JP2019511566A - 核酸凝縮ペプチド、核酸凝縮ペプチドセット、核酸送達キャリア、核酸送達方法、細胞作製方法、細胞検出方法及びキット - Google Patents

核酸凝縮ペプチド、核酸凝縮ペプチドセット、核酸送達キャリア、核酸送達方法、細胞作製方法、細胞検出方法及びキット Download PDF

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Abstract

実施形態に従う核酸凝縮ペプチドは、核酸を凝縮させるペプチドである。当該ペプチドは、その一方の端が第１の配列ＲＲＲＲＲＲであり、他方の端が第２の配列ＲＱＲＱＲである。第１の配列と第２の配列との間には、ＲＲＲＲＲＲ又はＲＱＲＱＲからなる中間配列が０個又は１個以上含まれる。かつ第１の配列、第２の配列及び中間配列のうち、隣り合う２つの配列の間に２つ以上の中性アミノ酸が含まれる。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
この出願は、参照によりそのすべてが本明細書に援用される、２０１６年１１月２２日に出願された日本特許出願第２０１６−２２６８９５号及び２０１７年９月１５日に出願された日本特許出願第２０１７−１７８２０６号を基礎とし、この優先権の利益を主張する。
本発明の実施形態は、核酸凝縮ペプチド、核酸凝縮ペプチドセット、核酸送達キャリア、核酸送達方法、細胞作製方法、細胞検出方法及びキットに関する。
近年、遺伝子治療や遺伝子検査などの分野において、核酸などの小分子を細胞に送達する技術の開発が盛んに行われている。核酸を細胞へ送達する方法の一例として、核酸をリポソームなどの脂質膜に封入し、エンドサイトーシスなどにより核酸を細胞に送達する方法が挙げられる。細胞内へ核酸を送達するために用いられるリポソームとして、カチオン性リポソームの応用が進んでいる（非特許文献１）。カチオン性リポソームは、カチオン性を有する脂質と、膜を安定化させる補助脂質とで構成されたリポソームであり、アニオン性に帯電した細胞膜に非特異的に集積する。しかしながら、核酸はアニオン性であるため、核酸をリポソームに封入する際に核酸がカチオン性リポソーム表面に張り付くことから、核酸を単独でリポソームに封入するのは困難である。そのため、効率的に核酸をリポソームに封入するために、核酸をペプチドなどに結合させてリポソームに封入する手法がしばしば用いられる。
上記のような状況において、現在、より効率的に核酸をリポソームに封入できるペプチドの更なる開発や、より効率的に核酸を細胞へ送達する方法の更なる開発が望まれている。
実施形態の核酸凝縮ペプチドの使用時の一例の様子を示す概略図である。 実施形態の核酸送達方法の一例を示すフローチャートである。 実施形態の細胞検出方法の一例を示すフローチャートである。 例１の実験結果を示すグラフである。 例１の実験結果を示すグラフである。 例２の実験結果を示す電気泳動の写真である。 例３の実験結果を示すグラフである。 例３の実験結果を示すグラフである。 例４の実験結果を示す電気泳動の写真である。 例５の実験結果を示す顕微鏡写真である。 例７の実験結果を示す電気泳動の写真である。 例９の実験結果を示すグラフである。 例９の実験結果を示すグラフである。 例１０の実験結果を示すグラフである。 例１１の実験結果を示す電気泳動の写真である。 例１４の実験結果を示すグラフである。
実施形態に従う核酸凝縮ペプチドは、核酸を凝縮させるペプチドである。当該ペプチドは、その一方の端が第１の配列ＲＲＲＲＲＲであり、他方の端が第２の配列ＲＱＲＱＲである。第１の配列と第２の配列との間には、ＲＲＲＲＲＲ又はＲＱＲＱＲからなる中間配列が０個又は１個以上含まれる。かつ第１の配列、第２の配列及び中間配列のうち、隣り合う２つの配列の間に２つ以上の中性アミノ酸が含まれる。
以下に、図面を参照しながら種々の実施形態について説明する。各図は実施形態とその理解を促すための模式図であり、その形状や寸法、比などは実際と異なる箇所があるが、これらは以下の説明と公知の技術を参酌して適宜、設計変更することができる。
１．概要
実施形態に従う核酸凝縮ペプチドは、核酸を凝縮させるためのペプチドである。当該核酸凝縮ペプチドは、例えば、以下のように使用される。図１に当該核酸凝縮ペプチドの使用時の一例を示した。
核酸凝縮ペプチド１を核酸２に接触させると、核酸２が凝縮され、複合体３が形成される（工程（ａ））。複合体３を核酸送達用膜４内に封入することにより、核酸送達キャリア５が得られる（工程（ｂ））。当該核酸送達キャリア５は、細胞６に導入される(工程（ｃ）)。核酸送達キャリア５が細胞６に導入されると、核酸送達用膜４が開裂し、複合体３が核酸送達用膜４の外に放出される（工程（ｄ））。その後、核酸凝縮ペプチド１から核酸２が解離され、核酸２が核７内に導入される（工程（ｅ））。このようにして、核酸２が効率的に細胞６に送達される。
実施形態に従うと、核酸凝縮ペプチド、核酸凝縮ペプチドを含む核酸凝縮ペプチドセット、核酸送達キャリア、核酸送達方法、細胞作製方法、細胞検出方法及びキットが提供される。以下にこれらについて詳細に説明する。
２．核酸凝縮ペプチド
核酸凝縮ペプチドは、核酸を凝縮するためのペプチドである。
核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。核酸は、例えば、環状であっても直鎖状であってもよい。環状である場合、核酸は、例えば、プラスミドベクターなどであってもよい。直鎖状である場合、核酸は、例えば、直鎖状のＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなどであってもよい。
核酸は、例えば、目的遺伝子を発現するための公知の遺伝子発現カセットを含んでいてもよい。遺伝子発現カセットは、例えば、当該核酸が細胞に導入された場合、当該細胞で発現し得る１つ以上の目的遺伝子をコードする塩基配列を含み得る。当該目的遺伝子は、例えば、目的のタンパク質又はＲＮＡなどを産出するための遺伝子であり得る。目的遺伝子は、例えば、細胞の機能を改変するための遺伝子、細胞を細胞死に導くための遺伝子、レポーター遺伝子又は細胞に所望の物質を生産させるための遺伝子などであってもよい。
細胞の機能を改変するための遺伝子は、例えば、新たな細胞の機能を付加するための遺伝子、弱まった若しくは失われた細胞の正常な機能を補うための遺伝子、細胞内の有害な効果を抑制する遺伝子又は細胞を分化させるための遺伝子などであってもよい。
新たな細胞の機能を付加するための遺伝子、弱まった又は失われた細胞の正常な機能を補うための遺伝子及び細胞内の有害な効果を抑制する遺伝子は、例えば、遺伝子治療の分野などにおいて、癌、精神疾患、生活習慣病、神経疾患、自己免疫疾患及び循環器疾患などの疾患を予防、治療又は処置するために用いられる公知の遺伝子であってもよい。そのような遺伝子として、例えば、Ｐ５３遺伝子、ＴＣＲ遺伝子又はＣＡＲ遺伝子などを用いることができる。
細胞を分化させるための遺伝子は、例えば、再生医療の分野などにおいて、幹細胞を所望の機能を有する細胞に分化させるために幹細胞に導入されるべき公知の遺伝子であってもよい。そのような遺伝子として、例えば、ＯＣＴ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃＭｙｃ遺伝子、Ｒｕｎｘ２遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子又はＮａｎｏｇ遺伝子などを用いることができる。
細胞を細胞死に導くための遺伝子は、例えば、遺伝子治療の分野などにおいて、癌、精神疾患、生活習慣病、神経疾患、自己免疫疾患及び循環器疾患などの疾患の病変部や病巣部の細胞を死滅させるために用いられる公知の遺伝子であってもよい。そのような遺伝子として、例えば、ジフテリアトキシン遺伝子又はｂａｘ遺伝子などを用いることができる。
レポーター遺伝子は、細胞の特性によって発現の有無又は量が変化する遺伝子である。細胞の特性とは、例えば、当該細胞で特定の遺伝子が発現しうる状態であるか否か、或いは、細胞が正常であるのか又は異常があるのかであり得る。異常のある細胞とは、特定の疾患に罹患している細胞であり得る。特定の疾患の例は、癌、精神疾患、生活習慣病、神経疾患、自己免疫疾患、及び循環器疾患などであってもよく、或いは前疾患状態、例えば、前癌状態、前糖尿病状態などであってもよい。
レポーター遺伝子は、公知のレポータータンパク質を発現する遺伝子であり得る。レポーター遺伝子は、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、一酸化窒素合成酵素遺伝子、キサンチンオキシダーゼ遺伝子、青色蛍光蛋白質遺伝子、緑色蛍光蛋白質遺伝子、赤色蛍光蛋白質遺伝子又は重金属結合蛋白質遺伝子などであり得る。
細胞に所望の物質を生産させるための遺伝子は、例えば、細胞に生産させるべき所望の物質をコードした公知の遺伝子、又は細胞が所望の物質を生産するために必要な物質をコードした公知の遺伝子などであってもよい。そのような遺伝子として、例えば、インスリン遺伝子、成長ホルモン遺伝子又はインターフェロン遺伝子などを用いることができる。
遺伝子発現カセットは、目的遺伝子の他に、当該目的遺伝子を発現させるための発現制御配列を含み得る。遺伝子発現カセットは、例えば、発現制御配列としてプロモーターを含み得る。プロモーターは、当該目的遺伝子の上流に機能的に連結されて配置され得る。それによって、核酸が導入された細胞の特性が、当該プロモーターが活性化されるような条件を有すれば、目的遺伝子が発現し得る。即ち、細胞の特性が目的遺伝子の有無又は量に反映され得る。
プロモーターは、内性又は外性のプロモーターであり得る。
目的遺伝子がレポーター遺伝子であって、細胞に特定の核酸が導入されているか否かを判断する場合、プロモーターは、外性のプロモーターであってもよい。外性のプロモーターは、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子プロモーターや、これらのMinimalプロモーター、或いは人工的に合成されたプロモーターであり得る。
目的遺伝子がレポーター遺伝子であって、細胞が正常な細胞であるのか又は異常のある細胞であるのかを判断する場合、プロモーターは、内性であり、かつその活性の度合いによって、上述の細胞の特性を判断することができるプロモーターであることが好ましい。その場合、プロモーターの活性の度合いがレポーター遺伝子の発現量に反映され、当該発現量によって細胞の特性を判断することができる。そのようなプロモーターは、例えば、ＣＫ１９プロモーター、Ｋｉ６７プロモーター、又はニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（nicotinamide phosphoribosyl transferase：ＮＡＭＰＴ）プロモーターであり得る。
遺伝子発現カセットは、更に、他の発現制御配列を含んでいることが好ましい。他の発現制御配列は、例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列及び／又は発現を抑制若しくは増強するために使用される任意の調節配列を含み得る。
当該核酸は、遺伝子発現カセットを複数含んでいてもよい。
核酸は、核酸送達キャリアを細胞に接触させた後に核酸が導入された細胞を選択するための遺伝子発現カセットを更に含んでいてもよい。そのような遺伝子発現カセットは、例えば、目的遺伝子が、薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子である遺伝子発現カセットなどである。
核酸を凝縮するとは、例えば、核酸を圧縮して全体の体積を小さくすること、及び／又は複数の核酸を一体とすることなどを意味する。実施形態の核酸凝縮ペプチドは、例えば、アニオン性の核酸の螺旋形状の隙間に結合し、隙間を縮めることによって核酸を凝縮し得る。
