JP2019156809A - ＣＡＤＭ１ｖ９認識抗体 - Google Patents
ＣＡＤＭ１ｖ９認識抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019156809A JP2019156809A JP2018049435A JP2018049435A JP2019156809A JP 2019156809 A JP2019156809 A JP 2019156809A JP 2018049435 A JP2018049435 A JP 2018049435A JP 2018049435 A JP2018049435 A JP 2018049435A JP 2019156809 A JP2019156809 A JP 2019156809A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- amino acid
- fragment
- cadm1
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 111
- 102000006818 Cell Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 claims abstract description 71
- 108010072135 Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 claims abstract description 48
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 46
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 91
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 42
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 25
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 17
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 claims description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 101000760620 Homo sapiens Cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 102000054903 human CADM1 Human genes 0.000 claims description 5
- 238000012767 chemiluminescent enzyme immunoassay Methods 0.000 claims description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 claims description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 9
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 abstract description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 111
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 30
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 101150095033 CADM1 gene Proteins 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 102100021267 Anion exchange protein 4 Human genes 0.000 description 8
- 101100165087 Homo sapiens SLC4A9 gene Proteins 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 6
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 5
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 108091007505 ADAM17 Proteins 0.000 description 4
- 102100031111 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17 Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 108091007504 ADAM10 Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100039673 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10 Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003447 ipsilateral effect Effects 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000001370 mediastinum Anatomy 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 101800000285 Big gastrin Proteins 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 206010026673 Malignant Pleural Effusion Diseases 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001470257 Nagara Species 0.000 description 2
- 208000005228 Pericardial Effusion Diseases 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 208000002458 carcinoid tumor Diseases 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N cysteic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 210000004412 neuroendocrine cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000011519 neuroendocrine tumor Diseases 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N octadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCO GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- RZIMNEGTIDYAGZ-HNSJZBNRSA-N pro-gastrin Chemical compound N([C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 RZIMNEGTIDYAGZ-HNSJZBNRSA-N 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- KQMBIBBJWXGSEI-ROLXFIACSA-N (2s)-2-amino-3-hydroxy-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C(O)C1=CNC=N1 KQMBIBBJWXGSEI-ROLXFIACSA-N 0.000 description 1
- AJFGLTPLWPTALJ-SSDOTTSWSA-N (2s)-2-azaniumyl-2-(fluoromethyl)-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoate Chemical compound FC[C@@](N)(C(O)=O)CC1=CN=CN1 AJFGLTPLWPTALJ-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- MSECZMWQBBVGEN-LURJTMIESA-N (2s)-2-azaniumyl-4-(1h-imidazol-5-yl)butanoate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC1=CN=CN1 MSECZMWQBBVGEN-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- UYEGXSNFZXWSDV-BYPYZUCNSA-N (2s)-3-(2-amino-1h-imidazol-5-yl)-2-azaniumylpropanoate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC(N)=N1 UYEGXSNFZXWSDV-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009746 Adult T-Cell Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000016683 Adult T-cell leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 238000012449 Kunming mouse Methods 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000978776 Senegalia senegal Species 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N Trichostatin A Natural products ONC(=O)C=CC(C)=CC(C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000006966 adult T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- HRRYYCWYCMJNGA-ZETCQYMHSA-N alpha-methyl-L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@](N)(C)CC1=CN=CN1 HRRYYCWYCMJNGA-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 125000001314 canonical amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940105990 diglycerin Drugs 0.000 description 1
- GPLRAVKSCUXZTP-UHFFFAOYSA-N diglycerol Chemical compound OCC(O)COCC(O)CO GPLRAVKSCUXZTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- GOQYKNQRPGWPLP-UHFFFAOYSA-N n-heptadecyl alcohol Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCO GOQYKNQRPGWPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000955 neuroendocrine Effects 0.000 description 1
- 201000002120 neuroendocrine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001272 neurogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001495 poly(sodium acrylate) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- NNMHYFLPFNGQFZ-UHFFFAOYSA-M sodium polyacrylate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C=C NNMHYFLPFNGQFZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N trichostatin A Chemical compound ONC(=O)/C=C/C(/C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 description 1
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 description 1
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 1
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】小細胞肺がんＳＣＬＣの新規腫瘍マーカーを提供する。【解決手段】細胞接着分子ＣＡＤＭ１のｖ９断片を認識する、抗体。【選択図】なし
Description
本発明は、CADM1v9認識抗体に関する。
小細胞肺がん(small cell lung cancer: SCLC) は日本の肺がんの約15%を占め、年間１万人以上が死亡する難治がんの代表である。小細胞肺がんは、初回化学療法である抗がん剤への反応が良好であるが、その後の抗がん剤耐性腫瘍の出現が必発である。また、早期から全身へ転移すること、鋭敏な病勢マーカーとしての腫瘍検出用マーカーが少ないことから、小細胞肺がんの５年生存率は10%未満と低く、予後不良である。
小細胞肺がんの治療には、抗がん剤の効果判定や再発の診断に用いる腫瘍検出用マーカーが必須であるため、Neuron-specific enolase (NSE)、及びPro-gastrin-releasing peptide (ProGRP) が用いられている。
Kikuchi et al, Cancer Science, 2012, 103(6): 1051-1057.
