JP2019207143A

JP2019207143A - 生化学分析用ブロッキング剤

Info

Publication number: JP2019207143A
Application number: JP2018102305A
Authority: JP
Inventors: 奈津子小久保; natsuko Kokubo; 啓輔倉内; Keisuke Kurauchi
Original assignee: Toyo Ink SC Holdings Co Ltd
Current assignee: Artience Co Ltd
Priority date: 2018-05-29
Filing date: 2018-05-29
Publication date: 2019-12-05

Abstract

【課題】本発明の課題は、標的のたんぱく質に対する染色剤の特異吸着による発色を妨げることなく、標的以外のたんぱく質を十分に覆い、標的以外のたんぱく質に対する染色剤の非特異吸着を防止して発色させない効果を発揮する生化学分析用ブロッキング剤を提供することである。【解決手段】上記課題は、ベタイン構造を有する繰り返し単位を含むビニル系スターポリマー（Ａ）を含有する、生化学分析用ブロッキング剤によって解決される。【選択図】なし

Description

本発明は、生化学分析用ブロッキング剤に関する。また本発明は、ビニル系スターポリマーに関する。

生化学分析の分野では、抗原抗体反応による特異吸着を利用し、標的のＤＮＡやたんぱく質を検出し可視化する方法が、サザンブロッティング法、ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、免疫染色法等として広く知られている。抗体は、標的たんぱく質以外とも非特異的な吸着反応を起こす。このような非特異的吸着を防ぐために、検出・測定対象表面を、非特異的な吸着は防ぐけれど特異的吸着は妨げないようなブロッキング剤で覆うような前処理が行われる。

ブロッキング剤としては、正常血清、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、スキムミルクのような生体由来のたんぱく質が知られている（特許文献１、非特許文献１）。

また、ホスホリルコリン基を側鎖に有する共重合体を用いたブロッキング剤の開発も検討されている（特許文献２、非特許文献２）。

国際公開第２０１６／０５２６９０号特開平０７−０８３９２３号公報

「渡辺・中根酵素抗体法」学際企画株式会社刊２００２年高分子論文集第３５巻７号４２３（１９７８）

しかし、特許文献１や非特許文献１に開示されるような生体由来のたんぱく質は、性能にばらつきが生じやすいという潜在的な課題を有している。また、特許文献２や非特許文献２に開示される共重合体は、原料の単量体合成時に複数の反応やそれに伴う精製が必要であるなど生産性に問題を有している。さらに生化学分析においてブロッキング剤として用いた時に感度の低下をもたらすなど、さらなる改善が必要であった。

本発明は、標的のたんぱく質に対する染色剤の特異吸着による発色を妨げることなく、標的以外のたんぱく質を十分に覆い、標的以外のたんぱく質に対する染色剤の非特異吸着を防止して発色させない効果を発揮する生化学分析用ブロッキング剤を提供することを目的とする。

すなわち、本発明は、下記〔１〕〜〔６〕に関する。

〔１〕ベタイン構造を有する繰り返し単位を含むビニル系スターポリマー（Ａ）を含有する、生化学分析用ブロッキング剤。

〔２〕前記ビニル系スターポリマー（Ａ）が、下記一般式１〜３で表される少なくともいずれかの繰り返し単位を含む、〔１〕に記載の生化学分析用ブロッキング剤。

一般式１

一般式２

一般式３

（一般式１〜３中、
Ｒ_１は水素原子又はメチル基、
Ｒ_２は炭素数１〜６のアルキレン基、
Ｒ_３及びＲ_４はそれぞれ独立して炭素数１〜４のアルキル基、
Ｒ_５は炭素数１〜４のアルキレン基、
Ｘは酸素原子又はＮＨ、
ＹはＣＯＯ⁻又はＳＯ_３ ⁻、
Ｒ_６は水素原子又はメチル基、
Ｒ_７は水素原子又はメチル基、
Ｒ_８は炭素数１〜６のアルキレン基又は炭素数１〜６のヒドロキシアルキレン基、
Ｒ_９は水素原子又はメチル基、
Ｒ_１０〜Ｒ_１４のうちの１つはビニル系スターポリマーの主鎖の＊部分と直接結合し、
Ｒ_１０〜Ｒ_１４のうち４つはそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基、
Ｒ_１５は炭素数１〜６のアルキレン基又は炭素数１〜６のヒドロキシアルキレン基を表す。）

〔３〕前記一般式１〜３で表される繰り返し単位の合計が、ビニル系スターポリマー（Ａ）の全構成単位中３０〜９９ｍｏｌ％である、〔２〕に記載の生化学分析用ブロッキング剤。

〔４〕前記ビニル系スターポリマー（Ａ）が、下記（i）又は（ii）のいずれかである〔１〕〜〔３〕に記載の生化学分析用ブロッキング剤。
（i）少なくともベタイン構造を有する繰り返し単位を形成するビニル系モノマー（ａ１）を含むビニル系モノマー（ａ２）と、三官能以上のチオール基含有化合物（ｘ）と、からなる共重合体。
（ii）３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ３）を含むビニル系モノマー（ａ４）と、三官能以上のチオール基含有化合物（ｘ）と、からなる共重合体の３級アミノ基に、ベタイン化剤（Ｅ）を反応させてなる共重合体。

〔５〕前記ビニル系モノマー（ａ２）又は（ａ４）が、さらに、炭素数１〜１８のアルキル基を有するビニル系モノマー（ａ５）を含む、〔４〕に記載の生化学分析用ブロッキング剤。

〔６〕下記一般式１〜３で表される少なくともいずれかの繰り返し単位を含む、ビニル系スターポリマー（Ａ）。

一般式１

一般式２

一般式３

本発明により、標的のたんぱく質に対する染色剤の特異吸着による発色を妨げることなく、標的以外のたんぱく質を十分に覆い、標的以外のたんぱく質に対する染色剤の非特異吸着を防止して発色させない効果を発揮する生化学分析用ブロッキング剤を提供することが出来る。これにより、感度よくウエスタンブロッティングや免疫組織染色などの抗原抗体反応を利用した生化学分析を行うことが可能になる。

以下において、本発明の生化学分析用ブロッキング剤及びビニル系スターポリマーについて詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施態様に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施態様に限定されるものではない。

＜生化学分析用ブロッキング剤＞
＜ベタイン構造を有する繰り返し単位を含むビニル系スターポリマー（Ａ）＞
本発明の生化学分析用ブロッキング剤は、ベタイン構造を有する繰り返し単位を含むビニル系スターポリマー（Ａ）を含有する。「ベタイン構造」とは、正電荷と負電荷とを同一分子内の隣り合わない位置に有し、正電荷を有する原子には解離できる水素原子が結合しておらず、分子全体としては無電荷である構造を意味する。分子内のベタイン構造は、たんぱく質への吸着抑制効果を有する。さらにビニル系スターポリマーが有する分岐構造は、牛血清アルブミン等生体由来のたんぱく質の水溶液中での溶解状態に類似しているため、優れたブロッキング性能が得られると推察される。