核酸凝縮ペプチドは、その一方の端が第１の配列ＲＲＲＲＲＲであり、他方の端が第２の配列ＲＱＲＱＲである。ここにおいて用いられるペプチドの配列を表現するためのアルファベットは、一般的にアミノ酸を一文字表記する際に使用されるアルファベットである。したがって、Ｒは、アルギニンであり、Ｑは、グルタミンである。
例えば、第１の配列がＮ末端側に配置され、第２の配列がＣ末端側に配置されていてもよいし、その逆で、第２の配列がＮ末端側に配置され、第１の配列がＣ末端側に配置されていてもよい。
核酸凝縮ペプチドは、第１及び第２の配列を有することによって、カチオン性を有する。カチオン性を有することによって、核酸を効率的に凝縮することが可能であり、更に、凝縮した核酸のアニオン性を中和し、効率よく核酸を核酸送達キャリアに封入することが可能である。
特に当該核酸凝縮ペプチドが第２の配列を含むことによって、核酸凝縮ペプチドのカチオン性の度合いが抑制され、核酸凝縮ペプチドが全体として適度な度合いのカチオン性を示す。そのため、核酸を均一、安定に凝集させることが可能であり、細胞内に送達された後、効率的に核酸を解離することが可能である。
第１の配列と第２の配列との間には、ＲＲＲＲＲＲ又はＲＱＲＱＲからなる中間配列が含まれていてもよい。中間配列は、核酸凝縮ペプチドに１個含まれていてもよいし、複数含まれていてもよいし、含まれていなくともよい。中間配列が複数含まれる場合、中間配列は全てＲＲＲＲＲＲであってもよいし、全てＲＱＲＱＲであってもよいし、ＲＲＲＲＲＲとＲＱＲＱＲとを両方含んでいてもよい。両方含んでいる場合、その順番は任意であってよく、特に限定されない。
第１の配列、第２の配列及び中間配列のうち、隣り合う２つの配列の間に、中性アミノ酸からなる配列が含まれる。中性アミノ酸は、中性のアミノ酸である。当該中性アミノ酸からなる配列には、中性アミノ酸が２個以上含まれる。中性アミノ酸は、２〜５個含まれることがより好ましい。中性アミノ酸は、グリシン（Ｇ）又はチロシン（Ｙ）を含むことが好ましい。当該２個以上の中性アミノ酸を含むことで、核酸凝縮ペプチドが核酸に結合する構造を取り易くなると考えられる。
核酸凝縮ペプチドの配列内において、当該２個以上の中性アミノ酸が配置される領域（以下、「中性アミノ酸領域」と称する）は、例えば、核酸凝縮ペプチド中に中間配列が含まれない場合、第１の配列及び第２の配列の間に１つ配置される。中間配列が１個含まれる場合、中性アミノ酸領域は、２つ、即ち、第１の配列と中間配列との間に１つ、及び第２の配列と中間配列との間に１つ配置される。中間配列が２個以上含まれる場合、第１の配列と中間配列との間及び第２の配列と中間配列との間に加えて、隣り合う２つの中間配列の間にも配置される。
１つの中性アミノ酸領域に含まれる２個以上の中性アミノ酸は、全て同じアミノ酸からなっていてもよいし、互いに異なっていてもよい。１つの中性アミノ酸領域に中性アミノ酸が３個以上含まれる場合、その中に互いに同種又は異種のアミノ酸が混在していてもよい。
また、中性アミノ酸領域が核酸凝縮ペプチドの配列内に複数存在する場合、中性アミノ酸領域に含まれる中性アミノ酸の数及び種類は、中性アミノ酸領域間で、異なっていてもよいし、同じであってもよい。
核酸凝縮ペプチドの全長は、例えば、５５アミノ酸以下であることが好ましい。この範囲の長さであることによって、核酸が効率よく凝縮され、後述する核酸送達キャリアに封入されやすい。
核酸凝縮ペプチドは、Ｒが、その配列全体に対して４５％以上の割合で含有されることが好ましい。この割合でＲが含まれていることによって、核酸凝縮ペプチドはカチオン性を示し、核酸を凝縮する効率が向上するとともに、核酸を核酸送達キャリアに封入する効率が向上する。
更なる実施形態において、核酸凝縮ペプチドは、硫酸イオンを含む塩として構成されてもよい。核酸凝縮ペプチドが硫酸イオンを含む塩として構成される場合、核酸の細胞内での発現量が向上するため好ましい。
このような核酸凝縮ペプチドは、例えば、以下の配列番号１又は配列番号２の配列からなるペプチドであってもよい。
ＲＱＲＱＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ（ｍＨＰ−１） （配列番号１）
ＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ（ｍＨＰ−３） （配列番号２）。
このような核酸凝縮ペプチドによれば、核酸を効率よく凝縮することが可能である。また、核酸の有するアニオン性を弱めることが可能である。そのため、例えば、効率よく核酸を核酸送達用膜などに封入することが可能である。更に、当該核酸凝縮ペプチドは細胞中で核酸を効率よく解離する。したがって、当該核酸凝縮ペプチドを用いれば、細胞内に導入された核酸を細胞内で効率よく発現させることが可能である。
３．核酸凝縮ペプチドセット
実施形態によれば、核酸凝縮ペプチドセットが提供される。
核酸凝縮ペプチドセットは、上記の核酸凝縮ペプチド（以下、「第１の核酸凝縮ペプチド」と称する）、並びに第２の核酸凝縮ペプチド及び／又は第３の核酸凝縮ペプチドを含む。即ち、核酸凝縮ペプチドセットは、第１の核酸凝縮ペプチド及び第２の核酸凝縮ペプチドを含んでいてもよいし、第１の核酸凝縮ペプチド及び第３の核酸ペプチドを含んでいてもよいし、又は第１の核酸凝縮ペプチド、第２の核酸凝縮ペプチド及び第３の核酸凝縮ペプチドを含んでいてもよい。
以下、第２及び第３の核酸凝縮ペプチドについて説明する。
第２の核酸凝縮ペプチドは、核酸を凝縮するためのペプチドであり、一方の端に第３の配列を有し、他方の端に第４の配列を有する。第３の配列及び第４の配列は、ともにＲＲＲＲＲＲである。ここで、Ｒはアルギニンである。
第２の核酸凝縮ペプチドは、第３の配列と第４の配列との間に、ＲＲＲＲＲＲ又はＲＱＲＱＲからなる中間配列を０個又は１個以上含む。即ち、中間配列は、第２の核酸凝縮ペプチドに１個含まれていてもよいし、複数含まれていてもよいし、含まれていなくともよい。中間配列が複数含まれる場合、中間配列は全てＲＲＲＲＲＲであってもよいし、全てＲＱＲＱＲであってもよいし、ＲＲＲＲＲＲとＲＱＲＱＲとを両方含んでいてもよい。両方含んでいる場合、その順番は任意であってよく、特に限定されない。ここで、Ｑは、グルタミンである。
第３の配列、第４の配列及び中間配列のうち、隣り合う２つの配列の間に２つ以上の中性アミノ酸を含む。中性アミノ酸は、上述の何れかの中性アミノ酸と同じものであってもよい。中性アミノ酸が２〜５個含まれる場合、核酸に結合する構造を取り易いため、より好ましい。
第２の核酸凝縮ペプチドの配列内において、中性アミノ酸が配置される領域、即ち、中性アミノ酸領域は、例えば、第２の核酸凝縮ペプチドに中間配列が含まれない場合、第３の配列及び第４の配列の間に１つ配置される。中間配列が１個含まれる場合、中性アミノ酸領域は、第３の配列と中間配列との間に１つ、及び第４の配列と中間配列との間に１つ配置される。中間配列が２個以上含まれる場合、第３の配列と中間配列との間及び第４の配列と中間配列との間に加えて、隣り合う２つの中間配列の間にも配置される。
１つの中性アミノ酸領域に含まれる中性アミノ酸は、全て同じであってもよい。或いは、異種のアミノ酸が混在していてもよい。
また、中性アミノ酸領域が核酸凝縮ペプチドの配列内に複数存在する場合、中性アミノ酸領域に含まれる中性アミノ酸の数及び種類は、中性アミノ酸領域間で、異なっていてもよいし、同じであってもよい。
第２の核酸凝縮ペプチドの全長は、例えば、５５アミノ酸以下であることが好ましい。この範囲の長さであることによって、核酸が効率よく凝縮され、核酸送達キャリアに封入されやすい。
第２の核酸凝縮ペプチドは、Ｒが、その配列全体に対して６０％以上の割合で含有されることが好ましい。この割合でＲが含まれていることによって、第２の核酸凝縮ペプチドはより強くカチオン性を示し、核酸を凝縮する効率が向上するとともに、核酸を核酸送達キャリアに封入する効率が向上する。
第２の核酸凝縮ペプチドは、硫酸イオンを含む塩として構成されていてもよい。第２の核酸凝縮ペプチドが硫酸イオンを含む塩として構成されている場合、核酸の細胞内での発現量が向上するため好ましい。
第２の核酸凝縮ペプチドは、例えば、以下の配列番号３の配列からなるペプチドであることが好ましい。
ＲＲＲＲＲＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ（ｍＨＰ−２） （配列番号３）
ここで、Ｙはチロシン、Ｇはグリシンである。
以上に説明した構造を有することによって、第２の核酸凝縮ペプチドは、両端のカチオン性が強く、核酸との結合性が高い。したがって、第２の核酸凝縮ペプチドを含む核酸凝縮ペプチドセットを用いることによって、第２の核酸凝縮ペプチドを用いない場合よりも更に効率よく核酸を凝縮することができる。それによってより多くの核酸を核酸送達キャリアに内包することができる。その結果、核酸送達キャリアの外に残存する核酸の量が低減される。核酸送達キャリアの外に残存する核酸は、核酸凝縮ペプチドによって凝集されなかった核酸又は凝集してもその後に核酸凝縮ペプチドから解離された核酸などである。このような核酸送達キャリアの外に残存した核酸は、核酸送達キャリア同士の凝集を引き起こす。ゆえに、上記核酸凝縮ペプチドセットを用いれば、核酸送達キャリア同士の凝集が防止されるため、核酸送達キャリア同士が大きな凝集体を形成することなく、核酸送達キャリアが細胞内に取り込まれやすい。したがって、第２の核酸凝縮ペプチドを用いれば、更に多くの核酸をより効率よく核酸を細胞に導入することが可能である。
加えて、細胞に核酸送達キャリアが入った後、第１の核酸凝縮ペプチドの働きにより核酸はペプチドから容易に解離される。したがって、第２の核酸凝縮ペプチドを含む核酸凝縮ペプチドセットを用いれば、核酸をさらに効率よく細胞内で発現させることができる。
第３の核酸凝縮ペプチドは、ＲＮＡ結合タンパク質であるｈｎＲＮＰ Ａ１のＭ９ドメインからなるペプチドであり、例えば、以下の配列番号６のアミノ酸配列を有する。
ＧＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（Ｍ９）（配列番号６）
ここで、Ｇはグリシン、Ｎはアスパラギン、Ｑはグルタミン、Ｓはセリン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリン、Ｍはメチオニン、Ｋはリシン、Ｒはアルギニン、Ｙはチロシン、Ａはアラニンである。
以上に説明した構造を有する第３の核酸凝縮ペプチドは、複合体を更に凝縮することができる。したがって、第３の核酸凝縮ペプチド用いることによって、更に効率よく核酸を凝縮することができる。それによって、更に粒径の小さい核酸送達キャリアが得られる。そのような核酸送達キャリアは細胞内に取り込まれやすいため、より効率よく核酸を細胞に導入することが可能である。加えて、細胞に核酸送達キャリアが入った後、第１の核酸凝縮ペプチドの働きにより核酸はペプチドから容易に解離される。以上のことから、実施形態の核酸凝縮ペプチドセットを用いれば、核酸をさらに効率よく細胞内で発現させることができる。
第３の核酸凝縮ペプチドは、核酸凝縮ペプチドセットに含まれる第１の核酸凝縮ペプチド及び／又は第２の核酸凝縮ペプチドと連結していてもよい。「連結している」とは、一方のペプチドのＣ末端と他方のペプチドのＮ端とがペプチド結合を形成している状態のことを言う。２つのペプチドが連結する場合、２つのペプチドは、例えば、１〜１０個のアミノ酸を介して連結していてもよい。そのようなアミノ酸は、例えば、グリシン又はシステインなどである。この場合、第３の核酸凝縮ペプチドに連結された第１及び／又は第２の核酸凝縮ペプチドが核酸に結合することによって、第３の核酸凝縮ペプチドが複合体に接触しやすいためより上記の効果を発揮しやすい。
第３の核酸凝縮ペプチドの一方の端には、任意のアミノ酸配列が連結されていてもよい。任意のアミノ酸配列は、核酸送達キャリアに含まれる核酸に結合するアミノ酸配列であることが好ましい。そのような配列として、例えば、核局在化シグナル（nuclear localization signal：ＮＬＳ）などのシグナル配列などを用いることができる。核酸に結合するアミノ酸配列が第３の核酸凝縮ペプチドに連結されていることによって、第３の核酸凝縮ペプチドが複合体に容易に接触することができるので、第３の核酸凝縮ペプチドの上記効果がより発揮されやすい。第３の核酸凝縮ペプチドに、核酸と結合する配列が連結されていない場合、静電気的な力で複合体に第３の核酸凝縮ペプチドが引き寄せられることで第３の核酸凝縮ペプチドの効果が発揮されると考えられる。
