JP2019518436A - セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統によりアブラナ科野菜の素材及び品種を選抜育種する方法 - Google Patents
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Abstract
本願は、セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統によりアブラナ科野菜の品種を選抜育種する方法であって、１）アブラナ科野菜の資源を収集し、鑑定及び分類してから、誘導系統の播種時期を調節して開花期との一致を保証し、２）誘導系統でアブラナ科野菜を授粉し、３）袋掛けして近親交配させるか、或いは、つぼみ期につぼみを開いて強制的に近親交配させ、４）株系統の安定性鑑定を実施し、５）安定株系統と不稔系統を検定交雑し、６）検定交雑後代の不稔性度合を調査して優良維持系統を選抜育種し、７）誘導系統で検定交雑後代の不稔性株を授粉し、８）誘導後代の繁殖可能性を調査して、引き続き誘導系統で不稔性単一株を授粉することで新たな不稔系統を選抜育種し、９）不稔系統と維持系統を検定交雑して交雑の新たな組み合わせを選抜育種する方法を提供する。【選抜図】図１
Description
本発明は農業に関し、特に、アブラナ科野菜における交雑新品種の選抜育種、及び、不稔系統、維持系統を迅速に選抜育種する方法に関する。
アブラナ科野菜は中国における代表的な冬野菜の一つである。また、中国における冬野菜の主な摂取源でもあり、主として、キャベツ、カリフラワー（ハナヤサイ）、ハクサイ（大白菜、小白菜）、ダイコン、カラシナ系アブラナ科野菜（チンゲン菜、ザーサイ、ダイトウサイ、カイラン等）を含む。現在、アブラナ科野菜は基本的に交雑品種の選抜育種が実現されており、雑種強勢手段として細胞質不稔タイプが主に用いられている。キャベツ、カリフラワー（ハナヤサイ）、ダイコンについては主にダイコンの細胞質不稔タイプを、その他のアブラナ科野菜については主に細胞質不稔を用いて交雑品種を選抜育種している。アブラナ科野菜は栄養体の取得が主たる目的のため、品種の選抜育種においては主に不稔系統と維持系統の選抜育種が最重要目的となり、回復系統は必要とされない。そして、新たな維持系統と不稔系統を検定交雑することで良好な交雑の組み合わせ又は新品種の選抜育種が可能となる。
アブラナ科野菜の新品種を選抜育種する場合には、まず新たな近交系統又は遺伝的に安定したホモ接合株系統――ホモ接合系統（近交系統）を選抜育種する。次に、ホモ接合株系統と細胞質不稔系統を検定交雑し、回復と維持の関係を判断する。維持系統の場合には不稔系統と交雑して新たな交雑品種を検定交雑するか、或いは、当該維持系統を用いて多世代の戻し交配を行い、当該維持系統の特性を有する不稔系統を選抜育種する。そして、新たな不稔系統と複数の維持系統を検定交雑すれば、良好な組み合わせ又は品種を選抜育種可能となる。一方、ホモ接合株系統と不稔系統を検定交雑した結果、検定交雑後代が回復系統でも維持系統でもない場合、通常は淘汰するか、次の維持系統に進んで選抜育種を行う。アブラナ科野菜の交雑化普及を実現すべく、現在選抜育種されているホモ接合近交系統は回復効率を有しつつも、生産的には品種の選抜育種に利用可能である。しかし、資源保護の観点から、育種者はより維持系統の選抜育種を志向する傾向にある。
一般的なアブラナ科野菜の近交系統の選抜育種では、２つ又は複数の遺伝的背景の異なる系統を交雑、収束交雑（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ｃｒｏｓｓ）、又は戻し交配することで交雑Ｆ１世代（或いは、戻し交配ＢＣ１世代。目的形質の選抜要求に応じて多世代戻し交配によりＢＣ２、ＢＣ３…等を形成可能）を形成する。戻し交配の後代又はＦ１世代は近親交配によりＦ２世代を形成し、Ｆ２世代が更に優良単一株を選抜して近親交配によりＦ３世代を形成する。そして、Ｆ３が更に単一株を選抜して近親交配する、というように、Ｆ５〜Ｆ６世代となってようやく安定的なアブラナ科野菜の新系統を取得可能となる。よって、１世代あたり１年と計算すると、およそ６〜７年の期間が必要とされる。また、安定的な近交系統を更に不稔系統と検定交雑し、多世代の戻し交配により新たな不稔系統を選抜育種するには５〜６世代の戻し交配が必要となる。そのため、一般的な手段でアブラナ科野菜の２系統による新品種の選抜育種を実現するには、１０〜１２年ほどの期間を要し、交雑の新たな組み合わせ又は新品種の選抜育種効率は大変低い。
現在のところ、アブラナ科野菜については、誘導系統又は倍加半数体誘導系統に関する報告は上がっていない。いわゆる「誘導系統」とは、当該植物を雄株とし、その花粉によって同種の株を授粉することで、同種の株（雌株）における半数体、倍加半数体（ＤＨ系統）等の発生といった相応の反応を誘導可能なものをいう。植物のうち、誘導系統を用いて新品種の選抜育種を行っているものとしてはトウモロコシが最も多いが、トウモロコシの誘導系統は半数体誘導系統に限られている。最も初期のトウモロコシの半数体誘導系統はｓｔｏｃｋ６であるが、当該誘導系統はトウモロコシの半数体の発生を誘導することしかできない。そこで、半数体株を人為的に染色体倍加することでホモ接合二倍体（倍加半数体）を形成するが、誘導効率が低く、一般的には１０％以下の誘導効率となる（収穫種子から取得した半数体数で計算）。
本発明は、迅速且つ効果的にアブラナ科野菜の育種素材及び品種を選抜育種する方法を提供することを目的とする。当該方法では、わずか３世代（２年又は３年）でアブラナ科野菜の遺伝的に安定した株系統が得られるため、アブラナ科野菜の育種素材や交雑品種の選抜育種効率と的確性が向上する。
本発明の目的は、以下のように実現される。
本発明におけるセイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統によりアブラナ科野菜の素材及び品種を選抜育種する方法は、１）アブラナ科野菜の育種資源を収集するとともに、耐病性、ストレス耐性、農業形質、収量特性、品質特性等を含む資源素材の特性を鑑定し、収集源が異なり、農業形質と遺伝的差異の大きな資源素材を分類のうえ番号を振り、開花時期を調査してから、開花時期に基づいて、セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統の播種を遅らせ、通常は、翌年のキャベツ、ハクサイ、ダイコン、カリフラワー等のアブラナ科野菜の開花期と一致するように、セイヨウアブラナの倍加半数体の播種時期を前年の１０月２０日〜１１月５日の間とするステップと、２）前記ステップ１）で優良と鑑定され、且つ遺伝的に不安定な資源素材を開花初期において人為的に除雄し（不稔性の資源を直接授粉可能とする）とともに袋掛けにより隔離し、２〜４日後にセイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統で授粉するとともに、単一株を袋掛けして誘導後代を収穫するステップと、３）前記ステップ２）で収穫した誘導後代を植栽し、実生期にフローサイトメーターで誘導後代の倍数性を鑑定して、倍数体、半数体、及びセイヨウアブラナの特性を有する株を淘汰し、繁殖可能性が