JP2017532560A - 液滴の内容物を分析する方法及び関連装置 - Google Patents
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Abstract
Description
− キャリア流体(carrier fluid)に含有される複数の液滴を提供する工程であって、液滴のうち少なくとも1個が、主軸に沿って長尺物(elongated object)を画定する、粒子の少なくとも1個の凝集体を含み、少なくとも特定の液滴が、凝集体に結合できる少なくとも1個の標的要素(target element)を含有する、工程
を含む、液滴の含有物を分析するための方法に関する。
− 粒子が磁性粒子であり、有利には常磁性粒子であり、好ましくは超常磁性粒子である;
− 液滴を提供する工程が、
− 液滴を形成するための流体塊(mass of fluid)中での粒子の分散、次いで
− 液滴の形態の流体塊の分散、
− 主軸に沿って長尺物を画定する、粒子の少なくとも1個の凝集体の各液滴中での形成
を含み、粒子の凝集体が分散後に各液滴中で形成される;
− 標的要素が、タンパク質、抗体、ペプチド、DNA又はRNA断片、代謝産物、鉄イオン、脂質、及び細胞によって産生されうる生体分子によって形成される群から選択される要素である;
− 少なくとも1個の液滴が、標的要素を産生しうる産生実体(productive entity)を含み、産生実体が、好ましくは細胞又はin vitro発現系によって形成される群から選択される;
− 測定工程が、液滴内に位置する複数の点における局所的な物理的パラメータの測定を含み、液滴内部で測定された値の積分値の決定を好ましくは含む;
− 方法が、測定工程の前に、凝集体の主軸を検出軸に沿って配向させる工程を含む;
− 方法が、各測定において異なる検出軸に沿って凝集体の主軸を配向させる工程を有する、複数の測定工程を含む;
− 測定工程が、液滴の循環を伴わずに、マイクロ流体チャンバー内で実施される;
− 方法が、
− 液滴を循環させるためのアセンブリ及び検出領域を含むデバイスの提供、
− 検出領域に向けた液滴の輸送
を含み、液滴内部の測定が検出領域において実行される;
− 方法が、
− 液滴を循環させるためのアセンブリ及び複数の分類領域を含むデバイス、並びに液滴又は液滴の一部分を分類領域に向けて選択的に誘導するための手段の提供、
− 液滴又は液滴の一部分に対する分類決定であって、複数の分類領域から1つの分類領域を選択的に選び出すことからなる決定、
− 決定工程中に選択された液滴の分類領域に向けた、液滴、特に液滴の一部分の輸送
を含む;
− 少なくとも1個の液滴が、少なくとも1個の標的要素、標的要素との複合体を形成することができる少なくとも1個の第1のシグナリング実体(signaling entity)、及び標的要素との複合体を形成することができる少なくとも1個の別個の第2のシグナリング実体を含み、方法が、凝集体上に再局在化したシグナリング実体のそれぞれの濃度を示す信号の測定を含む;
− 少なくとも1個の液滴が、少なくとも1個の標的要素、標的要素との複合体を形成することができる少なくとも1個のシグナリング実体が、及び標的要素との複合体を形成することができる少なくとも1個の定量化実体(quantification entity)を含み、方法が、
− 凝集体上に再局在化したシグナリング実体の濃度を表す信号の測定、
− 凝集体上に再局在化した定量化実体の濃度を表す信号の測定、
− 再局在化したシグナリング実体の信号の、再局在化した定量化実体の信号に対する比率からの、標的要素とシグナリング実体との解離定数の決定
を含む;
− 少なくとも特定の液滴が産生実体を含み、産生実体が、標的要素となる少なくとも1個の抗体を産生しうる細胞であり、方法が、少なくとも1種の抗原に対する産生実体により産生される抗体の親和度を決定する工程を含み、好ましくは、決定工程後に液滴を選別する工程を含む;
− 少なくとも1個の液滴が少なくとも2個の別個のシグナリング実体を含み、2個のシグナリング実体のそれぞれが、凝集体上で別個の標的要素との複合体を形成することができ、方法が、再局在化したシグナリング実体のそれぞれの濃度を示す信号の測定を含む;
