JP2020023567A - アミノ酸及びペプチド接合体及び接合方法 - Google Patents

アミノ酸及びペプチド接合体及び接合方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ペプチドワクチンの開発における重要な問題は、唯一のワクチン成分としてのペプチドにより示される免疫原性の欠如である。先天性免疫系の成分を活性化するよう企画されたアジュベント（例えば、フロイントアジュバント）を、ワクチンに含めることは、通常必要である。【解決手段】本発明は、アミノ酸及びペプチド接合体、アミノ酸及びペプチド接合体の製造方法、前記方法により製造される接合体、前記接合体を含む医薬組成物、対象における免疫応答を誘発する方法及び対象をワクチン接種する方法、それらのためへの接合体の使用、及びそれらのための薬剤の製造への接合体の使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、アミノ酸及びペプチド接合体、アミノ酸及びペプチド接合体の製造方法、前記方法により製造される接合体、前記接合体を含む医薬組成物、対象における免疫応答を誘発する方法及び対象をワクチン接種する方法、それらのためへの接合体の使用、及びそれらのための薬剤の製造への接合体の使用に関する。
合成ペプチドワクチンは一般的に、タンパク質抗原の免疫原性部分の合成コピーを含む。ワクチン開発へのアプローチは、多くの利点、例えば合成の容易さ、潜在的に有毒な生物学的副産物の回避、及び簡単な特性評価を有する。
ペプチドワクチンの開発における重要な問題は、唯一のワクチン成分としてのペプチドにより示される免疫原性の欠如である。先天性免疫系の成分を活性化するよう企画されたアジュベント（例えば、フロイントアジュバント）を、ワクチンに含めることは、通常必要である。
ペプチドワクチン企画の他の手段は、目的のペプチドエピトープが適切なアジュバントに共有結合されている自己アジュバントワクチンを創造することである。そのような自己アジュバントワクチンは、外部アジュバントとの抗原の単純な同時配合に比較して、抗原取り込み、提示及び樹状細胞成熟を増強することができる。
いくつかの自己アジュバントワクチンは、開発されてきたが、しかしワクチンの調製は複雑にされ得る。
新規の自己アジュバントワクチン、及び自己アジュバントワクチンの新規製造方法についての継続的な必要性がある。それらの必要性を満たし；そして／又は少なくとも有用な選択技を公衆に提供することが、本発明の目的である。
本発明の他の目的は、ほんの一例として与えられる以下の説明から明らかになるのであろう。
本明細書に包含されている、文書、行為、材料、装置、記事又は同様のことの任意の議論は、本発明のための文脈を提供する目的のために過ぎない。それらの事項の何れか又はすべては、従来技術基盤の一部を形成するか、又は優先日前に存在していた本発明に関連する分野において共通の一般的知識であったことは、容認されるものとして解釈されるべきではない。
１つの側面においては、本発明は、
脂質含有接合パートナー、及び
アミノ酸含有接合パートナー、
を、チオールによる炭素−炭素二重結合のハイドロチオール化により、脂質含有接合パートナーを、アミノ酸含有接合パートナーに接合するのに効果的な条件下で、反応せしめることを含んで成る、アミノ酸−又はペプチド接合体の製造方法を提供する。
本明細書に記載される実施形態の何れかは、本明細書における側面の何れかに関する。
１つの実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナーは、ペプチド含有接合パートナーであり、そして脂質含有接合パートナーは、ペプチド含有接合パートナーのペプチドにカップリングされる。
いくつかの実施形態によれば、脂質含有接合パートナーは、アミノ酸含有接合パートナーのアミノ酸又はペプチド含有接合パートナーのペプチドに接合される。
特定の実施形態によれば、脂質含有接合パートナーは、アミノ酸含有接合パートナーのアミノ酸に接合される。
従って、もう１つの側面によれば、本発明は、
脂質含有接合パートナー、及び
ペプチド含有接合パートナー、
を、チオールによる炭素−炭素二重結合のハイドロチオール化により、脂質含有接合パートナーを、ペプチド含有接合パートナーのペプチドに接合するのに効果的な条件下で、反応せしめることを含んで成る、ペプチド接合体の製造方法を提供する。
１つの実施形態によれば、接合体はリポペプチドであり、結果的に、前記方法は、リポペプチドを製造するためのものである。
１つの実施形態によれば、脂質含有接合パートナーは、炭素−炭素二重結合を含み、そしてペプチド含有接合パートナーのペプチドはチオールを含む。
１つの実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナーはエピトープを含む。１つの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーはエピトープを含む。１つの実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナーは複数のエピトープを含む。１つの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは複数のエピトープを含む。１つの実施形態によれば、ペプチド接合体は、複数のエピトープを含む。１つの実施形態によれば、エピトープは、ペプチドエピトープである。１つの実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナーは、ペプチドから成る。１つの実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナーは、ペプチドエピトープを含むペプチドから成る。１つの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、ペプチドから成る。１つの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、ペプチドエピトープを含むペプチドから成る。
いくつかの実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナーは、その接合パートナーのアミノ酸に接合されるエピトープを含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、ペプチド含有接合パートナーのペプチドに接合されるエピトープを含む。いくつかの実施形態によれば、エピトープは、リンカー基を介してペプチドに接合される。
いくつかの実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナーは、リンカー基を介して、その接合パートナーのアミノ酸に接合されるペプチドエピトープを含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、リンカー基を介してペプチドに接合されるペプチドエピトープを含む。
いくつかの実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナー及び／又はペプチド含有接合パートナーは、抗原ペプチドを含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体は、抗原ペプチドを含む。
いくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、ペプチド接合体を提供するために、アミノ酸接合体のアミノ酸を、アミノ酸又はペプチドにカップリングすることを包含する。
いくつかの実施形態によれば、ペプチドのカップリングは、１又は２以上のアミノ酸及び／又は１又は２以上のペプチドを、それぞれカップリングすることを包含する。
いくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、リンカー基又は１又は２以上のそのアミノ酸を含むペプチド接合体を提供するために、アミノ酸又はペプチドに、アミノ酸接合体のアミノ酸又はペプチド接合体のアミノ酸をカップリングすることを包含する。
いくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、脂質含有接合パートナーがリンカー基を介して接合されているアミノ酸に結合されるペプチドエピトープを含むペプチド接合体を提供するために、リンカー基を１又は２以上のそのアミノ酸を含むペプチド接合体のアミノ酸を、アミノ酸又はペプチドにカップリングすることを包含する。
いくつかの実施形態によれば、脂質含有接合体が接合される、前記ペプチド接合体のアミノ酸が、Ｎ−末端アミノ酸残基である。
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、ペプチドエピトープを含むペプチド接合体を提供するために、アミノ酸又はペプチドに、アミノ酸接合体のアミノ酸又はペプチド接合体のアミノ酸をカップリングすることを、さらに含んで成る。
いくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、アミノ酸接合体のアミノ酸又はペプチド接合体のアミノ酸に、エピトープをカップリングすることを、さらに含んで成る。いくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、アミノ酸接合体のアミノ酸又はペプチド接合体のアミノ酸に、ペプチドエピトープをカップリングすることを、さらに含んで成る。いくつかの実施形態によれば、エピトープは、リンカー基を介してカップリングされるか、又は接合される。
いくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、ペプチド接合体のペプチドに、エピトープをカップリングすることを包含する。いくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、ペプチド接合体のペプチドに、ペプチドエピトープをカップリングすることを包含する。いくつかの実施形態によれば、エピトープは、リンカー基を介してペプチドに接合される。
１つの実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナーは、アミノ酸から成る。１つの実施形態によれば、アミノ酸のＣ末端のカルボキシル基は、カルボキシル保護基により保護され、そして／又はアミノ酸のＮａ−アミノ基は、アミノ保護基により保護される。
いくつかの実施形態によれば、ペプチドのＣ末端のカルボキシル基は、カルボキシル保護基により保護され、そして／又はペプチドのＮａ−アミノ基は、アミノ保護基により保護される。
１つの実施形態によれば、脂質含有接合パートナーは、少なくとも４個の鎖連結された原子を、それぞれ含む、１つは２以上の任意に置換された直鎖又は分枝状脂肪族又はヘテロ脂肪族鎖を含む。１つの実施形態によれば、脂質含有接合パートナーは、少なくとも６個の鎖連結された原子を、それぞれ含む、１つは２以上の任意に置換された直鎖又は分枝状脂肪族又はヘテロ脂肪族鎖を含む。１つの特に具体的な実施形態によれば、１又は２以上の鎖は、脂肪族である。１つの特に具体的な実施形態によれば、１又は２以上の鎖は飽和されている。
いくつかの実施形態によれば、１又は２以上の鎖は任意には、置換される。いくつかの実施形態によれば、１又は２以上の鎖は任意には、１又は２以上のアリール基により置換される。
いくつかの実施形態によれば、１又は２以上の鎖は、少なくとも４、６、８、１０、１２又は１４個の鎖連結された原子を含む。いくつかの実施形態によれば、１又は２以上の鎖は、４−２２、６−２２、８−２２、１０−２２、１２−２２又は１４−２２個の鎖連結された原子を含む。
１つの実施形態によれば、１又は２以上の鎖は、ヘテロ原子含有官能基により、炭素−炭素二重結合又はチオールを含む成分に共有結合される。ヘテロ原子含有官能基の例としては、エーテル、アミン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、エステル、アミド、カーボネート、カルバメート及びウレア基を挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない。
典型的な実施形態によれば、１又は２以上の鎖は、エステル官能基により、前記成分に共有結合される。
１つの実施形態によれば、脂質含有接合パートナーは、１又は２以上の飽和又は不飽和脂肪酸エステルを含む。いくつかの実施形態によれば、脂肪酸は飽和される。１つの実施形態によれば、１又は２以上の脂肪酸エステルは、炭素−炭素二重結合又はチオールを含む成分に結合される。１つの実施形態によれば、エステルは、脂肪酸のカルボキシル基、及び前記成分のアルコールのエステルである。
１つの実施形態によれば、脂肪酸はＣ４−２２脂肪酸である。１つの実施形態によれば、脂肪酸はＣ６−２２脂肪酸である。別の実施形態によれば、脂肪酸はＣ１０−２２脂肪酸である。さらに別の実施形態によれば、脂肪酸はＣ１２−２２脂肪酸である。１つの典型的な実施形態によれば、脂肪酸はＣ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８又はＣ２０脂肪酸である。
いくつかの実施形態によれば、脂肪酸は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、α−リノレン酸、及びアラキドン酸である。１つの実施形態によれば、脂肪酸は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、又はステアリン酸である。特に意図される実施形態によれば、脂肪酸はパルミチン酸である。
１つの典型的な実施形態によれば、脂質含有接合パートナーは、１又は２以上の脂肪酸エステルを含む。特に意図される実施形態によれば、脂質含有接合パートナーは、１つの脂肪酸エステルを含む。
特定の実施形態によれば、脂肪酸エステルは、炭素−炭素二重結合又はチオールを含むアルコールのエステルである。１つの典型的な実施形態によれば、アルコールは、単価、二価又は三価のＣ２−６脂肪族アルコールである。別の実施形態によれば、アルコールは、単価又は二価のＣ２−４脂肪族アルコールである。１つの典型的な実施の形態によれば、アルコールは、単価のＣ２脂肪族、又は単価又は二価のＣ３脂肪族アルコールである。特に意図される実施形態によれば、アルコールは単価のＣ２アルコールである。
特定の実施形態によれば、脂質含有接合パートナーは、炭素−炭素二重結合を含む。
１つの典型的な実施形態によれば、アルコールは、炭素−炭素二重結合を含む。特に具体的な実施形態によれば、アルコールは、ビニルアルコールである。
特に具体的な実施形態によれば、ペプチドは、合成ペプチドである。
１つの実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナー及び／又はペプチド接合体は、合成ペプチドを含む。いくつかの実施形態によれば、合成ペプチドは、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を包含する方法により調製されるペプチドである。
いくつかの実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナーのアミノ酸は、炭素−炭素二重結合又はチオールを含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーのペプチドのアミノ酸残基は、炭素−炭素二重結合及びチオールを含む。
いくつかの実施形態によれば、炭素−炭素二重結合又はチオールを含むアミノ酸残基は、末端アミノ酸残基である。いくつかの実施形態によれば、末端アミノ酸残基は、Ｎ−末端残基である。
いくつかの実施形態によれば、炭素−炭素二重結合又はチオールを含むアミノ酸のＮａ−アミノ基は、アシル化される。
特定の実施形態によれば、前記方法はさらに、アミノ酸接合体のアミノ酸のＮａ−アミノ基、又は脂肪含有接合パートナーが接合されるペプチド接合体のアミノ酸残基のアシル化を包含する。特定の実施形態によれば、前記方法はさらに、Ｃ２−２０脂肪酸によるＮａ−アミノ基のアシル化を包含する。
特定の実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナーのアミノ酸は、チオールを含む。特定の実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーのペプチドのアミノ酸残基はチオールを含む。特定の実施形態によれば、チオールは、システイン残基のチオールである。
特定の実施形態によれば、システイン残基は、末端残基である。特定の実施形態によれば、システイン残基は、Ｎ−末端残基である。
いくつかの実施形態によれば、システイン残基のアミノ基はアシル化される。
１つの実施形態によれば、アミノ基は、Ｃ２−２０脂肪酸によりアシル化される。
１つの典型的な実施形態によれば、Ｃ２−３０脂肪酸は、アセチル又はパルミトイルである。別の典型的な実施形態によれば、Ｃ２−２０脂肪酸は、アセチルである。
いくつかの実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナー及び／又はペプチド接合体は、８−２２０、８−２００、８−１７５、８−１５０、８−１２５、８−１００、８−９０、８−８０、８−７０、８−６０、８−５０、８−４０、８−３０、８−２５、８−２０、又は８−１５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、８−２２０、８−２００、８−１７５、８−１５０、８−１２５、８−１００、８−９０、８−８０、８−７０、８−６０、８−５０、８−４０、８−３０、８−２５、８−２０、又は８−１５個のアミノ酸を含む。
１つの典型的な実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナー及び／又はペプチド接合体は、８−６０個のアミノ酸を含むペプチドを含む。１つの典型的な実施形態によれば、ペプチドは８−６０個のアミノ酸を含む。
他の実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナー及び／又はペプチド接合体は、５−２２０、８−２２０、５−１７５、８−１７５、８−１５０、１０−１５０、１５−１２５、２０−１００、２０−８０、２０−６０、２５−１００、２５−８０、２５−６０、３０−８０、４０−６０又は５０−６０個のアミノ酸を含む。他の実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、５−２２０、８−２２０、５−１７５、８−１７５、８−１５０、１０−１５０、１５−１２５、２０−１００、２０−８０、２０−６０、２５−１００、２５−８０、２５−６０、３０−８０、４０−６０又は５０−６０個のアミノ酸を含む。
他の実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナー及び／又はペプチド接合体は、５−１５０、５−１２５、５−１００、５−７５、５−６０、５−５０、５−４０、５−３０、５−２５、５−２０、８−１５０、８−１２５、８−１００、８−７５、８−６０、８−５０、８−４０、８−３０、８−２５、又は８−２０個のアミノ酸を含む。他の実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、５−１５０、５−１２５、５−１００、５−７５、５−６０、５−５０、５−４０、５−３０、５−２５、５−２０、８−１５０、８−１２５、８−１００、８−７５、８−６０、８−５０、８−４０、８−３０、８−２５、又は８−２０個のアミノ酸を含む。
１つの実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナー及び／又はペプチド接合体は、１又は２以上の可溶化基を含む。１つの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、１又は２以上の可溶化基を含む。
特定の実施形態によれば、可溶化基は、ペプチド鎖に複数の親水性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列である。特定の実施形態によれば、可溶化基は、ペプチド鎖に複数の連続した親水性アミノ酸残基の配列を含むアミノ酸配列である。１つの実施形態によれば、親水性アミノ酸残基は、カチオン性アミノ酸残基である。１つの実施形態によれば、カチオン性アミノ酸残基は、アルギニン又はリシン残基である。１つの特に意図される実施形態によれば、カチオン性アミノ酸残基は、リシン残基である。１つの実施形態によれば、配列は、２−２０、２−１５、２−１０、３−７、又は３−５個のアミノ酸を含む。１つの実施形態によれば、可溶化基は、トリ−、テトラ−、ペンタ−、ヘキサ−又はヘプタ−リシン配列である。１つの特に意図される実施形態によれば、可溶化基は、テトラリシン配列である。
いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はアミノ酸含有接合パートナーは、脂質含有接合パートナーが接合されるアミノ酸残基に隣接するセリン残基を含む。特に意図される実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーのペプチドは、脂質含有接合パートナーが接合されるアミノ酸残基に隣接するセリン残基を含む。典型的な実施形態によれば、脂質含有接合パートナーが接合されているアミノ酸残基は、Ｎ−末端である。特に意図される実施形態によれば、ペプチドはさらに、セリン残基に隣接する複数の親水性アミノ酸残基の連続配列を含む。
特定の実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はアミノ酸含有接合パートナーは、セリン残基に隣接する複数の親水性アミノ酸残基の連続配列を含む。
特定の実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はアミノ酸含有接合パートナーは、天然に存在するアミノ酸のみを含む。特定の実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、天然に存在するアミノ酸のみを含む。他の実施形態によれば、ペプチドにおける７５％又はそれ以上、８０％又はそれ以上、８５％又はそれ以上、９０％又はそれ以上、９５％又はそれ以上、９７％又はそれ以上、又は９９％又はそれ以上のアミノ酸残基が、天然に存在するアミノ酸である。
他の実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はアミノ酸含有接合パートナーにおける７５％又はそれ以上、８０％又はそれ以上、８５％又はそれ以上、９０％又はそれ以上、９５％又はそれ以上、９７％又はそれ以上、又は９９％又はそれ以上のアミノ酸残基が、天然に存在するアミノ酸である。
典型的な実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はアミノ酸含有接合パートナーは、ペプチドエピトープを含むペプチドである。典型的な実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーのペプチドは、１又は２以上のペプチドエピトープを含む。
１つの実施形態によれば、
前記ペプチドが、下記：
（ａ）配列Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３Ｘａａ４ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ［配列番号１］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、Ｘａａ２は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、Ｘａａ３は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、そしてＸａａ４は不在であるか、又は１又は２以上の親水性アミノ酸であり、
（ｂ）配列Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ［配列番号２］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、Ｘａａ２は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、そしてＸａａ３は不在であるか、又は１〜１０個の親水性アミノ酸であり、
（ｃ）配列Ｘａａ１Ｘａａ２ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ［配列番号３］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、そしてＸａａ２は不在であるか、又は１〜４個の親水性アミノ酸であり、
（ｄ）配列ＳＫＫＫＫＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ［配列番号４］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
（ｅ）配列番号１−４の何れか１つの配列、
（ｆ）配列ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ［配列番号５］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
（ｇ）配列番号５の配列、
（ｈ）配列ＬＡＭＰＦＡＴＰＭ［配列番号６］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
（ｉ）配列番号６の配列、
（ｊ）ＦＡＴＰＭＥＡＥＬ配列番号７］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
（ｋ）配列番号７の配列、
（ｌ）配列Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３Ｘａａ４ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ［配列番号８］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、Ｘａａ２は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、Ｘａａ３は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、そしてＸａａ４は不在であるか、又は１又は２以上の親水性アミノ酸であり、
（ｍ）配列Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ［配列番号９］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、Ｘａａ２は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、そしてＸａａ３は不在であるか、又は１〜１０個の親水性アミノ酸であり、
（ｎ）配列Ｘａａ１Ｘａａ２ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ［配列番号１０］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、そしてＸａａ２は不在であるか、又は１〜４個の親水性アミノ酸であり、
（ｏ）配列ＳＫＫＫＫＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ［配列番号１１］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
（ｐ）配列番号８−１１の何れか１つの配列、
（ｑ）配列ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ［配列番号１２］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
（ｒ）配列番号１２の配列、
（ｓ）配列ＥＦＴＶＳＧＮＩＬ［配列番号１３］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
（ｔ）配列番号１３の配列、
（ｕ）配列Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３Ｘａａ４ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ［配列番号１４］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、Ｘａａ２は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、Ｘａａ３は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、そしてＸａａ４は不在であるか、又は１又は２以上の親水性アミノ酸であり、
（ｖ）配列Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ［配列番号１５］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、Ｘａａ２は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、そしてＸａａ３は不在であるか、又は１〜１０個の親水性アミノ酸であり、
（ｗ）配列Ｘａａ１Ｘａａ２ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ［配列番号１６］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、そしてＸａａ２は不在であるか、又は１〜４個の親水性アミノ酸であり、
（ｘ）配列ＳＫＫＫＫＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ［配列番号１７］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
（ｙ）配列番号１４−１７の何れか１つの配列、
（ｚ）配列ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ［配列番号１８］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
（ａａ）配列番号１８の配列、
（ｂｂ）配列ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ［配列番号１９］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
（ｃｃ）配列番号１９の配列、
（ｄｄ）配列ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ［配列番号２０］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
（ｅｅ）配列番号２０の配列、又は
（ｆｆ）複数の上記（ａ）〜（ｅｅ）の組合せ、
から成る群から選択されたアミノ酸配列を含むか、それらから実質的に成るか、又はそれらから成る。
１つの典型的な実施形態によれば、ペプチドエピトープは、ＮＹ−ＥＳＯ−１に由来する。１つの特に意図される実施形態によれば、ペプチドは、配列番号５、６、７、１２、１３、１８、１９及び２０の何れか１つからの８又はそれ以上の連続アミノ酸残から成る群から選択されたアミノ酸を含むか、それらから実質的に成るか、又はそれらから成る。
１つの実施形態によれば、ペプチドは、配列番号５、６、７、１２、１３、１８、１９及び２０の何れか１つから成る群から選択されたアミノ酸を含むか、それらから実質的に成るか、又はそれらから成る。
１つの実施形態によれば、ペプチドは、配列番号５、１２及び１８の何れか１つから成る群から選択されたアミノ酸を含むか、それらから実質的に成るか、又はそれらから成る。
１つの実施形態によれば、ペプチドは、配列番号５、１２及び１８の何れか１つから成る群から選択されたアミノ酸を含むか、それらから実質的に成るか、又はそれらから成る。
１つの実施形態によれば、ペプチドは、配列番号４、１１及び１７の何れか１つから成る群から選択されたアミノ酸を含むか、それらから実質的に成るか、又はそれらから成る。
１つの特に意図される実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーのアミノ酸の反応性官能基は、保護されていない。
特定の実施形態によれば、ペプチド接合体の１又は２以上のアミノ酸の１又は２以上の反応性官能基は、保護されていない。
特定の実施形態によれば、アミノ酸接合体のアミノ酸の１又は２以上の反応性官能基は、保護されていない。
特定の実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナーの１又は２以上のアミノ酸の１又は２以上の反応性官能基は、保護されていない。
特定の実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナーは、ペプチドを含み、ここで前記ペプチドのアミノ酸の側鎖の反応性官能基は保護されておらず、但し反応されるチオール以外の任意のチオールを除く。
１つの特に意図される実施形態によれば、ぺプチド含有接合パートナーのペプチドのアミノ酸の反応性官能基は、保護されていない。１つの特に意図される実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーのペプチドのアミノ酸の反応性官能基は、保護されておらず、但し反応されるチオール以外の任意のチオールを除く。
１つの実施形態によれば、前記方法は、下記式（Ａ）：
［式中、
Ｚは、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−、及び−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ−から成る群から選択され；
Ｒは、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり、ここでアルキル又はシクロアルキルは任意に置換され；
ｍは、０−４の整数であり；
ｎは、１又は２であり；
ｍの各場合でのＲ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであるか；又はＲ１は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであるか；又はＲ３は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；
又はＲ９は、アミノ保護基、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；
ｎの各場合でのＲ６及びＲ７は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、又はＣ３−６シクロアルキルであり；
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０ヘテロアルキルであり；
Ｌ３は、Ｃ１−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、アミノ鎖又はペプチドであり；又はＡ１はＯＨ又はＯＰ１であり、ここでＰ１はカルボキシル保護基であり；
但し、
Ｒ３がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＣ１−６アルキルである場合、Ｒ１はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルではなく；
そして
ｍが２−４の整数である場合、１つだけのＲ１がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；そして
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｌ１及びＬ３に存在する何れかのアルキル、シクロアルキル又はヘテロアルキルが任意に置換されている］で表されるコンストラクト、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物を含む、アミノ酸又はペプチド接合体を製造することを包含する。
１つの実施形態によれば、前記方法は、下記式（Ａ）：
［式中、
Ｚは、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−、及び−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ−から成る群から選択され；
Ｒは、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり、ここでアルキル又はシクロアルキルは任意に置換され；
ｍは、０−４の整数であり；
ｎは、１又は２であり；
ｍの各場合でのＲ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであるか；又はＲ１は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであるか；又はＲ３は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；
又はＲ９は、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；
ｎの各場合でのＲ６及びＲ７は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、又はＣ３−６シクロアルキルであり；
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０ヘテロアルキルであり；
Ｌ３は、Ｃ１−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、ペプチドであり；又はＡ１はＯＨであり；
但し、
Ｒ９がＡ２でない場合、Ａ１はペプチドであり；
Ｒ３がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＣ１−６アルキルである場合、Ｒ１はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルではなく；
そして
ｍが２−４の整数である場合、１つだけのＲ１がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；そして
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｌ１及びＬ３に存在する何れかのアルキル、シクロアルキル又はヘテロアルキルが任意に置換されている］で表されるコンストラクト、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物を含む、ペプチド接合体を製造することを包含する。
１つの実施形態によれば、前記方法は、下記式（Ｂ）：
［式中、
Ｚは、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−、及び−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ−から成る群から選択され；
Ｒは、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり、ここでアルキル又はシクロアルキルは任意に置換され；
ｐは、０−４の整数であり；
ｑは、０−２の整数であり；
ｐの各場合でのＲ１１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ１１は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ１−６アルキルであり；
Ｒ３３、Ｒ４４、Ｒ５５、Ｒ６６、Ｒ７７、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ３３はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ１−６アルキルであり；
又は、Ｒ９は、アミノ保護基、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；
ｑの各場合でのＲａ及びＲｂは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
Ｌ３は、Ｃ１−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、アミノ酸又はペプチドであり；又はＡ１はＯＨ又はＯＰ１であり、ここでＰ１はカルボキシル保護基であり；
但し、
Ｒ３３がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＣ１−６アルキルである場合、Ｒ１１はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルではなく；
そして
ｐが２−４の整数である場合、１つだけのＲ１１がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；そして
Ｒ１１、Ｒ２２、Ｒ３３、Ｒ４４、Ｒ５５、Ｒ６６、Ｒ７７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒａ、Ｒｂ、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３に存在する何れかのアルキル、シクロアルキル又はヘテロアルキルが任意に置換されている］で表されるコンストラクト、又は医薬的に許容されるその塩又は溶媒和物を含む、アミノ酸又はペプチド接合体を製造することを包含する。
１つの実施形態によれば、前記方法は、下記式（Ｂ）：
［式中、
Ｚは、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−、及び−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ−から成る群から選択され；
Ｒは、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり、ここでアルキル又はシクロアルキルは任意に置換され；
ｐは、０−４の整数であり；
ｑは、０−２の整数であり；
ｐの各場合でのＲ１１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ１１は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ１−６アルキルであり；
Ｒ３３、Ｒ４４、Ｒ５５、Ｒ６６、Ｒ７７、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ３３はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ１−６アルキルであり；
又はＲ９は、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；
ｑの各場合でのＲａ及びＲｂは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
Ｌ３は、Ｃ１−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、ペプチドであり；又はＡ１はＯＨであり；
但し、
Ｒ９がＡ２でない場合、Ａ１はペプチドであり；
Ｒ３３がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＣ１−６アルキルである場合、Ｒ１１はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルではなく；
そして
ｐが２−４の整数である場合、１つだけのＲ１１がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；そして
Ｒ１１、Ｒ２２、Ｒ３３、Ｒ４４、Ｒ５５、Ｒ６６、Ｒ７７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒａ、Ｒｂ、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３に存在する何れかのアルキル、シクロアルキル又はヘテロアルキルが任意に置換されている］で表されるコンストラクト、又は医薬的に許容されるその塩又は溶媒和物を含む、ペプチド接合体を製造することを包含する。
１つの実施形態によれば、前記脂質含有接合パートナーは、下記式（Ａ１）：
［式中、
Ｚは、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−、及び−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ−から成る群から選択され；
Ｒは、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり、ここでアルキル又はシクロアルキルは任意に置換され；
ｍは、０−４の整数であり；
ｍの各場合でのＲ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ３は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ１−６アルキルであり；
Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ３はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ１−６アルキルであり；
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
但し：
Ｒ３がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＣ１−６アルキルである場合、Ｒ１はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルではなく；
そして
ｍが２−４の整数である場合、１つだけのＲ１がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；そして
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｌ１及びＬ２に存在する何れかのアルキル、シクロアルキル又はヘテロアルキルが任意に置換されている］で表される化合物、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物である。
１つの実施形態によれば、前記脂質含有接合パートナーは、下記式（Ｂ１）：
［式中、
Ｚは、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−、及び−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ−から成る群から選択され；
Ｒは、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり、ここでアルキル又はシクロアルキルは任意に置換され；
ｐは、０−４の整数であり；
ｐの各場合でのＲ１１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ１１は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ１−６アルキルであり；
Ｒ３３、及びＲ４４は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ３３はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ１−６アルキルであり；
