CN103081800A - 一种甘蓝型油菜新型胞质不育系的选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于油菜杂种优势利用技术领域，涉及一种甘蓝型油菜新型胞质不育系的选育方法，获得的不育材料育性稳定性好，不育株率和不育度均可达到100%。杂交油菜是提高油菜产量解决国民食用油的有效途径。利用中国新疆野生油菜遗传资源与甘蓝型油菜进行属间杂交创制成新型胞质雄性不育系，可大大丰富我国的油菜不育胞质资源，推动杂交油菜的发展有重要意义。

Description

一种甘蓝型油菜新型胞质不育系的选育方法

技术领域

本发明属于油菜杂种优势利用技术领域，特别是指一种利用中国新疆野生油菜获得甘蓝型油菜新型胞质不育系的选育方法。 

背景技术

油菜是我国的主要种植作物之一，也是最主要的食用植物油来源。发展杂交油菜是提高油菜产量，解决国民食用油的有效途径。油菜杂种优势的利用在提高油菜产量和品质上发挥着巨大的作用，而细胞质雄性不育杂种是利用油菜杂种优势的主要途径，也是最重要的授粉控制系统。目前中国油菜生产上应用的杂交油菜中，大部分是细胞质雄性不育杂种，但它们基本上都是来源于波里马不育胞质（Pol-CMS）。随着育种目标的提高、环境条件和耕作制度的改变，杂交油菜品种细胞质的单一化可能导致病害的大面积发生，并将成为持续性发展杂交油菜的限制因素。因此，创制新型胞质雄性不育系是油菜杂种优势利用的当务之急，也是杂交油菜可持续发展的重要种质资源基础。 

新疆野生油菜属十字花科植物，学名为Sinapis arvensis，分布在我国新疆西北部的野生油菜群体。它生长势强，具有低芥酸、低硫甙、抗裂角、抗病虫等特性，并具有雄性不育胞质，是十字花科植物育种的优良种质资源。利用中国新疆野生油菜遗传资源与甘蓝型油菜进行属间杂交创制新型胞质雄性不育系，可大大丰富我国的油菜不育胞质资源。 

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种利用远缘杂交引进近缘种胞质来获得异源细胞质雄性不育系的选育方法，是发掘新型胞质雄性不育系的有效手段。 

一种甘蓝型油菜新型胞质不育系的选育方法是利用中国新疆野生油菜与甘蓝型油菜进行属间远缘杂交获得新型胞质雄性不育系； 

所述选育方法的具体步骤依次如下： 

（1）属间杂种的获得：以新疆野生油菜为母本，以双低油菜品种湘油15号为父本；在油菜开花初期时，利用蕾期剥蕾授粉的方法获得属间杂种，属间杂种F1高度不育； 

（2）不育系和保持系的选育：用F1与双低油菜品种湘油15号自交系杂交，获得回交一代种子，选择回交一代群体中不育株继续与亲本双低油菜品种湘油15号自交系回交，获得回交二代种子，继续种植回交二代，选择回交二代不育株继续用双低油菜品种亲本湘油15号自交系回交，获得回交三代种子，继续回交，即每次得到的回交种子不育株与双低油菜品种亲本湘油15号自交系回交；直到回交群体中全为不育株，不育率达到100%，则回交群体为不育系，回交父本为保持系，形成一对同核异质的油菜异源细胞质雄性不育系和保持系。 

上述不育系繁殖时：厢宽2m，中间播8-10行不育系，密度1万株/亩左右；厢边播2行保持系。成熟时，收中间行种子为不育系种子（40-50公斤/亩），边行种子选优良单株作不育系繁殖时的保持系种子。 

本发明获得的不育材料育性稳定性好，不育株率和不育度均可达到100%。杂交油菜是提高油菜产量解决国民食用油的有效途径。利用中国新疆野生油菜遗传资源与甘蓝型油菜进行属间杂交创制成新型胞质雄性不育系，可大大丰富我国的油菜不育胞质资源，推动杂交油菜的发展有重要意义。 

