JP7315581B2 - 単一細胞の分析のためのマイクロ流体方法 - Google Patents
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Description
a.前記マイクロ流体システムにおいて少なくとも1つの液滴を作製するステップであって、前記少なくとも1つの液滴は以下を含む:
i.少なくとも1つの単一細胞、
ii.1または複数の第1の捕捉試薬、ここで前記1または複数の第1の捕捉試薬は、前記単一細胞および前記目的化合物に結合することが可能である、
iii.標識を含んでいる1または複数の第2の捕捉試薬、ここで前記1または複数の第2の捕捉試薬は、前記目的化合物に結合することが可能である、
b.検出可能なイベントを生じさせることが可能な前記少なくとも1つの液滴をインキュベートするステップ、
c.前記少なくとも1つの液滴を直接検出に供するステップ、
ここで、前記少なくとも1つの液滴内での前記検出可能なイベントの存在または再局在化は、前記目的化合物の存在を決定する。
a.以下を備えるマイクロ流体システムを提供するステップ:
i.少なくとも1つの入口、
ii.少なくとも1つの出口、
iii.1または複数のチャネル、
b.前記マイクロ流体システム内に液滴の流れを注入するステップ、ここで少なくとも1つの液滴は以下を含む:
i.少なくとも1つの単一細胞
ii.前記単一細胞および前記目的化合物に結合することが可能な複数の第1の捕捉試薬、および
iii.それぞれが標識を含んでいる複数の第2の捕捉試薬、ここで前記複数の第2の捕捉試薬は前記目的化合物に結合することが可能である、
c.目的化合物の生産を可能にする条件下で複数の液滴をインキュベートするステップ、それにより、目的化合物が単一細胞によって生産される場合は、前記複数の第1の捕捉試薬および第2の捕捉試薬によって捕捉される、
d.前記標識の存在または再局在化を検出するステップを用いて、目的化合物の存在を判定するステップ。
a.少なくとも1つの入口、
b.少なくとも1つの出口、
c.1または複数のチャネル、
d.以下を含んでいる少なくとも1つの液滴を作製するための、モジュール:
i.1または複数の単一細胞、
ii.第1の捕捉試薬、
iii.第2の捕捉試薬。
e.目的化合物を産生している細胞を含む液滴を検出する検出モジュール
f.シグナルの分析のために構成された分析モジュール。
a.前記マイクロ流体システムにおいて少なくとも1つの液滴を作製するステップであって、前記少なくとも1つの液滴は以下を含む:
i.少なくとも1つの単一細胞、
ii.1または複数の第1の捕捉試薬、ここで前記1または複数の第1の捕捉試薬は、前記単一細胞および前記目的化合物に結合することが可能である、
iii.標識を含んでいる1または複数の第2の捕捉試薬、ここで前記1または複数の第2の捕捉試薬は、前記目的化合物に結合することが可能である、
b.検出可能なイベントを生じさせることが可能な前記少なくとも1つの液滴をインキュベートするステップ、
c.前記少なくとも1つの液滴を直接検出に供するステップ、
ここで、前記少なくとも1つの液滴内での前記検出可能なイベントの存在または再局在化は、前記目的化合物の存在を決定する。
a.以下を備えるマイクロ流体システムを提供するステップ:
i.少なくとも1つの入口、
ii.少なくとも1つの出口、
iii.1または複数のチャネル、
b.前記マイクロ流体システム内に液滴の流れを注入するステップ、ここで少なくとも1つの液滴は以下を含む:
i.少なくとも1つの単一細胞
ii.前記単一細胞および前記目的化合物に結合することが可能な複数の第1の捕捉試薬、および
iii.それぞれが標識を含んでいる複数の第2の捕捉試薬、ここで前記複数の第2の捕捉試薬は前記目的化合物に結合することが可能である、
c.目的化合物の生産を可能にする条件下で複数の液滴をインキュベートするステップ、それにより、目的化合物が単一細胞によって生産される場合は、前記複数の第1の捕捉試薬および第2の捕捉試薬によって捕捉される、
d.前記標識の存在または再局在化を検出するステップを用いて、目的化合物の存在を判定するステップ.
