JP2019518061A - 口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法 - Google Patents
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Abstract
Description
アミノ酸配列がSEQ ID NO:2に示されるアダプタータンパク質を口蹄疫ウイルス不活化抗原に加え、混合し、インキュベートするステップ(1)と、
乳酸連鎖球菌(Lactococcus Lactis)骨格である精製担体を加え、混合し、インキュベートするステップ(2)と、
遠心し、沈殿したものを取るステップ(3)と、を含むがそれに限定されない。
アダプタータンパク質を設計した。アダプタータンパク質のアミノ酸の配列は、SEQ ID NO:2に示す通りである。該アダプタータンパク質は2つの機能識別領域を含む融合タンパク質であり、口蹄疫ウイルス不活化抗原及び乳酸連鎖球菌骨格をそれぞれ特異的に識別することができる。該アダプタータンパク質をコードする遺伝子の配列はSEQ ID NO:1に示す通りである。アダプタータンパク質の鑑定を容易にするため、SEQ ID NO:2に示す配列におけるカルボキシ基末端に6個のHisタグタンパク質(HHHHHH)を加える場合、SEQ ID NO:1に示す配列における3’−末端終止コドンの前に、Hisタグタンパク質をコードする遺伝子の配列を加えた後の配列がSEQ ID NO:3に示す通りである。SEQ ID NO:3に示す5’−末端にNde I酵素切断部位、3’−末端にXho I酵素切断部位を設計し、金斯瑞社に送って合成した。合成した遺伝子断片をpUC57担体に挿入し、組換えプラスミドpUC−PFLを得た。
pUC−PFL及びpET32aプラスミド二重酵素切断系(30μL):
10×Q.cut Buffer 3μL,
Q.cut Nde I 1μL,
Q.cut Xho I 1μL,
pUC−PFL又はpET32aプラスミド 8μL,
dH2O 体積を30μLまで補完する。
10×T4 ligase Buffer 2.5μL,
目的断片PFL 12μL,
担体断片 3μL,
T4 DNA ligase 1μL,
dH2O 体積を25μLまで補完する。
1.組換え発現菌株PFL/BL21誘導発現
(1)菌株PFL/BL21及びコントロール菌株pET/BL21の単一のクローンを取り、それぞれ50mg/mLのアンモニアベンジルシロマイシンを含むLB液体培地を接種し、37℃、200rpm条件下で一晩培養し、母液を得た。
1.組換え発現菌株PFL/BL21誘導発現
(1)菌株PFL/BL21及びコントロール菌株pET/BL21の単一のクローンを取り、それぞれ50mg/mLのアンモニアベンジルシロマイシンを含むLB液体培地を接種し、37℃、200rpmの条件下で一晩培養し、母液を得た。
(1)上記実施例2及び実施例3において誘導した後の菌液をそれぞれ収集し、8000g、4℃条件下で10分遠心し、菌体を得た。PBS緩衝液(pH7.0〜7.4、0.1mol/L)で菌体を2回洗浄し、PBSに再懸濁させて菌体懸濁液を得た。
アダプタータンパク質を鑑定するために、そのカルボキシ基末端のHisタグタンパク質により、誘導した後のPFL/BL21全菌並びにその分解液の上清及び沈殿を取ってウエスタンブロット鑑定を行った。ここで、誘導した後のpET/BL21全菌をコントロールとした。具体的には、各サンプルのSDS−PAGE電気泳動結果を硝酸セルロース膜上に転写し、そして5%BSAを含むTBST封止緩衝液で室温にて転写フィルムを1時間封止し、TBST緩衝液で3回洗浄し、1:5000倍希釈したマウス由来Hisモノクローナル抗体(Abcam社から購入し、品番はab15149である)と37℃条件下で1時間インキュベートした。次に再びTBST緩衝液で3回洗浄し、37℃条件下で1:10000に希釈したヒツジ抗マウスHRP−IgG2次抗体(KPL社から購入た品番が510−0183であるホースラディッシュペルオキシダーゼ標識のヒツジ抗マウスIgG抗体である)を45分インキュベートし、インキュベートが終了した後、TBST緩衝液で3回洗浄した。DAB発色キットを用いて発色を行い、写真を撮って保存した。その結果、図3に示すように、誘導した後のPFL/BL21分解液の上清の泳動路の36KDの位置に1本の明瞭なバンドが現われ、アダプタータンパク質の発現に成功したことが証明された。
1.精製担体の調製
新鮮なGM17培地で、30℃条件下で乳酸連鎖球菌IL1403(The Complete Genome Sequence of the Lactic Acid Bacterium Lactococcus lactis ssp.lactis IL1403、Genome Res.,10.1101/gr.169701.)を静置培養した。培養時間は16〜18時間とした。培養液を8000rpm条件下で5分遠心し、菌体を収集し、PBS緩衝液で沈殿を1回洗浄し、0.1mol/L塩酸を加え、30分沸騰させ、8000rpm条件下で5分遠心した。そしてPBS緩衝液で沈殿を3回洗浄し、最後にPBS緩衝液に再懸濁させ、乳酸連鎖球菌骨格、すなわち精製担体を得た。精製担体を血球板計数し、2.5×109個の精製担体を1単位とした。