Shirakabe et al, Scientific Reports, 2017, 7: 46714.
Nagara et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2012, 417(1): 462-467.
しかしながら、その検出方法において感度を最適化したとしても、NSEの感度は約30%以下、ProGRPの感度は45%程度であり、両マーカーを用いても検出不能なSCLCが全体の半数程度存在し、SCLC診断、治療の盲点になっている。特に早期のSCLCにおいてNSEは腫瘍を全く検出できず、ProGRPは腫瘍をわずかにしか検出できない。したがって、既存腫瘍マーカーで検出できないSCLCを検出し、さらに早期のSCLCをも検出できる新規腫瘍マーカーの開発が強く望まれている。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、SCLCの新規腫瘍マーカーを提供することである。
まず、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、細胞接着分子CADM1が、SCLCで高発現し、しかも正常組織では精巣に発現するスプライスバリアント v8/9を発現すること、CADM1v8/9 の発現がSCLC細胞の浮遊性増殖やマウスでの腫瘍原性を促進し、一方、その発現抑制によりスフェロイド形成能や生存、増殖が抑制されることを見出した (非特許文献１)。
次に、CADM1v8/9はADAM17による切断を受けて細胞外領域が断片として遊離するが (非特許文献２)、CADM1 v8/9に特徴的なexon 9 のコードするアミノ酸配列は細胞膜直上にあり遊離断片に含まれる。一方、精巣以外の正常組織、例えば上皮細胞ではCADM1はADAM10による切断を受けて細胞外領域が断片として遊離するが（非特許文献３）、CADM1v8/9は全く発現しないことから、CADM1v 8/9に特徴的なexon 9 のコードするアミノ酸配列は細胞膜直上になく遊離断片に含まれない。また、精巣から遊離し得るCADM1v9断片は、血液等に移行しにくいところ、本発明者らは、CADM1のv9断片はSCLCの診断における特異的分子標的として有望であることを見出した。
しかしながら、哺乳動物を用いた抗CADM1抗体の作製は困難を極めた。ヒトのCADM1タンパク質と哺乳類の実験動物（マウス、ウサギ等）のCADM1タンパク質の相同性が高く、また、CADM1断片が正常個体の血中に存在することから、ヒトのCADM1タンパク質を哺乳類の実験動物に免疫しても抗体が得られなかった。したがって、CADM1のv9断片を特異的に認識する抗体を作製することが長年困難とされてきた。
本発明者らは、CADM1遺伝子欠損マウスをBalb/c系統へ２年間以上戻し交配を行って得たマウスを準備し、そのマウスをCADM1のv9断片で免疫することでCADM1のv9断片に特異的な抗体を作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明者らは、CADM1遺伝子欠損マウスをBalb/c系統へ２年間以上戻し交配を行って得たマウスを準備し、そのマウスをCADM1のv9断片で免疫することでCADM1のv9断片に特異的な抗体を作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下に示す通りである。
［１］
ＣＡＤＭ１のｖ９断片を認識する、抗体。
［２］
ＣＡＤＭ１のｖ９断片が、ヒトＣＡＤＭ１のｖ９断片である、［１］に記載の抗体。
［３］
ＤＴＴＡＴＴＥＰＡＶＨのＣＡＤＭ１のエクソン９由来の配列番号：２で表されるアミノ酸配列を認識する、［１］又は［２］に記載の抗体。
［４］
配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１と、
配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２と、
配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１と、
配列番号：７で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２と、
配列番号：８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３と、を含む、抗体。
［５］
配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖と、
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、抗体。
［６］
［１］〜［５］のいずれかに記載される抗体を含む、腫瘍検出用マーカー。
［７］
ＣＡＤＭ１のｖ９断片に関連する腫瘍の検出に用いられる、［６］に記載の腫瘍検出用マーカー。
［８］