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
但し：
Ｒ３３がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＣ１−６アルキルである場合、Ｒ１１はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルではなく；
そして
ｐが２−４の整数である場合、１つだけのＲ１１がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；そして
Ｒ１１、Ｒ２２、Ｒ３３、Ｒ４４、Ｌ１及びＬ２に存在する何れかのアルキル、シクロアルキル又はヘテロアルキルが任意に置換されている］で表される化合物、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物である。
１つの実施形態によれば、脂質含有接合パートナーは、本明細書に記載される実施形態の何れかに定義されるような、式（ＩＩ）の化合物である。
１つの実施形態によれば、脂質含有接合パートナーは、本明細書に記載される実施形態の何れかに定義されるような、式（ＩＩＡ）の化合物である。
１つの実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナーは、本明細書に記載される実施形態の何れかに定義されるような、式（ＩＩＩ）の化合物である。
１つの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、本明細書に記載される実施形態の何れかに定義されるような、式（ＩＩＩ）の化合物である。
１つの実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナーは、本明細書に記載される実施形態の何れかに定義されるような、式（ＩＩＩＡ）の化合物である。
１つの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、本明細書に記載される実施形態の何れかに定義されるような、式（ＩＩＩＡ）の化合物である。
１つの実施形態によれば、前記方法は、下記式（Ｉ）：
［式中、
ｍは、０−４の整数であり；
ｎは、１又は２であり；
ｍの各場合でのＲ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであるか；又はＲ１は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであるか；又はＲ３は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；
又はＲ９は、アミノ保護基、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；
ｎの各場合でのＲ６及びＲ７は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、又はＣ３−６シクロアルキルであり；
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０ヘテロアルキルであり；
Ｌ３は、Ｃ１−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、アミノ鎖又はペプチドであり；又はＡ１はＯＨ又はＯＰ１であり、ここでＰ１はカルボキシル保護基であり；
但し、
Ｒ３がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＣ１−６アルキルである場合、Ｒ１はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルではなく；
そして
ｍが２−４の整数である場合、１つだけのＲ１がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；そして
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｌ１及びＬ３に存在する何れかのアルキル、シクロアルキル又はヘテロアルキルが任意に置換されている］で表されるコンストラクト、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物を含むアミノ酸又はペプチド接合体を製造することを含んで成り；
前記方法が、下記式（ＩＩ）：
［式中、ｍ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＬ１は、式（Ｉ）の化合物に定義される通りである］で表されるコンストラクトを含む脂質含有接合パートナー、及び下記式（ＩＩＩ）：
［式中、ｎ、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＡ１は、式（Ｉ）の化合物に定義される通りである］で表されるコンストラクトを含むペプチド含有接合パートナーを、式（ＩＩＩ）の化合物におけるチオールによる、式（ＩＩ）の化合物における炭素−炭素二重結合のハイドロチオール化により、式（ＩＩＩ）の化合物により式（ＩＩ）の化合物を接合するのに効果的な条件下で、反応せしめることを含んで成る。
１つの実施形態によれば、前記方法は、下記式（Ｉ）：
［式中、
ｍは、０−４の整数であり；
ｎは、１又は２であり；
ｍの各場合でのＲ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであるか；又はＲ１は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであるか；又はＲ３は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；
又はＲ９は、アミノ保護基、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；
ｎの各場合でのＲ６及びＲ７は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、又はＣ３−６シクロアルキルであり；
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０ヘテロアルキルであり；
Ｌ３は、Ｃ１−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、ペプチドであり；又はＡ１はＯＨであり；
但し、
Ｒ９がＡ２でない場合、Ａ１はペプチドであり；
Ｒ３がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＣ１−６アルキルである場合、Ｒ１はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルではなく；
そして
ｍが２−４の整数である場合、１つだけのＲ１がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；そして
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｌ１及びＬ３に存在する何れかのアルキル、シクロアルキル又はヘテロアルキルが任意に置換されている］で表されるコンストラクト、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物を含むペプチド接合体を製造することを含んで成り；
前記方法が、下記式（ＩＩ）：
［式中、ｍ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＬ１は、式（Ｉ）の化合物に定義される通りである］で表されるコンストラクトを含む脂質含有接合パートナー、及び下記式（ＩＩＩ）：
［式中、ｎ、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＡ１は、式（Ｉ）の化合物に定義される通りである］で表されるコンストラクトを含むペプチド含有接合パートナーを、式（ＩＩＩ）の化合物におけるチオールによる、式（ＩＩ）の化合物における炭素−炭素二重結合のハイドロチオール化により、式（ＩＩＩ）の化合物により式（ＩＩ）の化合物を接合するのに効果的な条件下で、反応せしめることを含んで成る。
１つの実施形態によれば、前記方法は、下記式（ＩＡ）：
［式中、
ｐは、０−４の整数であり；
ｑは、０−２の整数であり；
ｐの各場合でのＲ１１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ１１は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ１−６アルキルであり；
Ｒ３３、Ｒ４４、Ｒ５５、Ｒ６６、Ｒ７７、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ３３はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ１−６アルキルであり；
又はＲ９は、アミノ保護基、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；
ｑの各場合でのＲａ及びＲｂは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
Ｌ３は、Ｃ１−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、アミノ酸又はペプチドであり；又はＡ１はＯＨ又はＯＰ１であり、ここでＰ１はカルボキシル保護基であり；
但し、
Ｒ３３がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＣ１−６アルキルである場合、Ｒ１１はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルではなく；
そして
ｐが２−４の整数である場合、１つだけのＲ１１がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；そして
Ｒ１１、Ｒ２２、Ｒ３３、Ｒ４４、Ｒ５５、Ｒ６６、Ｒ７７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒａ、Ｒｂ、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３に存在する何れかのアルキル、シクロアルキル又はヘテロアルキルが任意に置換されている］で表されるコンストラクト、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物を含むアミノ酸又はぺプチド接合体を製造することを含んで成り；
ここで前記方法は、下記式（ＩＩＡ）：
［式中、ｐ、Ｒ１１、Ｒ２２、Ｒ３３、Ｒ４４、及びＬ１は、式（ＩＡ）の化合物に定義される通りである］で表される化合物、及び下記式（ＩＩＩＡ）：
［式中、ｑ、Ｒ５５、Ｒ６６、Ｒ７７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒａ、Ｒｂ及びＡ１は、式（ＩＡ）の化合物に定義される通りである］で表される化合物を、式（ＩＩＡ）の化合物におけるチオールによる、式（ＩＩＩＡ）の化合物における炭素−炭素二重結合のハイドロチオール化により、式（ＩＩＩＡ）の化合物により式（ＩＩＡ）の化合物を接合するのに効果的な条件下で反応せしめることを含んで成る。
１つの実施形態によれば、前記方法は、下記式（ＩＡ）：
［式中、
ｐは、０−４の整数であり；
ｑは、０−２の整数であり；
ｐの各場合でのＲ１１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ１１は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ１−６アルキルであり；
Ｒ３３、Ｒ４４、Ｒ５５、Ｒ６６、Ｒ７７、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ３３はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ１−６アルキルであり；
又はＲ９は、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；
ｑの各場合でのＲａ及びＲｂは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
Ｌ３は、Ｃ１−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、ペプチドであり；又はＡ１はＯＨであり；
但し、
Ｒ９がＡ２でない場合、Ａ１はペプチドであり；
Ｒ３３がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＣ１−６アルキルである場合、Ｒ１１はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルではなく；
そして
ｐが２−４の整数である場合、１つだけのＲ１１がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；そして
Ｒ１１、Ｒ２２、Ｒ３３、Ｒ４４、Ｒ５５、Ｒ６６、Ｒ７７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒａ、Ｒｂ、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３に存在する何れかのアルキル、シクロアルキル又はヘテロアルキルが任意に置換されている］で表されるコンストラクト、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物を含むぺプチド接合体を製造することを含んで成り；
ここで前記方法は、下記式（ＩＩＡ）：
［式中、ｐ、Ｒ１１、Ｒ２２、Ｒ３３、Ｒ４４、及びＬ１は、式（ＩＡ）の化合物に定義される通りである］で表される化合物、及び下記式（ＩＩＩＡ）：
［式中、ｑ、Ｒ５５、Ｒ６６、Ｒ７７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒａ、Ｒｂ及びＡ１は、式（ＩＡ）の化合物に定義される通りである］で表される化合物を、式（ＩＩＡ）の化合物におけるチオールによる、式（ＩＩＩＡ）の化合物における炭素−炭素二重結合のハイドロチオール化により、式（ＩＩＩＡ）の化合物により式（ＩＩＡ）の化合物を接合するのに効果的な条件下で反応せしめることを含んで成る。
１つの実施形態によれば、Ｌ１及びＬ２の少なくとも１つは、Ｃ５−２２アルキルである。
１つの実施形態によれば、ｐは０−２の整数である。別の実施形態によれば、ｐは０又は１である。
いくつかの実施形態によれば、ｐの各場合でのＲ１１及びＲ２２は、お互い独立して、水素であり；又はＲ１１はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ２である。１つの実施形態によれば、Ｌ１−Ｃ（Ｏ）−Ｏに隣接する炭素上のＲ１１は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ２である。
１つの特に意図される実施形態によれば、ｐの各場合でのＲ１１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素である。
１つの実施形態によれば、Ｒ３３は水素又はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ２である。
１つの実施形態によれば、Ｒ３３及びＲ４４のそれぞれ、水素である。
１つの特に意図される実施形態によれば、ｑは０又は１である。１つの特に意図される実施形態によれば、ｑは０である。
１つの特に意図される実施形態によれば、Ｒ５５、Ｒ６６及びＲ７７はそれぞれ、水素である。
いくつかの実施形態によれば、ｑの各場合でのＲａ及びＲｂはそれぞれ、水素である。
１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１−２１アルキルであり；ｐは１であり；Ｒ１１は水素又はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ２であり；Ｒ２２は水素であり；Ｒ３３は水素又はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ２であり；Ｒ４４は水素であり；そしてＬ２はＣ１１−２１アルキルである。
１つの実施形態によれば、Ｒ５５、Ｒ６６、Ｒ７７、Ｒａ、Ｒｂ及びＲ８はそれぞれ、水素であり；そしてＲ９は水素、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２である。１つの実施形態によれば、Ｒ５５、Ｒ６６、Ｒ７７、Ｒａ、Ｒｂ及びＲ８はそれぞれ、水素であり；そしてＲ９は水素又はＬ３−Ｃ（Ｏ）である。
１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１−２１アルキルであり；ｐは１であり；Ｒ１１は水素又はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ２であり；Ｒ２２は水素であり；Ｒ３３は水素又はＬＣ−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ２であり；Ｒ４４は水素であり；Ｌ２はＣ１１−２１アルキルであり；Ｒ５５、Ｒ６６、Ｒ７７、Ｒａ、Ｒｂ及びＲ８はそれぞれ、水素であり；そしてＲ９は水素、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２である。
１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ５−２１アルキルである。別の実施形態によれば、Ｌ１はＣ９−２１アルキルである。さらに別の実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１−２１アルキルである。１つの典型的な実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１、１３、Ｃ１５、Ｃ１７又はＣ１９アルキルである。１つの特に意図される実施形態によれば、Ｌ１はＣ１５アルキルである。
１つの実施形態によれば、Ｌ１は、９−２１個の炭素原子の直鎖を含む。１つの特に意図される実施形態によれば、Ｌ１は線状Ｃ１５アルキルである。
１つの実施形態によれば、ｍは０−２の整数である。別の実施形態によれば、ｍは０又は１である。１つの特に意図される実施形態によれば、ｍは０である。
いくつかの実施形態によれば、ｍの各場合でのＲ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素であり；又はＲ１は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ２である。１つの実施形態によれば、Ｌ１−Ｃ（Ｏ）−０に隣接する炭素原子上のＲ１は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ２である。
１つの特に意図される実施形態によれば、ｍの各場合でのＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素である。
１つの実施形態によれば、Ｒ３は水素又はＬＣ−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ２である。１つの特に意図される実施形態によれば、Ｒ３は水素である。
１つの実施形態によれば、Ｌ２はＣ５−２１アルキルである。別の実施形態によれば、Ｌ２はＣ９−２１アルキルである。さらに別の実施形態によれば、Ｌ２はＣ１１−２１アルキルである。１つの典型的な実施形態によれば、Ｌ２はＣ１１、Ｃ１３、Ｃ１５、Ｃ１７又はＣ１９アルキルである。別の典型的な実施形態によれば、Ｌ２はＣ１５アルキルである。
１つの特に意図される実施形態によれば、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ、水素である。
１つの特に意図される実施形態によれば、ｎは１である。
１つの特に意図される実施形態によれば、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ、水素である。
典型的な実施形態によれば、Ｒ８は、水素である。
１つの実施形態によれば、Ｒ８及びＲ９はそれぞれ、水素であり；又はＲ９はＬ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２である。１つの典型的な実施形態によれば、Ｒ８は水素であり、そしてＲ９はＬＣ−Ｃ（Ｏ）である。
いくつかの実施形態によれば、Ｌ３はＣ１−２１アルキルである。１つの特に意図される実施形態によれば、Ｌ３はメチル又は線状Ｃ１５アルキルである。典型的な実施形態によれば、Ｌ３はメチルである。
当業者は、式（ＩＩＩ）及び（ＩＩＩＡ）のコンストラクトがペプチド含有接合パートナーのペプチドを含むことができることを理解しているであろう。本明細書に記載されるように、ペプチドは、ペプチド含有接合パートナーを提供するために、本明細書に記載されるような種々の他の成分に、任意には置換され、修飾されるか又は結合され得る。
１つの実施形態によれば、Ａ１は、エピトープを含むペプチドである。１つの実施形態によれば、Ａ２は、エピトープを含むペプチドである。
いくつかの実施形態によれば、Ａ１はペプチドエピトープを含むペプチドである。いくつかの実施形態によれば、Ａ２は、ぺプチドエピトープを含むペプチドである。１つの実施形態によれば、Ａ１は、ペプチドエピトープを含むペプチドである。
別の実施形態によれば、Ａ２は、ペプチドエピトープを含むペプチドである。
１つの実施形態によれば、Ａ１は、エピトープにより置換されたペプチドである。１つの実施形態によれば、Ａ２は、エピトープにより置換されたペプチドである。
１つの実施形態によれば、エピトープは、リンカー基を介してペプチドに結合される。
１つの実施形態によれば、エピトープは、ペプチドエピトープである。
いくつかの実施形態によれば、Ａ１及び／又はＡ２は、それぞれ独立して、約８−２２０、８−２００、８−１７５、８−１５０、８−１２５、８−１００、８−９０、８−８０、８−７０、８−６０、８−５０、８−４０、８−３０、８−２５、８−２０、又は８−１５個のアミノ酸を含むペプチドである。１つの典型的な実施形態によれば、Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、約８〜６０個のアミノ酸を含むペプチドである。
他の実施形態によれば、Ａ１及び／又はＡ２は、それぞれ独立して、約８−２２０、８−２００、８−１７５、８−１５０、８−１２５、８−１００、８−９０、８−８０、８−７０、８−６０、８−５０、８−４０、８−３０、８−２５、８−２０、又は８−１５個のアミノ酸を含むペプチドである。
他の実施形態によれば、Ａ１及び／又はＡ２は、それぞれ独立して、約５−１５０、５−１２５、５−１００、５−７５、５−６０、５−５０、５−４０、５−３０、５−２５、５−２０、８−１５０、８−１２５、８−１００、８−７５、８−６０、８−５０、８−４０、８−３０、８−２５、又は８−２０個のアミノ酸を含むペプチドである。
いくつかの実施形態によれば、Ａ１及び／又はＡ２は、それぞれ独立して、８−６０個のアミノ酸を含むペプチドである。
いくつかの実施形態によれば、Ａ１及び／又はＡ２は、それぞれ独立して、８−６０個のアミノ酸を含むペプチドエピトープを含むか又はそれらにより置換されたペプチドである。
１つの実施形態によれば、Ｌ１は、Ｃ１１−２１アルキルであり；ｍは０であり；Ｒ３は水素又はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ２であり；Ｌ２はＣ１１−２１アルキルであり；そしてＲ４及びＲはそれぞれ、水素である。
１つの実施形態によれば、ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；そしてＲ９は水素、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２である。１つの実施形態によれば、ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；そしてＲ９は水素、又はＬ３−Ｃ（Ｏ）である。１つの実施形態によれば、Ｌ３は、メチル又は線状Ｃ１５アルキルである。
１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１−２１アルキルであり；ｍは０であり；Ｒ３は水素又はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ２であり；Ｌ２はＣ１１−２１アルキルであり；Ｒ４及びＲ５はそれぞれ、水素であり；ｎは１であり；Ｒ６，Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；Ｒ９は水素、Ｌ３−ＣＩＯ）又はＡ２である。１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１−２１アルキルであり；ｍは０であり；Ｒ３は水素又はＬ２−ＣＩＯ）−ＯＣＨ２であり；Ｌ２はＣ１１−２１アルキルであり；Ｒ４及びＲ５はそれぞれ、水素であり；ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；Ｒ９は水素又はＬ３−Ｃ（Ｏ）である。
１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１−２１アルキルであり；ｍは０であり；Ｒ３は水素であり；そしてＲ４及びＲ５はそれぞれ、水素である。
１つの実施形態によれば、ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；そしてＲ９は水素、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２である。１つの実施形態によれば、ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；そしてＲ９は水素又はＬ３−Ｃ（Ｏ）である。１つの実施形態によれば、ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；そしてＲ９は水素又はＬ３−Ｃ（Ｏ）であり、ここでＬ３はメチルである。
１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１−２１アルキルであり；ｍは０であり；Ｒ３は水素であり；Ｒ４及びＲ５はそれぞれ、水素であり；ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；Ｒ９は、水素、Ｌ３−Ｃ（０）又はＡ２である。１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１−２１アルキルであり；ｍは０であり；Ｒ３は水素であり；Ｒ４及びＲ５はそれぞれ、水素であり；ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；Ｒ９は、水素、又はＬ３−Ｃ（０）である。
１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１−２１アルキルであり；ｍは０であり；Ｒ３は水素であり；Ｒ４及びＲ５はそれぞれ、水素であり；ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；Ｒ９は、水素、又はＬ３−Ｃ（０）であり、ここでＬ３はメチルである。
１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１−２１アルキルであり；ｍは０であり；Ｒ３は水素であり；そしてＲ４及びＲ５はそれぞれ、水素である。
１つの実施形態によれば、ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；そしてＲ９は水素、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２である。１つの実施形態によれば、ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；そしてＲ９は水素又はＬ３−Ｃ（Ｏ）である。１つの実施形態によれば、ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；そしてＲ９は水素又はＬ３−Ｃ（Ｏ）であり、ここでＬ３はメチルである。
１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１−２１アルキルであり；ｍは０であり；Ｒ３は水素であり；Ｒ４及びＲ５はそれぞれ、水素であり；ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；Ｒ９は、水素、Ｌ３−Ｃ（０）又はＡ２である。１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１−２１アルキルであり；ｍは０であり；Ｒ３は水素であり；Ｒ４及びＲ５はそれぞれ、水素であり；ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；Ｒ９は、水素、又はＬ３−Ｃ（０）である。
１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１−２１アルキルであり；ｍは０であり；Ｒ３は水素であり；Ｒ４及びＲ５はそれぞれ、水素であり；ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；Ｒ９は、水素、又はＬ３−Ｃ（０）であり、ここでＬ３はメチルである。
いくつかの実施形態によれば、Ａ１は、最初のＮ末端アミノ酸残基としてセリンを含むペプチドである。いくつかの実施形態によれば、Ａ１及び／又はＡ２は、可溶化基を含むペプチドである。いくつかの実施形態によれば、可溶化基は、ペプチド鎖に複数の親水性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含む。特定の実施形態によれば、Ａ１は、ペプチド鎖に複数の親水性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含む可溶化基を含むペプチドである。
いくつかの実施形態によれば、Ａ１は、最初のＮ末端アミノ酸残基として、セリンを、及び前記セリンに隣接するペプチド鎖に複数の親水性アミノ酸残基を含むアミノ酸残基を含む可溶化基を、含むペプチドである。
いくつかの実施形態によれば、可溶化基は、ペプチド鎖に、複数の連続した親水性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含む。
１つの実施形態によれば、親水性アミノ酸残基は、カチオン性アミノ酸残基である。１つの実施形態によれば、カチオン性アミノ酸残基は、アルギニン又はリシン残基である。１つの特に意図される実施形態によれば、カチオン性アミノ酸残基は、リシン残基である。１つの実施形態によれば、配列は、２−２０、２−１５、２−１０、３−７又は３−５個のアミノ酸を含む。１つの実施形態によれば、可溶化基は、トリ−、テトラ−、ペンタ−、ヘキサ−又はヘプタ−リシン配列である。１つの特に意図される実施形態によれば、可溶化基は、テトラリシン配列である。
いくつかの実施形態によれば、Ｒ９は、水素、アミノ保護基又はＬ３−Ｃ（Ｏ）である。いくつかの実施形態によれば、Ｒ９は、水素又はＬ３−Ｃ（Ｏ）である。
いくつかの実施形態によれば、Ｒ９は水素又はアミノ保護基であり、そして前記方法はさらに、Ｒ９での水素又はアミノ保護基を、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）により置換するために、アミノ酸接合体又はぺプチド接合体をアシル化することを包含する。いくつかの実施形態によれば、Ｒ９でのアミノ保護基を、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）により置換するためへのアミノ酸接合体又はペプチド接合体のアシル化は、Ｒ９で水素を提供するためにアミノ保護基を除くことを包含する。
いくつかの実施形態によれば、Ａ１及び／又はＡ２は、アミノ酸又はペプチドである。いくつかの実施形態によれば、Ａ１及び／又はＡ２は、ペプチドである。
いくつかの実施形態によれば、Ａ１はＯＨ又はＯＰ１であり、そして／又はＲ９は水素、アミノ保護基又はＬ３−Ｃ（Ｏ）である。いくつかの実施形態によれば、Ａ１はＯＰ１又はＯＨであり、そして／又はＲ９は水素、アミノ保護基又はＬ３−Ｃ（Ｏ）である。いくつかの実施形態によれば、Ａ１はＯＰ１又はＯＨであり、そしてＲ９は水素、アミノ保護基又はＬ３−Ｃ（Ｏ）である。
いくつかの実施形態によれば、Ａ１はＯＰ１又はＯＨであり、そして／又はＲ９は水素、アミノ保護基又はＬ３−Ｃ（Ｏ）であり、そして前記方法は、Ａ１及び／又はＲ９を、アミノ酸又はペプチドにより置換するために、アミノ酸又はペプチドをカップリングすることを包含する。
いくつかの実施形態によれば、Ａ１はＯＰ１又はＯＨであり、そしてＲ９は水素、アミノ保護基又はＬ３−Ｃ（Ｏ）であり、そして前記方法はさらに、Ａ１及び／又はＲ９を、アミノ酸又はペプチドにより置換するために、アミノ酸又はペプチドをカップリングすることを包含する。
いくつかの実施形態によれば、ペプチドのカップリングは、１又は２以上のアミノ酸及び／又は１又は２以上のペプチドを、個々にカップリングすることを包含する。
いくつかの実施形態によれば、アミノ酸又はペプチドのカップリングは、ペプチドエピトープを含むペプチド接合体を提供する。いくつかの実施形態によれば、アミノ酸又はペプチドのカップリングは、リンカー基又は１又は２以上のそのアミノ酸を含むペプチド接合体を提供する。いくつかの実施形態によれば、アミノ酸又はペプチドのカップリングは、脂質含有接合パートナーがリンカー基を介して接合されているアミノ酸に接合されるペプチドエピトープを含むペプチド接合体を提供する。
いくつかの実施形態によれば、アミノ酸保護基は、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｃｂｚで（カルボキシベンジル）、ノシル（Ｏ−又はｐ−ニトロフェニルスルホニル）、Ｂｐｏｃ（２−（４−ビフェニル）イソプロポキシカルボニル）及びＤｄｅ（１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソベンジリデン）エチル）である。いくつかの実施形態によれば、アミノ保護基は、Ｂｏｃ又はＦｍｏｃである。
いくつかの実施形態によれば、カルボキシル保護基は、ｔｅｒｔ−ブチル又はベンジルである。１つの実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、下記式（ＩＶ）：
［式中、
Ｒ３は、水素又はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ２であり；
Ｒ９は、水素、アミノ保護基、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；そして
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
Ｌ３は、Ｃ１−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、アミノ酸又はペプチドであり；又はＡ１はＯＨ又はＯＰ１であり、ここでＰ１はカルボキシル保護基である］で表される化合物、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物である。
１つの実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、下記式（ＩＶ）：
［式中、
Ｒ３は、水素又はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ２であり；
Ｒ９は、水素、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；そして
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
Ｌ３は、Ｃ１−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、ペプチドであり；又はＡ１はＯＨであり；
ただし、
Ｒ９がＡ２でない場合、Ａ１はペプチドである］で表される化合物、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物である。
１つの実施形態によれば、式（ＩＶ）の化合物中のＬ１、Ａ１、Ａ２、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立して、式（Ｉ）の化合物に関連しての実施形態の何れかに定義される通りである。
１つの特に意図される実施形態によれば、Ｒ３は水素である。
１つの特に意図される実施形態によれば、Ｒ９はアセチルである。
１つの特に意図される実施形態によれば、Ｒ３は水素であり、そしてＲ９はアセチルである。
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、式（ＩＶ）（式中、Ｌ１はＣ１５線状アルキルであり、Ｒは水素であり、Ｒ９はＦｍｏｃであり、そしてＡ１はＯＨである）の化合物を製造するためであり、そして前記方法は、ビニルパルミテート及びＦｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨを反応せしめることを包含する。
いくつかの実施形態によれば、アミノ保護基は、Ｆｍｏｃではない。いくつかの実施形態によれば、アミノ保護基は、Ｂｏｃである。
いくつかの実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナーは、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨではない。
いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体は、３又はそれ以上、４又はそれ以上、又は５又はそれ以上の連続アミノ酸を含む。いくつかの実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、３又はそれ以上、４又はそれ以上、又は５又はそれ以上の連続アミノ酸を含む。
１つの実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナーに、脂質含有接合パートナーを接合するのに効果的な条件は、１又は２以上の遊離基の生成を包含する。１つの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーに、脂質含有接合パートナーを接合するのに効果的な条件は、１又は２以上の遊離基の生成を包含する。
いくつかの実施形態によれば、１又は２以上の遊離基の生成は、熱的に及び／又は光化学的に開始される。特定の実施形態によれば、１又は２以上の遊離基の生成は、遊離基開始剤の熱及び／又は光化学分離により開始される。典型的な実施形態によれば、１又は２以上の遊離基の生成は、熱開始剤の分解又は光化学開始剤の光化学分解により開始される。
いくつかの実施形態によれば、遊離基開始剤の熱分解は、適切な温度で、反応混合物を加熱することを包含する。いくつかの実施形態によれば、反応混合物は、約４０℃−約２００℃、約５０℃−約１８０℃、約６０℃−約１５０℃、約６５℃−約１２０℃、約７０℃−約１１５℃、約７５℃−約１１０℃、又は約８０℃−約１００℃の温度で加熱される。他の実施形態によれば、反応混合物は、少なくとも約４０℃、少なくとも約５０℃、少なくとも約６０℃、又は少なくとも約６５℃の温度で加熱される。１つの特に意図される実施形態によれば、反応混合物は、約９０℃の温度で加熱される。
いくつかの実施形態によれば、遊離基開始剤の光化学分解は、紫外線による照射を包含する。１つの特に意図される実施形態によれば、紫外線は、約３６５ｎｍの波長を有する。典型的な実施形態によれば、遊離基開始剤の光化学分解は、ほぼ周囲温度で実施される。
１つの特に意図される実施形態によれば、熱開始剤は、２，２′−アザビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）である、１つの特に意図される実施形態によれば、光開始剤は、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）である。
特定の実施形態によれば、反応は、液体媒体下で行われる。１つの実施形態によれば、液体媒体は、溶媒を包含する。１つの実施形態によれば、溶媒は、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、１，２−ジクロロエタン、及びそれらの混合物から成る群から選択される。１つの特に意図される実施形態によれば、溶媒は、ＮＭＰ、ＤＭＳＯ、又はそれらの混合物を包含する。
１つの特に意図される実施形態によれば、溶媒は、ＤＭＳＯを包含する。
いくつかの実施形態によれば、反応は、二量体化、テロメリゼーション、重合を阻害する１又は２以上の添加剤の存在下で実施される。いくつかの典型的な実施形態によれば、添加剤は、還元グルタチオン（ＧＳＨ）、２，２’−（エチレンジオキシ）ジエタンチオール（ＤＯＤＴ）、１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、及びタンパク質から成る群から選択される。１つの特に意図される実施形態によれば、添加剤はＤＴＴである。いくつかの実施形態によれば、添加剤は、ＤＴＴ又はｔｅｒｔ−ブチルメルカプタンである。
いくつかの実施形態によれば、１又は２以上の添加剤が、ＴＦＡ、ｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン及びそれらの組合せから成る群から選択される。特定の実施形態によれば、１又は２以上の添加剤は、ＴＦＡ及びｔｅｒｔ−ブチルメルカプタンの組合せである。いくつかの実施形態によれば、反応は、約５分−約４８時間、約５分−約２４時間、約５分−約１２時間、約５分−約６時間、約５分−約３時間、約５分−約２時間、又は約５分−約１時間、実施される。典型的な実施形態によれば、反応は、約５分−約１時間、行われる。いくつかの実施形態によれば、反応は、接合パートナーの１つが少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％消費されるまで、実施される。
特定の実施形態によれば、反応は、実質的に酸素を含まない条件下で行われる。
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、
アミノ酸又はペプチド接合体を提供するために、脂質含有接合パートナー及びアミノ酸含有接合パートナーを反応せしめ；
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により、ペプチドのアミノ酸配列を合成し；
ペプチドエピトープを含むペプチド接合体、リンカー基、又は１又は２以上のそのアミノ酸を含むペプチド接合体、又は脂質含有接合パートナーがリンカー基を介して接合されているアミノ酸に結合されるペプチドエピトープを含むペプチド接合体を提供するために、ＳＰＰＳにより、固相結合ペプチドに、アミノ酸接合体のアミノ酸又はペプチド接合体のアミノ酸をカップリングすることを含んで成る。
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、さらに、アミノ酸接合体のアミノ酸、又はペプチド接合体の何れか１つの脂質含有接合パートナーが接合されるアミノ酸のＮａ−アミノ基をアシル化することを包含する。
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、固相支持体からペプチド接合体を切断することを包含する。
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により、ペプチド含有接合パートナーのペプチドのアミノ酸配列を合成し；そして
本明細書に記載される実施形態の何れかに従って、脂質含有接合パートナー及びペプチド含有接合パートナーを反応せしめることを包含する。
典型的な実施形態によれば、前記方法は、
ＳＰＰＳにより、ペプチド含有接合パートナーのペプチドのアミノ酸配列を合成し；
固相支持体からペプチドを切断し；そして
本明細書に記載される実施形態の何れかに従って、脂質含有接合パートナー及びペプチド含有接合パートナーを反応せしめることを包含する。
１つの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、脂質含有接合パートナーとの反応の前、精製されていない。
いくつかの実施形態によれば、１又は２以上の保護基が、固相支持体からのペプチドの切断に基づいて除かれる。特定の実施形態によれば、ぺプチドに存在する保護基のすべてが除かれる。
１つの実施形態によれば、ＳＰＰＳは、Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳである。
いくつかの実施形態によれば、反応されるべき炭素−炭素二重結合又はチオールを担持するペプチド含有接合パートナーのペプチドにおけるアミノ酸残基は、Ｎ−末端アミノ酸残基であり、そして前記方法は、固相からペプチドの切断の前、Ｎ−末端アミノ基をアシル化することを包含する。典型的な実施形態によれば、アミノ酸残基は、Ｎ−末端残基である。１つの特に意図される実施形態によれば、Ｎ−末端残基は、システイン残基である。
１つの実施形態によれば、前記方法はさらに、反応媒体からペプチド接合体を分離し、そして任意には、ペプチド接合体を精製することを包含する。
別の側面によれば、本発明は、本発明の方法により製造されるアミノ酸接合体又はペプチド接合体を提供する。
別の側面によれば、本発明は、本発明の方法により製造されるペプチド接合体を提供する。
別の側面によれば、本発明は、下記式（Ｖ）：
［式中、
ｍは、０〜４の整数であり；
ｎは、１又は２であり；
ｍの各場合でのＲ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ９はアミノ保護基、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；
ｎの各場合でのＲ６及びＲ７は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；
Ｌ１は、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
Ｌ３は、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、アミノ酸又はペプチドであり；又はＡ１はＯＨ又はＯＰ１であり、ここでＰ１はカルボキシル保護基であり；
ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｌ１及びＬ３の何れかに存在する何れかのアルキル、シクロアルキル又はヘテロアルキルは、任意に置換される］で表される化合物、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物を提供する。
別の側面によれば、本発明は、下記式（Ｖ）：
［式中、
ｍは、０〜４の整数であり；
ｎは、１又は２であり；
ｍの各場合でのＲ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ９は、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；
ｎの各場合でのＲ６及びＲ７は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；
Ｌ１は、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
