JP2020010692A - 遺伝子改変動物、およびそれを作製する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本特許は、すべての目的のために本明細書に援用する、2011年2月25日に出願された米国特許出願第61/446,651号明細書に対する優先権を主張する。
本発明は、米国国立衛生研究所(National institutes of Health)が交付する補助金番号1R41HL108440−01「アテローム性動脈硬化症の遺伝的モデルブタの開発(Development of Porcine Genetic Models of Atherosclerosis)」よる政府支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
TALENにより改変された家畜類を作製する際の障壁の1つは、従来のベストプラクティスを用いても動物細胞の改変効率が数パーセントであることにある。意図した部位で欠失または挿入を達成しても、実際には外来性タンパク質の発現または内在性タンパク質の発現の停止など意図した作用を発揮しないこともあるため、必ずしも成功を意味するとは限らない。低効率でも、ミバエまたはマウスなどの下等動物の遺伝子改変動物の作製には有用な場合もある。こうした下等動物は生殖周期が短いうえ多く繁殖することから、数百の動物の作製、試験およびスクリーニングを行い、改変に成功した少数の動物が存在するかどうかを判定できるためである。しかしながら、これらの従来法で達成される効率のレベルは、妊娠期間が非常に長く、妊娠当たりの子孫が比較的少数である家畜類の偶蹄目動物には適さない。
複数のDNA部位に対するTALENを用いて実験を行った。各部位は、数千の塩基対離れていた。DNAは、部位間の全領域の欠失と再結合することができることが観察された。実施形態は、たとえば、1〜5メガベース、または染色体の50%〜80%、または約100〜約1,000,000塩基対の距離離れた部位を含む。当業者であれば、明記された範囲内の範囲および値、たとえば、約1,000〜約10,000塩基対、または約500〜約500,000塩基対をすべて意図していることをすぐに理解するであろう。あるいは、外来性DNAは、外来性DNAの挿入、または鋳型による部位間のDNA修復のため細胞または胚に加えてもよい。複数の部位での改変を使用して、遺伝子改変された細胞、胚、偶蹄目の動物および家畜類を作製してもよい。実施例6は、数千塩基対のDNAの欠失について記載し、末端の再結合が生化学的に確認される。
いくつかの家畜類の形質は、アレル、たとえば多型(大または小)、一塩基多型、欠失、挿入または他の変化に関係している。たとえば、ベルジアンブルー(Belgian Blue)ウシ(cattle)由来のミオスタチンアレル(11bp欠失)は、ウシ筋肉肥大表現型を引き起こすことでよく知られている。実施例7は、ベルジアンブルー(Belgian Blue)アレルを用いて、相同性依存型修復(HDR)により特定のアレルをある家畜品種から別の家畜品種に正確に移す方法を示す。ウシ線維芽細胞にアレルを導入したら、トランスジェニックウシ(cattle)の作製に直ちに使用してもよい。このアレルは、正常な発生を妨害するものではなく、本明細書に教示された方法により、他の遺伝子を破壊したり、または外来性遺伝子を組み込んだりすることなくアレルが正確に導入される。既に考察したように、本明細書に示した結果により、姉妹染色分体をHDR鋳型に使用した場合、家畜線維芽細胞のアレル変換の頻度は高く、したがってアレルが一方の姉妹染色分体に移入されると、多くの場合、ホモ接合になると予測され得ることが示される。
本発明はまた、たとえば、TALENをコードする核酸分子、TALENポリペプチド、こうした核酸分子もしくはポリペプチドを含む組成物、またはTALENにより操作された細胞株を含む組成物およびキットを提供する。こうした品目は、たとえば、リサーチツールとして使用しても、または治療に使用してもよい。
本発明の実施形態は、単数または複数のTALENをリコンビナーゼと共に投与することを含む。リコンビナーゼは、核酸フラグメントとフィラメントを形成し、実際に、細胞DNAを検索してその配列と実質的に相同なDNA配列を見つける。TALEN−リコンビナーゼ実施形態の一実施形態は、HDRの鋳型として働く核酸配列とリコンビナーゼを組み合わせることを含む。HDR鋳型配列は、TALEN/TALENペアによる切断の標的となる部位と実質的な相同性がある。本明細書に記載するように、HDR鋳型は、アレルの導入、インデルの作製、外来性DNAの挿入、または他の変化によりネイティブDNAを変化させる。TALENは、タンパク質、mRNAとしてまたはベクターを使用して、本明細書に記載の方法により細胞または胚に導入される。リコンビナーゼは、HDRと一緒になってフィラメントを形成し、細胞に導入される。