JP2005151908A

JP2005151908A - 核酸凝縮制御剤キット及び核酸凝縮制御方法

Info

Publication number: JP2005151908A
Application number: JP2003397650A
Authority: JP
Inventors: Shizuaki Murata; 静昭村田; A Zinchenko Anatoly; エイジンチェンコアナトリー
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2003-11-27
Filing date: 2003-11-27
Publication date: 2005-06-16

Abstract

【課題】生物細胞等の破壊や不安定化を招かない、２本鎖核酸の凝縮と凝縮状態の解除とのスイッチング制御技術を提供する。
【解決手段】２本鎖核酸の凝縮作用に関して互いに拮抗的に作用する不斉分子の異性体を用いるものであって、一方の異性体を有効成分とする第１剤と、他方の異性体を有効成分とする第２剤とからなり、２本鎖核酸の凝縮及び凝縮解除のスイッチング制御に用いる核酸凝縮制御剤キット。この核酸凝縮制御剤キットの第１剤と第２剤とを使い分けて２本鎖核酸の凝縮及び凝縮解除のスイッチング制御を行う核酸凝縮制御方法。
【選択図】図６

Description

本発明は核酸凝縮制御剤キット及び核酸凝縮制御方法に関する。更に詳しくは、本発明は、不斉分子の異性体が２本鎖核酸の凝縮作用に関して互いに拮抗的に作用する場合がある、と言う新規な知見に基づいて提供される核酸凝縮制御剤キットと、このキットを利用して２本鎖核酸の凝縮及び凝縮解除のスイッチング制御を行う核酸凝縮制御方法とに関する。

２本鎖核酸の凝縮制御技術は、２本鎖核酸を凝縮（折り畳み）させることと、この凝縮状態を解除させることとからなる。２本鎖核酸を凝縮させる際には蛍光色素等を用いて凝縮核酸を可視化させることも可能である。近年において、２本鎖ＤＮＡ等の２本鎖核酸の凝縮現象を制御することは、重要な技術であると認識されている。このような技術は、例えば遺伝子治療においては、リポソームからなる人工ベクターに遺伝子を封入して標的細胞内に送り込むために必須のテクニックである。又、一般的に、２本鎖核酸の凝縮制御を行うことにより、ＤＮＡの転写や複製等の分子生物学的機能を解析し制御することが可能となる。

２本鎖核酸の凝縮のメカニズムは、既にある程度解明されている。そして核酸凝縮を引起こす凝縮剤についても、例えばポリアミン等の多価カチオンが有効であることが知られている。下記の非特許文献１及び非特許文献２では、４級アンモニウムジカチオンを用いて２本鎖ＤＮＡを凝縮させる技術が開示されている。これらの４級アンモニウムジカチオンは、不斉炭素原子を含まないためにＳ体、Ｒ体と言う光学異性体は存在せず、更に、広義のいわゆる不斉分子にも該当しないものである。

M. P. Singh, B. Plouvier, G. C. Hill, J. Gueck,R. T. Pon, J. W. Lown, J. Am. Chem. Soc. 116, 7006-7020(1994) X. Qu, J. O. Trent, I. Fokt, W. Priebe,J. B. Chaires, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97, 12032-12037(2000) 凝縮剤による２本鎖ＤＮＡの凝縮は、凝縮剤の濃度平衡に依存している。このため、上記の各種の凝縮剤を用いて２本鎖ＤＮＡを凝縮させた場合、この凝縮剤を希釈することによって２本鎖ＤＮＡの凝縮状態を少なくとも緩和させることは可能である。しかしこのような方法による場合、凝縮状態の解除が中途半端になり易い。即ち、２本鎖ＤＮＡの凝縮状態と、その凝縮状態の解除とをそれぞれ明確に切り換えて発現させるスイッチング制御は困難である。

一方、２本鎖ＤＮＡの凝縮状態を積極的に解除させる凝縮解除剤（脱凝縮剤）も知られており、例えばポリエチレングリコール等が例示される。理論的には、互いに拮抗的に作用する上記の凝縮剤と凝縮解除剤とを使い分けることにより、２本鎖ＤＮＡの凝縮と凝縮解除とのスイッチング制御が可能であると考えることもできる。