Ｌ３は、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、ペプチドであり；又はＡ１はＯＨであり；
但し、
Ａ１及びＡ２の少なくとも１つは、エピトープを含み；そして
Ｒ９がＡ２でない場合、Ａ１はペプチドであり；そして
ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｌ１及びＬ３の何れかに存在する何れかのアルキル、シクロアルキル又はヘテロアルキルは、任意に置換される］で表される化合物、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物を提供する。
１つの実施形態によれば、ｍ、ｎ、Ｒ６、Ｒ７、Ａ１及びＡ２はお互い独立して、式（Ｉ）の化合物に関する実施形態の何れかに定義される通りである。
１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ５−２１アルキルである。１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ５−２１アルキルである。別の実施形態によれば、Ｌ１はＣ９−２１アルキルである。さらにもう１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１−２１アルキルである。１つの典型的な実施形態によれば、Ｌ１は、Ｃ１１、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１７又はＣ１９アルキルである。１つの特に意図される実施形態によれば、Ｌ１はＣ１５アルキルである。
１つの実施形態によれば、Ｌ１は、９−２１個の炭素原子の直鎖を含む。１つの特に意図される実施形態によれば、Ｌ１は線状Ｃ１５アルキルである。
１つの実施形態によれば、ｍは０−２の整数である。別の実施形態によれば、ｍは０又は１である。１つの特に意図される実施形態によれば、ｍは０である。
１つの特に意図される実施形態によれば、ｍの各場合でのＲ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素である。
１つの特に意図される実施形態によれば、Ｒ３は水素である。
１つの特に意図される実施形態によれば、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ、水素である。
１つの特に意図される実施形態によれば、ｎは１である。
１つの特に意図される実施形態によれば、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ、水素である。
典型的な実施形態によれば、Ｒ８は水素である。
いくつかの実施形態によれば、Ｒ８は水素であり、そしてＲ９は水素、アミノ保護基、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２である。１つの実施形態によれば、Ｒ８及びＲ９はそれぞれ、水素であり；又はＲ９はＬ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２である。１つの典型的な実施形態によれば、Ｒ８は水素であり、そしてＲ９はＬ３−Ｃ（Ｏ）である。１つの特に意図される実施形態によれば、Ｌ３はメチルである。
いくつかの実施形態によれば、Ａ１はＯＰ１又はＯＨであり、そしてＲ９は、水素、アミノ保護基又はＬ３−Ｃ（Ｏ）である。
いくつかの実施形態によれば、Ａ１及び／又はＡ２は、アミノ酸又はペプチドである。いくつかの実施形態によれば、ペプチドは、エピトープを含む。
いくつかの実施形態によれば、Ａ１は、セリン、又は最初のＮ末端をアミノ酸残基としてセリンを含むペプチドである。
いくつかの実施形態によれば、Ａ１及び／又はＡ２は、ペプチド鎖に複数の親水性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含む可溶化基を含むペプチドである。
いくつかの実施形態によれば、Ａ１は、最初のＮ末端アミノ酸残基としてのセリン、及び前記セリンに隣接するペプチド鎖に複数の親水性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含む可溶化基を含むペプチドである。
１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１−２１アルキルであり；ｍは０であり；Ｒ３は水素であり；そしてＲ４及びＲ５はそれぞれ、水素である。
１つの実施形態によれば、ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；そしてＲ９は水素、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２である。１つの実施形態によれば、ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；そしてＲ９は水素又はＬ３−Ｃ（Ｏ）である。１つの実施形態によれば、ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；そしてＲ９は水素又はＬ３−Ｃ（Ｏ）であり、ここでＬ３はメチルである。
１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１−２１アルキルであり；ｍは０であり；Ｒ３は水素であり；Ｒ４及びＲ５はそれぞれ、水素であり；ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；Ｒ９は、水素、Ｌ３−Ｃ（０）又はＡ２である。１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１−２１アルキルであり；ｍは０であり；Ｒ３は水素であり；Ｒ４及びＲ５はそれぞれ、水素であり；ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；Ｒ９は、水素、又はＬ３−Ｃ（０）である。
１つの実施形態によれば、Ｌ１はＣ１１−２１アルキルであり；ｍは０であり；Ｒ３は水素であり；Ｒ４及びＲ５はそれぞれ、水素であり；ｎは１であり；Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；Ｒ９は、水素、又はＬ３−Ｃ（０）であり、ここでＬ３はメチルである。
いくつかの実施形態によれば、Ｌ１はＣ１５線状アルキルであり；ｍは０であり；ｎは１であり；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ、水素であり；Ｒ９はＦｍｏｃであり、そしてＡ１は、式（Ｖ）の化合物におけるＯＨである。
いくつかの実施形態によれば、Ｒ９のアミノ保護基は、Ｆｍｏｃではない。いくつかの実施形態によれば、Ｒ９のアミノ保護基は、Ｂｏｃである。
いくつかの実施形態によれば、式（Ｖ）の化合物は、３又はそれ以上、４又はそれ以上、又は５又はそれ以上の連続アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態によれば、アミノ及び／又はカルボキシル保護基は、式（Ｉ）の化合物に関しての実施形態の何れかに定義される通りである。
当業者は、式（Ｖ）の化合物が、ペプチド接合体であり、そして本明細書に記載される接合方法のペプチド接合体に関連する特定の実施形態が、式（Ｖ）の化合物にも適用されることを理解しているであろう。
いくつかの実施形態によれば、式（Ｖ）の化合物は、自己アジュバントペプチドである。
いくつかの実施形態によれば、前記化合物は、リンカー、又は１又は２以上のそのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチドは、リンカー、又は１又は２以上のそのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチドは、Ｌ１が結合されるアミノ酸に、リンカーを介して結合されるペプチドエピトープを含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチドは、複数のエピトープを含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチドは、ペプチド抗原を含む。いくつかの実施形態によれば、リンカーは、約２−２０、２−１８、２−１６、２−１４、２−１２、２−１０又は２−８個の長さのアミノ酸のアミノ酸配列である。
別の側面によれば、本発明は、配列番号１−５、８−１２又は１４−１６の何れか１つのアミノ酸配列からの２０又はそれ以上の連続アミノ酸を含むか又はそれらから成る、単離された、精製された、又は組換えペプチドを提供する。
１つの実施形態によれば、ペプチドは、配列番号１−５、８−１２又は１４−１８の何れか１つから成る群から選択されたアミノ酸配列を含むか、それらから成るか、又はそれらから実質的に成る。
１つの実施形態によれば、ペプチドは、配列番号４、５、１１、１２、１７及び１８の何れか１つから成る群から選択されたアミノ酸配列を含むか、それらから成るか、又はそれらから実質的に成る。
別の側面によれば、本発明は、有効量の本発明のペプチド接合体又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物、及び医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。
１つの実施形態によれば、医薬組成物は、免疫原性組成物である。
１つの実施形態によれば、前記組成物は、外因性アジュバントを含まない。
いくつかの実施形態によれば、前記組成物は、ワクチンである。
１つの実施形態によれば、医薬組成物は、有効量の本発明の複数のペプチド接合体を含み、例えば医薬組成物は、有効量の本発明の３又はそれ以上のペプチド接合体を含む。
別の側面によれば、本発明は、有効量の本発明のペプチド、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物、及び医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。
１つの実施形態によれば、医薬組成物は、有効量の本発明の複数のペプチド接合体を含み、例えば医薬組成物は、有効量の本発明の３又はそれ以上のペプチド接合体を含む。
１つの実施形態によれば、医薬組成物は、有効量の本発明の１又は２以上のペプチド接合体、及び１又は２以上の本発明のペプチド、又はそれらの何れかの組合せを含む。例えば、医薬組成物は、有効量の本発明の複数のペプチド接合体、及び本発明の１又は２以上のペプチド、又は有効量の本発明の１又は２以上のペプチド接合体及び本発明の複数のペプチドを含む。
別の側面によれば、本発明は、有効量の本発明のペプチド接合体又はペプチドを、対象に投与することを含んで成る、対象にワクチン接種するか、又は対象における免疫応答を誘発する方法を提供する。
別の側面によれば、本発明は、対象にワクチン接種するか、又は対象において免疫応答を誘発するためへの、本発明のペプチド接合体又はペプチドの使用を提供する。
別の側面によれば、本発明は、対象にワクチン接種するか、又は対象において免疫応答を誘発するための薬剤の製造への、本発明のペプチド接合体又はペプチドの使用を提供する。
別の側面によれば、本発明は、有効量の本発明の医薬組成物を、対象に投与することを含んで成る、対象にワクチン接種するか、又は対象における免疫応答を誘発する方法を提供する。
別の側面によれば、本発明は、対象にワクチン接種するか、又は対象において免疫応答を誘発するためへの、本発明の医薬組成物の使用を提供する。
別の側面によれば、本発明は、対象にワクチン接種するか、又は対象において免疫応答を誘発するための薬剤の製造への、本発明の１又は２以上のペプチド、又は本発明の１又は２以上のペプチド接合体の使用を提供する。
別の側面によれば、本発明は、有効量の本発明のペプチド接合体又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物を、対象に投与することを含んで成る、対象において免疫応答を誘発する方法を提供する。
別の側面によれば、本発明は、対象において免疫応答を誘発するためへの、本発明のペプチド接合体又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物の使用を提供する。
別の側面によれば、本発明は、対象において免疫応答を誘発するための薬剤の製造への、本発明のペプチド接合体又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物の使用を提供する。
別の側面によれば、本発明は、有効量の本発明のペプチド接合体又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物を、対象に投与することを含んで成る、対象をワクチン接種するための方法を提供する。
別の側面によれば、本発明は、対象にワクチン接種するためへの、本発明のペプチド接合体又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物の使用を提供する。
別の側面によれば、本発明は、対象にワクチン接種するための薬剤の製造への、本発明のペプチド接合体又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物の使用を提供する。
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、１又は２以上の本発明のペプチド及び／又は１又は２以上の本発明のペプチド接合体、例えば１又は２以上のペプチド接合体と組合して、１又は２以上のペプチドの対象への投与を包含する。
いくつかの実施形態によれば、１又は２以上の本発明のペプチド及び／又は１又は２以上の本発明のペプチド接合体、例えば１又は２以上のペプチド接合体と組合して、１又は２以上のペプチドが、対象をワクチン接種するか、又は対象において免疫応答を誘発するために、又は対象をワクチン接種するか、又は対象において免疫応答を誘発するための薬剤の製造に使用される。
いくつかの実施形態によれば、複数のペプチド、複数のペプチド接合体、又は１又は２以上のペプチド及び１又は２以上のペプチド接合体が使用されるか、又は投与される。いくつかの実施形態によれば、複数のペプチド、複数のペプチド接合体、又は１又は２以上のペプチド及び１又は２以上のペプチド接合体は、同時に、連続的に、又は別々に使用されるか、又は投与される。
不斉中心は、本明細書に記載される化合物に存在することができる。不斉中心は、キラル炭素原子の三次元空間での置換基の立体配置に依存して、（Ｒ）又は（Ｓ）として指定され得る。化合物のすべての立体化学的異性体形、すなわちジアステレオマー、鏡像異性体及び異性体形、並びにＤ−異性体及びＬ−異性体、及びそれらの混合物、例えば立体化学異性体の鏡像異性体的に富化された及びジアステレオマー的に富化された混合物は、本発明の範囲内にある。
個々の鏡像異性体は、市販の光学純度の出発材料から、又は鏡像異性体混合物を調製し、そしてその混合物を、個々の鏡像異性体に分割することにより、合成的に調製され得る。分割方法は、ジアステレオマーの混合物への鏡像異性体混合物の転換、及び例えば再結晶化又はクロマトグラフィー処理、及び当業界において知られている何れか他の適切な方法による、ジアステレオマーの分離を包含する。定義される立体化学の出発材料は、市販されているか、又は必要なら、当業界において良く知られている技法により分割され得る。
本明細書に記載される化合物はまた、立体配座又は幾何学的異性体、例えばｃｉｓ、ｔｒａｎｓ、ｓｙｎ、ａｎｔｉ、ｅｎｔｇｅｇｅｎ（Ｅ）及びｚｕｓａｍｍｅｎ（Ｚ）異性体としても存在することができる。すべてのそのような異性体及びそれらの何れかの混合物は、本発明の範囲内にある。
記載される化合物の任意の互変異性異性体又はその混合物もまた、本発明の範囲内にある。当業者により理解されるように、広範囲の種類の官能基及び他のコンストラクトが互変異性を示すことができる。例としては、ケト／エノール、イミン／エナミン、及びチオケトン／エンチオール互変異性を挙げることができるが、但しそれらだけには制限されない。
本明細書に記載される化合物はまた、同位体及びアイソトポーマーとしても存在することができ、ここで化合物中の１又は２以上の原子は、異なった同位体により置換されている。適切な同位体は、例えば１Ｈ、２Ｈ（Ｄ）、３Ｈ（Ｔ）、１２Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１６Ｏ及び１８Ｏを包含する。そのような同位体を、本明細書に記載される化合物に組込むための方法は、当業者に明らかである。本明細書に記載される化合物の同位体及びアイソトポーマーもまた、本発明の範囲内である。
本明細書に記載される化合物の医薬的に許容できる塩及び溶媒和物、例えば水和物もまた、本発明の範囲内である。そのような塩は、酸付加塩、塩基付加塩、及び塩基性窒素含有基の四級塩を包含する。
酸付加塩は、遊離塩基形での化合物と、無機又は有機塩とを反応せしめることにより調製され得る。無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、及びリン酸を挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない。有機酸の例としては、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、ステアリン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、イセチオン酸、スルファニル酸、アジピン酸、酪酸、及びピバル酸を挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない。
塩基付加塩は、遊離酸形での化合物と、無機又は有機塩基とを反応せしめることにより調製され得る。無機塩基付加塩の例は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、及び他の生理学的に許容できる金属塩、例えばアルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム又は亜鉛塩を包含する。有機塩基付加塩の例は、アミン塩、例えばトリメチルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン及びエチレンジアミンの塩を包含する。
化合物中の塩基性窒素含有基の四級塩は、例えば、化合物と、アルキルハロゲン化物、例えばメチル、プロピル及びブチル塩化物、臭化物及びヨウ化物、硫酸ジアルキル、例えば硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチル及びジアミル、及び同様のものとを反応せしめることにより調製され得る。
本明細書における式に使用される一般的化学用語は、それらの通常の意味を有する。
用語「脂肪族（ａｌｉｐｈａｔｉｃ）」とは、飽和及び不飽和、非芳香族、直鎖、枝分かれ、非環式及び環式炭化水素を含むことが意図される。当業者は、脂肪族基が例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、及びシクロアルケニル基を包含することを理解しているのであろう。いくつかの実施形態によれば、脂肪族基は、飽和される。
用語「ヘテロ脂肪族（ｈｅｔｅｒｏａｌｉｐｈａｔｉｃ）」とは、１又は２以上の鎖炭素原子がヘテロ原子により置換されている脂肪族基を含むことが意図される。いくつかの実施形態によれば、ヘテロ脂肪族は、飽和される。
用語「アルキル（ａｌｋｙｌ）」とは、飽和又は不飽和の直鎖及び枝分かれ鎖の炭化水素基を含むことが意図される。飽和炭化水素基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、及び同様のものを挙げることができる。不飽和アルキル基は、１又は２以上の炭素−炭素二重結合又は三重結合を有する。不飽和アルキル基の例としては、ビニル、プロプ−２−エニルが、クロチル、イソペント−２−エニル、２−ブタジエニル、ペンタ−２，４−ジエニル、ペンタ−１，４−ジエニル、エチニル、プロプ−３−イニル、ブト−３−イニル、及び同様のものを挙げることができる。いくつかの実施形態によれば、アルキルは飽和される。
用語「ヘテロアルキル（ｈｅｔｅｒｏａｌｋｙｌ）」とは、１又は２以上の鎖炭素原子がへテロ原子により置換されているアルキル基を含むことが意図される。いくつかの実施形態によれば、ヘテロアルキルは飽和される。
用語「シクロアルキル（ｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ）」とは、非芳香族環状アルキル基を含むことが意図される。シクロアルキル基の例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキサ−１−エニル、シクロヘキサ−３−エニル、シクロペンチルを挙げることができるが但しそれらだけには限定されない。いくつかの実施形態によれば、シクロアルキルは飽和される。
用語「ヘテロ原子（ｈｅｔｅｒｏａｔｏｍ）」とは、酸素、窒素、硫黄又はリンを含むことが意図される。いくつかの実施形態によれば、ヘテロ原子は、酸素、窒素及び硫黄から成る群から選択される。
用語「アリール（ａｒｙｌ）」とは、芳香族基を含むことが意図される。例としては、フェニル、トリル、ナフチル、インダニル及び同様のものを挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない。いくつかの実施形態によれば、アリール基は、芳香族環系に４−８又は６−８個の炭素原子を含む。
本明細書において使用される場合、用語「置換された（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）」とは、示される基における１又は２以上の水素原子が、１又は２以上の独立して選択された適切な置換基により置換され、但し、置換基が結合される各原子の通常の原子価を越えず、そしてその置換が安定した化合物をもたらすことを意味する。
本明細書に記載される化合物における脂肪族、ヘテロ脂肪族、アルキル、ヘテロアルキル及びシクロアルキル基のための任意の置換基の例としては、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ１、ＮＲ１Ｒ２、Ｃ１−６ハロアルキル、Ｃ１−６ハロアルコキシ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ１、ＳＯ２Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、Ｓ（Ｏ）Ｒ１、Ｃ（Ｏ）Ｒ１、及びｃ１−６脂肪族（ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立してＣ１−Ｃ６アルキルである）を挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない。
用語「カルボキシル保護基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）」とは、本明細書に使用される場合、カルボキシル基のＯＨ基を提供するために容易に除去され得、そして合成の間、所望しない反応に対してカルボキシル基を保護する基を意味する。そのような保護基は、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９）及び‘Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ−Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ’ｂｙ Ｆｅｒｎａｎｄｏ Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ（ｗｉｔｈ Ａｌｂｅｒｔ Ｉｓｉｄｒｏ−Ｌｌｏｂｅｔ ａｎｄ Ｍｅｒｃｅｄｅｓ Ａｌｖａｒｅｚ）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００９（１０９）２４５５−２５０４に記載されている。例としては、アルキル及びシリル基、例えばメチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、メトキシメチル、２，２，２−トリクロロエチル、ベンジル、ジフェニルメチル、トリメチルシリル、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、及び同様のものを挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない。
用語「アミン保護基（ａｍｉｎｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）」とは、本明細書において使用される場合、アミン基のＮＨ２基を提供するために、容易に除去され得、そのような保護基は、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９）及び‘Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ−Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ’ ｂｙ Ｆｅｒｎａｎｄｏ Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ（ｗｉｔｈ Ａｌｂｅｒｔ Ｉｓｉｄｒｏ−Ｌｌｏｂｅｔ ａｎｄ Ｍｅｒｃｅｄｅｓ Ａｌｖａｒｅｚ）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００９（１０９）２４５５−２５０４に記載されている。例としては、アシル及びアシルオキシ基、例えばアセチル、クロロアセチル、トリクロロアセチル、Ｏ−ニトロフェニル、Ｏ−ニトロフェノキシアセチル、トリフルオロアセチル、アセトアセチル、４−クロロブチ、イソブチリル、ピコリノイル、アミノカプロン、ベンジル、メトキシカルボニル、９−フルオレニルカルボニル、２，２，２−トリフルオロエトキシカルボニル、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、及び同様のものを挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない。さらなる例として、ＣＢＺ（カルボキシベンジル）、Ｎｏｓｙｌ（ｏ−又はｐ−ニトロフェニルスルホニル）、ＢＰＯＣ（２−（４−ビフェニル）イソ）及びＤＤＥ（１−（４，４−ジメチル−２，６−ジベンジリデン）エチル）を挙げることができる。
本明細書において使用される場合、用語「及び／又は」とは、「及び」又は「又は」、又は両者を意味する。
各詞の後の用語「（ｓ）」は、単数形及び複数形、又は両者を意味する。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、本明細書において使用される場合、「〜から少なくとも一部、成る」ことを意味する。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を包含する、本明細書における各文を解釈する場合、その用語により前置きされるそれ又はそれ以外の特徴がまた存在することができる。関連する用語、例えば「含む（ｃｐｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、同じ態様で解釈されるべきである。「含む（ｃｐｎｔａｉｎｉｎｇ）」とはまた、同じ態様で解釈されるべきである。
本発明はまた、本出願の明細書に言及されるか又は示される、部分、要素及び特徴、個々には又は集合的には、複数の前記部分、要素又は特徴の何れか又はそれらのすべての組合せで構成されると、広く言われ、そして本発明が関連する技術分野における既知同価物を有する特定の整数が本明細書において言及される場合、そのような既知同価物は、個別に記載されたかのように、本明細書に組込まれたものと見なされる。
本明細書に開示される数の範囲（例えば、１−１０）への参照は、その範囲内のすべての有理数（例えば、１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９、及び１０）への参照、及びまた、その範囲内の何れかの有理数（例えば、２−８、１．５−５．５及び３．１−４．７）も組込み、そして従って、本明細書に明確に開示される全ての範囲のすべてのサブ範囲が本明細書に明示的に開示されることが意図される。それらは、具体的に意図されるものの例に過ぎず、そして列挙される最低値と最高値との間の数値のすべての可能な組合せが、類似する態様で本出願に開示されるものとして見なされるべきである。
本発明は上記で定義されたように広義であるが、当業者は、本発明がそれらに制限されず、そして本発明がまた、以下の記載が例を付与する実施形態も包含することを理解しているであろう。
本発明は添付される図を参照して記載されるであろう。
図１は、５つのドナーわたって、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、２２、２０及び２６のＣＰ８０応答を示す一連のグラフである。ＭＦＩ：平均蛍光強度：ＵＴ：未処理；Ｐａｍ３ＣＳＫ４＝Ｐａｍ３Ｃｙｓ；２２＝８；２０＝９；２６＝１１。 図２ａ及び２ｂは、純粋２５（２ａ）及び２６（２ｂ）の２１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。図２ｃは、２６のＨＰＬＣクロマトグラムの主要ピークのＥＳＩ−ＭＳである。 図３は、実施例に記載されるように、ＡＰＣとしての同種異系ＨＬＡ−Ａ２＋ＭｏＤＣと共に、ＣＭＶ ｐｐ６５４９５−５０３コンストラクト及びＣＤ８＋Ｔ細胞クローン４Ｄ９を用いてのＴ細胞活性化アッセイの結果を示すグラフである。 図４は、実施例５に記載されるように、ＡＰＣとしての自系ＬＣＬと共に、ＮＹ−ＥＳＯ−１１５３−１８０コンストラクト及びＣＤ８＋Ｔ細胞クローン２Ｆ２を用いてのＴ細胞活性化アッセイの結果を示すグラフである。 図５は、実施例５に記載されるように、ＡＰＣとしての同種異系ＨＬＡ−Ａ２＋ ＨＬＡ−ＤＰ４＋ ＭｏＤＣと共に、ＮＹ−ＥＳＯ−１１５３−１８０コンストラクト 及び ＣＤ８＋ Ｔ細胞クローン２Ｆ２を用いてのＴ細胞活性化アッセイの結果を示すグラフである。 図６は、実施例６に記載されるように、ＡＰＣとしての自系ＬＣＬと共に、ＮＹ−ＥＳＯ−１１５３−１８０コンストラクト及びＣＤ４＋ Ｔ細胞クローン１Ｂ７を用いてのＴ細胞活性化アッセイの結果を示すグラフである。 図７は、実施例６に記載されるように、ＡＰＣとしての同種異系ＨＬＡ−Ａ２＋ ＨＬＡ−ＤＰ４＋ ＭｏＤＣと共に、ＮＹ−ＥＳＯ−１１５３−１８０コンストラクト及びＣＤ４＋ Ｔ細胞クローン１Ｂ７を用いてのＴ細胞活性化アッセイの結果を示すグラフである。 図８は、実施例６に記載されるように、ＡＰＣとしての同種異系ＨＬＡ−Ａ２＋ ＨＬＡ−ＤＰ４＋ ＭｏＤＣと共に、ＮＹ−ＥＳＯ−１１５３−１８０コンストラクト及びＣＤ４＋ Ｔ細胞クローン１Ｃ１１を用いてのＴ細胞活性化アッセイの結果を示すグラフである。 図９は、実施例７に記載されるように、ＡＰＣとしての自系ＬＣＬと共に、ＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１１６コンストラクト及びＣＤ８＋ Ｔ細胞クローン１Ｄ７を用いてのＴ細胞活性化アッセイの結果を示すグラフである。 図１０は、実施例７に記載されるように、ＡＰＣとしての自系ＬＣＬと共に、ＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１１６コンストラクト及びＣＤ８＋ Ｔ細胞クローン１Ｆ１０を用いてのＴ細胞活性化アッセイの結果を示すグラフである。 図１１は、実施例８に記載されるように、ＡＰＣとしての自系ＬＣＬと共に、ＮＹ−ＥＳＯ−１１１８−１４３コンストラクト及びＣＤ８＋ Ｔ細胞クローン１Ｃ１１を用いてのＴ細胞活性化アッセイの結果を示すグラフである。 図１２は、実施例９に記載されるように、ＡＰＣとしての自系ＬＣＬと共に、ＮＹ−ＥＳＯ−１１１８−１４３コンストラクト及びＣＤ４＋ Ｔ細胞クローン１Ｅ４を用いてのＴ細胞活性化アッセイの結果を示すグラフである。 図１３は、実施例９に記載されるように、ＡＰＣとしての自系ＬＣＬと共に、ＮＹ−ＥＳＯ−１１１８−１４３コンストラクト及びＣＤ４＋ Ｔ細胞クローン１Ｄ６を用いてのＴ細胞活性化アッセイの結果を示すグラフである。 図１４は、実施例１０に記載されるように、ＮＹ−ＥＳＯ−１コンストラクト及びＨｅｋＢｌｕｅ（登録商標）を用いてのＴＬＲアルゴニズムアッセイの結果を示すグラフである。 図１５は、実施例１０に記載されるように、ＮＹ−ＥＳＯ−１コンストラクト及びＩＬ−８アッセイを用いてのＴＬＲアゴニズムの結果を示す４種のグラフである。
本発明は、アミノ酸及びペプチド接合体の製造方法に関する。前記方法は、脂質含有接合パートナー、及びアミノ酸含有接合パートナーを、チオール−エン反応において、脂質含有接合パートナーを、アミノ酸含有接合パートナーに接合するのに効果的な条件下で、反応せしめることを包含する。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、脂質含有接合パートナー、及びペプチド含有接合パートナーを、チオール−エン反応において、脂質含有接合パートナーを、ペプチド含有接合パートナーに接合するのに効果的な条件下で、反応せしめることを包含する。
チオール−エン反応は、非芳香族炭素−炭素二重結合へのチオールの添加（すなわち、炭素−炭素二重結合のハイドロチオール化）を包含する。反応は遊離基機構を介して進行する。反応には次の３種の明確な相が存在する：開始、重合又はカップリング、及び終結。基発生は、エン基を通して伝播し、炭素中心の基を形成する求電子性チイル基をもたらす。次に、追加のチオール分子からの連鎖移動が、最終生成物を得るために、炭素上の基を反応停止する。
本発明の方法においては、１つの接合パートナーは、チオールを含み、そして他のパートナーは炭素−炭素二重結合を含む。
１又は２以上の遊離基が、当業界において知られている何れかの方法により、本発明の方法において生成され得る。遊離基は、熱的に及び／又は光化学的に生成され得る。１又は２以上の遊離基開始剤を用いて、遊離基の生成を開始することができる。適切な遊離基開始剤は、熱開始剤及び光開始剤を包含する。
遊離基は、加熱により熱開始剤から生成される。熱開始剤の分解及び得られる遊離基形成の速度は、開始剤、及び開始剤が加熱される温度に依存する。より高い温度が一般的に、より早い分解をもたらす。当業者は、過度の実験なしで、開始剤を加熱するための適切な温度を選択することができるであろう。
多くの熱開始剤は市販されている。熱開始剤の例としては、次のものを列挙することができるが、但しそれらだけには限定されない：ｔｅｒｔ−アミルペルオキシベンゾエート、１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルペルアセテート、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシベンゾエート、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシイソプロピルカーボネート、過酸化ラウロイル、過酢酸、及び過硫酸カリウム。
遊離基は、光による照射により、光開始剤から生成され得る。光開始剤の分解及び遊離基形成を誘発するのに必要な光の周波数は、開始剤に依存する。多くの光開始剤は、紫外線により開始され得る。
特定の波長又は波長範囲の光を用いて、開始剤を選択的に照射することができ、ここで脂質含有接合パートナー又はアミノ酸含有接合パートナー、例えばペプチド含有接合パートナーは、感光性基を含む。本発明の方法の特定の実施形態によれば、約３６５ｎｍの周波数が用いられる。この周波数の光は一般的に、天然に存在するアミノ酸の側鎖と適合できる。
広範囲の光開始剤は、市販されている。光開始剤の例としては、次のものを挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない：アセトフェノン、アニソイン、アントラキノン、アントラキノン−２−スルホン酸、ベンジル、ベンゾイン、ベンゾインエチルエーテル、ベンゾインイソブチルエーテル、ベンゾインメチルエーテル、ベンゾフェノン、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、４−ベンゾイルビフェニル、２−ベンジル−２−（ジメチルアミノ）−４’−モルホリノブチロフェノン、４’−ビス（ジエチルアミノ）ベンゾフェノン、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ベンゾフェノン、カンファーキノン、２−クロロチオキサンテン−９−オン、ジベンゾスベレノン、２，２−ジエトキシアセトフェノン、４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノン、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）、４−（ジメチルアミノ）ベンゾフェノン、４，４’−ジメチルベンジル、２，５−ジメチルベンゾフェノン、３，４−ジメチルベンゾフェノン、４’−メトキシアセトフェノン、２−エチルアントラキノン、３’−ヒドロキシアセトフェノン、４’−ヒドロキシアセトフェノン、３−ヒドロキシベンゾフェノン、４−ヒドロキシベンゾフェノン、１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオフェノン、２−メチルベンゾフェノン、３−メチルベンゾフェノン、メティベンゾイルホルメート、２−メチル−４’−（メチルチオ）−２−モルホリノプロピオフェノン、フェナントレンキノン、４’−フェニル、及びオキサンテン−９−オン。
当業者は、例えば脂質含有接合パートナー、アミノ酸含有接合パートナー、例えばペプチド含有接合パートナー、及び反応混合物に存在する任意の他の成分の性質を考慮して、本発明の方法への使用のための適切な遊離基開始剤を選択することができるであろう。いくつかの実施形態によれば、反応に存在する開始剤：チオールを含む出発材料の化学量論的比は、約２０：１−約０．０５：１、約１０：１−約０．０５：１、約５：１−約０．０５：１、約３：１−約０．５：１である。
反応における脂質含有接合パートナー及びアミノ酸含有接合パートナー、例えばペプチド含有接合パートナーは、本明細書に記載される実施形態の何れかに定義される通りである。
脂質含有接合パートナー又はアミノ酸含有接合パートナー、例えばペプチド含有接合パートナーは、既知の合成化学技法（例えば、Ｌｏｕｉｓ Ｆ Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍａｒｙ Ｆ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｖ．１−１９，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６７−１９９９ ｅｄ．）又はＢｅｉｌｓｔｅｉｎｓ Ｈａｎｄｂｕｃｈ ｄｅｒ ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ，４，Ａｕｆｌ．Ｅｄ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ，、補充（また、Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ オンラインデータベースを介して入手できる）を包含する）を用いて調製され得るか、又はいくつかの実施形態によれば、市販されている。
下記式（ＩＩ）：
［式中、ｍ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＬ１は、それぞれ独立して、式（Ｉ）の化合物について記載される実施形態の何れかに定義される通りである］で表される脂質含有接合パートナーは、
下記式（VI）：
［式中、ＸはＯＨ、又は適切な脱離基である］で表される化合物と、下記式（VII）：
で表される化合物とを、エステル化のために効果的な条件下で反応せしめることにより調製され得る。エステル化のための方法は、当業界において良く知られている。例えば、Ｘがクロロである場合、反応ハ、適切な溶媒中、塩基、例えばピリジン又はトリエチルアミンの存在下で実施され得る。酸塩化物は、より反応性の種（例えば、ヨウ化ナトリウムを用いて、その対応するヨウ化物）に現場転換され得る。反応が実施される温度は、酸種及び使用される溶媒の反応性に依存する。
式（VI）の多数の化合物は市販されている。他は、市販の前駆体から、標準の合成化学技法を用いて調製され得る。式（VI）（式中、Ｘはクロロである）の化合物は、適切な溶媒又は溶媒混合物中、塩化チオニルにより、その対応するカルボン酸を処理することにより調製され得る。
下記式（ＩＩＡ）：
［式中、ｐ、Ｒ１１、Ｒ２２，Ｒ３３、Ｒ４４及びＬ１は、式（ＩＡ）の化合物に定義される通りである］で表される脂質含有接合パートナーは、下記式（VIII）：
［式中、ｐは適切な保護基である］で表される化合物と、上記で定義されたような式（ＶＩ）の化合物とを、エステル化のために効果的な条件下で反応せしめ、そして次に、保護基を除去することにより、調製され得る。
他方では、式（ＩＩＡ）の化合物は、下記式（ＩＸ）：
［式中、ｐは適切な保護基である］で表される化合物と、上記に定義されるような式（VI）の化合物とを、エステル化のために効果的な条件下で反応せしめ、保護基を除去し、そして次に、チオールに、その対応するアルコールを転換することにより、調製され得る。アルコールを、チオールに転換するための適切な方法は、当業者に明らかであろう。
前記化合物の調製は、種々の化学基の保護及び保護解除を包含することができる。保護及び保護解除のための必要性、及び適切な保護基の選択は、当業者により容易に決定され得る。保護基、及び保護及び保護解除のための方法は、当業界においてはよく知られている（例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照のこと）。
同様に、式（VII）、（VIII）及び（ＩＸ）の化合物はまた、市販されているか、又は標準の合成化学技法を用いて、市販の前駆体から調製され得る。
脂質含有接合パートナー又はアミノ酸含有接合パートナー、例えばペプチド含有接合パートナー、及び反応混合物に存在する何れか他の成分が、反応容器中に導入される順序は変えることができる。反応は、ワンーポット法（ｏｎｅ−ｐｏｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）として実施され得る。
反応における、脂質含有接合パートナー又はアミノ酸含有接合パートナー、例えばペプチド含有接合パートナーの化学論は、変えることができる。いくつかの実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナー：脂質含有接合パートナーの化学量論的比は、約１：０．５−約１：２０、約１：１−約１：１０、約１：１−約１：５、約１：１−約１：３である。いくつかの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナー：脂質含有接合パートナーの化学論的比は、約：１：０．５−約１：２０、約：１：１−約１：１０、約：１：１−約１：５、約：１：１−約１：３である。
反応は、何れか適切な温度で実施され得る。約：１：０．５−約１：２０、反応は、約−２５℃−約２００℃、約−１０℃−約１５０℃、約０℃−約１２５℃、ほぼ周囲温度−約１００℃で実施される。いくつかの実施形態によれば、反応は、約２００℃末端、約１７５℃末端、約１５０℃末端、約１２５℃末端、又は約１００℃末端の温度で実施される。
いくつかの実施形態によれば、反応は、周囲温度以上の温度で実施される。１つの実施形態によれば、反応は、４０−２００℃、５０−１５０℃、６０−１００℃、６５−９０℃、又は７０−８０℃の温度で実施される。いくつかの実施形態によれば、反応は、４０℃以上、５０℃以上、７５℃以上、１００℃以上、又は１５０℃以上の温度で実施される。
反応が実施される温度は、遊離基が反応において何にして生成されるかに依存する。使用される温度は、反応の速度を調節するよう選択され得る。温度は、反応速度を調節するために、反応の間、調節され得る。反応速度を調節することにより、所望しない副産物（例えば、テロメリゼーション又は重合生成物）の形成を最小化又は回避することが可能である。
遊離基が熱的に生成される場合（例えば、熱開始剤を用いて）、反応は一般的に、周囲温度上の温度で実施されるであろう。
遊離基が光化学的に生成される場合、反応は、好都合には、周囲温度で実施され得る。特定の実施形態によれば、反応速度を遅くするためには、反応混合物を冷却するか、又は逆に、反応速度を早めるためには、反応混合物を加熱することが所望される。
当業者は、脂質含有接合パートナー又はアミノ酸含有接合パートナー、例えばペプチド含有接合パートナー、及び使用される場合、遊離基開始剤の反応性に関する方法を実施するための適切な温度を選択することができる。
反応が行われる温度は、反応混合物を加熱するか、又は冷却することにより、調節され得る。反応混合物の温度は、当業界において知られている適切な方法により調節され得る。熱は、反応容器内の熱交換器、反応容器を取り囲む加熱ジャケットを用いて、又は加熱された液体（例えば、オイル又は砂浴）に反応容器を浸漬することにより、反応混合物に適用され得る。特定の典型的な実施形態によれば、反応混合物は、マイクロ波照射により加熱される。
反応の進行は、何れか適切な手段、例えば薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、又は高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりモニターされ得る。反応は、出発材料の少なくとも１つの消費によりモニターされる場合、実質的に完了するまで進行させても良い。いくつかの実施形態によれば、反応は１分−７日、５分−７２時間、１０−４８時間、１０分−２４時間、進行させられる。他の実施形態によれば、反応は、７２時間未満、４８時間未満、２４時間未満、１２時間未満、６時間未満、４時間未満、２時間未満、又は１時間未満、進行させられる。
いくつかの実施形態によれば、反応は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％の脂質含有接合パートナー又はアミノ酸含有接合パートナーが、化学量論的にはより少なくても良いが、消費されるまで、実施される。いくつかの実施形態によれば、反応は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％の脂質含有接合パートナー又はペプチド含有接合パートナーが、化学量論的にはより少なくても良いが、消費されるまで、実施される。出発材料の消費は、何れか適切な方法、例えばＨＰＬＣによりモニターされ得る。
反応混合物は、当業界において知られている何れか適切な方法により、例えば磁気又は機械的攪拌機を用いて、混合され得る。使用される方法は、反応が行われる規模に依存する。
反応は一般的に、液体反応媒体において行われる。液体反応媒体は、溶媒を含むことができる。適切な溶媒の例として、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素、水、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド、トリフルオロ酢酸、酢酸、アセトニトリル、及びそれらの混合物を挙げることができる。
溶媒は、溶媒における、脂質含有接合パートナー又はアミノ酸含有接合パートナー、例えばペプチド含有接合パートナーの溶解性に基づいて選択され得る。遊離基開始剤の溶解性もまた、関連する。いくつかの実施形態によれば、脂質含有生接合パートナーは、疎水性である。アミノ酸含有接合パートナー、例えばペプチド含有接合パートナーの疎水性又は親水性は、例えばペプチド含有接合パートナーのペプチドのアミノ酸配列に依存して変化することができる。ペプチド含有接合パートナーにおける可溶化基の存在は、極性溶媒、例えば水において溶解性を高めることができる。当業者は、過度の実験ナシで、適切な溶媒を選択することができるであろう。