ＣＡＤＭ１のｖ９断片に関連する腫瘍が、小細胞肺がんである、［６］又は［７］に記載の腫瘍検出用マーカー。
［９］
血清、血漿、胸水のいずれかを生体試料とする、［６］〜［８］のいずれかに記載される腫瘍検出用マーカー。
［１０］
［１］〜［５］のいずれかに記載される抗体、又は［６］〜［９］のいずれかに記載される腫瘍検出用マーカー、を含む、腫瘍検出用キット。
［１１］
前記抗体又は前記腫瘍検出用マーカーを、ＥＬＩＳＡ法、ＣＬＥＩＡ法、蛍光抗体法、酵素抗体法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法のいずれかに用いる、［１０］に記載の腫瘍検出用キット。
［１２］
［１］〜［５］のいずれかに記載される抗体、［６］〜［９］のいずれかに記載される腫瘍検出用マーカー、又は［１０］又は［１１］に記載の腫瘍検出用キットを用い、腫瘍を検出する、腫瘍検出方法。
［１］
ＣＡＤＭ１のｖ９断片を認識する、抗体。
［２］
ＣＡＤＭ１のｖ９断片が、ヒトＣＡＤＭ１のｖ９断片である、［１］に記載の抗体。
［３］
ＤＴＴＡＴＴＥＰＡＶＨのＣＡＤＭ１のエクソン９由来の配列番号：２で表されるアミノ酸配列を認識する、［１］又は［２］に記載の抗体。
［４］
配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１と、
配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２と、
配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１と、
配列番号：７で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２と、
配列番号：８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３と、を含む、抗体。
［５］
配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖と、
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、抗体。
［６］
［１］〜［５］のいずれかに記載される抗体を含む、腫瘍検出用マーカー。
［７］
ＣＡＤＭ１のｖ９断片に関連する腫瘍の検出に用いられる、［６］に記載の腫瘍検出用マーカー。
［８］
ＣＡＤＭ１のｖ９断片に関連する腫瘍が、小細胞肺がんである、［６］又は［７］に記載の腫瘍検出用マーカー。
［９］
血清、血漿、胸水のいずれかを生体試料とする、［６］〜［８］のいずれかに記載される腫瘍検出用マーカー。
［１０］
［１］〜［５］のいずれかに記載される抗体、又は［６］〜［９］のいずれかに記載される腫瘍検出用マーカー、を含む、腫瘍検出用キット。
［１１］
前記抗体又は前記腫瘍検出用マーカーを、ＥＬＩＳＡ法、ＣＬＥＩＡ法、蛍光抗体法、酵素抗体法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法のいずれかに用いる、［１０］に記載の腫瘍検出用キット。
［１２］
［１］〜［５］のいずれかに記載される抗体、［６］〜［９］のいずれかに記載される腫瘍検出用マーカー、又は［１０］又は［１１］に記載の腫瘍検出用キットを用い、腫瘍を検出する、腫瘍検出方法。
本発明によれば、SCLCの新規腫瘍マーカーを提供することができる。
本発明を、発明を実施するための形態により具体的に説明するが、本発明は、以下の発明を実施するための形態に限定されるものではなく、種々変形して実施することができる。
本発明において参照される文献に開示されている内容は、本発明に参照として取り込まれる。
本発明において参照される文献に開示されている内容は、本発明に参照として取り込まれる。
〔CADM1v9認識抗体〕
CADM1のv9断片に特異的な抗体は、長年作製が困難とされてきたところ、本発明に係る抗体は、CADM1のv9断片を認識する。特に、本発明に係る抗体は、CADM1の細胞外領域がプロテアーゼ (ADAM10やADAM17) により切断を受けて遊離したCADM1のv9断片を認識し得る。ここで、「CADM1のv9断片」とは、細胞接着分子CADM1の細胞外領域のうち、エクソン9に対応する領域（配列番号:1）を含むCADM1v8/9が、プロテアーゼにより切断等されて断片として細胞から遊離しているものを意味し、「CADM1v8/9」とは、細胞接着分子CADM1が、腫瘍、正常組織における精巣に発現するスプライスバリアント v8/9を意味する。本発明に係る抗体は、「CADM1v9認識抗体」、「v9認識抗体」、「抗CADM1v9抗体」又は「抗v9抗体」ともいい、また、「CADM1のv9断片」は、「CADM1のv9断片」、「CADM1v9断片」又は「v9断片」ともいう。
