JP2019520791A - 5−ヒドロキシメチル化無細胞系dnaをシーケンシングすることによる非侵襲性診断 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年4月7日に出願された米国特許仮出願第62/319,702号、2017年1月9日に出願された同第62/444,122号、および2017年2月21日に出願された同第62/461,712号の利益を主張し、それらの出願の全内容が参考として本明細書に組み込まれるものとする。
本明細書中で異なって定義しない限り、ここで使用する全ての技術用語と科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により普通に解釈されるのと同じ意味である。本明細書中に記載するのと同様または同等である、あらゆる方法と材料が本発明の実施または試験に使用できるけれども、好ましい方法と材料が記載される。
ヒドロキシメチル化された無細胞系DNAをシーケンシングする方法が提供される。ある態様では、該方法は、cfDNAのサンプル中のヒドロキシメチル化DNA分子だけにアフィニティータグを付加し;該アフィニティータグが付けられたDNA分子を濃縮せしめ;そして濃縮されたDNA分子をシーケンシングすることを含む。
上述した本発明の方法を実施するための試薬を含有するキットも本開示により提供される。本発明のキットは、上述した成分のいずれか1つまたは複数を含有する。例えば、ある場合、キットはcfDNAを解析するためのものであってよい。そのような態様では、該キットは、DNA β-グルコシルトランスフェラーゼ、化学選択性基で修飾されたUDP、および上述したような分子バーコードを含むアダプターを含んでなってよい。ある態様では、アダプターがY型アダプターまたはヘアピン型アダプターである。ある態様では、該キットがビオチン成分を含み、ここで前記ビオチン成分は前記化学選択性基と反応性である。
本発明の方法により製造される生成物を含む様々な組成物も本発明の開示により提供される。ある態様では、該組成物は、循環無細胞系DNAを含み、ここで前記DNA中のヒドロキシメチルシトシン残基が捕捉タグを含むように修飾されている。このような態様では、循環無細胞系DNAの両方の鎖が組成物の中に存在する。ある場合には、該DNAが二本鎖形である。別の態様では、該DNAが一本鎖形(例えば組成物が高温でのインキュベーションにより変性されている場合)である。
本発明の種々の態様は、次の実施例に鑑みれば更に理解できるだろうが、これらの実施例は決して本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
サンプル収集と処理健常被験者のサンプルはスタンフォード血液センターより入手した。HCCおよび乳癌患者は、スタンフォード大学施設内倫理委員会(Stanford University Institutional Review Board)承認プロトコルにより募集した。肺癌、膵癌、GBM、胃癌および大腸癌患者は、ウエストチャイナ病院施設内倫理委員会(West China Hospital Institutional Review Board)承認プロトコルにより募集した。全ての募集した被験者にインフォームド・コンセントを与えた。血液はEDTAコートしたバキュテイナ(商標)採血管中に収集した。4℃、1,600×gで10分間と4℃、16,000×gで10分間の遠心分離により、血液サンプルから血漿を収集した。cfDNAはCirculating Nucleic Acid Kit (Quiagen)を使って抽出した。DNAミニキット(Quiagen)を使って全血ゲノムDNAを抽出し、dsDNAフラグメンターゼ(NEB)を使って平均300 bpに断片化した。Qubit蛍光光度計(Life Technologies)によりDNAを定量した。無細胞RNAはPlasma/Serum Circulating and Exosomal RNA Purificationキット(Norgen)を使って抽出した。抽出された無細胞RNAを、Clontech社のプロトコルに従って、ベースライン-ゼロ(Baseline-ZERO)DNアーゼ(Epicentre)を使って更に消化しそしてリボ-ゼロ(Ribo-Zero)rRNA除去キット(Epicentre)を使ってRNAを枯渇させた。
無細胞系5hmCは、上記方法を使って10 ng未満のcfDNA(例えば1〜10 ngのcfDNA)を含むサンプルから容易に得られた。C、5mCまたは5hmCを所有する180 bpアンプリコンのプール中にスパイクすることにより、プルダウン後のビーズからのPCR増幅により、5hmC含有DNAだけを検出できることが証明された(図5B)。この結果は、最終シーケンシングライブラリー中で確認され、5hmCスパイクインDNAにマッピングするリード数に、100倍以上の濃縮(エンリッチメント)を示した(図1B)。更に、当該アプローチは、cfDNAとバルクゲノムDNA(1μgの全血ゲノムDNA(gDNA))を使って同等に良好に実施した(図1B)。最終無細胞系5hmCライブラリーは、軽度にシーケンスした時(中央値15ミリオンリード長、〜0.5×ヒトゲノムカバレッジ)、0.75のメジアン(中央値)一意非重複マップレートを示して高度に複雑であるが(図5C〜5D、下表1参照)、技術的複製物(rep)は高度に再現性がある(図1E)。ポアソン(Poisson)ベース法を使って配列データ中の5hmC濃縮領域(hMR)を同定した。hMRsは技術的複製物と統合サンプルとの間で高度に一致している:統合サンプル中のhMRの75%超が複製物の各々と共通しており(図5F)、ChIP-SeqのENCODE標準の範囲に達する。これらの結果は、改変hMe-Seal法により、無細胞系5hmCが簡便にかつ高信頼性でプロファイルできることを実証した。