核酸凝縮ペプチドセットに第１の核酸凝縮ペプチド及び第２の核酸凝縮ペプチドが含まれる場合、第１の核酸凝縮ペプチド及び第２の核酸凝縮ペプチドは、１：１〜１：５の比で含まれることが好ましい。この場合、より効率よく核酸を細胞内で発現させることが可能である。更に好ましい比は、１：３である。
核酸凝縮ペプチドセットに第１の核酸凝縮ペプチド及び第３の核酸凝縮ペプチドが含まれる場合、第１の核酸凝縮ペプチド及び第３の核酸凝縮ペプチドは、１：０．１〜１：０．８の比で含まれることが好ましい。この場合、より効率よく核酸を細胞内で発現させることが可能である。更に好ましい比は、１：０．２である。
核酸凝縮ペプチドセットに第１の核酸凝縮ペプチド、第２の核酸凝縮ペプチドセット及び第３の核酸凝縮ペプチドが含まれる場合、好ましい第１の核酸凝縮ペプチド、第２の核酸凝縮ペプチドセット及び第３の核酸凝縮ペプチドの比は、例えば、１：１：０．１〜１：１：０．８又は１：３：０．１〜１：３：０．８であり、更に好ましい比は、１：３：０．２である。第１の核酸凝縮ペプチド、第２の核酸凝縮ペプチド及び第３の核酸凝縮ペプチドを含む場合、リポソームにより多くの核酸が内包され、より小さい核酸送達キャリアが得られ、その結果核酸の導入効率が向上するため好ましい。
４．核酸送達キャリア
実施形態の核酸送達キャリアは、複合体と、核酸送達用膜とを備える。
複合体は、上述の核酸凝縮ペプチドと、核酸とを含む。複合体の一例としては、上述の核酸凝縮ペプチドと、核酸とからなる。或いは、複合体は、上述の核酸凝縮ペプチドセットと、核酸とを含む。複合体の一例としては、上述の核酸凝縮ペプチドセットと、核酸とからなる。核酸は、例えば、上述の核酸であり得る。核酸は、核酸凝縮ペプチド又は核酸凝縮ペプチドセットによって凝縮された状態で複合体に含まれ得る。複合体は、複数種類の核酸を含んでいてもよい。
当該複合体は、実施形態の核酸凝縮ペプチドを含むことから、多くの核酸を含み得る。複合体が核酸凝縮ペプチドセットを含み、核酸凝縮ペプチドセットが第２の核酸凝縮ペプチドを含む場合、その複合体はより多くの核酸を含む。
核酸送達用膜は、脂質組成物であることが好ましい。脂質組成物は、例えば、脂質が非共有結合で集合し、親水部を外側に向け、二重層をなす組成物であり得る。脂質は、例えば、リン脂質誘導体、スフィンゴ脂質誘導体、カチオン性脂質、ステロール又はそれらをポリエチレングリコールなどで修飾したものでもよく、或いは、それらの何れかの組み合わせであり得る。核酸送達用膜は、例えば、公知の生体膜であってもよい。
核酸送達用膜は、例えば、略球状であり得る。
核酸送達用膜は、例えば、リポソーム又はベシクル、カプセルなどであり得る。
実施形態の核酸送達キャリアは、当該核酸送達用膜内に当該複合体が封入されたものである。当該核酸送達用膜内に含まれる複合体の数は、限定されるものではないが、１個〜２個であることが好ましい。核酸送達キャリアの粒径は、限定されるものではないが、例えば、１００ｎｍ〜４００ｎｍであり得る。
当該核酸送達キャリアに封入される核酸の量は多く、かつ当該核酸送達キャリアの粒径が小さい。したがって、当該核酸送達キャリアを用いれば、細胞により多くの量の核酸を導入することが可能である。核酸送達キャリアが核酸凝縮ペプチドセットを含み、核酸凝縮ペプチドセットが第２の核酸凝縮ペプチドを含む場合、その核酸送達キャリアはより多くの核酸を含む。またこの場合、上述した通り、核酸送達キャリアに内包されない核酸が少ないため核酸送達キャリア同士が凝集しにくく、より細胞に取り込まれやすい核酸送達キャリアが得られる。第３の核酸凝縮ペプチドを含む場合、核酸送達キャリアはより粒径が小さい。
以上に説明した核酸送達キャリアは、例えば、限定されないが、細胞検出、細胞の機能改変、細胞の死滅及び細胞における物質生産などにおいて用いることができる。
ここにおいて細胞検出とは、例えば、上記のレポーター遺伝子発現カセットを含む核酸を備える核酸送達キャリアを用いて核酸を細胞に導入し、レポーター遺伝子からの信号を検出することによって、細胞の特性、例えば、細胞で特定の遺伝子が発現しうる状態であるか否か、或いは、細胞が正常であるのか又は異常があるのかなどを検出することをいう。異常のある細胞とは、特定の疾患に罹患している細胞であってもよい。特定の疾患の例は、癌、精神疾患、生活習慣病、神経疾患、自己免疫疾患、及び循環器疾患などであってもよく、或いは前疾患状態、例えば、前癌状態、前糖尿病状態などであってもよい。核酸送達キャリアを細胞検出に用いる場合、より効率よく核酸を細胞に導入することが可能であるため、より感度の高い検出が可能である。
ここにおいて細胞の機能改変とは、例えば、上記の細胞の機能を改変するための遺伝子を含む核酸を備える核酸送達キャリアを用いて細胞に核酸を導入することによって、弱まった若しくは失われた細胞の正常な活性を補うこと、有害な細胞の活性を抑制すること又は細胞を分化させることなどである。核酸送達キャリアを細胞の機能改変に用いる場合、より効率よく細胞の機能を改変することができる。細胞の機能改変は、例えば、遺伝子治療又は再生医療の分野などにおいて行われてもよい。この核酸送達キャリアを遺伝子治療に用いる場合、より治療の効果が高まる。この核酸送達キャリアを再生医療に用いる場合、所望の機能を有するように分化し得る細胞若しくは分化した細胞をより効率的に得ることができる。
ここにおいて細胞の死滅とは、例えば、上記の細胞を細胞死に導くことができる遺伝子を含む核酸を備える核酸送達キャリアを用いて細胞に核酸を導入することによって、その細胞を死滅させることである。細胞の死滅は選択的な細胞の死滅であってもよく、例えば、核酸送達キャリアを用いて核酸を導入された細胞のうち、特定の性質を有する細胞のみ死滅させることであってもよい。或いは、核酸送達キャリアによって、細胞に、細胞を細胞死に導くことができる遺伝子を導入し、その遺伝子の存在によって当該細胞が特異的に死滅する薬剤を投与することによって細胞を死滅させてもよい。この核酸送達キャリアを細胞の死滅に用いる場合、より効率よく細胞を死滅させることが可能である。細胞の死滅は、例えば、遺伝子治療の分野などにおいて行われる。この核酸送達キャリアを遺伝子治療に用いる場合、より治療の効果が高まる。
ここにおいて、細胞における物質生産とは、例えば、上記の細胞に所望の物質を生産させるための遺伝子を含む核酸を備える核酸送達キャリアを用いて細胞に核酸を導入することによって、細胞に所望の物質を生産させることである。細胞における物質生産を行う場合、より多くの核酸を細胞に導入できることから、より効率よく細胞における物質生産を行うことができる。
核酸凝縮ペプチドセットを含む核酸送達キャリアを用いれば、上記各用途における効果がより一層高まる。
核酸送達キャリアは、上記用途に応じて、所望の機能向上剤を含んでいてもよい。細胞検出に用いる場合、機能向上剤は、例えば、レポーター遺伝子からの信号を検出するための試薬である。この試薬は、例えば、レポータータンパク質の基質、賦形剤、安定剤、希釈剤又は補助剤、或いはこれらの組み合わせなどを含む。細胞の機能改変に用いる場合、機能向上剤は、例えば、対象の細胞が引き起こす病害を予防、治療又は処置するための薬剤、例えば、抗癌剤、低分子若しくは抗体など、又は分化を促進する薬剤、或いはこれらの組み合わせなどを含む。細胞の死滅に用いる場合、機能向上剤は、例えば、アクチノマイシンＤ、シスプラチン、ベンダムスチン塩酸塩（Ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）又はベツリン酸（Ｂｅｔｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、或いはこれらの組み合わせなどを含む。細胞における物質生産に用いる場合、機能向上剤は、例えば、転写促進剤などを含む。核酸送達キャリアを、上記用途以外に用いる場合は、機能向上剤は、その用途において用いられる所望の薬剤などを含んでもよい。これらの機能向上剤は、複合体とともに核酸送達用膜内に封入されていてもよい。
核酸送達キャリアは、例えば、小分子を生体膜などに封入する際に用いられる公知の方法で作製することができる。そのような方法は、例えば、核酸凝縮ペプチド又は核酸凝縮ペプチドセットを用意すること、用意した核酸凝縮ペプチド又は核酸凝縮ペプチドセットと、核酸とを互いに接触させて複合体を得ること、並びに複合体を核酸送達用膜に封入し核酸送達キャリアを得ることを含む方法によって作製することができる。以下にその工程について詳細に説明する。
まず、核酸凝縮ペプチド又は核酸凝縮ペプチドセットを用意する。核酸凝縮ペプチド又は核酸凝縮ペプチドセットは、公知の何れかの方法により作製することができる。例えば、各核酸凝縮ペプチドは、有機合成化学的手法又は遺伝子工学的手法により合成され得る。各核酸凝縮ペプチドは、例えば、溶媒に溶解されていてもよい。溶媒は、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、又はリン酸緩衝液などの緩衝溶液、生理食塩水、或いは水などであり得る。第３の核酸凝縮ペプチドを含む核酸凝縮ペプチドセットを用意する場合、第３の核酸凝縮ペプチドを他の核酸凝縮ペプチドとは別の溶液中に保存しておいてもよい。
次に、核酸凝縮ペプチド又は核酸凝縮ペプチドセットと、核酸とを互いに接触させて複合体を得る。核酸は、核酸凝縮ペプチドと接触する前に、溶媒に溶解されていてもよい。そのような溶媒は、例えばＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、又はリン酸緩衝液などの緩衝溶液、生理食塩水、或いは水などであり得る。その場合、溶液全体に対する核酸の濃度は、限定されるものではないが、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２．０ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。
核酸凝縮ペプチド又は核酸凝縮ペプチドセットと、核酸とを互いに接触させることは、例えば、核酸凝縮ペプチド又は核酸凝縮ペプチドセットを含む上述の何れかの溶媒に核酸を添加するか、或いは核酸を含む溶媒に核酸凝縮ペプチドを添加することによって行われ得る。当該添加は、撹拌しながら行われることが好ましい。この時、最終的な溶液の核酸に対する核酸凝縮ペプチドの重量比は、０．７〜１であることが好ましい。第３の核酸凝縮ペプチドが別の溶媒に保存されている核酸凝縮ペプチドセットを用いる場合、第３の核酸凝縮ペプチド以外の核酸凝縮ペプチドと核酸とを接触させて核酸を凝縮させた後、第３の核酸凝縮ペプチドをそこに添加して、核酸凝集物と第３の核酸凝縮ペプチドを接触させてもよい。この接触は、撹拌しながら行うことが好ましい。
当該接触によって、複合体が得られ得る。
次いで、複合体を核酸送達用膜に封入する。核酸送達用膜は、前述したものであり得る。当該封入は、例えば、小分子を生体膜などに封入する際に用いられる公知の方法で行われ得る。そのような方法は、例えば、核酸送達用膜の原料である上述の脂質を含む脂質溶液に、得られた複合体を添加することを含み得る。脂質溶液には、例えば、脂質の他に、溶媒としてのエタノール、クロロホルム、又はメタノールなどが含まれていてもよい。脂質溶液は、限定されるものではないが、例えば、脂質を１．０ｍｇ／ｍｌ〜１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含むことが好ましい。当該添加は、撹拌しながら行うことが好ましい。
当該添加によって、複合体が核酸送達用膜に封入され得る。それによって、核酸送達キャリアが得られ得る。