本発明で用いるベタイン構造を有する繰り返し単位としては、下記一般式１〜４で表される構造等が挙げられるが、これらに限定されず、２種以上の繰り返し単位を併用してもよい。

一般式１

一般式２

一般式３

一般式４

（一般式４中、
Ｒ_１６は水素原子又はメチル基、
Ｘは酸素原子又はＮＨ、
Ｒ_１７は−（ＣＨ_２−ＣＨＲ_２２Ｏ）ｍ−（ＣＨ_２−ＣＨＲ_２２）−基（ここで、Ｒ_２２は水素原子、メチル基又はエチル基をを表し、ｍは０〜１０の整数を表す。）、
Ｒ_１８は−（ＣＨ_２）ｇ−（ここで、ｇは０〜１０の整数を表す。）、
Ｒ_１９〜Ｒ_２１はそれぞれ独立して炭素数１〜８のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を表す。）

中でも、ビニル系スターポリマー（Ａ）はポリマーの製造及び精製の観点から、好ましくは一般式１〜３で表される繰り返し単位を含み、より好ましくは、下記（i）又は（ii）のいずれかである。
（i）少なくともベタイン構造を有する繰り返し単位を形成するビニル系モノマー（ａ１）を含むビニル系モノマー（ａ２）と、三官能以上のチオール基含有化合物（ｘ）と、からなる共重合体。
（ii）少なくとも３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ３）を含むビニル系モノマー（ａ４）と、三官能以上のチオール基含有化合物（ｘ）と、からなる共重合体の３級アミノ基に、ベタイン化剤（Ｅ）を反応させてなる共重合体。

ベタイン構造を有する繰り返し単位を形成することができるビニル系モノマー（ａ１）は、市販品を用いてもよいし、合成品を用いてもよく、例えば、後述の３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ３）の３級アミノ基に、後述のベタイン化剤（Ｅ）を反応させて製造することができる。

＜少なくともベタイン構造を有する繰り返し単位を形成するビニル系モノマー（ａ１）を含むビニル系モノマー（ａ２）＞
ビニル系モノマー（ａ２）は、少なくともベタイン構造を有する繰り返し単位を形成するビニル系モノマー（ａ１）を含むものである。

［ベタイン構造を有する繰り返し単位を形成するビニル系モノマー（ａ１）］
ビニル系モノマー（ａ１）は、少なくともベタイン構造を有する繰り返し単位を形成するものであり、好ましくは前記一般式１〜４で表される少なくともいずれかの繰り返し単位を形成するものである。以下に、一般式１〜４の繰り返し単位を形成するモノマーについて説明する。

一般式１の繰り返し単位を形成することができるモノマーとしては、
例えば、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムメチル−α−カルボキシベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムメチル−α−カルボキシベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムメチル−α−カルボキシベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシブチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムメチル−α−カルボキシベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシメチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアンモニウムメチル−α−カルボキシベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアンモニウムメチル−α−カルボキシベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアンモニウムメチル−α−カルボキシベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシブチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアンモニウムメチル−α−カルボキシベタイン、などのＮ−(メタ)アクリロイルオキシアルキル−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアンモニウムアルキル−α−カルボキシベタイン；
Ｎ−（メタ）アクリルアミドプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムメチル−α−カルボキシベタイン、Ｎ−（メタ）アクリルアミドプロピル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアンモニウムメチル−α−カルボキシベタイン、などのＮ−(メタ)アクリルアミドアルキル−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアンモニウムアルキル−α−カルボキシベタイン；
Ｎ−（メタ）アクリルアミドプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムメチル−α−カルボキシベタイン、Ｎ−（メタ）アクリルアミドプロピル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアンモニウムメチル−α−カルボキシベタイン、などのＮ−(メタ)アクリルアミドアルキル−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアンモニウムアルキル−α−カルボキシベタイン；
Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムメチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムエチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムプロピル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムメチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムエチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムプロピル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムメチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムエチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムプロピル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシブチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムメチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシブチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムエチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシブチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムプロピル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシブチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブチル−α−スルホベタイン、などのＮ−(メタ)アクリロイルオキシアルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムアルキル−α−スルホベタイン；
Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシメトキシメトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムメチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシメトキシメトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムエチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシメトキシメトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムプロピル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシメトキシメトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムメチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムエチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムプロピル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシプロポキシプロポキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムメチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシプロポキシプロポキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムエチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキプロポキシプロポキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムプロピル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシプロポキシプロポキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシブトキシブトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムメチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシブトキシブトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムエチル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシブトキシブトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムプロピル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシブトキシブトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブチル−α−スルホベタイン、などのＮ−(メタ)アクリロイルオキシアルコキシアルコキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムアルキル−α−スルホベタイン；
Ｎ−（メタ）アクリルアミドプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムプロピル−α−スルホベタイン、Ｎ−（メタ）アクリルアミドプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブチル−α−スルホベタインなどのＮ−(メタ)アクリルアミドアルキル−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアンモニウムアルキル−α−スルホベタインなどが挙げられる。本発明において（メタ）アクリルと表記した場合、メタクリルもしくはアクリルであることを示す。

一般式２の繰り返し単位を形成することができるモノマーとしては、
例えば、１−ビニル−３−（３−スルホプロピル）イミダゾリウム内部塩、１−ビニル−３−（３−スルホブチル）イミダゾリウム内部塩、１−ビニル−２−メチル−３−（３−スルホプロピル）イミダゾリウム内部塩、１−ビニル−２−メチル−３−（４−スルホブチル）イミダゾリウム内部塩などの１−ビニル−２−アルキル−３−（４−スルホアルキル）イミダゾリウム内部塩などが挙げられる。

一般式３の繰り返し単位を形成することができるモノマーとしては、
例えば、２−ビニル−１−（３−スルホプロピル）ピリジニウム内部塩、２−ビニル−１−（３−スルホブチル）ピリジニウム内部塩、などの２−ビニル−１−（３−スルホアルキル）ピリジニウム内部塩；
４−ビニル−１−（３−スルホプロピル）ピリジニウム内部塩、４−ビニル−１−（３−スルホブチル）ピリジニウム内部塩、などの４−ビニル−１−（３−スルホアルキル）ピリジニウム内部塩が挙げられる。

一般式４の繰り返し単位を形成することができるモノマーとしては、
例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、５−（メタ）アクリロイルオキシペンチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２’−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−２’−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル２’−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、５−（メタ）アクリロイルオキシペンチル−２’−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２’−（トリプロピルアンモニオ）エチルホスフェート、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−２’−（トリプロピルアンモニオ）エチルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル２’−（トリプロピルアンモニオ）エチルホスフェート、５−（メタ）アクリロイルオキシペンチル−２’−（トリプロピルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２’−（トリブチルアンモニオ）エチルホスフェート、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−２’−（トリブチルアンモニオ）エチルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル２’−（トリプロピルアンモニオ）エチルホスフェート、５−（メタ）アクリロイルオキシペンチル−２’−（トリブチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−３’−（トリメチルアンモニオ）プロピルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−４’−（トリメチルアンモニオ）ブチルエチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−３’−（トリエチルアンモニオ）プロピルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−４’−（トリエチルアンモニオ）ブチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−３’−（トリプロピルアンモニオ）プロピルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−４’−（トリプロピルアンモニオ）ブチルホスフェートが挙げられる。

