JP2019162101A - 核酸試料含有容器、核酸試料含有容器の製造方法、核酸試料含有容器の製造装置及び核酸試料含有プログラム、並びに、核酸試料 - Google Patents
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Abstract
Description
に関する。
しかし、検体中の核酸を定量する際には、検体中の血球、糖、脂肪などといったPCR反応阻害物から核酸のみを抽出する必要があり、また、目的とする核酸がRNAである場合には、cDNAへの逆転写が必要となる。このため、検体中の核酸を定量するためには核酸抽出効率や逆転写効率などの核酸分子の取り出し効率を考慮する必要が生じる。
そこで、従来、核酸取り出し効率を考慮するために、例えば、濃度が規定された標準核酸試料を内部標準として反応系に添加した上で、抽出、逆転写、リアルタイムPCRを行い初期核酸量及び各工程の効率を定量する方法が一般的に行われている。
また、遺伝子組み換え技術により特定のコピー数のDNA断片を細胞に導入し、DNA断片を導入した細胞を手技で単離することにより、目的のコピー数のDNA断片を含有する標準試薬の製造方法が提案されている(例えば、特許文献2参照)。
更に、ドロップレット又はゲルドロップレット内で、核酸の目的の塩基配列を有する領域を増幅し、核酸増幅反応が起きたドロップレット又はゲルドロップレットをソーティング(選別)する方法が提案されている(例えば、特許文献3参照)。
本発明の核酸試料含有容器は、目的の塩基配列、及び目的の塩基配列とは異なる塩基配列の検出用塩基配列を有する第一の核酸分子の所定数と、前記目的の塩基配列を有さず、前記検出用塩基配列を有する第二の核酸分子と、を含有し、溶液、さらに必要に応じてその他の材料を含有する。
上記リアルタイムPCRを用いた定量方法に用いる標準核酸試料は、従来技術に示すように、目的の塩基配列を有する核酸の希釈液に対するリアルタイムPCRの結果から、特定の分子数(コピー数)を含む希釈液を選別する場合において、100分子数(コピー数)未満の核酸の希釈を行う際にはポアソン分布の影響により希釈液に含まれる核酸の分子数(コピー数)の不確かさが大きくなるため、任意の分子数の核酸を含む標準試薬を作製することは難しいという問題がある。
また、従来の方法では、遺伝子組み換え技術を用いて目的の塩基配列を導入した細胞を使用する場合には、遺伝子組み換え、細胞培養などの煩雑な作業が要求され、短時間で標準核酸試料を作製することが難しいという問題がある。また、目的の塩基配列を有する核酸を細胞に導入し、単離した細胞を処理して標準核酸試料を作製するため、作製された標準核酸試料には細胞由来の夾雑物(タンパク質や脂質など)が混入しているため、反応系を汚染する可能性があるという問題がある。
また、従来の方法では、複数種の核酸を微小区画化により個別に増幅し、核酸増幅反応を起こした微小区画(ドロップレット又はゲルドロップレット)をソーティング(選別)する方法が記載されているが、微小区画には複数種の核酸が含まれているため、陽性検出された微小区画内に1種類の核酸分子のみの存在を保証することは困難であり、所望の分子数(所定数のコピー数、又は特定コピー数とも称する)の目的の塩基配列を有する核酸試料を得ることが難しいという問題がある。
さらに、これらの従来技術により製造される標準核酸試料は、溶液又は懸濁液の状態で存在しているため、使用者が任意の反応系に必要量の標準核酸試料を添加することが難しいという問題がある。
標的の塩基配列とは、少なくともプライマー及びプローブ領域の塩基配列が決まっているものを指し、特に、塩基配列の全長が定められているものを特定の塩基配列とも呼称する。
特定コピー数とは、前記コピー数のうち、標的の塩基配列の数が一定以上の精度で特定されていることを意味する。
すなわち、実際に容器(例えば、粒子、ウェルなどが挙げられる)に含まれている標的の塩基配列の数として既知ということができる。つまり、本願における特定コピー数は、従来の系列希釈により得られるコピー数(算出推定値)よりも、数としての精度、信頼性が高く、特に、1,000以下の低コピー数領域であってもポアソン分布によらない制御された値となる。制御された値は、概ね、不確かさを表す変動係数CVが平均コピー数xに対し、CV<1/√xもしくはCV≦20%のどちらかの値の大きさの中に収まっていることが好ましい。それゆえ、当該特定コピー数の標的の塩基配列を含む容器(例えば、粒子、ウェルなどが挙げられる)を用いることで、従来よりも正確に標的の塩基配列を有する試料の定性的、定量的な検査を行うことが可能となる。
なお、標的の塩基配列(センス鎖)と相補的な塩基配列を有する相補鎖(アンチセンス鎖)とが一体となっている二本鎖DNAのような核酸分子場合においては、単に、センス鎖の標的の塩基配列の数のみをコピー数とするのではなく、「センス鎖における標的の塩基配列」と「アンチセンス鎖における標的の塩基配列の相補鎖」の合計のコピー数が、反応系に存在する標的の塩基配列の「コピー数」と考える必要がある。
また、本発明においては、核酸の特定コピー数は、核酸の所定数又は絶対数と称することもある。
核酸の特定コピー数は、1コピー以上1,000コピー以下が好ましく、100コピー以下が好ましく、20コピー以下がより好ましく、10コピー以下がさらに好ましい。
核酸は、プリン又はピリミジンから導かれる含窒素塩基、糖、及びリン酸が規則的に結合した高分子の有機化合物を意味し、核酸の断片、あるいはこれら核酸又はその断片のアナログなども含まれる。
核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、DNA、RNA、cDNAなどが挙げられる。また、核酸としては、プラスミドも使用することができる。核酸は修飾又は変異されていてもよい。
核酸又は核酸断片のアナログとしては、核酸又は核酸断片に非核酸成分を結合させたもの、核酸又は核酸断片を蛍光色素や同位元素等の標識剤で標識したもの(例えば、蛍光標識色素や放射性同位体で標識されたプライマーやプローブ)、核酸又は核酸断片を構成するヌクレオチドの一部の化学構造を変化させた人工核酸(例えば、PNA、BNA、LNAなど)などが挙げられる。
また、核酸としては、後述する目的の塩基配列を同一分子上に複数有する場合、個々の目的の塩基配列と間に天然の核酸合成酵素(DNAポリメラーゼなど)により増幅不可能な人工核酸を少なくとも1塩基有することが好ましい。個々の目的の塩基配列と間に天然の核酸合成酵素(DNAポリメラーゼなど)により増幅不可能な人工核酸を少なくとも1塩基有することにより、1分子に複数の目的の塩基配列を有している場合においても、目的の塩基配列が1コピー毎に増幅されるため、目的の塩基配列を有する核酸の分子数が少ない場合であっても、一度に複数の増幅産物を得ることができる。
これらは、生物から得られる天然物又はそれらの加工物であってもよく、また、遺伝子組換技術を利用して製造されたもの、化学的に合成された人工合成核酸分子などでもよい。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。人工合成核酸分子とすることにより、不純物が少なくなり、低分子化することが可能となるため、初期反応効率を向上させることができる。
なお、人工合成核酸分子としては、天然に存在するDNA又はRNAと同様の構成成分(塩基、デオキシリボース、リン酸)からなる核酸を人工的に合成した核酸を意味する。人工合成核酸分子としては、例えば、タンパク質をコードする塩基配列を有する核酸に限らず、任意の塩基配列を有する核酸を含む。
第一の核酸分子は、目的の塩基配列、及び目的の塩基配列とは異なる塩基配列の検出用塩基配列を有する。
また、本発明の核酸試料含有容器は、第一の核酸分子を所定数有する。
第一の核酸分子の所定数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、100分子以下が好ましい。