正常で且つ倍数性が正常な単一株を選抜して袋掛けし、近親交配させるか、或いは、つぼみ期につぼみを開いて強制的に近親交配させるステップと、４）前記ステップ３）の誘導後代のうち正常な近親交配後代について株系統を植栽し、株系統内での安定性と一致性を鑑定するとともに、分子マーカー（ＳＳＲ又はＳＲＡＰ）で株系統内での一致性を鑑定し、安定株系統を雄株とし、安定細胞質不稔系統（ダイコンの細胞質不稔等の細胞質不稔タイプ）を雌株として検定交雑し、検定交雑後代の種子を収穫するステップと、５）前記ステップ４）における検定交雑の種子を植栽し、検定交雑後代の繁殖可能性を鑑定して、検定交雑後代が完全不稔の場合には、ステップ４）の雄株は当該不稔性タイプの維持系統であるとみなして当該維持系統の近親交配結実率を鑑定し、検定交雑後代が完全可稔の場合には、ステップ４）の雄株は当該不稔性タイプの回復系統であるため、対応する回復系統を淘汰し、検定交雑後代が完全な不稔性でない場合には（半回復・半維持）、ステップ４）の雄株は回復系統でも維持系統でもないため、淘汰するか、交雑して新たな維持系統を育成するステップと、６）前記ステップ５）で選抜育種した維持系統と同タイプの不稔系統とを検定交雑し、収量、品質、耐病性を特性として有する新たな交雑の組み合わせ又は品種を選抜育種するステップと、７）前記ステップ５）で選抜育種した維持系統と同タイプの不稔系統とを検定交雑した後、検定交雑後代の農業形質に基づいて、当該維持系統で検定交雑後代を戻し交配又は多世代戻し交配或いは１世代検定交雑し、セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統を用いて、検定交雑、戻し交配又は多世代戻し交配した不稔性株の単一株を授粉するとともに、袋掛けにより隔離するステップと、８）前記ステップ７）で収穫した単一株の種子を植栽し、開花期に繁殖可能性を鑑定して、不稔性の単一株を引き続きセイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統で授粉し、誘導するとともに、単一株を袋掛けにより隔離して単一株を収穫するステップと、９）前記ステップ８）で２回誘導された不稔性の単一株後代について、農業形質、分子マーカー（ＳＳＲ又はＳＲＡＰ）により株系統内での安定性及び一致性を鑑定するとともに、農業形質が一致しており、且つ株系統内で安定的な不稔性株系統について新たなアブラナ科野菜の細胞質不稔系統を形成し、セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統を用いて当該不稔性株系統につき３回目の誘導、授粉を行い、誘導効率を鑑定するステップと、１０）前記ステップ９）における３回目の誘導後代について、当該不稔性株系統に対する誘導系統の誘導能力を鑑定し、３回目の誘導後代株系統内の農業形質及び不稔性が高度に一致しており、且つ、誘導能力が９８％以上（株系統内の農業形質、高度不稔性株が全誘導後代に占める割合）である場合、最後に、新たに形成された不稔性株系統（又は安定不稔系統）の遺伝的特性及び不稔状態を、セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統を用いて維持するステップと、１１）前記ステップ８）において２回の誘導を経て形成された不稔性株系統を、セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統で授粉してその不稔状態を維持し、当該不稔性株系統（又は安定不稔系統）の遺伝的特性はセイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統と無関係であり、当該不稔性株系統は、前記ステップ７）の維持系統（暫定維持系統）の形質特性を有しているが、当該維持系統（暫定維持系統）とは一定の遺伝的差異があるか、或いは、維持系統（暫定維持系統）の核遺伝子を５０〜９９％含んでおり、維持系統（暫定維持系統）の核遺伝子をどの程度含むかは、維持系統（暫定維持系統）と不稔性単一株との戻し交配の世代数により決定され、維持系統（暫定維持系統）の核遺伝子を異なる程度含むだけでなく、更にステップ４）の安定細胞質不稔系統の核遺伝子も含むステップと、１２）前記ステップ９）で形成した遺伝的差異の異なる（又は遺伝的背景の異なる）細胞質不稔系統（安定不稔系統）について、細胞質不稔系統に対するセイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統の誘導能力（９８％超）に基づいて、同一の維持系統（セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統）でこれを維持可能であり、セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統は細胞質不稔系統の万能維持系統となり、且つ、１つの維持系統で複数の遺伝的安定及び異なる遺伝的背景を有する細胞質不稔系統を維持するステップと、１３）ステップ１）の異なる収集源、農業形質及び遺伝的差異の素材特性と対応する収集源とに基づいて誘導された安定的な維持系統と、ステップ１２）で形成した安定的な新たな不稔系統を検定交雑することで、収量潜在力、耐病性、ストレス耐性を有する新たなアブラナ科野菜の品種を選抜育種し、アブラナ科野菜の２系統による交雑新品種の選抜育種を実現するステップと、を含む。
本発明で取得したアブラナ科野菜の遺伝的に安定した後代を用い、セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統を適用すれば、雌株によるＦ１世代での単為生殖を誘導可能となり、Ｆ２世代に安定した倍加半数体の個体が形成される。また、Ｆ３世代について安定性及び一致性鑑定を行った結果、遺伝的に安定した後代を取得可能であった。
前記セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統の選抜育種方法は、（１）単為生殖性を遺伝的特性として有する初期世代安定系統を選抜育種するステップであって、１）２つのセイヨウアブラナの親素材を交雑したＦ１世代の種子を、培地において染色体倍加誘導剤により人為的に染色体倍加することで、倍加したＦ１世代の株を取得し、２）倍加したＦ１世代の株を近親交配又は強制的近親交配してＦ２世代を取得し、Ｆ２世代を畑に植栽して観察するとともに、各単一株の繁殖可能性を鑑定し、可稔性後代を選抜して近親交配によりＦ３世代を取得し、Ｆ３世代についてホモ接合性を鑑定するとともに、形態、細胞学及び分子マーカーによる鑑定を実施し、後代のＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応により増幅させ、各特異プライマーによる増幅下での単一株のＤＮＡバンドタイプ及びバンド数を電気泳動により観察し、各単一株がいずれも２つの親の交雑後代であることが示されるとともに、各単一株同士の分子マーカーチャートが一致している場合、これらの単一株はホモ接合系統――初期世代安定系統であることを意味し、３）取得した初期世代安定系統を少なくとも１０個のセイヨウアブラナにおける通常のホモ接合安定系統と正逆交雑し、Ｆ１世代、Ｆ２世代について初期世代安定系統の遺伝的特性である単為生殖特性の有