a.少なくとも1つの入口、
b.少なくとも1つの出口、
c.1または複数のチャネル、
d.以下を含んでいる少なくとも1つの液滴を作製するためのモジュール:
i.1または複数の単一細胞、
ii.第1の捕捉試薬、
iii.第2の捕捉試薬、
e.目的化合物を産生している細胞を含む液滴を検出する検出モジュール。
f.シグナルの分析のために構成された分析モジュール。
健康ドナーのヒトPBMCを、「キャッチ試薬」と呼ばれる過剰の二官能性抗体を用いて、マイクロチューブ内で事前標識する。キャッチ試薬は、白血球特異的な膜タンパク質(CD45)および目的サイトカインの両方に特異的である。サイトカイン分泌を妨げる条件下(すなわち4℃)で5分インキュベーションした後に、全ての白血球をキャッチ試薬で均等に標識化して、広範囲の洗浄によって過剰分を洗い流す。事前標識された細胞を、サイトカイン分泌を妨げる条件下で、1%v/vの最終濃度の蛍光標識抗-サイトカイン抗体とともに、ピコリットルの液滴内に単一細胞として封入する(図1)。単一細胞を含む液滴を、5%CO2制御インキュベーター内で37℃にて1h20インキュベートして、サイトカイン分泌を可能にさせる。液滴を再注入して、細胞上の検出試薬の蛍光シグナルの再局在化によって検出される(traduced)サイトカインの分泌を、各液滴について分析する。サイトカイン分泌細胞を含む液滴では、検出試薬シグナルは細胞上に再局在化して、液滴において蛍光の局所的な増大をもたらす。それとは対照的に、非分泌細胞を含む液滴では、検出試薬の蛍光シグナルは液滴内に均一に留まり、蛍光の局所的な増大は観察されない。
非活性化および非分泌CD8+ T細胞を、液滴分泌アッセイ手順に従って、様々な濃度の精製IFNγとともに液滴内に封入した。4つのエマルションが生産されて、単一細胞として単離された細胞および異なる濃度の精製サイトカイン:0nM、1nM、5nMまたは10nM最終濃度のIFNγ(図3)を液滴中にそれぞれ含んでいた。4つのエマルション全ての液滴を再注入して、蛍光シグナルを分析した。液滴分泌アッセイを用いて、1nMという少なさのサイトカイン濃度が偽陽性イベントなしに検出されて、高い感度および100%特異的なアッセイを示した。分泌アッセイはまた、80%よりも多い陽性細胞が液滴において検出されるように、効率的であることも示した。
共に培養されると、特異的なペプチドがローディングされた抗原提示細胞(APC)は、応答性T細胞のサブセットを特異的に活性化することができ、サイトカイン分泌をもたらす。液滴分泌アッセイを、液滴におけるAPCによるT細胞の特異的な活性化の検出に適用した(図4)。APCおよびT細胞を、サイトカイン分泌を妨げる条件下で液滴内に単一細胞として共に流した(co-flowed)。5%CO2制御インキュベーター内で液滴を37℃で一晩インキュベートして、後日、再注入した。T細胞およびAPCの両方の生存能力を、NucRed(登録商標)(インターカレート色素)を用いて、液滴内で一晩インキュベーションした後に測定した。そのような死滅細胞蛍光マーカーを用いて、封入された細胞の94%が生存可能として検出された。APCによるT細胞の特異的な活性化を、IFNγ分泌に適用された液滴分泌アッセイを用いて検出した。生存可能なT細胞およびAPCを含む液滴において、1.2%がIFNγを分泌し、液滴におけるT細胞の効果的な抗原-特異的活性化が示された。
捕捉試薬によって事前標識されたB細胞を検出試薬と一緒に液滴内に共封入することによって、示された液滴内分泌アッセイを用いて抗体分泌を評価することができる。捕捉試薬の第1の部分は、B細胞表面マーカーを認識することが可能であり、Pan-Bマーカーまたは特異的なB細胞マーカーであってよく、典型的な例は、免疫グロブリン分泌形質細胞に関するCD138マーカーである。捕捉試薬の第2の部分は、抗体を特異的に捕捉し、または目的抗原からなる。1つめの場合では、捕捉試薬は抗体を捕捉する部分からなり、検出試薬は検出可能な標識化抗原からなる。2つめの場合では、捕捉試薬は目的抗原からなり、検出試薬は検出可能な標識化抗-二次抗体からなる。B細胞上の蛍光シグナルの再局在化は(標識はここでは蛍光であるが、当業者にとって任意の手段によって検出され得る)、調べている液滴内に存在するB細胞による抗原特異的抗体の分泌を示す。ここに説明される方法は、捕捉試薬の事前インキュベーションを伴って、または伴わずに、適用することができる(図5A~E)。ここに説明される方法は、以前に言及された任意の目的化合物に適用することができる。