第一の核酸分子の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖核酸分子(dsDNA又はdsRNA)、一本鎖核酸分子(ssDNA又はssRNA)、二本鎖核酸分子及び一本鎖核酸分子が混在した核酸分子などが挙げられる。なお、二本鎖核酸分子及び一本鎖核酸分子が混在した核酸分子とは、第一の核酸分子中に、二本鎖である部分と一本鎖である部分が混在している核酸分子を意味する。
目的の塩基配列としては、後述する検出用塩基配列と異なる塩基配列であれば特に制限はなく、適宜選択できる。以下、目的の塩基配列を検出用塩基配列とは異なる塩基配列(異配列)などと称することがある。目的の塩基配列としては、例えば、以下のものが挙げられる。
感染症検査に用いられる塩基配列、自然界には存在しない非天然の塩基配列、動物細胞由来の塩基配列、植物細胞由来の塩基配列などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
検出用塩基配列は、上述した目的の塩基配列とは異なる塩基配列であり、目的の塩基配列を有する核酸の有無を確かめるのに使用する塩基配列である。検出用塩基配列としては、本発明の実施時において少なくともプライマー領域及びプローブ領域が既知の塩基配列であればよく、かつ、検出用塩基配列が増幅する条件にある場合には前記目的の塩基配列は増幅しない、塩基配列である。
検出用塩基配列としては、目的の塩基配列と異なる塩基配列であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
検出用塩基配列としては、後述する増幅手段により増幅されるため、検出用塩基配列のGC含有率は、30%以上70%以下であることが好ましい。
検出用塩基配列の塩基長としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、20塩基対(又はmer)以上1,000塩基対(又はmer)以下が好ましい。
検出用塩基配列のコピー(単位)数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
検出用塩基配列の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖核酸(dsDNA又はdsRNA)、一本鎖核酸(ssDNA又はssRNA)、二本鎖核酸分子及び一本鎖核酸分子が混在した核酸などが挙げられる。これらの中でも、検出用塩基配列が、一本鎖核酸(ssDNA又はssRNA)であることが好ましい。検出用塩基配列が一本鎖核酸であると、後述する本発明の核酸試料含有容器の製造方法において、目的の塩基配列のコピー数を変化させることなく第一の核酸分子を検出することができるため、本発明の核酸試料含有容器に含有させる目的の塩基配列のコピー数の精度を向上させることができる。なお、検出用塩基配列が一本鎖核酸であるとは、第一の核酸分子中の検出用塩基配列が少なくとも一本鎖核酸であることを意味する。
検出用塩基配列の第一の核酸分子における位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、検出用塩基配列が一本鎖核酸分子であり、かつ検出用塩基配列が目的の塩基配列の5’末端側に存在することで、後述する本発明の核酸試料含有容器の製造方法において、第一の核酸分子における目的の塩基配列のコピー数を変化させることなく、目的の塩基配列を検出することができるため、本発明の核酸試料含有容器に含有させる目的の塩基配列のコピー数の精度を向上させることができる。また、上記構成とすることによる相乗効果によって、本発明の核酸試料含有容器に含有させる目的の塩基配列のコピー数の精度をより向上させることができる。
また、目的の塩基配列と検出用塩基配列との距離としては、十分に離れていれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、500塩基対(又はmer)以上離れていることが好ましい。ただし、検出用塩基配列が一本鎖核酸かつ目的の塩基配列の5’側に存在する場合には、この限りではない。目的の塩基配列と検出用塩基配列との距離が、十分に離れていることにより、後述する本発明の核酸試料含有容器の製造方法において、第一の核酸分子における目的の塩基配列のコピー数を変化させることなく、目的の塩基配列を検出することができるため、本発明の核酸試料含有容器に含有させる目的の塩基配列のコピー数の精度を向上させることができる。
第二の核酸分子は、上述した目的の塩基配列を有さず、検出用塩基配列を有する核酸分子である。
第二の核酸分子における検出用塩基配列は、本発明の核酸試料含有容器の製造において、第一の核酸分子における検出用塩基配列を鋳型に増幅された塩基配列である。
溶液としては、核酸に影響を与えずに分散させることができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、ヌクレアーゼフリー水、培養液、分離液、希釈液、緩衝液、有機物溶解液、有機溶剤、高分子ゲル溶液、コロイド分散液、電解質水溶液、無機塩水溶液、金属水溶液、及びこれらの混合液体などが挙げられる。これらの中でも、水、緩衝液が好ましく、水、ヌクレアーゼフリー水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、Tris−EDTA緩衝液(TE)などが好ましい。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
分散相とは、微小な大きさに区分された区画を意味する。
分散相としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液相の分散相、固相の分散相などが挙げられる。
分散相の容積は、後述する本発明の核酸試料含有容器の製造方法における分散相の調製における、連続相の流量、分散相の流量、流路の幅、流路の高さ、界面活性剤の濃度、溶液の粘性、流路の圧力損失などにより、制御することができる。分散相の容積としては、1fL以上1μL以下であることが好ましい。
粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、目的の塩基配列を有する核酸と特異的に結合可能な核酸プローブが表面に修飾された粒子や、カオトロピック物質の存在下で核酸を固層吸着させるシリカ粒子などが挙げられる。
目的の塩基配列を有する核酸と特異的に結合可能な核酸プローブとしては、スペーサー配列、例えば、1個以上10個以下の炭素原子を含む炭化水素基を介して、粒子に固定してもよい。
また、目的の塩基配列を有する核酸と特異的に結合可能な核酸プローブにメルカプト基を導入し、粒子に活性エステル基、マレイミド基又はジスルフィド基を導入してもよい。
活性エステル基としては、例えば、p−ニトロフェニル基、N−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5−ノルボルネン−2、3−ジカルボキシイミド基などが挙げられる。
シランカップリング剤としては、例えば、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、N−β−(アミノエチル)−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、N−β−(アミノエチル)−β−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランなどが挙げられる。
また、分散相の形状としては、特に制限はなく、例えば球形などが挙げられる。
連続相とは、他の液体が分散している分散系中の液体を意味する。ここでは、分散媒と同義であり、溶液を区分して分散相に区分し、区分した分散相を輸送するために用いる液体を意味する。