無を鑑定するとともに、前記正逆交雑においてＦ１に分離が見られ、Ｆ２世代に部分的な安定株系統が出現した場合には、対応する初期世代安定系統が単為生殖性を遺伝的特性として有する初期世代安定系統であるステップと、（２）優性遺伝形質を備え、且つ単為生殖特性を有するとともに倍数性が遺伝的に安定している倍数体セイヨウアブラナを選抜育種するステップであって、１）単為生殖性を遺伝的特性として有する初期世代安定系統と優性形質を備えるセイヨウアブラナとを交雑することで（例えば、優性の矮性、紫葉、花葉、黄葉、高エルカ酸等の形質）交雑Ｆ１世代の種子を取得し、交雑Ｆ１の種子を培地において染色体倍加誘導剤により人為的に染色体倍加することで、倍加した優性形質を備えるＦ１株を取得し、２）倍加した優性形質を備えるＦ１株について、マイクロ顕微鏡で観察するか、或いは、フローサイトメーターで染色体の倍数性鑑定を実施し、優性形質を備える倍数体株を選抜するとともに、異常な倍加株、異数体株、及び優性形質を備えない倍加株を淘汰し、優性形質を備える倍数体株とは、主に倍数性が遺伝的に安定しており、結実性が良好で、単為生殖性を遺伝的特性として有し、優性形質（例えば、優性の矮性、紫葉、花葉、黄葉、高エルカ酸等の形質）を備える六倍体又は八倍体のセイヨウアブラナ株であるステップと、（３）セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統の鑑定及び誘導能力測定を行うステップであって、１）倍数性が遺伝的に安定しており、単為生殖性を遺伝的特性として有し、優性形質を備えた倍数体株における優性形質によって、検定交雑後代に発生する交雑株を除去可能であり、検定交雑後代に優性形質株又は異数体株が出現した場合には、当該株が倍数体株と雌株との交雑により発生したことを意味するため当該株を除去し、２）前記単一株の検定交雑後代に、完全不稔で正常な倍数性である二倍体又は四倍体のセイヨウアブラナであって、且つ優性形質を持たないものが出現した場合には、当該検定交雑後代に対応する雄株の遺伝子が検定交雑後代に入っていないことを意味するため、優性の倍数体株をセイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統とするステップ、を含む。
前記セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統による選抜育種では、２つの親素材を交雑したＦ１世代の種子、又は、単為生殖性を遺伝的特性として有する初期世代安定系統と優性形質を備えるセイヨウアブラナとを交雑することで取得した交雑Ｆ１世代の種子を、培地において染色体倍加誘導剤により人為的に染色体倍加するが、その具体的方法として、１）純度７５％のアルコールで種子の表面を２５〜４０秒間消毒し、０．１％の昇汞で１２〜１７分間消毒した後、滅菌水で種子表面の昇汞を洗い流し、滅菌紙で種子表面の水分を拭き取ってから、種子を第１培地に播種し、２）第１培地で種子を発根及び発芽させ、培養条件を、温度２３〜２５℃、昼光照射１２〜１６時間、照射強度２０００〜３０００ルクス、夜間暗所培養８〜１２時間とし、成葉が１〜２枚育ってから株を下胚軸から切り取り、第２培地で引き続き成長させ、３）続いて、切り取った株を第２培地に挿入して培養を続け、側芽が分化してから、側芽と株を第３培地に移して発根培養し、４）発根培養から２週間後、株から太い根が伸びた後に株を室温で３〜７日間育苗して取り出し、株上の培地を水道水で洗い流して緩衝液に１５〜３０分間浸漬してから温室に移植し、９５％以上の移植生育率を保証可能となるよう、温室は温度１６〜２５℃、相対湿度６０〜８０％とする。
前記第１培地は以下の成分比率で構成する。
ＭＳ培地 １Ｌ
６−ベンジルアミノプリン ０．５〜１．５ｍｇ
染色体倍加誘導剤 ３０〜７０ｍｇ
ショ糖 ２０〜３０ｇ
寒天 ８〜１０ｇ
第１培地はｐＨ＝５．８〜６．０である。
ＭＳ培地 １Ｌ
６−ベンジルアミノプリン ０．５〜１．５ｍｇ
染色体倍加誘導剤 ３０〜７０ｍｇ
ショ糖 ２０〜３０ｇ
寒天 ８〜１０ｇ
第１培地はｐＨ＝５．８〜６．０である。
前記第２培地は以下の成分比率で構成する。
ＭＳ培地 １Ｌ
６−ベンジルアミノプリン ０．５〜１ｍｇ
染色体倍加誘導剤 ２０〜４０ｍｇ
ショ糖 ２０〜３０ｇ
寒天 ８〜１０ｇ
第２培地はｐＨ＝５．８〜６．０である。
ＭＳ培地 １Ｌ
６−ベンジルアミノプリン ０．５〜１ｍｇ
染色体倍加誘導剤 ２０〜４０ｍｇ
ショ糖 ２０〜３０ｇ
寒天 ８〜１０ｇ
第２培地はｐＨ＝５．８〜６．０である。
前記第３培地は以下の成分比率で構成する。
ＭＳ培地 １Ｌ
１−ナフチル酢酸 ０．０３〜０．５ｍｇ
染色体倍加誘導剤 ５〜２０ｍｇ
ショ糖 ２０〜３０ｇ
寒天 ８〜１０ｇ
第３培地はｐＨ＝５．８〜６．０である。
ＭＳ培地 １Ｌ
１−ナフチル酢酸 ０．０３〜０．５ｍｇ
染色体倍加誘導剤 ５〜２０ｍｇ
ショ糖 ２０〜３０ｇ
寒天 ８〜１０ｇ
第３培地はｐＨ＝５．８〜６．０である。
前記の浸漬用緩衝液の成分比率は以下の成分比率で構成する。
水 １Ｌ
ファモキサドン又はシモキサニル ０．６〜１．２ｇ
１−ナフチル酢酸 ０．５〜１ｍｇ
水 １Ｌ
ファモキサドン又はシモキサニル ０．６〜１．２ｇ
１−ナフチル酢酸 ０．５〜１ｍｇ
セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統は、セイヨウアブラナとアブラナ科野菜について倍加半数体後代の発生を直接誘導可能であり、人為的な染色体倍加によってホモ接合系統を取得する必要がない。且つ、誘導効率が高く、最高で１００％、一般的な誘導効率は５０％以上である。倍加半数体誘導系統が雌株における倍加半数体の発生を誘導する主な原理は次の通りである。誘導系統は、大胞子生殖細胞（卵細胞）に単為生殖効果が発生し、且つ、卵細胞が染色体倍加を実施可能となるよう雌株を誘導することができる。即ち、卵細胞の単為生殖により発生する後代は倍加半数体となるが、このような現象が発生するメカニズムについては現在のところ明らかになっていない。
前記染色体倍加誘導剤として、コルヒチン、トリフルラリン、オリザリンのうちの少なくとも１つを用いる。
前記セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統（六倍体又は八倍体株）の基本原理として、誘導系統は単為生殖誘導遺伝子を有している。誘導系統を雄株とする場合、誘導系統の染色体（又は遺伝子）は雌株の染色体とは融合せず、雌株（即ち、卵細胞、二倍体）を誘導して単為生殖効果を発生させる。且つ、雌株の卵細胞染色体自体が倍加して倍加半数体を形成する。
本発明の方法によれば、アブラナ科野菜の育種素材における近交系統（ＤＨ系統）、維持系統、新たな細胞質不稔系統の迅速な選抜育種が可能となる。よって、２年又は３世代という期間内に上記素材を取得可能となり、アブラナ科野菜の育種期間が大幅に短縮されるため、育種効率が向上する。
本発明の方法は以下の利点を有する。
１．本発明の方法によれば、アブラナ科野菜の近交系統（維持系統）を迅速に選抜育種可能となり、最速３年で遺伝的に安定した近交系統（維持系統）を取得可能となる。また、新たな不稔系統についても迅速な選抜育種が可能であり、最速４年で安定的な不稔系統が取得される。また、５〜７年という期間内にアブラナ科野菜の２系統による新品種の選抜育種が実現され、アブラナ科野菜の選抜育種周期が１周期半以上短縮される。よって、アブラナ科野菜の新品種の選抜育種効率が向上し、労働力と物資の節約となる。