CADM1のv9断片に特異的な抗体は、長年作製が困難とされてきたところ、本発明に係る抗体は、CADM1のv9断片を認識する。特に、本発明に係る抗体は、CADM1の細胞外領域がプロテアーゼ (ADAM10やADAM17) により切断を受けて遊離したCADM1のv9断片を認識し得る。ここで、「CADM1のv9断片」とは、細胞接着分子CADM1の細胞外領域のうち、エクソン9に対応する領域（配列番号:1）を含むCADM1v8/9が、プロテアーゼにより切断等されて断片として細胞から遊離しているものを意味し、「CADM1v8/9」とは、細胞接着分子CADM1が、腫瘍、正常組織における精巣に発現するスプライスバリアント v8/9を意味する。本発明に係る抗体は、「CADM1v9認識抗体」、「v9認識抗体」、「抗CADM1v9抗体」又は「抗v9抗体」ともいい、また、「CADM1のv9断片」は、「CADM1のv9断片」、「CADM1v9断片」又は「v9断片」ともいう。
CADM1v9認識抗体は、CADM1のv9断片に関連する腫瘍（以下、「v9断片関連腫瘍」ともいう。）の検出に用いられる。ここで、「CADM1のv9断片に関連する腫瘍」とは、v9断片を遊離させる腫瘍組織を意味する。SCLCでは、正常組織ではほぼ精巣にのみ発現するCADM1v8/9を腫瘍組織において発現し、精巣以外の組織においてCADM1v8/9を発現しないところ、CADM1v9認識抗体を用いることにより、CADM1のv9断片を特異的に認識し、腫瘍組織を検出することができる。ここで、「CADM1のv9断片を特異的に認識」とは、細胞接着分子CADM1の細胞外領域のうち、エクソン9に対応する領域を含まないCADM1の断片を認識するよりも、CADM1のv9断片をより強く認識することを意味する。
CADM1v9認識抗体を用いることにより、従来の抗体を用いることと比較して、高特異度及び高感度で腫瘍組織の存在を検出することができる。よって、CADM1v9認識抗体は、小細胞肺がんを含む癌の疑いのある被験者のスクリーニング、及び、癌と診断された患者の腫瘍再発の監視に、より有効に使用することができる。例えば、後述する実施例に示すように、早期のSCLCである限局型 (病変が同側胸郭内、対側縦隔、対側鎖骨上窩リンパ節までに限られており、悪性胸水及び心嚢水を有さないもの) の患者においても、CADM1v9認識抗体を用いることにより、高特異度及び高感度で腫瘍組織を検出することができる。
CADM1v9認識抗体は、具体的に、以下の少なくとも１つのアミノ酸配列を認識する：
（１）ＤＴＴＡＴＴＥＰＡＶＨのＣＡＤＭ１のエクソン９由来の配列番号：２で表されるアミノ酸配列；
（２）ＤＴＴＡＴＴＥＰＡＶＨのＣＡＤＭ１のエクソン９由来の配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列；及び
（３）ＤＴＴＡＴＴＥＰＡＶＨのＣＡＤＭ１のエクソン９由来の配列番号：２で表されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
（１）ＤＴＴＡＴＴＥＰＡＶＨのＣＡＤＭ１のエクソン９由来の配列番号：２で表されるアミノ酸配列；
（２）ＤＴＴＡＴＴＥＰＡＶＨのＣＡＤＭ１のエクソン９由来の配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列；及び
（３）ＤＴＴＡＴＴＥＰＡＶＨのＣＡＤＭ１のエクソン９由来の配列番号：２で表されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
CADM1v9認識抗体の認識部位は、CADM1のv9断片におけるエクソン9に対応する領域であれば特に限定されない。例えば、CADM1v9認識抗体が認識するCADM1のv9断片は、実施例に示すヒトCADM1のv9断片、中でも、エクソン9に対応する領域である。
本明細書において、「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含むものを意味する。アミノ酸の例としては、天然タンパク原性L-アミノ酸；D-アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体等の化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β-アラニン、オルニチン等の天然非タンパク原性アミノ酸；アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物等が挙げられるがこれらに限定されない。非天然アミノ酸の例としては、α-メチルアミノ酸（α-メチルアラニン等）、D-アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン等）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において、「１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する」という場合、欠失、置換等されるアミノ酸の個数は、結果として得られるＣＤＲのセットが抗原認識機能を保持する限り特に限定されない。また、ここでの「複数」は、２以上の整数を意味し、好ましくは、数個例えば２〜５個、より好ましくは２個、３個、４個である。各ＣＤＲにおける欠失、置換又は付加の位置は、結果として得られるＣＤＲのセットが抗原認識機能を保持する限り、各ＣＤＲにおけるＮ末端でも、Ｃ末端でも、その中間であってもよい。