容器としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、開閉可能な容器や密閉容器、内容物を包含する外殻を有する粒子状の核酸試料含有容器(粒子状容器)などが挙げられる。これらの中でも、粒子状容器が好ましい。容器が粒子状容器であると、保存性及び操作性に優れ、含有する目的の塩基配列のコピー(単位)数が既知である核酸試料含有容器とすることができる。
核酸試料含有容器としては、凹部又は区画などの数が2以上である基材で連結されたマイクロチューブ、マルチウェルプレートなどを好適に用いることができる。
基材で連結されたマイクロチューブとしては、例えば、2連、3連、4連、6連、8連、12連、16連、24連、又は48連マイクロチューブが挙げられる。
マルチウェルプレートとしては、例えば、24穴、48穴、96穴、384穴、又は1,536穴のウェルプレートが挙げられる。
不溶性の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ふっ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレートなどが挙げられる。
可溶性の材質としては、例えば、アルギン酸ナトリウム、アガロースゲル、糖などが挙げられる。
基材としては、核酸試料含有容器が基材に設けられたプレート状のものが好ましいが、8連チューブ等の連結タイプのウェルチューブであってもよい。
基材としては、その材質、形状、大きさ、構造などについて特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
基材の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、半導体、セラミックス、金属、ガラス、石英ガラス、プラスチックスなどが挙げられる。これらの中でも、プラスチックスが好ましい。
プラスチックスとしては、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ふっ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレートなどが挙げられる。
基材の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、板状、プレート状などが好ましい。
基材の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、単層構造であっても複数層構造であっても構わない。
粒子状容器としては、第一の核酸分子と第二の核酸分子とを内包する外殻を有するか、第一の核酸分子と第二の核酸分子とを含有する固体状又はゲル状の粒子とすることなどが挙げられる。
第一の核酸分子と第二の核酸分子とを内包する外殻としては、例えば、カプセル状の粒子などが挙げられる。
ゲル状の粒子としては、例えば、アルギン酸ナトリウム、アガロースゲルなどを含む粒子などが挙げられる。具体的には、例えば、人工イクラなどが挙げられる。
陽性分散相とは、本発明の核酸試料含有容器の製造方法において説明する吐出機構の検出器により分散相中の標識が検出された分散相を意味し、陰性分散相(Nega)とは、吐出機構の検出器により分散相中の標識が検出されなかった分散相を意味する。なお、標識が検出されなかったとは、標識を検出すると認める閾値を超えなかったことを意味する。
ここで、「合理的に測定量に結びつけられ得る値」とは、測定量の真の値の候補を意味する。即ち、不確かさとは、測定対象の製造に係る操作、機器などに起因する測定結果のばらつきの情報を意味する。不確かさが大きいほど、測定結果として予想されるばらつきが大きくなる。
不確かさとしては、例えば、測定結果から得られる標準偏差であってもよく、真の値が所定の確率以上で含まれている値の幅として表す信頼水準の半分の値としてもよい。
不確かさを算出する方法としては、Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement(GUM:ISO/IEC Guide98−3)、及びJapan Accreditation Board Note 10 試験における測定の不確かさに関するガイドラインなどに基づき算出することができる。不確かさを算出する方法としては、例えば、測定値などの統計を用いたタイプA評価法と、校正証明書、製造者の仕様書、公表されている情報などから得られる不確かさの情報を用いたタイプB評価法の2つの方法を適用することができる。
不確かさは、操作及び測定などの要因から得られる不確かさを全て標準不確かさに変換することにより、同じ信頼水準で表現することができる。標準不確かさとは、測定値から得られた平均値のばらつきを示す。
不確かさを算出する方法の一例としては、例えば、不確かさを引き起こす要因を抽出し、それぞれの要因の不確かさ(標準偏差)を算出する。さらに、算出したそれぞれの要因の不確かさを平方和法により合成し、合成標準不確かさを算出する。合成標準不確かさの算出において、平方和法を用いるため、不確かさを引き起こす要因の中で不確かさが十分に小さい要因については無視することができる。不確かさは合成標準不確かさを期待値で除した変動係数(CV値)を用いてもよい。
情報の内容に応じて核酸試料含有容器を着色する方法を用いることにより、使用者が核酸試料含有容器の情報を視認することができ、操作性を向上させることができる。
その他の材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分散相の溶液以外の溶液、蛍光物質(蛍光標識試薬)、消光物質などが挙げられる。
分散相の溶液以外の溶液としては、例えば、プロトン性極性溶媒、非プロトン性極性溶媒、非極性溶媒などが挙げられる。
図2に示すように、核酸試料含有容器1は目的の塩基配列を有する核酸120を有する分散相110を内包している。また、図2に示すように、1つの分散相110に1分子の核酸を含むため、核酸試料含有容器1に分注する分散相110の数を制御することにより、核酸試料含有容器1が含有する目的の塩基配列を有する核酸120の数を任意の数に制御することができている。
また、本発明の核酸試料含有容器は、核酸試料が粒子に内包されているため、核酸の保存性に優れる。
さらに、本発明の核酸試料含有容器は、製造において核酸試料含有容器に含まれる目的の塩基配列を有する核酸のコピー(単位)数を厳密に制御することができるため、含有する目的の塩基配列のコピー(単位)数を把握することができる。
本発明の核酸試料含有容器の製造装置は、本発明の核酸試料含有容器の製造プログラムを読み出して実行することで、本発明の核酸試料含有容器の製造方法を実行する装置として動作する。すなわち、本発明の核酸試料含有容器の製造装置は、本発明の核酸試料含有容器の製造方法と同様の機能をコンピュータに実行させる本発明の核酸試料含有容器の製造プログラムを有する。なお、本発明の核酸試料含有容器の製造プログラムは、本発明の核酸試料含有容器の製造装置によって実行されることに限定されるものではない。例えば、本発明の核酸試料含有容器の製造プログラムは、他のコンピュータ又はサーバによって実行されてもよく、本発明の核酸試料含有容器の製造装置、他のコンピュータ、及びサーバのいずれかが協働して実行されてもよい。
つまり、本発明の核酸試料含有容器の製造装置は、本発明の核酸試料含有容器の製造方法を実施することと同義であるので、主に本発明の核酸試料含有容器の製造装置の説明を通じて本発明の製造方法の詳細についても明らかにする。また、本発明の核酸試料含有容器の製造プログラムは、ハードウェア資源としてのコンピュータ等を用いることにより、本発明の核酸試料含有容器の製造装置として実現させるため、本発明の製造装置の説明を通じて本発明の核酸試料含有容器の製造プログラムの詳細についても明らかにする。
目的の塩基配列及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成する分散相形成工程と、
前記分散相において前記検出用塩基配列を増幅する増幅工程と、