しかし、２本鎖核酸の凝縮制御技術は、前記した遺伝子治療やＤＮＡの転写／複製の研究等の例示からも分かるように、主として生物細胞やこれに準ずる細胞モデル中での２本鎖核酸の挙動等を追求するための手段であることが多い。従って、その技術目的を達成するためには、第１の条件として上記のスイッチング制御が可能であることを要求される他、第２の条件として凝縮制御技術が生物細胞やその細胞モデルの破壊や不安定化を招くようなものでないことが要求される。２本鎖核酸の凝縮制御技術がこれらの第１の条件及び第２の条件を併せ備えないことは、致命的な欠点であると言わねばならない。

前記した従来技術において、凝縮剤を用いて２本鎖ＤＮＡを凝縮させると共に凝縮剤を希釈して２本鎖ＤＮＡの凝縮状態を緩和させると言う方法は、そもそも第１の条件たるスイッチング制御が困難である。

次に、拮抗的に作用する凝縮剤と凝縮解除剤とを使い分けると言う方法では、第１の条件はクリアできる。しかしながら、公知の凝縮剤と凝縮解除剤との組み合わせは、例えば前者が４級アンモニウムジカチオンであり、後者がポリエチレングリコールである場合を想定すれば容易に了解されるように、両者の分子量や、溶質としての電気化学的性質等が互いに異なる。しかも、これらが大きく異なる場合が多い。このため、スイッチング制御の過程において、生物細胞を含む溶液系の浸透圧に無視できない落差を生じたり、溶媒の極性に無視できない変化を生じたりして、センシティブな生物細胞等の破壊や不安定化を招く恐れが大きい。即ち、上記した第２の条件をクリアできない。

そこで本発明は、凝縮と凝縮状態の解除とを明確に発現させるスイッチング制御が可能であると言う第１の条件と、２本鎖核酸を含む生物細胞やその細胞モデルの破壊や不安定化を招く恐れがないと言う第２の条件とを満たす２本鎖核酸の凝縮制御技術を提供することを、解決すべき技術的課題とする。本願発明者は、２本鎖核酸の凝縮制御技術を研究する過程において、生物細胞に対して無害である一定の不斉分子の異性体が、２本鎖核酸の凝縮に関して互いに強い拮抗的作用を示すと言う驚くべき知見を得た。本願発明は、この新規な知見に基づいて完成されたものである。

（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、異性体が２本鎖核酸の凝縮作用に関して互いに拮抗的に作用することが確認された不斉分子の一方の異性体を有効成分とする第１剤と、前記不斉分子の他方の異性体を有効成分とする第２剤とからなり、２本鎖核酸の凝縮及び凝縮解除のスイッチング制御に用いるものである、核酸凝縮制御剤キットである。

なお、上記の「一方の異性体」、「他方の異性体」とは、その不斉分子の異性体が２種類しかない場合にはその２種類の異性体の各一方を指すが、不斉分子の異性体が３種類以上ある場合においては、その内の２本鎖核酸の凝縮作用を示す異性体と２本鎖核酸の凝縮解除作用を示す異性体とを選択的に指しており、いずれの作用も示さない異性体は含まれない。

（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明に係る一方の異性体と他方の異性体とがそれぞれ２本鎖核酸の５０％を凝縮状態とするのに必要な濃度が、相対的に１０倍以上異なる、核酸凝縮制御剤キットである。

（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第１発明又は第２発明に係る不斉分子がＣ_ｎ対称性又はＤ_ｎ対称性を有する分子構造を持ち、かつ、スペーサーにより互いに隔てられた２個の陽荷電部を備える、核酸凝縮制御剤キットである。

（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、前記第１発明〜第３発明のいずれかに係る不斉分子が分子中に２個の不斉炭素原子を有するものであり、かつ、一方の異性体が２個の不斉炭素原子においてＳ体としての立体配置を備え、他方の異性体が２個の不斉炭素原子においてＲ体としての立体配置を備えるものである、核酸凝縮制御剤キットである。

（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、前記第１発明〜第４発明のいずれかに係る不斉分子が４級ジアンモニウムジカチオンである、核酸凝縮制御剤キットである。

