着している領域を含む基板全体を照射するか，あるいは非照射であった領域にのみ紫外線が照射されるよう，フォトマスク等の遮蔽物を介して照射を行うことができるが，これらに限らず，目的や培養の状況に応じて適宜，便利な方法を選んで行えばよい。
このようにして基材表面において種類の異なる細胞をそれぞれ位置特異的に接着させて培養した場合，種類の異なる細胞同士の境界領域では，異種細胞間の相互作用および分泌因子による作用で，また，異種細胞同士が接触していない領域にあるそれぞれの細胞は，ホルモンその他の循環因子による作用のみで，制御されると考えられる。従って，このように種類の異なる細胞を同一表面上でパターニングした細胞培養基材を用いることで，細胞活動の制御を行う上記２つの作用の程度，重要度の差などを，単一培養系で同時に評価することが可能となる。
以下，実施例を参照して本発明を更に具体的に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
〔材料〕
・４−(クロロメチル)フェニルトリメトキシシラン（ＣＭＰＴＳ）：アヅマックス（株）
・スライドガラス：松波硝子工業（株）。26ｍｍｘ22ｍｍｘ１ｍｍに切り出して使用。
・４，４'−アゾビス（４−シアノペンタン酸）（V-501, 98.0%）：和光純薬（株）
・（メトキシポリエチレングリコール）アクリルアミド（ＭＥＧＡｍ）：大阪有機化学工業（株）
〔実施例１〕 ポリマー層の形成及び評価−１
１．ＲＡＦＴ剤及びＲＡＦＴ剤前駆体の合成
（１）ＲＡＦＴ剤（ｎ−ブチルスルファニルチオカルボニルスルファニル ２−メチルプロピオン酸）（ＢＳＴＭＰＡ）の合成
Ｋ３ＰＯ4 4.25ｇ（20 mmol）をアセトン32.0ｍLに溶解し，30分間撹拌した。反応溶液に１−ブタンチオール 2.14ｍＬ（20 mmol）を加え10分撹拌し，二硫化炭素 3.6ｍＬ（60 mmol）を加え10分間撹拌した。更に２−ブロモ−２−メチルプロピオン酸 3.34ｇ（20 mmol）を加えた後，18時間反応させた。反応終了後，生成した塩を吸引濾過により取り除き，濾液をエバポレーターで減圧濃縮し，アセトンを除去した。次にシリカゲルカラムを用いて，分離，精製を行った。溶媒としては，ヘキサン／酢酸エチル＝10：1（v/v）を用いた。ＴＬＣ上の生成物のスポット（Rf＝0.13）が確認できたものを纏めて減圧濃縮した後，ヘキサンを加えて冷凍庫に保存し再結晶させた。生成した結晶を吸引濾過により回収し，デシケーター中で乾燥させることにより，生成物を黄色粉末として得た。
収量 840 mg（17％）,1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.94,（t, 3H, -CH 3)); 1.43 (6，2H, -CH 2-CH3); 1.66 (5，2H，-CH2-CH 2-CH2-); 1.73 (s，3 H×2，CCH 3)； 3.30 (t，2H，-S-CH 2-) ppm
（２）ＲＡＦＴ前駆体（ジチオ安息香酸ナトリウム：ＳＤＴＢ）の合成
ナトリウムメトキシド 1.08ｇ（0.020 mol）を脱水したメタノール 3.6ｍＬに溶解させ，元素としてのイオウ 640ｍｇ（0.020 mol）を加え窒素ガスバブリングを行いながら撹拌した。反応溶液に塩化ベンジル 1.14ｍＬ（0.010 mol）を30分かけて滴下した後，65℃で 10時間反応させた。反応終了後，氷水に浸し，析出した塩を吸引濾過により取り除き，溶媒を減圧濃縮により除去した。水10ｍＬを加え，再度吸引濾過を行った後，濾液に ４ｍＬのジエチルエーテルを加え，分液操作を行った。同様に，更に２回分液操作を行い，回収した水層にジエチルエーテル４ｍＬ，１Ｍ HCl ５ｍＬを加え分液操作を行った。回収したエーテル層に，水６ｍＬ及び１Ｍ NaOHを加え，分液操作を行った。分液操作後，回収した水層にジエチルエーテル及び１Ｍ HCl を加える分液操作と，回収したエーテル層に水と１M NaOHを加える分液操作を上記と同様にして更に２回行った。回収した水層から減圧濃縮により溶媒を除去しアセトンを加えた。析出した塩を吸引濾過により除去した後，濾液を減圧濃縮及び減圧乾燥して，生成物を赤褐色粉として得た。収量：542ｍｇ（31％）