得られた核酸送達キャリアは、溶媒中に溶解されていてもよい。溶媒は、例えば、ＨＥＰＥＳ、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、又はリン酸緩衝液などの緩衝溶液、生理食塩水、或いは水などであり得る。
５．核酸送達方法
実施形態によれば、上記の核酸凝縮ペプチドを用いた核酸送達方法が提供される。
実施形態の核酸送達方法の一例を図２に示す。当該核酸送達方法は、（Ａ）核酸送達キャリアを用意することと、（Ｂ）核酸送達キャリアを細胞に接触させて核酸を細胞に送達することとを含む。
工程（Ａ）は、上記何れかの方法により、上記の何れかの所望の核酸送達キャリアを作製することにより行うことができる。
（Ｂ）において、（Ａ）で得られた核酸送達キャリアを細胞に接触させて、核酸を細胞に送達する。
細胞は、例えば、ヒト、動物又は植物由来のものであり得る。細胞は、生体内の細胞であってもよいし、生体外に取り出された細胞であってもよい。そのような細胞は、例えば、血液、血球、尿、便、汗、唾液、口腔内粘膜、喀痰、リンパ液、髄液、涙液、母乳、羊水、精液、組織、バイオプシー、培養細胞などの生体物質、或いはそれらを材料として用いて調製さ・BR>黷ス調製物などの試料に含まれる細胞であり得る。細胞は、例えば、単離されたものであってもよいし、株化されたものであってもよい。
このような細胞に核酸送達キャリアを互いに接触させる。細胞が生体外に取り出された細胞である場合、接触は、例えば、培地、緩衝液、生理食塩水などに細胞を懸濁し、当該懸濁液に核酸送達キャリアを添加することを含み得る。或いは、細胞を含む試料に直接核酸送達キャリアを添加することを含んでもよい。核酸送達キャリアを添加した後、穏やかに撹拌することが好ましい。更に、核酸送達キャリアを添加した後、細胞を培養してもよい。培養は、例えば、当該細胞の培養に適した温度条件、及び二酸化炭素条件の下で、約４時間〜約１２時間以上に亘り行われ得る。
細胞が生体内の細胞である場合、接触は、例えば、キャリアを接触させるべき標的の細胞を含む生体に核酸送達キャリアを投与することによって行われる。投与は、例えば、非経口経路、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、眼内、肝内、病変内及び頭蓋内への注射又は点滴などによって行うことができる。
当該接触によって、核酸送達キャリアが細胞内に導入され、核酸が細胞に送達され得る。核酸は、核内に導入され得る。
更なる実施形態において、核酸送達方法は、核酸送達キャリアを細胞に接触させる前又は接触させた後に、細胞の細胞膜に細孔を開ける工程を含んでもよい。細胞膜に細孔を開ける工程は、例えば、電気穿孔法又は超音波穿孔法より行われ得る。それは、例えば、細胞に電圧又は超音波を印加することによって行われ得る。
当該核酸送達方法によれば、核酸を効率的に大量に細胞に送達することが可能である。また、細胞に導入された核酸は、効率的に核酸凝縮ペプチドと解離し、効率よく発現される。
当該核酸送達方法は、例えば、限定されないが、上記の細胞検出、細胞の機能改変、細胞の死滅、及び細胞における物質生産などにおいて、核酸を細胞に導入するために用いることができる。この方法を用いれば、上記の説明の通り、各用途において、より感度の高い細胞検出、より効率の高い細胞の機能改変及び細胞の死滅、より効果の高い遺伝子治療、より効率の良い細胞による物質生産などが可能である。
６．細胞作製方法
実施形態によれば、上記核酸凝縮ペプチドを用いた細胞を作製する方法が提供される。当該細胞を作製する方法は、（Ｃ）核酸送達キャリアを用意することと、（Ｄ）核酸送達キャリアを細胞に接触させて核酸を細胞に送達することと、（Ｅ）上記（Ｄ）で得られた細胞を培養すること、及び（Ｆ）細胞のうち、核酸が導入された細胞を選択することを含む。
工程（Ｃ）及び（Ｄ）は、上記工程（Ａ）及び（Ｂ）の説明に記載した核酸送達方法を実行することによって行うことができる。
工程（Ｅ）において、（Ｄ）で得られた細胞を培養する。培養は、例えば、用いた細胞を培養するのに適した公知の培養方法で行うことができる。培養は、例えば、限定されないが、細胞を適切な培地上で適切な二酸化炭素濃度、温度の条件の下約４〜１２時間以上インキュベートすることなどによって行うことができる。
工程（Ｆ）において、核酸が導入された細胞を選択する。選択は、限定されないが、例えば、核酸送達キャリアに含ませる核酸に薬剤耐性遺伝子発現カセットを含ませていた場合、細胞を対応する薬剤で処理することによって行うことできる。或いは、例えば、核酸にレポーター遺伝子発現カセットを含ませておいた場合、レポーター遺伝子からの信号を検出し、所望の信号が得られた細胞を取り出す、残す又は記録することなどによって行うことできる。
当該細胞作製方法によれば、より効率よく、導入するべき核酸をより多く含み、それらがより効率よく発現する細胞を得ることができる。また、当該核酸作製方法によれば、例えば、限定されないが、新たな機能を付加した細胞、弱まった若しくは失われた細胞の正常な機能がより十分に補われた細胞、細胞内の有害な効果がより抑制された細胞、所望の機能を有する細胞に分化し得る若しくは分化した細胞をより効率的に作製することができる。そのため、遺伝子治療や再生医療などにおいてより効果的な治療が可能である。また、より大量に物質を生産する細胞を作製することができる。
７．細胞検出方法
実施形態によれば、核酸送達方法を用いた細胞検出方法が提供される。
実施形態の細胞検出方法の一例を図３に示す。当該細胞検出方法は、（Ｉ）核酸送達キャリアを用意することと、（ＩＩ）核酸送達キャリアを細胞に接触させて核酸を細胞に送達することと、（ＩＩＩ）核酸に含まれるレポーター遺伝子からの信号を検出することと、（ＩＶ）検出された信号から細胞の特性を判断することとを含む。ここで、核酸送達キャリアに含まれる核酸はレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子発現カセットを含む。
工程（Ｉ）及び（ＩＩ）は、核酸が、レポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子発現カセットを含む核酸を備える核酸送達キャリアを用いて、上記工程（Ａ）及び（Ｂ）の説明に記載した核酸送達方法を実行することによって行うことができる。
（ＩＩＩ）において、レポーター遺伝子からの信号を検出する。レポーター遺伝子からの信号は、例えば、レポーター遺伝子の発現によって生じたレポータータンパク質からの信号であり得る。信号の検出は、信号の有無の検出であってもよいし、信号の強度の検出であってもよい。信号の検出は、レポータータンパク質の種類及び／又は信号の種類に応じて選択された何れかの公知の装置を用いて行えばよい。装置の例は、発光測定装置、蛍光測定装置、Ｘ線測定装置、電子スピン共鳴装置、核医学診断装置、磁気共鳴イメージング装置及び／又は発光／蛍光顕微鏡などであり得る。
必要に応じて、機能補助剤として、当該信号を検出するための試薬を用いてもよい。試薬は、例えば、レポータータンパク質の基質、賦形剤、安定剤、希釈剤及び／又は補助剤などであり得る。試薬は、核酸送達キャリアに含ませて用いてもよいし、後から添加してもよい。
（ＩＶ）において、前記（ＩＩＩ）で検出された信号から細胞の特性を判断する。
レポーター遺伝子は、細胞の特性によって発現の有無又は量が変化する遺伝子であることから、レポーター遺伝子の発現の有無又は量によって細胞の特性を判断することができる。
細胞の特性を判断するとは、例えば、（ＩＩＩ）で検出された信号の有無又は強度によって、細胞に特定の核酸が導入されているか否か、或いは、細胞が正常であるのか又は異常があるのかを判断することであり得る。更に、細胞に異常があると判断することと同時又はその後に、細胞が罹患している疾患の種類が判断されてもよい。特定の疾患の例は、上述した例であり得る。
必要に応じて、別途、（ＩＩＩ）で得られた検出結果と、細胞の特性が既知の対象細胞から得られたレポータータンパク質の検出量とを比較することによって細胞の特性を判断してもよい。
細胞特性の判断は、例えば、検出された信号を自動的に数値化する公知の装置によって得られた値を用いて行われてもよいし、発光／蛍光顕微鏡などを用いて細胞を観察することにより行われてもよい。
当該方法によれば、核酸が効率的に細胞に導入され、かつ効率的に発現するため、細胞の特性を高い精度で判断することができる。それによって、例えば、異常な細胞を高感度で検出することが可能である。
８．キット
更なる実施形態によれば、核酸送達キャリアを含むキットが提供される。
キットは、上述の何れかの核酸送達キャリアと、望ましくは、機能向上剤を含む。
核酸送達キャリアは、溶媒と共に容器に封入されてアッセイキットに含まれ得る。溶媒は、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液などの緩衝溶液、生理食塩水、或いは水などであり得る。キットは、複数種類の核酸送達キャリアを含んでいてもよい。
機能向上剤は、上述の何れかの機能向上剤である。キットは、複数種類の機能向上剤を含んでいてもよい。
当該核酸送達キャリア及び機能向上剤は、個別に又は何れかが組み合わされて容器に含まれて提供され得る。
キットは、核酸を検出するためのキットであってもよい。その場合、核酸送達キャリアに含まれる核酸は、レポーター遺伝子発現カセットを含み、機能向上剤は、核酸に含まれるレポーター遺伝子からの信号を検出するための試薬を含む。試薬は、例えば、レポータータンパク質の基質、賦形剤、安定剤、希釈剤又は補助剤、或いはこれらの組み合わせなどであり得る。
当該キットを用いれば、核酸が効率的に細胞に導入され、かつ効率的に発現するため、高い精度で細胞の特性を判断することができる。それによって、例えば、細胞を高感度で検出することが可能である。
キットは、細胞の機能を改変するためのキットであってもよい。その場合、核酸送達キャリアに含まれる核酸は、細胞の機能を改変するための遺伝子、例えば、新たな細胞の機能を付加するための遺伝子、弱まった若しくは失われた細胞の正常な機能を補うための遺伝子、細胞内の有害な効果を抑制する遺伝子又は細胞を分化させるための遺伝子などを含む遺伝子発現カセットを含み、機能向上剤は、対象の細胞が引き起こす病害を予防、治療又は処置するための薬剤、例えば、抗癌剤、低分子若しくは抗体など、又は分化を促進する薬剤、或いはこれらの組み合わせなどを含む。このキットを用いれば、より効率よく細胞の機能を改変することができる。
キットは、細胞を死滅させるためのキットであってもよい。その場合、核酸送達キャリアに含まれる核酸は、細胞を細胞死に導く遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含み、機能向上剤は、アクチノマイシンＤ、シスプラチン、ベンダムスチン塩酸塩又はベツリン酸、或いはこれらの組み合わせなどを含む。このキットを用いれば、より効率よく細胞を死滅させることが可能である。
キットは、細胞における物質生産を行うためのキットであってもよい。その場合、核酸送達キャリアに含まれる核酸は、細胞に所望の物質を生産させるための遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含み、機能向上剤は、転写促進剤などを含む。このキットを用いれば、より多くの核酸を細胞に導入できることから、より効率よく細胞における物質生産を行うことができる。
核酸凝縮ペプチドセットを含む核酸送達キャリアを含むキットを用いれば、上記各用途における効果がより一層高まる。
［例］
＜例１＞
実施形態のペプチドによる核酸の凝縮性及びペプチド−核酸複合体の電位を評価した。
表１に示す５種類のペプチド、即ち、サケ由来のプロタミン由来ペプチド配列（以下「プロタミン」と記す）、ｍＨＰ−１、ｍＨＰ−２、ｍＨＰ−３及びｍＨＰ−４を作製した。
Figure 2019511566
各ペプチドを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．３）に溶解し、それぞれにおいてペプチドの濃度の異なる複数のペプチド溶液を調製した。