リコンビナーゼおよび/またはリコンビナーゼと一緒になったHDR鋳型は、タンパク質、mRNAとしてまたはリコンビナーゼをコードするベクターを用いて、細胞または胚に導入してもよい。米国特許出願公開第2011/0059160号明細書(米国特許出願第12/869,232号明細書)の開示内容は、あらゆる目的において本明細書に援用する。矛盾が生じた場合、本明細書を優先する。リコンビナーゼという用語は、細胞において比較的長いDNA二重鎖の間で比較的短いDNA断片の連結を酵素的に触媒する遺伝子組換え酵素をいう。リコンビナーゼとして、Creリコンビナーゼ、Hinリコンビナーゼ、RecA、RAD51、CreおよびFLPを挙げることができる。Creリコンビナーゼは、loxP部位間でDNAの部位特異的組換えを触媒するP1バクテリオファージ由来のI型トポイソメラーゼである。Hinリコンビナーゼは、サルモネラ属(Salmonella)細菌に見られる198個のアミノ酸からなる21kDのタンパク質である。Hinは、活性部位セリンに依存してDNAの切断および組換えを惹起するDNAインベルターゼのセリンリコンビナーゼファミリーに属する。RAD51はヒト遺伝子である。この遺伝子がコードするタンパク質は、DNA二重鎖切断の修復を支援するRAD51タンパク質ファミリーのメンバーである。RAD51ファミリーメンバーは、細菌のRecAおよび酵母のRad51と相同的である。Creリコンビナーゼは、実験室試験でHIVにより挿入されたDNAを感染細胞から除去することに成功した実験酵素である。この酵素は、HIVマーカーを同定するため選択的突然変異によりCreリコンビナーゼから得られた。HIVマーカーは、loxP部位と接していないため、Cre−Lox組換えの試みは行われない。FLPは、パン酵母サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の2μのプラスミドに由来するフリッパーゼ組換え酵素(FLPまたはFlp)をいう。
TALENという用語は、本明細書で使用する場合、広義であり、別のTALENの援助なしに二重鎖DNAを切断できる単量体TALENを含む。TALENという用語は、協力して同じ部位でDNAを切断するように操作されたTALENのペアの一方または両方をいうのにも使用される。協力する各TALENは、DNAの左右方向を参照してleft−TALENおよびright−TALENということがある。
核酸コンストラクトを非ヒト動物に導入して、核酸コンストラクトがゲノムに組み込まれたファウンダー系統を作製するには、当該技術分野において公知の様々な技術を使用することができる。こうした技術には、以下に限定されるものではないが、前核へのマイクロインジェクション(米国特許第4,873,191号明細書)、レトロウイルスによる生殖系列への遺伝子導入(Van der Putten et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,6148−1652)、胚性幹細胞への遺伝子ターゲティング(Thompson et al.(1989)Cell 56,313−321)、胚のエレクトロポレーション(Lo(1983)Mol.Cell.Biol.3,1803−1814)、経精巣遺伝子導入(Lavitrano et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99,14230−14235;Lavitrano et al.(2006)Reprod.Fert.Develop.18,19−23)、および体細胞、たとえば卵丘もしくは乳腺細胞または成体、胎生もしくは胚性幹細胞のインビトロ形質転換後の核移植(Wilmut et al.(1997)Nature 385,810−813;and Wakayama et al.(1998)Nature 394,369−374)がある。前核へのマイクロインジェクション、経精巣遺伝子導入および体細胞核移植は、特に有用な技術である。
ノックアウトのために、または他の目的で遺伝子の発現を得るために、種々の核酸を偶蹄目の動物細胞または他の細胞に導入してもよい。トランスジェニック動物の作製に使用することができる核酸コンストラクトは、標的核酸配列を含む。本明細書で使用する場合、核酸という用語は、DNA、RNAおよび核酸アナログ、ならびに二重鎖または一本鎖(すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖)の核酸を含む。核酸アナログは、たとえば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解性を向上させるため塩基部分、糖部分またはリン酸骨格を修飾してもよい。塩基部分の修飾には、デオキシチミジンのデオキシウリジンと、デオキシシチジンの5−メチル−2’−デオキシシチジンおよび5−ブロモ−2’−デオキシシチジンとがある。