附图说明

图1为本发明最后获得的不育系不育花序形态； 

图2为本发明最后获得的不育系不育花形态； 

图3为本发明最后获得的保持系花序形态； 

图4为本发明最后获得的保持系花形态； 

图5为本发明最后获得的不育系花蕾剥蕾形态； 

图6为本发明最后获得的保持系花蕾剥蕾形态； 

图7为本发明最后获得的不育系（图上方）和保持系（图下方）雄蕊形态； 

图8为本发明最后获得的不育系天然授粉； 

图9为本发明最后获得的不育系套袋自交； 

图10为本发明最后获得的不育系套袋人工授粉； 

图11为本发明最后获得的不育系菌核菌离体叶片接种后90小时； 

图12为本发明最后获得的保持系菌核菌离体叶片接种后90小时； 

图13为实施例中随机引物S455的扩增情况；M为DNA marker；P1为新疆野生油菜； 

P2为湘油15号；F1-1～F1-9为F1各个单株； 

图14为1193YYS不育系选育过程图。 

具体实施方式：

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。 

实施例1 

1、以新疆野生油菜为母本，以双低油菜品种湘油15号（国审油2001006）为父本。在油菜开花初期时，利用蕾期剥蕾授粉的方法获得属间杂种，属间杂种F1高度不育。用F1与湘油15号自交系回交，再种植回交一代种子（BC1），选择群体中不育株继续与亲本湘油15号自交系回交，获得回交二代种子，继续种植回交二代中不育株，继续用亲本湘油15号自交系回交，获得回交三代种子，继续回交，直到在2010年秋播材料中发现回交群体10-1193号中所有单株全为不育株，不育率达到100%。然后，将回交群体10-1193和相应的回交父本10-1167号（湘油15号自交系02-902的2010年秋播编号）继续回交，观察不育特性和调查不育率。通过两年四代的繁殖，不育特性观察和不育率调查发现不育材料无论是在湖南长沙市秋天播种，还是在云南昆明市夏季繁殖都表现为完全的不育，不育性彻底，不育率达到100%。最终选育出一对同核异质的油菜异源细胞质雄性不育系和保持系。在此，不育系命名为1193YYS，回交父本即保持系命名为10-1167号，整个试验过程请见图14。 

2、属间杂种F1的分子鉴定：利用RAPD分子标记技术可以对杂种的真实性进行鉴定。从200条RAPD引物中筛选出11条。这11条随机引物3次重复扩增出的带型完全相同，而且双亲带型差异很大。它们在新疆野生油菜和湘油15号中共扩增出95条随机扩增DNA片段。在这些片段中，新疆野生油菜共扩增出53条片段，湘油15共扩增出66条片段，两者共有片段24条，两者亲缘系数r=0.33，表明两者亲缘关系很远。杂种扩增出的带型完全相同，杂种F1同时扩增出父母本特征扩增带，表现出父母本扩增带的综合，没有扩增出父母本没有的新带，只是在有些主带的亮度上有些差异，表明杂种全部是由母本新疆野生油菜和父本湘油15号杂交而成的真杂种。 

PCR反应条件:反应体积:25ul，其中ddH₂O17.6ul，10x buffer2.5ul，2.5mmol/L dNTP0.4ul，5u/u1Taq酶0.5ul，10umol/L引物2ul，25ng/u1DNA2ul。随机引物购自Snagon公司。 

PCR反应程序:95℃预变性3分钟，第一个循环是94℃变性50秒，36.5℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共39次循环。完成最后一个循环后，72℃延伸5分钟。 