（第６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、前記第５発明に係る４級ジアンモニウムジカチオンが、２，３−イソプロピリデンジオキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ヘキサメチル−１，４−ブタンジアンモニウムである、核酸凝縮制御剤キットである。

（第７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、第１発明〜第６発明のいずれかに係る核酸凝縮制御剤キットの第１剤と第２剤とを使い分けて、２本鎖核酸の凝縮及び凝縮解除のスイッチング制御を行う、核酸凝縮制御方法である。

（第１発明の効果）
第１発明の核酸凝縮制御剤キットは、同一の不斉分子の異性体であって２本鎖核酸の凝縮作用に関して互いに拮抗的に作用するものをそれぞれ有効成分とする第１剤及び第２剤からなる。従って、第１剤と第２剤との使い分けにより２本鎖核酸の凝縮及び凝縮解除の良好なスイッチング制御を行うことができる。即ち、２本鎖核酸の凝縮制御技術としての前記第１の条件を満足することができる。

次に、第１剤と第２剤との有効成分は同一の不斉分子の異性体であるから分子量が同一であり、溶質としての電気化学的性質も事実上同一である。従ってスイッチング制御の過程において生物細胞を含む溶液系の浸透圧に落差を生じたり、溶媒の極性に変化を生じたりしてセンシティブな生物細胞等の破壊や不安定化を招く恐れがない。即ち、２本鎖核酸の凝縮制御技術としての前記第２の条件を満足することができる。

２本鎖核酸の凝縮作用に関して、不斉分子の異性体が互いに拮抗的に作用する場合がある理由については、必ずしも完全には解明していない。しかし本願発明者は、次のような推定が合理的かつリーズナブルであると考えている。

図１のように、同一の不斉分子の異性体１、２が分子の両端部に１対の陽荷電部３を備え、かつ１対の陽荷電部３が分子軸に対して逆方向へ突出している構造である場合を考える。この場合、図示するように、異性体１、２における陽荷電部３の突出方向は、立体構造の相違に起因して、互いに対称になり得る。このような不斉分子が２重螺旋構造を取る２本のＤＮＡ鎖４、４’に対して方向性を以て結合（例えば、マイナーグルーブへの結合、又は塩基の層間へのインターカレート）する場合、異性体１では、１対の陽荷電部３がＤＮＡ鎖４、４’の陰荷電部５（リン酸結合部）に近接して位置する。即ち、１対の陽荷電部３がＤＮＡ鎖４、４’の陰荷電部５に対して良好にマッチングするため、２本鎖核酸に対する強い凝縮作用を発揮する。一方、異性体２では、１対の陽荷電部３がＤＮＡ鎖４、４’の陰荷電部５から離隔して位置することとなり、上記のマッチングが悪いため、却って２本鎖核酸に対する凝縮解除作用を発揮するのである。

次に、図１よりも特殊化したケースとして、不斉分子が２個の不斉炭素原子を有する場合の光学異性体６、７、８について、図２に基づいて説明する。光学異性体６は２個の不斉炭素原子がいずれもＳ型の立体配置を取るものであり、その分子の両端部に備えた１対の陽荷電部９は図示の方向へ突出している。光学異性体７は、２個の不斉炭素原子がいずれもＲ型の立体配置を取るものであり、その１対の陽荷電部９が、光学異性体６の場合とは対称となる方向へ突出している。更に光学異性体８は２個の不斉炭素原子の一方がＳ型、他方がＲ型の立体配置を取るものであり、その１対の陽荷電部９が分子軸に対して同一方向へ突出している。

図２に示すように、光学異性体６においては、図１の異性体１の場合と同様に、１対の陽荷電部９がＤＮＡ鎖４、４’の陰荷電部５に対して良好にマッチングし、２本鎖核酸に対する強い凝縮作用を発揮する。光学異性体７では、図１の異性体２の場合と同様にＤＮＡ鎖４、４’の陰荷電部５に対する１対の陽荷電部９のマッチングが悪いため、却って２本鎖核酸に対する凝縮解除作用を発揮する。更に、光学異性体８では、ＤＮＡ鎖４、４’の陰荷電部５に対して、片方の陽荷電部９のマッチングが良く、他の片方の陽荷電部９のマッチングが悪いため、２本鎖核酸に対する凝縮作用と凝縮解除作用とが相殺され、実質的にいずれの作用も示さない。