Claims (50)
- ヒドロキシメチル化された無細胞系DNA(cfDNA)をシーケンシングする方法であって、
cfDNAのサンプル中のヒドロキシメチル化されたDNA分子のみにアフィニティータグを付加し;
支持体に結合させることによって、前記アフィニティータグがタグ付けされたDNA分子を濃縮し;そして
前記濃縮されたDNA分子をシーケンシングすること
を含む、方法。 - 前記方法が、
(a)cfDNAの末端にアダプター配列を付加し;
(b)アダプター連結されたcfDNAを、DNA β−グルコシルトランスフェラーゼと、化学選択性基で修飾されたUDPグルコースと共にインキュベートし、それにより前記cfDNA中のヒドロキシメチル化DNA分子を前記化学選択性基で共有結合的に標識し;
(c)環付加反応を介して、前記化学選択的に修飾されたcfDNAにビオチン成分を連結させ;
(d)工程(c)の生成物を、ビオチンに結合する支持体に結合させることにより、ビオチン化されたDNA分子を濃縮し;
(e)前記濃縮されたDNAを、前記アダプターに結合するプライマーを使って増幅し;そして
(f)増幅されたDNAをシーケンシングし、複数の配列リードを生成させること
を含む、請求項1記載の方法。 - 前記方法が、工程(d)の後であって、工程(e)の前に、前記ビオチン化されたDNA分子を支持体から遊離させることを含まない、請求項2記載の方法。
- 前記工程(e)が、
i.前記ビオチン化されたDNA分子を支持体に結合させた後の(d)の支持体を洗浄し;その後、
ii.前記ビオチン化されたDNA分子を前記支持体から遊離させることなく、前記支持体を含む増幅反応をセットアップすることを含む、請求項3記載の方法。 - 前記アダプター配列を付加する工程(a)が、前記cfDNAの末端にY型アダプターまたはヘアピン型アダプターを連結させることを含む、請求項2〜4のいずれか一項記載の方法。
- 前記付加環化反応が、アジド基とアルキニル基との間で起こる、請求項2〜5のいずれか一項記載の方法。
- 前記工程(b)の化学選択性基で修飾されたUDPグルコースが、UDP−6−N3−Gluである、請求項2〜6のいずれか一項記載の方法。
- 前記工程(c)のビオチン成分が、ジベンゾシクロオクチン修飾ビオチンである、請求項2〜7のいずれか一項記載の方法。
- 前記工程(b)のDNA β−グルコシルトランスフェラーゼが、T4 DNA β−グルコシルトランスフェラーゼである、請求項2〜8のいずれか一項記載の方法。
- 前記工程(c)のビオチン成分がビオチンを含む、請求項2〜9のいずれか一項記載の方法。
- 前記工程(d)のビオチンに結合する支持体が、ストレプトアビジンビーズを含む、請求項2〜10のいずれか一項記載の方法。
- 前記ビーズが磁気ビーズである、請求項11記載の方法。
- cfDNA中のどの配列がヒドロキシメチル化されているかを定量的に測定する、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
- 表現型と相関するヒドロキシメチル化パターンを同定する方法であって、
(a)複数のcfDNAサンプルに対して請求項1〜13のいずれか一項記載の方法を実行し、ここで前記cfDNAサンプルが既知の表現型を有する患者から単離され、それにより前記患者の各々からのcfDNA中のどの配列がヒドロキシメチル化されているかを決定し;そして
(b)前記表現型と相関するヒドロキシメチル化シグネチャーを同定すること
を含む、方法。 - 前記表現型が疾病、状態または臨床転帰である、請求項14記載の方法。
- 前記ヒドロキシメチル化シグネチャーが診断、予後診断または治療のシグネチャーである、請求項14記載の方法。
- サンプル分析の方法であって、
(a)請求項1〜13のいずれか一項記載の方法を使って、患者のcfDNA中のヒドロキシメチル化されている配列を同定し;
(b)前記工程(a)において同定された配列を、ある表現型と相関するシグネチャー配列のセットと比較し;
(c)前記表現型との相関を示すレポートを提供すること
を含む、方法。 - 前記(b)の比較の結果に基づいて、診断または予後診断を行うこと、あるいは治療法を推奨することを更に含む、請求項17記載の方法。
- サンプル分析の方法であって、