− 少なくとも特定の液滴が産生実体を含み、産生実体が、1種又は複数の種類のタンパク質を産生しうる細胞であり、各タンパク質が別個の標的要素であり、再局在化したシグナリング実体のそれぞれの濃度を示す信号の測定が、前記種類のタンパク質の定量化を可能にする;
− 物理的パラメータの測定が蛍光測定である;
− 液滴のうち少なくとも1個が、標的要素を分泌できる細胞を含み、方法が、標的要素が細胞によって液滴中に分泌されるインキュベーション工程を含む;
− 液滴のうち少なくとも1個が細胞を含み、方法が細胞溶解のための工程を含む;
− 液滴のうち少なくとも1個が、標的要素を発現できるin vitro翻訳系を含む;
− 方法が、液滴のうち少なくとも1個における凝集体から離れて位置する第1の点において局所的に、物理的パラメータを測定し、同じ液滴内の凝集体の近傍にある第2の点において局所的に、同じ物理的パラメータを測定する工程を含む;
− 粒子の最大寸法が、液滴の直径の50%未満である;
− 液滴が、少なくとも1個のシグナリング実体を含有し、物理的パラメータの測定が、液滴内での、又は凝集体に対するシグナリング実体の位置に依存する;
− 産生実体が、タンパク質、ペプチド、DNA又はRNA断片、代謝産物、イオン、脂質及び細胞によって産生されうる生体分子により形成される群から選択される複数の標的要素を産生する;
− 方法が、産生実体の少なくとも1個の特性を決定する工程を含む;
− 分類を決定する工程が、測定工程の後に行われる;
− 液滴が超常磁性粒子を含有し、液滴又は液滴の一部分が、磁力、電界、誘電泳動、電気合体(electrocoalescence)、又は表面弾性波の中から選択された誘導手段により、分類領域に向けて誘導される;
− 液滴の一部分が磁力によって抽出され、抽出部分が、副液滴を形成し、凝集体を含有する。
− キャリア流体に含有される複数の液滴を提供するためのアセンブリであって、液滴のうち少なくとも一個が、主軸に沿って長尺物を画定する、粒子の少なくとも1個の凝集体を含むアセンブリ
を備える、液滴の内容物を分析するための装置において、凝集体上への標的要素の付着に特有の物理的パラメータを測定するためのアセンブリを備え、好ましくは、
− 液滴を循環させるためのアセンブリ、
− 液滴の分類を決定するためのアセンブリ、
− 分類決定に従って液滴を選別するためのアセンブリ
を更に備えることを特徴とする装置である。
− 捕捉要素36が、標的要素の少なくとも90%超、有利には全体を凝集体上に捕捉するのに十分な量存在し、標的要素37に対する十分な親和性を有し;
− シグナリング実体34の濃度が標的要素37の濃度よりも大きく、シグナリング実体34と標的要素37との間の解離定数Kdが標的要素37の濃度よりも小さく、有利には10倍超である、という条件に当てはまる場合である。これは、典型的には、サブナノモルのKdを有するモノクローナル抗体のような最適な用量の試薬が使用されるケース、及び実施例5に示されるように、1ナノモル濃度超の標的要素37の濃度を検出することが意図されるケースである。
Kd=[Afree][Bfree]/[A:B]
式中、
[Afree]は、溶液中でBに結合していないAの濃度であり、
[Bfree]は、溶液中でAに結合していないBの濃度であり、
[A:B]は、溶液中の複合体A:Bの濃度であり、AはBに結合している。
種Aの全濃度は、
[Atotal]=[Afree] + [A:B]
である。
種Bの全濃度は、
[Btotal]=[Bfree] + [A:B]
である。
− 捕捉要素36が、標的要素37の90%超、凝集体10上のA、有利には全体を捕捉するのに十分な量存在し、標的要素37に対する十分な親和性を有し、
− シグナリング実体34の濃度が標的要素37の濃度よりも大きく、
− Aを定量化するために使用される定量化実体の濃度が標的要素37の濃度よりも大きく、定量化実体と標的要素37との間の解離定数が標的要素37の濃度よりも小さく、有利には10倍超である、
という条件に当てはまる場合である。
− 粒子12、シグナリング実体34及び標的要素又は有利には液滴中で標的要素を生成しうる系を含有する、複数の水溶液の調製、液滴生成チップの入口での水溶液の注入、
− 試験の全試薬を含む液滴の生成、