（第２発明の効果）
上記の第１発明において、２本鎖核酸の凝縮作用に関する一方の異性体と他方の異性体との「拮抗的作用」の程度は、要するに目的とするスイッチング制御を達成できる程度であれば良く、一概には限定されない。但し、好ましい拮抗的作用の具体的基準の一つとして、第２発明に規定する程度の拮抗的作用を例示することができる。

（第３発明の効果）
上記の第１発明に言う「不斉分子」の種類としては、必ずしも限定はされないが、Ｃ_ｎ対称性又はＤ_ｎ対称性を有する分子構造を持ち、かつスペーサーにより互いに隔てられた２個の陽荷電部を備えるものを、好ましく例示できる。少なくともこれらの不斉分子は、その立体構造如何により、図１や図２で説明した作用・効果を期待できる。

（第４発明の効果）
上記の第１発明に言う「不斉分子」として、分子中に２個の不斉炭素原子を有するものであり、かつ、一方の異性体が２個の不斉炭素原子においてＳ体としての立体配置を備え、他方の異性体が２個の不斉炭素原子においてＲ体としての立体配置を備えるものを特に好ましく例示できる。少なくともこれらの不斉分子は、図２で説明した作用・効果を期待できる。

なお、第４発明に規定する不斉分子においては理論的に３種類以上の光学異性体の存在が考えられるが、これらの異性体の内には、２本鎖核酸に対する凝縮作用も凝縮解除作用も明瞭には示さない異性体があり得ると考えられる。このような異性体は、第１剤又は第２剤の有効成分とはならない。

（第５発明の効果）
不斉分子として、とりわけ前記第３発明の条件を良好に満たす不斉分子として、第５発明に規定するような４級ジアンモニウムジカチオンのカテゴリーに属するものを、好ましく例示することができる。

（第６発明の効果）
不斉分子たる４級ジアンモニウムジカチオンの内でも、２，３−イソプロピリデンジオキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ヘキサメチル−１，４−ブタンジアンモニウムをとりわけ好ましく例示することができる。

（第７発明の効果）
第７発明においては、上記した第１発明〜第６発明のいずれかに係る核酸凝縮制御剤キットの第１剤と第２剤とを使い分けるので、２本鎖核酸の凝縮及び凝縮解除の良好なスイッチング制御を行うことができる。

次に、本願の第１発明〜第７発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。以下において単に「本発明」と言う時は、本願の各発明を一括して指している。

〔核酸凝縮制御剤キット〕
本発明に係る核酸凝縮制御剤キットは、第１剤と第２剤とからなるセット物であり、その一方が核酸凝縮剤であり、他方が核酸凝縮解除剤である。核酸凝縮制御剤キットの用途は必ずしも限定されないが、２本鎖核酸の凝縮と凝縮解除とのスイッチング制御に用いるのに特に好適である。第１剤と第２剤それぞれの有効成分は、同一の不斉分子の異性体同士であって、一方の異性体は核酸凝縮作用、他方の異性体は核酸凝縮解除作用と言う拮抗的な作用を示す関係にある。

ここに「核酸凝縮作用」とは、図３（ｂ）に示すように２本鎖ＤＮＡ等の２本鎖核酸をコンパクトなグロビュール状態に凝縮させる作用を言い、「核酸凝縮解除作用」とは、コンパクトなグロビュール状態にある２本鎖核酸を図３（ａ）に示すように凝縮していないコイル状態まで凝縮解除させる作用を言う。

第１剤及び第２剤の有効成分における上記の拮抗的作用の程度は必ずしも限定されないが、一つの具体的かつ有効な基準として、一方の異性体と他方の異性体とがそれぞれ２本鎖核酸の５０％を凝縮状態とするのに必要な濃度が、相対的に１０倍以上異なる、と言うことを例示できる。あるいは、一方の異性体の一定濃度の溶液が非凝縮コイル状態にある２本鎖核酸の８０％以上を凝縮させ、こうして凝縮した２本鎖核酸を他方の異性体の同一濃度の溶液に移した時に、凝縮核酸の６０％以上において凝縮が解除される、と言うことを例示できる。