前記分散相において前記検出用塩基配列が増幅された陽性分散相と前記検出用塩基配列が増幅されなかった陰性分散相を判別する判別工程と、
前記判別工程で判別した、前記陽性分散相と前記陰性分散相を選別する選別工程と、
前記選別工程で選別した、前記陽性分散相を容器に分注する分注工程と、
を含み、更に必要に応じてその他の工程を有する。
目的の塩基配列及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成する分散相形成手段と、
前記分散相において前記検出用塩基配列を増幅する増幅手段と、
前記分散相において前記検出用塩基配列が増幅された陽性分散相と前記検出用塩基配列が増幅されなかった陰性分散相を判別する判別手段と、
前記判別手段で判別した、前記陽性分散相と前記陰性分散相を選別する選別手段と、
前記選別手段で選別した、前記陽性分散相を容器に分注する分注手段と、
を有し、更に必要に応じてその他の手段を有する。
具体的には、例えば、従来技術では、目的の塩基配列を有する核酸の希釈液に対するリアルタイムPCRの結果から、特定の分子数を含む希釈液を選別する場合には、任意の分子数の核酸を含む標準試薬を作製し、分注することが難しいという問題があった。この場合、標準試薬を作製する際に要する時間及び標準試薬を作製できる量は、リアルタイムPCRを行う装置の性能に依存するため、短時間で標準試薬を作製し、分注できないことがある。
また、例えば、従来技術では、遺伝子組み換え技術を用いて目的の塩基配列を導入した細胞を使用する場合には、遺伝子組み換え、細胞培養などの煩雑な作業が要求され、短時間で核酸を分注することが難しいという問題がある。この場合、目的の塩基配列を導入した細胞を単離する際に、細胞由来の夾雑物(タンパク質や脂質など)が、分注した容器を汚染してしまうことがある。
さらに、従来技術では、核酸の目的の塩基配列を有する部分を増幅し、核酸増幅反応が起きたドロップレット又はゲルドロップレットをソーティング(選別)する方法では、目的の塩基配列を所望のコピー数(特定コピー数)分注することは難しいことがある。
分散相形成手段は、目的の塩基配列及び目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成する。
分散相形成工程は、分散相形成手段により、目的の塩基配列及び目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成させる。
核酸含有液の分散相の形成が自動化された装置として、例えば、ドロップレットジェネレータを用いることもできる。
ドロップレットジェネレータとしては、公知のものを利用することができ、例えば、バイオ・ラッド社製のAutomated Doroplet Generator、特許第3746766号に記載のエマルション(分散相)の製造装置などが挙げられる。特許第3746766号に記載のエマルションの製造装置は、マイクロチャネル(マイクロ流路)を流れる連続相に対し、分散相を連続相の流れに交差する向きで排出し、連続相のせん断力により分散相を製造する。
また、分散相に連続的な複数のスプリッタを通過させることで、より高速に溶液を区分することも好ましい。
核酸含有液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択でき、本発明の核酸試料含有容器に用いる溶液と同様のものを使用することができるため、説明を省略する。
核酸増幅試薬としては、例えば、DNAポリメラーゼ、4種の塩基(dGTP、dCTP、dATP、dTTP)、Mg2+(2mMの塩化マグネシウム)、最適pH(pH7.5〜9.5)を保持するバッファー、dNTP、dUTP、Tris−HCl、ヌクレアーゼフリー水などが挙げられる。
核酸含有液に検出用塩基配列を増幅させるためのプライマー及び核酸増幅試薬を含有させることにより、後述する判別工程において、分散相に含まれる目的の塩基配列のコピー数を変化させることなく、分散相に目的の塩基配列が含まれていることを検出することができる。
また、インターカレータを利用する場合は、検出用塩基配列を増幅した後に、核酸含有液にインターカレータを添加する方式も利用可能である。
分散相とは、上述した核酸含有液が微小な大きさの単位に区分されたもの意味する。以下、分散相を、「微小区画」と称することがある。
1つの分散相に、目的の塩基配列を有する核酸が多くとも1分子含まれるような核酸の濃度としては、例えば、10個から100個の分散相に対して、目的の塩基配列を有する核酸が含まれる分散相が1つとなるような核酸の濃度が好ましい。
溶液を目的の塩基配列を有する核酸が含まれる分散相が1つとなるような核酸の濃度とすることで、分散相に含まれる核酸の数は0分子(核酸が含まれていない)又は1分子となることが見込まれ、後述する分注手段により分散相を分注する際に、分注する核酸の分子数をより正確に制御することができる。
核酸は、本発明の核酸試料含有容器に用いることができるものと同じものを使用することができるため、説明を省略する。
目的の塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択でき、本発明の核酸試料含有容器に用いることができるものと同じものを使用することができるため、説明を省略する。
検出用塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択でき、本発明の核酸試料含有容器に用いることができるものと同じものを使用することができるため、説明を省略する。
増幅手段は、分散相において前記検出用塩基配列を増幅する。
増幅工程では、増幅手段により、分散相の中で前記検出用塩基配列を増幅させる。
増幅手段としては、精密な温度制御ができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択でき、例えば、サーマルサイクラー、リアルタイムPCR装置、ホットプレートなどが挙げられる。
等温増幅法としては、例えば、NASBA法、LAMP法、RCA法、SMAP法、RPA法、HCR法などが挙げられる。
RCA法を用いる場合、例えば、まず、3’末端に配置した検出用塩基配列を有する核酸において、3’末端と5’末端の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブを用いて核酸を環状化し、ライゲーション反応を行うことで、環状化核酸を得る。次に、得られた環状に対する伸長反応プライマーを用いて、検出用塩基配列を有する核酸断片を増幅することが可能である。
また、3’末端に配置された検出用塩基配列と相補的な塩基配列を含む予め環状化された環状プローブを用いて核酸増幅反応を行うこともできる。この場合は、後述する光学的標識用試薬として、検出用塩基配列と特異的に結合するプローブなどの標識を用いることが好ましい。
また、増幅手段は、マイクロ流路上で分散相に含まれる検出用塩基配列を増幅させる形態でも、チューブに取り分けられた分散相に含まれる検出用塩基配列を増幅させる形態でもよい。
判別手段は、分散相において検出用塩基配列が増幅された分散相(陽性分散相)と検出用塩基配列が増幅されなかった分散相(陰性分散相)を判別する。
判別工程では、分散相において判別手段により、検出用塩基配列が増幅された分散相(陽性分散相)と検出用塩基配列が増幅されなかった分散相(陰性分散相)を判別させる。
判別手段を光学的判別手段とすることにより、判別手段は、分散相が生ずる光信号を検出して、検出用塩基配列が増幅された核酸を含む分散相を判別することができる。具体的な光学的判別手段の判別の手法としては、例えば、分散相が生ずる光信号の強度に対する閾値を設定し、検出した光信号の強度が閾値を上回った場合に、分散相に目的の塩基配列を有する核酸が含まれると判別する手法が挙げられる。