所定のT細胞受容体への特異的な抗体の結合は、T細胞を活性化することができ、例えば、サイトカイン分泌をもたらす。液滴分泌アッセイは、液滴において、免疫グロブリン発現細胞によって分泌されたT細胞受容体特異的抗体によるT細胞活性化を検出することができる(図6)。典型的な例は、捕捉試薬で事前標識されて、免疫グロブリン発現細胞と一緒に液滴内に封入されたPBMCを含む。液滴は、標識された検出試薬を含みながら(標識はここでは蛍光であるが、任意の手段によるものであってよい)、抗体産生を妨げる条件下で生産される。抗体産生を可能にする条件下で液滴をインキュベートした後に、例えば、サイトカイン分泌の検出を通してT細胞活性化が検出される。T細胞受容体特異的抗体の結合は、続いてT細胞を活性化して、その結果、例えばサイトカインを分泌する。分泌されたサイトカインは、T細胞に結合した捕捉試薬上に再局在化し、蛍光検出試薬は目的サイトカイン上に再局在化する。分泌された抗体によって活性化されたT細胞を含む液滴は、その結果、活性化T細胞上の検出試薬の再局在化に起因して検出可能なシグナルを示す。ここに説明される方法は、捕捉試薬の事前インキュベーションを伴って、または伴わずに、適用することができる。上述の方法の典型的な例は、T細胞活性化をトリガーする抗-CD3抗体の検出である。拡張することによって、このシステムは、抗-チェックポイント抗体の同定に用いることができる。
液滴内分泌アッセイを用いて、ADCC活性を有する抗原特異的抗体が分泌される場合における、誘導される死を評価することができる(図7)。ここに示される二重陽性アッセイは、死滅化細胞(例として、一次ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球および樹状細胞、ならびに細胞培養細胞株が含まれる)による細胞傷害性因子の分泌、および、死滅化細胞により分泌された化合物によって誘導される標的細胞の死滅化の両方の検出を可能にする。目的の細胞傷害性因子に特異的なキャッチ試薬を不飽和状態で用いて、死滅化細胞を事前標識する。捕捉試薬の不飽和条件状態は、死滅化細胞による分泌された目的化合物の分泌物の捕捉および検出の両方を可能にするのに必須であり、標的細胞上にまだ捕捉されていない分泌化合物の効果は、最終的に細胞死を誘導する。それから、標的細胞が、免疫グロブリン産生細胞および死滅化細胞とともに液滴内に共封入される。封入された細胞は、目的の細胞傷害性因子に特異的な検出試薬とともに、封入前は抗体産生を妨げる条件下で共に流される(coflowed)。産生後、抗体産生を可能にする条件下で液滴をインキュベートする。特異的抗体は標的細胞上に再局在化し、死滅化細胞はFc受容体を介して抗体に結合する。ADCC活性を有する抗体に結合した時点で、死滅化細胞は細胞傷害性因子を放出して、標的細胞を死滅させる。分泌された細胞傷害性因子の一部は、死滅化細胞上の捕捉試薬によって捕捉されて、検出試薬を再局在化して、細胞傷害性因子の産生の検出を可能にする。細胞死は、目的抗原を発現している死滅中の標的細胞からの化合物の放出によって監視される。あるいは、細胞死は、細胞表面マーカー、または当業者に公知の任意の他の適切なマーカーによって監視される。拡張することによって、液滴内アッセイを、補体依存性細胞傷害およびオプソニン化貪食作用または任意の他の上述のアッセイに適用することができる。
Claims (15)
- マイクロ流体システムにおける目的化合物の検出のための方法であって、
以下のステップを含む:
a.前記マイクロ流体システムにおいて少なくとも1つの液滴を作製するステップ、
前記少なくとも1つの液滴は以下を含む:
i.少なくとも1つの単一細胞、
ii.1または複数の第1の捕捉試薬、
ここで前記1または複数の第1の捕捉試薬は、前記単一細胞および前記目的化合物に結合することが可能である、
iii.標識を含んでいる1または複数の第2の捕捉試薬、
ここで前記1または複数の第2の捕捉試薬は、前記目的化合物に結合することが可能である、
b.検出可能なイベントを生じさせることが可能な前記少なくとも1つの液滴をインキュベートするステップ、
c.前記少なくとも1つの液滴を直接検出に供するステップ、
ここで、前記少なくとも1つの液滴内での前記検出可能なイベントの存在または再局在化は、前記目的化合物の存在を決定し、
前記目的化合物は少なくとも1つの細胞によって生産され、
少なくとも1つ以上の第1の捕捉試薬は、前記の少なくとも1つの液滴が形成される前に、前記少なくとも1つの単一細胞、および/または、さらなる1つの単一細胞に結合される、
方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記1または複数の第1の捕捉試薬は、前記の少なくとも1つの単一の液滴の作製前または作製後に、前記少なくとも1つの単一細胞の表面に結合する、
方法。 - 請求項1および2のいずれかに記載の方法であって、