第１剤及び第２剤は、上記のような拮抗的作用を示す異性体の各一方を有効成分とする限りにおいて組成や剤型は限定されないが、有効成分のみからなる任意の剤型や、水又は緩衝液をベースとする溶液剤が特に好ましい。有効成分の種類によっては、水又は緩衝液をベースとする乳化液や懸濁液とすることもできる。液剤である第１剤及び第２剤における有効成分たる異性体の濃度は、その使用目的に応じて任意に設定されるものであり、全く限定されない。

〔不斉分子と異性体〕
上記した不斉分子としては、２本鎖核酸の凝縮作用を示す異性体と、２本鎖核酸の凝縮解除作用を示す異性体とが存在するものである限りにおいて、異性体が２種類しか存在しないものでも、異性体が３種類以上存在するものでも良い。異性体が３種類以上存在する不斉分子においては、それらの異性体の全てが２本鎖核酸の凝縮作用又は凝縮解除作用を示す必要はなく、その内の少なくとも２種類の異性体の一方が２本鎖核酸の凝縮作用を示し、他方が２本鎖核酸の凝縮解除作用を示せば足りる。

上記の要求を満たす限りにおいて、化合物としての不斉分子の種類は限定されない。好ましい不斉分子として、Ｃ_ｎ対称性又はＤ_ｎ対称性を有する分子構造を持つ化合物を例示することができる。周知のように、「Ｃ_ｎ対称性」とは、構造式中に存在する対称要素として、ただ１本のｎ回回転軸のみを有する構造であることを言い、「Ｄ_ｎ対称性」とは、構造式中に存在する対称要素として、ただ１本のｎ回回転軸とそれに直交するｎ本の２回回転軸のみを有する構造であることを言う。ビフェニル化合物、ビナフチル化合物、スピロ環化合物、アレン誘導体等の中には、Ｃ_ｎ対称性又はＤ_ｎ対称性を有する不斉分子があり得る。又、４級アンモニウム化合物では、不斉窒素原子を含む不斉分子があり得る。

又、不斉分子は、その分子中に２個の陽荷電部を備えることが好ましく、これらの２個の陽荷電部がスペーサーたる任意の中間構造部分により互いに隔てられた化学構造を有することが特に好ましく、上記の２個の陽荷電部が分子の長軸方向の両端又はその近傍に位置していることが、とりわけ好ましい。

不斉分子の好ましいカテゴリーの一つとして、上記の要求を満たす不斉分子であることを前提として、４級ジアンモニウムジカチオンを挙げることができる。４級ジアンモニウムジカチオンの内、実施例で使用している２，３−イソプロピリデンジオキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ヘキサメチル−１，４−ブタンジアンモニウムは特に好ましい一例であり、この化合物の場合、異性体としてはＳＳ体とＲＲ体を使用できる。ＳＳ体とは２個の不斉炭素原子がいずれもＳ体型の立体配置を備えるものを言い、ＲＲ体とは２個の不斉炭素原子がいずれもＲ体型の立体配置を備えるものを言う。上記化合物においては、２個の不斉炭素原子の一方がＳ体型の立体配置を備え、他方がＲ体型の立体配置を備える異性体（これをメゾ体と呼ぶ）は、核酸の凝縮制御としては使用できない。

本発明に用いる不斉分子の異性体は、特に生物細胞や生物細胞モデルに対して適用する場合においては、これらに対して毒性等の不具合な性質を示さないものであることが望ましい。

〔核酸凝縮制御方法〕
本発明に係る核酸凝縮制御方法は、上記した核酸凝縮制御剤キットの第１剤と第２剤とを使い分けて、２本鎖核酸の凝縮及び凝縮解除のスイッチング制御を行うことを内容とする。

第１剤と第２剤とを「使い分ける」とは、例えば制御対称である２本鎖核酸や、あるいは２本鎖核酸を有する生物細胞又は生物細胞モデルを含む試料に対して、第１剤と第２剤のいずれか一方を適宜な濃度となるように投与して２本鎖核酸の凝縮を起こさせ、及び／又は、第１剤と第２剤のいずれか一方を適宜な濃度となるように投与して凝縮している２本鎖核酸の凝縮を解除させることを言う。