糖部分の修飾には、2’−O−メチルまたは2’−O−アリル糖を形成するためのリボース糖の2’ヒドロキシルの修飾がある。デオキシリボースリン酸骨格は、塩基部分がそれぞれ6員のモルホリノ環に連結されたモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸骨格が偽ペプチド骨格で置換され、4つの塩基が保持されたペプチド核酸が得られるように修飾してもよい。Summerton and Weller(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7(3):187;and Hyrup et al.(1996)Bioorgan.Med.Chem.4:5を参照されたい。さらに、デオキシリン酸骨格は、たとえば、ホスホロチオアートまたはホスホロジチオアート骨格、ホスホロアミダイトまたはアルキルホスホトリエステル骨格で置換してもよい。
TALENの直接インジェクションにより作製された遺伝子改変偶蹄目家畜類(ウシ)
Cermak et.al.(2011)Nuc.Acids Res.39:e82に記載されているように3つのTALENペアを設計および構築し(図3)、授精から約19時間後にウシ胚の細胞質にmRNAをインジェクトした。インジェクトされた胚をインビトロで培養し、胚盤胞期で採取した(図3)。個々の胚盤胞のゲノムDNAを全ゲノム増幅(WGA)(Carlson et al.(2011)Trangenic Res.20:29)により増幅し、SURVEYORヌクレアーゼアッセイを用いてインデルについてスクリーニングした(図3、4Aおよび4B)。TALEN活性が示唆された切断産物は、インジェクトされた胚の10%で観察された(たとえば、図3、4A、および4B)。予想された領域の突然変異は、ACAN11のTALENペアまたはACAN12のTALENペアのどちかをインジェクトされた2つの胚盤胞で確認された(図3)。TALENをインジェクトされた胚の発生能の著しい低下は、観察されなかった。次いでACAN12のTALENペアを用いて10〜100ng/μlの範囲のmRNA用量で2回目のインジェクションを行った。1回目(33%)と2回目(5%)(10ng/μlの条件)との胚盤胞形成率の比較から、胚の品質が不十分であることが明らかになった(表S2)。胚の品質は不十分であるものの、SURVEYORアッセイを用いて12個の推定ミュータント(インジェクトされたうちの27%)が同定された。SURVEYOR陽性胚の遺伝子型はそれぞれ、クローン化したPCR産物由来の14個のシーケンシングリードを用いて解析した。シーケンシングから、遺伝子改変においてモザイク現象が明らかになった。インデルは4個のSURVEYOR陽性胚で同定され、これらのうち、インデル陽性配列リードは胚ごとに全リードの7〜29%を占めた。これらの結果から、TALENは偶蹄目動物胚で機能することが立証された。ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)およびTALENを用いた胚の遺伝子改変については、ヌクレアーゼペアをコードするZFNまたはTALENのmRNAの直接インジェクションによるモデル生物が報告されているGeurts et al.(2009)Science 325:433;Carbery et al.,(2010)Genetics 186:451;Mashimo et al.(2010)PLoS One 5:e8870;Tesson et al.(2011)Nature Biotechnol.29:695。
TALENの直接インジェクションにより作製された遺伝子改変偶蹄目動物家畜類(ブタ(swine))。
また、アフリカ豚コレラ耐性アレルが提唱された(Palgrave et al.(2011)J.Virol.85:6008)ブタRELA遺伝子(p65)を標的とするTALENを使用して、ブタのIVP胚に一連のインジェクションを行った。ネイティブなTALEスキャフォールドの切断型変異体を用いてTALEN活性が増強されることを2つのグループが報告した(Mussolino et al.(2011)Nucleic Acids Res.39:9283;Miller et al.(2011)Nature Biotechnol.29:143{Mussolino,2011 #151;Miller,2011 #42}。したがって、+231スキャフォールド(BamHIフラグメント、Christian et.al.(2010)Genetics 186:757)を使用した上記の実験とは異なり、p65TALENスキャフォールドを選択し、Miller et.al.2011(前掲)に記載された+63型を模して切断した(図5も参照)。