さらに、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−３’−（トリブチルアンモニオ）プロピルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−４’−（トリブチルアンモニオ）ブチルホスフェート、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−３’−（トリメチルアンモニオ）プロピルホスフェート、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−４’−（トリメチルアンモニオ）ブチルホスフェート、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−３’−（トリエチルアンモニオ）プロピルホスフェート、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−４’−（トリエチルアンモニオ）ブチルホスフェート、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−３’−（トリプロピルアンモニオ）プロピルホスフェート、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−４’−（トリプロピルアンモニオ）ブチルホスフェート、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−３’−（トリブチルアンモニオ）プロピルホスフェート、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−４’−（トリブチルルアンモニオ）ブチルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル３’−（トリメチルアンモニオ）プロピルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル４’−（トリメチルアンモニオ）ブチルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル３’−（トリエチルアンモニオ）プロピルエチルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル４’−（トリエチルアンモニオ）ブチルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル３’−（トリプロピルアンモニオ）プロピルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル４’−（トリプロピルアンモニオ）ブチルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル３’−（トリブチルアンモニオ）プロピルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル４’−（トリブチルアンモニオ）ブチルホスフェートが挙げられる。

［その他ビニル系モノマー］
ビニル系モノマー（ａ２）は、少なくともベタイン構造を有する繰り返し単位を形成するビニル系モノマー（ａ１）以外の、その他ビニル系モノマーを含んでもよい。その他ビニル系モノマーの中でも、水酸基、カルボン酸基、無水カルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基、１〜３級アミド基、１〜４級アミン基、ポリエーテル鎖を分子構造内に有するものを、極性官能基を有するビニル系モノマーとする。

（極性官能基を有するビニル系モノマー）
極性官能基を有するビニル系モノマーとしては、特に限定されないが、例えば、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、２−（メタ）アクリロイロキシエチル−２−ヒドロキシエチルフタル酸、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシビニルベンゼン、１−エチニル−１−シクロヘキサノール、アリルアルコールなどの水酸基を有する単量体；
マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、シトラコン酸、又は、これらのアルキルもしくはアルケニルモノエステル、フタル酸β−（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、イソフタル酸β−（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、テレフタル酸β−（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、コハク酸β−（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、けい皮酸などのカルボン酸基、もしくはその無水物を有する単量体；
ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸などのスルホン酸基を有する単量体；
（２−ヒドロキシエチル）メタクリレートアッシドホスフェートなどのリン酸基を有する単量体；
（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メトキシメチル−（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシメチル−（メタ）アクリルアミド、Ｎ−プロポキシメチル−（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ブトキシメチル−（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ペントキシメチル−（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジ（メトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−エトキシメチル−Ｎ−メトキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジ（エトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−エトキシメチル−Ｎ−プロポキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジ（プロポキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−ブトキシメチル−Ｎ−（プロポキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジ（ブトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−ブトキシメチル−Ｎ−（メトキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジ（ペントキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−メトキシメチル−Ｎ−（ペントキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ダイアセトン（メタ）アクリルアミドなどの１〜３級アミド基を有する単量体；
（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチルメチルクロライド塩、トリメチル−３−（１−（メタ）アクリルアミド−１，１−ジメチルプロピル）アンモニウムクロライド、トリメチル−３−（１−（メタ）アクリルアミドプロピル）アンモニウムクロライド、及びトリメチル−３−（１−（メタ）アクリルアミド−１，１−ジメチルエチル）アンモニウムクロライドなどの１〜４級アミン基を有する単量体；
ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、プロポキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ−ブトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、プロポキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ−ブトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシテトラエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヘキサエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシヘキサエチレングリコール（メタ）アクリレートなどのポリエーテル鎖を有する単量体が挙げられる。

極性官能基を有するビニル系モノマー以外のその他ビニル系モノマーとしては、
メトキシエチル（メタ）アクリレート、エトキシエチル（メタ）アクリレート、プロポキシエチル（メタ）アクリレート、ブトキシエチル（メタ）アクリレート、エトキシプロピル（メタ）アクリレート等のアルコキシ（メタ）アクリレート；
フェニル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、フェノキシエチル（メタ）アクリレート等の芳香族エステル（メタ）アクリレート；
（メタ）アクリル酸アリル、（メタ）アクリル酸１−メチルアリル、（メタ）アクリル酸２−メチルアリル、（メタ）アクリル酸１−ブテニル、（メタ）アクリル酸２−ブテニル、（メタ）アクリル酸３−ブテニル、（メタ）アクリル酸１，３−メチル−３−ブテニル、（メタ）アクリル酸２−クロルアリル、（メタ）アクリル酸３−クロルアリル、（メタ）アクリル酸ｏ−アリルフェニル、（メタ）アクリル酸２−（アリルオキシ）エチル、（メタ）アクリル酸アリルラクチル、（メタ）アクリル酸シトロネリル、（メタ）アクリル酸ゲラニル、（メタ）アクリル酸ロジニル、（メタ）アクリル酸シンナミル、ジアリルマレエート、ジアリルイタコン酸、（メタ）アクリル酸ビニル、クロトン酸ビニル、オレイン酸ビニル，リノレン酸ビニル、（メタ）アクリル酸２−（２’−ビニロキシエトキシ）エチルなどのエチレン性不飽和基含有（メタ）アクリル酸エステル類；
パーフルオロメチルメチル（メタ）アクリレート、パーフルオロエチルメチル（メタ）アクリレート、２−パーフルオロブチルエチル（メタ）アクリレート、２−パーフルオロヘキシルエチル（メタ）アクリレート、２−パーフルオロオクチルエチル（メタ）アクリレート、２−パーフルオロイソノニルエチル（メタ）アクリレート、２−パーフルオロノニルエチル（メタ）アクリレート、２−パーフルオロデシルエチル（メタ）アクリレート、パーフルオロプロピルプロピル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルプロピル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルアミル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルウンデシル（メタ）アクリレートなどの炭素数１〜２０のパーフルオロアルキル基を有するパーフルオロアルキル基含有エチレン性不飽和単量体などの（メタ）アクリレート系単量体；
ラクトン変性（メタ）アクリレートなどのポリエステル鎖を有するエチレン性不飽和化合物などの側鎖に高分子構造を有する（メタ）アクリレート系単量体；
スチレン、α−メチルスチレン、２−メチルスチレン、クロロスチレン、アリルベンゼン、エチニルベンゼン等の芳香族ビニル単量体；
（メタ）アクリロニトリルなどのニトリル基含有エチレン性不飽和単量体；
酢酸ビニル、酪酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ヘキサン酸ビニル、カプリル酸ビニル、ラウリル酸ビニル、パルミチン酸ビニル、ステアリン酸ビニルなどの脂肪酸ビニル系化合物；ブチルビニルエーテル、エチルビニルエーテルなどのビニルエーテル系エチレン性不飽和単量体；
酢酸アリル、シアン化アリルなどのアリル単量体；
シアン化ビニル、ビニルシクロヘキサン、ビニルメチルケトンなどのビニル単量体；
アセチレン、エチニルトルエンなどのエチニル単量体；
パーフルオロブチルエチレン、パーフルオロヘキシルエチレン、パーフルオロオクチルエチレン、パーフルオロデシルエチレンなどのパーフルオロアルキル、アルキレン類などのパーフルオロアルキル基含有エチレン性不飽和化合物等の、（メタ）アクリレートではないエチレン性不飽和結合を有する単量体；
等が挙げられる。