反応は、実質的に無酸素素条件下で行われ得る。酸素は、反応において形成される遊離基を不活性化することができる。反応混合物は、遊離基が生成される前、何れかの溶解される酸素を除くために実質的に無酸素である不活性ガス（例えば、窒素又はアルゴン）により脱気され得る。他方では、反応混合物中の個々の成分は、反応容器において組合される前、実質的に酸素を含まない不活性ガスにより脱気され得る。反応は、実質的に酸素を有さない不活性ガスの雰囲気下で実施され得る。
本発明の方法は、周囲圧力で実施され得る。
チオール−エン反応において伝播への連鎖移動の相対速度が遅い場合、所望しない二量体化、テロメリゼーション又は重合が発生する可能性がある。
二量体化、テロメリゼーション又は重合を阻害する添加剤が、本発明の方法における反応混合物に含まれ得る。本発明者は、いくつかの実施形態によれば、反応混合物において添加剤として連鎖移動を促進する外来性チオールの包含が、望ましくない副生成物の形成を低めることを見出した。外来性チオールは、いくつかの実施形態によれば、所望のチオール−エン反応の効率を高めることができる。適切な外来性チオールの例としては、還元グルタチオン、ＤＯＤＴ、ＤＴＴ、タンパク質及び同様のものを挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない。本発明者は、いくつかの実施形態によれば、ＤＴＴの包含が所望しない副生成物をもたらさなかったことを見出した。
特定の実施形態によれば、外来性チオールは、立体的ヒンダードチオールである。適切な外来性の立体的ヒンダードチオールの非制限的例は、ｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン及び１−メチルプロピルメルカプランを包含する。
いくつかの実施形態によれば、酸の包含はまた、二量体化、テロメリゼーション又は重合を阻害することができる。酸は、強無機酸、例えばＨＣｌ、又は有機酸、例えばＴＦＡであり得る。特定の実施形態によれば、添加剤はＴＦＡである。
本発明者は、いくつかの実施形態によれば、反応混合物における活性剤としてのｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン及びＴＦＡの両者の包含は、オリゴマーの形成を低め、そして所望する生成物への出発材料の転換を高めることを見出した。従って、特定の典型的な実施形態によれば、反応混合物は、ＴＦＡ及びｔｅｒｔ−ブチルメルカプタンの組合せを含む。
添加剤は一般的に、反応、又は前記方法における何れか、任意の続く工程に悪影響を与えないで、所望しない副産物の形成を最少にするのに十分な量で使用される。いくつかの実施形態によれば、反応における添加剤：チオールを含む出発材料の化学量論的比は、約２０：１−約０．０５：１、約１０：１−約０．０５：１、約５：１−約１：１、約３：１−約１：１である。
いくつかの実施形態によれば、反応に使用される出発材料の脂質含有接合パートナー及びアミノ酸含有接合パートナーの約５０重量％未満、約４０重量％未満、約３０重量％未満、約２５重量％未満、約２０重量％未満、約１５重量％未満、約１０重量％未満、約５重量％未満、約３重量％未満、又は約１重量％未満が、二量体化、テロメリゼーション又は重合に起因する所望しない副産物である。いくつかの実施形態によれば、反応に使用される出発材料の脂質含有接合パートナー及びペプチド含有接合パートナーの約５０重量％未満、約４０重量％未満、約３０重量％未満、約２５重量％未満、約２０重量％未満、約１５重量％未満、約１０重量％未満、約５重量％未満、約３重量％未満、又は約１重量％未満が、二量体化、テロメリゼーション又は重合に起因する所望しない副産物である。反応の生成物の純度は、例えばＨＰＬＣにより決定され得る。
反応混合物における、脂質含有接合パートナー及びアミノ酸含有接合パートナー、例えばペプチド含有接合パートナーのそれぞれの濃度はまた、反応に影響を及ぼすことができる。当業者は、例えば、過度の実験なしで、収率及び純度を最適にするために、反応混合物における脂質含有接合パートナー及びペプチド含有接合パートナーの濃度を変えることができるであろう。
いくつかの実施形態によれば、チオールを含む出発材料は、約０．０５ｍＭ−約１Ｍ、約０．５ｍＭ−約１Ｍ、１ｍＭ−約１Ｍの濃度で存在する。いくつかの実施形態によれば、前記濃度は少なくとも約０．０５ｍＭ、０．５ｍＭ又は１ｍＭである。
いくつかの実施形態によれば、アルケンを含む出発材料の濃度は、少なくとも約０．０５ｍＭ、０．５ｍＭ又は１ｍＭである。
いくつかの実施形態によれば、アミノ酸接合体又はペプチド接合体は、反応の後、反応媒体から分離され、そして任意には、精製され得る。いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体は、反応の後、反応の媒体から分離され、そして任意には、精製される。接合体は、当業界において知られている何れか適切な方法、例えば沈殿法を用いて、反応媒体から分離され得る。
いくつかの実施形態によれば、アミノ酸又はペプチド接合体は、それを反応媒体から分離した後、精製される。いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体は、それを反応媒体から分離した後、精製される。１つの特に意図される実施形態によれば、接合体は、１又は２以上の適切な溶媒を用いて、ＨＰＬＣにより精製される。
本発明の方法におけるペプチド含有接合パートナーにより生成されるペプチド接合体は、合成ペプチドを含むことができる。合成ペプチドは、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いて、調製される。
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）のための基本的原理は、ポリペプチド鎖が完結すると、切断及び精製を可能にする、固相支持体、典型的には樹脂粒子に、リンカー分子を介して固定される、成長ポリペプチド鎖へのアミノ酸の段階的付加である。手短に言及すれば、固相樹脂支持体及び出発アミノ酸が、リンカー分子を介して、お互い結合されるそのような樹脂−リンカー−酸マトリックスは、市販されている。
樹脂にカップリングされるアミノ酸は、化学保護基によりそのＮａ−末端で保護される。
アミノ酸はまた、側鎖保護基を有する。そのような保護基は、カップリングされるアミノ酸のカルボキシル基と、樹脂に結合されるペプチド鎖の保護されていないＮａ−アミノ基との間で新規ペプチド結合を形成する工程の間に生じる、所望しないか又は有害な反応を妨げる。
カップリングされるアミノ酸が、ペプチド鎖のＮ−末端アミノ酸の保護されていないＮａ−アミノ基と反応せしめられ、１つのアミノ酸によるペプチド鎖の鎖長が延長される。カップリングされるアミノ酸のカルボキシル基は、ペプチド鎖のＮａ−アミノ基との反応を促進するために、適切な化学活性剤により活性化され得る。次に、ペプチド鎖のＮ−末端アミノ酸のＮａ−保護基が、次のアミノ酸残基とのカップリングの調製において除去される。この技法は、可能な場合いつでも、自動化を魅力的にする多くの反復工程から構成される。当業者は、例えば収束ペプチド合成が所望される場合、個々のアミノ酸の代わりに、固相結合アミノ酸又はペプチドのＮａ−アミノ基にカップリングされ得ることを理解するであろう。
アミノ酸の所望する配列が達成される場合、ぺプチドは、リンカー分子で固相支持体から切断される。
ＳＰＰＳは、連続フロー法又はバッチフロー法を用いて行われ得る。連続フローは、分光光度計を介して反応の進行のリアルタイムモニターリングを可能にするが、しかし次の２つの明白な欠点を有する：樹脂上のペプチドと接触する試薬が希釈され、そして固相樹脂の物理的なサイズの制約のために、スケールがより制限される。バッチフローは、フィルター反応容器内で起こり、そして反応物がアクセス可能であり、そして手動的に又は自動的に添加され得るので、有用である。
次のタイプの保護基が通常、Ｎ−α−アミノ末端を保護することに使用される：「Ｂｏｃ」（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）及び「Ｆｍｏｃ」（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）。Ｂｏｃ方法のための試薬は、比較的安価であるが、しかしそれらは、非常に腐食性であり、そして高価な機器及びより厳密な予防措置を必要とする。低腐食性であるが、より効果な試薬を使用するＦｍｏｃ法が典型的には、好ましい。
ＳＰＰＳに関しては、広範囲の種類の固体支持体相が利用できる。合成のために使用される固体支持相は、合成目的のために適切な、合成樹脂、合成ポリマーフィルム、又はシリコン又はシリカ表面（例えば、制御された多孔性ガラス）であり得る。一般的に、樹脂、通常ポリスチレン懸濁液、又はポリスチレン−ポリエチレングリコール、又はポリマー支持体、例えばポリアミドが使用される。Ｂｏｃ―化学のために適切なリンカーにより官能化された樹脂の例は、ＰＡＭ樹脂、オキシム樹脂ＳＳ，フェノール樹脂、臭素化Ｗａｎｇ樹脂及び臭素化ＰＰＯＡ樹脂を包含する。Ｆｍｏｃ化学のために適切な樹脂の例は、ＡＭＰＢ−ＢＨＡ樹脂、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂、Ｒｉｎｋ酸樹脂、Ｔｅｎｔａｇｅｌ Ｓ ＡＣ樹脂、２−クロロトリチルクロライド樹脂、２−クロロトリチルアルコール樹脂、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ Ｔｒｔ−ＯＨ樹脂、Ｋｎｏｒｒ−２−クロロトリチル樹脂、ヒドラジン−２−クロロトリチル樹脂、ＡＮＰ樹脂、Ｆｍｏｃ光解離性樹脂、ＨＭＢＡ−ＭＢＨＡ樹脂、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＨＭＢ樹脂、Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｓａｆｅｔｙ Ｃａｔｃｈ樹脂、ＢＡｌ樹脂及びＦｍｏｃ−ヒドロキシルアミン２ クロロトリチル樹脂を包含する。他の樹脂は、ＰＬ Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂、ＰＬ−Ｏｘｉｍｅ樹脂及びＰＬ−ＨＭＢＡ樹脂を包含する。
各樹脂のために適切なカップリング条件は、出発モノマー又はサブユニットの結合について文献において知られている。
固相支持体の調製は、適切な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド）において支持体を溶媒和することを包含する。固相は典型的には、溶媒和の間、体積上昇し、これが、ペプチド合成を実施するために利用できる表面積を高める。
次に、リンカー分子が、固相支持体にペプチド鎖を連結するために、支持体に結合される。リンカー分子は一般的に、最終的な切断がＣ−末端で遊離酸又はアミドの何れかを提供するよう企画される。リンカーは一般的に、樹脂特異的ではない。リンカーの例は、ペプチド酸、例えばヒドロキシメチルフェノキシアセチル−４’−メチルベンズヒドリルアミン（ＨＭＰ）、又はベンズヒドリルアミン誘導体のためのペプチドアミドを包含する。
ペプチド配列の最初のアミノ酸は、リンカーが固相支持体に結合されるか、又はペプチド配列の最初のアミノ酸を含むリンカーを用いて、固相支持体に結合された後、リンカーに結合され得る。アミノ酸を含むリンカーは、市販されている。
次の工程は、最初のアミノ酸のＮａ−アミノ基を保護解除することである。Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳに関しては、Ｎａ−アミノ基の保護解除は、弱塩基処理（例えば、ピペラジン又は（ピペリジン）により行われ得る。側鎖保護基は、適度な酸分解（例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））により除去され得る。Ｂｏｃ ＳＰＰＳに関しては、Ｎａ−アミノ基の保護解除は、例えばＴＦＡを用いて行われ得る。
保護解除に続いて、アミノ酸鎖伸長、又はカップリングは、ペプチド結合の形成により進行する。この工程は、カップリングされるアミノ酸のＣ−ａ−カルボキシル基の活性化を必要とする。これは例えば、現場試薬、予備形成された対称無水物、活性エステル、酸ハロゲン化物、又はウレタン保護Ｎ−カルボキシ無水物を用いて達成され得る。現場方法は、同時活性化及びカップリングを可能にする。カップリング試薬は、カルボジイミド誘導体、例えばジシクロへキシルカルボジイミド又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミドを包含する。カップリング試薬はまた、ベンゾトリアゾールのウロニウム又はホスホニウム塩誘導体も包含する。そのようなウロニウム又はホスホニウム塩の例は、次のものを包含する：ＨＢＴＵ（Ｏ−１Ｈ−ベンゾトリアゾ−ル−１−イル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェ−ト）、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾ−ル−１−イルオキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェ−ト）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾ−ル−１−イル−オキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェ−ト）、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ（Ｏ−（１Ｈ−６−クロロベンゾトリアゾ−ル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェ−ト）、ＴＣＴＵ（Ｏ−１Ｈ−６−クロロベンゾトリアゾ−ル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレ−ト）、ＨＡＴＵ（Ｏ−（−７−アザベンゾトリアゾ−ル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェ−ト）、ＴＡＴＵ（Ｏ−（−７−アザベンゾトリアゾ−ル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレ−ト）、ＴＯＴＵ（Ｏ−［シアノ（エトキシカルボニルアミノ］−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレ−ト）、及びＨＡＰＵ（Ｏ−（ベンゾトリアゾ−ル−１−イル）オキシビス−（ピロリジノ）−ウロニウムヘキサフルオロホスフェ−ト。いくつかの実施形態によれば、カップリング試薬は、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＢＯＰ又はＰｙＢＯＰである。
所望のアミノ酸配列が合成された後、ペプチドは、樹脂から切断される。この工程に使用される条件は、ペプチド及び側鎖保護基のアミノ酸組成の感受性に依存する。一般的に、切断は、保護基及びリンカーに起因する反応性カルボニウムイオンをクエンチするために複数のスカベンジング剤を含む環境下で行われる。一般的な切断剤は、例えばＴＦＡ及び弗化水素（ＨＦ）を包含する。いくつかの実施形態によれば、ペプチドがリンカーを介して固相支持体に結合される場合、ペプチド鎖は、リンカーからペプチドを切断することにより、固相支持体から切断される。
樹脂からペプチドを切断するために使用される条件は、１又は２以上の側鎖保護基を同時に除去することができる。
ＳＰＰＳにおける保護基の使用は、十分に確立されている。一般的な保護基の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：セトアミドメチル（ＡＣＭ）、アセチル（ＡＣ）、アダマンチルオキシ（ＡｄａＯ）、ベンゾイル（Ｂｚｌ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、２−ブロモベンジル、ベンジルオキシ（ＢｚｌＯ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−ＢＲＺ）、ｔｅｒｔ−ブトキシ（ｔＢｕＯ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル（Ｂｕｍ）、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）、ｔｅｒｔ−ブチルチオ（ｔＢｕｔｈｉｏ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、シクロヘキシルオキシ（ｃＨｘＯ）、２、６−ジクロロベンジル（２、６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、４、４’−ジメトキシベンズヒドリル（Ｍｂｈ）、１−（４、４−ジメチル−２、６−ジオキソ−シクロヘキシリデン）３−メチル−ブチル（ｉｖＤｄｅ）、４−｛Ｎ−［１−（４、４−ジメチル−２、６−ジオキソ−シクロヘキシリデン）３−メチルブチル］−アミノ）ベンジルオキシ（ＯＤｍａｂ）、２、４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ホルミル（Ｆｏｒ）、メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ）、４−メトキシベンジル（ＭｅＯＢｚｌ）、４−メトキシ−２、３、６−トリメチル−ベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、４−メチルベンジル（ＭｅＢｚｌ）、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）、２、２、４、６、７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、２、２、５、７、８−ペンタメチル−クロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、トシル（Ｔｏｓ）、トリフルオロアセチル（Ｔｆａ）、トリメチルアセトアミドメチル（Ｔａｃｍ）、トリチル（Ｔｒｔ）及びキサンチル（Ｘａｎ）。
ペプチドのアミノ酸の１又は２以上の側鎖が官能基、例えば追加のカルボキシル、アミノ、ヒドロキシ又はチオール基を含む場合、追加の保護基が必要である。例えば、Ｆｍｏｃ法が使用される場合、Ｍｔｒ、Ｐｍｃ、ＰｂｆがＡｒｇの保護のために使用され得；Ｔｒｔ，ＴｍｏｂがＡｓｎ及びＧｌｎの保護のために使用され得；ＢｏｃがＴｒｐ及びＬｙｓの保護のために使用され得；ｔＢｕがＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒの保護のために使用され得；そしてＡｃｍ、ｔＢｕ、ｔＢｕｔｈｉｏ、Ｔｒｔ及びＭｍｔがＣｙｓの保護のために使用され得る。当業者は、多くのほかの適切な組合せが存在することを理解しているであろう。
上記に概略されるＳＰＰＳについての方法は、当業界において良く知られている。例えば、次のものを参照のこと：Ａｔｈｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｓｈｅｐｐａｒｄ，“Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ： “Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ２ｎｄ Ｅｄ．，”Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ：Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，１９８４；Ｊｏｎｅｓ，“Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，”Ｏｘｆｏｒｄ：Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９４；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４６−２１４９（１９６３）；Ｍａｒｇｌｉｎ，Ａ．ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：８４１−６６（１９７０）；ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｒ．Ｂ． ＪＡＭＡ．２１０（７）：１２４７−５４（１９６９）；及び“Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，ｅｄｓ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）。ペプチド又はポリペプチドの自動合成のための装置は、サプライヤー、例えばＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から容易に入手でき、そしてその製造業者の説明書に従って操作され得る。
樹脂からの切断に続いて、ペプチドは、例えば遠心分離又は濾過により、反応媒体から分離され得る。次に、ペプチドは、１又は２以上の適切な溶媒を用いて、ＨＰＬＣにより、連続的に精製され得る。
好都合には、本発明者は、いくつかの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーが、樹脂からのペプチド切断に続いて、精製なしで、本発明の方法に使用され得ることを見出した。
本発明者はまた、好都合には、本発明の方法が、ペプチド含有接合パートナーを用いて実施され得、ここで前記ペプチドは、Ｎａ−アミノ基保護基又は任意の側鎖保護基を含まないことを見出した。反応は一般的に、チオール及び非芳香族炭素−炭素二重結合のために選択的である。
本発明の方法において所望しない競争反応を妨げるために、ペプチド含有接合パートナー（例えば、ペプチドのシステイン残基）に存在するチオール基を、保護基により保護する必要がある。チオール基は、ペプチドに存在する１又は２以上の他の保護基を除去するか、又は樹脂からペプチドを切断するために使用される条件下で、取り外し不可能である保護基により保護され得る。典型的には、ペプチドは、適切な保護基を担持するアミノ酸を用いて合成されるであろう。当業者は、過度の実験なしに、適切な保護基を選択できるであろう。
特定の実施形態によれば、アミノ酸含有接合パートナー及び脂質含有接合パートナーは、反応される炭素−炭素二重結合の他に、１又は２以上の不飽和炭素−炭素結合を含む。特定の実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナー及び脂質含有接合パートナーは、反応される炭素−炭素二重結合の他に、１又は２以上の不飽和炭素−炭素結合を含む。当業者は、そのような実施形態において、反応される炭素−炭素二重結合に対するチオールの選択性が、例えば１又は２以上の不飽和炭素−炭素結合に対する炭素−炭素二重結合の立体的及び／又は電子的環境に依存することができることを理解するであろう。特定の実施形態によれば、反応される炭素−炭素二重結合は、アミノ酸含有接合パートナー及び脂質含有接合パートナーにおける何れか不飽和炭素−炭素結合に対して活性化される。特定の実施形態によれば、反応される炭素−炭素二重結合は、ペプチド含有接合パートナー及び脂質含有接合パートナーにおける何れか不飽和炭素−炭素結合に対して活性化される。
いくつかの実施形態によれば、炭素−炭素二重結合又はチオールを含む、アミノ酸含有接合パートナーのアミノ酸のＮａ−アミノ基は、アシル化され、例えばアセチル化される。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、反応される炭素−炭素二重結合又はチオールを含むアミノ酸含有接合パートナーのアミノ酸のＮａ−アミノ基をアシル化し、例えばアセチル化することを包含する。
ペプチド含有接合パートナーがＳＰＰＳにより合成されている場合、アシル化は、樹脂からの切断の前、又は後、実施され得る。いくつかの実施形態によれば、反応される炭素−炭素二重結合又はチオールを担持するペプチド含有接合パートナーのアミノ酸残基は、Ｎ−末端アミノ酸残基であり、そして前記方法は、ペプチドを切断する前、Ｎ−末端アミノ基をアシル化することを包含する。
いくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、アミノ酸接合体のアミノ酸のＮａ−アミノ基、又は脂質含有接合パートナーが接合されるペプチド接合体のアミノ酸残基をアシル化することを包含する。
アミノ酸のＮａ−アミノ基のアシル化は、適切な溶媒、例えばＤＭＦ中、塩基の存在下で、アシル化剤と、アミノ酸又はペプチドとを反応せしめることにより実施され得る。アシル化剤の非制限的例は、ハロゲン化物、例えば酸塩化物、例えば塩化アセチル、及び酸無水物、例えば無水酢酸を包含する。そのような剤は、市販されているか、又は当業界において良く知られている方法により調製され得る。適切な塩基の非制限的例は、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、４−メチルモルホリン及び同様のものを包含する。
他の実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーのペプチドの合成は、アミノ酸、又はＮａ−アミノ基でアシル化され、そして反応される炭素−炭素二重結合又はチオールを含むアミノ酸を含むペプチドを、１又は２以上のアミノ酸及び／又は１又は２以上のペプチドにカップリングすることを包含する。
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、ペプチド接合体を提供するために、アミノ酸又はペプチドへのアミノ酸接合体のアミノ酸のカップリングを包含する。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、ＳＰＰＳにより、固相樹脂支持体に接合されるアミノ酸又はペプチドに、アミノ酸接合体のアミノ酸をカップリングすることを包含する。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、ＳＰＰＳにより、固相樹脂支持体に接合されるペプチドに、アミノ酸接合体のアミノ酸をカップリングすることを包含する。前記方法は、ＳＰＰＳにより、固相樹脂支持体に結合されるペプチドを合成するこをを包含する。
いくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、ペプチドエピトープを含むペプチド接合体を提供するために、アミノ酸又はペプチドに、アミノ酸接合体のアミノ酸又はペプチド接合体のアミノ酸をカップリングすることを包含する。いくつかの実施形態によれば、カップリングされるペプチドは、ペプチドエピトープを含む。他の実施形態によれば、ペプチドエピトープは、カップリングに基づいて形成される。カップリングは、本明細書に記載のように、ＳＰＰＳにより実施され得る。
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、ペプチドエピトープを含むペプチド接合体を提供するために、ＳＰＰＳにより、固相樹脂支持体に結合されるペプチドに、アミノ酸接合体のアミノ酸をカップリングすることを包含する。
１つの実施形態によれば、カップリングされるペプチド接合体のペプチドは、固相樹脂支持体に結合され、そして前記方法は、ペプチドエピトープを含むペプチド接合体を提供するために、アミノ酸又はペプチドに、カップリングされるペプチド接合体のアミノ酸をカップリングすることを包含する。
他の実施形態によれば、前記方法は、ペプチドエピトープを含むペプチド接合体を提供するために、ＳＰＰＳにより、固相樹脂支持体に結合されるアミノ酸又はペプチドに、ペプチド接合体のアミノ酸をカップリングすることを包含する。
いくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、アミノ酸接合体又はペプチド接合体に、エピトープ、例えばペプチドエピトープをカップリングすることを包含する。前記方法がペプチドエピトープをカップリングすることを包含する場合、カップリングは、本明細書に記載のように、ＳＰＰＳにより実施され得る。
特定の実施形態によれば、エピトープ、例えばペプチドエピトープは、リンカー基を介してカップリングされるか又は結合される。特定の実施形態によれば、リンカー基は、アミノ配列、例えば２又はそれ以上、３又はそれ以上、又は４又はそれ以上の連続アミノ酸の配列である。特定の実施形態によれば、リンカーは、約２−２０、２−１８、２−１６、２−１４、２−１２、２−１０、４−２０、４−１８、４−１６、４−１４、４−１２、又は４−１０個のアミノ酸を含む。
アミノ酸又はペプチドの本明細書に記載のような別のアミノ酸又はペプチドへのカップリングが、前記アミノ酸のＮａ−末端、又は１つのカップリングパートナーのペプチドのアミノ酸と、前記アミノ酸のＣ−末端、又は他のカップリングパートナーのペプチドのアミノ酸との間でペプチド結合を形成することを包含することは、当業者により理解されるであろう。
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、ＳＰＰＳにより、ペプチド含有接合パートナーのペプチドのアミノ酸配列を合成し；そして脂質含有接合パートナーと、ペプチド含有接合パートナーとを反応せしめることを包含する。
いくつかの実施形態によれば、ＳＰＰＳによる、ペプチド含有接合パートナーのペプチドのアミノ酸配列の合成は、ペプチド又はその一部のアミノ酸配列を提供するために、固相樹脂支持体に結合されるアミノ酸又はペプチドに、アミノ酸又はペプチドをカップリングすることを包含する。特定の実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーの全ペプチドのアミノ酸配列は、ＳＰＰＳにより合成される。
ペプチド含有接合パートナーは、固相樹脂支持体に結合される間、脂質含有接合パートナーと反応せしめられ得る。他方では、ペプチドは、固相樹脂支持体から切断され得、そして任意には、精製され、続いて脂質含有接合パートナーと反応せしめられる。
ペプチド接合体、及び／又はアミノ酸含有接合パートナー、例えばペプチド含有接合パートナーは、１又は２以上の可溶化基を含むことができる。その１つ又は２以上の可溶化基は、極性溶媒、例えば水におけるペプチド含有接合パートナーの溶解性を高める。典型的な実施形態によれば、可溶化基は、ペプチド接合体の生物学的活性に悪影響を与えない。
可溶化基の存在は、医薬組成物としてのペプチド接合体の形成及び／又は投与のために好都合である。
いくつかの実施形態によれば、可溶化基は、ペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーのペプチドに結合される。いくつかの実施形態によれば、可溶化基は、ペプチド含有接合パートナーのペプチドに結合される。いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体のペプチド及び／又はペプチド含有パートナーのペプチドは、可溶化基を含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチド含有パートナーのペプチドは、、可溶性基を含む。
いくつかの実施形態によれば、可溶化基は、ペプチド鎖におけるアミノ酸の側鎖に結合される。いくつかの実施形態によれば、可溶化基は、ペプチド鎖のＣ−又はＮ−末端に結合される。いくつかの実施形態によれば、可溶化基は、ペプチド鎖における２つのアミノ酸残基間で結合される。いくつかの実施形態によれば、可溶化基は、ペプチド鎖における１つのアミノ酸残基のＮａ−アミノ基、及びペプチド鎖における別のアミノ酸残基のカルボキシル基に結合される。
適切な可溶化基の例は、親水性アミノ酸配列、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
１つの実施形態によれば、可溶化基は、ペプチド鎖に複数の親水性アミノ酸残基を含む親水性アミノ酸配列である。いくつかの実施形態によれば、可溶化基は、ペプチド鎖に複数の連続親水性アミノ酸残基の配列を含むアミノ酸配列である。そのような可溶化基は、ＳＰＰＳにより、ペプチド鎖に、可溶化基の各アミノ酸を付加することにより形成される。
別の実施形態によれば、可溶化基は、ポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態によれば、ポリエチレングリコールは、ペプチド鎖における１つのアミノ酸残基のＮａ−アミノ基、及びペプチド鎖における別のアミノ酸残基のカルボキシル基に結合される。
いくつかの実施形態によれば、ポリエチレングリコールは、約１−約１００、約１−約５０、約１−約２５、約１−約２０、約１−約１５、約１−約１０、約２−約１０、又は約２−約４個のエチレングリコールモノマー単位を含む。ペプチドに、ポリエチレングリコールをカップリングするための方法は、公知である。
いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーは、抗原、例えば抗原性ペプチドを含む。１つの実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーのペプチドは、抗原であるか、又は抗原を含み；又は抗原は、任意には、リンカーを介してペプチドに結合される。いくつかの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、抗原、例えば抗原性ペプチドを含む。１つの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーのペプチドは、抗原であるか、又はそれを含み；又は抗原は、任意には、リンカーを介してペプチドに結合される。
１つの実施形態によれば、抗原は、エピトープを含むペプチドを含む。１つの実施形態によれば、エピトープを含むペプチドは、エピトープを含む糖ペプチドである。１つの実施形態によれば、抗原は、エピトープを含む糖ペプチドである。
いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーは、エピトープを含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーのペプチドは、エピトープを含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、エピトープを含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーのペプチドは、エピトープを含む。
いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーは、複数のエピトープを含み、例えばペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーのペプチドは、複数のエピトープを含む。
いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーは、エピトープを含む糖ペプチドであるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーのペプチドは、糖ペプチドである。いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーは、ペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーのペプチドに結合されるエピトープを含む糖ペプチドを含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、エピトープを含む糖ペプチドであるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーのペプチドは、糖ペプチドである。いくつかの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、ペプチド含有接合パートナーのペプチドに結合されるエピトープを含む糖ペプチドを含む。
いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーは、タンパク質分解切断部位を含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーのペプチドは、タンパク質分解性切断部位を含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、タンパク質の分野性切断部位を含む。
いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーのペプチドは、１又は２以上のリンカー基を含む。ペプチド含有接合パートナー、ペプチド含有接合パートナーのペプチドは、１又は２以上のリンカーを含む。
いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーは、リンカー基を含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、リンカー基を含む。
いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーは、リンカー基を介して、ペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーのペプチドに結合されるエピトープを含む。いくつかの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、リンカー基を介して、ペプチド含有接合パートナーのペプチドに結合されるエピトープを含む。
リンカー基の例は、アミノ酸配列（例えば、ペプチド）、ポリエチレングリコール、アルキルアミノ酸及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。いくつかの実施形態によれば、リンカーは、タンパク質分解性切断部位であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態によれば、リンカーは、可溶化基であるか、又はそれを含む。
いくつかの実施形態によれば、リンカーは、ペプチド鎖における２つのアミノ酸残基間に接合される。
いくつかの実施形態によれば、リンカー基は、ペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーにおける１つのアミノ酸残基のＮａ−アミノ基、及びペプチド含有接合パートナーにおける別のアミノ酸残基のカルボキシル基に結合される。いくつかの実施形態によれば、リンカー基は、ペプチド含有接合パートナーにおける１つのアミノ酸残基のＮａ−アミノ基、及びペプチド含有接合パートナーにおける別のアミノ酸残基のカルボキシル基に結合される。
１つの実施形態によれば、リンカー基は、それが結合されるアミノ酸から、インビボで切断することができる。１つの実施形態によれば、リンカー基は、インビボでの加水分解により切断することができる。１つの実施形態によれば、リンカー基は、インビボでの酵素加水分解により切断することができる。リンカー基は、当業界において知られている何れかの適切な方法により導入され得る。
前記方法はさらに、アミノ酸接合体のアミノ酸又はペプチド接合体のペプチドに、エピトープをカップリングすることを包含する。エピトープは、上記おように、リンカー基を介して結合され得る。いくつかの実施形態によれば、エピトープは、ペプチドエピトープである、いくつかの実施形態によれば、前記方法は、エピトープを含む糖ペプチドをカップリングすることを包含する。
特定の所望の実施形態によれば、本発明のペプチド接合体が、抗原提示細胞による、適切な取り込み、プロセッシング及び提示を維持することは理解されるであろう。所望には、脂質含有接合体は、抗原提示細胞による、接合体に存在する何れかの抗原性ペプチドの提示を妨害しない。本明細書に提供される実施例は、本発明の接合体が、非接合、関連ペプチドに比較して、抗体提示細胞により提示されることを確立する。
合成されたペプチドのアイデンティティの確認は、便利には、例えばアミノ酸分析、質量分析、エドマン分解及び同様の手段により達成され得る。
本発明の方法はさらに、液体反応媒体からアミノ酸接合体を分離することを包含する。他方では、本発明の方法はさらに、液体反応媒体からペプチド接合体を分離することを包含する。当業界において知られている任意の適切な分離方法、例えば沈殿及び濾過が使用され得る。続いて、接合体は、例えば１又は２以上の適切な溶媒を用いて、ＨＰＬＣにより精製され得る。
本発明はまた、本発明の方法により製造される、アミノ酸接合体及びペプチド接合体にも関する。接合体は、本明細書に記載される実施形態の何れかに定義される通りである。
本発明はまた、アミノ酸接合体である、式（Ｖ）の化合物にも関する。
本発明はまた、ペプチド接合体である、式（Ｖ）の化合物にも関する。
ペプチド接合体は、純粋であるか、又は精製されるか、又は実質的に純粋であり得る。
本明細書において使用される場合、「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、絶対的純度を必要とせず；むしろ、それは、問題の材用が、それが以前にあった環境においてよりも、より純粋である相対的な用語として意図される。実際、その材料は典型的には、例えば種々の他の成分を除去するために、分別にゆだねられており、そして得られる材料は、その所望する生物学的活性を、実質的に保持している。用語「実質的に精製された（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、製造の間、関連しない他の成分を、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、及び最も好ましくは少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又はそれ以上、含まない材料を言及する。
用語「α−アミノ酸（α―ａｍｉｎｏ ｅｃｉｄ）」又は「アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」とは、α−炭素として指定される炭素に結合されるアミノ基及びカルボキシル基の両者を含む分子を意味する。適切なアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸、及び有機合成又は他の代謝経路により調製された天然に存在しないアミノ酸のＤ−及びＬ−異性体の両者を包含するが、但しそれらだけには限定されない。特にことわらない限り、用語「アミノ酸」とは、本明細書において使用される場合、アミノ酸類似体を包含することが意図される。
特定の実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーは、天然のアミノ酸のみを含む。用語「天然に存在するアミノ酸（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」とは、天然において合成されたペプチドに通常、見出され、そして次の１文字略語により知られている２０種のアミノ酸の何れか１つを言及する：Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶ。
用語「アミノ酸類似体（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇ）」又は「天然に存在しないアミノ酸（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ ａｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」とは、アミノ酸に構造的に類似し、そしてアミノ酸により置換され得る分子を意味する。アミノ酸類似体は、本明細書に定義されるように、アミノ酸に構造的に同一である化合物（但し、アミノ基とカルボキシル基との間の１又は２以上の追加のメチレン基の包含（例えば、α−アミノβ−カルボン酸）、又は類似する反応性基によるアミノ又はカルボキシル基の置換（例えば、第２又は第３アミンによる第１アミンの置換、又はエステルによるカルボキシル基の置換）を除く）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
特にことわらない限り、当業者の範囲内である分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技法は、本明細書に記載される方法の実施に使用され得る。そのような技法は、次の文献に十分に説明されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ． Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ ＮＹ，１９９４）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；及び Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｒ．Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ，Ｗ．Ｈ．Ａｌｂｅｒｔ，ａｎｄ Ｎ．Ａ．Ｓｔａｉｎｅｓ，ｅｄｓ．，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓ ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｂＨ，１９９３）。
用語「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」及び同様のものは、何れかの長さのアミノ酸残基の何れかのポリマーを言及するよう本明細書において使用される。ポリマーは線状又は非線状（例えば、枝分かれ）であり得、それは、修飾されたアミノ酸又はアミノ酸類似体を含むことができる。この用語はまた、天然において、又は介入により、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂肪化、アセチル化、リン酸化、又は何れか他の修飾又は操作、例えば標識又は生活性成分との接合により、修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する。
本発明者は、本発明の特定のペプチド接合体が免疫学的活性を有することを見出した。
細胞媒介性免疫は、Ｔ−リンパ球により主に媒介される。病原性抗原は、主要組織適合性ＭＨＣクラスエ又はＭＨＣクラスＩＩ分子の何れかに接合される抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、Ｂ−リンパ球及び樹状細胞）の表面上に発現される。ＭＨＣクラスＩＩにカップリングされる病原性抗原の提示は、ヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ−細胞応答を活性化する。抗原−ＭＨＣＩＩ複合体へのＴ−細胞の結合に基づいて、ＣＤ４＋ Ｔ−細胞は、サイトカインを放出し、そして増殖する。
ＭＨＣクラスＩに結合される病原性抗原の提示は、細胞毒性（ＣＤ８＋）Ｔ−細胞応答を活性化する。抗原−ＭＨＣＩ複合体へのＴ−細胞の結合に基づいて、ＣＤ８＋細胞は、パーフォリン及び他のメディエーターを分泌し、標的細胞死をもたらす。何れかの理論に束縛されるものではないが、出願人は、特定の実施形態によれば、ＣＤ８＋細胞により増強された応答が、ＣＤ４＋細胞により認識される１又は２以上のエピトープの存在下で達成されると考えている。