光源としては、分散相の光信号を励起できるものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、水銀ランプやハロゲンランプなどの一般的なランプに特定の波長を照射するようにフィルタをかけたものや、LED(Light Emitting Diode)、レーザーなどを用いることが可能である。ただし、特に1nL以下の微小な液滴を形成するときには、狭い領域に高い光強度を照射する必要があるため、レーザーを用いるのが好ましい。レーザー光源としては、固体レーザーやガスレーザー、半導体レーザーなど一般的に知られている多種のレーザーを用いることが可能である。
受光素子は、分散相から発せられる光信号を受光できる素子であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、液滴に特定の波長を有する光を照射して液滴内の分散相からの光信号を受光する光学センサが好ましい。受光素子としては、例えば、フォトダイオード、フォトセンサ等の1次元素子が挙げられるが、高感度な測定が必要な場合には、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオードを用いることが好ましい。受光素子として、例えば、CCD(Charge Coupled Device)、CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor)、ゲートCCD等の2次元素子を用いてもよい。
選別手段は、前記判別手段で判別した、前記陽性分散相と前記陰性分散相を選別する。
選別工程では、選別手段により、前記判別工程で判別した、前記陽性分散相と前記陰性分散相を選別させる。
選別手段を電気力学的な機構とすることにより、選別手段は、前記陽性分散相を高速に選別することができる。具体的な電気力学的な機構としては、例えば、不平等電界を形成し、誘電泳動によって狙いの分散相のみを引き寄せる手法が挙げられる。
また、前記判別手段及び判別工程において検出された光信号と同期させることにより、分散相の選別を好適に行うことができる。
分注手段は、前記選別手段で選別した、陽性分散相を容器に分注する。
分注工程では、分注手段により、選別工程で選別した、陽性分散相を容器に分注させる。
吐出機構は、選別機構が選別した目的の塩基配列を有する核酸を含む分散相を容器に分注する。
吐出機構としては、特に制限はなく、適宜選択でき、例えば、分散相を容器に輸送可能な流路、オンデマンド方式のもの、コンティニュアス方式ものなどが挙げられる。これらの中でも、分散相を容器に輸送可能な流路が好ましい。
分散相を容器に輸送可能な流路としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分散相を搬送可能なチューブなどが挙げられる。
オンデマンド方式の吐出機構としては、例えば、吐出ヘッドなどが挙げられる
インクジェット方式の吐出ヘッドとしては、圧力印加方式、サーマル方式、静電方式のものなどが挙げられる。これらの中でも、以下の理由から、圧力印加方式が好ましい。
サーマル方式は、局所的な加熱が発生するため生体材料である核酸への影響や、ヒーター部への焦げ付き(コゲーション)が懸念される。熱による影響は、分散相の含有物や分注物の用途に依存するため、一概に除外する必要はないが、圧力印加方式は、サーマル方式よりヒーター部への焦げ付きの懸念がないという点から好ましい。
検出器としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、光学的増幅検出機構(判別手段)と同様のものを用いることができる。
コンピュータとしては、記憶、演算、制御などの装置を備えた機器であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パーソナルコンピュータなどが挙げられる。
ウェルの中に充填する水性の液体としては、例えば、ヌクレアーゼフリー水、核酸増幅試薬、核酸保存試薬などが挙げられ、水性の液体をウェルの中に充填しておくことにより、すぐに核酸試料を次の反応に用いることができる。
その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、計数工程、などが挙げられる。
計数工程は、計数手段により好適に行うことができる。
計数手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択でき、例えば、標識用試薬として光学的標識(蛍光標識)を用いた場合は、光源と受光素子を有する光学的計数機構などが挙げられる。
また、吐出機構により吐出された連続相の液滴に含まれる分散相の数を計数する場合、光学的計数機構が照射する光は、飛翔中の液滴に含まれる分散相の数を計数するため、液滴が通過する領域を連続的に照射したもの、液滴の吐出に同期して液滴吐出動作に対して所定時間遅延を付けたタイミングでパルス的に照射するものなどが好ましい。
図3に示すように、目的の塩基配列A及び目的の塩基配列Aの存在を確認するための検出用塩基配列Bを有する核酸500を含む溶液Xは、分散相形成手段601の左上の流路を流れている。また、核酸増幅試薬及び蛍光標識試薬を含む溶液Yは分散相形成手段601の左下の流路を流れている。溶液Xと溶液Yとは、1本の流路で合流し、混合される。
目的の塩基配列A及び目的の塩基配列Aの存在を確認するための検出用塩基配列Bを有する核酸500を含む核酸含有液である溶液Xは、分散相形成手段601の右上の流路を流れている。また、核酸増幅試薬及び蛍光標識試薬を含む溶液Yは分散相形成手段601の左上の流路を流れている。液Xと溶液Yとは、1本の流路で合流し、混合される。
増幅手段602は、核酸500を含む分散相510に対して、PCR法を用いた核酸増幅反応を行うことで、核酸500に含まれる検出用塩基配列Bを増幅させて、分散相510を光学的に標識する。
光学的に標識された分散相512は、図6に示す判別手段603の光源により光が照射された際に、核酸500が含まれない分散相511より強い蛍光を発するため、光学的に標識された分散相512と核酸500が含まれない分散相511とを、判別することが容易になる。
判別手段603は、検出用塩基配列Bが増幅された分散相512からの蛍光を検出し、検出用塩基配列Bが増幅された核酸500を含む分散相512と核酸500が含まれない分散相511を判別する。
判別手段603は、受光素子が受光した蛍光の強度に基づいて、検出用塩基配列Bが増幅された核酸を含む分散相512と核酸500が含まれない分散相511を判別する。
選別機構604は、検出用塩基配列Bが増幅された核酸500を含む分散相512が選別機構604の周辺を通過する際に、図6上部に示す陰極604a及び陽極604bに適切な電圧を印加することにより、不平等電界を選別機構604周辺に形成する。不平等電界により分極した分散相512は、不平等電界によって誘電泳動して選別機構604側に引き寄せられて、図6右上の流路を流れていき、吐出機構へ輸送される。
選別機構604は、核酸500が含まれない分散相511が選別機構604の周辺を通過する際には、陰極604a及び陽極604bに電圧を印加しない。よって、核酸500が含まれない分散相511は、誘電泳動することなく、図6右下の流路へ流れて廃棄される。
このとき、選別機構604により選別された検出用塩基配列Bが増幅された分散相512が流れる流路は、核酸500が含まれない分散相511が流れる廃棄用の流路よりも1.2倍から1.5倍の流体抵抗を持つようにすることが好ましい。前述した流体抵抗とすることで、電界が印加されていない状態では全ての分散相が廃棄用の流路へ流れるため、検出用塩基配列Bが増幅された核酸を含む分散相512をより確実に選別することができる。
図7に示すように、吐出機構605は、判別手段603と同様の検出機構606、分散相を輸送可能な流路607を有している。なお、以下の説明では、検出用塩基配列Bが増幅された核酸を含む分散相512を、選別された分散相350と称することがある。