leftおよびright TALENをそれぞれ10ng/μlを含むmRNAの混合物と共に5ng/μlのEGFPのmRNAをインジェクションの成功の指標として接合体にインジェクトした。75個のEGFP陽性接合体(インジェクトした214個のうち、35%)が同定され、WGAによるインデル解析に供した。EGFP陽性胚のうち56個のPCR増幅に成功し、これらのうち16個(29%)から、SURVEYORアッセイ(図3)または配列解析によりインデルが明らかになった。ウシ(cattle)と比較してブタの接合体ではモザイク現象が減少するようであり、実際、ホモ接合性またはヘテロ接合性の両アレルのミュータント(図4)は、ミュータントの3分の1(6/16)であった。これらの結果から、TALENが偶蹄目動物胚で機能することが立証された。改変された胚に基づく動物ファウンダー系の作製プロセスは、周知である。
ウシおよびブタ(swine)体細胞の遺伝子改変により作製された遺伝子改変偶蹄目動物家畜類。
生物医学的または農業上のいずれかの重要性に基づき選択したブタおよびウシ(cattle)の標的に対し、いくつかの追加のTALENペアを構築した。前述の2つのTALENスキャフォールド(+231、Christian et.al.2010(前掲)および+63、Miller et.al.2011(前掲))(図5)に照らして、6つのTALENペアの結合ドメインを導入した。各TALENペアを初代家畜類線維芽細胞にトランスフェクトし、3日目にSURVEYORアッセイ(Guschin,et al.(2010)Methods Mol.Biol.649:247によりゲノム改変を測定した。最も活性なTALENペアDMDE7.1およびACAN12からは、それぞれ染色体の38%および25%の切断が示され、サンガーシーケンシングから、NHEJによるDNA修復の特徴である様々なインデルが明らかになった(図5および図6)。TALENスキャフォールドは、線維芽細胞の活性に大きな影響を与えた。全体で、+63アイソフォームの標的となる6つの遺伝子座のうち4つが3.5%以上で切断されたのに対し、+231スキャフォールドでは、1%を超えて切断したのはDMDE7.1TALENペアのみであった(図5)。これまでの研究Doyon et al.(2010)Nature Methods 8:74;Miller,(2011)op.cit.)に記載されているように、トランスフェクション後30℃で72時間のインキュベーションを行っても、活性にプラスの影響があり、3つのTALENペアの活性には、こうしたインキュベーションが必要とされた。活性TALENペアの作製の成功率は高いものとなっている。出願時までに収集されたデータでは、常染色体とX染色体およびY染色体とのブタおよび雌ウシのゲノムに散在する15個の遺伝子において36TALENペアのうち23(64%)が検出できる程度に活性(>1.0%NHEJ)であったことが示される(表S3)。活性ペアの4分の3が高効率(19〜40%)で切断し、平均の改変率は25%であった。改変された線維芽細胞に基づき動物ファウンダー系を作製するクローン法は、周知である。
トランスポゾンのコトランスフェクションによる拡大培養およびインデル濃縮。
TALENペアを線維芽細胞にトランスフェクトし、トランスポゾン共選択を用いてまたは用いずに細胞を14日間以上培養してから改変レベルを測定した。結果を図7にまとめてある。0日目(D0)に、各TALENの発現カセット(2つのプラスミド)、選択マーカーをコードするトランスポゾン(ピューロマイシンをコードする第3のプラスミド、およびトランスポザーゼ−発現カセット(第4のプラスミド)を含むプラスミドの混合物を細胞にトランスフェクトする。TALENのプラスミドが各トランスフェクションの主要な成分である(4倍過剰量)。トランスフェクト細胞を継代前に30℃あるいは37℃で3日間培養し、SURVEYORアッセイのためのサンプルを採取し、拡大培養によりトランスポゾン組み込みを+/−選択するためリプレートする。3日目以降、全細胞を37℃で培養する。SURVEYORアッセイのため14日間以上培養した細胞を集め、下流用途、すなわち、SCNTのため凍結保存する。比較のため、ヌクレオフェクションにより他の線維芽細胞にもトランスフェクトし、3日目、および14日目以降の非選択(NS)および選択(S)集団におけるNHEJの割合を測定した。比較のため、カチオン性脂質による線維芽細胞のトランスフェクションも行った。
片アレルおよび両アレルのKOクローンの単離。