プロタミンに関して、ペプチドの濃度が２．１ｍｇ／ｍｌ（１）、２．４ｍｇ／ｍＬ（２）、２．７ｍｇ／ｍｌ（３）になるように、３つのペプチド溶液を調製した。ｍＨＰ−４に関して、ペプチドの濃度が、１．８ｍｇ／ｍｌ（４）、２．１ｍｇ／ｍｌ（５）、２．４ｍｇ／ｍＬ（６）、２．７ｍｇ／ｍｌ（７）になるように、４つのペプチド溶液を調製した。ｍＨＰ−１に関して、ペプチドの濃度が２．１ｍｇ／ｍｌ（８）、２．４ｍｇ／ｍＬ（９）、２．７ｍｇ／ｍｌ（１０）になるように、３つのペプチド溶液を調製した。ｍＨＰ−２に関して、ペプチドの濃度が１．２ｍｇ／ｍｌ（１１）、１．５ｍｇ／ｍｌ（１２）、２．１ｍｇ／ｍｌ（１３）、２．４ｍｇ／ｍＬ（１４）、２．７ｍｇ／ｍｌ（１５）になるように、５つのペプチド溶液を調製した。ｍＨＰ−３に関して、ペプチドの濃度が２．１ｍｇ／ｍｌ（１６）、２．４ｍｇ／ｍＬ（１７）、２．７ｍｇ／ｍｌ（１８）になるように、３つのペプチド溶液を調製した。また、プラスミドベクター（ｐＤＮＡ）を精製水で希釈し、ｐＤＮＡ濃度が３．０ｍｇ／ｍｌである核酸溶液を調製した。
チューブに入れた核酸溶液（９０μＬ）を１８セット用意し、それぞれに、撹拌しながら上述の（１）〜（１８）のペプチド溶液（９０μＬ）を滴下して混合し、核酸を凝縮させ、ペプチド−核酸複合体を得た。その後、当該各混合物を精製水で２５倍にそれぞれ希釈したペプチド−核酸溶液を作製した。また、参考用として、核酸溶液を添加せず、各ペプチドのみを含むサンプルもそれぞれ調製した。
当該各ペプチド−核酸溶液を用いて、ペプチド−核酸複合体の平均粒子径及びＺｅｔａ電位を調査した。平均粒子径とＺｅｔａ電位とは、ゼータサイザーを用いて測定した。
結果を表２、図４及び図５に示す。図４の（ａ）〜（ｅ）は、各ペプチド−核酸溶液に含まれるペプチド−核酸複合体の粒子径の分布を示す。図５の（ｆ）〜（ｊ）は、各ペプチド−核酸溶液に含まれるペプチド−核酸複合体のＺｅｔａ電位の分布を示す。
Figure 2019511566
表２、図４及び図５の結果から、ｍＨＰ−１及びｍＨＰ−３を用いたサンプルでは、他のサンプルと比較して平均粒子径が小さく、径のばらつきも少ないことが明らかとなった。このことから、ｍＨＰ−１及びｍＨＰ−３は核酸を凝縮する性質において優れており、均一な粒子径のペプチド−核酸複合体を形成することが分かった。したがって、ペプチド配列の一方の末端がＲＱＲＱＲ、他方の末端がＲＲＲＲＲＲであるペプチドは、核酸凝縮性能に優れていることが示唆された。また、何れのサンプルにおいても、Ｚｅｔａ電位の値が−３０ｍＶ前後であり、リポソームに封入されやすい電荷を有する複合体が形成されることが分かった。
＜例２＞
実施形態のペプチドによる核酸の凝縮性及びペプチドと核酸との解離性をゲル遅延度アッセイ（Ｇｅｌ Ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）によって評価した。
凝縮性評価用サンプルとして、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．３）８．０μＬを１８セット用意し、そこに例１の各ペプチド−核酸溶液１．０μＬとポリグルタミン酸（ＰＧＡ）溶液１．０μＬを加えて混合した混合物を調製した。解離性評価用サンプルとして、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．３）８．０μＬに、各ペプチド−核酸溶液１．０μＬとポリグルタミン酸（ＰＧＡ）溶液１．０μＬを加えて混合した混合物を調製した。それらを室温に１５分間静置した後、各混合物に電気泳動バッファー（５０％ショ糖溶液）を１．０μＬ加えてよく混合し、０．８％アガロースゲルで電気泳動を行った。泳動後、エチジウムブロマイドで染色された核酸を、ＵＶ照射で可視化し、ペプチドに凝縮された核酸及びペプチドと解離してゲル中に移動した核酸を検出した。
結果を図６に示した。図６は、上記アガロースゲルにＵＶ照射して撮影した写真である。各サンプルの番号が示す２つのレーンのうち、左側のレーンがＰＧＡ（−）サンプル（凝縮性評価用サンプル）、右側のレーンがＰＧＡ（＋）サンプル（解離性評価用サンプル）の結果を示している。左側のレーンにおいて、分子量が大きな強く光るまとまった１つのバンドが観察されれば、凝縮性が高いと評価した。右側のレーンにおいて、分子量５〜７ｋｂｐの強く光る２つのバンドが観察されれば解離性が高いと評価した。ｍＨＰ−１及びｍＨＰ−３は、どの濃度のサンプルにおいても凝縮性及び解離性の両方が優れていた。特に、ペプチド−核酸溶液（８）及び（１６）が優れていた。したがって、ペプチド配列の一方の末端がＲＱＲＱＲ、他方の末端がＲＲＲＲＲＲであるペプチドは、両端がＲＲＲＲＲＲであるもの又はプロタミン由来のペプチド配列よりも核酸凝縮性能及び解離性ともに優れていることが示唆された。
＜例３＞
実施形態のペプチドによるリポソームへの核酸の内包性の評価を行った。
リポソームへのペプチド及び核酸の封入
ＣＯＡＴＳＯＭＥ／ＳＳ−２０（日本油脂）、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ−ＰＥＧをそれぞれ５：３：１：０．３のモル比でエタノール中に溶解し脂質溶液を得た。チューブに入れた脂質溶液（０．５ｍｌ）を２セット用意し、当該各脂質溶液に、撹拌しながら、例１の（８）（ｍＨＰ−１）及び（１６）（ｍＨＰ−３）のペプチド−核酸溶液をそれぞれ０．５ｍｌ滴下し、リポソーム化した。当該各リポソーム溶液に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．３）を９ｍＬそれぞれ添加し、総量１０ｍｌとした（以下このリポソーム溶液を「Ｃｏｍｐｌｅｘ」と記す）。更に、当該リポソームを生体に取り込ませる場合を仮定し、Ｃｏｍｐｌｅｘの溶媒であるエタノールをＨＥＰＥＳに置換したリポソーム溶液（以下「ＨＥＰＥＳ置換」と記す）を作製した。「ＨＥＰＥＳ置換」は、Ｃｏｍｐｌｅｘの各溶液を、３００ｋＤａ用の限外ろ過膜により１．５ｍｌに濃縮し、更に１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を８．５ｍｌそれぞれを加え、限外ろ過を行った後、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）に溶媒を置換し、最終的に０．５ｍＬに濃縮することによって作製した。更に、「ＨＥＰＥＳ置換」を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過滅菌した溶液（以下「０．４５μｍ」と記す）を調製した。
内包性の確認
以上のように調製された、プロタミン、ｍＨＰ−１、ｍＨＰ−３をそれぞれ含む「ペプチド−核酸溶液」、「ＨＥＰＥＳ置換」及び「０．４５μｍ」を用いて、リポソームの平均粒子径、Ｚｅｔａ電位、プラスミド内包量を調査した。平均粒子径とＺｅｔａ電位とは、ゼータサイザーを用いて測定した。プラスミド内包量は、Ｑｕａｎｔ―ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡアッセイキットを用いて測定した。
結果を表３、図７及び図８に示す。図７の（ａ）〜（ｃ）は、各溶液に含まれるペプチド−核酸溶液及びリポソームの粒子径の分布を示す。図８の（ｄ）〜（ｆ）は、溶液に含まれるペプチド−核酸溶液及びリポソームのＺｅｔａ電位の分布を示す。
Figure 2019511566
ｍＨＰ−１及びｍＨＰ−３どちらのサンプルにおいても、プロタミンを含むサンプルよりも平均粒子径が小さく、プラスミド内包量が多かった。したがって、ペプチド配列の一方の末端がＲＱＲＱＲ、他方の末端がＲＲＲＲＲＲであるペプチドは、プロタミン由来のペプチド配列よりも核酸凝縮性能及びリポソームへの内包性に優れていることが分かった。
＜例４＞
ゲル遅延度アッセイによって実施形態のペプチドによるリポソームへの核酸の内包性の評価を行った。
内包性評価用サンプルとして、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）８．０μＬを２セット用意し、例３のｍＨＰ−１又はｍＨＰ−３を含む「Ｃｏｍｐｌｅｘ」の各溶液１．０μＬと、リポソームを開裂させるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、最終濃度：１％）とを加えて混合したものを調製した。加えて、コントロールとして、ＳＤＳの代わりにポリグルタミン酸（ＰＧＡ）溶液１．０μＬを加えて混合したもの、並びにＳＤＳもＰＧＡも含まないサンプルを調製した。各溶液を室温で１５分間静置した後、それぞれに電気泳動バッファー（５０％ショ糖溶液）を１．０μＬ加えてよく混合し、０．８％アガロースゲルで電気泳動を行った。泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド溶液に浸して核酸を染色し、ＵＶ照射しながらゲルを撮影し、核酸を検出した。
結果を図９に示す。図９は、上記アガロースゲルにＵＶ照射して撮影した写真である。ｍＨＰ−１及びｍＨＰ−３どちらのサンプルにおいても、リポソームが開裂されているＳＤＳを含む溶液を泳動したレーンにおいて、分子量の小さい領域に強く光るバンドが観察された。この結果から、ｍＨＰ−１及びｍＨＰ−３のペプチドを用いて作成されたリポソーム内に核酸がよく内包されることが示された。
＜例５＞
実施形態のペプチドによって核酸を内包したリポソームによる、核酸の細胞への導入度合いを評価した。
リポソームの作製
リポソームに内包する核酸として、ｐＡｍｐ−ＣＭＶ−ｎＬｕｃを使用した。ｐＡｍｐ−ＣＭＶ−ｎＬｕｃは、ＮａｎｏＬｕｃ遺伝子をレポーター遺伝子として含むレポーターベクターである。ｐＡｍｐ−ＣＭＶ−ｎＬｕｃは、遺伝子発現用プロモーターとしてのＣＭＶプロモーターを含み、その下流にＮａｎｏＬｕｃ遺伝子と、ＩＲＥＳ配列と、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の複製開始白質（ＬＴ、ラージＴ抗原）遺伝子とがこの順番で連結され、その下流にＳＶ４０の複製開始配列（ＳＶ４０ｏｒｉ）を含む。当該核酸と、例３のプロタミン、ｍＨＰ−１及びｍＨＰ−３のペプチドを用いて、例３と同様の方法でリポソーム溶液を作製した。
リポソームの細胞への導入
上述のように作成したリポソーム溶液を、ヒト正常乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）（クラボウ）に添加した。ＨＭＥＣは、ＨＭＥＣ凍結ストックから起眠後、３７度、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で６〜７日間培養したものを用いた。ＨＭＥＣを培養した培地は、ＭａｍｍａｒｙＬｉｆｅ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（クラボウ）に、ＭａｍｍａｒｙＬｉｆｅ ＬｉｆｅＦａｃｔｏｒｓ（クラボウ）を添加した培地であり、培地中の各成分の最終濃度は、インスリン：５ｍｇ／ｍＬ、Ｌ−グルタミン：６ｍＭ、エピネフリン：１ｍＭ、アポ−トランスフェリン：５ｍｇ／ｍＬ、ＴＧＦａ：０．５ｎｇ、ＥｘｔｒａｃｔＰ：０．４％、コハク酸ヒドロコルチゾン：１００ｎｇ／ｍＬであった。培養後、ＨＭＥＣを０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡを用いて、培養底面から剥離させた後、２００×ｇ、３分間の遠心で細胞を回収したのち、細胞数が１．４〜１．６×１０４細胞／１００μＬとなるように新鮮な培地を用いて調整した。この細胞縣濁液１５０μＬに対して、前記リポソーム溶液を１０μＬ加え、穏やかに混合した後、３７℃、５％のＣＯ２雰囲気下でさらに細胞を培養した。
細胞の検出