（炭素数１〜１８のアルキル基を有するビニル系モノマー（ａ５））
その他ビニル系モノマーとしては、炭素数１〜１８のアルキル基を有するビニル系モノマーを含むことが好ましい。炭素数１〜１８のアルキル基を有するエチレン性不飽和単量体を用いることにより、ビニル系スターポリマー（Ａ）の極性や硬さが適切に制御され、優れたブロッキング性能を発揮することができる。

炭素数１〜１８のアルキル基を有するビニル系モノマー（ａ５）としては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート、などのアルキル（メタ）アクリレート；
１−プロピレン、１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン、１−ノネン、１−デセンなどのα−オレフィン系エチレン性不飽和単量体などが挙げられる。

本発明において、その他ビニル系モノマーの有するビニル基は、重合性の観点から（メタ）アクリレート基もしくは芳香族ビニル基であることが好ましい。

＜少なくとも３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ３）を含むビニル系モノマー（ａ４）＞
ビニル系モノマー（ａ４）は、少なくとも３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ３）を含むものである。

［３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ３）］
３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ３）は、３級アミノ基にベタイン化剤（Ｅ）を反応させることにより、ベタイン構造を有する繰り返し単位を形成するビニル系モノマー（ａ１）とすることができる。以下に、ベタイン化剤（Ｅ）を反応させることで一般式１〜３の繰り返し単位を形成することができる、３級アミノ基を有するビニル系モノマーについて説明する。

ベタイン化剤（Ｅ）を反応させることで一般式１の繰り返し単位を形成することができる３級アミノ基を有するビニル系モノマーとしては、例えば、
Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、
Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、
Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、
Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシブチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、
Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシメチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン、
Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン、
Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン、
Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシブチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン、
などのＮ−(メタ)アクリロイルオキシアルキル−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミン；
Ｎ−（メタ）アクリルアミドプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、
Ｎ−（メタ）アクリルアミドプロピル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン、
などのＮ−(メタ)アクリルアミドアルキル−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミン；
Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシメトキシメトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、
Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、
Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシプロポキシプロポキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、
Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシブトキシブトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、
などのＮ−(メタ)アクリロイルオキシアルコキシアルコキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンなどが挙げられる。

ベタイン化剤（Ｅ）を反応させることで一般式２の繰り返し単位を形成することができる３級アミノ基を有するビニル系モノマーとしては、例えば、１−ビニルイミダゾール、１−ビニル−２−メチル−イミダゾール、などの１−ビニル−２−アルキル−イミダゾールが挙げられる。

ベタイン化剤（Ｅ）を反応させることで一般式３の繰り返し単位を形成することができる３級アミノ基を有するビニル系モノマーとしては、例えば、４−ビニル−ピリジン、２−ビニル−ピリジンなどのビニルピリジンが挙げられる。

［その他ビニル系モノマー］
ビニル系モノマー（ａ４）は、少なくとも３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ３）以外の、その他ビニル系モノマーを含んでもよい。その他モノマーとしては、前述のその他ビニル系モノマーと同義である。

本発明のビニル系スターポリマー（Ａ）は、前記一般式１〜４で表される少なくともいずれかの繰り返し単位の合計が、全構成単位中３０〜９９ｍｏｌ％であることが好ましく、４０〜９６ｍｏｌ％であることがより好ましい。より好ましくは、本発明のビニル系スターポリマー（Ａ）は、前記一般式１〜３で表される少なくともいずれかの繰り返し単位の合計が、全構成単位中３０〜９９ｍｏｌ％であることが好ましく、４０〜９６ｍｏｌ％であることがより好ましい。上記特定範囲内にあることによって、好適な水溶性を発現すると共に、抗原抗体反応は阻害せず、標的以外のたんぱく質に対する染色剤の非特異吸着を抑制できるため好ましい。一般式１〜４で表される少なくともいずれかの繰り返し単位の合計量（ｍｏｌ％）は、全ビニル系モノマーに対する、一般式１〜４で表される繰り返し単位を形成するビニル系モノマーの合計量（ｍｏｌ％）により算出することができる。

また、炭素数１〜１８のアルキル基を有するビニル系モノマー（ａ５）は、全ビニル系モノマーの合計１００ｍｏｌ％中、１〜７０ｍｏｌ％であることが好ましく、さらに４〜６０ｍｏｌ％であることが好ましい。７０ｍｏｌ％以下とすることにより、染色の標的であるたんぱく質に対する疎水的な相互作用を抑制でき、効果的に染色阻害を抑制できる点で好ましい。１ｍｏｌ％以上とすることにより、ビニル系スターポリマーの水溶性を適度に抑制し、標的以外のたんぱく質への吸着を向上できる点で好ましい。

＜ビニル系スターポリマー（Ａ）の合成＞
本発明のビニル系スターポリマーの合成法は、３官能以上のコア部から逐次又は連鎖的に重合し、枝ポリマーを形成する方法であってもよいし、合成した枝ポリマーを少なくとも３官能以上のコア部とカップリングする方法であっても良い。好適に用いられる方法として、連鎖移動剤を用いてラジカル重合を行う方法が挙げられる。連鎖移動剤としては、チオール基含有化合物を挙げることができ、少なくとも３官能以上のチオール基含有化合物存在下、ラジカル重合を行う方法がプロセス上簡便であり好ましい。

［３官能以上のチオール基含有連鎖移動剤（ｘ）］
３官能以上のチオール基含有化合物は、分子内に連鎖移動剤として作用する３官能以上のチオール基（‐ＳＨ基）があればよく、そのような化合物として、例えば下記一般式５で表す化合物が挙げられる。

一般式５

（一般式５中、Ｒ^５は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基又はイソシアヌレート基を表す。ｎはそれぞれ独立に０〜１０の整数を表し、ｋ^１は０〜３の整数を表し、ｌ^１は０〜４の整数を表し、ｍ^１は０〜３の整数を表し、ｋ^２は０〜３の整数を表し、ｌ^２は０〜３の整数を表し、ｍ^２は０〜３の整数を表す。ただし、ｋ^１とｌ^１とｍ^１との総和は４以下であり、ｋ^２とｌ^２とｍ^２との総和は４以下であり、ｌ^１とｌ^２の総和は３以上である。）