対象における細胞媒介性応答の開始又は進行を評価し、そしてモニターするほう方法は、当業者によく知られている。便利な典型的方法は、細胞媒介性応答に関連する１又は２以上のサイトカイン、例えば本明細書において同定されるそれらの存在又はレベルが評価されるそれらの方法を包含する。同様に、細胞媒介性応答の開始及び進行を評価するか、又はモニターする細胞ベースの方法は、本発明での使用に適しており、そして細胞増殖又は活性化アッセイ、例えば免疫細胞、例えばＴ−リンパ球の１又は２以上の集団の活性化又は拡大を標的とするアッセイを包含することができる。
特定の実施形態によれば、本発明の方法は、細胞媒介性免疫応答及び体液性応答の両者を誘発する。
体液性免疫応答は、Ｂ細胞により生成される分泌抗体により媒介される。分泌された抗体は、侵入正病原体の表面上に提示される抗原に結合し、それらを破壊するために合図をする。
再び、多液性応答の開始又は進行を評価し、そしてモニターする方法は、当業界において良く知られている。それらは、抗体結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、皮膚−ブリックテスト及び同様の手段を包含する。
理論に束縛されるものではないが、本発明者は、いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体がＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を刺激すると考えている。
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、病原体関連分子パターンを認識し、そして危険信号を細胞に伝達する、高く保存されるパターン認識受容体（ＰＲＲ）である。（Ｋａｗａｉ，Ｔ．，Ａｋｉｒａ，Ｓ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１１，３４，６３７−６５０）。ＴＬＲ２は、広範囲の異なった細胞型、例えば樹状細胞、マクロファージ及びリンパ球上に発現される細胞表面受容体である（Ｃｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｌ．，Ｓｈｅｒ，Ａ．，Ｓｅｄｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１０，３３，４９２−５０３）。
ＴＬＲ２は、広範囲の微生物成分、例えばリポ多糖、ペプチドグリカン及びリボテイコ酸を認識する。それは、ＴＬＲ１又はＴＬＲ６の何れかと共に、ヘテロダイマーを形成することにおいて、ＴＬＲの中でユニークであり；他のＰＲＲと共に複合体を形成する能力が、ＴＬＲ２に対する広範囲のアゴニストを説明することができる（Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｍ．，Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００５，４３５，６１２−６１９）。リガンド結合及びヘテロダイマー化に基づいて、シグナル伝達がＭｙＤ８８経路を介して行われ、ＮＦκＢ活性化及び炎症及びエフェクターサイトカインの続く生成に至る。
細菌の細胞壁成分に由来するジ−及びトリアシル化されたリポペプチドが、ＴＬＲ２アゴニストとして集中的に研究されてきた（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．Ｙ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．ａｎｄ Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．２００７，８，４１２−４１７）。リポペプチドは、細胞表面上の共刺激分子のアップレギュレーション及び増強された抗原提示を引起す、樹状細胞成熟を促進することが報告されている。リポペプチドはまた、サイトカインを放出し、そしてＢ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞を包含するリンパ球の活性化を促進するようマクロファージを刺激することも報告されている。
いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体は、ＴＬＲ２アゴニスト活性を有する。いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体は、Ｐｍ３ＣＳＫ４に匹敵するＴＬＲ２アゴニスト活性を有する。いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体は、Ｐａｍ３ＣＳＫ４の活性の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％のＴＬＲ２アゴニスト活性を有する。いくつかの実施形態によれば、例えばモジュレートされた免疫応答が所望される実施形態によれば、ペプチド接合体は、Ｐａｍ３ＣＳＫ４の活性よりも低いＴＬＲ２アゴニスト活性を有する。例えば、ペプチド接合体は、Ｐａｍ３ＣＳＫ４の活性の約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満又は約１０％未満のＴＬＲ２アゴニスト活性を有する。
いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体及び／又はペプチド含有接合パートナーのペプチドは、アミノ酸に隣接してセリンアミノ酸残基を含み、前記アミノ酸を通して、脂質含有接合パートナーがペプチドに接合される。いくつかの実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナーのペプチドは、アミノ酸に隣接してセリンアミノ酸残基を含み、前記アミノ酸を通して、脂質含有接合パートナーがペプチドに接合される。この位置でのセリンアミノ酸残基の存在が、ＴＬＲ２結合を増強する。いくつかの実施形態によれば、セリンアミノ酸残基が、アミノ酸のＣ−末端に結合され、前記アミノ酸を通して、脂質含有結合パートナーがペプチドに接合される。
本開示を読む当業者により理解されるように、ペプチド接合体は、エピトープ、例えば複数のエピトープを含むことができる。いくつかの実施形態によれば、エピトープは、ペプチドエピトープである。当業者は、広範囲のペプチドエピトープが本発明に使用され得ることを理解するであろう。
抗原
非常に多くの抗原、例えば腫瘍抗原、又は種々の病原性生物からの抗原は、特徴づけられており、そして本発明への使用のために適切であることは理解されるであろう。現在、特徴づけられているか、否かにかかわらず、免疫応答を誘発することができるすべての抗原が企画される。
従って、抗原お選択に依存して、本発明の接合体は、広範囲の免疫療法、例えば感染性疾患の治療及び予防、癌の治療及び予防、及び骨髄移植又は造血幹細胞移植された患者における免疫抑制の間、又はそれに続いて、ウィルス再活性化の治療（但し、それらだけには限定されない）に適用できる。
１又は２以上のアミノ酸置換、例えば１又は２以上の保存性アミノ酸置換を含む抗原がまた企画される。
「保存性アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、アミノ酸残基が、化学的に類似するか、又は誘導体化された側鎖を有する別の残基により置換されている置換である。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界において定義されている。それらのファミリーは、例えば塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、産生側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオエンチロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を包含する。アミノ酸類似体（例えば、リン酸化された、又はグリコシル化されたアミノ酸）もまた、天然に存在しないアミノ酸、例えばＮ−アルキル化されたアミノ酸（例えば、Ｎ−メチルアミノ酸）、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、及びγ−アミノ酸（但し、それらだけには限定されない）により置換されたペプチドであるとして、本発明において企画される。
抗原のフラグメント及び変異体もまた、特別に企画される。
ペプチドの「フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、酵素又は結合活性のために必要とされ、そして／又はペプチドの立体構造、例えばポリペプチドの立体構造を提供する機能を実行するペプチドの副配列である。
用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、本明細書において使用される場合、ペプチド配列、例えば特別に同定された配列とは異なるペプチド配列を意味し、ここで１又は２以上のアミノ酸残基が欠失され、置換されるか、又は付加されている。変異体は、天然に存在する変異体、又は天然に存在しない変異体である。変異体は、同じか又は他の種からであり、そしてホモログ、パラログ及びオルソログを包含することができる。特定の実施形態によれば、ペプチドを含むペプチド変異体は、野生型ペプチドの活性と同じか又は類似する生物学的活性を有する。ペプチドを参照しての用語「変異体」とは、本明細書に定義されるような全ての形のペプチドを包含する。
当業者は、本発明の接合体が、特定の実施形態によれば、例えば腫瘍性疾患、例えば癌の治療において、Ｔ−細胞応答を刺激するために、特に適切であることを理解しているであろう。１又は２以上の腫瘍抗原を含む本発明の接合体が特に企画される。本発明のペプチド接合体の調製に使用するために企画される腫瘍抗原は一般的に、１又は２以上のペプチドを含むことは、理解されるであろう。例えば、本発明の医薬組成物を包含する、本発明の特定の実施形態によれば、１又は２以上の追加の腫瘍抗原が存在し、ここで前記１又は２以上の腫瘍抗原は、ペプチドを含まない。腫瘍抗原は典型的には、ユニーク抗原、又は共有抗原の何れかとして分類され、ここで後者のグループは分化抗原、癌特異的抗原、及び過剰発現された抗原を含む。各種類の抗原の例は、本発明での使用に適している。治療、例えば免疫療法治療、又は腫瘍疾患、例えば癌に対するワクチン接種への使用のための代表的な腫瘍抗原が、下記に論じられる。それらの免疫化方法を用いて調製される１又は２以上の抗原を含む、化合物、ワクチン及び組成物が特に企画される。
特定の実施形態によれば、腫瘍抗原は、ペプチド含有腫瘍抗原、例えばポリペプチド腫瘍抗原又は糖タンパク質腫瘍抗原である。特定の実施形態によれば、腫瘍抗原は、サッカリド含有腫瘍抗原、例えば糖質腫瘍抗原又はガングリオシド腫瘍抗原である。特定の実施形態によれば、腫瘍抗原は、ポリペプチド含有腫瘍抗原を発現するポリヌクレオチド含有腫瘍抗原、例えばＲＮＡベクターコンストラクト、又はＤＮＡベクターコンストラクト、例えばプラスミドＤＮＡである。
本発明への使用のために適切な腫瘍抗原は、広範囲の種類の分子、例えば（ａ）ペプチドエピトープ（８―２０個の長さのアミノ酸の範囲であるが、但しこの範囲以外の長さもまた一般的である）、リポポリペプチド及び糖タンパク質を含むペプチド含有腫瘍抗原、（ｂ）多糖、ムチン、ガングリオシド、糖脂質及び糖タンパク質を含むサッカリド含有腫瘍抗原、及び（ｃ）抗原ポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを包含する。再び、当業者は、本発明の接合体又は組成物に存在する腫瘍高原は典型的には、ペプチドを含むであろうことを理解するであろう。しかしながら、１又は２以上の接合体が、それ自体、ペプチドを含まないが、しかし例えば、アミノ酸含有又はペプチド含有接合パートナーに結合される腫瘍抗原を含む本発明の実施形態が企画される。同様に、それ自体、ペプチドを含まない１又は２以上の腫瘍抗原が存在する本発明の組成物が企画される。
特定の実施形態によれば、腫瘍抗原は、例えば、（ａ）癌細胞に関連する完全長分子、（ｂ）欠失された、付加された及び／又は置換された部分を有する分子の相同体及び修飾された形、及び（ｃ）抗原性又は免疫原性を保持する、前記分子のフラグメントである。特定の実施形態によれば、腫瘍抗原は、組換え形で提供される。特定の実施形態によれば、腫瘍抗原は、例えば、ＣＤ８＋リンパ球により認識されるクラスＩ−制限抗原、又はＣＤ４＋リンパ球により認識されるクラスＩＩ―制限抗原を包含する。
共有腫瘍抗原は、一般的に、発生的に抑制された遺伝子の抑制解除を可能にするエピジェネティック変化のために、腫瘍により発現される、ネイティブの変異誘発されていない配列であると思われる。従って、共有抗原は典型的には、正常組織には発現は存在しないので、過剰発現されたか、又は分化関連抗原に好ましいと考えられる。また、同じ抗原が、多くの癌患者において標的化され得る。例えば、癌−精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１は、多くの腫瘍を有する患者の大部分に存在し、そして他の腫瘍を有する患者にはかなり少数である。別の例によれば、乳房分化腫瘍抗原ＮＹＢＲ−１及びＮＹＢＲ−１．１が、乳癌患者の集団に見出される。従って、共有腫瘍抗原は、開発のための魅力的標的を表す。
共有腫瘍抗原、例えばＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＴＳＰ−１、ＣＴＳＰ−２、ＣＴＳＰ−３、ＣＴＳＰ−４、ＳＳＸ２およびＳＣＰ１を含む癌−精巣抗原、及び乳癌抗原ＮＹＢＲ−１及びＮＹＢＲ−１．１の本発明の接合体への使用が、本明細書において特に企画される。
１つの典型的な実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナー又はペプチド接合体のペプチドは、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来の１又は２以上のエピトープを含む。１つの実施形態によれば、ペプチドは、ＮＹ−ＥＳＯ−１残基７９−１１６由来の１又は２以上のエピトープを含む。１つの実施形態によれば、ペプチドは、ＮＹ−ＥＳＯ−１残基１１８−１４３由来の１又は２以上のエピトープを含む。１つの実施形態によれば、ペプチドは、ＮＹ−ＥＳＯ−１残基１５３−１８０由来の１又は２以上のエピトープを含む。
１つの特に意図される実施形態によれば、ペプチド含有接合パートナー又はペプチド接合体のペプチドは、配列番号１−２０の何れか１つからの、８又はそれ以上の連続した、１０又はそれ以上の連続した、１２又はそれ以上の連続した、１５又はそれ以上の連続した、２０又はそれ以上の連続した、又は２５又はそれ以上の連続したアミノ酸から成る群から選択されたアミノ酸配列を含み、それらから実質的に成るか、又はそれらから成る。
種々の実施形態によれば、ぺプチドは、配列番号１−２０の何れか１つから成る群から選択された２以上のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態によれば、ペプチドは、配列番号４−７、１２、１３及び１８−２０から成る群から選択された１又は２以上のアミノ酸配列を含む。
同様に、抗原前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）を含む前立腺ワクチンＳｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ（ＡＰＣ８０１５、Ｐｒｕｖｅｎｇｅ（登録商標）は、９５％の前立腺癌細胞に存在する。かなりの割合の前立腺癌患者におけるこの可能性ある有効性のために、少なくとも部分的に、Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔは、無症候性、ホルモン不応性前立腺癌の治療への使用のために、２０１０年、ＦＤＡにより承認された。本発明の接合体へのＰＡＰ抗原の使用は、本発明において、特に企画される。
ユニーク抗原が、個人に対してユニークであるか、又は低割合の癌患者により共有され、そして典型的には、ユニークタンパク質配列に導く突然変異に起因するそれらの抗原であると思われる。ユニーク腫瘍抗原の代表的な例としては、突然誘発されたＲａｓ抗原、及び突然変異誘発されたｐ５３抗原を挙げることができる。この明細書を読んだ当業者により理解されるであろうように、本発明の方法は、例えば、患者固有の治療法の調製において、例えば１又は２以上のユニーク腫瘍抗原に対する特異的Ｔ−細胞応答を誘発するために、１又は２以上のユニークの腫瘍抗原を含む接合体の容易な調製を可能にする。
従って、代表的腫瘍抗原は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：（ａ）抗原、例えばＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ及びＭＡＧＥファミリーのポリペプチド、例えばＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６及びＭＡＧＥ−１２（例えば、黒色腫、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、及び膀胱腫瘍を対処するために使用され得る）、（ｂ）突然変異誘発された抗原、例えばｐ５３（種々の固形腫瘍、例えば、結腸直腸、肺、頭頸部癌に関連する）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵臓癌及び結腸直腸癌に関連する）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫に関連する）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫に関連する）、カスパーゼ−８（例えば、、頭頸部癌に関連する）、ＣＩＡ ０２０５（例えば、膀胱癌に関連する）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、βカテニン（例えば、黒色腫に関連する）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫に関連する）、ＢＣＲ−ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、リオースリン酸イソメラーゼ、ＭＡ ０２０５、ＣＤＣ−２７、及びＬＤＬＲ−ＦＵＴ、（ｃ）過剰発現された抗原、例えばガレクチン４（例えば、結腸直腸癌に関連する）、ガレクチン９（例えば、ホジキン病に関連する）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、ウィルムス腫瘍抗原−１（ＷＴ１、例えば、様々な白血病に関連する）、炭酸脱水酵素（例えば、腎癌に関連する）、アルドラーゼＡ（例えば、肺癌に関連する）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫に関連する）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、乳癌、結腸癌、肺癌及び卵巣癌に関連する）、α−フェトプロテイン（例えば、肝癌に関連する）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸癌に関連する）、ガストリン（例えば、ａ膵臓及び胃癌に関連する）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（例えば、乳癌及び卵巣癌に関連する）、Ｇ−２５０（例えば、腎細胞癌に関連する）、ｐ５３（例えば乳癌、結腸癌に関連する）、及び癌胎児性抗原（例えば、乳癌、肺癌、及び胃腸管の癌、例えば結腸直腸癌に関連する）、（ｄ）共有抗原、例えばラノーマ−メラニン細胞分化抗原、例えばＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラニン細胞刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１及びロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２（例えば、黒色腫に関連する）、（ｅ）前立腺関連抗原、例えばＰＡＰ、前立腺血清抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２、前立腺癌に関連する、（ｆ）免疫グロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫に関連する）、及び（ｇ）他の腫瘍抗原、例えば次のものを含むポリペプチド−及びサッカリド−含有抗原：（ｉ）糖タンパク質、例えば糖タンパク質、例えばシアリルＴｎ及びシアリルＬｅ．ｓｕｐ．ｘ（例えば乳癌、及び結腸癌に関連する）及び種々のムチン；糖タンパク質はキャリアタンパク質にカップリングされる（例えば、ＭＵＣ−１はＫＬＨにカップリングされる）；（ｉｉ）リポポリペプチド（例えば、脂質成分に結合されるＭＵＳ−１）；（ｉｉｉ）キャリアタンパク質（例えば、ＫＬＨ）にカップリングされる多糖類（例えば、Ｇｌｏｂｅ Ｈ合成六糖類）；（iV）例えばまたキャリヤタンパク質（例えば、ＫＬＨ）にカップリングされる、ガングリオシド、例えばＧＭ２、ＧＭ１２、ＧＤ２、ＧＤ３（例えば、脳、肺癌、メラノーマに関連する）。
本発明の使用に適する他の代表的腫瘍抗原は、次のものを包含する：ＴＡＧ−７２（例えば、米国特許第５、８９２、０２０号；ヒト癌抗原（例えば、米国特許第５、８０８、００５号を参照のこと）；骨肉腫細胞からのＴＰ１及びＴＰ３抗原（例えば、米国特許第５、８５５、８６６号を参照のこと）；腺癌細胞からのトムセン−フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原（例えば、米国特許第５、１１０、９１１号を参照のこと）；ヒト前立腺腺癌からのＫＣ−４抗原（例えば、米国特許第４、７４３、５４３号を参照のこと）；ヒト結腸直腸癌抗原（例えば、米国特許第４、９２１、７８９号を参照のこと）；嚢胞腺癌からのＣＡ１２５抗原（例えば、米国特許第４、９２１、７９０号を参照のこと）；ヒト乳癌からのＤＦ３抗原（例えば、米国特許第４、９６３、４８４号及び第５、０５３、４８９号を参照のこと）；ヒト乳房腫瘍抗原（例えば、米国特許第４、９３９、２４０号を参照のこと）；ヒト黒色腫のｐ９７抗原（例えば、米国特許第４、９１８、１６４号を参照のこと）；癌又はオロソムコイド関連抗原（ＣＯＲＡ）（例えば、米国特許第４、９１４、０２１号を参照のこと）；ヒト乳癌の糖タンパク質におけるＴ及びＴｎハプテン、ＭＳＡ乳癌糖タンパク質；ＭＦＧＭ乳癌抗原；ＤＵ−ＰＡＮ−２膵臓癌抗原；ＣＡ１２５卵巣癌抗原；ＹＨ２０６肺癌抗原、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）肝細胞癌抗原；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）大腸癌抗原；上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）乳癌抗原；チロシナーゼ；ｒａｆ癌遺伝子産物；ｇｐ７５、ｇｐ１００；ＥＢＶ−ＬＭＰ １＆２；ＥＢＶ−ＥＢＮＡ １、２＆３ｃ；ＨＰＶ−Ｅ４、６、７；ＣＯ１７−１Ａ；ＧＡ７３３；ｇｐ７２；ｐ５３；プロテイナーゼ３；テロメラーゼ；及びメラノーマガングリオシド。現在特徴づけられているか、否かにかかわらず、それらの及び他の腫瘍抗原が、本発明への使用のために企画される。
特定の実施形態によれば、腫瘍抗原は、突然変異誘発されたか、又は変更された細胞成分に由来する。変更された細胞成分の代表的例は、ｒａｓ、Ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｉｌｍｓの腫瘍遺伝子によりコードされる変更されたタンパク質、ユビキチン、ムチン、ＤＣＣ、ＡＰＣ及びＭＣＣ遺伝子によりコードされるタンパク質、並びに、受容体又は受容体様コンストラクト、例えばｎｅｕ、甲状腺ホルモン受容体、血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体、インスリン受容体、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、及びコロニー刺激因子（ＣＳＦ）受容体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
本発明に使用されるポリヌクレオチド含有抗原は、ポリペプチド腫瘍抗原、例えば上記に列挙されるそれらの抗原をコードするポリヌクレオチドを包含する。特定の実施形態によれば、ポリヌクレオチド含有抗原は、インビボでポリペプチド腫瘍抗原を発現することができる、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターコンストラクト、例えばプラスミドベクター（例えば、ｐＣＭＶ）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
本発明はまた、免疫抑制されているか、又は免疫抑制された患者、例えば骨髄移植、造血幹細胞移植を受けたか、又は他方では、免疫抑制を受けている患者において効果的な抗−ウィルス免疫性を誘発するために、Ｔ−細胞を刺激することができるウィルス抗原を含む接合体の調製も企画する。
同様に、高められた癌発生率に関連するか、又は癌を引起すことが報告されているウィルス、例えばヒトパピローマウィルス、Ａ型肝炎ウィルス、及びＢ型肝炎ウィルスに由来の抗原が、本発明に使用のために企画される。
例えば、特定の実施形態によれば、腫瘍抗原は、次のものを包含するが、但しそれらだけには制限されない：ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バーウイルス抗原、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、例えばＥ６及びＥ７、Ｂ型肝炎及びＣウイルス抗原、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス抗原、ＴＳＰ−１８０、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｍｎ−２３Ｈ１、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ ７２−４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１ Ｔｇｐ７２、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３（ＣＡ ２７．２９／ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質／サイクロフィリンＣ−結合タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、及び同様のもの。
病原性生物に対するワクチン接種に使用するための代表的抗原が下記に論じられる。それらの免疫化方法を用いて調製される１又は２以上の抗原を含む、化合物、ワクチン及び組成物が具体的に企画される。
結核抗原
非常に多くの結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗原が特徴づけられており、そして本発明への使用のために適切であることは、理解されているであろう。免疫応答を誘発することができる全ての結核菌抗原が、現在、特徴づけられているか否かにかかわらず、企画される。
使用のために適切な典型的結核菌抗原は、初期分泌抗原性標的物（ＥＳＡＴ）−６、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ（ＭＰＴ５９）、Ａｇ８５Ｂ、Ａｇ８５Ｃ、ＭＰＴ３２、ＭＰＴ５１、ＭＰＴ５９、ＭＰＴ６３、ＭＰＴ６４、ＭＰＴ８３、ＭＰＢ５、ＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＴＣ２８、Ｍｔｂ２、Ｍｔｂ８．４、Ｍｔｂ９．９、Ｍｔｂ３２Ａ、Ｍｔｂ３９、Ｍｔｂ４１、ＴＢ１０．４、ＴＢ１０Ｃ、ＴＢ１１Ｂ、ＴＢ１２．５、ＴＢ１３Ａ、ＴＢ１４、ＴＢ１５、ＴＢ１５Ａ、ＴＢ１６、ＴＢ１６Ａ、ＴＢ１７、ＴＢ１８、ＴＢ２１、ＴＢ２０．６、ＴＢ２４、ＴＢ２７Ｂ、ＴＢ３２、ＴＢ３２Ａ、ＴＢ３３、ＴＢ３８、ＴＢ４０．８、ＴＢ５１、ＴＢ５４、ＴＢ６４、ＣＦＰ６、ＣＦＰ７、ＣＦＰ７Ａ、ＣＦＰ７Ｂ、ＣＦＰ８Ａ、ＣＦＰ８Ｂ、ＣＦＰ９、ＣＦＰ１０、ＣＦＰ１１、ＣＦＰ１６、ＣＦＰ１７、ＣＦＰ１９、ＣＦＰ１９Ａ、ＣＦＰ１９Ｂ、ＣＦＰ２０、ＣＦＰ２１、ＣＦＰ２２、ＣＦＰ２２Ａ、ＣＦＰ２３、ＣＦＰ２３Ａ、ＣＦＰ２３Ｂ、ＣＦＰ２５、ＣＦＰ２５Ａ、ＣＦＰ２７、ＣＦＰ２８、ＣＦＰ２８Ｂ、ＣＦＰ２９、ＣＦＰ３０Ａ、ＣＦＰ３０Ｂ、ＣＦＰ５０、ＣＷＰ３２、ｈｓｐＸ（アルファ結晶）、ＡＰＡ、ツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ＳＴ−ＣＦ、ＰＰＥ６８、ＬｐｐＸ、ＰｓｔＳ−１、ＰｓｔＳ−２、ＰｓｔＳ−３、ＨＢＨＡ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＬ２、ＧｒｐＥＳ、ＬＨＰ、１９ｋＤａのリポタンパク質、７１ｋＤａ、ＲＤ１−ＯＲＦ２、ＲＤ１−ＯＲＦ３、ＲＤ１−ＯＲＦ４、ＲＤ１−ＯＲＦ５、ＲＤ１−ＯＲＦ８、ＲＤ１−ＯＲＦ９Ａ、ＲＤ１−ＯＲＦ９Ｂ、Ｒｖ１９８４ｃ、Ｒｖ０５７７、Ｒｖ１８２７、ＢｆｒＢ、Ｔｐｘ．Ｒｖ１３５２、Ｒｖ１８１０、ＰｐｉＡ、Ｃｕｔ２、ＦｂｐＢ、ＦｂｐＡ、ＦｂｐＣ、ＤｎａＫ、ＦｅｃＢ、Ｓｓｂ、ＲｐｌＬ、ＦｉｘＡ、ＦｉｘＢ、ＡｈｐＣ２、Ｒｖ２６２６ｃ、Ｒｖ１２１１、Ｍｄｈ、Ｒｖ１６２６、Ａｄｋ、ＣｌｐＰ、ＳｕｃＤ（Ｂｅｌｉｓｌｅ ｅｔ ａｌ、２００５；米国特許第７、０３７、５１０号；米国特許第２００４／００５７９６３号；米国特許第２００８／０１９９４９３号；米国特許第２００８／０２６７９９０号）、又は上記抗原の何れかの少なくとも１つの抗原性部分又はＴ−細胞エピトープを包含する。
肝炎抗原
多くの肝炎抗原は、特徴づけられており、そして本発明の使用のために適切である。典型的なＣ型肝炎抗原は、Ｃ−ｐ２２、Ｅ１−ｇｐ３５、Ｅ２−ｇｐ７０、ＮＳ１−ｐ７、ＮＳ２−ｐ２３、ＮＳ３−ｐ７０、ＮＳ４Ａ−ｐ８、ＮＳ４Ｂ−ｐ２７、ＮＳ５Ａ−ｐ５６／５８、及びＮＳ５Ｂ−ｐ６８を包含し、そしてそれらに由来する１又は２以上の抗原性部分又はエピトープが、本発明での用途のために、それぞれ適切である（単独で又は組合しても）。免疫応答を誘発できるすべての肝炎抗原が、現在特徴づけられているか、否かにかかわらず、企画される。
インフルエンザ抗原
多くのインフルエンザ抗原は、特徴づけられており、そして本発明の使用のために適切である。典型的なインフルエンザ抗原は、ＰＢ、ＰＢ２、ＰＡ、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質の何れか、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳを包含し、そしてそれらに由来する１又は２以上の抗原性部分又はエピトープが、本発明での用途のために、それぞれ適切である（単独で又は組合しても）。免疫応答を誘発できるすべてのインフルエンザ抗原が、現在特徴づけられているか、否かにかかわらず、企画される。
炭疽菌抗原
多くの炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）抗原が、ワクチン開発のための有能な候補体として同定されており、そして本発明において有用である。例えば、ＰＡ８３は、ワクチン開発のための１つのそのような抗原である。現在、炭疽菌のための唯一のＦＤＡライセンス取得されたワクチンは、「吸着炭疽菌ワクチン」（ＡＶＡ）又はＢｉｏＴｈｒａｘ（登録商標）として市販されている。このワクチンは、アルミニウムアジュバントに吸着された炭疽菌の非被包性菌株の無細胞上清液から誘導される。ＰＡは、ＡＶＡにおける腫瘍免疫原である。本発明への使用のために適切な他の典型的な炭疽菌抗原は、保護抗原（ＰＡ又はＰＡ６３）、ＬＦ及びＥＦ（タンパク質）、ポリ−ガンマ−（Ｄ−グルタミン酸）カプセル、胞子抗原（内生胞子特異的成分）、ＢｃｌＡ（外膜特異的タンパク質）、ＢｘｐＢ（胞子関連タンパク質）及び分泌されたタンパク質を包含する。炭疽菌由来の１又は２以上の抗原性部分又はエピトープと共に免疫応答を誘発できるすべての炭疽菌抗原が、現在、特徴づけられているか、否かにかかわらず、企画される。
野兎病抗原
多くの野兎病抗原は、ワクチン開発のための有能な候補体として同定されており、そして本発明において有用である。例えば、ＡｃｐＡ及びＩｇｌＣは、ワクチン開発のために適切な抗原である。本発明への使用のために適切な他の典型的な野兎病抗原は、Ｏ−抗原、ＣＰＳ、外膜タンパク質（例えば、ＦｏｐＡ）、リポタンパク質（例えば、Ｔｕｌ４）、分泌されたタンパク質及びリポ多糖を包含する。野兎病抗原由来の１又は２以上の抗原部分又はエピトープと共に、免疫応答を誘発できるすべての野兎病抗原が、現在、特徴づけられているか、否かにかかわらず、企画される。
ブルセラ症抗原
多くのＢ．アボルタス（Ｂ．Ａｂｏｒｔｕｓｉｓ）抗原は、ワクチン開発のための有能な候補体として同定されており、そして本発明において有用である。例えばＯｍｐ１６は、ワクチン開発のための１つのそのような抗原である。本発明での使用のために適切な他の典型的なブルセラ症抗原は、Ｏ−抗原、リポ多糖、外膜タンパク質（例えば、Ｏｍｐ１６）、分泌されたタンパク質、リボソームタンパク質（例えば、Ｌ７及びＬ１２）、バクテリオフェリチン、ｐ３９（推定上のペリプラズム結合タンパク質）、ｇｒｏＥＬ（ヒートショックタンパク質）、ルマジンシンターゼ、ＢＣＳＰ３１表面タンパク質、ＰＡＬ１６．５ＯＭリポタンパク質、カラターゼ、２６ｋＤａのペリプラズムタンパク質、３１ｋＤａのＯｍｐ３１、２８ｋＤａのＯｍｐ、２５ｋＤａのＯｍｐ、及び１０ｋＤａのＯｍリポタンパク質を包含する。ブルセラ症抗原由来の１又は２以上の抗原部分又はエピトープと共に、免疫応答を誘発できるすべてのブルセラ症抗原が、現在、特徴づけられているか、否かにかかわらず、企画される。
髄膜炎抗原
多くの髄膜炎（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）抗原は、ワクチン開発のための有能な候補体として同定されており、そして本発明において有用である。例えば、Ｃｙｓ６、ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＦｅｔＡ及びＺｎｕＤは、ワクチン開発のために適切な抗原である。本発明への使用のために適切な他の典型的な髄膜炎抗原は、Ｏ−抗原、Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）、ＴｂｐＢ、ＮｓｐＡ、ＮａｄＡ、外膜タンパク質、グループＢ ＣＰＳ、分泌されたタンパク質及びリポ多糖を包含する。髄膜炎抗原由来の１又は２以上の抗原部分又はエピトープと共に、免疫応答を誘発できるすべての髄膜炎抗原が、現在、特徴づけられているか、否かにかかわらず、企画される。
デング熱抗原
多くのフラビウィルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）抗原は、デング熱を治療するためのワクチン開発のための有能な候補体として同定されており、そして本発明において有用である。例えば、デングウィルスエンベロープタンパク質Ｅ１−Ｅ４及び膜タンパク質Ｍ１−Ｍ４は、ワクチン開発のために適切な抗原である。本発明への使用のために適切な他の典型的なデング熱抗原は、Ｃ、ｐｒｅＭ、１、２Ａ、２Ｂ、３、４Ａ、４Ｂ及び５を包含する。デング熱抗原由来の１又は２以上の抗原部分又はエピトープと共に、免疫応答を誘発できるすべてのデング熱抗原が、現在、特徴づけられているか、否かにかかわらず、企画される。
エボラ高原
多くのエボラウィルス抗原は、エボラ感染を治療するためのワクチン開発のための有能な候補体として同定されており、そして本発明において有用である。例えば、それぞれフィロウィルス（Ｆｉｌｏｃｉｒｉｄａｅ）ザイールエボラウィルス及びスーダンエボラウィルスビリオンスパイク糖前駆体抗原ＺＥＢＯＶ−ＧＰ及びＳＥＢＵＶ−ＧＰが、ワクチン開発のために適切である。本発明への使用のために適切な他の典型的なエボラ抗原は、ＮＰ、ｖｐ３５、ｖｐ４０、ＧＰ、ｖｐ３０、ｖｐ２４及びＬを包含する。エボラ抗原由来の１又は２以上の抗原部分又はエピトープと共に、免疫応答を誘発できるすべてのエボラ抗原が、現在、特徴づけられているか、否かにかかわらず、企画される。
西ナイル高原
多くの西ナイルウィルス抗原が、感染を治療するためへのワクチン開発のための有能な候補体として同定されており、そして本発明において有用である。例えば西ナイルウィルス（ＷＮＶ）からのフラビウィルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）エンベロープ抗原（Ｅ）は、ＷＮＶビリオン（ＷＮＶＥ）の表面上に発現される非毒性タンパク質であり、そしてワクチン開発のために適切である。本発明への使用のために適切な他の手系的なＷＮＶ抗原は、Ｃｐ、Ｐｒｍ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５を包含する。
西ナイル抗原由来の１又は２以上の抗原部分又はエピトープと共に、免疫応答を誘発できるすべての西ナイル抗原が、現在、特徴づけられているか、否かにかかわらず、企画される。
上記に列挙されるか又は参照される抗原は、本発明を限定するものではなく、例示的なものである。
本発明はまた、有効量の本発明のペプチド接合体、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物、及び医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物にも関する。
本発明はまた、有効量の本発明のペプチド、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物、及び医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物にも関する。
本発明は、有効量の本発明の複数のペプチド、本発明の複数のペプチド接合体、又は本発明の１以上のペプチド、及び本発明の１又は２以上のペプチド接合体を、組合して含むことができる。
用語「医薬的に許容できる担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」とは、本発明のペプチド又はペプチド接合体、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物、及び医薬的に許容できる担体と共に、対象に投与され得る担体（アジュバント又はビークル）を意味する。
組成物に使用され得る医薬的に許容できる担体は、次のものを包含するが、但しそれらだけには制限されない：イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化薬物送達システム（ＳＥＤＤＳ）、例えばｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００スクスネート、医薬投薬形に使用される界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎｓ又は他の類似のポリマー送達マトリックス、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩及び電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂。シクロデキストリン、例えばα−、β−及びγ−シクロデキストリン、又は化学的に変性された誘導体、例えばヒドロキシアルキルシクロデキストリン、例えば２−及び３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、又は他の溶解された誘導体もまた、送達を増強するために有利に使用され得る。油溶液又は懸濁液はまた、医薬的に許容できる投与形、例えばエマルジョン及び／又は懸濁液の配合において通常使用される、長鎖アルコール希釈剤又は分散剤、又はカルボキシメチルセルロース又は類似する分散剤を含むことができる。
組成物は、何れかの選択された経路、例えば経口又は非経路（局所、皮下、筋肉内及び静脈内を包含する）投与（但し、それらだけには制限されない）による、対象への投与のために製剤化され得る。
例えば、組成物は、意図される投与経路及び標準的な薬務を考慮して選択される適切な医薬的に許容できる担体（例えば、賦形剤、希釈剤、助剤、及びそれらの組合せ）と共に配合され得る。例えば、組成物は、粉末、液体、錠剤又はカプセルとして経口的に、又は軟膏、クリーム又はローションとして局所的に投与され得る。適切な製剤は、必要なら、追加の剤、例えば乳化剤、酸化防止剤、香料又は着色剤を含むことができ、そして即時−、遅延−、変性、持続−、パルス−又は制御−放出のために適合され得る。
組成物は、生物学的利用能、免疫原性を最適化するか、又は免疫原性又は治療範囲内に、例えば拡張された期間、血漿、血液又は組織濃度を維持するために製剤化され得る。制御された放出製剤はまた、例えば作用の部位で抗原濃度を最適化するために使用され得る。
組成物は、例えば、継続的な暴露を提供するために、定期的な投与のために製剤化され得る。有益な免疫学的応答を誘発するための手段、例えば１又は２以上の「ブースター」ワクチン接種を用いる手段は、当業界において良く知られており、そしてその手段が採択される。
組成物は、非経口路を介して投与され得る。非経口投与形の例としては、活性剤又は他の良く知っている医薬的に許容できる賦形剤の水溶液、等張食塩水又は５％グルコースを挙げることができる。シクロデキストリン、例えば、又は当業者に周知の他の可溶化剤が、治療剤の送達のための医薬賦形剤として利用され得る。
経口投与のために適切な投与形の例は、治療的有効量の組成物を提供できる、錠剤、カプセル、トローチ剤、又は同様の形、又は任意の液体形、例えばシロップ、水溶液、エマルジョン及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。カプセルは、任意の標準の医薬的に許容できる材料、例えばゼラチン又はセルロースを含むことができる。錠剤は、活性成分と、固形担体及び滑剤との混合物を圧縮することにより、従来の手順に従って配合され得る。固形担体の例は、澱粉及び砂糖ベントナイトを包含する。活性成分はまた、結合剤、例えばラクトース又はマンニトール、従来の充填剤及び錠剤化剤を含む、ハードシェル錠剤、又はカプルの形で投与され得る。
経皮投与のために適切な投与形の例は、経皮用バッチ、経皮用バンデージ、及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
組成物の局所投与のために適切な投与形の例は、皮膚に直接的に適用されるか、又は媒介性パッド、パッチ又は同様のものを介して適用されるかどうかにかかわらず、任意のローション、スティック、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ゲル、等を包含する。
組成物の座薬投与に適した投与の例は、身体腔中に挿入される任意の固形投与形、特に直腸、膣及び尿道に挿入されるそれらの投与形を包含する。
組成物の注射のために適した投与形の例は、ボーラスを介してこの送達、例えば静脈内注射、皮下、真皮下及び筋肉内投与による単一又は複数回投与、又は経口投与を包含する。
組成物のデポ投与のために適した投与の例は、ペプチド又はペプチド接合体のペレット、又はペプチド又はペプチド接合体が生分解性のポリマーのマトリックス、マイクロエマルジョン、リポソームに取り込まれるか、又はマイクロカプセル化されている固体形を包含する。
組成物のための注入装置の例は、所望する回数の用量又は定常状態投与を提供するための注入ポンプを包含し、そして移植可能な薬物ポンプも包含する。
組成物のための移植可能注入装置の例は、任意の固体形を包含し、ここでペプチド又はペプチド接合体が生分解性ポリマー又は合成ポリマー、例えばシリコーン、シリコーンゴム、シラスティック又は類似ポリマー内にカップセル化されるか又はそれら全体に分散されている。
組成物の経粘膜送達のために適した投与形の例は、浣腸剤、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、ファームのための沈殿溶液（ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、ネブライザー溶液、粉末、及び活性成分の他に、適切であることが周知であるそのような担体を含む類似する製剤を包含する。そのような投与形は、医薬的に許容できる、水性又は有機溶媒中、溶液及び／又は懸濁液、又はその混合物及び／又は粉末を含む組成物の吸入又はガス注入のために適切な形を包含する。組成物の経粘膜投与は、任意の粘膜を利用するが、しかし通常、鼻、頬、膣及び直腸組織を利用する。組成物の経鼻投与に適した製剤は、液体形、例えば鼻スプレー、点鼻薬の形で、又はポリマー粒子の水性又は油状溶液を含むネブライザーによるエアロゾル投与により投与され得る。製剤は、例えば生理食塩中、水溶液、すなわちベンジルアルコール又は他の適切な保存剤、生理学的利用能を増強するための吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／又は当業界において知られている他の可溶化剤又は分散剤を用いる溶液として調製され得る。
組成物の口腔又は舌下投与のために適した投与形の例は、トローチ剤、錠剤及び同様のものを包含する。組成物の眼への投与のために適した投与形の例は、医薬的に許容できる、水性又は有機溶媒中、溶液及び／又は懸濁液を含む、挿入体及び／又は組成物を包含する。
組成物の製剤、例えばワクチンの例は、例えば、Ｓｗｅｅｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．（Ｅｄ．）．Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ．Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｄｒｕｇ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，３３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ，２００２，２４８３ ｐｐ．；Ａｕｌｔｏｎ，Ｍ．Ｅ．（Ｅｄ．）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍ Ｄｅｓｉｇｎ．Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，２０００，７３４ ｐｐ．；及びＡｎｓｅｌ，Ｈ．Ｃ．，Ａｌｌｅｎ，Ｌ．Ｖ．ａｎｄ Ｐｏｐｏｖｉｃｈ，Ｎ．Ｇ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ １９９９，６７６ ｐｐ．に見出され得る。薬物送達システムの製造に使用される賦形剤は、当業者に知られている種々の出版物、例えばＫｉｂｂｅ，Ｅ．Ｈ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，２０００，６６５ ｐｐ．に記載されている。米国薬局方は、調節された放出経口投与形、例えば錠剤又はカプセルとして製剤化されたそれらの形の例を提供する。例えば、持続放出及び遅延放出錠剤及びカプセルの薬物放出能力を決定するための特定の試験をまた記載する、Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ ２３／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ １８，Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ，１９９５（この後、「ＵＳＰ」と称する）を参照のこと。持続放出及び遅延放出物品についての薬物放出についてのＵＳＰ試験は、試験の経過時間に対する投与単位からの薬物溶解に基づかれる。種々の試験装置及び手順の説明は、ＵＳＰに見出され得る。持続放出投与形の分析に関する、さらなる手引きは、Ｆ．Ｄ．Ａにより提供されて来た（産業界についてのガイダンスを参照のこと。持続放出経口投与形：インビトロ／インビボ相関関係の開発、評価及び適用。Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ：Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，１９９７）。
組成物は、１又は２以上の外因性アジュバントを含むことができるが、好都合には、いくつかの実施形態によれば、これは必要ではない。いくつかの実施形態によれば、ペプチド接合体はエピトープを含み、そして自己アジュバントである。
本発明は、有効量の本発明のペプチド接合体又はペプチドを、対象に投与することを含んで成る、対象にワクチン接種するか、又は対象における免疫応答を誘発する方法を提供する。本発明はまた、対象にワクチン接種するか、又は対象における免疫応答を誘発するためへの、本発明のペプチド接合体又はペプチドの使用、及び対象にワクチン接種するか、又は対象における免疫応答を誘発するための薬剤の製造への、本発明のペプチド接合体又はペプチドの使用にも関する。
本発明はまた、有効量の本発明の医薬組成物を、対象に投与することを含んで成る、対象にワクチン接種するか、又は対象における免疫応答を誘発する方法を提供する。本発明はまた、対象にワクチン接種するか、又は対象における免疫応答を誘発するためへの、本発明の医薬組成物の使用、及び対象にワクチン接種するか、又は対象における免疫応答を誘発するための薬剤の製造への、１又は２以上の本発明のペプチド、及び１又は２以上の本発明のペプチド接合体の使用にも関する。
本発明はまた、有効量の本発明のペプチドを、対象に投与することを含んで成る、対象における免疫応答を誘発する方法を提供する。本発明はまた、対象における免疫応答を誘発するためへの、本発明の接合体の使用、及び対象における免疫応答を誘発するための薬剤の製造への、本発明のペプチド接合体の使用にも関する。
本発明はまた、有効量の本発明のペプチドを、対象に投与することを含んで成る、対象にワクチン接種する方法を提供する。本発明はまた、対象における免疫応答を誘発するためへの、本発明の接合体の使用、及び対象における免疫応答を誘発するための薬剤の製造への、本発明のペプチド接合体の使用にも関する。
１又は２以上の本発明のペプチド及び／又は１又は２以上の本発明のペプチド接合体、例えば１又は２以上のペプチド、及び１又は２以上のペプチド接合体の、対象にワクチン接種するか、又は対象における免疫応答を誘発するためへの投与又は使用が、本明細書において企画される。
複数のペプチド、複数のペプチド接合体、又は１又は２以上のペプチド、及び１又は２以上のペプチド接合体が投与されるか、又は使用される場合、前記複数のペプチド、複数のペプチド接合体、又は１又は２以上のペプチド及び１又は２以上のペプチド接合体は、同時に、連続的に又は別々に、投与されるか又は使用され得る。
「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」とは、哺乳類、例えばヒトである脊椎動物を意味する。哺乳類は、ヒト、家畜、スポーツ用動物、ペット、霊長類、マウス及びラットを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」とは、臨床学的結果を包含する有益な又は所望する結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、種々の投与経路により、１又は２回以上の投与で投与され得る。
有効量は、他の要因の中で、示される疾患、疾患お重症度、対象の年齢及び相対的健康状態、投与される化合物の効力、投与の様式及び所望される治療に依存して、変化するであろう。当業者は、それらの何れか他の適切な要因を考慮して、適切な投与量を決定することができるであろう。
組成物の効力は、インビトロ及びインビボの両者で評価され得る。例えば、組成物は、細胞介在性免疫応答を誘発するその能力について、インビトロ又はインビボで試験され得る。インビボ研究に関しては、組成物が、動物（例えば、マウス）に供給されるか、又は注入され、そして次に、免疫応答の誘発に対するその効果が評価される。その結果に基づいて、適切な用量範囲及び投与経路が決定され得る。
組成物は、単回投与又は複数回投与スケジュールとして投与され得る。複数回投与は、一次免疫化スケジュール及び／又はブースター免疫化スケジュールに使用され得る。
特定の実施形態によれば、免疫応答の誘発は、免疫応答を高めるか、又は増強することを包含する。典型的な実施形態によれば、免疫応答の誘発は、体液性及び細胞介在性応答の誘発を包含する。
特定の実施形態によれば、免疫応答の誘発は、免疫性を提供する。
免疫応答は、疾患又は病状を治療するために誘発される。当業者は、本明細書に記載されるペプチド及びペプチド接合体が、例えばエピトープの性質に依存して、種々の疾患及び病状を治療するために有用であることを理解するであろう。
いくつかの実施形態によれば、疾患又は病状は、本明細書に記載される種々の抗原に関連するそれらから選択される。
いくつかの実施形態によれば、骨髄移植後、又は何れか他の理由のために深遠な免疫抑制の誘発後、感染性疾患、癌又はウィルス再活性化が治療されるか又は予防される。
用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」及び関連する用語、例えば「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」とは、本明細書において使用される場合、いくらかの所望する治療効果が達成される、ヒト又は非ヒト対象の治療を、一般的に意味する。例えば、治療効果は、疾患又は病状の阻害、低滅、改善、停止又は予防であり得る。
組成物は、全身性及び／又は粘膜免疫性を誘発するために使用され得る。増強された全身性及び／又は粘膜免疫性は、増強されたＴＨ１及び／又はＴＨ２免疫応答に反映され得る。増強された免疫応答は、ＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ２ａ及び／又はＩｇＡの産生の増加を包含することができる。
実施例１．接合体２００、２０、２２及び２６の調製
１．１ 一般的な詳細
市販の出発材料を、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ａｊａｘ Ｆｉｎｅｃｈｅｍ， Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ，ＣＥＭ，ＧＬ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｍｅｒｃｋ，ＮＯＶＡ Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ａｎｄ ＴＣＩから購入し、そして供給されるように使用した。乾燥された溶媒を、Ｎ２又はアルゴン雰囲気下での蒸留を通して調製した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を、新たに、ナトリウム／ベンゾフェノンケチル上で蒸留した。メタノール（ＭｅＯＨ）及びトルエンを、新たに、水素化カルシウム上で蒸留した。収率は、特にことわらない限り、クロマトグラフィー的に及び分光学的に（１Ｈ ＮＭＲ）、均質の材料に対して参照する。
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）処理を、Ｍｅｒｃｋ ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ Ｆ２５４ ２００μｍシリカプレート上で行った。紫外線を、可視化剤として、及び塩基性水溶液中、過マンガン酸カリウム及びエタノール溶液中、バニリンの一般的現像剤として使用した。使用される特定の現像剤は、一次アミノの同定のための酸とニンヒドリンのエタノール溶液であった。加熱は、何れかの現像剤を用いる場合、適用された。シリカゲル（０．０６３−０．１００ｍｍ）を、フラッシュカラムクロマトグラフィーのために使用した。
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、１Ｈ核用の４００ＭＨｚで及び１３Ｃ核用の１００ＭＨｚで作用するＢｒｕｋｅｒ ＤＲＸ４００分光計上でＣＤＣｌ３又はＤ２Ｏ中、室温で取得された。１Ｈ及び１３Ｃスペクトルについての参照ピークを、それぞれ、ＣＤＣｌ３についてδ０．００及びδ７７．０及びＤ２Ｏ中、１Ｈスペクトルについてδ４．７９に設定した。ＮＭＲデータを、δスケールに基づいてパートパーミリオン（ｐｐｍ）として化学シフトの値で、及びヘルツ（Ｈｚ）でカップリング定数を報告した。多重度は、次のように報告した：ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｄｄ＝ダブレットのダブレット、ｄｔ＝トリプレットのダブレット、ｔｔ＝トリプレットのトリプレット、ｄｑ＝カルテットのダブレット、ｄｑｎ＝クインテットのダブレット、ｓｘ＝セクステット、ｂｒ ｓ＝ブロードシングレット、及びｍ＝マルチプレット。Ｃｑの割り当てを用いて、四級炭素を示した。
高分解能質量スペクトルを、５０００の公称解像度でＢｒｕｋｅｒ ｍｉｃｒｏＯＴＯＦ−ＱＩＩ質量分光計上で得た。分析用高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び液体クロマトグラフィーの質分析（ＬＣ−ＭＳ）クロマトグラムは、Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ＭＳＱ Ｐｌｕｓ 質量分光計を備えたＤｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステム、又はＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｓｅｒｉｅｓ １１００ ＭＳＤ質量分光計を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１２０ Ｃｏｍｐａｃｔ ＬＣシステムの何れか上で取得される。分析用逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣを、ＭｅＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ溶媒システムを用いて実施した。せみ分取ＲＰ ＨＰＬＣを、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ溶媒システムを用いて、Ｄｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステム上で行った。マイクロ波反応を、ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ自動マイクロ波システムを用いて実施した。
１．２ ペプチド鎖伸長のための一般的方法
手動合成方法
膨潤されたペプチド−樹脂を、ＤＭＦ（５．０ｍｌ）中、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンにより処理し、そして室温で２０分間、振盪した。溶液を排水し、そして樹脂を、ＤＮＦ（×２）及びＤＣＭ（×２）により洗浄した。ＤＭＦ（１ｍｌ）中、Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ（２．０等量）、ＨＢＴＵ（２．０当量）及びｉＰｒ２ＮＥｔ（４．０当量）のカップリング混合物を添加し、そして樹脂を１時間、振盪した。樹脂を排出し、そして再び洗浄した。この手順を、配列における残る残基について反復した。
自動合成方法（標準、０．２ｍモル規模）
ペプチド−樹脂を、Ｔｒｉｂｕｔｅ自動ペプチド合成機の反応容器に移した。自動合成を、Ｆｍｏｃ保護解除及びＦｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨカップリング段階のサイクルで実施した。保護解除を、ＤＭＦ（６．０ｍｌ）中、２０％ｖ／ｖピペリジンの添加、及び攪拌（２×７分）により実施した。樹脂排水及びＤＭＦ洗浄（４ｍｌ×３）に続いて、カップリング工程を、ＨＢＴＵ（０．２４ｍＭ、ＤＭＦ中、４ｍｌ）に溶解された５当量のＦｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨにより実施した。ＤＭＦ（４ｍｌ）中、２ＭのＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）を、塩基付加工程に利用した。カップリングは、１時間、進行した。ＤＭＦ洗浄工程に続いて、保護解除及びカップリングの次のサイクルを開始し、すべてのアミノ酸がカップリングされるまで、反復した。
システイン誘導体のカップリング手段（０．１ｍモル規模）
ペプチド−樹脂を、１：１のＣＨ２Ｃｌ２：ＤＭＦにおいて３０分間、膨潤し、次に排水した。Ｃｙｓアミノ酸（０．２ｍモル、２当量）、ＢＯＰ（０．４ｍモル、４当量）及びＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（０．４ｍモル、４当量）のカップリング混合物を、１：１のＣＨ２Ｃｌ２：ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解した。次に、２，４，６−コリジン（０．４ｍモル、４当量）を添加し、そして得られる溶液を、ペプチド−樹脂に添加した。樹脂を、１時間、又はニンヒドリン試験が遊離アミンが無いことを示すまで、攪拌した。次に、樹脂を排水し、ＤＭＦ（２×）及びＣＨ２Ｃｌ２（２×）により洗浄し、そして乾燥した。
ニンヒドリン試験手順
樹脂のごく一部を採取し、ＣＨ２Ｃｌ２により洗浄し、そして、乾燥した。各１滴のＥｔＯＨ中、５％ｖ／ｖニンヒドリン溶液、ＥｔＯＨ中、８０％ｗ／ｖフェノール溶液及びピリジン中、２％ｖ／ｖＫＣＮ溶液を、樹脂に添加し、そしてその混合物を、９０℃で２分間、加熱した。青く着色されたビース及び溶液が遊離一次アミンの存在を示すが、ところが黄色は遊離アミノ基が存在しないことを示す。
１．３ アミノ酸接合体２００の調製
Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−［Ｒ］−システイン
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（１．０ｇ、１．７ｍモル）を、ＣＨ２Ｃｌ２（５０％）に溶解した。ＴＦＡ（１．５ｍｌ、１９．６ｍモル）及びｉＰｒ３ＳｉＨ（０．７５ｍｌ）を添加し、溶液の黄色への変化を引起した。溶液を、室温で２時間、攪拌し、この点で、溶液は、無色に変化した。混合物を、Ｎａ２ＣＯ３・Ｈ２Ｏの添加により、ｐＨ９に塩基性にし、そしてＥｔＯＡｃにより洗浄した。溶液を、１０ＭのＨＣｌにより酸性化し、ＥｔＯＡにより抽出し、そして真空下で濃縮し、白色粉末及びピング色の残渣を得た。粉末及び残渣を、４：１のＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏに溶解し、そして凍結乾燥し、粗ピング−白色粉末（４２％ｍｇ、粗収率７３．１％）を得た。この粗生成物を、下記チオール−エン反応に提供した。
（Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（（２−（パルミトイルオキシ）エチル）チオ）プロパン酸（２００）
熱開始（Ｌｉ，Ｊ．Ｄｏｎｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｓ ａｎ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｆｕｌｌｙ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｄ Ｆｕｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ（１−１４１）．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１２，５１（４９），１２２６３−１２２６７）
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ（１００ｍｇ、０．２９ｍモル）、ビニルパルミテート（４７６μｌ、１．５ｍモル）及びＡＩＢＮ（９．６ｍｇ、５９μモル）を、脱気された１．２−ジクロロメタン（３ｍｌ）に溶解した。次に、反応混合物を、還流（９０℃）下で２４時間、加熱、その後、ＴＬＣは、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨの完全な消費を示した。次に、溶液を、室温に冷却した。溶媒を、減圧下で除去した。粗反応混合物における所望の生成物２００の存在を、質量分光計により確かめた。
ＭＳ（ＥＳＩ−）：Ｃ３６Ｈ５１ＮＯ６Ｓ−について、［Ｍ−Ｈ］−ｍ／ｚ 計算値６２５．９６ 実測値６２６．０。
光−開始
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ（１００ｍｇ、０．２９ｍモル）を、脱気された無水ＤＭＦ（５００μｌ）に溶解した。ビニルパルミテート（９０μｌ、０．３ｍモル）及びＤＭＰＡ（５．０ｍｇ、２０μモル）を、脱気されたＣＨ２Ｃｌ２（２００μｌ）に溶解した。２種の溶液を組合し、そして得られる混合物を、標準の光化学装置において６時間（３６５ｎｍのＵＶ）照射した。反応混合物におけるさらなる変化がＴＬＣにより観察されない場合、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（３：１のＥｔＯＡ：ｎ−ヘキサン＋２％ＡｃＯＨ）により精製し、続いて、１：１のＨ２Ｏ：ＭｅＣＨ＋０．１％ＴＦＡから凍結乾燥し、標記化化合物を、粉末状の白色固形物（２４ｍｇ、１３％）として得た。所望する生成物２００の構造を、質量分光計により確かめた。
ＭＳ（ＥＳＩ−）：Ｃ３６Ｈ５１ＮＯ６Ｓ−について、［Ｍ−Ｈ］−ｍ／ｚ 計算値６２５．９６ 実測値６２６．０。
１．４ ペプチド接合体の調製
ペプチド
ＡｃＮ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−ＯＨ２５［配列番号２１］
１：１のＣＨ２Ｃｌ２：ＤＭＦにおいて前もって膨潤されたアミノメチルポリスチレン（ＰＳ）樹脂（０．２０ｇ、１．０ｍモル／ｇの負荷、０．２ｍモルの規模）に、ＤＭＦ（３ｍｌ）中、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ−Ｏ−ＣＨ２−ｐｈｉ−ＯＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ（１５５．２ｍｇ、０．３ｍモル）、ＨＢＴＵ（１１３．８ｍｇ、０．３ｍモル）及びｉＰｒ２ＮＥｔ（１０４μｌ、０．６ｍモル）のカップリング混合物を添加した。樹脂を、室温で２時間、振盪し、その後、ニンヒドリン試験は、完全なカップリングを示した。次に、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌアミノ基を、ＤＭＦ（５ｍｌ）中、２０％ｖ／ｖピペリジンによる樹脂の室温での２０分間の処理により保護解除した。樹脂を、Ｔｒｉｂｕｔｅ自動ペプチド合成機に移した。Ｓｅｒ残基まで（それを含む）の鎖延長を、一般的な自動カップリング方法を用いて行った。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ残基のカップリングを、１：１のＣＨ２Ｃｌ２：ＣＭＦ（２ｍｌ）中、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（２３５ｍｇ、０．４ｍモル）、ＢＯＰ（３６０ｍｇ、０．８ｍモル）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１２０ｍｇ、０．８ｍモル）及び２，４，６−コリジン（１２０μｌ、０，８ｍモル）の混合物の添加により、手動的に実施した。樹脂を、１時間、振盪し、この後、ニンヒドリン試験は、完全なカップリングを示した。最終Ｆｍｏｃ保護解除を、ＤＭＦ（５ｍｌ）中、２０％ｖ／ｖピペリジンにより樹脂を、室温で２０分間、処理することにより達成した。
Ｆｍｏｃ保護解除の後、Ｎ−アセチル化を、樹脂に、ＤＭＦ（３ｍｌ）中、無水酢酸（５０μｌ）及びｉＰｒ２ＮＥｔ（５０μｌ）を添加することにより実施した。次に、樹脂を室温で３０分間、振盪し、その後、ニンヒドリン試験は、遊離アミンが残存しないことを示した。樹脂を排出し、ＤＭＦ及びＣＨ２Ｃｌ２により洗浄し、そして空気乾燥した。ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＤＯＤＴ：ｉＰｒ３ＳｉＨ（９４：２．５：２．５：１％ｖ／ｖ、１０．０ｍＬ）の切断カクテルを、乾燥樹脂に添加し、そしてその混合物を、室温で４時間、振盪した。次に、切断カクテルを、冷ジエチルエーテルにより処理し、粗ペプチドを沈殿し、これを、４０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。上清液を捨てて、そしてペレットを、ジエチルエーテルにより洗浄し、その後、回転工程を反復した。次に、エーテル相を捨て、そしてペプチドを、Ｎ２流下で乾燥した。次に、粗ペプチドを、Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡから凍結乾燥した。粗生成物を、下記に概略されるチオール−エン反応に提供した。
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ７４Ｈ１３４Ｎ２０Ｏ２０Ｓ２ ＋について、［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ計算値１６８８．１１実測値１６８８．８。
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ２［配列番号２２］
１：１のＣＨ２Ｃｌ２：ＤＭＦにおいて前もって膨潤されたアミノメチルポリスチレン（ＰＳ）樹脂（０．２０ｇ、１．０ｍモル／ｇの負荷、０．２ｍモルの規模）に、ＤＭＦ（２ｍｌ）中、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−アミド−ＯＨ（２１６ｍｇ、０．４ｍモル）、ＨＢＴＵ（１５１．８ｍｇ、０．４ｍモル）及びｉＰｒ２ＮＥｔ（１４０μｌ、０．８ｍモル）のカップリング混合物を添加した。樹脂を、室温で１時間、振盪し、その後、ニンヒドリン試験は、完全なカップリングを示した。次にリンカーアミノ基を、ＤＭＦ（４ｍｌ）中、２０％ｖ／ｖピペリジンにより樹脂を、室温で２０分間、処理することにより保護解除した。樹脂を、Ｔｒｉｂｕｔｅ自動ペプチド合成機に移した。Ｓｅｒ残基まで（それを含む）の鎖延長を、一般的な自動カップリング方法を用いて行った。Ｃｙｓ残基のカップリングを、１：１のＣＨ２Ｃｌ２：ＣＭＦ（２ｍｌ）中、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（２３５ｍｇ、０．４ｍモル）、ＢＯＰ（３６０ｍｇ、０．８ｍモル）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１２０ｍｇ、０．８ｍモル）及び２，４，６−コリジン（１２０μｌ、０，８ｍモル）の混合物の添加により、手動的に実施した。樹脂を、１時間、振盪し、この後、ニンヒドリン試験は、完全なカップリングを示した。最終Ｆｍｏｃ保護解除を、ＤＭＦ（５ｍｌ）中、２０％ｖ／ｖピペリジンにより樹脂を、室温で２０分間、処理することにより達成した。樹脂を排出し、ＤＭＦ及びＣＨ２Ｃｌ２により洗浄し、そして空気乾燥した。ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＤＯＤＴ：ｉＰｒ３ＳｉＨ（９４：２．５：２．５：１％ｖ／ｖ、１０．０ｍＬ）の切断カクテルを、乾燥樹脂に添加し、そしてその混合物を、室温で２時間、振盪した。次に、切断カクテルを、冷ジエチルエーテルにより処理し、粗ペプチドを沈殿し、これを、４０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。上清液を捨てて、そしてペレットを、ジエチルエーテルにより洗浄し、その後、回転工程を反復した。次に、エーテル相を捨て、そしてペプチドを、Ｎ２流下で乾燥した。次に、粗ペプチドを、Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡから凍結乾燥した。粗生成物を、下記に概略されるチオール−エン反応に提供した。
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ３０Ｈ６１Ｎ１１Ｏ７Ｓ＋について、［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ計算値７１９．９４実測値７２０．０。
Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ２ ２４［配列番号２２］
１：１のＣＨ２Ｃｌ２：ＤＭＦにおいて前もって膨潤されたアミノメチルポリスチレン（ＰＳ）樹脂（０．２０ｇ、１．０ｍモル／ｇの負荷、０．２ｍモルの規模）に、ＤＭＦ（２ｍｌ）中、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−アミド−ＯＨ（２１６ｍｇ、０．４ｍモル）、ＨＢＴＵ（１５１．８ｍｇ、０．４ｍモル）及びｉＰｒ２ＮＥｔ（１４０μｌ、０．８ｍモル）のカップリング混合物を添加した。樹脂を、室温で１時間、振盪し、その後、ニンヒドリン試験は、完全なカップリングを示した。次にリンカーアミノ基を、ＤＭＦ（４ｍｌ）中、２０％ｖ／ｖピペリジンにより樹脂を、室温で２０分間、処理することにより保護解除した。樹脂を、Ｔｒｉｂｕｔｅ自動ペプチド合成機に移した。Ｓｅｒ（Ｔｒｔ）残基まで（それを含む）の鎖延長を、一般的な自動カップリング方法を用いて行った。Ｃｙｓ残基のカップリングを、１：１のＣＨ２Ｃｌ２：ＣＭＦ（２ｍｌ）中、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（２３５ｍｇ、０．４ｍモル）、ＢＯＰ（３６０ｍｇ、０．８ｍモル）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１２０ｍｇ、０．８ｍモル）及び２，４，６−コリジン（１２０μｌ、０，８ｍモル）の混合物の添加により、手動的に実施した。樹脂を、１時間、振盪し、この後、ニンヒドリン試験は、完全なカップリングを示した。Ｆｍｏｃ保護解除の後、Ｎ−アセチル化を、ＤＭＦ（３ｍｌ）中、無水酢酸（５０μｌ）及びｉＰｒ２ＮＥｔ（５０μｌ）の樹脂への添加により実施した。次に、樹脂を、室温で３０分間、振盪し、その後、ニンヒドリン試験は、遊離アミンが残存していないことを示した。樹脂を排出し、ＤＭＦ及びＣＨ２Ｃｌ２により洗浄し、そして空気乾燥した。ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＤＯＤＴ：ｉＰｒ３ＳｉＨ（９４：２．５：２．５：１％ｖ／ｖ、１０．０ｍＬ）の切断カクテルを、乾燥樹脂に添加し、そしてその混合物を、室温で２時間、振盪した。次に、切断カクテルを、冷ジエチルエーテルにより処理し、粗ペプチドを沈殿し、これを、４０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。上清液を捨てて、そしてペレットを、ジエチルエーテルにより洗浄し、その後、回転工程を反復した。次に、エーテル相を捨て、そしてペプチドを、Ｎ２流下で乾燥した。次に、粗ペプチドを、Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡから凍結乾燥した。粗生成物を、下記に概略されるチオール−エン反応に提供した。
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ３２Ｈ６３Ｎ１１Ｏ８Ｓ＋について、［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ計算値７６１．９８実測値７６２．０。
ペプチド接合体
Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ２ ２４［配列番号２２］のチオール−エン反応産物及びビニルパリミテート ２２のチオール−エン反応生成物
ＮＭＰ（４ｍｌ）の溶液中、粗ペプチド２４（２５ｍｇ、３２．６μモル）及びＤＭＰＡ（３．３ｍｌ、１３．１μモル）に、ビニルパルミテート（５２．９μｌ、０．１６ｍモル）を添加した。得られる混合物を、標準ＵＶ光化学装置を用いて、３６５ｎｍで１時間、攪拌しながら照射した。所望する生成物２２を、貨量分析により検出した。粗生成物２２を、５−６５％ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ（３％、ＭｅＣＮ／分、５０℃）の勾配を実行するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム上で半分取用ＲＰ ＨＰＬＣを介して精製した。質量分析は、所望する生成物２２（５．１ｍｇ、粗から１４．９４％）の構造を確証した。
Ｒｔ＝５−９５ＭｅｃＮ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ（３％ＭｅＣＮ／分の勾配）を用いてのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８ ３μ １１０Å ２．０ｘ５０ｍｍカラム上で１１．４分；ＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ５０Ｈ９７Ｎ１１Ｏ１０Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ計算値１０４４．４実測値１０４４．９。
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ２［配列番号２２］及びビニルパルミテートのチオール−エン反応性生物２０
ＮＭＰ中、粗Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ２、５当量ビニルパルミテート、０．４当量のＤＭＰＡのチオール−エン反応、３６５ｎｍでの１時間の照射、ＭＳ分析により、所望する生成物２０（Ｐａｍ−ＣＳＫ４）を得た。
Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−ＯＨ ２５［配列番号２１］及びビニルパルミテートのチオール−エン反応生成物２６
ＮＭＰ（３ｍｌ）の溶液中、粗ペプチド２５（２０ｍｇ、１１．９μモル）及びＤＭＰＡ（１．２ｍｌ、４．７４μモル）に、ビニルパルミテート（１９．２μｌ、５９．３μモル）を添加した。得られる混合物を、標準ＵＶ光化学装置を用いて、３６５ｎｍで１時間、攪拌しながら照射した。所望する生成物２６を、質量分析により検出した。粗生成物２６を、５−６５％ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ（３％、ＭｅＣＮ／分、５０℃）の勾配を実行するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム上で半分取用ＲＰ ＨＰＬＣを介して精製した。質量分析は、所望する生成物２６及び酸化されたＭｅｔ（Ｏ）副産物（１．６７ｍｇ、粗から７．１５％−Ｍｅｔ（Ｏ）生成物を含む）の構造を確証した。
Ｒｔ＝５−９５ＭｅｃＮ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ（３％ＭｅＣＮ／分の勾配）を用いてのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８ ３μ １１０Å ２．０×５０ｍｍカラム上で１１．４分；ＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ９２Ｈ１６８Ｎ２０Ｏ２Ｓ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ計算値９８５．１実測値９９３．６Ｍｅｔ（Ｏ）。
１．５ ペプチドに対するチオール−エン反応についての一般方法
ＤＭＳＯの溶液中、粗又は精製されたペプチド（１０ｍＭ）のＤＴＴ（３０ｍＭ）及びＤＭＰＡ（４ｍＭ）に、ビニルパルミテート（４０ｍＭ）を添加した。得られる混合物を、標準ＵＶ光化学装置を用いて、３６５ｎｍで１時間、攪拌しながら照射した。所望する生成物を、ＥＳＩ質量分析により検出した。完全な転換を達成するために、ＤＭＰＡ 光開始剤のさらなる添加が時々、必要とされる。粗生成物を、１−６５％ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ（３％、ＭｅＣＮ／分）の勾配を実行するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム上で半分取用ＲＰ ＨＰＬＣを介して精製した。プールされた画分を、凍結乾燥、白色粉末として純粋な生成物を得た。
１．６ 議論
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨと、ビニルパルミテートとの熱反応を、基開始剤として５当量のアルケン及び０．２当量のＡＩＢＮを用いて、１，２−ジクロロエタン下で実施した。
反応を、還流（９０℃）下で２４時間、行った。マイクロ波加熱（１００Ｗ、１時間）は、同じ結果を生成した。所望する生成物を、ＴＬＣにより検出した。多くの副産物がまた、形成された。
反応の光開始を、光開始剤として、１当量のビニルパルミテート及び０．２当量のＤＭＰＡを用いて行った。反応は、脱気されたＤＭＦ：ＤＣＭ溶媒混合物において行われ、標準の光化学装置を用いて、３６５ｎｍのＵＶ光により１時間、照射された。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨのほぼ完全な転換を、ＴＬＣにより観察した。最少の副産物が形成された。精製により、約１５％の収率で生成物２００を得た。２当量のビニルパルミテートの使用により、精製の後、４４％の収率で２００を得た。
チオール−エン反応を、ＮＡｃ−ＣＳＫ４を用いて実施した。必要とされるペプチドモチーフ２４を、上記のようにして合成した。アミノメチル樹脂へのＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅリンカーの結合に続いて、ＳＫ４配列を、自動Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳ（標準カップリング条件）を用いて構築した。次に、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを、エピマー化を低めるための条件を用いて、手動的にカップリングした。次に、Ｎ−アセチル化を行った。
質量分析は、副産物形成が、システインのｔｅｔｔ−ブチル化（＋５６）のために、樹脂からのペプチドの切断に基づいて発生することを示した。Ｆｍｏｃ−Ｓｅｔ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨの代わりに、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｔｒｔ）−ＯＨを用いてのＮＡｃ−ＣＳＫ４の合成の反復が、システイン−アルキル化生成物を有さない生成物をもたらした。ペプチドを切断し、そして次に、凍結乾燥した。
次に、粗ペプチド２４と、ビニルパルミテートとのチオール−エン反応を行った。Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）は、親水性ＣＳＫ４ペプチド及び疎水性ビニルパルミテート分子の両者を効果的に溶媒和した。
ＡＩＢＮ及びマイクロ波加熱を用いての熱開始を、過剰のビニルパルミテート（２０当量までの）を用いて、粗及び精製されたペプチドの両者に対して行った。その反応の光開始は、良好な結果を提供した。光開始剤としてのＤＭＰＡと共に粗ペプチドを用いて、反応は、１時間の照射（２ｍｌのＮＭＰ中、５当量のビニルパルミテート、０．４当量のＤＭＰＡ）に続いて、完了まで進行した。所望する生成物を、ＭＳにより確かめた（９０％以上の転換率、ＨＰＬＣによれば６０％の純度）。
好都合には、切断の後、精製は、チオール−エンカップリングの前、必要とされなかった。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製は典型的には、非効率的であり、５０％以上の材料の損失が通常である。一般的に、可能な限り、必要とされるＨＰＬＣ精製段階の数を減じることが好都合である。
Ｎ−アセチル化されたモノアシルリポペプチド２２の精製を、１分当たり、５−９５％のＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、３％ＭｅＣＮの勾配を実行するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８カラムを用いて、半分取用ＲＰ−ＨＰＬＣにより達成した。次に、精製されたペプチドを、凍結乾燥し、所望する生成物を、白色粉末（５．１ｍｇ、粗ペプチドから１４．９％）として得た。比較的低い収率は、チオール−エン反応における副産物形成のためである。
２５ｍＭのペプチド濃度の上昇は、副産物形成の少々の低下を導いた（９０％以上の転換率、ＨＰＬＣによれば８０％の純度）。５ｍＭへのその濃度の低下は、反対の効果を有した。
５ｍＭのペプチド濃度で、グルタチオン（ＧＳＨ）（３当量）の存在下でのＮＭＰ：Ｈ２Ｏ：ＤＭＳＯ（４：２：１）の混合物における反応の実施は、混合されたジスルフィド形成をもたらした（５０％の転換率、ＨＰＬＣによれば、７５％の純度）。５ｍＭのペプチド濃度で、ＮＭＰ中、２，２７−（エチレンジオキシ）ジエタンチオール（ＤＯＤＴ）（３当量）の使用は、生成物の複雑な混合物を導いた（ＨＰＬＣによれば８０％の転換率）。
好都合には、反応混合物（ＮＭＰ中、１０ｍＭのペプチド）への３当量のＤＴＴの添加後、ビニルパルミテートテロメリゼーションに起因する副産物、又は混合されたジスルフィドは、観察されず、そして反応は、高い転換率に進行した（９０％以上の転換率、ＨＰｌＣによれば８５％の純度）。ＤＴＴを用いて、良性で、より多目的溶媒であるＤＭＳＯにおいて反応（２５ｍＭのペプチド）を行うことがまた可能であった（９０％の転換率、ＨＰＬＣによれば９５％以上の純度）。
チオール−エン反応をまた、アセチル化されていない類似ＣＳＫ４を用いて行った。ＣＳＫ４モチーフの合成を、上記手順を利用して実施した。次に、ペプチドを、樹脂から切断し、そして凍結乾燥した。ビニルパルミテートと、粗生成物とのチオール−エン反応は、ＮＭＰ中、５当量のビニルパルミテート、０．４当量のＤＭＰＡ、３６５ｎｍでのでの１時間の照射、円滑に進行し、ＭＳ分析によれば、所望する生成物２０（Ｐａｍ−ＣＳｋ４）を得た。
サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）ｐｐＵＬ８３タンパク質（「ＮＬＶペプチド」）由来の、免疫優勢Ａ＊０２００制限エピトープ（Ｋｏｐｙｃｉｎｓｋｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ＨＬＡ Ａ＊０２０１ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｐｐＵＬ８３ ＣＤ８ Ｔ−ｃｅｌｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００９，８２（１）９４−１０３）と、ビニルパルミテートとのチオール−エン反応をまた、行った。
ＮＬＶ配列を、標準条件を用いて、自動Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳにより構築した。次に、Ｋ４クダ及びセリン残基を、配列のＮ−末端にカップリングした。次に、ペプチジル残基を、合成機から除き、そしてシステイン残基を、標準条件下で、手動的にカップリングした。次に、ペプチドを、樹脂から切断し、そして凍結乾燥し、良好な収率で白色粉末を得た。
保護されていないペプチド２５及びビニルパルミテートのチオール−エン反応を、ペプチド２０及び２２について記載のようにして、光開始により行った。質量分析は、パルミトイル化された生成物２６への転換を示した。精製を、５−９５％のＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、３％ＭｅＣＮの勾配を実行するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８カラムを用いて、半分取用ＲＰ−ＨＰＬＣにより達成した。精製されたペプチドを凍結乾燥し、白色粉末として所望する生成物（７．５％）を、その対応するＭｅｔ（Ｏ）生成物（約３０％）と共に得た。
粗２５と、ビニルパルミテートとのチオール−エン反応をまた、上記一般的手段に従って行った。ＥＳＩ−ＭＳ及びＨＰＬＣ分析は、パルミトイル化された生成物２６への良好な転換を示した（図２ａ及び２６）。精製を半分取用ＲＰ−ＨＰＬＣにより行い、９６％以上の純度で所望する生成物を得た（図２ｂ及び２ｃ）。
実施例２．ペプチド結合体２０、２２及び２６の生物学的活性
２．１ 手順
全血におけるヒト単球の活性化
１００μｌのヘパリン処理された全血（ＷＢ）を、１００ｎＭ、１μＭ及び１０μＭの各化合物と共に、二重反復してインキュベートし、そして５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーターにおいて３７℃で一晩、インキュベートした。Ｐａｍ３ＣＳＫ４（１０μＭ；ＥＭＣ Ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ）を、正の対照として使用した。単球の活性化を検出するために、ＷＢサンプルを、抗−ＣＤ１４−ＦＩＴＣ、抗−ＨＬＡ−ＤＲ−Ａｌｅｘａ７００、抗−ＣＤ８０−ＰＥ−Ｃｙ７、抗−ＣＤ４０−ＰＥ、抗−ＣＤ８６−ＡＰＣ、抗−ＣＤ１６−ＡＰＣ−Ｃｙ７（すべてはＢｉｏｌｅｇｅｎｄからである）により、ＲＴで２０分間、染色し、光から保護した。インキュベーションに続いて、２ｍｌのＢＤ ＦＡＣＳ溶解物（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し、ＲＴで１５分間インキュベートし、次に、氷冷却された洗浄緩衝液（ＰＢＳ，１％ヒト血清）により、２度、洗浄した。データ収集を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で行い、そしてＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン７．６．５（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて分析した。単球上でのＣＤ８０受容体発現を、ＣＤ１４＋ＨＬＡＤＲ＋細胞上に与えることにより、検出した。
２．２ 議論
リポペプチド２０、２２及び２６の生活性を、フローサイトメトリーにより評価し、新鮮な血液サンプルにおけるヒト単球に対する共刺激分子ＣＤ８０のアップレギュレーションを測定した（図１）。
単球を、特徴的細胞表面マーカーにより、５つのドナーサンプルにおいて同定し、そしてＣＤ８０の発現を、３種の投与量での各化合物への暴露の前及び後、正の対照として作用する市販のＰａｍ３ＣＳＫ４（１０μＭ）により決定した。
２２及び２６の両者は、試験されるすべての用量で、ＣＤ８０の発現を強くアップレギュレートし、このことは、ほとんどのドナーにおいて、１０μＭの用量で、Ｐａｍ３ＣＳＫ４と同等の効力を実証した。
３種のドナーにおいて、２０は、２２及び２６よりも低い効力を示し、ヒト細胞においてＴＬＲアゴニズムの効力を改善するシステインアミノ基のアセチル化と一致する。２６の効力は、抗原性ペプチドの接合がＴＬＲ２アゴニズムに影響を与えないことを実証する。
実施例３．接合体２００、１２０、１２１、１１０−１１２、１１２Ａ及び１１３−１１６の調製
３．１ 一般的詳細
保護されたアミノ酸及びカップリング試薬を、ＧＬ−Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）から購入した。固体支持体合成に使用される樹脂は、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＧｍｂＨ（Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ）からのプリロードされたテンタゲル樹脂であり、そして他の溶媒及び試薬は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）及びＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから入手された。
下記ペプチド合成を、Ｔｒｉｂｕｔｅペプチド合成機（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）上で、標準の反復Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成技法を用いて行った。０．１ｍモルの規模で行われる典型的な保護解除及びカップリングサイクルは、ＤＭＦ中、２０％ピペリジンの２回の処理（４ｍｌ×５分）、次にＤＭＦによる樹脂の洗浄により、樹脂結合アミノ酸からのＦｍｏｃ保護基の除去を、必然的に伴った。別々の容器において、Ｆｍｏｃアミノ酸（０．５ｍモル）及びカップリング剤（１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−とリアゾル［４，５−ｂ］ピリジニウム−３−オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、０．４５ｍモル）を、ＤＭＦ（１．５ｍｌ）に溶解し、そして塩基（４−メチルモルホリン、１ｍモル）を添加した。１分間の混合の後、この溶液を樹脂に移し、これを、ＲＴで１時間、攪拌し、抽出し、そして洗浄した。
ペプチド（０．１ｍモルの規模）の切断を、５％（ｖ／ｖ）エンタジオール（ＥＤＴ）を含む、５ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に、樹脂を懸濁し、そして室温で３時間、攪拌することにより達成した。次に、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）を、１％（ｖ／ｖ）に添加し、そして攪拌を、さらに５分間、続け、その後、冷却されたジエチルエーテル（４０ｍｌ）中にＴＥＡを排出した。沈殿された材料を、遠心分離によりペレット化し、エーテルを捨て、ペレットをエーテル（２５ｍｌ）により１度、洗浄し、そして空気乾燥か又は凍結乾燥した。
逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣを、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステムを用いて実施した。半分取精製のために、ペプチドサンプルを、溶離液Ａ（水／０．１％ＴＦＡ）及び溶離液Ｂ（ＭｅｃＮ／０．１％ＴＦＡ）の適切な混合物において平衡化された逆相Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（５μ、１１０Å；１０×２５０ｍｍ）中に注入し、次に、溶離液Ｂの上昇する勾配を生成し、構成成分を溶出した。分析用ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ（３μ、１１０Å；４．６×１５０ｍｍ）を用いて、同様に実施した。
低分離能質量スペクトルを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ６１２０ Ｑｕａｄｒａｐｏｌｅ質量分析を用いて得た。
ＮＭＲスペクトルを、１Ｈ ＮＭＲについて４００μＨｚで、及び１３Ｃ ＮＨＲについて１００ＭＨｚで作動するＢｒｕｋｅｒ ＢＲＸ４００分光計を用いて得た。