(a)請求項1〜13のいずれか一項記載の方法を使って、cfDNAの第一サンプル中のどの配列がヒドロキシメチル化されるか、およびcfDNAの第二サンプル中のどの配列がヒドロキシメチル化されるかを決定し、ここで前記cfDNAの第一サンプルと第二サンプルが2つの異なる時点で同一被験体より得られ;そして、
(b)前記第一サンプルについてのヒドロキシメチル化パターンを前記第二サンプルについてのヒドロキシメチル化パターンと比較し、ヒドロキシメチル化に経時変化が見られたかどうかを測定すること
を含む、方法。 - 前記測定工程(a)が定量的である、請求項19記載の方法。
- 前記比較工程(b)が、1または複数の特定の配列のヒドロキシメチル化レベルを比較することを含む、請求項20記載の方法。
- 前記(b)の比較が、疾病、状態の過程または疾病もしくは状態の治療の過程におけるヒドロキシメチル化の変化のマップをもたらす、請求項19記載の方法。
- 循環無細胞系DNAを含む組成物であって、該DNA中のヒドロキシメチルシトシン残基が捕捉タグを含むように修飾されている、組成物。
- 前記循環無細胞系DNAが二本鎖形である、請求項23記載の組成物。
- 前記捕捉タグがビオチン成分である、請求項23又は24記載の組成物。
- 前記捕捉タグが化学選択性基である、請求項23又は24記載の組成物。
- β−グルコシルトランスフェラーゼと、化学選択性基で修飾されたUDPグルコースとを更に含む、請求項23〜26のいずれか一項記載の組成物。
- 前記無細胞系ヒドロキシメチル化DNAが、アダプター連結されている、請求項23〜27のいずれか一項記載の組成物。
- 前記組成物中の核酸分子の少なくとも10%が、捕捉タグを含むように修飾されている1以上のヒドロキシメチルシトシンを含有する、請求項23〜28のいずれか一項記載の組成物。
- 前記組成物が支持体を更に含み、前記支持体と循環無細胞系DNAが捕捉タグを介して互いに連結されている、請求項23〜29のいずれか一項記載の組成物。
- PCRにより作製された無細胞系ヒドロキシメチル化DNAのコピーを更に含む、請求項29記載の組成物。
- 前記支持体と前記無細胞系DNAが共有結合を介して互いに連結される、請求項30または31記載の組成物。
- 前記支持体と前記循環無細胞系DNAが非共有結合により互いに連結される、請求項30または31記載の組成物。
- 前記支持体がストレプトアビジンに連結されており、そして前記捕捉剤がビオチンである、請求項31記載の組成物。
- (a)循環無細胞系DNAを含むサンプルを収得し;
(b)前記サンプル中のヒドロキシメチル化DNAを濃縮し;そして
(c)1以上の標的遺伝子座の各々にマッピングされる前記濃縮ヒドロキシメチル化DNA中の核酸の量を個別に定量すること
を含む、方法。 - (d)前記濃縮ヒドロキシメチル化DNA中の1以上の核酸配列が、前記濃縮ヒドロキシメチル化DNA中に増加提示されるか、または減少提示されるかを決定すること
を更に含む、方法。 - (e)前記濃縮ヒドロキシメチル化DNA中に過剰提示または減少提示されている核酸の素性に基づいた結果に関して、診断、治療法決定または予後診断を行うこと
を更に含む、請求項36記載の方法。 - 前記診断、治療法決定または予後診断が癌診断である、請求項37記載の方法。
- 前記標的遺伝子座が、次の遺伝子本体の1つまたは複数を含む、請求項35〜38のいずれか一項記載の方法:
ABRACL、ADAMTS4、AGFG2、ALDH1A3、ALG10B、AMOTL1、APCDD1L-AS1、ARL6IP6、ASF1B、ATP6V0A2、AUNIP、BAGE、C2orf62、C8orf22、CALCB、CC2D1B、CCDC33、CCNL2、CLDN15、COMMD6、CPLX2、CRP、CTRC、DACH1、DAZL、DDX11L1、DHRS3、DUSP26、DUSP28、EPN3、EPPIN-WFDC6、ETAA1、FAM96A、FENDRR、FLJ16779、FLJ31813、GBX1、GLP2R、GMCL1P1、GNPDA2、GPR26、GSTP1、HMOX2、HOXC5、IGSF9B、INSC、INSL4、IRF7、KIF16B、KIF20B、LARS、LDHD、LHX5、LINC00158、LINC00304、LOC100128946、LOC100131234、LOC100132287、LOC100506963、LOC100507250、LOC100507410、LOC255411、LOC729737、MAFF、NPAS4、NRADDP、P2RX2、PAIP1、PAX1、PODXL2、POU4F3、PSMG1、PTPN2、RAG1、RBM14-RBM4、RDH11、RFPL3、RNF122、RNF223、RNF34、SAMD11、SHISA2、SIGLEC10、SLAMF7、SLC25A46、SLC25A47、SLC9A3R2、SORD、SOX18、SPATA31E1、SSR2、STXBP3、SYT11、SYT2、TCEA3、THAP7-AS1、TMEM168、TMEM65、TMX2、TPM4、TPO、TRAM1、TTC24、UBQLN4、WASH7P、ZNF284、ZNF423、ZNF444、ZNF800、ZNF850、及び ZRANB2。 - 前記標的遺伝子座が、hg19参照ゲノム中の次の領域1つまたは複数を含む、請求項35〜39のいずれか一項記載の方法:
chr1:114670001-114672000、chr1:169422001-169424000、chr1:198222001-198224000、chr1:239846001-239848000、chr1:24806001-24808000、chr1:3234001-3236000、chr1:37824001-37826000、chr1:59248001-59250000、chr1:63972001-63974000、chr1:67584001-67586000、chr1:77664001-77666000、chr2:133888001-133890000、chr2:137676001-137678000、chr2:154460001-154462000、chr2:200922001-200924000、chr2:213134001-213136000、chr2:219148001-219150000、chr2:41780001-41782000、chr2:49900001-49902000、chr3:107894001-107896000、chr3:108506001-108508000、chr3:137070001-137072000、chr3:17352001-17354000、chr3:23318001-23320000、chr3:87312001-87314000、chr3:93728001-93730000、chr4:39342001-39344000、chr4:90790001-90792000、chr5:103492001-103494000、chr5:39530001-39532000、chr5:83076001-83078000、chr6:122406001-122408000、chr6:129198001-129200000、chr6:156800001-156802000、chr6:157286001-157288000、chr6:45304001-45306000、chr7:11020001-11022000、chr7:13364001-13366000、chr8:42934001-42936000、chr8:53686001-53688000、chr8:69672001-69674000、chr9:3496001-3498000、及びchr9:88044001-88046000。 - 前記癌診断が癌の組織型の表示を含む、請求項38〜40のいずれか一項記載の方法。
- 前記工程(c)が、シーケンシング、デジタルPCRまたはアレイへのハイブリダイゼーションを含む、請求項35〜41のいずれか一項記載の方法。
- 前記決定工程がコントロールと比較して実施され、ここで前記コントロールが、
濃縮されたヒドロキシメチル化DNA;
(a)のサンプル;
工程(b)においてヒドロキシメチル化されたDNAを除去した後の、(a)のサンプル;または、
他のサンプル
の中の1つ以上のコントロール配列を含む、請求項35〜42のいずれか一項記載の方法。 - サンプル分析の方法であって、
cfDNAのサンプル中の1以上のヒドロキシメチルシトシンヌクレオチドおよびメチルシトシンヌクレオチドを含むDNA分子に標識を取り付け、ここで前記ヒドロキシメチルシトシンヌクレオチドが第一のフルオロフォアで標識され、そして前記メチルシトシンヌクレオチドが第一の標識から識別可能な第二のフルオロフォアで標識され、それにより標識されたサンプルを生成させ;そして、
前記標識されたサンプルを、表10A、10B、11Aおよび11Bの遺伝子または領域に対する少なくとも1つのプローブを含むアレイにハイブリダイズさせること
を含む、方法。 - 前記アレイがトップ鎖プローブとボトム鎖プローブを含む、請求項44記載の方法。
- サンプル分析の方法であって、
cfDNAのサンプル中の1以上のヒドロキシメチルシトシンヌクレオチドおよびメチルシトシンヌクレオチドを含むDNA分子に標識を取り付け、ここで前記ヒドロキシメチルシトシンヌクレオチドが第一の捕捉タグで標識され、そして、前記メチルシトシンヌクレオチドが第一の捕捉タグとは異なる第二の捕捉タグで標識され、それにより標識されたサンプルを生成させ;そして、
前記標識されているDNA分子を濃縮し;そして、
前記濃縮されたDNA分子をシーケンシングすること
を含む、方法。 - 1つ以上のヒドロキシメチルシトシンヌクレオチドを含むDNA分子と、1つ以上のメチルシトシンヌクレオチドを含むDNA分子とを別々に濃縮することを含む、請求項46記載の方法。
- cfDNAを解析するためのキットであって、
DNA β−グルコシルトランスフェラーゼと;
化学選択性基で修飾されたUDPグルコースと;
分子バーコードを含むアダプターと
を含む、キット。 - 前記アダプターがY型アダプターまたはヘアピン型アダプターである、請求項48記載のキット。
- ビオチン成分を更に含み、前記ビオチン成分が前記化学選択性基と反応性である、請求項48または49記載のキット。
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