Ｒ^５が表すアルキル基としては、炭素数１〜１０のアルキル基を挙げることができ、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｔ−ブチル基等を挙げることができる。
Ｒ^５が表すアルコキシ基としては、炭素数１〜１０のアルコキシ基を挙げることができ、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、２−メトキシエトキシ基等が挙げられる。
Ｒ^５が表すアリール基としては、炭素数６から３０のアリール基、例えば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。

本発明のビニル系スターポリマー（Ａ）の合成に用いる少なくとも３官能以上のチオール基含有化合物の具体例を以下に挙げるが、本発明で採用することができるチオール含有化合物はこれらの具体例に限定されるものではない。

本発明のビニル系スターポリマー（Ａ）は上記３官能以上のチオール基含有連鎖移動剤（ｘ）を用いて重合することで、スター構造のような分岐構造を持つだけでなく、ポリマー分子内に硫黄原子を組み込むことができる。そのため、牛血清アルブミン等生体由来のたんぱく質の構造や、あるいは水溶液中での溶解状態に近づくことができるため、優れたブロッキング性能が得られると推察される。

本発明で使用する上記３官能以上のチオール基含有連鎖移動剤（ｘ）は、重合反応時の添加量でビニル系スターポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）が決まる。そのため３官能以上のチオール基含有連鎖移動剤（ｘ）の添加量は、全ビニル系モノマーに対して、０．１質量％〜１５質量％が好ましく、さらに０．１質量％〜１０質量％が好ましい。０．１％質量％以上加えることで重合反応時の熱制御や分子量制御がしやすく、１５質量％以下にすることで優れたブロッキング性能を有する分子量となる。

また前述のように、合成した枝ポリマーを少なくとも３官能以上のコア部とカップリングしてビニル系スターポリマー（Ａ）を合成することもできる。具体例としては、以下の方法が挙げられる。
（１）少なくともベタイン構造を有する繰り返し単位を形成するビニル系モノマー（ａ１）を含むビニル系モノマー（ａ２）と、２−メルカプトエタノール等の官能基含有連鎖移動剤とを用いて、片末端に水酸基を有するビニル系ポリマーを合成する。
（２）得られた片末端に水酸基を有するビニル系ポリマーの末端水酸基に、イソホロンジイソシアネート等のジイソシアネートを反応させて、片末端にイソシアネート基を有するビニル系ポリマーを合成する（枝ポリマーに相当）。
（３）得られた片末端にイソシアネート基を有するビニル系ポリマーと、トリス(２-アミノエチル)アミン等の３官能以上の１級アミノ基を持つ化合物（３官能以上のコア部に相当）とを反応させて、ビニル系スターポリマー（Ａ）を得る。

また、ビニル系スターポリマー（Ａ）の合成においては必要に応じて溶媒を使用することができる。使用できる溶媒としては、特に制限はないが、重合反応等の反応に影響を与えない範囲で、かつモノマー及び生成するスターポリマーが溶解する溶媒が好ましい。

＜ベタイン化剤（Ｅ）＞
ベタイン化剤（Ｅ）は、好ましくは、環状スルホン酸エステル（Ｅ１）、ω‐ハロゲン化アルキルスルホン酸金属塩（Ｅ２）、環状カルボン酸エステル（Ｅ３）及びω‐ハロゲン化アルキルカルボン酸金属塩（Ｅ４）からなる群より選択される。３級アミノ基を有するビニル系モノマー由来の３級アミノ基の窒素の少なくとも一部と反応させて、スルホベタイン化もしくはカルボベタイン化するために用いられる化合物群である。

このような環状スルホン酸エステル（Ｅ１）としては、例えば、１，２−エタンスルトン、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトンが挙げられる。

このようなω‐ハロゲン化アルキルスルホン酸金属塩（Ｅ２）としては、例えば、２-クロロエタンスルホン酸ナトリウム、２-ブロモエタンスルホン酸ナトリウム、３-クロロプロパンスルホン酸ナトリウム、３-ブロモプロパンスルホン酸ナトリウム、４-クロロブタンスルホン酸ナトリウム、４-ブロモブタンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。

このような環状カルボン酸エステル（Ｅ３）としては、例えば、β−プロピオラクトン、γ−ブチロラクトン、δ−バレロラクトンなどが挙げられる。

このようなω‐ハロゲン化アルキルカルボン酸金属塩（Ｅ４）としては、例えば、２−クロロ酢酸ナトリウム、２−ブロモ酢酸ナトリウム、３−クロロプロピオン酸ナトリウム、３−ブロモプロピオン酸ナトリウム、４−クロロ酪酸ナトリウム、４−ブロモ酪酸ナトリウム、５−クロロペンタン酸ナトリウム、５−ブロモペンタン酸ナトリウムなどが挙げられる。

３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ３）を重合してなるビニル系スターポリマーとベタイン化剤（Ｅ）との反応例を下記スキーム１〜６に示す。

スキーム１

スキーム２

スキーム３

スキーム４

スキーム５

スキーム６

＜ビニル系スターポリマー（Ａ）の重量平均分子量（Ｍｗ）＞
ビニル系スターポリマー（Ａ）の重量平均分子量（Ｍｗ）は、１，０００〜５，０００，０００が好ましく、さらに１，０００〜１，０００，０００が好ましい。重量平均分子量（Ｍｗ）１，０００以上であることで、標的以外の非特異的吸着を抑制でき、５，０００，０００以下であることで、水溶性とすることができる。

ビニル系スターポリマー（Ａ）の重量平均分子量（Ｍｗ）はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリスチレン換算で計測した値を採用する。測定装置及び測定条件としては、下記条件１によることを基本とし、試料の溶解性等により条件２とすることを許容する。ただし、重合体種によっては、さらに適宜適切なキャリア（溶離液）及びそれに適合したカラムを選定して用いてもよい。その他の事項については、ＪＩＳＫ７２５２−１〜４：２００８を参照することとする。なお、難溶の高分子化合物については下記条件の下、溶解可能な濃度で測定することとする。
（条件１）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺＭ−Ｈ、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺ４０００、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺ２０００ををつないだカラムを用いる。
キャリア：テトラヒドロフラン
測定温度：４０℃
キャリア流量：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
試料濃度：０．１質量％
検出器：ＲＩ（屈折率）検出器
注入量：０．１ｍｌ
（条件２）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷＭ−Ｈを２本つなげる
キャリア：１０ｍＭＬｉＢｒ／Ｎ−メチルピロリドン
測定温度：４０℃
キャリア流量：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
試料濃度：０．１質量％
検出器：ＲＩ（屈折率）検出器
注入量：０．１ｍｌ

また、ビニル系スターポリマー（Ａ）の分子量測定が困難な場合は、ベタイン前駆体ポリマーの重量平均分子量をビニル系スターポリマー（Ａ）の重量平均分子量とすることが出来る。ベタイン前駆体ポリマーの重量平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリスチレン換算で計測した値を採用し、測定装置及び測定条件としては、下記条件３によることを基本とする。
（条件３）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ４０００、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ３０００、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ２５００
をつないだカラムを用いる
キャリア：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１Ｌ）、トリエチルアミン（３．０４ｇ）、ＬｉＢｒ（０．８７ｇ）の混合液
測定温度：４０℃
キャリア流量：０．６ｍｌ／ｍｉｎ