− 液滴を含有する溶液のインキュベーション、
− 本発明によるデバイス(2種類のデバイスが以下の実施例1及び2に記載されている)への液滴の注入、
− 試験の結果の測定、
− 任意に測定値に応じた液滴の選別
を含む。
タイプ1の液滴生成及び液滴測定用デバイス
区画化とも呼ばれる、液滴の生成は、試薬溶液及び試料溶液をチップ上で混合した後に行う。
タイプ2の液滴測定用デバイス
第2タイプの測定デバイスは、二次元平面内で生成された液滴を貯蔵するためのチャンバーである。この例には、そのようなチャンバーを作製するための2つの可能な選択肢がある。
以下の実施例では、液滴の調製は、
− 以下の実施例において、粒子12、シグナリング実体34を含有する「試薬溶液」、及び標的要素を含有する「スクリーニング対象試料溶液」と称される、2種の水溶液を調製すること、
− 液滴を生成するためにチップ入口に両方の水溶液を注入すること、
− 両方の溶液のそれぞれの等容積を含む液滴を生成すること、
− タイプ1のデバイス内で液滴を測定すること、
− 任意に液滴を選別すること(実施例4)
を含む。
この溶液に含まれる要素は、液滴生成前における試薬の凝集を避けるために、有利には互いに不活性である。
− ここでは捕捉要素36、ここではプロテインGにより官能化されたコロイド状磁性粒子である粒子12、及び
− ここでは蛍光で標識された抗原、例えばフルオロフォアAlexafluor488で標識された抗原であるシグナリング実体34、
− 液滴6の検出を可能性にする着色剤、例えばスルホローダミンB、
− ここでは蛍光性である抗体、例えばフルオロフォアAlexafluor647で標識された抗マウスモノクローナル抗体の断片を定量化するための実体、
− 希釈標準溶液
を含有する。
− Percoll(Sigma Aldrich社により提供)30v/v%、
− NaCl 50mM、
− pH7.4のHEPES緩衝液25mM、
− Life Technologies社により提供されるPluronic F−68 0.1v/v%、
− Thermo Scientific社製Super Low IgG血清5v/v%
を含む。
スクリーニング対象試料溶液は、
− 捕捉要素36によって捕捉可能な標的要素37、
− 又はインキュベーション段階において液滴中でこの標的要素37を合成できる産生実体90(この系は、例えば、細胞、又はDNA若しくはin vitro発現系であってもよい。この場合、標的要素37は、スクリーニング対象試料溶液中に予め存在してはいない。)
− 希釈標準溶液
を含む。
抗原に対するモノクローナル抗体の親和度の定量化及び測定。
この実施例では、標的要素37は、スクリーニング対象溶液に既に含有されている抗体であり、この実施例は細胞には当てはまらない。
− 磁性粒子8.33v/v%(Ademtech社#0433)、
− Fab−DL650抗マウスFab’2(定量化実体)200nM、
− hTNFα−AF488(シグナリング実体)100nM、
− スルホローダミンB(液滴標識用)1μm
を含有する。
ハイブリドーマが分泌する抗体の親和度に従った、単一細胞の尺度におけるハイブリドーマの選別。
この実験の目的は、実施例3と同様の試薬及びアプローチを使用することにより、分泌されるモノクローナル抗体の結合親和度に従う抗体産生細胞のスクリーニングを実証することである。特に、2種類のハイブリドーマ:抗TNFアルファ(25H12株)抗体を分泌するハイブリドーマと抗c−Myc抗体(9E10株)とを区別し選別することが可能であることがわかっている。
− 磁性粒子(Ademtech社#0433)8.33v/v%、
− 抗体−DL650抗マウスFab’2断片(定量化実体)100nM、
− hTNFα−AF488(シグナリング実体)100nM、
− スルホローダミンB 2μm
を含有する。
単一細胞の尺度において分泌されたサイトカインの定量化。
この実施例の目的は、サンドイッチ免疫学的試験の包括的アプローチを用いて、単一細胞の尺度において分泌されたサイトカインを検出及び定量する可能性を実証することである。この実施例では、捕捉要素36はストレプトアビジンに結合したビオチン化抗体であり、シグナリング実体34は蛍光検出抗体である。
− ビオチン化捕捉抗体(Mabtech社7−B6−1)200nM