実施例2における方法に従ってアダプタータンパク質溶液を調製した。2mLのアダプタータンパク質溶液(総タンパク質含有量は4.2mgである)に、過剰の精製担体(10×109個)を加え、30分インキュベートすることにより、アダプタータンパク質を精製担体と完全に結合させた。9000rpmで3分遠心し、上清1及び沈殿1を得た。沈殿1には精製担体及びそれとアダプタータンパク質との複合体が含まれる。沈殿1を400μLのPBS緩衝液に再懸濁させた。
アダプタータンパク質が精製担体と完全に解離しているか否かを解析するために、上清1、沈殿1、上清2及び沈殿2をSDS−PAGE電気泳動で解析した。その結果、図4に示すように、解離した後、すべてのアダプタータンパク質が上清2(泳動路4)中にあった。
上清2における総タンパク質含有量をBCAタンパク質定量キットで測定した。その結果は2mLのアダプタータンパク質溶液(実施例2に記載の方法で調製した)におけるアダプタータンパク質の総量である。検出結果は表3に示す通りである。計算の結果から分かるように、1ミリリットルのLB培地毎に最終的に約90μgのアダプタータンパク質が得られた。
1.抗原調製
O型FMDVをBHK細胞により増殖し、そして培養物を繰り返して凍結融解し、遠心により上清液を取り、不活化した後、O型FMDV不活化抗原を得た。抗原滴定濃度は108.5TCID50/mLであり、146S含有量は5.6μg/mLであり、総タンパク質濃度は716.4μg/mLであった。
(1)無菌条件下で、アダプタータンパク質溶液(実施例4中の方法で調製した)におけるアダプタータンパク質濃度を50μg/mLに調整し、そして精製対象のO型FMDV不活化抗原に加えた。加える割合は滴定濃度108.5TCID50/mLのO型FMDV不活化抗原5mL当たりに50μgのアダプタータンパク質とした。加えてから十分に混合した。
本実施例に係る方法によりO型FMDV不活化抗原の精製と濃縮の目的を達成したことを検証するために、本実施例で得られた上清3及び沈殿3についてSDS−PAGE電気泳動及びウエスタンブロット鑑定解析を行い、図5(A)及び図5(B)を得た。
(1)本実施例に係る方法によるウイルス不活化抗原を精製する効率を検出するために、FMDV O型抗体でELISAを遮断する検出キット(蘭州獣医研究所から提供された抗体コーティングプレート)によりO型FMDV不活化抗原(本実施例の標題1)及び上清3中の抗原含有量を検出した。検出結果のデータによれば、上清3中の抗原残存量は28(256)倍希釈されたO型FMDV不活化抗原の抗原含有量を下回り、それは精製によって、上清3中のウイルス残存量が原ウイルス抗原含有量の1%より少なく、すなわち本実施例中の精製方法による抗原の回収効率が99%を超えていることを示している。
A型FMDV不活化抗原を精製と濃縮する方法は以下のステップを含む。
A型FMDVをBHK細胞で増殖させ、そして培養物を繰り返して凍結融解し、遠心により上清液を取り、不活化した後、A型FMDV不活化抗原を得た。抗原滴定濃度は108.3TCID50/mLで、146S含有量は5.2μg/mLであり、総タンパク質濃度は680μg/mLであった。
(1)無菌条件下で、アダプタータンパク質溶液(実施例4中の方法で調製した)におけるアダプタータンパク質濃度を50μg/mLに調整し、そして精製対象のO型FMDV不活化抗原に加えた。加える割合は滴定濃度が108.3TCID50/mLのA型FMDV不活化抗原5mL当たりに50μgのアダプタータンパク質とした。加えてから十分に混合した。
本実施例に係る方法によりO型FMDV不活化抗原の精製と濃縮の目的を達成したことを検証するために、精製前のA型FMDV不活化抗原、本実施例の標題2で得られた上清4及び沈殿4に対しSDS−PAGE電気泳動及びウエスタンブロット鑑定解析を行い、図6(A)及び図6(B)を得た。
(1)本実施例に係る方法によるウイルス不活化抗原を精製と濃縮する効率を検出するために、FMDV A型抗体でELISAを遮断する検出キット(蘭州獣医研究所から提供された抗体コーティングプレート)によりA型FMDV不活化抗原及び上清4中の抗原含有量を検出した。検出結果のデータによれば、上清4中の抗原残存量は28(256)倍希釈されたA型FMDV不活化抗原の抗原含有量を下回った。それは精製によって、上清4におけるウイルス残存量が原ウイルス抗原含有量の1%よりも少なくなったことを示す。すなわち本実施例の精製と濃縮方法による抗原の回収効率が99%を超えていることが示された。
1.抗原調製