以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、以下の実施例は本発明の権利範囲を何ら制限するものではない。「部」及び「％」は、「質量部」及び「質量％」を表し、ｍｏｌとは物質量を表し、ｍｏｌ％は全単量体中の物質量の割合を表す。

＜各種ベタインモノマーの合成＞
ビニル系スターポリマー（Ａ）の合成に用いたＮ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブチル−α−スルホベタインは、国際公開第２０１４／１８５９７７号の段落００３２を参考に使用した。同様に、Ｎ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムメチル−α−カルボベタインは特開平１１−２２２４７０号公報の段落００３６を、１−ビニル−３−（３−スルホプロピル）イミダゾリウム内部塩と２−ビニル−１−（３−スルホプロピル）ピリジニウム内部塩は特開平０８−２１８０６５号公報の段落００１８を参考に合成した。

＜ビニル系スターポリマー（Ａ）の製造＞
［製造例１］
ガス導入管、攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、ブタノールを２５．８部、ビニル系モノマー（ａ１）としてＮ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブチル−α−スルホベタインを９５部（８９．３ｍｏｌ％）、炭素数１〜１８のアルキル基を有するビニル系モノマー（ａ５）としてブチルアクリレートを５．０部（１０．７ｍｏｌ％）を仕込んだ。さらにここに、チオール含有連鎖移動剤（ｘ）としてトリメチロールプロパントリス（３-メルカプトプロピオネート）を全ビニル系モノマーの合計質量に対して３質量％になるように、３．０部加え、十分に窒素置換したのち、内温を９０℃に昇温した。別途ジメチル２,２'-アゾビス(２-メチルプロピネート)を０．１部とブタノール４２．９部を混合したものを準備し、これを１３分割して添加した。なお、ジメチル２,２'-アゾビス(２-メチルプロピネート)のブタノール溶液は、反応容器が９０℃で安定化した時点で１回目の添加を行い、以後３０分おきに反応容器に添加した。合計反応時間が８時間となったところで固形分測定を行い、転化率が９８％超えたことを確認し、冷却して取出した。その後、オーブンでブタノールを完全に揮発させ、ビニル系スターポリマー（Ａ−１）を得た。
得られたビニル系スターポリマー（Ａ−１）を２５℃のイオン交換水中９９ｇ中に１ｇ入れて撹拌し溶解後、２５℃で２４時間放置した。その結果これらの樹脂は分離、析出ともに見られず、完全に溶解可能であり、水溶性であることが示された。

［製造例２〜１５］
表１に示す配合組成で、製造例１と同様の方法でビニル系スターポリマー（Ａ−２〜Ａ−１５）を合成した。表１中の数値は特に断りのない限り、ｍｏｌ％を表す。

表１中の略称を以下に示す。
ＤＭＢＳ：Ｎ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブチル−α−スルホベタイン（一般式１相当）
ＤＭＭＣ：Ｎ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムメチル−α−カルボベタイン（一般式１相当）
ＶＳＰＩ：１−ビニル−３−（３−スルホプロピル）イミダゾリウム内部塩（一般式２相当）
ＶＳＰＰ：２−ビニル−１−（３−スルホプロピル）ピリジニウム内部塩（一般式３相当）
ＭＰＣ：２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（一般式４相当）
ＭＭＡ：メチルメタクリレート
ＢＡ：ブチルアクリレート
２ＥＨＭＡ：２−エチルヘキシルメタクリレート
ＬＭＡ：ラウリルメタクリレート
ＡＡ：アクリル酸
Ｓｔ：スチレン
ＴＭＭＰ：トリメチロールプロパントリス（３-メルカプトプロピオネート）
ＰＥＭＰ：ペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）
ＤＰＭＰ：ジペンタエリスリトールヘキサキス（３−メルカプトプロピオネート）

［製造例１６］
ガス導入管、攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、ブタノール２５．８部、３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ３）としてメタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチルを５０部（５１．７ｍｏｌ％）、炭素数１〜１８のアルキル基を有するビニル系モノマー（ａ５）としてブチルアクリレートを２０．０部（１０．９ｍｏｌ％）、その他ビニル系モノマーとしてヒドロキシエチルメタクリレート３０．０部（３７．４ｍｏｌ％）を仕込んだ。さらにここに、チオール基含有連鎖移動剤（ｘ）としてトリメチロールプロパントリス（３-メルカプトプロピオネート）を全ビニル系モノマーの合計重量に対して３質量％になるように、３．０部加え、十分に窒素置換したのち、内温を９０℃に昇温した。別途ジメチル２,２'-アゾビス(２−メチルプロピネート)を０．１部とブタノール４２．９部を混合したものを準備し、これを１３分割して添加した。なお、ジメチル２,２'-アゾビス(２-メチルプロピネート)のブタノール溶液は、反応容器が９０℃で安定化した時点で１回目の添加を行い、以後３０分おきに反応容器に添加した。合計反応時間が８時間となったところで固形分測定を行い、転化率が９８％超えたことを確認し、３級アミノ基を有するビニル系スターポリマーを得た。その後、ベタイン化剤（Ｅ）として１，４−ブタンスルトンを６５．０部（前記３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ３）由来のアミノ基の１．５倍に当たる量）加え、さらに２０時間撹拌を続けた。
次いで、冷却して取り出し、オーブンでブタノールを完全に揮発させ、ビニル系スターポリマー（Ａ−１６）を得た。乾燥させた樹脂をメチルエチルケトンでよく洗浄し、副生成物や残存した原料を取り除いた。
得られたビニル系スターポリマー（Ａ−１６）を２５℃のイオン交換水中９９ｇ中に１ｇ入れて撹拌し溶解後、２５℃で２４時間放置した。その結果これらの樹脂は分離、析出ともに見られず、完全に溶解可能であり、水溶性であることが示された。

［製造例１７〜２１］
表２に示す組成にて３級アミノ基を有するビニル系スターポリマーを合成した後、ベタイン化剤（Ｅ）を反応させ、ベタイン構造を有するビニル系スターポリマー（Ａ−１７〜Ａ−２１）を得た。表２中の数値は特に断りのない限り、ｍｏｌ％を表す。

表２中の略称を以下に示す。
ＤＭ：Ｎ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（一般式１相当）
ＶＩ：１−ビニルイミダゾール（一般式２相当）
ＶＰ：２−ビニルピリジン（一般式３相当）
ＭＭＡ：メチルメタクリレート
２ＥＨＭＡ：２−エチルヘキシルメタクリレート
ＨＥＭＡ：２−ヒドロキシエチルメタクリレート
Ｓｔ：スチレン
ＴＭＭＰトリメチロールプロパントリス（３-メルカプトプロピオネート）
ＤＰＭＰ：ジペンタエリスリトールヘキサキス（３−メルカプトプロピオネート）