２・ＲＡＦＴ重合を用いたポリマーブラシの構築
（１）ガラス基板表面への４−（クロロメチル）フェニルトリメトキシシラン（ＣＭＰＴＳ）自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）の形成
４−（クロロメチル）フェニルトリメトキシシラン（ＣＭＰＴＳ）と精製トルエンとを用いて，2 v/v％ＣＭＰＴＳ溶液 40ｍＬを調製した。その中に水（UltraPure water, 18 ＭΩ, Millipore System，以下同じ。），メタノール，アセトンで予備洗浄した後，UV/ozone洗浄機（UV/ozone cleaner UV253E, フィルジェン（株））を用いて洗浄したガラス基板（22ｍｍ×26ｍｍ）を浸し，更に窒素ガス置換した後，蓋を閉め 80℃で 15時間反応を行った。シランカップリング剤で修飾した後，精製トルエンに浸して３回濯ぎ洗いし，その後窒素ガスで乾燥させた。
（２）シランカップリング剤処理ガラス基板表面へのＲＡＦＴ剤の形成
合成したＳＤＴＢとＴＨＦを用いて，20ｇ／ｍＬ ＳＤＴＢ溶液 40ｍＬを調製した。その中に，シランカップリング剤（ＣＭＰＴＳ）で処理したガラス基板を浸漬し，反応を行った。１時間静置して，ＳＤＴＢを反応させた後，メタノールに浸し３回濯ぎ洗いした後，窒素ガスで乾燥させた。
（３）ＲＡＦＴ重合によるＰＭＥＧＡｍブラシの構築
サンプル瓶にマグネティックスターラーチップ及び基板立て（テフロン（登録商標）製）を入れ，そこにＭＥＧＡｍ 2.69ｍＬ(8 mmol), V-501 2.24ｍｇ(0.008 mmol) 及びＢＳＰＭＴＡ 9.36ｍｇ(0.04 mmol) を入れ，エタノール 37.3ｍＬに溶解させた。更に，ＲＡＦＴ剤の自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を表面に形成させたガラス基板を入れた後，反応系を完全に窒素ガス雰囲気にするために窒素ガスを30分間封入した。その後，70℃の水浴中にサンプル瓶を浸漬することで反応開始とした。24時間反応させた後，氷水に反応容器を浸漬し，重合反応を停止させた。基板を取出し，メタノール及び水の順で交互に洗浄し，窒素ガスで乾燥させた。
３．接触角測定による濡れ性評価
表面の濡れ性を評価するため接触角計（FACE Contact angle meter CA-D, 協和界面科学（株））を用いて水接触角測定を行った。乾燥状態の基板を測定する液滴法の場合には，室温条件下で，３〜４μＬの水を試料に接触させてから，27，33秒後の角度の合計で示し，各基板６点ずつ評価を行い，その平均値を測定値として採用した。
４．エリプソメトリー測定による膜厚の評価
エリプソメーター（M-2000U, J.A. Woollam Co. Inc., USA）により乾燥状態の試料膜厚評価を行った。測定は，入射角 70°，波長 242ｎｍから 999ｎｍ，試料層の屈折率 1.49（ポリ（メチルメタクリレート）の値）として，空気中，室温で行った。
５．ＵＶ照射によるＰＭＥＧｍブラシ構築基板の表面改質
（１）ＵＶ照射器（300〜400 nm）による表面改質