吐出機構10は、液室11と、メンブレン12と、駆動素子13とを有している。液室11は、液室11内を大気に開放する大気開放部115を上部に有しており、オイル300中に混入した気泡を大気開放部115から排出可能に構成されている。なお、以下では、検出用塩基配列Bが増幅された核酸を含む分散相512を、選別された分散相350と称することがある。
制御部70は、本発明の核酸試料含有容器の製造装置全体を制御する。
制御部70は、本発明の核酸試料含有容器の製造装置全体を制御する。
制御部70の分散相計数部742は、受光素子60からの情報に基づいて、液滴310に含有された選別された分散相350の個数(ゼロである場合も含む)を計数する。ここで、受光素子60からの情報とは、選別された分散相350の輝度値(光量)や面積値である。
ウェル520には、あらかじめ水性の液体515が充填されている。オイル300の比重が水性の液体515より小さい場合は、ウェル520に液滴310が着弾した直後は、図14のように、選別された分散相350を含む油層514とオイル513とが、水性の液体515の上部に位置する。
ウェル520に着弾した液滴310に含まれる選別された分散相350の水溶性成分は水性の核酸含有液に溶解する。そのため、選別された分散相350に含まれる目的の塩基配列Aを有する核酸500及び増幅された検出用塩基配列Bは、水性の液体515に溶解する。
選別された分散相350が水性の液体515に接触できなかった場合には、遠心分離を行い比重に基づく層分離を形成することで水性の液体515に、選別された分散相350を溶解させることができる。
ステップS102では、制御部70は、増幅手段602により、核酸500、核酸増幅試薬及び蛍光標識試薬を含む分散相510に対して、蛇行流路を流れている間に複数の温度帯に温度を上下させると、処理をS103に移行する。分散相510の温度を複数の温度帯に温度を上下させることで、検出用塩基配列Bを増幅させて、分散相512が光学的に標識された状態にする。
ステップS103では、制御部70は、判別手段603により、検出用塩基配列Bが増幅された陽性分散相512から生じる蛍光を検出すると、処理をS104に移行する。
ステップS104では、制御部70は、選別機構604により、判別手段603の検出結果に基づき、誘電泳動により検出用塩基配列Bが増幅された陽性分散相512を選別させると、処理をS105に移行する。ここで、検出用塩基配列Bが増幅された陽性分散相512を選別するとは、S103で検出した分散相の光信号の強度に基づいて、選別機構604により検出用塩基配列Bが増幅された陽性分散相512のみを吐出機構10に輸送することを意味する。
ステップS105では、制御部70は、吐出機構10により、検出用塩基配列Bが増幅された陽性分散相512をカプセル100に分注させると、処理をS106に移行させる。
ステップS106では、制御部70は、光源30及び受光素子60により、分注した陽性分散相512を検出し、検出した陽性分散相512の数が、ユーザーの設定した所望の数(例えば、カプセル520に分注する分散相の数)に達していない場合は、処理をS105に戻す。一方、制御部70は、計数した数が、ユーザーの設定した所望の数に達している場合は、本処理を終了する。
本発明の核酸試料は、検出用塩基配列及び該検出用塩基配列と異なる塩基配列を有する第一の核酸分子の所定数と、検出用塩基配列を有する第二の核酸分子と、を有し、更に必要に応じてその他の部材を有する。
本発明の核酸試料の形態としては、特に制限はなく、例えば、分散相などが挙げられる。分散相としては、本発明の核酸試料含有容器において説明したものと同様であるため、説明を省略する。
<核酸(dsDNA)試料含有容器(粒子状容器)の作製>
−核酸・核酸増幅試薬・蛍光標識試薬の混合液の調製−
鋳型となる核酸としてDNA600−G(国立研究開発法人産業技術総合研究所製、NMIJ CRM 6205−a、配列番号1参照)と、核酸増幅試薬として核酸に相補的なフォワードプライマー(配列番号2参照)及びリバースプライマー(配列番号3参照)、蛍光標識試薬として核酸のフォワードプライマーとリバースプライマーの間の一部に相補的な塩基配列と、蛍光色素としてFAMと、消光物質としてTAMRAを有するTaqManプローブ(配列番号4参照)、Supermix(バイオ・ラッド社製、ddPCR Supermix for Probes(no dUTP)、186−3025)、NFW((サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、UltraPure DNase/RNase−Free−Distilled Water、10977−015)を用いて、表2に示す混合比で試薬を調製し、最後にデジタルPCR用プレート(バイオ・ラッド社製、ddPCR96−Well Plates、12001925)に22μLずつ充填した。各試薬はNFWを用いて表2に記載の濃度に希釈して用いた。
ドロップレットジェネレータ(バイオ・ラッド社製、装置名Automated Droplet Generator)を用いて調製した混合液を分散相に区分した。移動相の溶媒としては、バイオ・ラッド社製のAutomated Droplet Generator Oil for Probesを用いた。作製されたドロップレット懸濁液は、プレートシーラー(バイオ・ラッド社製、商品名:PX1 Plate Sealer)を用いてアルミシーリングの後に、直ちに次の増幅工程を行った。
増幅工程は、サーマルサイクラー(バイオ・ラッド社製、装置名:T100サーマルサイクラー)により表3に示すサーマルサイクル過程によって行われた。
核酸増幅が行われた分散相(陽性分散相とも称することがある)は、ドロップレットリーダー(バイオ・ラッド社製、装置名:QX200 Droplet Reader)によって蛍光を確認すると共に、検出結果(図17、及び表4)に基づき、分散相内に含まれる各コピー数の確率を、ポアソン分布を考慮した計算処理(式1)によって算出した。算出した結果(表4におけるD02の場合)を表5に示す。
核酸増幅された分散相(陽性分散相)の選別と粒子状容器内への分注は、例えば、図6に示す選別機構604を用いて判別・選別した。陽性分散相の検出結果を図18に示す。また、陽性分散相(実線)に対して不平等電界を生じさせるために印加波形(点線)を印加した(図19)。陽性分散相512が選別される様子を図20に示す。選別した陽性分散相は、次工程の分注工程における吐出機構に導入された。
図7に示すような粒子状容器の内部に分注するための流路を設け、選別した分散相の数を検出しながら分注した。粒子状容器として用いるカプセルは、MPカプセル5号(アズワン株式会社製)を用いた。分注したカプセルには算出した分散相に1滴に含まれる目的の塩基配列のコピー数から求められる粒子状容器内の目的の塩基配列のコピー数の総数、DNAコピー数の不確かさの情報を着色により表示して視認可能な状態にした。
<核酸(dsDNA)試料含有容器の作製>
実施例1と同様の方法で、分散相を容器内に分注した。容器には、MicroAmpTM Optical 96−Well Reaction Plate with Barcode(Thermo Fisher Scientific社製)を用いた。
容器に陽性分散相を分注した後、容器を真空乾燥した。乾燥させた容器(プレート)の側面にバーコードを付した。バーコードには、容器中に分注した目的の塩基配列のコピー数の総数の算出結果(分散相1滴に含まれる目的の塩基配列のコピー数から算出)と、容器中に分注したdsDNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を計数したコピー数の不確かさの情報をバーコードにより参照可能にした。
<RNA試料含有容器の作製>
−RNA−DNAハイブリダイズ核酸溶液の調製−
鋳型となる核酸としてRNA500−A(国立研究開発法人産業技術総合研究所製、NMIJ CRM 6204−a、配列番号5参照)とssDNA(一本鎖DNA)(配列番号6参照)とを表6の組成で混合した後に、95℃で2分間熱変性し、1時間かけて常温まで冷却して十分にハイブリダイズさせ、RNA−DNA二本鎖を合成した。その後、Exonuclease I(タカラバイオ株式会社製)を5μL添加して、常温で30分間静置し、一本鎖DNAを除去した。その後、80℃、15分間不活性化処理を行い、Exonuclease Iを不活化し、RNA−DNAハイブリダイズ核酸溶液を得た。