［製造例２２］
（枝ポリマー＋コア部とのカップリングによるスターポリマーの合成）
ガス導入管、攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、酢酸エチル２６．８部、ビニル系モノマー（ａ１）としてＮ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブチル−α−スルホベタインを９５部（８９．３ｍｏｌ％）、炭素数１〜１８のアルキル基を有するビニル系モノマー（ａ５）としてブチルアクリレートを５．０部（１０．７ｍｏｌ％）を仕込んだ。さらにここに、メルカプトエタノールを７．０部加え、十分に窒素置換したのち、内温を９０℃に昇温した。別途ジメチル２,２'-アゾビス(２-メチルプロピネート)を０．１部と酢酸エチル８０．２部を混合したものを準備し、これを１３分割して添加した。なお、ジメチル２,２'-アゾビス(２-メチルプロピネート)の酢酸エチル溶液は、反応容器が９０℃で安定化した時点で１回目の添加を行い、以後３０分おきに反応容器に添加した。合計反応時間が８時間となったところで固形分測定を行い、転化率が９８％超えたことを確認後冷却して、重量平均分子量５，０００の片末端にヒドロキシル基を有したベタイン構造含有のプレポリマー１（固形分５０％溶液）を取出した。
次にガス導入管、攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、プレポリマー１の固形分５０％溶液を２１４部、イソホロンジイソシアネート１９．９部と、触媒としてジブチル錫ジラウレート０．３ｇ仕込み、窒素ガスで置換した。反応容器内を１００℃に加熱して、６時間反応した後、４０℃まで冷却して取り出し、片末端イソシアネート基を有したベタイン構造含有のプレポリマー２を得た。
次にガス導入管、攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、酢酸エチル１８９.２部、トリス(２−アミノエチル)アミン０．０３部を仕込み、十分に窒素置換したのち、内温を１００℃に昇温した。別途プレポリマー２の固形分５４．３％溶液を２３３．９部を３０分かけて滴下し、さらに１時間反応した後、室温まで冷却して反応を終了した。これにより、枝ポリマーとなる片末端イソシアネート基を有したベタイン構造含有のプレポリマー２と、コア部となるトリス(２-アミノエチル)アミンが反応して、枝ポリマーとコア部がウレア結合したビニル系スターポリマーを得た。その後、オーブンで酢酸エチルを完全に揮発させ、重量平均分子量１５，０００のビニル系スターポリマー（Ａ−２２）を得た。
得られたビニル系スターポリマー（Ａ−２２）を２５℃のイオン交換水中９９ｇ中に１ｇ入れて撹拌し溶解後、２５℃で２４時間放置した。その結果これらの樹脂は分離、析出ともに見られず、完全に溶解可能であり、水溶性であることが示された。

［比較製造例１］
攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、エタノール６０部を仕込み、内温を７５℃に昇温し十分に窒素置換した。別途用意しておいた、ジメチル２,２'-アゾビス(２−メチルプロピネート)を０．４部、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを７０．０部（４７ｍｏｌ％）、ブチルアクリレートを１５．０部（２３．２ｍｏｌ％）、メチルメタクリレートを１５．０部（２９．７ｍｏｌ％）、を混合したものを、内温を７５℃に保ちながら３時間滴下を続け、さらに２時間撹拌を続けた。固形分測定によって転化率が９８％超えたことを確認後、冷却して取出した。その後、オーブンでエタノールを完全に揮発させ、比較ビニル系重合体（ＨＡ−１）を得た。
なお、２５℃のイオン交換水中９９ｇ中に、得られた比較ビニル系重合体（ＨＡ−１）を１ｇ入れて撹拌し溶解後、２５℃で２４時間放置した。その結果これらの樹脂は分離、析出ともに見られず、完全に溶解可能であり、水溶性であることが示された。

［比較製造例２］
攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、ブタノール２５．８部、メタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチルを５０部（４１．９ｍｏｌ％）、メチルメタクリレートを２５．０部（３２．９ｍｏｌ％）、２−ヒドロキシエチルメタクリレート２５．０部（２５．３ｍｏｌ％）を仕込んだ。さらにここに、チオール含有連鎖移動剤（ｘ）としてトリメチロールプロパントリス（３-メルカプトプロピオネート）を全ビニル系モノマーの合計重量に対して３％になるように、３．０部加え、十分に窒素置換したのち、内温を９０℃に昇温した。別途ジメチル２,２'-アゾビス(２−メチルプロピネート)を０．１部とブタノール４２．９部を混合したものを準備し、これを１３分割して添加した。なお、ジメチル２,２'-アゾビス(２-メチルプロピネート)のブタノール溶液は、反応容器が９０℃で安定化した時点で１回目の添加を行い、以後３０分おきに反応容器に添加した。合計反応時間が８時間となったところで固形分測定を行い、転化率が９８％超えたことを確認後、冷却して取出した。その後、オーブンでブタノールを完全に揮発させ、ベタイン構造を含有しない比較ビニル系スターポリマー（ＨＡ−２）を得た。
得られた比較ビニル系スターポリマー（ＨＡ−２）を２５℃のイオン交換水中９９ｇ中に１ｇ入れて撹拌し溶解後、２５℃で２４時間放置した。その結果これらの樹脂は分離、析出ともに見られず、完全に溶解可能であり、水溶性であることが示された。

＜ブロッキング剤の調製＞
［実施例１］
（ブロッキング剤１溶液の調整）
得られたビニル系スターポリマー（Ａ−１）を、リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ溶液）に溶かし、固形分１質量％のブロッキング剤１の溶液を得た。

［実施例２〜２２、比較例１〜２］
（ブロッキング剤２〜２４溶液の調整）
ビニル系スターポリマー（Ａ−１）を、ビニル系スターポリマー（Ａ−２〜Ａ−２２）及び比較ビニル系重合体（ＨＡ−１〜ＨＡ−２）に変更した以外は、ブロッキング剤１溶液と同様にして、ブロッキング剤２〜２４の溶液を得た。

＜ブロッキング剤の評価＞
実施例及び比較例で得られたブロッキング剤溶液について、下記のとおり、［抗原抗体反応試験］及び［非特異吸着試験］を実施し、吸光度の差異を基準に評価した。結果を表３に示す。

［抗原抗体反応試験］
（ウェルプレートの固相抗体処理）
固相用ＣＲＰ抗体ａｂ８２７９（ａｂｃａｍ社製）が２５μｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳ溶液で調整した。この固相用ＣＲＰ抗体溶液をＰＳｔ製９６穴ウェルプレートに５０μｌずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。

（抗原吸着処理）
ＣＲＰ抗原８Ｃ７２（Ｈｙｔｅｓｔ社製）が２μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ溶液で調整した。このＣＲＰ抗原溶液を、前述の固相抗体処理した９６穴ウェルプレートに５０μｌずつ添加し、４℃１２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。

（ブロッキング処理）
得られたブロッキング剤溶液を、前述の抗原処理した９６穴ウェルプレートに５０μｌずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。