トランスジェニック初代線維芽細胞は、標準的な密度(>150細胞/cm2)で非トランスジェニック線維芽細胞(フィーダー細胞)と一緒に播種し、上記で使用したトランスポゾン共選択技術を使用して薬剤選択に供すると、効率的に増殖させ、コロニーとして単離することができる(Carlson et al.(2011) Transgenic Res.20:1125)。このアプローチを評価するため、6つのTALENペアで処理した細胞のピューロマイシン耐性コロニーを単離し、それらの遺伝子型を、標的部位をまたぐPCR産物のSURVEYORアッセイまたは直接シーケンシングにより評価した(図8Aおよび8B)。一般に、インデル陽性クローンの比率は、3日目の改変レベルに基づき行った予測と同様であった。両アレルノックアウトクローンは、6つのTALENペアのうち5つで同定され、インデル陽性細胞の最大35パーセントで生じた(表1)。過半数の例(23のうち15)では、インデルは各アレルに特有のインデルではなく、同型(各アレルで同じインデル)であったことから、姉妹染色分体を鋳型とした修復が一般的であることが示唆された(図9)。目を引くのは、染色体切断を独立した現象として処理する場合、改変されたクローンのうち、過半数のTALENペアで両アレル改変の頻度(17〜35%)が3日目の改変に基づく予測(10〜15.6%)を上回ることである。ZFNを用いたこれまでの研究(Kim et al.(2009) Genome Res.19:1279;Lee et al.(2010) Genome Res.20:81;Perez et al.(2008) Nature Biotechnol.26:808))は、これらの結果を裏付けるものである。こうしたこれまでの研究から、両アレル改変は、ヌクレアーゼ活性のレベルに関係なく、改変された細胞の3分の1で起こることが示唆される。
TALENによる染色体欠失および逆位。
同一染色体を標的とする2つのTALENペアを同時送達すると、大きな染色体欠失または逆位が誘導できるとの仮説を立てた。TALENペアDMDE6およびDMDE7.1の高い活性と、ブタモデルがヒトの状態に合うように高い割合のデュシェンヌ型筋ジストロフィーが大規模欠失によりで引き起こされる(Blake,2002)という事実とのため、DMDE6およびDMDE7.1を試験した。結果を図10にまとめてある。各TALENペアの3日目の遺伝子改変レベルは、TALENペアのどちらかを個別にトランスフェクトしたときより若干低いものの、高レベルであった(DMDE6で24%およびDMDE7.1で23%)(図10)。2つのTALENペアの間の配列が欠失されたかどうかを判定するため、TALENの標的部位をまたぐプライマーを用いてPCRを試みた。6.5kbの配列が除去された場合、選択したPCR条件では、約500bpのバンドが予想される一方、7kbの野生型バンドは増幅されないと考えられた。TALENペアの両方を導入した複製物ではほぼ500bpのバンドが観察されたが、TALENペアの一方のみを導入した場合には存在しなかった(図10)。
TALEN誘導性相同組換えは、選択マーカーを連結する必要がない。
ベルジアンブルー(Belgian Blue)ウシ(cattle)由来のミオスタチンアレルミュータント(11bp欠失)を野生型和牛(Wagyu cattle)のゲノムに導入した(Grobet et al.(1997) Nature Genet.17:71)(図13)。btGDF8.1 TALENペアを単独でトランスフェクトした場合、標的遺伝子座で染色体の最大16%を切断した(図13)。TALEN(btGDF83.1)およびdsDNA鋳型(BB−HDR)は、ウシGDF8のエクソン−3に11bpの欠失(ベルギーブルー(Belgium Blue)突然変異)をDSB誘導性相同組換えにより導入するように設計した。BB−HDR鋳型ではleft TALENの結合部位の半分が欠損していたため、BB−HDR鋳型はTALEN切断に対して抵抗性があった。SURVEYORアッセイから、37℃および30℃の両方でbtGDF83.1 TALENの活性が立証された。本アッセイで使用したPCR産物は、プライマーbおよびb’を使用して作製した(図13の図aに示す)。BB−HDR鋳型は、btGDF83.1活性の推定を難しくすると考えられるため、これらの複製物に含めなかった。アレル特異的PCRから、HDRの誘導は、TALENとBB−HDR鋳型とのコトランスフェクションに依存することが立証された。PCRアッセイは、HDRにより改変されたGDF8アレルを、プライマーcおよびc’を使用して特異的に検出するように開発した(図13の図aに示す)。プライマーc’の3’末端は11bpの欠失をまたぎ、野生型アレル「wt」を増幅できない。陽性対照「C」を含む各PCR反応に500細胞相当量を加えた。HDR率は、実験反応と対照反応とをデンシトメトリーにより比較して判定した。ベルジアンブルー(Belgian Blue)ウシ(cattle)由来の1623bpのDNAフラグメントを有するスーパーコイルDNA鋳型とコトランスフェクションを行ったところ、所望の現象に対する選択を行わずに3日目の半定量PCRにより示唆されたように、遺伝子変換頻度(HDR)が最大5%となった(図13)。これらの結果から、マーカーを用いずにTALENを使用して、アレルを含む外来性核酸配列を家畜類に効率的に組み込むことができることが立証された。個々のコロニーにおける組み込み頻度を評価するため、トランスポゾン共選択戦略を実施し、個々のコロニーを単離し増殖させてDNAシーケンシングを行った。PCRにより調べた366コロニーのうち5つのコロニーにおいて、ベルジアンブルー(Belgian Blue)ウシ(cattle)由来の鋳型を使用した遺伝子変換が検出された。ベルジアンブルー(Belgian Blue)HDR鋳型の外側のプライマーで増幅し、シーケンシングを行ったところ、予想された11bpの欠失の存在が4つのコロニーで確認された(図14)。