乾燥状態のＰＭＥＧＡｍブラシ構築基板表面に，ＵＶ照射器 (SP-9, ウシオ電機 (株))を用いてＵＶ光を照射し（照射強度：７３１ｍＷ／ｃｍ２，照射時間：30分，照射直径：15ｍｍ，波長：300〜400ｎｍ，集光レンズ：SFH レンズ），水とメタノールによる洗浄を行った後，70％エタノール溶液に浸漬させ，クリーンベンチ内で風乾させて滅菌した。その後，５０μｇ／ｍＬポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）（Ｍｗ：30000〜70000）水溶液をマウントして１時間静置した。POL 溶液を除去後，滅菌水で１回洗浄し，次いで25μｇ／ｍＬラミニン/PBS (LN) 溶液をマウントして１時間静置した。PBS で２回洗浄し，細胞を播種するまでの間，培養液に浸漬した。
（２）蛍光顕微鏡（３６０〜３７０ｎｍ）による表面改質
溶液中に浸漬させたＰＭＥＧＡｍブラシ構築基板表面に，倒立蛍光顕微鏡（IX71, オリンパス(株)）の励起光（波長：３６０〜３７０ｎｍ，３２０ｍＷ/ｃｍ２，レンズ：２０倍フィールドレンズ）を３０分照射し，水とメタノールによる洗浄を行った後，７０％エタノール溶液に浸漬させ，クリーンベンチ内で風乾させ滅菌した。その後，ポリ−Ｌ−オルニチン（PLO）水溶液をマウントして１時間静置した。PLO水溶液を除去し，滅菌水で１回洗浄し，ついでラミニン溶液（細胞外マトリックスタンパク質の一種）をマウントして１時間静止した。PBSで２回洗浄し，細胞を播種するまでの間，培養液中に浸漬した。
６．表面改質基板上への神経幹／前駆細胞播種
５日間浮遊培養（neurosphere培養）することで増幅させたFischer ラット胎児（14 日胚）線条体由来神経幹／前駆細胞（ＮＳＰＣ）（第一継代細胞）を，0.05％ トリプシン−0.2ｍＭ ＥＤＴＡにより単個細胞にした。ＵＶ照射器若しくは蛍光顕微鏡を用いて表面改質を行ったＰＭＥＧＡｍブラシ構築基板上に，５×104 個/ｃｍ２の細胞密度でＮＳＰＣを播種し，３μＭ Glutamax (Gln-Ala のジアミノ酸)，５μｇ／ｍＬ ヘパリン，100 単位／ｍＬペニシリン，２％ B27 (血清代替物)，20ｎｇ/ｍＬ塩基性繊維芽細胞増殖因子 (ｂＦＧＦ)及び 20 ｎｇ／ｍＬ表皮増殖因子 (ＥＧＦ) を含む Dulbecce's Modified Eagle 培地−栄養混合物 F-12 の１：１混合液（DMEM/F12）中で，37℃，５％ CO2 下において３日間培養を行った。
７．細胞接着基板へのＵＶ照射による表面改質と照射領域への細胞伸展の評価
上の６（２）と同条件でＵＶ照射したＰＭＥＧＡｍブラシ構築基板上で 14 日間，ＮＳＰＣを培養した。細胞培養基板上に倒立蛍光顕微鏡の励起光 (360〜370ｎｍ) を所定時間照射した。照射領域は，細胞接着／非接着の境界領域とした。図３に示すように，細胞接着基板の裏側から，培養を継続した状態で照射を行った。照射処理後，培養液を交換し，培養を継続した。
また，倒立型蛍光顕微鏡を使用する場合は，基板の裏側からＵＶを照射することになるため，基板の底面からの照射が可能であるかを調査すべく，細胞培養で使用したスライドガラス及びポリスチレンシャーレ（ＴＣＰＳ）の紫外線透過性を紫外可視分光光度計（Lamda 950 UV/Vis Spectrometer, Perkin Elmer）により評価した。
８．結果
（１）ＲＡＦＴ重合によるポリマーブラシ構築の評価
ＰＭＥＧＡｍブラシ構築基板調製時の，各反応段階における液的接触角及び膜厚の推移により，基板の表面状態を評価した結果を表１に示す。無処理ガラスでの接触角が 5.2°であるのに対し，ＣＭＰＴＳ及びＳＤＴＢ修飾後ではそれぞれ 63.7°及び 62.0°と，親水性の著しい低下が認められた。これは，無処理ガラス表面のＯＨ基が，より疎水性の高い芳香環を有する表面へと変化したことによるものであり，基板表面がＲＡＦＴ剤により修飾されたことを示している。