本明細書において、「配列番号：Ｘで表されるアミノ酸配列とＹ％以上の同一性を有する」とは、２つのポリペプチドのアミノ酸配列の一致が最大になるように整列（アライメント）させたときに、共通するアミノ酸残基数の、配列番号：Ｘに示す全アミノ酸数に対する割合が、Ｙ％以上であることを意味する。
CADM1v9認識抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、本発明に係る抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥのいずれのアイソタイプであってもよい。
CADM1v9認識抗体は、細胞から遊離しているCADM1のv9断片を認識する限り、マウス抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体であってもよく、低分子抗体であってもよいが、これらに限定されない。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＣＤＲを、ヒト抗体のＣＤＲで置換した抗体である。ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体に由来する可変領域と、ヒト抗体に由来する定常領域からなる抗体である。また、ヒト化抗体とは、ヒト以外の動物の抗体において、安全性の高い一部の領域を残して、ヒトの抗体に由来する部分を組み込んだものをいい、ヒト型キメラ抗体、及びヒト型ＣＤＲ移植抗体を含む概念である。
本明細書において「低分子抗体」とは、抗体の断片又は抗体の断片に任意の分子を結合させたものであって、もとの抗体と同一のエピトープを認識するものを意味する。具体的には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１領域からなるＦａｂ；２つのＦａｂがヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結されているＦ（ａｂ'）２；ＶＬ及びＶＨからなるＦｖ；ＶＬ及びＶＨを人工のポリペプチドリンカーで連結した一本鎖抗体であるｓｃＦｖのほか、ｓｄＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃ（Ｆｖ）２が挙げられるが、これらに限定されない。
CADM1v9認識抗体は、特に限定されないが、例えば、（ａ）配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号：７で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３とを含む抗体が挙げられる。
CADM1v9認識抗体は、また例えば、以下のいずれかの抗体が挙げられる：
（１）配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む抗体；
（２）配列番号：９で表されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む抗体；
（３）配列番号：９で表されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む抗体。
（１）配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む抗体；
（２）配列番号：９で表されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む抗体；
（３）配列番号：９で表されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む抗体。
〔CADM1v9認識抗体の作製方法〕
CADM1v9認識抗体の作製方法は限定されないが、例えば、モノクローナル抗体は、CADM1のv9断片で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、CADM1のv9断片で免疫した動物の血清から得ることができる。免疫に用いるCADM1のv9断片は、得られる抗体がCADM1のv9断片を認識する限り特に限定されない。
CADM1v9認識抗体の作製方法は限定されないが、例えば、モノクローナル抗体は、CADM1のv9断片で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、CADM1のv9断片で免疫した動物の血清から得ることができる。免疫に用いるCADM1のv9断片は、得られる抗体がCADM1のv9断片を認識する限り特に限定されない。
