JP2019511227A - 乾燥および/またはuv損傷および/または炎症から皮膚を保護するための組成物の製造方法 - Google Patents
乾燥および/またはuv損傷および/または炎症から皮膚を保護するための組成物の製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
【選択図】なし
Description
(a)脱分化したカメリア・シネンシス幹細胞を含む細胞培養物を調製する工程と、
(b)抽出溶媒としてエタノールおよび/またはメタノールを用いて細胞培養物を抽出して、カメリア・シネンシス脱分化細胞培養抽出物を製造する工程と
を含む方製造法に関する。
茶カルス細胞培養
・スリランカクローン2(カメリア・シネンシス・アッサミカ)の若葉を以下のように滅菌した。
○流水下で15分間洗う
○表面を過酸化水素で2分間滅菌する
○流水下で洗う
○70%エタノール中で2分間表面を滅菌する
○流水下で洗う
○フローフードに移し、10%の家庭用漂白剤で30分間表面滅菌する
○蒸留水で洗う(フード内)
○葉を四角形(外植片)に切断し、ペトリ皿中の培地に移す
・固体培地組成:
○MS培地(塩類およびビタミン)
○30g/Lのスクロース
○0.8%の寒天
○pHを0.2M KOHで5.8に調整
○ホルモン0.25mgのL−1 2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)、0.25mgのL−1ナフタレン酢酸(NAA)および1mgのL−1 6−ベンジルアミノプリン(BAP)。
・外植片の創傷領域に発生するカルスの集塊を十分に増殖させた後、注意深く取り出し、固体培地の新鮮なペトリ皿上で継代培養した。
茶カルス細胞抽出物の調製
・凍結乾燥カルス材料の20%懸濁液を96%エタノール中で調製した
・0.1gの凍結乾燥材料を0.9gの96%エタノールと混合した。
・懸濁液を4℃、13,000rpmで10分間遠心分離し、上清を保持した(幹細胞抽出物のストック溶液)
・幹細胞抽出物のストック溶液を、使用まで−20℃で保存した
皮膚細胞乾燥保護アッセイ
・ヒト成人真皮線維芽細胞(カタログ番号C−013−5C、Life Technologies)を、低血清増殖補助剤(カタログ番号S−003−10、Life Technologies)を補添した0.5mlのMedium 106(カタログ番号M−106−500、Life Technologies)を含む24ウェルプレートにおいて、約90%培養密度まで37℃、5%CO2において培養した。
・その後、細胞をさらに24時間増殖させた
・ウェルから培地を完全に吸引し、室温で層流細胞培養フード中に10分間放置することにより、細胞を乾燥させた。
・0.5mlの新鮮培地を各ウェルに加え、細胞を37℃、5%CO2においてインキュベートした
・1時間後、50μlのAlamarBlue Cell Viability Reagent(Molecular Probes、カタログ番号DAL1025)を各ウェルに添加した
・37℃、5%CO2においてさらに4時間インキュベートした後、200μlの培地を各ウェルから取り出し、96ウェルプレートに入れた。次いで、試料の蛍光強度を励起550nm/発光612nmで読み取った。AlamarBlueは、代謝的に活性な細胞における還元反応を介して、非蛍光色素(レサズリン)を高蛍光色素(レゾルフィン)に変換することにより、細胞生存度指標として働く。
・ヒト成人真皮線維芽細胞(カタログ番号C−013−5C、Life Technologies)を、1mMのピルビン酸、2mMのグルタミンおよび10%のウシ胎仔血清を補添加した1mlのDMEM (Life Technologies、カタログ番号21063−029)を含む6cmのペトリ皿において、約90%集密まで37℃、5%CO2において培養した。
・その後、細胞をさらに24時間増殖させた
・ペトリ皿から蓋を取り外し、細胞にUvacube400紫外線チャンバー(Honle UV technology)で30分間照射した
・古い培地を取り除き、同じ種類の新鮮な培地を加えた。
・ヒト成人真皮線維芽細胞(カタログ番号C−013−5C、Life Technologies)を、1%ウシ胎仔血清を補添した1mlのDMEM GlutaMAX(Gibco、カタログ番号10566016)を含む12ウェルプレートにおいて、60,000細胞/ウェルの濃度まで37℃、5%CO2において増殖させた。
・細胞を37℃、5%CO2でさらに24時間インキュベートした
・その後、細胞培養培地を除去し、16,000RPMで1分間遠心分離した。上清を回収し、必要になるまで−20℃で保存した。