更に，ＭＥＧＡｍの重合を行うことで，ＭＥＧＡｍ tDP 50 及びＭＥＧＡｍ tDP 200 共に濡れ性が向上した。ＰＥＧの接触角が約 40°付近であるという報告（Benhabbour, S.R. et al., Macromolecules, 2008, 13, 4817）と，ポリマーブラシの末端に存在するＲＡＦＴ剤の影響を考慮すると，これらの結果は，基板表面にＰＭＥＧＡｍブラシが構築されたことを示している。また，ＭＥＧＡｍ tDP 50では，膜厚の増加も観察された（ＭＥＧＡｍtDP 200では膜厚は測定せず）。
（２）ＰＭＥＧＡｍブラシ構築基板の表面改質に伴う細胞接着挙動の評価
（ａ）ＵＶ照射器（３００〜４００ｎｍ）による表面改質の評価
紫外線照射（７３１ｍＷ／ｃｍ２，３０分間，照射直径：１５ｍｍ）を行ったＰＭＥＧＡｍブラシ表面への細胞接着性評価を行った。１日間細胞を培養したＰＭＥＧＡｍ表面の顕微鏡画像を図４に，３日間培養した際の画像を図５に示す。図４及び５において，(a)，(a)’及び(a)” は照射領域；(b)，(b)’及び(b)” は照射領域と非照射領域の境界，(c)，(c)’，(c)” は非照射領域の，顕微鏡写真である。
１日間細胞を培養したＰＭＥＧＡｍ表面においては，非照射領域への接着細胞数は非常に少なく，接着細胞の伸展も見られず，ＰＭＥＧＡｍブラシは細胞接着抑制能を有する表面であることがわかった（図４(c)）。一方，ＵＶ照射領域には多くの接着細胞が観察され（図４(a)），更に，接着細胞の伸展も見られたことから，ＵＶ照射によりＰＭＥＧＡｍブラシ表面の細胞接着抑制能が失われていることが示された。また，ＵＶ照射領域と非照射領域との境界において，細胞接着領域と非接着領域の明瞭な境界の形成が観察された（図４(b)）。
１日間細胞を培養したものと比較して，３日間細胞培養したＰＭＥＧＡｍ表面では，ＵＶ照射領域における細胞接着の増加及び接着細胞の伸展している様子がより顕著に見られた。また，非照射領域には細胞の接着及び伸展は認められなかった。
ＰＥＧは細胞接着抑制能を示すことが知られており，ＰＭＥＧＡｍはＰＥＧ鎖を側鎖に有している。加えて，ポリマーブラシの排除体積効果等も反映され，ＰＭＥＧＡｍブラシ表面が細胞接着抑制能を示したと考えられる。しかしながら，ＰＭＥＧＡｍブラシ表面にＵＶ照射を行うことで，側鎖のＰＥＧが脱離し，細胞接着性表面へと改質されたものと考えられる。上記の結果は，ＰＭＥＧＡｍブラシ表面にＵＶ照射を行うことで，ＰＭＥＧＡｍ表面の改質及び細胞の位置選択的接着が可能であることを示している。
（ｂ）蛍光顕微鏡の励起光（３６０〜３７０ｎｍ）による表面改質の評価
蛍光顕微鏡を用いて励起光を 30 分間照射したＰＭＥＧＡｍブラシ表面への細胞接着性評価を行った。１日間細胞を培養したＰＭＥＧＡｍ表面の顕微鏡画像を図６に，３日間培養した際の画像を図７に示す。図６及び７において，(a)，(a)’及び(a)”は照射領域；(b)，(b)’及び(b)”は照射領域と非照射領域の境界，(c)，(c)’，(c)”は非照射領域の，顕微鏡写真である。
ＵＶ照射器を用いてＵＶ照射（300〜400ｎｍ）を行った場合と同様に，非照射領域のＰＭＥＧＡｍブラシ表面には細胞接着も接着細胞の伸展も見られなかった（図６(c)等，７(c)等）。また，照射領域には細胞の接着及び接着細胞の伸展が観察された（図６(a)等，図７(a)）。これらの結果は，波長 360〜370 nm の励起光照射でも，ＰＭＥＧＡｍブラシの表面改質及び細胞の位置特異的接着が可能であることを示している。
〔実施例２〕 Ｐ（ＭＥＧＡｍ−ｒ−ＭＰＴＭＳ）による基材表面の修飾