実施例1と同様にして、得られた分散相を判別及び選別した。
実施例2と同様にして、選別された分散相を容器内に分注した。容器には、MicroAmpTM Optical 96−Well Reaction Plate with Barcode(Thermo Fisher Scientific社製)を用いた。容器(プレート)に陽性分散相を分注した後、真空乾燥により乾燥させた。乾燥させた容器(プレート)の側面にバーコードを付した。バーコードには、容器(プレート)中に分注した目的の塩基配列のコピー数の総数の算出結果(分散相1滴に含まれる目的の塩基配列のコピー数から算出)と、容器中に分注したRNAコピー数の不確かさの情報をバーコードにより参照可能にした。
<核酸(ssDNA)試料含有容器の作製>
−核酸・核酸増幅試薬・蛍光標識試薬の混合液の調製−
鋳型となる核酸としてk03_ssDNA(Integrated DNA Technologies製、配列番号10参照)と、核酸増幅試薬として核酸に相補的なフォワードプライマー(配列番号11参照)及びリバースプライマー(配列番号12参照)、蛍光標識試薬として核酸のフォワードプライマーとリバースプライマーの間の一部に相補的な塩基配列と、蛍光色素としてFAMと、消光物質としてZEN及びTAMRAを有するTaqManプローブ(配列番号13参照)とを用いた以外は、実施例1と同様にして、核酸・核酸増幅試薬・蛍光標識試薬の混合液の調製、分散相の形成、増幅工程、及び核酸増幅の確認と不確かさの算出を行った。組成を下記表10に、増幅工程におけるサーマルサイクル過程を表11に示す。結果を図22、表12、及び表13(表12におけるE11の場合)に示す。
実施例1と同様にして、得られた分散相を判別及び選別した。
実施例2と同様にして、選別された分散相を容器内に分注した。容器には、MicroAmpTM Optical 96−Well Reaction Plate with Barcode(Thermo Fisher Scientific社製)を用いた。容器(プレート)に陽性分散相を分注した後、真空乾燥により乾燥させた。乾燥させた容器(プレート)の側面にバーコードを付した。バーコードには、容器(プレート)中に分注した目的の塩基配列のコピー数の総数の算出結果(分散相1滴に含まれる目的の塩基配列のコピー数から算出)と、容器中に分注したssDNAコピー数の不確かさの情報をバーコードにより参照可能にした。
<1> 目的の塩基配列、及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する第一の核酸分子の所定数と、
前記目的の塩基配列を有さず、前記検出用塩基配列を有する第二の核酸分子と、を含有することを特徴とする核酸試料含有容器である。
<2> 前記第一の核酸分子が、前記目的の塩基配列を同一分子内に複数有する前記<1>に記載の核酸試料含有容器である。
<3> 前記第一の核酸分子中の複数の前記目的の塩基配列を有する場合、
一の目的の塩基配列と他の目的の塩基配列との間に、天然の核酸合成酵素により増幅不可能な人工核酸を少なくとも1塩基有する前記<2>に記載の核酸試料含有容器である。
<4> 前記目的の塩基配列の数が1,000未満かつ、前記目的の塩基配列の数の変動係数(CV値)が20%未満である前記<1>から<3>のいずれかに記載の核酸試料含有容器である。
<5> 前記核酸分子が人工合成核酸分子である前記<1>から<4>のいずれかに記載の核酸試料含有容器である。
<6> 前記第一の核酸分子と前記第二の核酸分子とを内包する外殻を有する前記<1>から<5>のいずれかに記載の核酸試料含有容器である。
<7> 前記第一の核酸分子と、前記第二の核酸分子とを含有する固体粒子及びゲル粒子のいずれかである前記<1>から<5>のいずれかに記載の核酸試料含有容器である。
<8> 可溶性である前記<6>から<7>のいずれかに記載の核酸試料含有容器である。
<9> 着色されている前記<1>から<8>のいずれかに記載の核酸試料含有試料である。
<10> 核酸を含有する分散相と、連続相と、前記分散相及び前記連続相を内包する保護部材とを有する核酸試料含有容器である。
<11> 前記第一の核酸分子が、一本鎖核酸分子である前記<1>から<10>のいずれかに記載の核酸試料含有容器である。
<12> 前記目的の塩基配列の5’側に前記検出用配列を有する前記<1>から<11>のいずれかに記載の核酸試料含有容器である。
<13> 目的の塩基配列及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成する分散相形成工程と、
前記分散相において前記検出用塩基配列を増幅する増幅工程と、
前記検出用塩基配列が増幅された前記分散相を判別する判別工程と、
前記判別工程で判別した、前記検出用塩基配列が増幅された前記核酸を含む前記分散相を分注する分注工程と、
を含むことを特徴とする核酸試料含有容器の製造方法である。
<14> 前記分散相が目的の塩基配列を1つ含む確率が、90%以上である前記<13>に記載の核酸試料含有容器の製造方法である。
<15> 前記判別工程は、前記分散相が生ずる光信号を検出して、前記検出用塩基配列が増幅された前記核酸を含む前記分散相を判別する前記<13>から<14>のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法である。
<16> 前記分注工程は、前記判別工程において、前記目的の塩基配列の数が特定されている前記核酸を含む前記分散相を分注する前記<13>から<15>のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法である。
<17> 前記分散相形成工程は、前記核酸が1つの前記分散相に多くとも1分子含まれるような前記核酸の濃度の核酸含有液で行う前記<13>から<16>のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法である。
<18> 前記分注工程は、インクジェット方式で行う前記<12>から<15>のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法である。
<19> 前記分注工程は、吐出された液滴に含まれる前記分散相の数を計数して行う前記<13>から<18>のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法である。
<20> 前記分注工程は、判別された前記分散相の数を分注前に計数して行う前記<13>から<19>のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法である。
<21> 目的の塩基配列及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成する分散相形成手段と、
前記分散相において前記検出用塩基配列を増幅する増幅手段と、
前記検出用塩基配列が増幅された前記分散相を判別する判別手段と、
前記判別手段で判別した、前記検出用塩基配列が増幅された前記核酸を含む前記分散相を容器に分注する分注手段と、
を有することを特徴とする核酸試料含有容器の製造装置である。
<22> 目的の塩基配列及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成させ、
前記分散相において前記検出用塩基配列を増幅させ、
前記検出用塩基配列が増幅された前記分散相を判別させ、
前記判別手段で判別した、前記検出用塩基配列が増幅された前記核酸を含む前記分散相を容器に分注させる、
制御処理をコンピュータに実行させること特徴とする核酸試料含有容器の製造プログラムを記憶した非一過性記録媒体である。