市販されているCADM1モノクローナル抗体は実用的にはトリの抗体（トリ抗ヒトCADM1抗体）のみであり（非特許文献２参照）、トリ、哺乳類に関わらずCADM1のv9断片を認識できない。また、哺乳類のCADM1のv9断片を認識できる抗体は、世界中の研究者が挑戦しつつも成功例は報告されておらず、本発明者らが後述する実施例に示すように長期間に及んでCadm1-/- マウスをBalb/c系統へ２年間戻し交配を行って得たBalb/c, Cadm1-/- マウスを、CADM1v9断片で免疫したことにより、初めて得られた。
特定のアミノ酸配列を有する抗体を作製する場合は、例えば、抗体をコードする核酸を含む発現ベクターで適当な宿主を形質転換し、この形質転換体を適当な条件で培養して抗体を発現させ、公知の方法に従って単離精製することによって、抗体を作製することができる。単離精製方法としては、例えば、プロテインＡ等を用いたアフィニティカラム、その他のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等が挙げられ、これらを適宜組み合わせることができる。
また、「ある抗体Ｘと同一のエピトープに特異的に結合する抗体Ｙ」は、下記のようにエピトープの配列を決定してから作製することができる。
例えば、多数のランダムな配列のペプチドを固相担体に固定してアレイ化し、抗体Ｘと反応させ、酵素標識２次抗体で結合を検出して、抗体Ｘが特異的に結合するペプチドのアミノ酸配列を調べ、このアミノ酸配列と抗原タンパク質のアミノ酸配列の相同性を検索することによって、抗原タンパク質上のエピトープを決定することが可能である。固相担体に固定するペプチドを、予め、抗原タンパク質の部分ペプチド群としてもよい。また、抗原タンパク質の種々の部分ペプチドの存在下で、抗体Ｘと抗原タンパク質との結合をＥＬＩＳＡ法で検出し、競合活性の有無を調べることによっても、抗原タンパク質上のエピトープを決定することが可能である。
エピトープの配列を決定することができれば、これに特異的に結合する抗体Ｙは、公知の方法にしたがって当業者が作製することができる。例えば、エピトープ配列を含むペプチドを固相担体に固定し、当該ペプチドと種々の抗体の結合を検出することにより、同エピトープに特異的に結合する抗体を得ることができる。
ここで、「種々の抗体」としては、動物を抗原タンパク質又はその部分ペプチドで免疫することによって得たものを用いてもよいし、ファージディスプレイ法によって作製した抗体ライブラリ又は抗体フラグメントライブラリを用いてもよい。ファージディスプレイ法によるライブラリを用いる場合、エピトープ配列を含むペプチドを固相担体に固定しパニングを繰り返すことによって、同エピトープに特異的に結合する抗体Ｙを得ることもできる。
また、ヒトキメラ抗体及びヒトＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体を産生するハイブリドーマのｍＲＮＡから抗体遺伝子をクローン化し、これをヒト抗体遺伝子の一部と遺伝子組換え技術で連結することによって作製することができる。
例えば、ヒト型キメラ抗体の場合、マウス抗体を産生するハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＬＨ）をＰＣＲでクローニングして配列を解析する。次に、一致率の高い抗体塩基配列から、リーダー配列を含む５’プライマーを作製し、５’プライマーと可変部３’プライマーによって上記ｃＤＮＡから、シグナル配列から可変領域の３’末端までをＰＣＲでクローニングする。一方で、ヒトＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖の定常領域をクローニングし、重鎖と軽鎖それぞれについて、マウス抗体由来可変領域と、ヒト抗体由来定常領域とをＰＣＲによるOverlapping Hanging法で連結し、増幅する。得られたＤＮＡを適当なベクターに挿入し、これを形質転換して、ヒト型キメラ抗体を得ることができる。
ＣＤＲ移植抗体の場合、使用するマウス抗体可変部と最も相同性の高いヒト抗体可変部を選択してクローン化し、メガプライマー法を用いた部位選択的突然変異導入により、ＣＤＲの塩基配列を改変する。なお、フレームワーク領域を構成するアミノ酸配列をヒト化すると抗原との特異的な結合ができなくなる場合には、フレームワークの一部のアミノ酸をヒト型からラット型に変換してもよい。
その他の抗体の製造方法として、トリコスタチンＡ処理ニワトリＢ細胞由来ＤＴ４０細胞株から抗体産生株を取得するＡｄｌｉｂ法（Seo, H. et al., Nat. Biotechnol., 6:731-736, 2002）、マウス抗体遺伝子が破壊されヒト抗体遺伝子が導入されたマウスであるＫＭマウスを免疫してヒト抗体を作製する方法（Itoh,K. et al., Jpn. J. Cancer Res., 92:1313-1321, 2001;Koide, A. et al., J. Mol. Biol., 284:1141-1151, 1998）等があり、これらもCADM1v9認識抗体の産生に応用することができる。