２．本発明の方法はアブラナ科野菜全般に応用可能であり、応用領域が広い。
３．セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統は、雌株における倍加半数体の発生を直接誘導するため、人為的な染色体倍加の必要がなく、更に安定した後代を形成可能となる。
４．本発明の方法はアブラナ科野菜の交雑品種の選抜育種に適用可能であり、特に、アブラナ科野菜の細胞質不稔系統素材の選抜育種、例えば、ダイコンの細胞質不稔、核・細胞質相互作用性の細胞質不稔系統、維持系統の選抜育種に適用される。
図１、図２、図５、図７を参照する。多年草であるキャベツ資源を畑に植え、形質を観察したところ、甘３３６は外観形状、豊作性、耐病性に優れるが、群内において不安定であり、遺伝的分離が見られることがわかった。前年秋の８月中旬に播種、９月中旬に定植、１２月下旬に栄養成長に伴い再定植し、１年目の３月末の開花初期に甘３３６を人為的に除雄して袋掛けにより隔離した。除雄３日後、セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統Ｙ３３８０で誘導授粉し、袋掛けして隔離した。同年８月に誘導後代を畑に播種したところ、後代２５株は外形がキャベツと１００％一致していた。且つ、フローサイトメトリーで倍数性を鑑定したところ、いずれも二倍体であることがわかった。２年目の開花期に誘導後代である単一株のつぼみを開き、強制的に近親交配させて袋掛けにより隔離した。これにより、単一株から１８株が収穫された。３年目に誘導後代の株系統を鑑定したところ、１８株の株系統は全て一致していたが、各株系統間には部分的な差が存在することがわかった。１８個の株系統とキャベツの不稔系統（ダイコンの細胞質不稔）である蓉蘿Ａ０１９を検定交雑したところ、１８個の安定株系統の検定交雑後代はいずれも高度不稔となり、１８個の安定株系統は不稔系統に対していずれも維持系統であった。形態観察及び収量調査の結果、０１２株系統が収量に優れ、耐病性であり、且つストレス耐性がより良好であったため、最後に、キャベツダイコンの細胞質不稔系統と直接組み合わせることで新品種を選抜育種可能な蓉甘Ｂ０１２の維持系統を形成した。
本実施例において、セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統は以下の方法で取得した。
図２、図４、図６、図７、図１３を参照する。出願人が取得したキャベツ型セイヨウアブラナの四倍体初期世代安定系統Ｐ３−２を２０個のホモ接合キャベツ型四倍体セイヨウアブラナと正逆交雑したところ、３つの正逆交雑Ｆ１世代において分離が見られた。また、これら３つの組み合わせのＦ２世代に安定株系統が出現したことから、Ｐ３−２が単為生殖性を遺伝的特性として有することが示された。Ｐ３−２と高エルカ酸・矮性セイヨウアブラナ４２４７を正逆交雑し（矮性・高エルカ酸は優性形質）、交雑Ｆ１世代の種子を染色体倍加した。そして、倍加した後代についてフローサイトメーターによる鑑定又は根端顕微鏡による観察・鑑定を行ったところ、矮性の八倍体株であることが示された。そこで、当該株をＹ３５６０と命名した。
図２、図５、図６、図１０、図１１、図１２を参照する。出願人が取得したキャベツ型セイヨウアブラナの四倍体初期世代安定系統Ｐ３−２を２０個のホモ接合キャベツ型四倍体セイヨウアブラナと正逆交雑したところ、３つの正逆交雑Ｆ１世代において分離が見られた。また、これら３つの組み合わせのＦ２世代に安定株系統が出現したことから、Ｐ３−２が単為生殖性を遺伝的特性として有することが示された。Ｐ３−２と四倍体キャベツ型矮性セイヨウアブラナＤ３−５を正逆交雑し（矮性は優性形質）、交雑Ｆ１世代の種子を染色体倍加した。そして、倍加した後代についてフローサイトメーターによる鑑定又は根端顕微鏡による観察・鑑定を行ったところ、矮性の八倍体株であることが示された。そこで、当該株をＹ３３８０と命名した。
本実施例では、Ｐ３−２と矮性セイヨウアブラナＤ３−５との交雑Ｆ１及びＰ３−２と矮性・高エルカ酸セイヨウアブラナ４２４７との交雑Ｆ１の種子を、培地においてコルヒチンにより人為的に染色体倍加した。具体的な方法は以下の通りである。
１）純度７５％のアルコールで種子の表面を２５秒間消毒し、０．１％の昇汞で１２分間消毒した。続いて、滅菌水で種子表面の昇汞を洗い流し、滅菌紙で種子表面の水分を拭き取ってから、種子を第１培地（染色体倍加誘導培地）に播種した。
２）第１培地で種子を発根及び発芽させた。培養条件としては、温度２５℃、昼光照射１６時間、照射強度２０００ルクス、夜間暗所培養８時間とし、成葉が１〜２枚育ってから株を下胚軸から切り取り、第２培地で引き続き成長させた。
３）続いて、切り取った株を第２培地に挿入して培養を続け、側芽が分化してから、側芽と株を第３培地（発根培地）に移して発根培養した。
４）発根培養から２週間後、株から太い根が伸びた後に株を室温で３日間育苗し、取り出した。そして、株上の培地を洗い流し、緩衝液に１５分間浸漬してから温室に移植した。温室は温度２５℃、相対湿度６０％とした。これにより、９５％以上の移植生育率を保証可能であった。
前記第１培地は、以下の成分比率で構成した。
ＭＳ培地 １Ｌ
６−ベンジルアミノプリン（６ＢＡ） ０．５ｍｇ
コルヒチン ５０ｍｇ
ショ糖 ２０ｇ
寒天 ８ｇ
ＭＳ培地 １Ｌ
６−ベンジルアミノプリン（６ＢＡ） ０．５ｍｇ
コルヒチン ５０ｍｇ
ショ糖 ２０ｇ
寒天 ８ｇ
第１培地はｐＨ＝５．８〜６．０であった。また、ＭＳ培地はＭｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇにより発明されたもので、ＭＳと略称される。配合については表１を参照する。
前記第２培地は、以下の成分比率で構成した。
ＭＳ培地 １Ｌ
６−ベンジルアミノプリン（６ＢＡ） ０．５ｍｇ
コルヒチン ３０ｍｇ
ショ糖 ３０ｇ
寒天 ８ｇ
ＭＳ培地 １Ｌ
６−ベンジルアミノプリン（６ＢＡ） ０．５ｍｇ
コルヒチン ３０ｍｇ
ショ糖 ３０ｇ
寒天 ８ｇ
第２培地はｐＨ＝５．８〜６．０であった。また、前記第３培地は以下の成分比率で構成した。
ＭＳ培地 １Ｌ
１−ナフチル酢酸 ０．０３ｍｇ
コルヒチン ２０ｍｇ
ショ糖 ２０ｇ
寒天 ８ｇ
ＭＳ培地 １Ｌ
１−ナフチル酢酸 ０．０３ｍｇ
コルヒチン ２０ｍｇ
ショ糖 ２０ｇ
寒天 ８ｇ
第３培地はｐＨ＝５．８〜６．０であった。また、上記の浸漬用緩衝液は以下の成分比率で構成した。
水 １Ｌ
ファモキサドン又はシモキサニル ０．６ｇ
１−ナフチル酢酸 ０．５ｍｇ
水 １Ｌ
ファモキサドン又はシモキサニル ０．６ｇ
１−ナフチル酢酸 ０．５ｍｇ