下記アミノ酸接合体及びペプチド接合体においては、略語ＡｃＮ−Ｃ（Ｐａｎ−１）−及びＨ２Ｎ−Ｃ（Ｐａｍ−１）は、下記式：
［式中、Ｒは、必要に応じて、Ａｃ又はＨである］を意味する。
３．２ 直接的接合によるペプチド接合の調製
ペプチド
ペプチド１００、１０２、１０３、１０４、１０５及び１０６（表１）を、下記に記載され、そして示されるようにして合成した（スキーム１）
（ｉ）反復Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳ；（ｉｉ）Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、ＨＡＴＵ、ＮＭＭ、ＤＭＦ；（ｉｉｉ）２０％ピペリジン／ＤＭＦ；（ｉｖ）Ａｃ２Ｏ／ＮＭＭ、ＤＭＦ；（ｖ）ＴＦＡ／ＥＤＴ；（ｖｉ）ビニルパルミテート、ＤＴＴ、ＤＭＰＡ、ＮＭＰ、３６５ｎｍ。
反復Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳを用いての最後から２番目のアミノ酸までのペプチド配列の合成に続いて、Ｆｍｏｃ−システインを、ＤＭＦ中、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、ＨＡＴＵ及び４−メチルモルホリンとの反応により樹脂上のペプチドのＮ−末端残基として導入した。Ｆｍｏｃ基を、ＤＭＦ中、２０％ピペリジンを用いて除去した。必要に応じて、得られるアミン基を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中、２０％無水酢酸及び４−メチルモルホリン（１ｍモル）の混合物による処理により、アセとアミドに転換した。
ＴＦＡ／ＥＤＴによる樹脂からのペプチドの切断及びエーテルにおけるその沈殿に続いて、固形物を、１：１の水／ＭｅＣＮに溶解し、そして凍結乾燥した。ペプチドがメチオニン残基を含む場合、その溶液を、凍結乾燥の前、６０℃で１時間、加熱し、切断の間に生じている何れかのＳ−アルキル化を逆転した。次に、ペプチドを、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、９５％以上の材料を得た。
ペプチド１０２を、この位置での所望しない副反応を回避するのに、ｔｅｒｔ−ブチルチオエーテルとしての非末端システイン残基の側鎖により合成した。
ペプチド接合体
次に、チオール−エン反応を、ペプチド１００及び１０２−１０６に対して実施し、その対応するペプチド接合体１１０、１１２Ａ及び１１３−１１６を生成した（表２）。
ＤＭＰＡ（２．６ｍｇ）、ジチオトレイトール（９．２ｍｇ）及びビニルパルミテート（４０ｍｇ、ｍモル）を、脱気されたＮＭＰ（２ｍｌ）に溶解した。次に、この溶液１００μｌを、小ポリプロピレン容器中に計量された１μモルのペプチドに添加し、１０ｍＭのペプチド、５ｍＭのＤＭＰＡ、３０ｍＭのＤＴＴ及び５０ｍＭのビニルパルミテートを含む溶液を得た。ＮＭＰは反応条件に適合でき、そして反応混合物の全ての成分を効果的に溶媒和した。
反応容器を、窒素によりフラッシュし、そして激しく攪拌された混合物を、３６５ｎｍで作動する手持ちの６ワットランプ（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、ＮＹ）により照射した。３０分後、反応をＨＰＬＣにより分析し、そして所望する生成物への転換を示した。次に、生成物を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより単離し、そして未反応の出発材料を回収した。
１１２Ａの精製に続いて、システインのｔｅｒｔ−ブチル保護基を、トリフリック酸及びトリフルオロ酢酸（１：１６ｖ／ｖ）の混合物による３分間の処理により、除去し、完全に保護解除されたリポペプチド１１２を得た（表２Ａ）。
アセチル化されていないＮ−末端システインを有するペプチドは、還元剤ＤＴＴの存在にもかかわらず、有意な量のジスルフィドダイマーを形成した。これは、その対応するＮ−アセチル化されたペプチドによっては観察されなかった。
ペプチド接合体１１０及び１１３−１１６をまた、次の別の手順により、ペプチド１００及び１０３−１０６から調製した（表２Ｂ）。
この手順によれば、ｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン（ｔＢｕＳＨ）チオールを、ＤＴＴの代わりに使用した。これは、所望するペプチド接合体への基質ペプチドの高められた及び明白な転換をもたらした。
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）をまた、反応混合物に導入した。これはさらに、反応プロフィールを改善した。ビス−パルミトイル化された種を得るために、生成物ペプチド接合体を、ビニルパルミテートの第２分子との反応により形成されるマイナーな副産物のオリゴマーの形成が、ＴＦＡの添加により非常に抑制された。
メチオニンのそれらの条件下でのその対応するスルホキシドに酸化する見かけの傾向のために、メチオニン基を有するそれらのペプチドの粗生成物混合物を、凍結乾燥し、ＴＦＡに溶解し、そしてテトラブチルアンモニウムヨウ化物により処理し、酸化メチオニンを還元し、メチオニンに戻した。
典型的な手順は、次の通りであった。ＤＭＰＡ（６．５ｍｇ）を、脱気されたＮＭＰ（０．５ｍｌ）に溶解し、そしてｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン（１７ｍｌ）を添加し、そして別の容器において、ビニルパルミテート（１１．３ｍｇ）を脱気されたＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）（０．５ｍｌ）に溶解した。ペプチド（１μモル）を、小さな攪拌機を備えた小さなポリプロピレン容器中に計量し、そして１０μｌのＤＭＰＡ／ｔＢｕＳＨ容器、続いて１００μｌのビニルパルミテート溶液を添加し、約１０ｍＭのペプチド、５ｍＭのＤＭＰＡ、３０ｍＭのＤＴＴ及び８０ｍＭのビニルパルミテートの溶液を得た。次に、ＴＦＡ（５．５μｌ）を添加し、５％溶液を得た。反応容器を、窒素によりフラッシュし、そして激しく攪拌された混合物を、３６４ｎｍでの作動する、手持ちの６ワットＵＶランプ（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ＮＹ）により照射した。２０分後、さらにＤＭＰＡ（１０μｌ）及びビニルパルミテート（５０μｌ）を添加し、そして照射を２０分間、続けた。
メチオニンを含むそれらのペプチドのために、水（０．５ｍｌ）及びＭｅＣＮ（０．５ｍｌ）を添加し、そしてその混合物を凍結乾燥した。得られる固形物を、純ＴＦＡ（１５０μｌ）に溶解し、０℃に冷却し、そして２５μのＴＦＡ中、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヨウ化物（３．７ｍｇ、１０μモル）を添加した。１分後、冷却されたジエチルエーテル（０．５ｍｌ）を添加し、還元されたリボペプチドを沈殿し、これを、遠心分離によりペレット化し、そして凍結乾燥した。
反応を、ＨＰＬＣにより分析し、所望する生成物への転換を示し（表２Ｂ）、次に、ＲＰ−ＨＰＬＣにより単離した。
３．３ アミノ酸接合体の調製
アミノ酸接合体２００、１２０及び１２１を、下記に記載され、そして示されているようにして、それぞれＮ−α−Ｆｍｏｃ−、Ｎ−α−アセチル−及びＮ−α−Ｂｏｃ−保護されたシステインから調製した（スキーム２）。
固体Ｎ−α−保護されたシステインを、溶解するか又は懸濁し、示される溶媒において１００ｍｇ／ｍｌの濃度にし（表３）、そしてビニルパルミテート（１．５モル当量）、続いて示される量の開始剤を添加した。光分解条件下で行われる反応のために、溶液をポリプロピレン容器において調製し、ＤＭＰＡを、示されるモル割合で添加し（表３）、そして次に、攪拌された混合物を、３６４ｎｍで照射した。熱条件下で行われる反応のために、溶液をガラス管において調製し、示される量のＡＩＢＮ（アゾビスイソブチロニトリル）を添加し、そして攪拌された混合物を、油浴又はマイクロ波オーブンの何れかにおいて加熱した。
反応の進行を、薄層クロマトグラフィーを用いてモニターし、そしてシステイン開始材料の消費に基づいて完結まで進行せしめた。次に、溶媒を除去し、そして残渣を、ヘキサン／酢酸エチル混合物により溶出する、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｐａｍ−１）−ＯＨ（２００）、Ａｃ−Ｃｙｓ（Ｐａｍ−１）−ＯＨ（１２０）及びＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｐａｍ−１）−ＯＨ（１２１）のアイデンティティを、１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲ、及び質量分析により確かめた。
Ｎ―Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｐａｍ−１）−ＯＨ（２００）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．７６（ｄ，Ｊ ７．６１Ｈｚ，２Ｈ），７．６０（ｂｒ ｓ，Ｊ ６．８０Ｈｚ，２Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ ７．５０Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｄｔ，Ｊ１ ０．７７ Ｊ２ ７．５０Ｈｚ，２Ｈ），６．９２−６．４２（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），５．７２（ｄ，Ｊ ７．６６Ｈｚ，１Ｈ，ＦｍｏｃＮＨ），４．７０−４．６２（ｍ，１Ｈ），４．４５−４．３８（ｍ，２Ｈ），４．２６−４．１８（ｍ，３Ｈ），３．１４（ｄｄ，Ｊ１ ４．６７ Ｊ２ １３．６６Ｈｚ，１Ｈ），３．０６（ｄｄ，Ｊ１ ５．３６，Ｊ２ １３．８４Ｈｚ，１Ｈ），２．７８（ｔ，Ｊ ６．４０Ｈｚ，２Ｈ），２．２９（ｔ，Ｊ ７．５０Ｈｚ，２Ｈ），１．５９（ｍ，２Ｈ），１．２８−１．２１（ｍ，２４Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ ６．８７Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１７４．１，１７３．９，１５５．９，１４３．６９，１４３．６２，１４３．５，１４１．３，１２７．７，１２７．０，１２５．０，１１９．９，６７．３，６３．０，５３．５，４７．０，３４．３，３４．１，３１．９，３１．２，２９．６７，２９．６４，２９．６０，２９．４，２９．３，２９．２，２９．１，２４．８，２２．６，１４．０；ＨＲＭＳ実測値（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ ６４８．３３２８、Ｃ３６Ｈ５１ＮＯ６ＳＮａ ６４８．３３２９有する。
Ｎ―Ａｃ―Ｃｙｓ（Ｐａｍ−１）−ＯＨ（１２０）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．２１−７．７０（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），６．２９（ｄ，Ｊ ７．５１Ｈｚ，１Ｈ，ＮＨＡｃ），４．７９（ｄｄｄ，Ｊ１ ５．０６ Ｊ２ ５．４９ Ｊ３ ６．９４Ｈｚ，１Ｈ），４．２２（ｔ，Ｊ ６．７２Ｈｚ，１Ｈ），４．２１（ｔ，Ｊ ６．５３Ｈｚ，１Ｈ），３．１２（ｄｄ，Ｊ１ ４．７２ Ｊ２ １４．０８Ｈｚ，１Ｈ），３．０５（ｄｄ，Ｊ１ ５．８０ Ｊ２ １３．９３Ｈｚ，１Ｈ），２．７８（ｔ，Ｊ ６．６０Ｈｚ，１Ｈ），２．７７（ｔ，Ｊ ６．７６ Ｈｚ，１Ｈ），２．３３（ｔ，Ｊ ７．５０Ｈｚ，２Ｈ），２．０９（ｓ，３Ｈ），１．６５−１．５５（ｍ，２Ｈ），１．２７−１．２２（ｓ，２４Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ ６．９２Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１７４．０，１７２．７，１７１．４，６２．９，５２．１，３４．２，３３．８，３１．８，３１．２，２９．６，２９．６３，２９．６０，２９．４，２９．３，２９．２，２９．１，２４．８，２２．８，２２．６，１４．０；ＨＲＭＳ実測値（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ ４６８．２７５０、Ｃ２３Ｈ４３ＮＯ５ＳＮａ ４６８．２７５４を有する。
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｐａｍ−１）−ＯＨ（１２１）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ９．７１−８．８４（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），５．４３−５．３６（ｍ，１Ｈ，ＢｏｃＮＨ），４．６０−４．４９（ｍ，１Ｈ），４．２１（ｔ，Ｊ ６．８０Ｈｚ，２Ｈ），３．１４−２．９３（ｍ，２Ｈ），２．７８（ｔ，Ｊ ６．７３Ｈｚ，２Ｈ），２．３０（ｔ，Ｊ ７．４６Ｈｚ，２Ｈ），１．６４−１．５６（ｍ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ），１．２４（ｓ，２４Ｈ），０．５６（ｔ，Ｊ ６．８２Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１７４．７，１７３．８，１５５．４，６３．１，５３．２，３４．４，３４．２，３１．９，３１．２，２９．６９，２９．６６，２９．６２，２９．４，２９．３，２９．２，２９．１，２８．２，２８．１，２４．９，２２．６，１４．１；ＨＲＭＳ実測値（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ ５２６．３１７６、Ｃ２６Ｈ４９ＮＯ６ＳＮａ ５２６．３１７３を有する。
接合反応を、表３に要約される種々の条件下で実施した。
ａ：ＵＶ照射は３６５ｎｍで作動する手持ちＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ６を用いた；マイクロ波反応を、１００Ｗ及び７０℃で作動するＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒマイクロ波反応機を用いて実施する。ｂ：収率は、マイクロクロマトグラフィー処理の後、単離された材料に基づかれる。ｃ：この時間の後、不完全な収率は、残留Ｆｍｏｃ−システイン基質に基づかれる。
表３から見られ得るように、光分解性条件の使用は、システイン基質のＮ−保護基及び光開始剤の相対的濃度にかかわらず、比較的一定の収率を有する所望する生成物を生成した。
開始剤としてのＡＩＢＮを用いる熱条件下で、収率は相当に変化した。Ｎ−アセチル化された基質は、所望する生成物１２０（エントリー９）の卓越した収率をもたらした。マイクロ波加熱の使用は、特に効果的であり、アセチル化された生成物１２０（エントリー７）の定量的収率及びＢｏｃ生成物１２１（エントリー１０）の高い収率を付与した。
３．４ アミノ酸接合体のカップリングを介してのペプチド接合体の調製
ペプチド接合体１１０−１１６（表４）を、下記に記載され、そして示されるようにして調製した（スキーム３）。
（ｉ）反復Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳ；（ｉｉ）Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｐａｍ−１）−ＯＨ（２００）、ＰｙＢＯＰ、コリジン、ＤＭＦ；（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｃｙｓ（Ｐａｍ−１）−ＯＨ（１２０）又はＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｐａｍ−１）−ＯＨ（１２１）、ＰｙＢＯＰ、コリジン、ＤＭＦ；（ｉｖ）２０％ピペリジン／ＤＭＦ；（ｖ）Ａｃ２Ｏ／ＮＭＭ、ＤＭＦ；（ｖｉ）ＴＦＡ／ＥＤＴ。
所望するペプチド配列を、前に記載されたように、Ｔｒｉｂｕｔｅペプチド合成機を用いる標準の反復Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳ技法を用いて合成した。最後から２番目のアミノ酸残基のカップリングの後、樹脂結合ペプチド鎖を、ＤＭＦ中、ＰｙＢＯＰ及びコリジンを用いて、アミノ酸接合体Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｐａｍ−１）−ＯＨ２００により誘導体化した。次に、ＤＭＦ中、２０％ピペリジンを用いて除去した。
次に、得られるペプチドを、保護基の付随する除去を伴って、ＴＦＡ／ＥＤＴを用いて、樹脂から切断し、ペプチド接合体１１１、１１３及び１１５を得た。
他方では、得られるペプチドを、ＤＭＦ（２ｍｌ）中、２０％無水酢酸及び４−メチルモルホリン（１ｍモル）の混合物による処理により、その対応するアセとアミドに転換し、そして次に、樹脂から切断し、ペプチド接合体を得た。
他方では、樹脂結合ペプチドを、アミノ酸接合体Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｐａｍ−１）−ＯＨ １２１又はＮ−Ａｃ−Ｃｙｓ（Ｐａｍ−１）−ＯＨ １２０の何れかにより誘導体化した。樹脂からの切断に基づいて、ペプチド接合体１１０−１１６を、Ｆｍｏｃ基に関して必要な追加の操作もなしに、直接的に得た。
アミノ酸接合体のカップリングのための条件は、活性化に基づいてのアミノ酸のα−炭素のラセミ化する傾向を低めた。アミノ酸接合体（０．０７５ｍモル）及びＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）（０．１ｍモル）を組合し、そしてＤＭＦ（０．３ｍｌ）に溶解した。純２，４，６−トリメチルピリジン（０．１ｍモル）を添加し、そして３０秒の混合の後、溶液を、０．０２５ｍモルの樹脂に移し、次に、９０分間、攪拌し、排出し、そして洗浄した（ＤＭＦ）。
次にペプチドを、５％（ｖ／ｖ）エタンジチオールを含むトリフルオロ酢酸１ｍｌにおいて、０．０１５ｍモルの樹脂を、室温で３時間、攪拌することにより切断した。次に、上清液を、冷却されたジエチルエーテル（１０ｍｌ）中にシンターを通して排出し、そして樹脂を、さらなる１ｍｌのＴＦＡにより洗浄し、これを、エーテルにまた添加した。
沈殿された材料を、遠心分離によりペレット化し、そしてペレットを、エーテル（５ｍｌ）により１度、洗浄し、その後、１：１のＭｅＣＮ／水（＋０．１％ｔｆａ）に溶解し、そして凍結乾燥した。ペプチドがメチオニン残基を含む場合、溶液を、凍結乾燥の前、６０℃で１時間、加熱した。次に、ペプチドを、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し（９５％以上）、そしてそれらのアイデンティティを、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ及び質量分析により確かめた。
実施例４．１０．ペプチド及びペプチド接合体の生物学的活性
これらの実施例は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による、種々の抗原性ペプチドコンストラクトの種々のＴ細胞クローンへのプロセッシング及び提示を支持することへの本発明のペプチド及びペプチド接合体の効力の評価を記載する。
材料
次の例に使用されるペプチド及びペプチド接合体コンストラクトが、下記表５に概略されている。
一般方法
Ｔ細胞クローンの維持
ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞を、グルタマックス、ペニシリン／ストレプトマイシン及び ５％ ｖ／ｖヒト血清（「ＲＳ５」、すべての試薬はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅからである）により補充されたＲＰＭＩ１６４０において、１−３×１０６／ｍｌの濃度で維持した。培地を、週２度、５０％ｖ／ｖ、リフレッシュした。ＣＤ４＋ Ｔ細胞クローンのためのＲＳ５を、ＩＬ−７及びＩＬ−２１により補充し、そしてＣＤ８＋ Ｔ細胞のためのＲＳ５を、ＩＬ−７＋ＩＬ−１５により補充した（ＰｅｐｒＴｅｃｈからの全てのサイトカイン、５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用された）。
リンパ芽球様細胞系（「ＬＣＬ」）の生成及び維持
エプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）−産生Ｂ９５−８ＭＭ細胞を、Ｔ７５フラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、グルタマックス、ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％ｖ／ｖウシ胎仔血清（“「ＲＦ１０」、すべての試薬はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅからである）により補充されたＲＰＭＩ１６４０中で増殖した。ＥＢＶ−含有培地を集め、そして遠心分離し、非付着性細胞をペレット化し、そして次に、ＥＢＶ−含有上清液を、フィルター殺菌（０．２２μｍ）した。１０×１０６個のドナー末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｔ２５フラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で、１．５ｍｌのＲＦ１０に懸濁した。２．５ｍｌのＢ９５−８細胞培養物の上清液を、添加し、そして細胞を２時間インキュベートした。次に、５％ｖ／ｖフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、Ｇｉｂｃｏ）を含む１ｍｌの新鮮なＲＦ１０を添加した（１％ｖ／ｖの最終濃度）。フラスコを、Ｂ細胞ＬＣＬの成長について、典型的には４−６週間にわたってモニターし、必要の場合、Ｔ７５フラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。ＬＣＬ系を、凍結保存し、そして作業用ストックを、０．５−１．５×１０６／ｍｌで、ＲＦ１０において維持した。
単球由来の樹状細胞（ＭｏＤＣ）の培養
血液を、インフォームドコンセントを得た健康なドナーから採血した。ＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ （Ａｘｉｓ Ｓｈｉｅｌｄ）を用いて、密度遠心分離により精製した。単球を、単球単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＰＢＭＣから単離し、そしてＭｏＤｃを、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ及び５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４（両者ともＰｅｐｒｏｔｅｃｈからである）により補充されたＲＦ１０においての６日間の培養により生成した。培地を、２日ごとに、５０％ｖ／ｖリフレッシュした。
ＣＤ８＋ Ｔ細胞クローンの活性化アッセイ
ドナーＬＣＬ又はＭｏＤＣ（また、本明細書においては、抗原提示細胞又は「ＡＰＣ」とも言及される）を、ＲＦ１０＋ペプチド／コンストラクトにおいて、所望する濃度でインキュベートした。Ｐａｍ３Ｃｙｓ（Ｐ３Ｃ）及びペプチド成分の両者が存在するが、しかし接合されていないサンプルにおいて、ＬＣＬを、Ｐ３Ｃにより３０分間、前処理し、そして次に、培地を、Ｐ３Ｃ及びペプチドの両者を含むＲＦ１０によりリフレッシュした。未処理のＡＰＣを、ＲＦ１０のみにおいてインキュベートした。ＡＰＣ／コンストラクトインキュベーションを、アッセイの性質、及び処理当たりに必要とされるＡＰＣの数に依存して、９６ウェル（Ｕ底、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又は４８ｗｐ（平底、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において実施した。インキュベーションに続いて、ＡＰＣを、ＲＰＭＩ１６４０により４度、洗浄し、未結合コンストラクト／Ｐ３Ｃを除去した。
フローサイトメトリー検出を可能にするために、ＣＤ８＋ Ｔ細胞クローンを、０．５μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ（登録商標）Ｖｉｏｌｅｔ（「ＣＴＶ」）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、その製造業者のプロトコルに従って、ＡＰＣウェル中への播種の前、前染色するか、又は下記のようにして、同時インキュベーションに従って、抗−ＣＤ８抗体により染色した。
パルスされた／洗浄されたＡＰＣ及びＣＴＶ染色されたＴ細胞クローンを、９６ウェルプレート（Ｕ底）に、４：１の比率で、二重反復して播種した（使用される細胞の典型的な数は、１．２５×１０４個の細胞／ｍｌ Ｔ細胞及び５×１０４個の細胞／ｍｌ ＡＰＣ）。播種に続いて、ＡＰＣ／Ｔ細胞プレートを、軽く遠心分離し（３００ｘｇ以下、３分）、即時の相互作用を可能にし、そして標準の細胞培養インキュベーターにおいて２６時間、インキュベートした。
Ｔ細胞活性化を検出するために、サンプルを、５０μｌの合計体積の洗浄緩衝液（ＰＣＳ／ＦＣＳ（１％ｖ／ｖ））において、下記表６に示される抗体（細胞がＣＴＶにより前染色されていない場合のみ使用される抗−ＣＤ８）により染色した。
サンプルを、暗室において３０分間、氷上でインキュベートし、そして次に、洗浄緩衝液により２度洗浄し、未結合抗体を除去した。ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌの最終濃度）を、生／死の除外を可能にするために、取得の直前、各サンプルに添加した。
データの取得を、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアと共にＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩを用いて行い、そしてデータ分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトフェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を用いて行った。データは、ＣＤ１３７発現について陽性の生存クローン細胞の平均％±ＳＤとして提示された。
ＣＤ４＋ Ｔ細胞クローンお活性化アッセイ
全てのＡＰＣパルス／洗浄／播種；Ｔ細胞クローンＣＴＶ染色；及びＡＰＣ／Ｔ細胞同時インキュベーション設定手順を、上記「ＣＤ８＋ Ｔ細胞クローンの活性化アッセイ」について記載されるようにして、実施した。
Ｔ細胞活性化を検出するために、サンプルを、５０μｌの合計体積の洗浄緩衝液（ＰＣＳ／ＦＣＳ（１％ｖ／ｖ））において、下記表７に示される抗体（細胞がＣＴＶにより前染色されていない場合のみ使用される抗−ＣＤ４）により染色した。
サンプルを、暗室において３０分間、氷上でインキュベートし、そして次に、洗浄緩衝液により２度洗浄し、未結合抗体を除去した。ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌの最終濃度）を、生／死の除外を可能にするために、取得の直前、各サンプルに添加した。
データの取得を、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアと共にＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩを用いて行い、そしてデータ分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトフェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を用いて行った。データは、生存クローン細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３４発現のメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）＋ＳＤとして提供された。
実施例４
これらの実施例は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による、種々の抗原性ペプチドコンストラクトの種々のＴ細胞クローンへのプロセッシング及び提示を支持することへの本発明のペプチド及びペプチド接合体の効力の評価を記載する。
材料
この実施例に使用されるＣＤ８＋ Ｔ細胞クローン（クローン４Ｄ９）により認識されるペプチドエピトープ、ｐ４９５−５０３が下記に太字でコンストラクト配列内に示されている：
１４２：Ａｃ−Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ−ＮＬＶＰＭＶＡＴＶＫ（Ａｃ）−ＮＨ２［配列番号２７］
１３１：Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ−ＮＬＶＰＭＶＡＴＶＫ（Ａｃ）−ＮＨ２［配列番号２７］
１１０：Ｐａｍ１Ｃｙｓ（Ａｃ）−ＳＫＫＫＫ−ＮＬＶＰＭＶＡＴＶＫ（Ａｃ）−ＮＨ２［配列番号２７］
ＭｏＤＣ調製及びＣＤ８＋ Ｔ細胞クローン活性化アッセイは、下記方法に記載のようにして行われた。
結果
図３に示されるように、Ｔ脂肪活性化を、１０μＭでのすべてのペプチドコンストラクトについて検出したが、しかし１００ｎＭではペプチドコンストラクト１３１及び１１０について検出した。
両濃度で、コンストラクト１３１及び１１０は、コンストラクト１４２よりも高いＴ細胞活性化を誘発した。それらの結果は、本発明の方法を用いて、ＴＬＲ−アゴニストに接合される場合、このエピトープの提示を維持し、そして多分、そのエピトープの提示を改善する、本発明のペプチド接合体の効力を指示する。
実施例５
この実施例は、自系ＬＣＬにより、及び同種異系ＨＬＡ−Ａ２＋ＨＬＡ−ＤＰ４＋ＭｏＤＣにより、ＣＤ８＋ Ｔ細胞クローンへのＮＹ−ＥＳＯ−１１５３−１８０コンストラクトのプロセッシング及び提示を支持することにおいての本発明のペプチド及びペプチド接合体の効力の評価を記載する。
材料
この実施例に使用されるＣＤ８＋ Ｔ細胞クローン（クローン２Ｆ２）により認識されるペプチドエピトープ、ｐ１５７−１６５が下記に太字でコンストラクト配列内に示されている：
１４３：ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ−ＯＨ［配列番号１８］
１４４：ＳＫＫＫＫ−ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ−ＯＨ［配列番号１７］
１１２：Ｐａｍ１Ｃｙｓ（Ａｃ）−ＳＫＫＫＫ−ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ−ＯＨ［配列番号２４］
１１１：Ｐａｍ１Ｃｙｓ（ＮＨ２）−ＳＫＫＫＫ−ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ−ＯＨ［配列番号２４］
１３２：Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ−ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ−ＯＨ［配列番号２４］
ＬＣＬ／ＭｏＤＣ調製及びＣＤ８＋ Ｔ細胞クローン活性化アッセイは、実施例４に記載のような方法を用いて行われた。
結果
１００％Ｔ細胞活性化が、ＬＣＬを用いて、１０μＭですべてのコンストラクト（＋／−Ｐ３Ｃ）により誘発された（図４を参照のこと）。５０−１００％Ｔ細胞活性化が、コンストラクト１４３及び１４４（＋／−外因性Ｐ３Ｃ）を用いて、１００ｎＭで観察された。ペプチドコンストラクト１４３のみが、１００ｎＭで１００％のＴ細胞活性化を誘発し、このことは、Ｎ−末端ＳＫＫＫＫモチーフの存在が、エピトープｐ１５７−１５６の損なわれたプロセッシングを有することを示唆する。ペプチドコンストラクト１１２、１１１及び１３２が、１００ｎＭで２０％以下のＴ細胞活性化を誘発し、このことは、ＴＬＲアゴニスト接合がＣＤ８＋ Ｔ細胞へのｐ１５７−１６５エピトープの提示を可能にしたけれども、それはエピトープのプロセッシング及び提示を改善しなかったことを示唆する。
図５に示されるように、Ｔ細胞活性化はまた、ＭｏＤＣが、ＡＰＣとして使用される場合、検出でき、１０ｎＭで５５−９５％のレベルに達した。
実施例６
この実施例は、自系ＬＣＬにより、及び同種異系ＨＬＡ−Ａ２＋ＨＬＡ−ＤＰ４＋ＭｏＤＣにより、ＣＤ４＋ Ｔ細胞クローンへのＮＹ−ＥＳＯ−１１５３−１８０抗原性ペプチドコンストラクトのプロセッシング及び提示を支持することにおいての本発明のペプチド及びペプチド接合体の効力の評価を記載する。
材料
この実施例に使用されるＣＤ４＋ Ｔ細胞クローン１Ｂ７及び１Ｃ１１により認識されるペプチドエピトープ、ｐ１５７−１７０が下記に太字でコンストラクト配列内に示されている。
１４３：ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ−ＯＨ［配列番号１８］
１４４：ＳＫＫＫＫ−ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ−ＯＨ［配列番号１７］
１１２：Ｐａｍ１Ｃｙｓ（Ａｃ）−ＳＫＫＫＫ−ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ−ＯＨ［配列番号２４］
１１１：Ｐａｍ１Ｃｙｓ（ＮＨ２）−ＳＫＫＫＫ−ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ−ＯＨ［配列番号２４］
１３２：Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ−ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ−ＯＨ［配列番号２４］
ＬＣＬ／ＭｏＤＣ調製及びＣＤ４＋ Ｔ細胞クローン活性化アッセイは、実施例４に記載のような方法を用いて行われた。
結果
図６−８に見られ得るように、Ｔ細胞活性化（未処理のバックグラウンドに対するＣＤ２５発現の上昇により決定される場合）は、ＬＣＬ（クローン１Ｂ７のみ、図６）又はＭｏＤＣ（クローン１Ｂ７、図７及びクローン１ｃ１１、図８）が使用される場合、１０μＭ及び１００ｎＭの両者で、全てのコンストラクトについて検出できた。各図７及び８に比較して、図６の比較により示されるように、自系ＬＣＬは、同種異系ＭｏＤＣよりも高レベルのＣＤ２５アップレギュレーションを誘発するように見えた。
ＴＬＲアゴニスト接合は、このエピトープ（ｐ１５７−１７０）のための遊離ペプチドに比較される場合、ＭＨＣクラスＩＩに対する同等のエピトーププロセッシング及び提示を提供した。それらの結果は、本発明の方法を用いてＴＬＲアゴニストとの接合が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞への抗原プロセッシング及び提示を維持することを確認する。
図４−８の組合わされた結果は、本発明の方法を用いてのＴＬＲアゴニストとの接合が、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ヒトＴ細胞の両者へのペプチド抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１１５３−１８０内のエピトープのプロセッシング及び提示を保持することを示している。
実施例７
この実施例は、自系ＬＣＬにより、ＣＤ８＋ Ｔ細胞クローンへのＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１１６コンストラクトのプロセッシング及び提示を支持することにおいての本発明のペプチド及びペプチド接合体の効力の評価を記載する。
材料
この実施例に使用されるＣＤ８＋ Ｔ細胞クローン１Ｄ７により認識されるペプチドエピトープ、ｐ９２−１００が下記に太字でコンストラクト配列内に示されている：
１４５：ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ−ＯＨ［配列番号５］
１１４：Ｐａｍ１Ｃｙｓ（Ａｃ）−ＳＫＫＫＫ−ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ−ＯＨ［配列番号２５］
１１３：Ｐａｍ１Ｃｙｓ（ＮＨ２）−ＳＫＫＫＫ−ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ−ＯＨ［配列番号２５］
この実施例において使用されるＣＤ８＋ Ｔ細胞クローン１Ｆ１０により認識されるペプチドエピトープ、ｐ９６−１０４が、下記太字でコンストラクト配列内に示される：
１４５：ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ−ＯＨ［配列番号５］
１１４：Ｐａｍ１Ｃｙｓ（Ａｃ）−ＳＫＫＫＫ−ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ−ＯＨ［配列番号２５］
１１３：Ｐａｍ１Ｃｙｓ（ＮＨ２）−ＳＫＫＫＫ−ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ−ＯＨ［配列番号２５］
ＬＣＬ調製及びＤＣ８＋ Ｔ細胞活性化アッセイを、実施例４の方法に記載されるようにして、実施した。１００ｎＭの最少ペプチドエピトープによりパルスされたＬＣＬは、正の対照として作用した（データは示されていない）。
結果
クローン１Ｄ７（ｐ９２−１００）は、試験されるすべての濃度で、すべてのコンストラクトに応答した（図９を参照のこと）。ペプチドコンストラクト１１４及び１１３に対する応答は、一致した濃度で、特に１μＭ／１００ｎＭで、ペプチドコンストラクト１４５＋／−Ｐ３Ｃによる応答よりもやや劣っていた。
クローン１Ｆ１０（ｐ９６−１０４）は、試験されるすべての濃度で、すべてのコンストラクトに応答した（図１０を参照のこと）。ペプチドコンストラクト１１４及び１１３に対する応答は、一致した濃度で、特に１０μＭで、ペプチドコンストラクト１４５＋／−Ｐ３Ｃによる応答と同等か、又はそれよりもわずかに良好であった（ＣＤ１３７ＭＦＩにおける上昇により最良に実証された；データは示されていない）。
それらの結果は、本発明の方法を用いてのＴＬＲアゴニストとの接合の後、ペプチドＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１１６が、２種の異なったエピトープ（ｐ９２−１００及びｐ９６−１０４）を認識する２種の異なったＣＤ８＋Ｔ細胞系にプロセッシングされ、そして提示されるその能力を保持することを確立する。
実施例８
この実施例は、自系ＬＣＬにより、ＣＤ８＋ Ｔ細胞クローンへのＮＹ−ＥＳＯ−１１１８−１４３コンストラクトのプロセッシング及び提示を支持することにおいての本発明のペプチド及びペプチド接合体の効力の評価を記載する。
材料
この実施例に使用されるＣＤ８＋ Ｔ細胞クローン１Ｃ１１により認識されるペプチドエピトープ、ｐ１２５−１３３が下記に太字でコンストラクト配列内に示されている：
１４７：ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ−ＯＨ［配列番号１２］
１１６：Ｐａｍ１Ｃｙｓ（Ａｃ）−ＳＫＫＫＫ−ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ−ＯＨ［配列番号２６］
１１５：Ｐａｍ１Ｃｙｓ（ＮＨ２）−ＳＫＫＫＫ−ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ−ＯＨ［配列番号２６］
ＬＣＬ調製及びＤＣ８＋ Ｔ細胞活性化アッセイを、実施例４の方法に記載されるようにして、実施した。１μＭのＮＹ−ＥＳＯ−１１２１−１３８によりパルスされたＬＣＬは、正の対照として作用した（データは示されていない）。
結果
図１１に示されるように、９５％以上のＴ細胞活性化が、１０μＭでのすべてのコンストラクト（＋／−９３Ｃ）により誘発された。１μＭで、ペプチドコンストラクト１４７（＋／−外因性Ｐ３Ｃ）によるＴ細胞活性化がそれぞれ、７５％／６０％に低下したが、しかしペプチドコンストラクト１１６及び１１５に関して、９０％以上で推移した。１００ｎＭで、ペプチドコンストラクト１４７については、全くないか又はごくわずかなＴ細胞活性化が観察され、ところがペプチドコンストラクト１１６及び１１５は、それぞれ、３０％以上及び２０％、誘発した。
Ｔ細胞活性化の誘発でのペプチドコンストラクト１１６及び１１５の優位性は、ＴＬＲアゴニストへの接合がこのエピトープ（ｐ１２５−１３３）のプロセッシング及び提示を改善することを示唆する。
実施例９
この実施例は、自系ＬＣＬにより、ＣＤ４＋ Ｔ細胞クローン１Ｅ４及び１Ｄ６へのＮＹ−ＥＳＯ−１１１８−１４３コンストラクトのプロセッシング及び提示を支持することにおいての本発明のペプチド及びペプチド接合体の効力の評価を記載する。
材料
この実施例に使用されるペプチドコンストラクトが、下記に示される：
１４７：ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ−ＯＨ［配列番号１２］
１１６：Ｐａｍ１Ｃｙｓ（Ａｃ）−ＳＫＫＫＫ−ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ−ＯＨ［配列番号２６］
１１５：Ｐａｍ１Ｃｙｓ（ＮＨ２）−ＳＫＫＫＫ−ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ−ＯＨ［配列番号２６］
この実施例に使用されるＣＤ４＋クローン１Ｅ４により認識される推定上のペプチドエピトープｐ１２７−１３８が、下記に太字でコンストラクト配列内に示される：
１４７：ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ−ＯＨ［配列番号１２］
１１６：Ｐａｍ１Ｃｙｓ（Ａｃ）−ＳＫＫＫＫ−ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ−ＯＨ［配列番号２６］
１１５：Ｐａｍ１Ｃｙｓ（ＮＨ２）−ＳＫＫＫＫ−ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ−ＯＨ［配列番号２６］
この実施例に使用されるＣＤ４＋クローン１Ｄ６により認識される推定上のペプチドエピトープｐ１２１−１３２が、下記に太字でコンストラクト配列内に示される：
１４７：ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ−ＯＨ［配列番号１２］
１１６：Ｐａｍ１Ｃｙｓ（Ａｃ）−ＳＫＫＫＫ−ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ−ＯＨ［配列番号２６］
１１５：Ｐａｍ１Ｃｙｓ（ＮＨ２）−ＳＫＫＫＫ−ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ−ＯＨ［配列番号２６］
ＬＣＬ調製及びＤＣ４＋ Ｔ細胞活性化アッセイを、実施例４の方法に記載されるようにして、実施した。１μＭのＮＹ−ＥＳＯ−１１２１−１３８によりパルスされたＬＣＬは、正の対照として作用した（データは示されていない）。
結果
クローン１Ｅ４は、図１２に明白にみられるように、試験されるすべての濃度で、すべてのコンストラクト（＋／−外因性Ｐ３Ｃ）に対して応答した。それらの結果は、ｐ１１８−１４３からこのクローンのための同族エピトープのプロセッシングが効果的であり、そしてＴＬＲアゴニスト連結に依存しないか、又はそれにより影響されないことを示唆する。
図１３に示されるように、クローン１Ｄ６は、ｐ１２１−１３８によりパルスされたＬＣＬに対して良好に応答するが（データは、示されていない）、しかしペプチドコンストラクト１４７（ｐ１１８−１４３）＋／−Ｐ３Ｃに対しては応答せず、このことは、その同族エピトープのプロセッシングにおける障害を示唆する。これは、ＴＬＲアゴニスト接合の不在下で、Ｎ−末端ＶＰＧ又はＣ−末端ＴＡＡＤＨＲの何れかの存在のためであることが提案されている。このプロセッシング欠陥は、トランスでの同時ＴＬＲ連結により救済されない。
しかしながら、クローン１Ｄ６は、滴定方式で、ペプチドコンストラクト１１６及び１１５（１１６は、１１５よりも高い応答を誘発する）に対して応答する（図１３を参照のこと）。これは、ＴＬＲアゴニストへの接合を介して後期エンドソーム／リソソーム経路へのペプチド成分の効果的標的化が、接合されていないペプチドコンストラクト１４７に関して観察されるプロセッシングブロックを軽減することを示唆する。何れかの理論にも束縛されることは望まないが、出願人は、これが後期エンドソーム又はリソソーム特異的プロテアーゼ又はプロセッシング経路への暴露により、少なくとも部分的であり得ることを提案している。
実施例１０
この実施例は、本発明のペプチドコンストラクトによりＴＬＲアルゴニストを調査する。
方法
ＴＬＲアッセイを、前述の実施例に記載されるコンストラクトを用いて、以下に説明するようにして、実施した。
Ｈｅｋｂｌｕｅ細胞を用いてのＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）アゴニスト
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（登録商標）−ｈＴＬＲ２及びＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（登録商標）−ｍＴＬＲ２を、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから購入した。それらのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞を、レポーター遺伝子ＳＥＡＰ（分泌された胚性アルカリホスファターゼ）、及びそれぞれ、ヒト又はネズミＴＬＲ２の何れかの同時−トランスフェクションにより生成した。ＳＥＡＰレポーター遺伝子は、５種のＡＰ−１及び５種のＮＦｋＢ結合部位に融合されたＩＦＮ−Ｂ最小プロモーターの制御下にある。細胞を、製造業者の説明書に従って培養した。アッセイの日、コンストラクトを、９６ウェルプレートにおいて、２０μｌの体積のエンドドキシンを含まない水に、示される濃度で添加した。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（登録商標）−ｈＴＬＲ２ 及びＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（登録商標）−ｍＴＬＲ２細胞を、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（登録商標）検出培地において、役２．８３×１０４個の細胞／ｍｌで再懸濁し、そしてすぐに、１８０ｍｌの細胞懸濁液（ウィル当たり約５×１０４個の細胞）を添加した。細胞を、５％ＣＯ２下で３７℃で一晩インキュベートした。ＳＥＡＰ発現を、６３５ｎＭで、Ｅｎｓｐｉｅｒプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて定量化した。
ＴＬＲ２−一過性トランスフェクトされたＨｅＫ２９３細胞からのＩＬ−８の検出方法