− フィコエリトリン(PE)(Miltenyi社45−15)で標識した検出抗体(シグナリング実体)200nM
− 希釈標準溶液:Percoll(Sigma社)30%/Pluronic F−68(LifeTech社)1%/PBS(Sigma社)69%。
− 組換えIFNγ1B(Miltenyi社)0又は20又は200nM
− 磁性ビーズscreenMAG/Rストレプトアビジン0.5μm(Chemicell社)(エマルション120μlで20μl)。
一次細胞が分泌する抗体の結合活性に従った、単一細胞の尺度における、一次細胞、より具体的にはBリンパ球(形質細胞)の選別。
この実験の目的は、実施例3と同様の試薬及びアプローチを使用することにより、分泌されるモノクローナル抗体の結合活性に従う、抗体を産生する一次細胞のスクリーニングを実証することである。特に、Bリンパ球が分泌するモノクローナル抗体の結合活性に従って、Bリンパ球を区別し選別することが可能であることを示す。
− Super Low IgG血清(#SH30898.03、Thermo Scientific社)5v/v%、
− pH7.4のHEPES緩衝液25mM、
− Life Technologies社により提供されるPluronic F−68 0.1v/v%、
− 抗生物質−抗真菌剤(#15240、ThermoFisher社)1v/v%
を含む。
− ストレプトアビジン磁性粒子(Ademtech社#0433)33.33v/v%、
− ウサギFab’2抗FCマウス(anti−FCmouse)AF647、JacksonIR社#315−606−146(定量化実体)200nM、
− TTビオチン(捕捉要素36)100nM、
− スルホローダミンB(Sigma Aldrich社#S1402)0.8又は1.6又は2.4μM
を含有する。
モノクローナル抗体の定量化及び2Dチャンバーにおけるその抗原との結合の検出。
この実施例では、標的要素37は、スクリーニング対象溶液に既に含有されている抗体であり、この実施例は細胞には当てはまらない。
− Super Low IgG血清(#SH30898.03、Thermo Scientific社)5v/v%、
− pH7.4のHEPES緩衝液25mM、
− Life Technologies社により提供されるPluronic F−68 0.1v/v%、
を含む。
− 捕捉実体の飽和度により予め標識された、ストレプトアビジン磁性粒子(Ademtech社#0433)33.33v/v%、
− ウサギFab’2抗FCマウスAF647、JacksonIR社#315−606−146(定量化実体)150nM、
− TT−AF488(捕捉実体)50nM、
− スルホローダミンB(Sigma Aldrich社#S1402)0.8又は1.6又は2.4μM
を含有する。
2Dチャンバーにおける抗原に対するモノクローナル抗体の親和度の測定。
この実施例は、抗原の親和度範囲を表す複数の別個の標的要素37が測定されることを除き、すべての点において実施例7と同様である。
2Dチャンバー内での一次細胞によるモノクローナル抗体の分泌の動態的及び定量的測定。
この実施例は、標的要素37が一次細胞によって分泌されるモノクローナル抗体であること及びこの分泌が動態的に測定されることを除き、すべての点において実施例8と同様である。
液滴内の磁性ビーズの凝集体の数、形状及び安定性。
この実施例において、標的要素37は、ビオチン化蛍光分子、例えばシグナリング実体の役割をも有しスクリーニング対象溶液に既に含有されている、AF546−ビオチン(ThermoFisher社#S11225)である。この実施例は細胞には一切当てはまらない。
− Super Low IgG血清(#SH30898.03、Thermo Scientific社)50v/v%、
− pH7.4のHEPES緩衝液25mM、
− Life Technologies社より提供されるPluronic F−68 0.1v/v%、
− 抗生物質−抗真菌剤(#15240、ThermoFisher社)1v/v%
を含む。
− 最終濃度100nMのAF546−ビオチン(シグナリング実体)、
− 標準量の1倍、2倍又は3倍の33.33v/v%の磁性粒子ストレプトアビジン(Ademtech社#0433)、