図２、図３、図５を参照する。Ｙ３３８０を雄株とし、キャベツ型セイヨウアブラナの細胞質不稔系統（０４６４Ａ）と検定交雑したところ、検定交雑後代の５０株はいずれも高性であり、且つ、全て四倍体セイヨウアブラナであった。また、これらのうち４９株は完全不稔、１株は半不稔であった。更に、形態的特徴は０４６４Ａと全く同じであった。また、対照検定として、Ｐ３−２と矮性セイヨウアブラナＤ３−５との交雑Ｆ１（非倍加株）を雄株として０４６４Ａと交雑したところ、交雑後代の１０２株に矮性６２株、高性４０株が現れた。且つ、稔性の分離が大きく、完全可稔が７３株、半不稔が２０株、完全不稔が９株現れた。これより、Ｙ３３８０の遺伝子は検定交雑株に入っておらず、検定交雑後代は０４６４Ａの単為生殖によることが示された。誘導率は９８％であった。また、Ｙ３３８０を雄株とし、キャベツ型セイヨウアブラナ３９５４を除雄して収束交雑したところ（３９５４は中双１１とＣＡＸとの交雑Ｆ１）、収束交雑後代Ｆ１に分離が見られた。各Ｆ１を近親交配させてＦ１近親交配株４５個を取得し、Ｆ２世代の株系統を４５個植栽したところ、安定株系統が４５個現れた。よって、安定株系統は出現率１００％、誘導率１００％であった。
また、Ｙ３３８０を雄株とし、キャベツ型セイヨウアブラナ３９６８を除雄して収束交雑したところ（３９６８は中双１１と１３６５との交雑Ｆ１）、収束交雑後代Ｆ１に分離が見られた。各Ｆ１を近親交配させてＦ１近親交配株５２個を取得し、Ｆ２世代の株系統５２個を植栽したところ、安定株系統が２８個現れた、よって、安定株系統は出現比率５３．８５％、誘導率５３．８５％であった。
また、Ｙ３３８０を雄株とし、キャベツ型セイヨウアブラナである中双１１（一般品種、ホモ接合系統）を除雄して交雑したところ、交雑Ｆ１株が７０株得られた。７０株のＦ１は中双１１と全く同じ形態を示した。且つ、各単一株を近親交配したＦ２世代に分離は見られず、安定株系統であった。また、形態も中双１１と全く同じであった。これより、Ｆ１世代が純系であることが示された。即ち、Ｙ３３８０と中双１１の交雑過程において、中双１１の単為生殖が誘導された。また、発生したＦ１は単為生殖性で近親交配したため、ホモ接合系統となった。結果、Ｆ１は安定系統、Ｆ２もまた安定的となり、且つ、中双１１と完全に同形態となった。これの誘導率は１００％であった。
同様に、Ｙ３３８０を雄株とし、ハクサイ型セイヨウアブラナである雅安黄油菜ＹＨ（二倍体セイヨウアブラナ、２ｎ＝２０）を除雄して交雑したところ、交雑Ｆ１株が９８株得られた。このうち９７株のＦ１はＹＨと全く同じ形態を示した。且つ、各単一株を近親交配したＦ２世代の形態はいずれも二倍体であり、ＹＨと外形が一致していた。これより、Ｙ３３８０とＹＨの交雑過程においてＹＨの単為生殖が誘導されたといえる。また、発生したＦ１は単為生殖性で近親交配し、且つ、形態もＹＨと全く同じであった。これの誘導率は９８．９％であった。最後に、優性の矮性八倍体株Ｙ３３８０をセイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統として決定した。
図２、図３、図４を参照する。Ｙ３５６０を雄株とし、キャベツ型セイヨウアブラナの細胞質不稔系統（０４６４Ａ）と検定交雑したところ、検定交雑後代の８０株はいずれも高性であった。且つ、７６株は四倍体セイヨウアブラナ、２株は二倍体、２株は八倍体であった。このうち、７６株の四倍体株は完全不稔、４株は半不稔であり、且つ、形態的特徴は０４６４Ａと全く同じであった。また、対照検定として、Ｐ３−２と矮性・高エルカ酸セイヨウアブラナ４２４７との交雑Ｆ１（非倍加株）を雄株として０４６４Ａと交雑したところ、交雑後代の１５３株に矮性１０２株、高性５１株が現れた。且つ、稔性の分離が大きく、完全可稔が６５株、半不稔が３５株、完全不稔が５３株現れた。これより、Ｙ３５６０の遺伝子は検定交雑株に入っておらず、検定交雑後代は０４６４Ａの単為生殖によることが示された。誘導率は９５％であった。
また、Ｙ３５６０を雄株とし、ハクサイ型セイヨウアブラナである雅安黄油菜ＹＨ（二倍体セイヨウアブラナ、２ｎ＝２０）を除雄して交雑したところ、交雑Ｆ１株が１４５株得られた。このうち１４３株のＦ１はＹＨと全く同形態であった。且つ、各単一株を近親交配したＦ２世代の形態はいずれも二倍体であり、ＹＨと外形が一致していた。これより、Ｙ３５６０とＹＨの交雑過程においてＹＨの単為生殖が誘導されたといえる。また、発生したＦ１は単為生殖性で近親交配し、且つ、形態もＹＨと全く同じであった。これの誘導率は９８．６％であった。
同様に、Ｙ３５６０を雄株とし、カラシナ型セイヨウアブラナＧＷ（四倍体セイヨウアブラナ、２ｎ＝３６）を除雄して交雑したところ、交雑Ｆ１株が１２４株得られた。このうち１２３株のＦ１はＧＷと全く同形態であった。且つ、各単一株を近親交配したＦ２世代の形態はいずれも四倍体であり、ＧＷと外形が一致していた。これより、Ｙ３５６０とＧＷの交雑過程においてＧＷの単為生殖が誘導されたといえる。また、発生したＦ１は単為生殖性で近親交配し、且つ、形態もＧＷと全く同じであった。これの誘導率は９９．２％であった。最後に、優性の矮性八倍体株Ｙ３５６０をセイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統として決定した。
図３、図６、図１０、図１１を参照して、初期世代安定系統Ｐ３−２は以下の方法で取得した。
キャベツ型セイヨウアブラナＦ００９（四倍体、染色体２ｎ＝３８）とハクサイ型セイヨウアブラナＹＨ（二倍体、雅安黄油菜、染色体２ｎ＝２０）のつぼみを開き、人為的に除雄して交雑し、Ｆ１世代の交雑種子を取得した。次に、Ｆ１世代の交雑種子を培地においてコルヒチンで人為的に染色体倍加した。そして、倍加したＦ１世代株を近親交配（又は強制的近親交配）することでＦ２世代を取得し、Ｆ２世代を畑に植栽して観察及び繁殖可能性鑑定（即ち、アセトカルミンによる花粉の染色）することで花粉の繁殖可能性を判断したところ、３種類の状況が見られた（１．半数体株。花粉が極めて少なく、且つ繁殖可能性が極めて低い。２．完全不稔の倍数体株。花器官の発育が阻害され、正常な開花が不可能。花粉なし。３．正常可稔株。花粉量が多く、花粉の繁殖可能性が９５％以上）。続いて、Ｆ２世代の正常可稔の単一株を近親交配してＦ３世代を取得した。そして、Ｆ３世代についてホモ接合性を鑑定し、Ｆ３世代の単一株系統を植栽したところ、可稔性株系統のうち３２％の単一株が一致しており、開花・結実が正常であった。また、一致していた株系統について細胞学的鑑定を行ったところ、染色体本数が一致しており（３８本）、染色体の形態に異常は見られなかった。ＳＳＲ分子マーカーについては、ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応によって各特異プライマーによる増幅下での単一株のＤＮＡバンドタイプを電気泳動で観察したところ、各単一株はいずれもＦ００９とＹＨの交雑後代であることが示された。且つ、各単一株のＤＮＡ増幅バンド数とバンドタイプが一致していたことから、これらの株系統はホモ接合系統であり、即ち初期世代安定系統であると判断可能であった。このうち、葉が大きくて亀裂がなく、着生が密であり、含油率５５％のキャベツ型（染色体３８本）セイヨウアブラナの初期世代安定系統をＰ３−２と命名した。
本実施例では、Ｆ１世代の交雑種子を培地においてコルヒチンにより人為的に染色体倍加した。具体的な方法は以下の通りである。
１）純度７５％のアルコールで種子の表面を２５秒間消毒し、０．１％の昇汞で１２分間消毒した。続いて、滅菌水で種子表面の昇汞を洗い流し、滅菌紙で種子表面の水分を拭き取ってから、種子を第１培地（染色体倍加誘導培地）に播種した。