リポソームの添加から４８時間後に、発光基質（Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１／２０００希釈となるように培地に加えた。この培養ディッシュをＬＶ２００（オリンパス社製発光イメージングシステム)にセットして撮影した。撮影条件は、以下の通りであった。対物レンズ倍率：×２０、結像レンズ倍率：×０．２、露光時間：明視野１００ｍｓ、暗視野１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、ＥＭＧａｉｎ：明視野４、暗視野６１０。ＬＶ２００とＩｍａｇｅＭＥＸの制御及び撮影した明視野と暗視野像の画像処理は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ）で行った。
結果を図１０に示す。写真中の白く光る点は、ベクターが導入され、レポーター遺伝子が発現された細胞である。ｍＨＰ−１を用いたサンプルで、最も多くの細胞で発光が観察された。ｍＨＰ−３を用いたサンプルでは、プロタミンを用いたサンプルよりも多くの細胞で発光が観察された。この結果から、ｍＨＰ−１及びｍＨＰ−３を用いた核酸を細胞へ送達する方法によれば、細胞への核酸送達量が多く、かつ送達された核酸の発現量も多いことが示唆された。この結果を引き起こした一つの理由として、例１〜４の結果に示される通り、プロタミンよりも、ｍＨＰ−１及びｍＨＰ−３の方が核酸の凝縮性及び解離性に優れ、リポソームへの核酸の内包性も優れていることが考えられる。
以上の実験結果から、実施形態のペプチドは従来よりも核酸凝縮性、及び核酸解離性に優れており、その結果、実施形態のペプチドによって効率的にリポソームに核酸が内包されること、当該リポソームを用いた実施形態の核酸を細胞に送達する方法によってより効率的に細胞により多くの核酸を導入できること、及び当該方法によって細胞に送達された核酸がより効率的に発現され、当該核酸が発現された細胞を検出できることが明らかとなった。 ＜例６＞
実施形態のペプチドによる核酸の凝縮性及びペプチド−核酸複合体の電位を評価した。
表４に示す２種類のペプチド、即ち、ｍＨＰ−１及びｍＨＰ−２を作製した。
Figure 2019511566
各ペプチドを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．４）に溶解し、それぞれにおいてペプチド濃度の異なる複数のペプチド溶液を調製した。
ｍＨＰ−１に関して、ペプチドの濃度が０．２４ｍｇ／ｍｌ（１）になるように、１つのペプチド溶液を調製した。ｍＨＰ−２に関して、ペプチドの濃度が０．２４ｍｇ／ｍｌ（２）になるように、１つのペプチド溶液を調製した。ｍＨＰ−１及びｍＨＰ−２に関して、全ペプチドの濃度が０．２４ｍｇ／ｍｌであり、ｍＨＰ−１とｍＨＰ−２との混合比が１：１（３）、１：３（４）、１：５（５）、１：７（６）、１：９（７）になるように、５つのペプチド溶液を調製した。また、プラスミドベクター（ｐＤＮＡ）を精製水で希釈し、ｐＤＮＡ濃度が０．１５ｍｇ／ｍｌである核酸溶液を調製した。
チューブに上述の（１）〜（７）ペプチド溶液（１００μＬ）を用意し、それぞれを撹拌しながら核酸溶液（２００μＬ）を滴下して混合し、核酸を凝縮させ、ペプチド−核酸複合体を得た。
当該各ペプチド−核酸溶液を用いて、ペプチド−核酸複合体の平均粒子径、多分散性指数及びＺｅｔａ電位を調査した。平均粒子径、多分散性指数及びＺｅｔａ電位は、ゼータサイザーを用いて測定した。
結果を表５に示す。
Figure 2019511566
表５の結果から、何れのサンプルにおいても、平均粒子径は１４０〜１６０ｎｍ前後、ＰＤＩは０．３以下、Ｚｅｔａ電位の値は−３０ｍＶ前後であった。このことから、ｍＨＰ−１とｍＨＰ−２の混合比に関わらず、リポソームに封入されやすい粒子径と電荷を有するペプチド−核酸複合体が均一に形成されることが分かった。
＜例７＞
実施形態のペプチドによる核酸の凝縮性及びペプチドと核酸との解離性を、ゲル遅延度アッセイによって評価した。
凝縮性評価用サンプルとして、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．４）５．５μＬを７セット用意し、そこに例６の各ペプチド−核酸溶液４．５μＬを加えて混合したものを調製した。解離性評価用サンプルとして、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．４）４．５μＬを７セット用意し、そこに例６の各ペプチド−核酸溶液４．５μＬとポリグルタミン酸（ＰＧＡ）溶液１．０μＬを加えて混合したものを調製した。それらを室温に１０分間静置した後、各混合物に電気泳動バッファー（５０％ショ糖溶液）を１．０μＬ加えてよく混合し、０．８％アガロースゲルで電気泳動を行った。泳動後、エチジウムブロマイドで染色された核酸を、ＵＶ照射で可視化し、ペプチドによって凝縮された核酸及びペプチドと解離してゲル中に移動した核酸を検出した。
結果を図１１に示した。図１１は、上記アガロースゲルにＵＶ照射して撮影した写真である。各サンプルが示す２つのレーンのうち、左側のレーンがＰＧＡ（−）サンプル（凝縮性評価用サンプル）、右側のレーンがＰＧＡ（＋）サンプル（解離性評価用サンプル）の結果を示している。左側のレーンにおいて、分子量が大きな強く光るまとまった１つのバンドが観察されれば、凝縮性が高いと評価した。右側のレーンにおいて、分子量５〜１０ｋｂｐの領域に強く光るバンドが観察されれば、解離性が高いと評価した。図１１の結果より、ｍＨＰ−１とｍＨＰ−２とを混合して作製したペプチド−核酸複合体は、ｍＨＰ−１単独の場合と比べて、解離性が低減されていた。また、ｍＨＰ−２単独の場合と比べて凝縮性が高かった。したがって、ｍＨＰ−１とｍＨＰ−２と両方含む場合は、高い凝縮性を持ち、かつｍＨＰ−１単独の場合とｍＨＰ−２単独の場合と中間の解離性を有することが示された。特に、ｍＨＰ−１とｍＨＰ−２の混合比が１：１〜１：５の場合が優れていた。
＜例８＞
実施形態のペプチドによるリポソームへの核酸の内包性を評価した。
ＣＯＡＴＳＯＭＥ／ＳＳ−２０（日本油脂）、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ−ＰＥＧをそれぞれ５：３：１：０．３のモル比でエタノール中に溶解して、脂質溶液を得た。チューブに脂質溶液５０μＬを５セット用意し、撹拌しながら、例６で作製したペプチド−核酸溶液（１）〜（４）および（７）をそれぞれ５０μＬ滴下し、リポソーム化した。当該各リポソーム溶液に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．４）４００μＬをそれぞれ添加し、総量５００μＬとした（以下このリポソーム溶液を「Ｃｏｍｐｌｅｘ」と記す）。
当該Ｃｏｍｐｌｅｘを用いて、リポソームの平均粒子径、多分散性指数及びＺｅｔａ電位を調査した。平均粒子径、多分散性指数及びＺｅｔａ電位は、ゼータサイザーを用いて測定した。
結果を表６に示した。
Figure 2019511566
表６の結果から、何れのサンプルにおいても、平均粒子径は２３０〜２５０ｎｍ前後、ＰＤＩは０．３以下、Ｚｅｔａ電位の値は３５ｍＶ前後であった。このことから、ｍＨＰ−１とｍＨＰ−２の混合比に関わらず、リポソームが均一に形成されることが分かった。
＜例９＞
実施形態のペプチドによるリポソームへの核酸の内包性を、リポソームに内包された核酸量の測定によって評価した。リポソームに内包された核酸量は、ＡｃｃｕＢｌｕｅ（登録商標）ｄｓＤＮＡ定量キットを用いて測定した。
例８で作製した当該各Ｃｏｍｐｌｅｘを用いて、Ｃｏｍｐｌｅｘの溶媒であるエタノールをＨＥＰＥＳに置換したリポソーム溶液（以下「ＨＥＰＥＳ置換」と記す）を作製した。ＨＥＰＥＳ置換は、Ｃｏｍｐｌｅｘ４００μＬに１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．４）を４００μＬ加えて、３００ｋＤａ用の限外ろ過膜により２００μＬに濃縮し、さらに１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）２．１ｍｌを加えて限外ろ過を行うことで溶媒を置換し、最終的に１００μＬに濃縮することによって作製した。
全核酸定量用サンプルとして、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）８μＬを５セット用意し、そこに上述の各ＨＥＰＥＳ置換１μＬと、リポソームを開裂させるＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（登録商標、最終濃度：１％）１．０μＬを加えて混合したものを調製した。未内包核酸定量用サンプルとして、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）９μＬを５セット用意し、そこに上述の各ＨＥＰＥＳ置換１μＬを加えて混合したものを調製した。それらを室温に１０分間静置した後、各サンプルにＡｃｃｕＢｌｕｅ定量液を加えてよく混合し、蛍光マイクロプレートリーダーで各サンプルの核酸濃度を測定した。
結果を図１２及び図１３に示した。図１２は、未内包核酸定量用サンプルにおける核酸量を示した。図１３は、全核酸定量用サンプルにおける核酸量から未内包核酸定量用サンプルにおける核酸量を減算した数値を、全核酸定量用サンプルにおける核酸量で除算することで、各リポソームの核酸内包率を算出して示した。図１２及び図１３の結果から、ｍＨＰ−１とｍＨＰ−２とを１：３以上の比率で混合したペプチド溶液を用いて作製したリポソームでは、未内包核酸量が減少して核酸内包率が向上した。このことから、ｍＨＰ−１とｍＨＰ−２との１：３以上の比率で混合したものでは、核酸凝縮性が向上し、より多くの核酸がリポソームに内包されることが示唆された。加えて、上記の実験結果及び例８の表６に示す実験結果から、ｍＨＰ−１とｍＨＰ−２とを両方用いれば、より多くの核酸を内包しているにも関わらず、適度な平均粒径やＺｅｔａ電位を有する核酸送達キャリアを作製することができることが明らかとなった。
＜例１０＞
実施形態のペプチドによって核酸を内包したリポソームによる、核酸の細胞への導入度合いを評価した。
リポソームに内包する核酸として、ｐＡｍｐ−ＣＭＶ−ｎＬｕｃを使用した。ｐＡｍｐ−ＣＭＶ−ｎＬｕｃは、ＮａｎｏＬｕｃ遺伝子をレポーター遺伝子として含むレポーターベクターである。ｐＡｍｐ−ＣＭＶ−ｎＬｕｃは、遺伝子発現用プロモーターとしてのＣＭＶプロモーターを含み、その下流にＮａｎｏＬｕｃ遺伝子と、ＩＲＥＳ配列と、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の複製開始白質（ＬＴ、ラージＴ抗原）遺伝子とがこの順番で連結され、その下流にＳＶ４０の複製開始配列（ＳＶ４０ｏｒｉ）を含む。当該核酸を用いて、例８及び例９と同様の方法でリポソーム溶液を作製した。
上述のように作製した当該リポソーム溶液を、ヒト急性Ｔ細胞リンパ腫由来細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）に添加した。Ｊｕｒｋａｔを培養した培地は、ＲＰＭＩ１６４０にウシ胎児血清を１０％添加した培地を使用した。培養後、Ｊｕｒｋａｔを０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡを用いて、培養底面から剥離させた後、２００×ｇ、３分間の遠心で細胞を回収したのち、細胞数が５．０×１０５細胞／ｍＬとなるように新鮮な培地を用いて調整した。この細胞縣濁液２００μＬに対して、上述のリポソーム溶液を１０μＬ加え、穏やかに混合した後、３７度、５％のＣＯ２雰囲気下でさらに細胞を培養した。
リポソーム溶液の添加から４８時間後に、発光基質（Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１／２０００希釈となるように培地に加えた。この培養ディッシュをＬＶ２００（オリンパス社製発光イメージングシステム)にセットして撮影した。撮影条件は、以下の通りであった。対物レンズ倍率：×２０、結像レンズ倍率：×０．２、露光時間：３ｍｉｎ、ＥＭＧａｉｎ：６１０。ＬＶ２００とＩｍａｇｅＭＥＸの制御及び撮影した画像の処理は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）で行った。