凝縮と凝縮解除とのスイッチングの際には、適宜な手段により第１剤と第２剤との相対的な濃度を必要な範囲で逆転させる。例えば、既に第１剤が投与されている試料液から検体たる２本鎖核酸、生物細胞又は生物細胞モデルを遠沈等によって分離した後、これらの検体を第２剤を含む液に溶かしたり、懸濁させたりすることができる。又、第１剤を含む試料液に対して、第１剤の濃度を有意に上回る濃度に第２剤を投与することも有効である。

周知のように、２本鎖核酸を凝縮させる際には、蛍光発色剤等を用いて視覚的ないしは光学的な観察を容易にする手法がある。本発明の核酸凝縮制御方法においても、この方法を利用することができる。可能ならば、第１剤／第２剤の有効成分たる異性体を、その分子内に蛍光発色部を備える化学構造とすることも考えられる。又、２本鎖核酸の凝縮や凝縮解除は、光吸収スペクトル法や光散乱法等で観察することも可能である。

次に本発明に係る実施例を説明する。これらの実施例が本発明の技術的範囲を限定するものでないことは、もちろんである。

（実施例１）
試料用の核酸を含む下記濃度組成の溶液を調製した。下記において「核酸」としては非凝縮状態にある約１６５．６ｋｂｐの２本鎖ＤＮＡ（Ｔ４ＤＮＡ）を用いた。

１０ｍＭトリス緩衝溶液
０．２μＭ核酸
４％２−メルカプトエタノール
０．２μＭＤＡＰＩ（蛍光染色剤）
核酸凝縮剤各所定濃度
なお、上記の「核酸凝縮剤」としては、２，３−イソプロピリデンジオキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ヘキサメチル−１，４−ブタンジアンモニウムのＳＳ体、ＲＲ体、メゾ体、又はこれらの異性体の任意の組合わせに係る混合物をそれぞれ用いた。従って、混合物にはラセミ体（ＳＳ体とＲＲ体の等量混合物）も含まれる。ＳＳ体の構造を図４（ａ）に、ＲＲ体の構造を図４（ｂ）に、メゾ体の構造を図４（ｃ）に示す。

上記の各溶液について、蛍光顕微鏡にて各２本鎖ＤＮＡの長軸長を観察した。その結果を図５の（ａ）〜（ｃ）に示す。図５の（ａ）は核酸凝縮剤がＳＳ体である場合の結果を、図５の（ｂ）は核酸凝縮剤がＲＲ体である場合の結果を、図５の（ｃ）は核酸凝縮剤がメゾ体である場合の結果を、それぞれ示す。又、図５の（ａ）〜（ｃ）において、「 [SS],M 」等と表記した軸は核酸凝縮剤の濃度を、「L/μm 」と表記した軸は２本鎖ＤＮＡの長軸長を、「population」と表記した軸は該当する長軸長の２本鎖ＤＮＡの個数割合を、それぞれ示している。図５より分かるように、全体的には２本鎖ＤＮＡの長軸長が核酸凝縮剤の高濃度化に対応して相対的に短縮化する傾向が見られるが、ＳＳ体では２本鎖ＤＮＡの長軸長の分布が短縮化方向に著しくシフトしており、ＲＲ体では長軸長が短縮化していない傾向が顕著であり、メゾ体ではそれらの中間の傾向である。即ち、これらの各異性体は、２本鎖ＤＮＡの長軸長の分布に大きな相違をもたらすことが明瞭であった。

又、上記の図５のデータに基づき、長軸長が１μｍを超えるコイル状態（非凝縮状態）の２本鎖ＤＮＡと、長軸長が１μｍ以下のグロビュール状態（凝縮状態）の２本鎖ＤＮＡとの個数をカウントした。その結果を図６に示す。図６の横軸（ [dication] / M ）は核酸凝縮剤の濃度を表し、縦軸（ coil population, ％）は２本鎖ＤＮＡ中のコイル状態のものの個数割合（パーセンテージ）を表す。図６中、「ＳＳ」と表記したグラフは核酸凝縮剤がＳＳ体である場合の結果を、「ＲＲ」と表記したグラフは核酸凝縮剤がＲＲ体である場合の結果を、「ｍｅｓｏ」と表記したグラフは核酸凝縮剤がメゾ体である場合の結果を、「ｒａｃ」と表記したグラフは核酸凝縮剤がラセミ体である場合の結果をそれぞれ示す。