（標識抗体吸着処理）
ＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体ａｂ２４４６２（ａｂｃａｍ社製）が０．０８μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ溶液で調整した。このＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体溶液を、前述のブロッキング処理した９６穴ウェルプレートに５０μｌずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。その後各ウェルにＰＢＳ溶液２００μｌずつ添加し吸引除去し、これを３回繰り返した。

（発色反応）
住友ベークライト社製ペルオキシダーゼ用発色キットの発色剤１０ｍｌと基質液０．１ｍｌを用いて発色溶液を調整した。この発色溶液を前述の標識抗体吸着処理した９６穴ウェルプレートに１００μｌずつ添加し、室温１時間静置した。次に各ウェルに住友ベークライト社製ペルオキシダーゼ用発色キットの停止液１００μｌを添加した。

（吸光度Ａ測定）
各ウェルの４５０ｎｍの吸光度Ａを測定した。これは、抗原抗体反応（特異吸着）によりウェルに吸着した抗体量を表す吸光度である。

［非特異吸着試験］
（ウェルプレートの固相抗体処理）
固相用ＣＲＰ抗体ａｂ８２７９（ａｂｃａｍ社製）が２５μｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳ溶液で調整した。この固相用ＣＲＰ抗体溶液をＰＳｔ製ＥＬＩＳＡ用９６穴ウェルプレートに５０μｌずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。

（ブロッキング処理）
得られたブロッキング剤溶液を、前述の固相抗体処理した９６穴ウェルプレートに５０μｌずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。

（吸光度Ｂ測定）
各ウェルの４５０ｎｍの吸光度Ｂを測定した。これは、抗原がないため、標識抗体の非特異吸着によるウェルに吸着した抗体量を表す吸光度である。

［評価基準］
◎：１．０≦（吸光度Ａ−吸光度Ｂ）：良好
〇：０．８≦（吸光度Ａ−吸光度Ｂ）＜１．０：使用可能
△：０．５≦（吸光度Ａ−吸光度Ｂ）＜０．８：使用不可
×：（吸光度Ａ−吸光度Ｂ）＜０．５：不良

表３に示すように、本発明の生化学分析用ブロッキング剤を用いることで、ＣＲＰ抗原抗体反応を利用した生化学分析を行うことができた。具体的には、本発明のビニル系スターポリマー（Ａ）を使用した実施例１〜２２は、ＣＲＰ抗原抗体反応と非特異吸着反応の吸光度の差が大きく、ＣＲＰ抗原抗体反応を高感度に検出できた。すなわち、これは本発明の生化学分析用ブロッキング剤に含まれるビニル系スターポリマー（Ａ）が、ベタイン構造を有し且つ分岐構造をもつスターポリマーであるために、抗体との相互作用が適切に制御され、ＣＲＰの抗原抗体反応を阻害せず、ＣＲＰ抗原抗体反応以外の非特異的な吸着反応を抑えることができたためであると考えられる。

一方、ベタイン構造を有するビニル系スターポリマーを用いていないブロッキング剤を使用した比較例１及び２は、ＣＲＰ抗原抗体反応と非特異吸着反応の吸光度の差が小さく、分析として十分な感度を得ることができなかった。これは、ベタイン構造とビニル系スターポリマーとを共に満たさない場合は、ＣＲＰの抗原抗体反応以外の非特異的な吸着反応を抑えることができない、あるいは、ＣＲＰの抗原抗体反応自体を阻害したため、と推察される。

Claims

ベタイン構造を有する繰り返し単位を含むビニル系スターポリマー（Ａ）を含有する、生化学分析用ブロッキング剤。
前記ビニル系スターポリマー（Ａ）が、下記一般式１〜３で表される少なくともいずれかの繰り返し単位を含む、請求項１に記載の生化学分析用ブロッキング剤。
一般式１

一般式２

一般式３

（一般式１〜３中、
Ｒ_１は水素原子又はメチル基、
Ｒ_２は炭素数１〜６のアルキレン基、
Ｒ_３及びＲ_４はそれぞれ独立して炭素数１〜４のアルキル基、
Ｒ_５は炭素数１〜４のアルキレン基、
Ｘは酸素原子又はＮＨ、
ＹはＣＯＯ⁻又はＳＯ_３ ⁻、
Ｒ_６は水素原子又はメチル基、
Ｒ_７は水素原子又はメチル基、
Ｒ_８は炭素数１〜６のアルキレン基又は炭素数１〜６のヒドロキシアルキレン基、
Ｒ_９は水素原子又はメチル基、
Ｒ_１０〜Ｒ_１４のうちの１つはビニル系スターポリマーの主鎖の＊部分と直接結合し、
Ｒ_１０〜Ｒ_１４のうち４つはそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基、
Ｒ_１５は炭素数１〜６のアルキレン基又は炭素数１〜６のヒドロキシアルキレン基を表す。）
前記一般式１〜３で表される繰り返し単位の合計が、ビニル系スターポリマー（Ａ）の全構成単位中３０〜９９ｍｏｌ％である、請求項２に記載の生化学分析用ブロッキング剤。
前記ビニル系スターポリマー（Ａ）が、下記（i）又は（ii）のいずれかである請求項１〜３に記載の生化学分析用ブロッキング剤。
（i）少なくともベタイン構造を有する繰り返し単位を形成するビニル系モノマー（ａ１）を含むビニル系モノマー（ａ２）と、三官能以上のチオール基含有化合物（ｘ）と、からなる共重合体。
（ii）３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ３）を含むビニル系モノマー（ａ４）と、三官能以上のチオール基含有化合物（ｘ）と、からなる共重合体の３級アミノ基に、ベタイン化剤（Ｅ）を反応させてなる共重合体。
前記ビニル系モノマー（ａ２）又は（ａ４）が、さらに、炭素数１〜１８のアルキル基を有するビニル系モノマー（ａ５）を含む、請求項４に記載の生化学分析用ブロッキング剤。
下記一般式１〜３で表される少なくともいずれかの繰り返し単位を含む、ビニル系スターポリマー（Ａ）。
一般式１

一般式２

一般式３

（一般式１〜３中、
Ｒ_１は水素原子又はメチル基、
Ｒ_２は炭素数１〜６のアルキレン基、
Ｒ_３及びＲ_４はそれぞれ独立して炭素数１〜４のアルキル基、
Ｒ_５は炭素数１〜４のアルキレン基、
Ｘは酸素原子又はＮＨ、
ＹはＣＯＯ⁻又はＳＯ_３ ⁻、
Ｒ_６は水素原子又はメチル基、
Ｒ_７は水素原子又はメチル基、
Ｒ_８は炭素数１〜６のアルキレン基又は炭素数１〜６のヒドロキシアルキレン基、
Ｒ_９は水素原子又はメチル基、
Ｒ_１０〜Ｒ_１４のうちの１つはビニル系スターポリマーの主鎖の＊部分と直接結合し、
Ｒ_１０〜Ｒ_１４のうち４つはそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基、
Ｒ_１５は炭素数１〜６のアルキレン基又は炭素数１〜６のヒドロキシアルキレン基を表す。）