− Dy−649(Dyomics社)50、100、200、400、800又は1,600nM、
− 0対1、5若しくは1.25対1、又は100対1の可変比のビオチンBSAと磁性ビーズ、即ち0、0.5、2.5、5又は15nMの濃度のビオチンBSA
を含有する。
4 供給アセンブリ
6 液滴
8 キャリア流体
10 凝集物
10 凝集体
12 粒子
14 測定アセンブリ
16 測定点
18 測定点
20 デバイス
22 循環アセンブリ
24 循環導管
24 導管
26 検出領域
28 装填アセンブリ
30 凝集アセンブリ
31 離隔アセンブリ
32 初期液滴
34 シグナリング実体
34a シグナリング実体
34b シグナリング実体
36 捕捉要素
36a 捕捉要素
36b 捕捉要素
37 標的要素
37a 標的要素
37b 標的要素
38 永久磁石
40 蛍光強度
41 蛍光強度
42 液滴
44 プラトー
48 液滴
50 ピーク
52 プラトー
56 液滴
58 ピーク
59 プラトー
60 装置
60 デバイス
62 チャンバー
64 循環路
66 分離パッド
70 装置
72 分類アセンブリ
74 内相入口領域
76 キャリア流体入口領域
78 連結領域
79 インキュベーション領域
80 入口導管
82 入口導管
84 合流導管
86 流体塊
88 流体
88 流体塊
90 細胞
90 産生実体
92 キャリア流体入口導管
94 分類領域
96 分類領域
98 誘導手段
100 フォーク
102 出口導管
104 出口導管
106 第1の液滴群
108 第2の液滴群
120 装置
122 抽出アセンブリ
124 主液滴
126 副液滴
Claims (17)
- 以下の工程:
− キャリア流体(8)に含有される複数の液滴(6)を提供する工程であって、液滴(6)のうち少なくとも1個が、主軸(X)に沿って長尺物を画定する、粒子(12)の少なくとも1個の凝集体(10)を含み、少なくとも特定の液滴(6)が、凝集体(10)に結合できる少なくとも1個の標的要素(37)を含有する、工程を含む、液滴の内容物を分析するための方法において、
凝集体(10)上への標的要素(37)の付着に特有の物理的パラメータを測定する測定工程を含むことを特徴とする方法。 - 粒子(12)が超常磁性粒子である、請求項1に記載の方法。
- 液滴(6)を提供する工程が、
− 液滴(6)を形成するための流体塊(86)中での粒子(12)の分散、次いで
− 液滴(32)の形態の流体塊(86)の分散、
− 主軸に沿って長尺物を画定する、粒子の少なくとも1個の凝集体の各液滴中での形成
を含み、粒子(12)の凝集体(10)が分散後に各液滴(6)中で形成される、請求項1又は2に記載の方法。 - 標的要素(37)が、タンパク質、抗体、ペプチド、DNA又はRNA断片、代謝産物、イオン、脂質、及び細胞によって産生されうる生体分子により形成される群から選択される要素である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも特定の液滴(6)が、標的要素(37)を産生しうる産生実体(90)を含み、産生実体(90)が、好ましくは細胞及びin vitro発現系によって形成される群から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 測定工程が、液滴(6)中に位置する複数の点における局所的な物理的パラメータの測定を含み、好ましくは液滴(6)内部で測定された値の積分値の決定を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 測定工程の前に、凝集体の主軸(X)を検出軸(D)に沿って配向させる工程を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 各測定において異なる検出軸に沿って凝集体の主軸(X)を配向させるための工程を有する、複数の測定工程を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 測定工程が、液滴の循環を伴わずに、マイクロ流体チャンバー内で実施される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- − 液滴を循環させるためのアセンブリ(22)及び検出領域(26)を含むデバイスの提供、