１．ポリ（ＭＥＧＡｍ−ｒ−ＭＰＴＭＳ）の合成
ＭＥＧＡｍ及びトリメチルシリルプロピルメタクリレート（ＭＰＴＭＳ）とを，エタノール中，重合開始剤としてＡＩＢＮを用いて，下の表２に示すようにモノマーの配合比率及び開始剤の量をそれぞれ変えて共重合を行い，高分子量及び点分子量の各３種のポリ（ＭＥＧＡｍ−ｒ−ＭＰＴＭＳ）を得た。
２．基材表面の修飾
上記６種類のポリ（ＭＥＧＡｍ−ｒ−ＭＰＴＭＳ）をそれぞれ10ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液とし，あらかじめ洗浄しておいたガラス基板を浸漬し，50℃で12 時間反応させた。反応後，メタノールおよび水で洗浄し，乾燥させて，下に概念的に示すように表面修飾し，細胞培養用基材とした。
３．細胞培養用基材表面のＵＶによる改質
上記で準備した各種基板を，乾燥状態で波長３６０〜３７０ｎｍの紫外線（照射強度:９７ｍＷ／ｃｍ２）を１００分間した後，水とメタノールによる洗浄を行い，70％エタノール溶液に浸漬させ，クリーンベンチ内で風乾させ滅菌した。その後，血清成分を含む培養液中に浸漬させ，細胞を播種するまでの間静置した。
４．ポリ（ＭＥＧＡｍ−ｒ−ＭＰＴＭＳ）修飾表面への紫外線照射による接触角の変化
上記６種類のポリ（ＭＥＧＡｍ−ｒ−ＭＰＴＭＳ）で修飾したそれぞれの基材表面につき，紫外線（３６０〜３７０ｎｍ）の照射領域と非照射領域の水接触角を実施例１と同様にして測定し比較した，結果を次の表及び図８に示す。
表３及び図８に見られるように，何れのポリマーについても，紫外線照射により接触角が増大するのが確認された。
５．ポリ（ＭＥＧＡｍ−ｒ−ＭＰＴＭＳ）修飾表面へのタンパク質の吸着量の変化
上記６種類のポリ（ＭＥＧＡｍ−ｒ−ＭＰＴＭＳ）で修飾したそれぞれの基材表面につき，紫外線照射（３６０〜３７０ｎｍ）の前後でのタンパク質の吸着量の変化を測定した。
即ち，上記と同様にして紫外線（３６０〜３７０ｎｍ）照射を行う前後の各基材を，血清アルブミンを溶解させたリン酸塩緩衝液（２０ｍｇ/ｍＬ）に浸漬し，２時間常温下で静置し，その後，リン酸緩衝液による洗浄により，弱く吸着したタンパク質を除去した。続いて，ビシンコニン酸タンパク質定量溶液に浸漬して３７℃で２時間反応し，その溶液の呈色を紫外可視分光光度計により測定（測定波長：５７０ｎｍ）することによって，基材表面に吸着したタンパク質を定量（ｎｇ／ｃｍ２）して比較した。結果を表４及び図９に示す。
表４及び図９から明らかなように，何れのポリマーにおいても，紫外線の照射によりタンパク質の吸着量が顕著に著しく増大した。
６．ポリ（ＭＥＧＡｍ−ｒ−ＭＰＴＭＳ）修飾表面へＵＶ照射による細胞接着性の変化
上記６種類の表面修飾基板のそれぞれにつき，上記と同様に紫外線（３６０〜３７０ｎｍ）を照射し，それらを用いて実施例１と同様にして細胞培養を行い，紫外線の照射領域と非照射領域との細胞接着性を比較した。
その結果，何れの表面修飾基板においても，細胞接着は紫外線照射領域で顕著であり，非照射領域にはごく僅かにしか認められなかった。また照射領域の細胞には，盛んな伸展が見られたが，非照射領域には殆ど見られなかった。典型的な例を，高分子量側の３種のポリマーについて図１０に，及び低分子量側の３種のポリマーについて図１１に，それぞれ顕微鏡写真で示す。図中，上段（UV(-)）は紫外線非照射領域，下段（UV(+)）は紫外線照射領域のものである。
本発明は，基材上において，特定の部位にのみに細胞を接着させて培養することや，異なる特定部位に種類の異なる種類の細胞を接着させて培養することを可能にし，且つこれを簡便且つ安価な方法で実現するものとして，有用である。
１ ガラス
２ 組織培養用ポリスチレン製シャーレ
３ 紫外線
４ レンズ