２）第１培地で種子を発根及び発芽させた。培養条件としては、温度２５℃、昼光照射１６時間、照射強度２０００ルクス、夜間暗所培養８時間とし、成葉が１〜２枚育ってから株を下胚軸から切り取り、第２培地で引き続き成長させた。
３）続いて、切り取った株を第２培地に挿入して培養を続け、側芽が分化してから、側芽と株を第３培地（発根培地）に移して発根培養した。
４）発根培養から２週間後、株から太い根が伸びた後に株を室温で３日間育苗し、取り出した。そして、株上の培地を洗い流し、緩衝液に１５分間浸漬してから温室に移植した。温室は温度２５℃、相対湿度６０％とした。これにより、９５％以上の移植生育率を保証可能であった。
前記第１培地は、以下の成分比率で構成した。
ＭＳ培地 １Ｌ
６−ベンジルアミノプリン（６ＢＡ） ０．５ｍｇ
コルヒチン ３０ｍｇ
ショ糖 ２０ｇ
寒天 ８ｇ
ＭＳ培地 １Ｌ
６−ベンジルアミノプリン（６ＢＡ） ０．５ｍｇ
コルヒチン ３０ｍｇ
ショ糖 ２０ｇ
寒天 ８ｇ
第１培地はｐＨ＝５．８〜６．０であった。また、ＭＳ培地はＭｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇにより発明されたもので、ＭＳと略称される。配合については表１を参照する。
前記第２培地は、以下の成分比率で構成した。
ＭＳ培地 １Ｌ
６−ベンジルアミノプリン（６ＢＡ） ０．５ｍｇ
コルヒチン ２０ｍｇ
ショ糖 ３０ｇ
寒天 ８ｇ
ＭＳ培地 １Ｌ
６−ベンジルアミノプリン（６ＢＡ） ０．５ｍｇ
コルヒチン ２０ｍｇ
ショ糖 ３０ｇ
寒天 ８ｇ
第２培地はｐＨ＝５．８〜６．０であった。また、前記第３培地は以下の成分比率で構成した。
ＭＳ培地 １Ｌ
１−ナフチル酢酸 ０．０３ｍｇ
コルヒチン ５ｍｇ
ショ糖 ２０ｇ
寒天 ８ｇ
ＭＳ培地 １Ｌ
１−ナフチル酢酸 ０．０３ｍｇ
コルヒチン ５ｍｇ
ショ糖 ２０ｇ
寒天 ８ｇ
第３培地はｐＨ＝５．８〜６．０であった。また、上記の浸漬用緩衝液は以下の成分比率で構成した。
水 １Ｌ
ファモキサドン又はシモキサニル ０．６ｇ
１−ナフチル酢酸 ０．５ｍｇ
水 １Ｌ
ファモキサドン又はシモキサニル ０．６ｇ
１−ナフチル酢酸 ０．５ｍｇ
図１、図２、図４、図５、図８を参照する。従来のキャベツ不稔系統を改変し、不稔系統の組合せ能力と耐病性及び耐貯蔵・運輸特性を向上するために、キャベツの自家不和合系統（高組合せ能力系統）である甘１２１と耐貯蔵・運輸系統である甘０５１を交雑した。交雑したＦ１世代は開花期において人為的に除雄し、セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統Ｙ３５６０で授粉し、誘導した。すると、Ｆ２世代（誘導第１世代）として１５個の単一株が取得されたが、調査の結果、１５個の単一株はいずれも外形がキャベツであり、且つ二倍体であることがわかった。次に、１５個の単一株を袋掛けして（つぼみを開き）近親交配するとともに、花粉を取ってキャベツの不稔系統（ダイコンの細胞質不稔）である蓉蘿Ａ０１９と検定交雑した。そして、近親交配後代については株系統内での安定性・一致性鑑定を、検定交雑後代については一致性及び不稔性鑑定を実施したところ、近親交配後代は株系統内において全て一致しており、いずれも二倍体であった。また、検定交雑後代についても高度に一致しており、いずれも不稔性であった。ただし、耐貯蔵・輸送性で平頭特性を有し、且つ、検定交雑後代の収量が高く、耐病性が良好であったのは株系統１０５のみであった。続いて、セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統Ｙ３３８０で株系統１０５に対応する検定交雑後代の単一株を授粉し、隔離して単一株の種子を取得した。そして、１０５の検定交雑誘導後代を畑に植栽し、４５株を取得したところ、４２株が完全にキャベツの特性を有しており、且つ二倍体であった。一方、３株は外観がセイヨウアブラナ交雑株の特性と類似しており、倍数性が三倍体であった。また、４２個の単一株は高度不稔であった。続いて、耐貯蔵・輸送性及び平頭特性を有する不稔性の単一株をＹ３５６０で授粉した。そして、袋掛けにより隔離し、単一株から種子を収穫したところ、３０個の株系統から種子が得られた。３０個の株系統について、外観形態、農業形質、分子マーカー（ＳＲＡＰ）で株系統内での一致性・安定性を鑑定したところ、１０個の株系統で株系統内での一致性・安定性が高度に一致していた。また、２つ株系統が耐貯蔵・輸送性、耐病性、豊作特性を有していた。そこで、２つの株系統各々から１０株を選抜し、Ｙ３５６０とＹ３３８０で５株ずつ授粉するとともに、袋掛けにより隔離した。また、５つの株系統については混合授粉を行った。そして、安定的不稔系統に対する両誘導系統の誘導効率を鑑定したところ、Ｙ３５６０による一方の不稔系統に対する誘導効率は１００％、他方の不稔系統に対する誘導効率は９７％であり、Ｙ３３８０による２つの不稔系統の誘導効率はそれぞれ９７％及び９６％であることがわかった。したがって、最終的には、新たな不稔系統としてキャベツダイコンの細胞質不稔系統である蓉甘Ａ１０５のみが形成された。また、当該不稔系統はＹ３５６０による授粉で繁殖可能であった。
図１、図２、図４、図５、図９を参照して、カブＹ２３で韓国ダイコンＨ２２を交雑し、Ｆ１世代の開花期に人為的除雄を行ってからセイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統Ｙ３３８０で授粉した。そして、Ｆ２世代の誘導後代の実生期にフローサイトメーターで誘導後代の倍数性を鑑定したところ、１０個の単一株のうち１つが半数体、９個が二倍体であり、且つ、外形はいずれもダイコンの特性を有していることがわかった。９個の単一株の開花期に袋掛けして近親交配し、近親交配後代について株系統内での一致性及び安定性を鑑定したところ、９個の株系統は株系統内が高度に一致及び安定していた。また、９個の株系統の花粉でダイコンの不稔系統である蓉蘿Ａ００１を検定交雑し、検定交雑後代について一致性、倍数性を鑑定したところ、９個の検定交雑後代はいずれも不稔性であった。このうち、７番の株系統は耐病性であり、収量特性が最も高かった。そこで、引き続きセイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統Ｙ３５６０の花粉で７番の株系統の検定交雑後代を授粉して誘導し、袋掛けにより隔離した。すると、誘導後代に形態の分離が見られたことから、７番の株系統特性を有する４つの不稔性の単一株を選抜し、引き続きＹ３３８０で授粉して誘導することで４つの株系統を形成した。次に、４つの株系統について株系統内での一致性、安定性を鑑定したところ、各株系統内が高度に一致及び安定していることがわかった。ただし、各株系統間では農業形質にやや差があり、主には葉の色と株の高さに発現していた。また、４つの安定株系統について、Ｙ３５６０とＹ３３８０でそれぞれ単一株を５つずつ授粉し、袋掛けにより隔離した。また、５つの株系統については混合収穫した。そして、不稔系統に対する誘導系統の誘導効果を鑑定したところ、Ｙ３５６０の誘導効率は９４〜９９．８％の間であった。このうち１つの株系統の誘導効率は９９．８％であり、当該株系統はＹ３５６０で不稔性を維持可能であった。一方、Ｙ３３８０の誘導率は９３〜９９．７％の間であった。このうち１つの株系統の誘導効率は９９．７％であり、Ｙ３３８０で不稔性を維持可能であった。最後に、これら２つの高誘導率の不稔系統は同一の不稔系統であり、当該不稔系統はＹ３５６０とＹ３３８０で不稔性を維持可能であることがわかった。また、新たな不稔系統はダイコンの細胞質不稔であり、その遺伝子型は上記で選抜育種した７番の安定株系統（カブＹ２３、韓国ダイコンＨ２２由来の遺伝子型）と蓉蘿Ａ００１由来であったため、蘿蓉Ａ００７と命名した。