前記1または複数の第1の捕捉試薬は、101~108分子/細胞の範囲の密度で前記単一細胞に結合する、
方法。 - 請求項1から3のいずれかに記載の方法であって、
前記目的化合物は、10pM~100μMの濃度で前記液滴において生産される、
方法。 - 請求項1から4のいずれかに記載の方法であって、
前記液滴は、2pL~10nLの範囲の容量を有する、
方法。 - 請求項1から5のいずれかに記載の方法であって、
前記方法は、インキュベーション後に液滴における細胞生存能力を測定するステップをさらに含む、
方法。 - 請求項1から6のいずれかに記載の方法であって、
前記標識は、蛍光標識、アミノ酸に基づく標識または核酸に基づく標識、またはバーコード標識を含む群から選択される、
方法。 - 請求項1から7のいずれかに記載の方法であって、
前記第1の捕捉試薬および前記第2の捕捉試薬は、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸、蛍光コンジュゲート、酵素コンジュゲート、合成ポリマー、またはそれらの組み合わせを含む群から独立に選択される、
方法。 - 請求項1から8のいずれかに記載の方法であって、
前記第1の捕捉試薬は抗体であり、前記第2の捕捉試薬は、蛍光性の抗-目的化合物抗体である、
方法。 - 請求項9の方法であって、
前記第1の捕捉試薬は二官能性抗体である、
方法。 - 請求項1から10のいずれかに記載の方法であって、
ここで前記目的化合物は、細胞によって分泌される化合物であり、制限されないが、抗体(IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgE、IgA(IgA1、IgA2)、IgM、サイトカイン(IL-1様、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6様、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10様、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-20、共通b鎖(CD131)、LIF、OSM、インターフェロン類(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、TNF、TNF-α、TNF-β、CD153、CD154、LT-β、4-1BBL、APRIL、CD70、CD132、CD178、GITRL、LIGHT、OX40L、TALL-1、TRAIL、TWEAK、TRANCE、TGF-β、Tpo、Flt-3L、SCF、M-CSF、MSP)、ケモカイン(CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、XCL1、XCL2、CX3CL1)、ホルモン類(エストロゲン、プロゲストゲン類、チロキシン、ステロイド、インスリン、アドレナリンエピネフリン、メラトニン、トリヨードチロニン、チロキシン、プロスタグランジン類、ロイコトリエン類、プロスタサイクリン、セロシス(Therocis)、アディポネクチン、副腎皮質刺激ホルモン(またはコルチコトロピン)、アミリン(または膵島アミロイドポリペプチド)、アンギオテンシノーゲンおよびアンジオテンシン、抗ミュラー管ホルモン(または、ミュラー管阻害因子もしくはホルモン)、抗利尿ホルモン(または、バソプレシン、アルギニンバソプレシン)、心房性ナトリウム利尿ペプチド(またはアトリオペプチン)、カルシトニン、コレシストキニン、コルチコトロピン放出ホルモン、コルチスタチン、エンドセリン、エンケファリン、エリスロポエチン、卵胞刺激ホルモン、ガラニン、胃抑制ポリペプチド、ガストリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド-1、ゴナドトロピン分泌ホルモン、グアニリン、ヘプシジン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、インスリン、インスリン様増殖因子(またはソマトメジン)、レプチン、リポトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン、モチリン、オレキシン、オステオカルシン、オキシトシン、リラキシン、レニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、ウログアニリン、血管作用性小腸ペプチド、ステロイド、エストロゲン、グルココルチコイド、プロゲストゲン、セコステロイド)、増殖因子(G-CSF、GM-CSF、Fas-リガンド、アドレノメデュリン(AM)、アンジオポエチン(Ang)、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質(BMP)、毛様体神経栄養因子ファミリー、毛様体神経栄養因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、インターロイキン-6(IL-6)、コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子(m-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、上皮増殖因子(EGF)、エフリン(A1-A5、B1-B3)、エリスロポエチン(EPO)、線維芽細胞増殖因子(FGF1-FGF23)、ウシ胎児ソマトトロピン(Foetal Bovine Somatotrophin)(FBS)、リガンドのGDNFファミリー、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン、増殖分化因子-9(GDF9)、肝細胞増殖因子(HGF)、肝癌由来増殖因子(HDGF)、インスリン、インスリン様増殖因子、インスリン様増殖因子-1(IGF-1およびIGF-2)、インターロイキン類;IL-1-すなわち、IL-3およびIL-6の補因子、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、遊走刺激因子(MSF)、肝細胞増殖因子様タンパク質(HGFLP)としても知られるマクロファージ刺激タンパク質(MSP)、ミオスタチン(GDF-8)、ニューレグリン類(NRG1-NRG4)、ニューロトロフィン類、脳由来神経栄養因子(BDNF)、神経成長因子(NGF)、ニューロトロフィン-3(NT-3)、ニューロトロフィン-4(NT-4)、胎盤増殖因子(PGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、レナラーゼ(Renalase)(RNLS)-抗-アポトーシス生存因子、T細胞増殖因子(TCGF)、トロンボポエチン(TPO)、形質転換増殖因子α(TGF-α、TGF-β(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3))、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、血管内皮増殖因子(VEGF))を含む群から選択される、
方法。 - 請求項1から11のいずれかに記載の方法の使用であって、
生物学的イベントを監視するための、
使用。 - 請求項12に記載の方法の使用であって、
前記生物学的イベントは免疫応答またはその調節である、
使用。 - 液滴における目的化合物の検出のための方法であって、
以下のステップ:
a.以下を備えるマイクロ流体システムを提供するステップ:
i.少なくとも1つの入口、
ii.少なくとも1つの出口、
iii.1または複数のチャネル、
b.前記マイクロ流体システム内に液滴の流れを注入するステップ、
ここで少なくとも1つの液滴は以下を含む:
i.少なくとも1つの単一細胞
ii.前記単一細胞および前記目的化合物に結合することが可能な複数の第1の捕捉試薬、および
iii.それぞれが標識を含んでいる複数の第2の捕捉試薬、
ここで前記複数の第2の捕捉試薬は前記目的化合物に結合することが可能である、
c.目的化合物の生産を可能にする条件下で複数の液滴をインキュベートするステップ、それにより、目的化合物が単一細胞によって生産される場合は、前記複数の第1の捕捉試薬および第2の捕捉試薬によって捕捉される、
d.前記標識の存在または再局在化を検出するステップを用いて、目的化合物の存在を判定するステップ、
を含み、
少なくとも1つ以上の第1の捕捉試薬は、前記の少なくとも1つの液滴が形成される前に、前記少なくとも1つの単一細胞に結合される、
方法。 - マイクロ流体システムであって、
a.少なくとも1つの入口、
b.少なくとも1つの出口、
c.1または複数のチャネル、
d.以下を含んでいる少なくとも1つの液滴を作製するためのモジュール:
i.1または複数の単一細胞、
ii.第1の捕捉試薬、
iii.第2の捕捉試薬、
e.目的化合物を産生している細胞を含む液滴を検出する検出モジュール、および
f.シグナルの分析のために構成された分析モジュール、
を備え、
前記検出モジュールは、請求項1および/または請求項14のいずれかに記載の方法のインキュベーションおよび検出ステップを可能とするように構成される、
マイクロ流体システム。
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