家畜類細胞におけるHDRの標的としての、TALENによるDNA切断。
ブタ(swine)低密度リポタンパク質受容体(LDLR)遺伝子の第4エクソンを標的とするTALENペア(LDLR2.1)をスーパーコイルプラスミドLdlr−E4N−stopとコトランスフェクトした。Ldlr−E4N−stopは、ブタ(swine)LDLR遺伝子に対応するホモロジーアーム、およびHDR時にネオマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を可能にする遺伝子トラップを含む(図15)。培養から3日後、PCR解析により、抗生物質選択を行わなくても、30℃で標的遺伝子座(レーン4)にてHDR現象に対応するバンドを検出し得ることが明らかになった。ジェネティシン(G418)による14日間の培養細胞集団の選択の結果、HDR細胞が顕著に濃縮された(レーン11および13)。こうして改変された細胞を体細胞核移植によりクローニングすると、8頭のブタ(雌ブタ5頭、雄ブタ3頭)が誕生し、各々が、TALENを介したHDR現象を含むことがホモロジーアームの両側のフランキングPCRにより証明された(図16)。雌ブタを図17に示す。これらのブタは、下記表に示すように正常ブタと比較して食後脂質異常症の意図した表現型を示す:
本明細書に記載した特許出願、特許、刊行物および学術論文は、あらゆる目的において本明細書に援用する。矛盾が生じた場合、本明細書を優先する。
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家畜類細胞におけるHDRの標的としての、TALENによるDNA切断。
ブタ(swine)低密度リポタンパク質受容体(LDLR)遺伝子の第4エクソンを標的とするTALENペア(LDLR2.1)をスーパーコイルプラスミドLdlr−E4N−stopとコトランスフェクトした。Ldlr−E4N−stopは、ブタ(swine)LDLR遺伝子に対応するホモロジーアーム、およびHDR時にネオマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を可能にする遺伝子トラップを含む(図15)。培養から3日後、PCR解析により、抗生物質選択を行わなくても、30℃で標的遺伝子座(レーン4)にてHDR現象に対応するバンドを検出し得ることが明らかになった。ジェネティシン(G418)による14日間の培養細胞集団の選択の結果、HDR細胞が顕著に濃縮された(レーン11および13)。体細胞核移植により、こうして改変された細胞のクローニングが実施され、代理雌ブタは現在胚を妊娠している。
Claims (68)
- インビトロ培養物中の初代細胞または胚を、TALENをコードする核酸に接触させることを含み、前記細胞は家畜の細胞であり、前記胚は家畜の胚である、遺伝子改変を行う方法。
- 前記初代細胞は前記インビトロ培養物中で前記核酸に接触する、請求項1に記載の方法。
- TALENをコードする前記核酸はmRNAを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENは、left TALENであり、前記left TALENと協同してDNAの二重鎖切断を行うright TALENをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 第2のベクターが、前記TALENをコードする前記核酸を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞または前記胚を、レポーターをコードするベクターに接触させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 選択マーカーをコードするベクターをさらに含む、請求項6に記載の方法。
- 前記レポーターは選択マーカーを含む、請求項6に記載の方法。
- その後の処理のため前記レポーターを発現する細胞または胚を選択することをさらに含む、請求項6に記載の方法。