本実施例２及び実施例３におけるセイヨウアブラナの倍加誘導系統の選抜育種方法は実施例１と同様であった。
本発明の方法によれば、育種又は基礎研究において応用価値のあるアブラナ科野菜の素材を迅速（３世代）、高効率、大規模に取得可能となる。且つ、当該特許技術は応用範囲が広く、キャベツ、カリフラワー（ハナヤサイ）、ハクサイ（大白菜、小白菜）、ダイコン、カラシナ系アブラナ科野菜（チンゲン菜、ザーサイ、ダイトウサイ、カイラン等）を含むアブラナ科作物全般に適応される。当該技術は応用領域が広く、アブラナ科野菜作物の高収量化及び品質育種の推進を積極的に促進する役割を有する。
上記の実施例は本発明における上記内容を更に説明するものであるが、本発明における上記テーマの範囲を上記実施例にのみ限定するものと解釈すべきではない。よって、上記の内容に基づき実現される技術はいずれも本発明の範囲に属する。
Claims (3)
- セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統によりアブラナ科野菜の素材及び品種を選抜育種する方法であって、
１）アブラナ科野菜の育種資源を収集するとともに、資源素材の特性を鑑定し、収集源が異なり、農業形質と遺伝的差異の大きな資源素材を分類のうえ番号を振り、開花時期を調査してから、開花時期に基づいて、セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統の播種を遅らせ、通常は、翌年のアブラナ科野菜の開花期と一致するように、セイヨウアブラナの倍加半数体の播種時期を前年の１０月２０日〜１１月５日の間とするステップと、
２）前記ステップ１）で収集したアブラナ科野菜の資源素材を開花初期において人為的に除雄し、不稔性の資源を直接授粉可能するとともに、袋掛けにより隔離し、２〜４日後にセイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統で授粉するとともに、単一株を袋掛けして誘導後代を収穫するステップと、
３）前記ステップ２）で収穫した誘導後代を植栽し、実生期にフローサイトメーターで誘導後代の倍数性を鑑定して、倍数体、半数体、及びセイヨウアブラナの特性を有する株を淘汰し、繁殖可能性が正常で且つ倍数性が正常な単一株を選抜して袋掛けし、近親交配させるか、或いは、つぼみ期につぼみを開いて強制的に近親交配させるステップと、
４）前記ステップ３）の誘導後代のうち正常な近親交配後代について株系統を植栽し、株系統内での安定性と一致性を鑑定するとともに、分子マーカーで株系統内での一致性を鑑定し、安定株系統を雄株とし、安定細胞質不稔系統を雌株として検定交雑し、検定交雑後代の種子を収穫するステップと、
５）前記ステップ４）における検定交雑後代の種子を植栽し、検定交雑後代の株の繁殖可能性を鑑定して、検定交雑後代が完全不稔の場合には、ステップ４）の雄株は当該不稔性タイプの維持系統であるとみなして当該維持系統の近親交配結実率を鑑定し、検定交雑後代が完全可稔の場合には、ステップ４）の雄株は当該不稔性タイプの回復系統であるため、対応する回復系統を淘汰し、検定交雑後代が完全な不稔性でない場合には、ステップ４）の雄株は回復系統でも維持系統でもないため、淘汰するか、交雑して新たな維持系統を育成するステップと、
６）前記ステップ５）で選抜育種した維持系統と同タイプの不稔系統とを検定交雑し、収量、品質、耐病性を特性として有する新たな交雑の組み合わせ又は品種を選抜育種するステップと、
７）前記ステップ５）で選抜育種した維持系統と同タイプの不稔系統とを検定交雑した後、検定交雑後代の農業形質に基づいて、当該維持系統で検定交雑後代を戻し交配又は多世代戻し交配或いは１世代検定交雑し、セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統を用いて、検定交雑、戻し交配又は多世代戻し交配した不稔性株の単一株を授粉するとともに、袋掛けにより隔離するステップと、
８）前記ステップ７）で収穫した単一株の種子を植栽し、開花期に繁殖可能性を鑑定して、不稔性の単一株を引き続きセイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統で授粉し、誘導するとともに、単一株を袋掛けにより隔離して単一株を収穫するステップと、
９）前記ステップ８）で２回誘導された不稔性の単一株後代について、農業形質、分子マーカーにより株系統内での安定性及び一致性を鑑定するとともに、農業形質が一致しており、且つ株系統内で安定的な不稔性株系統について新たなアブラナ科野菜の細胞質不稔系統を形成し、セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統を用いて当該不稔性株系統につき３回目の誘導、授粉を行い、誘導効率を鑑定するステップと、
１０）前記ステップ９）における３回目の誘導後代について、当該不稔性株系統に対する誘導系統の誘導能力を鑑定し、３回目の誘導後代株系統内の農業形質及び不稔性が高度に一致しており、且つ、株系統内の農業形質及び高度不稔性株が全誘導後代に占める割合である誘導能力が９８％以上の場合、最後に、新たに形成された不稔性株系統又は安定不稔系統の遺伝的特性及び不稔状態を、セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統を用いて維持するステップと、
１１）前記ステップ８）において２回の誘導を経て形成された不稔性株系統を、セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統で授粉してその不稔状態を維持し、当該不稔性株系統又は安定不稔系統の遺伝的特性はセイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統と無関係であり、当該不稔性株系統は、前記ステップ７）の維持系統である暫定維持系統の形質特性を有しているが、当該維持系統である暫定維持系統とは一定の遺伝的差異があるか、或いは、維持系統である暫定維持系統の核遺伝子を５０〜９９％含んでおり、維持系統である暫定維持系統の核遺伝子をどの程度含むかは、維持系統である暫定維持系統と不稔性単一株との戻し交配の世代数により決定され、維持系統である暫定維持系統の核遺伝子を異なる程度含むだけでなく、更にステップ４）の安定細胞質不稔系統の核遺伝子も含むステップと、