当該細胞画像を用いて、核酸が導入されてレポーター遺伝子が発現した細胞の発光強度を検出した。発光強度の検出は、ＮＩＳ−ＥｌｅｍｅｎｔｓＤ（Ｎｉｋｏｎ）で行った。
結果を図１４に示した。図１４の結果から、ｍＨＰ−１にｍＨＰ−２を１：１〜１：５の比率で混合したペプチド溶液を用いて作製したリポソームは、ｍＨＰ−１及びｍＨＰ−２単独のペプチドを用いた場合と比べて、細胞の発光強度が増大した。このことから、ｍＨＰ−１とｍＨＰ−２の混合比率１：１〜１：５のときに、細胞への核酸送達量が多く、かつ送達された核酸の発現量が多いことが示唆された。
以上の実験結果から、ｍＨＰ−１とｍＨＰ−２を混合すると核酸凝縮性が向上し、リポソームに核酸が効率的に内包されること、当該リポソームを用いた実施形態の核酸を細胞に送達する方法によってより効率的に細胞に多くの核酸を導入できること、及び当該方法によって細胞に送達された核酸がより効率的に発現されることが明らかとなった。このような結果が得られた理由として以下のことが考えられる。例えば、例７の図１１に示す実験結果からも示されるように、ｍＨＰ−１とｍＨＰ−２とを両方用いたものは高い凝縮性を有し、かつｍＨＰ−１とｍＨＰ−２との中間の解離性を有する。そのため、ｍＨＰ−２の存在によってｍＨＰ−１単独の場合よりも多くの核酸がリポソームに内包され、核酸送達キャリアが細胞に送達された後、ｍＨＰ−１の存在によってｍＨＰ−２単独の場合よりも、効率よく核酸が解離される。そのため、より多くの核酸が細胞に送達され、それらがより効率よく発現する。
＜例１１＞
実施形態のペプチドによる核酸の凝縮性及びペプチドと核酸との解離性を、ゲル遅延度アッセイによって評価した。
表７に示す３種類のペプチド、即ち、ｍＨＰ−１、ｍＨＰ−２及びＭ９を作製した。
Figure 2019511566
各ペプチドを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．４）に溶解し、それぞれにおいてペプチド濃度の異なる複数のペプチド溶液を調製した。
Ｍ９に関して、ペプチドの濃度が０．２４ｍｇ／ｍｌ（１）になるように、１つのペプチド溶液を調製した。ｍＨＰ−１及びｍＨＰ−２に関して、ペプチドの濃度が０．２４ｍｇ／ｍｌであり、ｍＨＰ−１とｍＨＰ−２との混合比が１：３になるようにペプチド溶液を調製し、そこにＭ９を１μＬを加えたペプチド溶液（２）、並びにＭ９を加えていないペプチド溶液（３）を調製した。また、プラスミドベクター（ｐＤＮＡ）を精製水で希釈し、ｐＤＮＡ濃度が０．１５ｍｇ／ｍｌである核酸溶液を調製した。
チューブに上述の（１）〜（３）ペプチド溶液（１００μＬ）を用意し、それぞれを撹拌しながら核酸溶液（２００μＬ）を滴下して混合し、核酸を凝縮させ、ペプチド−核酸複合体を得た。
凝縮性評価用サンプルとして、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．４）５．５μＬを５セット用意し、そこに上述の各ペプチド−核酸溶液４．５μＬを加えて混合したものを調製した。解離性評価用サンプルとして、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．４）４．５μＬを５セット用意し、そこに上述の各ペプチド−核酸溶液４．５μＬとポリグルタミン酸（ＰＧＡ）溶液１．０μＬを加えて混合した混合物を調製した。それらを室温に１０分間静置した後、各混合物に電気泳動バッファー（５０％ショ糖溶液）を１．０μＬ加えてよく混合し、０．８％アガロースゲルで電気泳動を行った。泳動後、エチジウムブロマイドで染色された核酸を、ＵＶ照射で可視化し、ペプチドに凝縮された核酸及びペプチドと解離してゲル中に移動した核酸を検出した。
結果を図１５に示した。図１５は、上記アガロースゲルにＵＶ照射して撮影した写真である。各サンプルの番号が示す２つのレーンのうち、左側のレーンがＰＧＡ（−）サンプル（凝縮性評価用サンプル）、右側のレーンがＰＧＡ（＋）サンプル（解離性評価用サンプル）の結果を示している。左側のレーンにおいて、分子量が大きな強く光るまとまった１つのバンドが観察されれば、凝縮性が高いと評価した。右側のレーンにおいて、分子量５〜１０ｋｂｐの領域に強く光る２つのバンドが観察されれば、解離性が高いと評価した。図1５の結果より、Ｍ９は単独での核酸凝縮性を有さず、また、ｍＨＰ−１とｍＨＰ−２を混合したペプチド溶液による核酸の凝縮性及び解離性に影響しないことが示された。
＜例１２＞
実施形態のペプチドによる核酸の凝縮性及びペプチド−核酸複合体の電位を評価した。
例１１で作製した（２）及び（３）のペプチド−核酸溶液を用いて、ペプチド−核酸複合体の平均粒子径、多分散性指数及びＺｅｔａ電位を調査した。平均粒子径、多分散性指数及びＺｅｔａ電位は、ゼータサイザーを用いて測定した。
結果を表８に示した。
Figure 2019511566
表８の結果から、Ｍ９を加えて作製したペプチド−核酸複合体は、Ｍ９を加えていない場合と比べて平均粒子径が約５０ｎｍ大きくなったが、どちらのサンプルもＰＤＩは０．３以下であった。このことから、Ｍ９を加えると複合体の粒子径はわずかに大きくなるが、均一な粒子が形成されることがわかった。また、何れのサンプルにおいても、Ｚｅｔａ電位の値は−３０ｍＶ前後であり、リポソームに封入されやすい電荷を有する複合体が形成されることが分かった。
＜例１３＞
実施形態のペプチドによるリポソームへの核酸の内包性を評価した。
ＣＯＡＴＳＯＭＥ／ＳＳ−２０（日本油脂）、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ−ＰＥＧをそれぞれ５：３：１：０．３のモル比でエタノール中に溶解して、脂質溶液を得た。チューブに脂質溶液５０μＬを５セット用意し、撹拌しながら、例１１で作製した（２）及び（３）のペプチド−核酸溶液をそれぞれ５０μＬ滴下し、リポソーム化した。当該各リポソーム溶液に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．４）４００μＬをそれぞれ添加し、総量５００μＬとした（以下このリポソーム溶液を「Ｃｏｍｐｌｅｘ」と記す）。
当該Ｃｏｍｐｌｅｘを用いて、リポソームの平均粒子径、多分散性指数、Ｚｅｔａ電位を調査した。平均粒子径、多分散性指数、Ｚｅｔａ電位は、ゼータサイザーを用いて測定した。
結果を表９に示した。
Figure 2019511566
表９の結果から、Ｍ９を加えたペプチド溶液を用いて作製したリポソームは、当該方法でこれまで作製したリポソームの平均粒子径（２３０ｎｍ〜２５０ｎｍ前後）より小さくなった。一方、Ｍ９を加えていないペプチド溶液を用いて作製したリポソームの平均粒子径は、上述のリポソーム平均粒子径の範囲内であった。また、どちらのサンプルにおいてもＰＤＩは０．３以下であり、Ｚｅｔａ電位は４５ｍＶ前後であった。このことから、Ｍ９をペプチド溶液に加えると、粒子径が小さいリポソームが均一に形成されることがわかった。
＜例１４＞
実施形態のペプチドによって核酸を内包したリポソームによる、核酸の細胞への導入度合いを評価した。
リポソームに内包する核酸として、ｐＡｍｐ−ＣＭＶ−ｎＬｕｃを使用した。ｐＡｍｐ−ＣＭＶ−ｎＬｕｃは、ＮａｎｏＬｕｃ遺伝子をレポーター遺伝子として含むレポーターベクターである。ｐＡｍｐ−ＣＭＶ−ｎＬｕｃは、遺伝子発現用プロモーターとしてのＣＭＶプロモーターを含み、その下流にＮａｎｏＬｕｃ遺伝子と、ＩＲＥＳ配列と、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の複製開始白質（ＬＴ、ラージＴ抗原）遺伝子とがこの順番で連結され、その下流にＳＶ４０の複製開始配列（ＳＶ４０ｏｒｉ）を含む。当該核酸を用いて、例１３と同様の方法でＣｏｍｐｌｅｘを作製した。更に、Ｃｏｍｐｌｅｘの溶媒であるエタノールをＨＥＰＥＳに置換したリポソーム溶液（以下「ＨＥＰＥＳ置換」と記す）を作製した。ＨＥＰＥＳ置換は、Ｃｏｍｐｌｅｘ４００μＬに１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．４）を４００μＬ加えて、３００ｋＤａ用の限外ろ過膜により２００μＬに濃縮し、さらに１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）２．１ｍｌを加えて限外ろ過を行うことで溶媒を置換し、最終的に１００μＬに濃縮することによって作製した。
上述のように作製したリポソーム溶液を、ヒト急性Ｔ細胞リンパ腫由来細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）に添加した。Ｊｕｒｋａｔを培養した培地は、ＲＰＭＩ１６４０にウシ胎児血清を１０％添加した培地を使用した。培養後、Ｊｕｒｋａｔを０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡを用いて、培養底面から剥離させた後、２００×ｇ、３分間の遠心で細胞を回収したのち、細胞数が５．０×１０５細胞／ｍＬとなるように新鮮な培地を用いて調整した。この細胞縣濁液２００μＬに対して、前記リポソーム溶液を１０μＬ加え、穏やかに混合した後、３７度、５％のＣＯ２雰囲気下でさらに細胞を培養した。
リポソーム溶液の添加から４８時間後に、発光基質（Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１／２０００希釈となるように培地に加えた。この培養ディッシュをＬＶ２００（オリンパス社製発光イメージングシステム)にセットして撮影した。撮影条件は、以下の通りであった。対物レンズ倍率：×２０、結像レンズ倍率：×０．２、露光時間：３ｍｉｎ、ＥＭＧａｉｎ：６１０。ＬＶ２００とＩｍａｇｅＭＥＸの制御及び撮影した画像の処理は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）で行った。
当該細胞画像を用いて、核酸が導入されてレポーター遺伝子が発現した細胞の発光強度を検出した。発光強度の検出は、ＮＩＳ−ＥｌｅｍｅｎｔｓＤ（Ｎｉｋｏｎ）で行った。
結果を図１６に示した。図１６の結果から、Ｍ９を加えたペプチドを用いて作製したリポソームは、Ｍ９を加えていない場合と比べて、細胞発光強度が大きかった。このことから、Ｍ９を加えたペプチドを用いた場合、細胞への核酸送達量が多く、かつ送達された核酸の発現量も多いことが示唆された。この結果を引き起こした一つの理由として、例１３の結果に示される通り、Ｍ９を加えるとリポソームが小型化することで、細胞への核酸送達量が増大して発光強度が大きくなると考えられる。
特定の実施形態について説明したが、これらの実施形態は単なる例示として提示されたものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。実際に、本明細書に記載の新規な実施形態は、様々な他の形態で実施することができる。更に、本発明の精神を逸脱することなく、本明細書に記載された実施形態の形態における様々な省略、置換、及び変更を行うことができる。添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物は、本発明の範囲及び精神に含まれるようなそのような形態又は改変を包含することが意図されている。

Claims (27)

  1. 核酸を凝縮するペプチドであって、
    一方の端が第１の配列ＲＲＲＲＲＲであり、他方の端が第２の配列ＲＱＲＱＲであり、 前記第１の配列と前記第２の配列との間に、ＲＲＲＲＲＲ又はＲＱＲＱＲからなる中間配列を０個又は１個以上含み、
    前記第１の配列、前記第２の配列及び前記中間配列のうち、隣り合う２つの配列の間に２つ以上の中性アミノ酸を含む
    核酸凝縮ペプチド。
  2. 前記中性アミノ酸が、Ｇ又はＹを含む請求項１に記載のペプチド。
  3. 全長が５５アミノ酸以下である請求項１又は２に記載のペプチド。
  4. 前記Ｒが配列全体に対して４５％以上の割合で含有される請求項１〜３の何れか１項に記載のペプチド。