- 前記細胞は、前記レポーターを発現しない細胞を前記培養物から除去することに基づき選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記レポーターは蛍光生体分子を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記胚は前記レポーターの発現に基づき選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記細胞は前記レポーターの発現に基づき選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記ベクターはプラスミドを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記ベクターは前記レポーターをコードするトランスポゾンを含み、前記トランスポゾンを認識するトランスポザーゼをコードするベクターをさらに含む、請求項6に記載の方法。
- 前記トランスポザーゼは、Sleeping Beauty、Frog Prince、Tol2、Minos、Hsmar、PlaiceおよびPassportからなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記レポーターを発現する細胞または胚を選択すること、および前記細胞または胚を使用して遺伝子改変動物を作製することをさらに含み、前記遺伝子改変は前記TALENにより特異的に結合されるDNA部位にある、請求項1に記載の方法。
- 前記動物を繁殖させること、および前記遺伝子改変を発現し、かつ外来性レポーターを含まない子孫を選択することをさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 前記動物は前記改変のホモ接合性両アレルである、請求項18に記載の方法。
- 前記培養物の前記細胞から遺伝子改変動物をクローニングすることをさらに含み、前記細胞は、前記TALENにより特異的に結合されるDNA部位に遺伝子改変を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞は、体細胞核移植またはクロマチン移植により前記動物をクローニングするために使用される、請求項20に記載の方法。
- 前記遺伝子改変は、挿入、欠失、外来性核酸フラグメントの挿入、逆位、天然のアレルへの遺伝子変換、合成アレルへの遺伝子変換、および新規なアレルへの遺伝子変換からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞または胚にリコンビナーゼを送達することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記リコンビナーゼはタンパク質、mRNAとして、または前記リコンビナーゼをコードするベクターにより、送達される、請求項23に記載の方法。
- 前記リコンビナーゼは核酸と組み合わさってフィラメントを形成し、前記核酸は相同性依存型修復の鋳型となる、請求項23に記載の方法。
- 前記リコンビナーゼは、RecA、recA803、uvsX、recAミュータント、recA様リコンビナーゼ、Creリコンビナーゼ、Hinリコンビナーゼ、RAD51、Tre、FLP、RuvC、DST2、KEM1 XRN1、STPa/DST1およびHPP−1からなる群から選択される、請求項23に記載の方法。
- 前記細胞は、家畜の細胞、偶蹄目動物の細胞、培養細胞、初代細胞、初代体細胞、接合体、始原生殖細胞または幹細胞および接合体からなる群から選択され、あるいは、前記胚は胚盤胞である、請求項1に記載の方法。
- TALENをコードする核酸フラグメント、および前記TALENにより特異的に結合されるDNA部位の遺伝子改変を含む細胞または胚であって、前記細胞は動物組織から単離された初代細胞を含み、前記細胞および前記胚は、偶蹄目の動物、ブタ(swine)、ウシ、魚、ウサギおよび家畜類からなる群から選択される、細胞または胚。
- 前記細胞を含み、前記初代細胞はインビトロ培養物中で前記核酸に接触する、請求項28に記載の細胞または胚。
- TALENをコードする前記核酸はmRNAを含む、請求項28に記載の細胞または胚。
- レポーターをコードするベクターをさらに含む、請求項28に記載の細胞または胚。
- 選択マーカーをコードするベクターをさらに含む、請求項28に記載の細胞または胚。
- 前記レポーターは選択マーカーを含む、請求項31に記載の細胞または胚。
- レポーターをコードするベクター、および前記TALENをコードするベクターをさらに含む、請求項28に記載の細胞または胚。
- トランスポザーゼをコードするベクターをさらに含み、前記レポーターおよび前記TALENはそれらのそれぞれのベクターによりコードされるトランスポゾンである、請求項34に記載の細胞または胚。
- 前記胚を含み、前記胚は前記遺伝子改変のホモ接合性両アレルである、請求項28に記載の細胞または胚。
- 外来性リコンビナーゼをさらに含む、請求項28に記載の細胞または胚。