更に、図７において、各異性体とその混合物の核酸凝縮能力を対比して示す。図７の「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」のグラフでは、「ＳＳ」はＳＳ体を、「ＲＲ」はＲＲ体を、「ｍｅｓｏ」はメゾ体をそれぞれ表す。更に、各グラフの中央に表記した「ｍｉｘ」とは、その両側に表記された異性体の等量混合物を表す。又、これらのグラフの縦軸は凝縮能（ compaction activity）を示す。凝縮能とは、上記した試料溶液中の全２本鎖ＤＮＡの内、５０％に凝縮状態を与える濃度の逆数を言う。

図７の「Ａ」に示すように、ＳＳ体とＲＲ体では凝縮能に顕著な相違が認められる。換言すれば、２本鎖ＤＮＡの５０％を凝縮させるに必要な両者の濃度には１０倍を超える相違が認められる。一方、図７の「Ｂ」及び「Ｃ」に示すように、メゾ体はＳＳ体とＲＲ体との中間程度の凝縮能を示す。なお、図７の「Ｃ」に示すように、メゾ体とＲＲ体との間にも、凝縮能にかなりの相違が認められる。この凝縮能の相違が、例えば上記した２本鎖ＤＮＡの５０％凝縮濃度に換算して１０倍を超える相違である場合には、メゾ体とＲＲ体とを用いて２本鎖ＤＮＡの凝縮と凝縮解除とのスイッチング制御を有効に行うことも可能であると考えられる。更に、図７の各グラフの全体から分かるように、２種異性体の混合物である「ｍｉｘ」は、ラセミ体の場合も含めて、常に混合された２種異性体の凝縮能の中間値を示している。

（比較例１）
アミノ酸であるリシンやアルギニンには、光学異性体の存在が知られている。そこで、リシン及びアルギニンについて、それぞれＳ体の３量体ペプチドとＲ体の３量体ペプチドとを調製し、これらを核酸凝縮剤として上記の実施例１の場合と同様の濃度組成で試料用溶液を調製した。そして実施例１の場合と同様に蛍光顕微鏡にて２本鎖ＤＮＡの長軸長を観察し、コイル状態（非凝縮状態）のものと、グロビュール状態（凝縮状態）のものとの個数をカウントした。

リシンの３量体ペプチドについての評価結果を図８の（ａ）に、アルギニンの３量体ペプチドについての評価結果を図８の（ｂ）にそれぞれ示す。又、図８の（ａ）、（ｂ）において、横軸は試料用溶液における核酸凝縮剤の濃度を表し、縦軸は全２本鎖ＤＮＡ中のグロビュール状態にある２本鎖ＤＮＡの割合を表す。「Ｓ」の表記で示すグラフはＳ体の３量体ペプチドについての評価結果、「Ｒ」の表記で示すグラフはＲ体の３量体ペプチドについての評価結果を示す。

図８に示す結果から分かるように、リシンの３量体ペプチドにおいてはＳ体とＲ体との核酸凝縮能の差異がアルギニンの３量体ペプチドの場合よりも大きい。しかし、リシン／アルギニンのいずれの場合においても、２本鎖ＤＮＡの５０％を凝縮させるに必要な両異性体の濃度には、１０倍を大きく下回る相違しか認められない。よって、リシンやアルギニンの光学異性体は、本発明に係る核酸凝縮のスイッチング制御に用いることは困難である。

（実施例２）
試料用の核酸を含む下記濃度組成の溶液を調製した。核酸としては実施例１の場合と同じものを用いた。「ＳＳ体核酸凝縮剤」とは、実施例１で定義したＳＳ体である核酸凝縮剤のことである。

１０ｍＭトリス緩衝溶液
０．２μＭ核酸
４％２−メルカプトエタノール
０．２μＭＤＡＰＩ（蛍光染色剤）
７ｍＭＳＳ体核酸凝縮剤
上記の溶液における各２本鎖ＤＮＡの長軸長を蛍光顕微鏡にて観察した。その結果としての長軸長の分布を図９の「ＳＳ」と表記したグラフに示した。図９において「L/μm 」と表記した軸は２本鎖ＤＮＡの長軸長を示し、「population」と表記した軸は該当する長軸長の２本鎖ＤＮＡの個数割合を示している。従って、大半の２本鎖ＤＮＡが、前記図３（ｂ）に示すような十分に短縮化（凝縮）したグロビュール状態にあることが分かる。