  5. 硫酸イオンを含む塩として構成されている請求項１〜４の何れか１項に記載のペプチド。
  6. 配列が、ＲＱＲＱＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ又はＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲである請求項１に記載のペプチド。
  7. 核酸を凝縮するためのペプチドのセットであって、
    第１の核酸凝縮ペプチドとしての請求項１〜６の何れか１項に記載の核酸凝縮ペプチド、並びに第２の核酸凝縮ペプチド及び／又は第３の核酸凝縮ペプチドを含み、
    前記第２の核酸凝縮ペプチドは、一方の端が第３の配列ＲＲＲＲＲＲであり、他方の端が第４の配列ＲＲＲＲＲＲであり、前記第３の配列と前記第４の配列との間に、ＲＲＲＲＲＲ又はＲＱＲＱＲからなる中間配列を０個又は１個以上含み、前記第３の配列、前記第４の配列及び前記中間配列のうち、隣り合う２つの配列の間に２つ以上の中性アミノ酸を含み、
    前記第３の核酸凝縮ペプチドは、アミノ酸配列ＧＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを含む
    核酸凝縮ペプチドセット。
  8. 前記第２の核酸凝縮ペプチドのアミノ酸配列が、ＲＲＲＲＲＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲである請求項７に記載のペプチドセット。
  9. 前記第３の核酸凝縮ペプチドの一方の末端に任意のアミノ酸配列が連結している請求項７に記載のペプチドセット。
  10. 前記任意のアミノ酸配列は、前記核酸に結合するアミノ酸配列である請求項９に記載のペプチドセット。
  11. 前記第３の核酸凝縮ペプチドを含む場合、前記第１の核酸凝縮ペプチド及び／又は前記第２の核酸凝縮ペプチドと、前記第３の核酸凝縮ペプチドとが連結している請求項７に記載のペプチドセット。
  12. 請求項１〜６の何れか１項に記載の核酸凝縮ペプチド及び核酸を含む複合体と、核酸送達用膜とを備え、前記複合体は、前記核酸送達用膜内に封入されている核酸送達キャリア。
  13. 請求項７〜１１に記載の核酸凝縮ペプチドセット及び核酸を含む複合体と、核酸送達用膜とを備え、前記複合体は、前記核酸送達用膜内に封入されている核酸送達キャリア。
  14. 機能向上剤を更に含み、前記機能向上剤は、前記核酸送達用膜内に封入されている請求項１２又は１３に記載の核酸送達キャリア。
  15. 前記核酸送達用膜が、脂質組成物である請求項１２〜１４の何れか１項に記載の核酸送達キャリア。
  16. 前記核酸送達用膜が、リポソームである請求項１２〜１４の何れか１項に記載の核酸送達キャリア。
  17. 請求項１２〜１６の何れか１項に記載の核酸送達キャリアを用意することと
    前記核酸送達キャリアを細胞に接触させて前記核酸を前記細胞に送達することと
    を含む核酸送達方法。
  18. 前記細胞が生体内の細胞である請求項１７に記載の方法。
  19. 前記核酸送達キャリアと前記細胞を接触させる前又は後に、前記細胞の細胞膜に細孔を開けることを更に含む請求項１７又は１８に記載の方法。
  20. 前記細孔を開けることが、前記細胞に電圧又は超音波を印加することによって行われる請求項１９に記載の方法。
  21. 請求項１７〜２０の何れか１項に記載の核酸送達方法を実行すること、
    得られた前記細胞を培養すること、及び
    前記細胞のうち、前記核酸が導入された細胞を選択すること
    を含む細胞を作製する方法。
  22. 請求項１７〜２０の何れか１項に記載の核酸送達方法を実行することと、ここで、前記核酸はレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子発現カセットを含み、
    前記レポーター遺伝子からの信号を検出することと
    検出された前記信号に基づいて前記細胞の特性を判断することと
    を含む細胞検出方法。
  23. 請求項１２〜１６の何れか１項に記載の核酸送達キャリア及び機能向上剤を含むキット。
  24. 前記キットは、細胞を検出するためのキットであって、前記核酸送達キャリアに含まれる前記核酸は、レポーター遺伝子を発現するためのレポーター遺伝子発現カセットを含み、前記機能向上剤は、前記レポーター遺伝子からの信号を検出するための試薬を含む請求項２３に記載のキット。
  25. 前記キットは、細胞の機能を改変するためのキットであって、前記核酸送達キャリアに含まれる前記核酸は、前記細胞の機能を改変するための遺伝子を含み、前記機能向上剤は、前記細胞が引き起こす病害を予防、治療若しくは処置するための薬剤、又は分化を促進する薬剤、或いはそれらの何れかの組み合わせを含む請求項２３に記載のキット。
  26. 前記キットは、細胞を死滅させるためのキットであって、前記核酸送達キャリアに含まれる前記核酸は、前記細胞を細胞死に導く遺伝子を含み、前記機能向上剤は、アクチノマイシンＤ、シスプラチン、ベンダムスチン塩酸塩又はベツリン酸、或いはそれらの何れかの組み合わせを含む請求項２３に記載のキット。
  27. 前記キットは、細胞において物質生産を行うためのキットであって、前記核酸送達キャリアに含まれる前記核酸は、細胞に所望の物質を生産させるための遺伝子を含み、前記機能向上剤は、転写促進剤を含む請求項２３に記載のキット。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021016371A (ja) * 2019-07-23 2021-02-15 株式会社東芝 Ｃａｒ−ｔ細胞の製造方法、核酸導入キャリア及びキット

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021016370A (ja) * 2019-07-23 2021-02-15 株式会社東芝 核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002514892A (ja) * 1995-06-08 2002-05-21 コブラ セラピューティクス リミテッド 遺伝子治療における合成ウイルス様粒子の使用
JP2006502703A (ja) * 2002-03-29 2006-01-26 クレアゼン インコーポレーテッド 細胞質残留性細胞膜透過ペプチド及びこれの用途｛ＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＵｓｅｓｔｈｅｒｅｏｆ｝
JP2006517790A (ja) * 2003-01-09 2006-08-03 インヴィトロジェン コーポレーション ポリペプチド−核酸複合体の細胞の送達および活性化
JP2011501742A (ja) * 2007-10-02 2011-01-13 エムディーアールエヌエー，インコーポレイテッド 核酸の送達のためのリポペプチド
JP2011137001A (ja) * 2003-10-24 2011-07-14 Gencia Corp ポリヌクレオチドを送達する方法、及び送達用組成物
JP2011520424A (ja) * 2008-04-15 2011-07-21 アメリカ合衆国 阻害性オリゴヌクレオチドを送達するための組成物および方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
GB0027328D0 (en) * 2000-06-23 2000-12-27 Aventis Pharma Inc Bioengineered vehicles for targeted nucleic acid delivery
JP3965448B2 (ja) 2000-11-24 2007-08-29 有限会社プロテオセラピー 細胞内特定部位へ物質を導入するための化合物
JP3806059B2 (ja) 2002-04-02 2006-08-09 一仁 富澤 ペプチド核酸およびオリゴペプチドからなる化合物、その製造法ならびにその用途
DE10355559A1 (de) 2003-11-21 2005-06-23 Orthogen Ag Transskin
JP2005151908A (ja) 2003-11-27 2005-06-16 Japan Science & Technology Agency 核酸凝縮制御剤キット及び核酸凝縮制御方法
JP2006067891A (ja) 2004-09-01 2006-03-16 Hokkaido Univ 核移行性ペプチド
JPWO2006101201A1 (ja) 2005-03-24 2008-09-04 国立大学法人 北海道大学 目的物質を効率的に核内に送達可能なリポソーム
CA2727971A1 (en) 2007-08-29 2009-03-12 Tufts University Methods of making and using a cell penetrating peptide for enhanced delivery of nucleic acids, proteins, drugs, and adenovirus to tissues and cells, and compositions and kits
WO2011087804A2 (en) * 2009-12-21 2011-07-21 Medtronic, Inc. Peptide-polynucleotide compositions, and methods for transfecting a cell with dna and treatment of neurodegenerative disease
US10046065B2 (en) 2013-08-06 2018-08-14 Japan Science And Technology Agency Nucleic acid-encapsulating polymer micelle complex and method for producing same

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002514892A (ja) * 1995-06-08 2002-05-21 コブラ セラピューティクス リミテッド 遺伝子治療における合成ウイルス様粒子の使用
JP2006502703A (ja) * 2002-03-29 2006-01-26 クレアゼン インコーポレーテッド 細胞質残留性細胞膜透過ペプチド及びこれの用途｛ＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＵｓｅｓｔｈｅｒｅｏｆ｝
JP2006517790A (ja) * 2003-01-09 2006-08-03 インヴィトロジェン コーポレーション ポリペプチド−核酸複合体の細胞の送達および活性化
JP2011137001A (ja) * 2003-10-24 2011-07-14 Gencia Corp ポリヌクレオチドを送達する方法、及び送達用組成物
JP2011501742A (ja) * 2007-10-02 2011-01-13 エムディーアールエヌエー，インコーポレイテッド 核酸の送達のためのリポペプチド
JP2011520424A (ja) * 2008-04-15 2011-07-21 アメリカ合衆国 阻害性オリゴヌクレオチドを送達するための組成物および方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCONJUGATE CHEMISTRY, vol. 15, JPN6019023657, 2004, pages 152 - 161, ISSN: 0004060461 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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