表1 

表1为11条随机引物扩增条带统计；F₁-1~F₁-9为F1各个单株。 

两亲本之间的亲缘系数计算公式如下:r=2N²xy/NxNy，N²xy是两亲本共同扩增出的带数，Nx是父本扩增出的总带数，Ny是母本扩增出的总带数。 

3、不育系育性表现：2010年9月将回交群体BC8种植在湖南省长沙市湖南农业大学油菜实验基地。2011年油菜开花期时调查回交群体不育率情况时，发现编号为10-1193号的回交群体中，全区113株都表现为雄性不育，不育率达到100%，不育株花器不育特性明显，表现为雄蕊退化缩短，花药呈三角形，无花粉散出，雌蕊发育正常；将该小区材料与相应的回交父本继续回交，共回交23个组合。2011年5月将23个回交组合和相应的回交父本种植于云南省昆明市寻甸县国家小麦油菜夏繁基地，油菜开花期时观察不育特性和调查23个组合的不育率，23个组合共1541株，全部为雄性不育株，不育率达到100%；然后继续将不育群体材料与回交父本回交，共24个回交组合。将回交组合和相应的回交父本于2011年9月种植在湖南省长沙市湖南农业大学油菜实验基地，2012年油菜开花期观察不育特性和调查不育率，回交群体共3317株，全部为雄性不育株，不育率达到100%；然后继续将不育材料与回交父本回交，2012年5月种植在云南省昆明市寻甸县国家小麦油菜夏繁基地，油菜开花时观察不育特性和调查不育率，回交群体共484株，全部为不育株，不育率达到100%。通过两年四代的繁殖，不育特性观察和不育率调查发现不育材料无论是在长沙市，还是在昆明市种植都表现为完全的不育，不育性稳定彻底，不育率达到100%，不育特性良好，表现为雄蕊退化缩短，花药呈三角形，无花粉散出，雌蕊发育正常，且套袋自交不结实，套袋后人工授粉，结实正常，天然授粉异交结实正常。 

在2012年油菜开花期时，用湖南省农业科学院提供的10个Pol-CMS的恢复系材料与不育材料测交，测交20个组合（表2）。2012年5月将这20个测交组合种植于云南省昆明市寻甸县国家小麦油菜夏繁基地，油菜开花期时调查不育率情况，发现20个测交组合，共1883株，全部为不育株，不育率为100%，说明该不育材料与Pol-CMS是不同胞质的雄性不育系材料。 

表2 

4、不育系与保持系的菌核病抗性鉴定：采用离体叶接种法，在油菜初花期取基部短柄叶。将叶片洗净后放入接种盘中。将菌核病菌丝块圆片倒置放于叶片主脉上部叶肉组织上，接种后用透明塑料薄膜覆盖保湿。于23℃温育，观察病斑面积变化。不育系离体叶接种后病斑扩展速度慢于保持系，对菌核病的抗性强于保持系。 

基本特性: 

1、本发明不育系特点：属甘蓝型半冬性细胞质雄性不育系，不育系与保持系杂交，后代不育性彻底。在长沙秋播和云南夏播都表现出高度不育，不育特性明显。 

2、自交、异交结实情况：套袋自交不结实；套袋后人工授粉，结实正常；天然授粉异交结实正常，结实率在80%左右。 

3、花器形态：大花瓣，花瓣重叠，雄蕊退化缩短，花药呈三角形，无花粉散出，雌蕊发育正常；花瓣长13.2mm，花瓣宽9.3mm，面积约122.8mm²，雌蕊长8.5mm，长雄蕊长5.2mm，短雄蕊长4.3mm。 

4、生育期(长沙)：9月下旬播种，2月20日左右初花，4月15日左右终花，5月10日左右成熟。 

5、植株性状：株高172厘米左右，一次有效分枝数8个左右，二次分枝9个左右，单株角果数310个左右，每角果粒数18粒左右，千粒重3.75克左右。 

6、品质性状：根据农业部油料及制品质量监督检验测试中心检测结果，种子芥酸未检测出，硫苷31.05μmol/g,含油量40.54%。 

7、抗性表现：抗菌核病能力较强，田间菌核发病率较低。 

优点： 

不育特性好，不育性彻底，大花瓣，抗菌核病较强。 

Claims (1)

1.一种甘蓝型油菜新型胞质不育系的选育方法，其特征在于利用中国新疆野生油菜与甘蓝型油菜进行属间远缘杂交获得新型胞质雄性不育系；

所述选育方法的具体步骤依次如下：

（1）属间杂种的获得：以新疆野生油菜为母本，以双低油菜品种湘油15号为父本；在油菜开花初期时，利用蕾期剥蕾授粉的方法获得属间杂种，属间杂种F1高度不育；

（2）不育系和保持系的选育：用F1与双低油菜品种湘油15号自交系杂交，获得回交一代种子，选择回交一代群体中不育株继续与亲本双低油菜品种湘油15号自交系回交，获得回交二代种子，继续种植回交二代，选择回交二代不育株继续用双低油菜品种亲本湘油15号自交系回交，获得回交三代种子，继续回交，即每次得到的回交种子不育株与双低油菜品种亲本湘油15号自交系回交；直到回交群体中全为不育株，不育率达到100%，则回交群体为不育系，回交父本为保持系，形成一对同核异质的油菜异源细胞质雄性不育系和保持系。

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