次に、上記の溶液に対して実施例１で定義したＲＲ体である核酸凝縮剤を２０ｍＭとなるように添加し、その３０分後、及び１日後に、溶液における各２本鎖ＤＮＡの長軸長を蛍光顕微鏡にて観察した。その結果としての長軸長の分布を、３０分後のものについては図９の「ＳＳ＋ＲＲ」と表記したグラフに、１日後のものについては図９の「ＳＳ＋ＲＲ１ｄａｙ」と表記したグラフに、それぞれ示した。

これらのグラフの長軸長分布から、溶液中の２本鎖ＤＮＡの大半が図３（ａ）に示すような凝縮解除されたコイル状態に移行したことが分かる。即ち、２本鎖ＤＮＡをＳＳ体によって凝縮させ、ＲＲ体によって凝縮解除させると言うサイクルにより、例えば試料溶液におけるＳＳ体とＲＲ体との濃度の制御に基づいて、十分に満足できるスイッチング制御を行い得ることが分かった。

本発明によって、２本鎖核酸の凝縮と凝縮状態の解除とのスイッチング制御が、２本鎖核酸を含む生物細胞やその細胞モデルの破壊や不安定化を招くことなく、可能となる。

不斉分子の異性体による作用の相違を簡略化して説明する図である。

２本鎖核酸の凝縮したグロビュール状態と、凝縮していないコイル状態とを示すスケッチ図である。

実施例で用いた不斉分子の異性体構造を示す図である。

２本鎖ＤＮＡの長軸長の分布を示すグラフである。

２本鎖ＤＮＡにおけるコイル状態のものの個数割合を表すグラフである。

実施例で用いた各異性体の核酸凝縮能力を対比して示すグラフである。

比較例で用いた不斉分子の各異性体の核酸凝縮能力を示すグラフである。

２本鎖ＤＮＡのスイッチング制御に関わるデータを示すグラフである。

符号の説明

１異性体
２異性体
３陽荷電部
４、４’ ＤＮＡ鎖
５陰荷電部
６光学異性体
７光学異性体
８光学異性体
９陽荷電部

Claims

異性体が２本鎖核酸の凝縮作用に関して互いに拮抗的に作用することが確認された不斉分子の一方の異性体を有効成分とする第１剤と、前記不斉分子の他方の異性体を有効成分とする第２剤とからなり、２本鎖核酸の凝縮及び凝縮解除のスイッチング制御に用いるものであることを特徴とする核酸凝縮制御剤キット。
前記一方の異性体と他方の異性体とがそれぞれ２本鎖核酸の５０％を凝縮状態とするのに必要な濃度が、相対的に１０倍以上異なることを特徴とする請求項１に記載の核酸凝縮制御剤キット。
前記不斉分子がＣ_ｎ対称性又はＤ_ｎ対称性を有する分子構造を持ち、かつ、スペーサーにより互いに隔てられた２個の陽荷電部を備えることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の核酸凝縮制御剤キット。
前記不斉分子が分子中に２個の不斉炭素原子を有するものであり、かつ、一方の異性体が２個の不斉炭素原子においてＳ体としての立体配置を備え、他方の異性体が２個の不斉炭素原子においてＲ体としての立体配置を備えるものであることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の核酸凝縮制御剤キット。
前記不斉分子が４級ジアンモニウムジカチオンであることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれかに記載の核酸凝縮制御剤キット。
前記４級ジアンモニウムジカチオンが、２，３−イソプロピリデンジオキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ヘキサメチル−１，４−ブタンジアンモニウムであることを特徴とする請求項５に記載の核酸凝縮制御剤キット。
請求項１〜請求項６のいずれかに記載の核酸凝縮制御剤キットの第１剤と第２剤とを使い分けて、２本鎖核酸の凝縮及び凝縮解除のスイッチング制御を行うことを特徴とする核酸凝縮制御方法。