- 遺伝子改変家畜動物であって、挿入、欠失、外来性核酸フラグメントの挿入、逆位、天然のアレルへの遺伝子変換、合成アレルへの遺伝子変換、および新規なアレルへの遺伝子変換からなる群から選択される遺伝子改変を含み、前記動物は外来性レポーター遺伝子を含まない、遺伝子改変家畜動物。
- 雌ウシ、ブタ(swine)、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、家禽および魚からなる群から選択される、請求項38に記載の家畜動物。
- 前記遺伝子改変は500塩基対の欠失を含む欠失を含む、請求項38に記載の家畜動物。
- 前記遺伝子改変は1メガ塩基対の欠失を含む欠失を含む、請求項38に記載の家畜動物。
- 前記遺伝子改変は1メガベースの染色体DNAを含む逆位を含む、請求項38に記載の家畜動物。
- 前記遺伝子改変は500塩基対を含む逆位を含む、請求項38に記載の家畜動物。
- 前記遺伝子改変は逆位を含み、前記逆位は遺伝形質をコードする、請求項38に記載の家畜動物。
- ベルジアンブルー(Belgian Blue)ウシ(cattle)でないウシ系統の動物を含み、前記遺伝子改変はベルジアンブルー(Belgian Blue)ウシ(cattle)に多く見られるミオスタチン欠失を含む、請求項38に記載の家畜動物。
- 形質を選択すること、および家畜動物の創始体として使用される細胞または胚において前記形質をコードするDNAの領域を反転させることを含む、家畜動物を遺伝子改変する方法。
- 前記逆位は1000塩基対を含む、請求項46に記載の方法。
- 前記逆位は1メガベースの染色体DNAを含む、請求項46に記載の方法。
- 前駆細胞または胚を第1のDNA部位で特異的に結合する第1のTALEN、および第2のDNA部位で特異的に結合する第2のTALENに接触させることを含み、前記部位の間の領域が欠失される、動物を遺伝子改変する方法。
- 前記第1のTALENは第1のTALENペアを含み、前記第2のTALENは第2のTALENペアを含む、請求項49に記載の方法。
- 前記前駆細胞を含み、前記前駆細胞の体細胞核移植またはクロマチン移植が前記動物を作製するために使用される、請求項49に記載の方法。
- 前記TALENを前記前駆細胞に導入すること、およびレポーターを含むベクターをさらに導入すること、および前記レポーターが発現する場合に限り、前記動物の作製のため前記前駆細胞または胚を選択することを含む、請求項49に記載の方法。
- アレルを第1の家畜品種から第2の家畜品種に移す方法であって、
前記第1の家畜品種の前記アレルをコードする核酸の存在下でTALENを前記第2の家畜品種の細胞または胚に導入することを含み、前記アレルは前記細胞または前記胚にコピーされ、さらに前記細胞または前記胚から前記第2の品種の動物を作製すること
を含む方法。 - 前記アレルはベルジアンブルー(Belgian Blue)ウシ(cattle)に存在するミオスタチンアレルを含む、請求項53に記載の方法。
- 前記TALENはmRNAまたはベクターによりコードされる、請求項53に記載の方法。
- 前記TALENはright TALENであり、left TALENをさらに含む、請求項53に記載の方法。
- 前記TALENと独立にレポーターベクターを導入することをさらに含む、請求項53に記載の方法。
- 前記アレルは前記第1の家畜品種の形質に連鎖する、請求項53に記載の方法。
- 前記細胞または胚にリコンビナーゼを送達することをさらに含む、請求項53に記載の方法。
- 前記リコンビナーゼはタンパク質、mRNAとして、または前記リコンビナーゼをコードするベクターにより、送達される、請求項59に記載の方法。
- 前記リコンビナーゼは前記核酸と組み合わさってフィラメントを形成する、請求項59に記載の方法。
- 第2の品種の家畜動物のアレルを含む第1の品種の家畜動物
を含み、
前記第1の品種の家畜動物は前記第2の品種の動物との減数分裂組換えを含まない遺伝子改変家畜動物。 - 前記動物は、ブタ(swine)、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギおよび魚からなる群から選択される、請求項62に記載の動物。
- 前記第1の品種は和牛(Wagyu cattle)であり、前記第2の品種はベルジアンブルー(Belgian Blue)ウシ(cattle)である、請求項62に記載の動物。
- 前記アレルは挿入、欠失、多型および一塩基多型からなる群から選択される、請求項62に記載の動物。
- 前記動物は外来性マーカー遺伝子を含まない、請求項62に記載の動物。
- 複数の前記アレルを含む、請求項62に記載の動物。
- 前記アレルは前記第2の品種の量的形質または質的形質に連鎖する、請求項62に記載の動物。
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