Ｈｅｋ−２９３細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（培地は、抗生物質により補充されていない）を有する９６ウェルプレートに、ウェル当たり５０μｌで３×１０４個の細胞をプレートした。細胞を、ｐＦＬＡＧ−ＴＬＲ２プラスミド及びｐｃＤＮＡ３．１（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．，Ｙ．Ｋｉｄａ ａｎｄ Ｋ．Ｋｕｗａｎｏ（２００５）．”Ａ ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｅｄ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ ｔｈｒｏｕｇｈ ＴＬＲ１，ＴＬＲ２，ａｎｄ ＴＬＲ６．”Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７５（７）：４６４１−４６４６に報告されるように、Ｓｈｉｍｉｚｕからの寄贈である）の組み合わせ、又は対照プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１）の何れかによりトランスフェクトした。リポフェクタミン／ＤＮＡ複合体のマスター混合物を、サンプル当たり５０μｌの体積で、０．３μｌのリポフェクタミン中、１００ｎｇのＤＮＡでＯｐｔｉ−ＭＥＭにおいて構成した。２０分間のインキュベーションに続いて、プラスミド混合物を、細胞に添加した。タンパク質発現を、コンストラクトの添加の前、２４時間、誘発した。
コンストラクトを、示される濃度でウェルに添加し、ウェル当たり２００μｌの最終体積にした。１８時間の刺激に続いて、上清液を、各サンプルから収穫し、そして必要とされるまで、−２０℃で貯蔵した。ＩＬ−８分泌を、次のわずか１つの修飾を伴って、サイトメトリービーズアレイ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））により、その製造業者のプロトコルに従って決定した：ならし培地２５μｌを、５０μｌの代わりに使用した。分泌されたＩＬ−８の濃度を正確に決定するために、１１−点標準曲線（１−５０００ｎｇ／ｍｌ）を実施した。サンプルを、ＢＤ−ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析し、そしてデータを、ＦＣＡＰ ＡＲＲＡＹソフトウエア及び（バージョン１．０．１）を用いて分析した。
結果
図１４及び１５に示されるように、試験されたすべてのコンストラクトは、ＨｅｋＢｌｕｅ（登録商標）（図１４）及びＩＬ−８（図１５）レポーターシステムにおいて、ＴＬＲアルゴニストを実証した。ＴＬＲアゴニストは、滴定可能であり、そして試験された両濃度で、バックグラウンド以上に検出できた。
両アッセイシステムにおいて、Ｐａｍ１Ｃ（Ａｃ）コンストラクトは、一致したＰａｍ１Ｃ（ＮＨ２）コンストラクトよりも強い応答を誘発した。
上記実施例に本発明の範囲を制限する意図はありません。当業者により理解されるように、多くの変形が、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。

Claims (93)

  1. アミノ酸−又はペプチド接合体の製造方法であって、
    脂質含有接合パートナー、及び
    アミノ酸含有接合パートナー、
    を、チオールによる炭素−炭素二重結合のハイドロチオール化により、脂質含有接合パートナーを、アミノ酸含有接合パートナーに接合するのに効果的な条件下で、反応せしめることを含んで成る方法。
  2. 前記アミノ酸含有接合パートナーが、ペプチド含有接合パートナーである、請求項１記載の方法。
  3. 前記アミノ酸含有接合パートナーがエピトープを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. ペプチド接合体を提供するために、アミノ酸又はペプチドに、アミノ酸接合体のアミノ酸をカップリングすることを、さらに含んで成る、請求項１記載の方法。
  5. ペプチドエピトープを含むペプチド接合体を提供するために、アミノ酸又はペプチドに、前記アミノ酸接合体のアミノ酸又は前記ペプチド接合体のアミノ酸をカップリングすることを、さらに含んで成る、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
  6. 前記アミノ酸接合体のアミノ酸又は前記ペプチド接合体のアミノ酸に、エピトープをカップリングすることを、さらに含んで成る、請求項５記載の方法。
  7. 前記エピトープが、ペプチドエピトープである、請求項３、５、及び６の何れか１項に記載の方法。
  8. 前記エピトープが、リンカー基を介してカップリングされるか又は接合される。請求項７記載の方法。
  9. 前記脂質含有接合体が接合される、前記ペプチド接合体のアミノ酸が、Ｎ−末端アミノ酸残基である、請求項４〜８の何れか１項に記載の方法。
  10. 前記アミノ酸含有接合パートナーのアミノ酸が、炭酸−炭素二重接合又はチオールを含む、請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
  11. 前記炭素−炭素二重結合又はチオールを含む前記アミノ酸が、Ｎ−末端アミノ酸残基である、請求項１０記載の方法。
  12. 前記炭素−炭素二重結合を含むアミノ酸のアミノ基が、アシル化される、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 前記アミノ酸接合体のアミノ酸のアミノ基、又は前記脂質含有接合パートナーが接合されているペプチド接合体のアミノ酸残基をアシル化することを、さらに含んで成る、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
  14. 前記アミノ酸含有接合パートナーのアミノ酸が、チオールを含む、請求項１０〜１３の何れか１項に記載の方法。
  15. 前記チオールが、システイン残基のチオールである、請求項１４記載の方法。
  16. 前記システイン残基のアミノ基が、Ｃ２−２０の脂肪酸によりアシル化される、請求項１５記載の方法。
  17. 前記Ｃ２−２０の脂肪酸がアセチルである、請求項１６記載の方法。
  18. 前記ペプチド接合体又はアミノ酸含有接合パートナーが、１又は２以上の可溶化基を含む、請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法。
  19. 前記可溶化基が、ペプチド鎖に複数の連続した親水性アミノ酸残基の配列を含むアミノ酸配列である。請求項１８記載の方法。
  20. 前記ペプチド接合体又はアミノ酸含有接合体パートナーが、脂質含有接合パートナーが接合されるアミノ酸残基に隣接したセリン残基を含む、請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法。
  21. 前記ペプチドが、前記セリン残基に隣接した複数の親水性アミノ酸残基の連続配列をさらに含む、請求項２０記載の方法。
  22. 前記アミノ酸含有接合パートナーの１又は２以上のアミノ酸の１又は２以上の反応性官能基が保護されていない、請求項１〜３、５，７，８及び１０〜２１の何れか１項に記載の方法。
  23. 前記アミノ酸含有接合パートナーが、ペプチドから成る、請求項１〜３、５，７，８及び１０〜２２の何れか１項に記載の方法。
  24. 前記アミノ酸含有接合パートナーが、アミノ酸から成る、請求項１〜４、及び１２〜２１の何れか１項に記載の方法。
  25. 前記アミノ酸のカルボキシル基が、カルボキシル保護基により保護され、そして／又は前記アミノ酸のアミノ基がアミノ保護基により保護される、請求項２４記載の方法。
  26. 前記脂質含有接合パートナーが、少なくとも４又は少なくとも６の鎖−連結された原子をそれぞれ含む、１又は２以上の任意に置換された直鎖状又は分枝状脂肪族又はヘテロ志脂肪鎖を含む、請求項１〜２５の何れか１項に記載の方法。
  27. 前記１又は２以上の鎖が、ヘテロ原子含有官能基により、炭素−炭素二重結合又はチオールを含む部分に共有結合される、請求項２６記載の方法。
  28. 前記脂質含有接合パートナーが、下記式（Ａ１）：
    ［式中、
    Ｚは、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−、及び−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ−から成る群から選択され；
    Ｒは、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり、ここでアルキル又はシクロアルキルは任意に置換され；
    ｍは、０−４の整数であり；
    ｍの各場合でのＲ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ３は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ１−６アルキルであり；
    Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ３はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ１−６アルキルであり；
    Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
    但し：
    Ｒ３がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＣ１−６アルキルである場合、Ｒ１はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルではなく；
    そして
    ｍが２−４の整数である場合、１つだけのＲ１がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；そして
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｌ１及びＬ２に存在する何れかのアルキル、シクロアルキル又はヘテロアルキルが任意に置換されている］で表される化合物、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物である、請求項１〜２７の何れか１項に記載の方法。
  29. 前記脂質含有接合パートナーが、下記式（Ｂ１）：
    ［式中、
    Ｚは、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−、及び−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ−から成る群から選択され；
    Ｒは、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり、ここでアルキル又はシクロアルキルは任意に置換され；
    ｐは、０−４の整数であり；
    ｐの各場合でのＲ１１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ１１は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ１−６アルキルであり；
    Ｒ３３、及びＲ４４は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ３３はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ１−６アルキルであり；
    Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
    但し：
    Ｒ３３がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＣ１−６アルキルである場合、Ｒ１１はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルではなく；
    そして
    ｐが２−４の整数である場合、１つだけのＲ１１がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；そして
    Ｒ１１、Ｒ２２、Ｒ３３、Ｒ４４、Ｌ１及びＬ２に存在する何れかのアルキル、シクロアルキル又はヘテロアルキルが任意に置換されている］で表される化合物、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物である、請求項１〜２７の何れか１項に記載の方法。
  30. 前記アミノ酸又はペプチド接合体が、下記式（Ａ）：
    ［式中、
    Ｚは、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−、及び−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ−から成る群から選択され；
    Ｒは、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり、ここでアルキル又はシクロアルキルは任意に置換され；
    ｍは、０−４の整数であり；
    ｎは、１又は２であり；
    ｍの各場合でのＲ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであるか；又はＲ１は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；
    Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであるか；又はＲ３は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；
    又はＲ９は、アミノ保護基、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；
    ｎの各場合でのＲ６及びＲ７は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、又はＣ３−６シクロアルキルであり；
    Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０ヘテロアルキルであり；
    Ｌ３は、Ｃ１−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
    Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、アミノ鎖又はペプチドであり；又はＡ１はＯＨ又はＯＰ１であり、ここでＰ１はカルボキシル保護基であり；
    但し、
    Ｒ３がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＣ１−６アルキルである場合、Ｒ１はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルではなく；
    そして
    ｍが２−４の整数である場合、１つだけのＲ１がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；そして
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｌ１及びＬ３に存在する何れかのアルキル、シクロアルキル又はヘテロアルキルが任意に置換されている］で表されるコンストラクト、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物を含む、請求項１〜２８の何れか１項に記載の方法。
  31. 前記アミノ酸又はペプチド接合体が、下記式（Ｂ）：
    ［式中、
    Ｚは、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−、及び−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ−から成る群から選択され；
    Ｒは、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり、ここでアルキル又はシクロアルキルは任意に置換され；
    ｐは、０−４の整数であり；
    ｑは、０−２の整数であり；
    ｐの各場合でのＲ１１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ１１は、Ｌ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ１−６アルキルであり；
    Ｒ３３、Ｒ４４、Ｒ５５、Ｒ６６、Ｒ７７、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ３３はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ１−６アルキルであり；
    又はＲ９は、アミノ保護基、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；
    ｑの各場合でのＲａ及びＲｂは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；
    Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
    Ｌ３は、Ｃ１−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
    Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、アミノ酸又はペプチドであり；又はＡ１はＯＨ又はＯＰ１であり、ここでＰ１はカルボキシル保護基であり；
    但し、
    Ｒ３３がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＣ１−６アルキルである場合、Ｒ１１はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルではなく；
    そして
    ｐが２−４の整数である場合、１つだけのＲ１１がＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣ１−６アルキルであり；そして
    Ｒ１１、Ｒ２２、Ｒ３３、Ｒ４４、Ｒ５５、Ｒ６６、Ｒ７７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒａ、Ｒｂ、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３に存在する何れかのアルキル、シクロアルキル又はヘテロアルキルが任意に置換されている］で表されるコンストラクト、又は医薬的に許容されるその塩又は溶媒和物を含む、請求項１〜２７及び２９の何れか１項に記載の方法。
  32. Ｒ９が独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、又はＣ３−６シクロアルキルであり；
    又はＲ９が、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；そして
    Ａ１及びＡ２がそれぞれ独立して、ペプチドであるか；又はＡ１は、ＯＨであり；
    但し、Ｒ９がＡ２でない場合、Ａ１はペプチドである、請求項３０又は３１に記載の方法。
  33. 前記アミノ酸又はペプチド接合体が、下記式（Ｉ）：
    ［式中、ｍ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｌ１及びＡ１は、請求項３０に定義された通りである］で表されるコンストラクト、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物を含み；そして
    前記方法が、下記式（ＩＩ）：
    で表されるコンストラクトを含む脂質含有接合パートナー、及び下記式（ＩＩＩ）：
    で表されるコンストラクトを含むペプチド含有接合パートナーを、式（ＩＩＩ）の化合物におけるチオールによる、式（ＩＩ）の化合物における炭素−炭素二重結合のハイドロチオール化により、式（ＩＩＩ）の化合物により式（ＩＩ）の化合物を接合するのに効果的な条件下で、反応せしめることを含んで成る、請求項１〜２８、３０及び３２の何れか１項に記載の方法。
  34. 前記アミノ酸又はペプチド接合体が、下記式（ＩＡ）：
    ［式中、ｐ、ｑ、Ｒ１１、Ｒ２２、Ｒ３３、Ｒ４４、Ｒ５５、Ｒ６６、Ｒ７７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒａ、Ｒｂ、Ｌ１及びＡ１は、請求項３１に定義される通りである］で表されるコンストラクト、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物を含み；そして
    前記方法が、下記式（ＩＩＡ）：

    で表される化合物、及び下記式（ＩＩＩＡ）：
    で表される化合物を、式（ＩＩＡ）の化合物におけるチオールによる、式（ＩＩＩＡ）の化合物における炭素−炭素二重結合のハイドロチオール化により、式（ＩＩＩＡ）の化合物により式（ＩＩＡ）の化合物を接合するのに効果的な条件下で反応せしめることを含んで成る、請求項１〜２７、２９、３１及び３２の何れか１項に記載の方法。
  35. ｐが、０−２の整数である、請求項２９、３１、３２及び３４の何れか１項に記載の方法。
  36. ｐが０又は１である、請求項３５に記載の方法。
  37. ｐの各場合でのＲ１１及びＲ２２が、それぞれ独立して、水素である、請求項２９、３１、３２及び３４−３６の何れか１項に記載の方法。
  38. Ｒ３３及びＲ４４がそれぞれ水素である、請求項２９、３１、３２及び３４−３７の何れか１項に記載の方法。
  39. ｑが０又は１である、請求項３１、３２及び３４−３８の何れか１項に記載の方法。
  40. Ｒ５５、Ｒ６６及びＲ７７がそれぞれ、水素である、請求項３１、３２及び３４−３９の何れか１項に記載の方法。
  41. ｑの各場合でのＲａ及びＲｂがそれぞれ、水素である、請求項３１、３２及び３４−４０の何れか１項に記載の方法。
  42. ｍが０〜２の整数である、請求項２８、３０、３２及び３３の何れか１項に記載の方法。
  43. ｍが０又は１である、請求項４２に記載の方法。
  44. ｍの各場合でのＲ１及びＲ２がそれぞれ独立して、水素である、請求項２８、３０、３２、３３、４２及び４３の何れか１項に記載の方法。
  45. Ｒ４及びＲ５がそれぞれ、水素である、請求項２８、３０、３２、３３、４２及び４４の何れか１項に記載の方法。
  46. Ｒ６及びＲ７がそれぞれ、水素である、請求項３０、３２、３３及び４２−４５の何れか１項に記載の方法。
  47. 前記式（Ｉ）の化合物が、下記式（ＩＶ）：
    ［式中、
    Ｒ３は、水素又はＬ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ２であり；
    Ｒ９は、水素、アミノ保護基、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；そして
    Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
    Ｌ３は、Ｃ１−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
    Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、アミノ酸又はペプチドであり；又はＡ１はＯＨ又はＯＰ１であり、ここでＰ１はカルボキシル保護基である］で表される化合物、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物。
  48. Ｒ９が、水素、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；そして
    Ａ１及びＡ２がそれぞれ独立して、ペプチドであり；又はＡ１がＯＨであり；
    但し、
    Ｒ９がＡ２でない場合、Ａ１がペプチドである、請求項４７に記載の方法。
  49. Ｌ１がＣ５−２１アルキルである、請求項２８−４８の何れか１項に記載の方法。
  50. Ｌ１が、線状Ｃ１５アルキルである、請求項４９に記載の方法。
  51. Ｌ２がＣ５−２１アルキルである、請求項２８−５０の何れか１項に記載の方法。
  52. Ｒ３が水素である、請求項２８、３０、３２、３３及び４２−５１の何れか１項に記載の方法。
  53. Ｒ９が水素、アミノ保護基又はＬ３−Ｃ（Ｏ）である、請求項３０−５２の何れか１項に記載の方法。
  54. Ｒ９が水素又はアミノ保護基であり、そして前記方法がさらに、Ｒ９での水素又はアミノ保護基を、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）により置換するために、アミノ酸接合体又はペプチド接合体をアシル化することを包含する、請求項３０−５３の何れか１項に記載の方法。
  55. Ｌ３がメチル又は線状Ｃ１５アルキルである、請求項３０−５４の何れか１項に記載の方法。
  56. Ｌ３がメチルである、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記アミノ保護基がＢｏｃ又はＦｍｏｃである、請求項２５−５６の何れか１項に記載の方法。
  58. Ａ１及び／又はＡ２がアミノ酸又はペプチドである、請求項３０−５７の何れか１項に記載の方法。
  59. Ａ１がＯＰ１又はＯＨであり、そしてＲ９が水素、アミノ保護基又はＬ３−Ｃ（Ｏ）である、請求項３０−５７の何れか１項に記載の方法。
  60. 前記方法がさらに、Ａ１及び／又はＲ９を、アミノ酸又はペプチドにより置換するために、アミノ酸又はペプチドをカップリングすることを包含する、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記ペプチドが、エピトープを含む、請求項５８又は６０に記載の方法。
  62. 前記ペプチドが、下記：
    ａ．配列Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３Ｘａａ４ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ［配列番号１］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、Ｘａａ２は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、Ｘａａ３は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、そしてＸａａ４は不在であるか、又は１又は２以上の親水性アミノ酸であり、
    ｂ．配列Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ［配列番号２］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、Ｘａａ２は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、そしてＸａａ３は不在であるか、又は１〜１０個の親水性アミノ酸であり、
    ｃ．配列Ｘａａ１Ｘａａ２ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ［配列番号３］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、そしてＸａａ２は不在であるか、又は１〜４個の親水性アミノ酸であり、
    ｄ．配列ＳＫＫＫＫＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ［配列番号４］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｅ．配列ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ［配列番号５］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｆ．配列ＬＡＭＰＦＡＴＰＭ［配列番号６］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｇ．ＦＡＴＰＭＥＡＥＬ［配列番号７］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｈ．配列Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３Ｘａａ４ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ［配列番号８］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、Ｘａａ２は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、Ｘａａ３は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、そしてＸａａ４は不在であるか、又は１又は２以上の親水性アミノ酸であり、
    ｉ．配列Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ［配列番号９］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、Ｘａａ２は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、そしてＸａａ３は不在であるか、又は１〜１０個の親水性アミノ酸であり、
    ｊ．配列Ｘａａ１Ｘａａ２ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ［配列番号１０］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、そしてＸａａ２は不在であるか、又は１〜４個の親水性アミノ酸であり、
    ｋ．配列ＳＫＫＫＫＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ［配列番号１１］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｌ．配列ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ［配列番号１２］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｍ．配列ＥＦＴＶＳＧＮＩＬ［配列番号１３］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｎ．配列Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３Ｘａａ４ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ［配列番号１４］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、Ｘａａ２は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、Ｘａａ３は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、そしてＸａａ４は不在であるか、又は１又は２以上の親水性アミノ酸であり、
    ｏ．配列Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３２ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ［配列番号１５］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、Ｘａａ２は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、そしてＸａａ３は不在であるか、又は１〜１０個の親水性アミノ酸であり、
    ｐ．配列Ｘａａ１Ｘａａ２２ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ［配列番号１６］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、そしてＸａａ２は不在であるか、又は１〜４個の親水性アミノ酸であり、
    ｑ．配列ＳＫＫＫＫＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ［配列番号１７］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｒ．配列ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ［配列番号１８］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｓ．配列ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ［配列番号１９］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｔ．配列ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ［配列番号２０］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｕ．配列番号１−２０の何れか１つの配列、又は
    ｖ．複数の上記（ａ）〜（ｕ）の組合せ、
    から成る群から選択されたアミノ酸配列を含むか、それらから実質的に成るか、又はそれらから成る、請求項３及び５−６１の何れか１項に記載の方法。
  63. 前記アミノ酸含有接合パートナーに前記脂質含有接合パートナーを接合するのに効果的な条件は、熱開始剤の熱分解、又は光化学開始剤の光化学分解により開始される１又は２以上の遊離基の分解を包含する、請求項１−６２の何れか１項に記載の方法。
  64. 前記熱開始剤がＡ１ＢＮである、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記光開始剤がＤＭＰＡである、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記遊離基開始剤の光化学分解が、約３６４ｎｍの波長を有する紫外線による照射を包含する、請求項６３又は６５に記載の方法。
  67. 前記反応が、溶媒を含む液体媒体下で実施され、ここで前記溶媒がＮＭＰ、ＤＭＳＯ、又はその混合物を包含する、請求項１−６６の何れか１項に記載の方法。
  68. 前記反応が、二量体化、テロメリゼーション又は重合を阻害する１又は２以上の添加剤の存在下で行われる、請求項１−６７の何れか１項に記載の方法。
  69. 前記添加剤が、ＤＴＴ又はｔｅｒｔ−ブチルメルカプタンである、請求項６８に記載の方法。
  70. 請求項１−６９の何れか１項に記載の方法により製造されるアミノ酸又はペプチド接合体。
  71. 下記式（Ｖ）：
    ［式中、
    ｍは、０〜４の整数であり；
    ｎは、１又は２であり；
    ｍの各場合でのＲ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；
    Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ９はアミノ保護基、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；
    ｎの各場合でのＲ６及びＲ７は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；
    Ｌ１は、Ｃ５−２１アルキル又はＣ４−２０へテロアルキルであり；
    Ｌ３は、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；
    Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、アミノ酸又はペプチドであり；又はＡ１はＯＨ又はＯＰ１であり、ここでＰ１はカルボキシル保護基であり；
    ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｌ１及びＬ３の何れかに存在する何れかのアルキル、シクロアルキル又はヘテロアルキルは、任意に置換される］で表される化合物、又は医薬的に許容できるその塩又は溶媒和物。
  72. Ｒ９が独立して、水素、Ｃ１−６アルキル又はＣ３−６シクロアルキルであり；又はＲ９はＬ３−Ｃ（Ｏ）又はＡ２であり；そして
    Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して、ペプチドであり；又はＡ１はＯＨであり；
    但し；
    Ａ１及びＡ２の少なくとも１つは、エピトープを含み；そして
    Ｒ９がＡ２でない場合、Ａ１はペプチドである、請求項７２に記載の化合物。
  73. Ｌ１が請求項４９又はｎ５０に定義される通りであり、請求項７２に記載の化合物。
  74. ｍが、請求項４２又は４３に定義される通りである、請求項７２−７３の何れか１項に記載の化合物。
  75. ｍが０である、請求項７２−７４の何れか１項に記載の化合物。
  76. ｍの各場合でのＲ１及びＲ２がそれぞれ独立して、水素である、請求項７２−７５の何れか１項に記載の化合物。
  77. Ｒ３が水素である、請求項７２−７６の何れか１項に記載の化合物。
  78. Ｒ４及びＲ５がそれぞれ水素である、請求項７２−７７の何れか１項に記載の化合物。
  79. Ｒ６及びＲ７がそれぞれ水素である、請求項７２−７８の何れか１項に記載の化合物。
  80. Ｒ８が水素であり、そしてＲ９が水素、アミノ保護基、Ｌ３−Ｃ（Ｏ）、又はＡ２である、請求項７２−７９の何れか１項に記載の化合物。
  81. Ａ１がＯＰ１又はＯＨであり、そしてＲ９が水素、アミノ保護基又はＬ３−Ｃ（Ｏ）である、請求項７２−８０の何れか１項に記載の化合物。
  82. Ｌ３がＭｅである、請求項７２−８１の何れか１項に記載の化合物。
  83. Ａ１及び／又はＡ２が、アミノ酸又はペプチドである、請求項７２−８２の何れか１項に記載の化合物。
  84. 前記ペプチドがエピトープを含む、請求項７２−８３の何れか１項に記載の化合物。
  85. Ａ１がセリン、又は第１のＮ末端アミノ酸残基としてセリンを含むペプチドである、請求項７２−８１及び８２−８４の何れか１項に記載の化合物。
  86. Ａ１及び／又はＡ２が、ペプチド鎖に複数の親水性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含む可溶化基を含むペプチドである、請求項７２−８１及び８３−８５の何れか１項に記載の化合物。
  87. 前記ペプチドが、下記：
    ａ．配列Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３Ｘａａ４ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ［配列番号１］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、Ｘａａ２は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、Ｘａａ３は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、そしてＸａａ４は不在であるか、又は１又は２以上の親水性アミノ酸であり、
    ｂ．配列Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ［配列番号２］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、Ｘａａ２は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、そしてＸａａ３は不在であるか、又は１〜１０個の親水性アミノ酸であり、
    ｃ．配列Ｘａａ１Ｘａａ２ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ［配列番号３］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、そしてＸａａ２は不在であるか、又は１〜４個の親水性アミノ酸であり、
    ｄ．配列ＳＫＫＫＫＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ［配列番号４］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｅ．配列ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬ［配列番号５］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｆ．配列ＬＡＭＰＦＡＴＰＭ［配列番号６］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｇ．ＦＡＴＰＭＥＡＥＬ［配列番号７］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｈ．配列Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３Ｘａａ４ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ［配列番号８］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、Ｘａａ２は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、Ｘａａ３は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、そしてＸａａ４は不在であるか、又は１又は２以上の親水性アミノ酸であり、
    ｉ．配列Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ［配列番号９］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、Ｘａａ２は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、そしてＸａａ３は不在であるか、又は１〜１０個の親水性アミノ酸であり、
    ｊ．配列Ｘａａ１Ｘａａ２ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ［配列番号１０］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、そしてＸａａ２は不在であるか、又は１〜４個の親水性アミノ酸であり、
    ｋ．配列ＳＫＫＫＫＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ［配列番号１１］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｌ．配列ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ［配列番号１２］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｍ．配列ＥＦＴＶＳＧＮＩＬ［配列番号１３］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｎ．配列Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３Ｘａａ４ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ［配列番号１４］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、Ｘａａ２は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、Ｘａａ３は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、そしてＸａａ４は不在であるか、又は１又は２以上の親水性アミノ酸であり、
    ｏ．配列Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３２ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ［配列番号１５］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、Ｘａａ２は不在であるか、又は親水性アミノ酸であり、そしてＸａａ３は不在であるか、又は１〜１０個の親水性アミノ酸であり、
    ｐ．配列Ｘａａ１Ｘａａ２２ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ［配列番号１６］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、ここで前記配列において、Ｘａａ１は不在であるか、又はＳであり、そしてＸａａ２は不在であるか、又は１〜４個の親水性アミノ酸であり、
    ｑ．配列ＳＫＫＫＫＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ［配列番号１７］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｒ．配列ＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ［配列番号１８］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｓ．配列ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ［配列番号１９］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｔ．配列ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ［配列番号２０］からの８又はそれ以上の連続するアミノ酸残基、
    ｕ．配列番号１−２０の何れか１つの配列、又は
    ｖ．複数の上記（ａ）〜（ｕ）の組合せ、
    から成る群から選択されたアミノ酸配列を含むか、それらから実質的に成るか、又はそれらから成る、請求項８３−８６の何れか１項に記載の化合物。
  88. 配列番号１−５、８−１２又は１４−１８の何れか１つから成る群から選択されたアミノ酸配列を含むか、成るか又は実質的に成る、単離され、精製されたか、又は組換えペプチド。
  89. 前記ペプチドが、配列番号４、５、１１、１２、１７及び１８の何れか１つから成る群から選択されたアミノ酸配列から成る、請求項８８に記載の化合物。
  90. 有効量の請求項７１〜８７の何れか１項記載のペプチド接合体、又は請求項８８又は８９に記載のペプチド、又は医薬敵に許容できるその塩又は溶媒和物、又はその何れかの組合せ、及び医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物。
  91. 有効量の請求項７１〜８７の何れか１項記載の複数のペプチド接合体、又は請求項８８又は８９に記載の複数のペプチド、又は請求王７１〜８７の何れか１項記載の複数のペプチド接合体及び請求項８８又は８９に記載の１又は２以上のペプチドの何れかの組合せを含む、請求項９０に記載の医薬的組成物。
  92. 有効量の請求項７１〜８７の何れか１項記載のペプチド接合体、又は請求項８８又は８９に記載のペプチド、又は医薬敵に許容できるその塩又は溶媒和物を、対象に投与することを含んで成る、対象にワクチン接合するか又は免疫応答を誘発する方法。
  93. 有効量の請求項９０又は９１に記載の医薬組成物を、対象に投与することを含んで成る、対象にワクチン接種するか又は免疫応答を誘発する方法。
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