FMDV Asia1型ウイルスをBHK細胞で増殖し、そして培養物を繰り返して凍結融解し、遠心により上清液を取り、不活化した後、Asia1型FMDV不活化抗原を得た。抗原滴定濃度は108.2TCID50/mLであり、146S含有量は5.3μg/mLであり、総タンパク質濃度は658μg/mLであった。
(1)無菌条件下で、アダプタータンパク質溶液(実施例4中の方法で調製した)におけるアダプタータンパク質の濃度を50μg/mLに調整し、そして精製対象のFMDV Asia1型ウイルス不活化抗原に加えた。加えた割合は滴定濃度108.2TCID50/mLのAsia1型FMDV不活化抗原5mL当たりに50μgのアダプタータンパク質とした。加えてから十分に混合した。
本実施例に係る方法によりAsia1型FMDV不活化抗原の精製と濃縮の目的を達成したことを検証するために、上清5及び沈殿5に対しSDS−PAGE電気泳動及びウエスタンブロット鑑定解析を行い、図7(A)及び図7(B)を得た。
(1)本実施例に係る方法によるウイルス不活化抗原を精製する効率を検出するために、FMDV Asia1型抗体でELISAを遮断する検出キット(蘭州獣医研究所から提供された抗体コーティングプレート)によりAsia1型FMDV不活化抗原及び上清5中の抗原含有量を検出した。データ検出結果によれば、上清5中の抗原残存量は27(128)倍希釈されたAsia1型FMDV不活化抗原の抗原含有量を下回った。それは精製した後、ウイルス残存量が原ウイルス抗原含有量の1%よりも少なくなったことを示す。従って抗原の回収効率が99%を超えていることが示された。
TE緩衝液(10mmol/LのTris−HCL、50mmol/LのNaClを含み、pH8.0)によりAsia1型FMDV不活化抗原(実施例9における標題1)、Asia1型FMDV不活化抗原複合体(実施例9の標題2における沈殿5)の146S濃度をそれぞれ5.3μg/mLに希釈した。実施例3で調製した精製担体の含有量を約5×108個とし、そして206アジュバント(フランスSeepicから購入)と体積比46:54で混合し、乳化することにより、Asia1型不活化ワクチン及びそのコントロールワクチンをそれぞれ得た。
40〜45日齢の口蹄疫抗体が陰性の健康な子豚80頭を表2の方法に従ってランダムに8組に分け、頸部筋肉に注射する方式で免疫した。免疫線量は2mL/頭とし、各組の免疫のワクチンは表2に示す通りとした。
G1−G8組を免疫した後、直ちに体温、食、精神状態などを含め子豚の免疫ストレス反応を観察しながら記録し、且つ免疫した後の28日内の子豚の成長状況(食、体重、毛など)を観察しながら記録した。その結果、G1、G3、G5、G7組とG8コントロール組は免疫した後、体温、食はいずれも正常であり、明らかな異常反応がなく、成長状況がよかった。G2、G4組は免疫した後、それぞれ1頭の子豚に0.5時間で興奮ストレスが現われ、G2組は1頭、G4、G6組はそれぞれ2頭に体温上昇、食量低下などのストレス反応が起こった。その結果として、G1、G3、G5組に免疫したワクチンは、そのFMDV抗原複合体の純度が著しく向上しているため、ワクチンの免疫ストレス反応が著しく軽減されている。G7のコントロール組に免疫してから検出終了まで明らかな異常反応が起こらなかった。これは精製中に導入した精製担体とアダプタータンパク質が生体に被毒副作用を与えず、生体の正常な成長に影響しないことを示している。
(付記1)
アミノ酸配列がSEQ ID NO:2に示されるアダプタータンパク質を口蹄疫ウイルス不活化抗原に加え、混合し、インキュベートするステップ(1)と、
乳酸連鎖球菌骨格である精製担体を加え、混合し、インキュベートするステップ(2)と、
遠心し、沈殿したものを取るステップ(3)と、
を含むことを特徴とする口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
ステップ(1)におけるインキュベート条件は、インキュベート中に振とうし、インキュベート温度が20〜25℃であり、インキュベート時間が45分〜60分である、ことを特徴とする付記1に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
ステップ(2)におけるインキュベート条件は、インキュベート中に振とうし、インキュベート温度が20〜25℃であり、インキュベート時間が25分〜35分である、ことを特徴とする付記1又は2に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
108.7TCID50〜109.2TCID50の口蹄疫ウイルス不活化抗原に、40〜60μgの割合でアダプタータンパク質を加える、ことを特徴とする付記3に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
108.7TCID50〜109.2TCID50の口蹄疫ウイルス不活化抗原に2.4×109〜2.6×109個の割合で精製担体を加える、ことを特徴とする付記4に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