表1:ヒト真皮線維芽細胞由来培地のAlamarBlue蛍光測定値を、励起550nm/発光612nmで読み取った。各条件について3回反復した(試料1〜3)。培地およびAlamarBlue単独の蛍光強度(バックグラウンド蛍光)を平均値から差し引いた。
・粉砕し、凍結乾燥したカルス材料の20%懸濁液を、以下の溶媒:エタノール、メタノール、クロロホルム、エーテル、アセトン、水中で調製した。
・懸濁液を4℃、13,000rpmで10分間遠心分離し、上清を保持した
・上清を真空乾燥して溶媒を蒸発させた
・残留固体抽出物を1mlのDMSOに溶解した(激しく1分間ボルテックス混合した)
・抽出物を、記載のように最終培地中1%の濃度で皮膚細胞乾燥アッセイに使用した
・1%DMSOを含有する実験対照(担体のみ)も調製した
表2:ヒト真皮線維芽細胞由来培地のAlamarBlue蛍光測定値を、励起550nm/発光612nmで読み取った。各条件について3回反復した(試料1〜3)。培地およびAlamarBlue単独の蛍光強度(バックグラウンド蛍光)を平均値から差し引いた。
表3:ヒト真皮線維芽細胞由来培地のAlamarBlue蛍光測定値を、励起550nm/発光612nmで読み取った。各条件について3回反復した(試料1〜3)。培地およびAlamarBlue単独の蛍光強度(バックグラウンド蛍光)を平均値から差し引いた。
表4:炎症経路アクチベーターPMAと、1%茶カルス抽出物または1%エタノール(対照)のいずれかで処理したヒト成人真皮線維芽細胞によって産生されるインターロイキン−6の濃度(IL−6のpg/全細胞タンパク質1μg)を示す。各処理について3回反復した(試料1〜3)。結果は、茶カルス抽出物が、抗炎症活性を示すPMA処理細胞で産生されるIL−6の量を低下させることを示す。
試料:
・茶葉−2015年6月に収穫された葉
・茶カルス(旧)−2015年初めに培養された茶カルスの古いバッチ。
Claims (12)
- カメリア・シネンシス(Camellia sinensis)脱分化幹細胞抽出物の製造方法であって、
(a)カメリア・シネンシス脱分化幹細胞を含む細胞培養物を調製する工程と、
(b)抽出溶媒としてエタノールおよび/またはメタノールを用いて前記細胞培養物を抽出して、カメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物を製造する工程と
を含む製造方法。 - 前記細胞培養物が、カメリア・シネンシス植物カルス細胞を培養することによって製造される、請求項1に記載の製造方法。
- 前記細胞培養培地が、ホルモンである2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)、ナフタレン酢酸(NAA)および6−ベンジルアミノプリン(BAP)を含む、請求項1から2のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記細胞培養培地が5.6〜6.0のpHを有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の製造方法。
- 没食子酸塩を実質的に含まないカメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物を含んだ組成物。
- 請求項1から5のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるカメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物を含む組成物。
- 経口または局所用皮膚治療組成物である、請求項5または請求項6に記載の組成物。
- 前記カメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物を少なくとも0.01重量%含む、請求項5から7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記カメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物(Camellia sinensis stem dedifferentiated cell extract)を少なくとも0.1重量%含む、請求項8に記載の組成物。
- 乾燥および/またはUV損傷から皮膚を保護するための、カメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物の使用。
- 炎症の危険性から皮膚を保護するための、カメリア・シネンシスの脱分化幹細胞抽出物の使用。
- 前記脱分化幹細胞抽出物が、細胞培養物からエタノールおよび/またはメタノールで抽出されている、請求項10に記載の使用。
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