− 検出領域(26)に向けた液滴の輸送
を含み、液滴(6)内部の測定が検出領域(26)において実行される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。 - − 液滴を循環させるためのアセンブリ(22)及び複数の分類領域(94、96)を含むデバイス、並びに液滴又は液滴の一部分を分類領域(94、96)に向けて選択的に誘導するための手段(98)の提供、
− 液滴(6)又は液滴の一部分の分類に関する決定であって、複数の分類領域(94、96)の中から1つの分類領域を選択的に選び出すことからなる決定、
− 決定工程中に選択された液滴(6)の分類領域に向けた、液滴(6)、液滴の一部分のそれぞれの輸送
を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。 - 少なくとも1個の液滴が、少なくとも1個の標的要素(37)、標的要素(37)との複合体を形成することができる少なくとも1個の第1のシグナリング実体(34)、及び標的要素(37)との複合体を形成することができる少なくとも1個の別個の第2のシグナリング実体(34)を含み、方法が、凝集体(10)上に再局在化したシグナリング実体(34)のそれぞれの濃度を示す信号の測定を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1個の液滴が少なくとも1個の標的要素(37)、標的要素(37)との複合体を形成することができる少なくとも1個のシグナリング実体(34)、及び標的要素(37)との複合体を形成することができる少なくとも1個の定量化実体を含み、方法が、
− 凝集体(10)上に再局在化したシグナリング実体(34)の濃度を表す信号の測定、
− 凝集体(10)上に再局在化した定量化実体の濃度を表す信号の測定、
− 再局在化したシグナリング実体(34)の信号の、再局在化した定量化実体の信号に対する比率からの、標的要素(37)とシグナリング実体(34)との解離定数の決定
を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。 - 少なくとも特定の液滴(6)が産生実体(90)を含み、産生実体(90)が、標的要素(37)となる少なくとも1個の抗体を産生しうる細胞であり、方法が、少なくとも1種の抗原に対する産生実体(90)により産生される抗体の親和度を決定する工程を含み、好ましくは、決定工程後に液滴を選別する工程を含む、請求項13に記載の方法。
- 少なくとも1個の液滴が少なくとも2個の別個のシグナリング実体(34)を含み、両方のシグナリング実体(34)のそれぞれが、凝集体(10)上で別個の標的要素(37)との複合体を形成することができ、方法が、再局在化したシグナリング実体(34)のそれぞれの濃度を示す信号の測定を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも特定の液滴(6)が産生実体(90)を含み、産生実体(90)が、1種又は複数の種類のタンパク質を産生しうる細胞であり、各タンパク質が別個の標的要素(37)であり、再局在化したシグナリング実体(34)のそれぞれの濃度を示す信号の測定が、前記種類のタンパク質の定量化を可能にする、請求項15に記載の方法。
- − キャリア流体(8)に含有される複数の液滴(6)を提供するためのアセンブリであって、液滴(6)のうち少なくとも1個が、主軸(X)に沿って長尺物を画定する、粒子(12)の少なくとも1個の凝集体(10)を含む、アセンブリ
を備える、液滴の含有物を分析するための装置において、
凝集体(10)上への標的要素(37)の結合に特有の物理的パラメータを測定するためのアセンブリを備え、
好ましくは、
− 液滴を循環させるためのアセンブリ(22)、
− 液滴の分類を決定するためのアセンブリ、
− 分類決定に従って液滴を選別するためのアセンブリ
を更に備えることを特徴とする装置。
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