１２）前記ステップ９）で形成した遺伝的差異の異なる安定細胞質不稔系統について、細胞質不稔系統に対するセイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統の誘導能力が９８％よりも大きいことに基づいて、同一の維持系統であるセイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統によってこれを維持し、セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統は細胞質不稔系統の万能維持系統となり、且つ、１つの維持系統で複数の遺伝的安定及び異なる遺伝的背景を有する安定細胞質不稔系統を維持するステップと、
１３）ステップ１）の異なる収集源、農業形質及び遺伝的差異の素材特性と対応する収集源とに基づいて誘導された安定的な維持系統と、ステップ１２）で形成した安定的な新たな複数の細胞質不稔系統を検定交雑することで、収量潜在力、耐病性、ストレス耐性を有する新たなアブラナ科野菜の品種を選抜育種し、アブラナ科野菜の２系統による交雑新品種の選抜育種を実現するステップと、を含み、
前記セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統の選抜育種方法は、
（１）単為生殖性を遺伝的特性として有する初期世代安定系統を選抜育種するステップであって、
１）２つのセイヨウアブラナの親素材を交雑したＦ１世代の種子を、培地において染色体倍加誘導剤により人為的に染色体倍加することで、倍加したＦ１世代の株を取得し、
２）倍加したＦ１世代の株を近親交配又は強制的近親交配してＦ２世代を取得し、Ｆ２世代を畑に植栽して観察するとともに、各単一株の繁殖可能性を鑑定し、可稔性後代を選抜して近親交配によりＦ３世代を取得し、Ｆ３世代についてホモ接合性を鑑定するとともに、形態、細胞学及び分子マーカーによる鑑定を実施し、後代のＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応により増幅させ、各特異プライマーによる増幅下での単一株のＤＮＡバンドタイプ及びバンド数を電気泳動により観察し、各単一株がいずれも２つの親の交雑後代であることが示されるとともに、各単一株同士の分子マーカーチャートが一致している場合、これらの単一株はホモ接合系統――初期世代安定系統であることを意味し、
３）取得した初期世代安定系統を少なくとも１０個のセイヨウアブラナにおける通常のホモ接合安定系統と正逆交雑し、Ｆ１世代、Ｆ２世代について初期世代安定系統の遺伝的特性である単為生殖特性の有無を鑑定するとともに、前記正逆交雑においてＦ１に分離が見られ、Ｆ２世代に部分的な安定株系統が出現した場合には、対応する初期世代安定系統が単為生殖性を遺伝的特性として有する初期世代安定系統であるステップと、
（２）優性遺伝形質を備え、且つ単為生殖特性を有するとともに倍数性が遺伝的に安定している倍数体セイヨウアブラナを選抜育種するステップであって、
１）単為生殖性を遺伝的特性として有する初期世代安定系統と優性形質を備えるセイヨウアブラナとを交雑することで交雑Ｆ１世代の種子を取得し、交雑Ｆ１の種子を培地において染色体倍加誘導剤により人為的に染色体倍加することで、倍加した優性形質を備えるＦ１株を取得し、
２）倍加した優性形質を備えるＦ１株について、マイクロ顕微鏡で観察するか、或いは、フローサイトメーターで染色体の倍数性鑑定を実施し、優性形質を備える倍数体株を選抜するとともに、異常な倍加株、異数体株、及び優性形質を備えない倍加株を淘汰し、優性形質の倍数体株とは、倍数性が遺伝的に安定しており、結実性が良好で、単為生殖性を遺伝的特性として有し、優性形質を備える六倍体又は八倍体のセイヨウアブラナ株であるステップと、
（３）セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統の鑑定及び誘導能力測定を行うステップであって、
１）倍数性が遺伝的に安定しており、単為生殖性を遺伝的特性として有し、優性形質を備えた倍数体株における優性形質によって、検定交雑後代に発生する交雑株を除去可能であり、検定交雑後代に優性形質株又は異数体株が出現した場合には、当該株が倍数体株と雌株との交雑により発生したことを意味するため当該株を除去し、
２）前記単一株の検定交雑後代に、完全不稔で正常な倍数性である二倍体又は四倍体のセイヨウアブラナであって、且つ優性形質を持たないものが出現した場合には、当該検定交雑後代に対応する雄株の遺伝子が検定交雑後代に入っていないことを意味するため、優性の倍数体株をセイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統とするステップ、を含む方法。 - セイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統による選抜育種では、２つの親素材を交雑したＦ１世代の種子、又は、単為生殖性を遺伝的特性として有する初期世代安定系統と優性形質を備えるセイヨウアブラナとを交雑することで取得した交雑Ｆ１世代の種子を、培地において染色体倍加誘導剤により人為的に染色体倍加するが、その具体的方法として、
１）純度７５％のアルコールで種子の表面を２５〜４０秒間消毒し、０．１％の昇汞で１２〜１７分間消毒した後、滅菌水で種子表面の昇汞を洗い流し、滅菌紙で種子表面の水分を拭き取ってから、種子を第１培地に播種し、
２）第１培地で種子を発根及び発芽させ、培養条件を、温度２３〜２５℃、昼光照射１２〜１６時間、照射強度２０００〜３０００ルクス、夜間暗所培養８〜１２時間とし、成葉が１〜２枚育ってから株を下胚軸から切り取り、第２培地で引き続き成長させ、
３）続いて、切り取った株を第２培地に挿入して培養を続け、側芽が分化してから、側芽と株を第３培地に移して発根培養し、
４）発根培養から２週間後、株から太い根が伸びた後に株を室温で３〜７日間育苗して取り出し、株上の培地を水道水で洗い流して緩衝液に１５〜３０分間浸漬してから温室に移植し、９５％以上の移植生育率を保証可能となるよう、温室は温度１６〜２５℃、相対湿度６０〜８０％とし、
前記第１培地は以下の成分比率で構成し、
ＭＳ培地 １Ｌ
６−ベンジルアミノプリン ０．５〜１．５ｍｇ
染色体倍加誘導剤 ３０〜７０ｍｇ
ショ糖 ２０〜３０ｇ
寒天 ８〜１０ｇ、
第１培地はｐＨ＝５．８〜６．０であり、
前記第２培地は以下の成分比率で構成し、
ＭＳ培地 １Ｌ
６−ベンジルアミノプリン ０．５〜１ｍｇ
染色体倍加誘導剤 ２０〜４０ｍｇ
ショ糖 ２０〜３０ｇ
寒天 ８〜１０ｇ、
第２培地はｐＨ＝５．８〜６．０であり、
前記第３培地は以下の成分比率で構成し、
ＭＳ培地 １Ｌ
１−ナフチル酢酸 ０．０３〜０．５ｍｇ
染色体倍加誘導剤 ５〜２０ｍｇ
ショ糖 ２０〜３０ｇ
寒天 ８〜１０ｇ、
第３培地はｐＨ＝５．８〜６．０であり、
前記の浸漬用緩衝液の成分比率は、
水 １Ｌ
ファモキサドン又はシモキサニル ０．６〜１．２ｇ
１−ナフチル酢酸 ０．５〜１ｍｇ、
で構成されることを特徴とする請求項１に記載のセイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統によりアブラナ科野菜の素材及び品種を選抜育種する方法。 - 染色体倍加誘導剤として、コルヒチン、トリフルラリン、オリザリンのうちの少なくとも１つを用いることを特徴とする請求項１又は２に記載のセイヨウアブラナの倍加半数体誘導系統によりアブラナ科野菜の素材及び品種を選抜育種する方法。
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