<23> 検出用塩基配列及び該検出用塩基配列と異なる塩基配列を有する第一の核酸分子の所定数と、
検出用塩基配列を有する第二の核酸分子と、を有することを特徴とする核酸試料である。
11 分散相
12、500 核酸
70 制御部
410 吐出機構
601 区分手段
602 核酸増幅機構
603 増幅検出機構
604 選別機構
605 吐出機構
Claims (20)
- 目的の塩基配列、及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する第一の核酸分子の所定数と、
前記目的の塩基配列を有さず、前記検出用塩基配列を有する第二の核酸分子と、を含有することを特徴とする核酸試料含有容器。 - 前記第一の核酸分子が、前記目的の塩基配列を同一分子内に複数有する請求項1に記載の核酸試料含有容器。
- 前記第一の核酸分子中の複数の前記目的の塩基配列を有する場合、
一の目的の塩基配列と他の目的の塩基配列との間に、天然の核酸合成酵素により増幅不可能な人工核酸を少なくとも1塩基有する請求項2に記載の核酸試料含有容器。 - 前記目的の塩基配列の数が1,000未満かつ、前記目的の塩基配列の数の変動係数(CV値)が20%未満である請求項1から3のいずれかに記載の核酸試料含有容器。
- 前記核酸分子が人工合成核酸分子である請求項1から4のいずれかに記載の核酸試料含有容器。
- 前記第一の核酸分子と、前記第二の核酸分子とを含有する固体粒子及びゲル粒子のいずれかである請求項1から5のいずれかに記載の核酸試料含有容器。
- 可溶性である請求項6に記載の核酸試料含有容器。
- 着色されている請求項1から7のいずれかに記載の核酸試料含有容器。
- 前記第一の核酸分子中の少なくとも目的の塩基配列が、一本鎖核酸である請求項1から8のいずれかに記載の核酸試料含有容器。
- 前記目的の塩基配列の5’側に前記検出用配列を有する請求項9に記載の核酸試料含有容器。
- 目的の塩基配列及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成する分散相形成工程と、
前記分散相において前記検出用塩基配列を増幅する増幅工程と、
前記分散相において前記検出用塩基配列が増幅された陽性分散相と前記検出用塩基配列が増幅されなかった陰性分散相を判別する判別工程と、
前記判別工程で判別した、前記陽性分散相と前記陰性分散相を選別する選別工程と、
前記選別工程で選別した、前記陽性分散相を容器に分注する分注工程と、
を含むことを特徴とする核酸試料含有容器の製造方法。 - 前記分散相が前記目的の塩基配列を1つ含む確率が、90%以上である請求項11に記載の核酸試料含有容器の製造方法。
- 前記判別工程は、前記分散相が生ずる光信号を検出して、前記陽性分散相と前記陰性分散相を判別する請求項11から12のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法。
- 前記分注工程は、前記判別工程において、前記目的の塩基配列の数が特定されている前記核酸を含む前記分散相を分注する請求項11から13のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法。
- 前記分散相形成工程は、前記核酸が1つの前記分散相に多くとも1分子含まれるような前記核酸の濃度の核酸含有液で行う請求項11から14のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法。
- 前記分注工程は、インクジェット方式で行う請求項11から15のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法。
- 前記分注工程は、判別された前記分散相の数を分注前に計数して行う請求項11から16のいずれかに記載の核酸試料含有容器の製造方法。
- 目的の塩基配列及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成する分散相形成手段と、
前記分散相において前記検出用塩基配列を増幅する増幅手段と、
前記分散相において前記検出用塩基配列が増幅された陽性分散相と前記検出用塩基配列が増幅されなかった陰性分散相を判別する判別手段と、
前記判別手段で判別した、前記陽性分散相と前記陰性分散相を選別する選別手段と、
前記選別手段で選別した、前記陽性分散相を容器に分注する分注手段と、
を有することを特徴とする核酸試料含有容器の製造装置。 - 目的の塩基配列及び前記目的の塩基配列とは異なる検出用塩基配列を有する核酸を含む分散相を複数形成させ、
前記分散相において前記検出用塩基配列を増幅させ、
前記検出用塩基配列が増幅された陽性分散相と前記検出用塩基配列が増幅されなかった陰性分散相を判別させ、
前記判別した、前記陽性分散相と前記陰性分散相を選別させ、
前記選別した、前記陽性分散相を容器に分注させる、
制御処理をコンピュータに実行させること特徴とする核酸試料含有容器の製造プログラム。 - 検出用塩基配列及び該検出用塩基配列と異なる塩基配列を有する第一の核酸分子の所定数と、
検出用塩基配列を有する第二の核酸分子と、を有することを特徴とする核酸試料。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008245612A (ja) * | 2007-03-30 | 2008-10-16 | Hitachi Ltd | 試料調製法および装置 |
JP2013521764A (ja) * | 2010-02-12 | 2013-06-13 | レインダンス テクノロジーズ, インコーポレイテッド | デジタル検体分析 |
JP2017532560A (ja) * | 2014-10-15 | 2017-11-02 | エコール・シュペリュール・ドゥ・フィシック・エ・シミー・アンデュストリエル・ドゥ・ラ・ヴィル・ドゥ・パリ | 液滴の内容物を分析する方法及び関連装置 |
WO2017192633A1 (en) * | 2016-05-02 | 2017-11-09 | Procure Life Sciences Inc. | Macromolecule analysis employing nucleic acid encoding |
-
2019
- 2019-03-11 JP JP2019043914A patent/JP7326778B2/ja active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008245612A (ja) * | 2007-03-30 | 2008-10-16 | Hitachi Ltd | 試料調製法および装置 |
JP2013521764A (ja) * | 2010-02-12 | 2013-06-13 | レインダンス テクノロジーズ, インコーポレイテッド | デジタル検体分析 |
JP2017532560A (ja) * | 2014-10-15 | 2017-11-02 | エコール・シュペリュール・ドゥ・フィシック・エ・シミー・アンデュストリエル・ドゥ・ラ・ヴィル・ドゥ・パリ | 液滴の内容物を分析する方法及び関連装置 |
WO2017192633A1 (en) * | 2016-05-02 | 2017-11-09 | Procure Life Sciences Inc. | Macromolecule analysis employing nucleic acid encoding |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11795446B2 (en) | 2020-03-23 | 2023-10-24 | Ricoh Company, Ltd. | Carrier and testing method |
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