前記アダプタータンパク質は、前記アダプタータンパク質をコードする遺伝子を担持する組換え菌を誘導発現して得られるものである、ことを特徴とする付記5に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
前記組換え菌は、発現担体pET32におけるNde I及びXho Iの酵素切断点の間にアダプタータンパク質をコードする遺伝子を挿入し、次いで大腸菌を導入することにより得られる、ことを特徴とする付記6に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
前記組換え菌を35〜37℃で1〜2時間培養し、24〜26℃で2〜4時間培養し、15〜17℃で10〜20分静置し、次いで最終濃度が0.1〜0.3mmol/Lのイソプロピルチオガラクトシドを加えて15〜17℃で18〜22時間誘導培養することにより、アダプタータンパク質を得る、ことを特徴とする付記7に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
前記乳酸連鎖球菌骨格は、乳酸連鎖球菌を塩酸で沸騰させ、洗浄して得えられたものである、ことを特徴とする付記1に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
付記1に記載の方法により得られた沈殿を含む、ことを特徴とする口蹄疫ウイルス不活化ワクチン。
Claims (10)
- アミノ酸配列がSEQ ID NO:2に示されるアダプタータンパク質を口蹄疫ウイルス不活化抗原に加え、混合し、インキュベートするステップ(1)と、
乳酸連鎖球菌骨格である精製担体を加え、混合し、インキュベートするステップ(2)と、
遠心し、沈殿したものを取るステップ(3)と、
を含むことを特徴とする口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。 - ステップ(1)におけるインキュベート条件は、インキュベート中に振とうし、インキュベート温度が20〜25℃であり、インキュベート時間が45分〜60分である、ことを特徴とする請求項1に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
- ステップ(2)におけるインキュベート条件は、インキュベート中に振とうし、インキュベート温度が20〜25℃であり、インキュベート時間が25分〜35分である、ことを特徴とする請求項1又は2に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
- 108.7TCID50〜109.2TCID50の口蹄疫ウイルス不活化抗原に、40〜60μgの割合でアダプタータンパク質を加える、ことを特徴とする請求項3に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
- 108.7TCID50〜109.2TCID50の口蹄疫ウイルス不活化抗原に2.4×109〜2.6×109個の割合で精製担体を加える、ことを特徴とする請求項4に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
- 前記アダプタータンパク質は、前記アダプタータンパク質をコードする遺伝子を担持する組換え菌を誘導発現して得られるものである、ことを特徴とする請求項5に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
- 前記組換え菌は、発現担体pET32におけるNde I及びXho Iの酵素切断点の間にアダプタータンパク質をコードする遺伝子を挿入し、次いで大腸菌を導入することにより得られる、ことを特徴とする請求項6に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
- 前記組換え菌を35〜37℃で1〜2時間培養し、24〜26℃で2〜4時間培養し、15〜17℃で10〜20分静置し、次いで最終濃度が0.1〜0.3mmol/Lのイソプロピルチオガラクトシドを加えて15〜17℃で18〜22時間誘導培養することにより、アダプタータンパク質を得る、ことを特徴とする請求項7に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
- 前記乳酸連鎖球菌骨格は、乳酸連鎖球菌を塩酸で沸騰させ、洗浄して得えられたものである、ことを特徴とする請求項1に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
- 請求項1に記載の方法により得られた沈殿を含む、ことを特徴とする口蹄疫ウイルス不活化ワクチン。
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