Claims (11)

  1. 光改質性ポリマーであって，構成要素（Ａ）として式（１），

    〔式中，Ｒ１は水素又はメチル基，Ｒ２は炭素数１〜２２のアルキル基を，それぞれ表し，ｎは１〜３０の整数を表す。〕で示されるモノマーと，トリアルコキシシリル基を備えた構成要素（Ｂ）とを含んでなるものである，光改質性ポリマー。
  2. 該構成要素（Ｂ）におけるトリアルコキシシリル基を構成する各アルコキシ基が，それぞれ独立して，炭素数１〜４のものである，上記１の光改質性ポリマー。
  3. 該構成要素（Ａ）の複数が重合してなる部分を含むポリマー鎖の末端に，該構成要素（Ｂ）のトリアルコキシシリル基が位置しているものである，上記１又は２の光改質性ポリマー。
  4. 該構成要素（Ｂ）が，式（２），

    〔式中，Ｒ３は水素又はメチル基，Ｒ４は炭素数１〜８のアルキレン基，Ｒ５，Ｒ６及びＲ７は，それぞれ独立して炭素数１〜４のアルキル基を，それぞれ表す。〕で示されるものである，上記１又は２の光改質性ポリマー。
  5. 式（１）で示される構成要素（Ａ）と式（２）で示される構成要素（Ｂ）とを含んでなり，それらモル比が，構成要素（Ａ）：構成要素（Ｂ）＝７５：２５〜９８：２である，上記４の光改質性ポリマー。
  6. 該ポリマーが次式（３），

    〔式中，Ｒ８は，炭素数１〜４の飽和炭化水素基を有してよい芳香族基，Ｒ９は水素又はメチル基，Ｒ１０，Ｒ１１及びＲ１２は，互いに独立して炭素数１〜４個のアルコキシ基，そしてＺは，基−Ｓ−Ｃ（Ｓ）−Ｓ−Ｒ１３を表し，ここにＲ１３は，炭素数１〜６のアルキル基を表す。〕で示される構造を有するものである，上記３の光改質性ポリマー。
  7. 基材とその表面に形成されたポリマー層とを含んでなる細胞培養用基材であって，該ポリマー層が，上記１〜６の何れかの光改質性ポリマーであり，該構成要素（Ｂ）のトリアルコキシシリル基と該基材との反応で形成された結合により，該ポリマー層が該基材に保持されているものである，細胞培養用基材。
  8. 該基材が，ガラス，セラミック，金属，又はガラス系プライマーで処理された樹脂からなるものである，上記７の細胞培養用基材。
  9. 細胞培養用基材の製造方法であって，上記１〜５の何れかの光改質性ポリマーを基材表面に適用することを含むものである，製造方法。
  10. 細胞培養用基材の製造方法であって，
    構成要素（Ａ）として，式（１），

    〔式中，Ｒ１は水素又はメチル基，Ｒ２は炭素数１〜２２のアルキル基を，それぞれ表し，ｎは１〜３０の整数を表す。〕で示されるモノマーと，
    構成要素（Ｂ）として，式（２），

    〔式中，Ｒ３は水素又はメチル基，Ｒ４は炭素数１〜８のアルキレン基，Ｒ５，Ｒ６及びＲ７は，それぞれ独立して炭素数１〜４のアルキル基を，それぞれ表す。〕で示されるモノマーとを該基材上で共重合させることを含んでなる，製造方法。
  11. 該基材が，ガラス，セラミック，金属，又はガラス系プライマーで処理された樹脂からなるものである，上記１０の製造方法。
    １２．種類の異なる細胞集団を同一の基材上のそれぞれに対応する領域に接着させた状態で共培養する方法であって，上記７又は８の細胞培養用基材の第１の領域に紫外線を照射して改質した後，第１の種類の細胞を該基材上で培養して該第１の領域に該第１の種類の細胞の集団を接着させるステップと，該基材の該第１の領域以外の第２の領域に紫外線を照射して改質した後，第１の種類とは異なる第２の種類の細胞を該基材上で培養して該第２の領域に該第２の種類の細胞の集団を接着させるステップとを含むものである，方法。
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