CADM1v9認識抗体が低分子抗体である場合、該低分子抗体をコードするＤＮＡを用いて上記方法で発現させてもよいし、また、全長の抗体をパパイン、ペプシン等の酵素で処理して作製してもよい。
CADM1v9認識抗体は、作製方法や精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が、CADM1v9認識抗体と同等の機能を有している限り、その抗体は本発明に含まれる。例えば、CADM1v9認識抗体を、大腸菌等の原核細胞で発現させた場合、元の抗体のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加される。しかし、本発明は、かかる抗体も包含する。
〔腫瘍検出用マーカー〕
本発明に係る腫瘍検出用マーカーは、CADM1v9認識抗体を含み、担体や添加物をさらに含んでいてもよい。担体及び添加物の例として、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等の薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明に係る腫瘍検出用マーカーは、CADM1v9認識抗体を含み、担体や添加物をさらに含んでいてもよい。担体及び添加物の例として、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等の薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明に係る腫瘍検出用マーカーは、CADM1v9認識抗体を含むことにより、NSEやProGRPの従来のマーカーでは認識できないCADM1のv9断片を検出できる。また、本発明に係る腫瘍検出用マーカーは、CADM1のv9断片を検出できるため、腫瘍検出における感度及び特異度等の検出率の向上が図れる。すなわち、腫瘍の中でも、特に早期のSCLCにおいて、従来の代表的なマーカーであるNSEは腫瘍を全く検出できず、ProGRPは腫瘍をわずかにしか検出できないということに対して、本発明に係る腫瘍検出用マーカーを用いることにより、腫瘍の検出率を向上させることができる。
〔腫瘍検出用キット〕
本発明に係る腫瘍検出用キットは、CADM1v9認識抗体又は腫瘍検出用マーカーを含む。用途は特に限定されず、CADM1のv9断片の検出や、CADM1のv9断片に関連する腫瘍の検出に用いられる。
本発明に係る腫瘍検出用キットは、CADM1v9認識抗体又は腫瘍検出用マーカーを含む。用途は特に限定されず、CADM1のv9断片の検出や、CADM1のv9断片に関連する腫瘍の検出に用いられる。
腫瘍検出用キットは、その用途に応じて試薬や、腫瘍検出用マーカーと同様に担体や添加物を含んでいてもよく、更には緩衝液、容器、使用説明書等を含んでいてもよい。
CADM1v9認識抗体、腫瘍検出用マーカー及びキットは、CADM1のv9断片に関連する腫瘍（v9断片関連腫瘍）、特にがんの検出に用いられる。また、がんの中でも、特にCADM1のv9断片の細胞からの遊離に基づく、神経内分泌腫瘍や、神経芽細胞腫等の神経原性の腫瘍の検出に用いられる。神経内分泌腫瘍は、神経内分泌細胞（ホルモン産生細胞）から発生する腫瘍であれば特に限定されないが、肺（肺カルチノイド、肺大細胞神経内分泌がん）、膵臓、消化管、甲状腺等における神経内分泌細胞で発生し得る。肺で発生する腫瘍としては、小細胞肺がん（SCLC）、肺カルチノイド、及び肺大細胞神経内分泌が挙げられる。CADM1v9認識抗体、腫瘍検出用マーカー及びキットは、特に小細胞肺がん（SCLC）の検出に好適に用いられる。CADM1v9認識抗体は、腫瘍検出における特異度及び感度に優れるため、SCLCの検出に好適に利用できる。
〔腫瘍検出方法〕
本発明に係る腫瘍検出方法は、CADM1v9認識抗体、腫瘍検出用マーカー、又は腫瘍検出用キットを用い、腫瘍を検出する。検出方法としては、抗体を用いた検出方法であれば特に限定されないが、例えば、CADM1v9認識抗体、腫瘍検出用マーカー、又は腫瘍検出用キットを、ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 法、CLEIA（化学発光酵素免疫測定）法、蛍光抗体法、酵素抗体法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法のいずれかに用いて腫瘍を検出することができる。
本発明に係る腫瘍検出方法は、CADM1v9認識抗体、腫瘍検出用マーカー、又は腫瘍検出用キットを用い、腫瘍を検出する。検出方法としては、抗体を用いた検出方法であれば特に限定されないが、例えば、CADM1v9認識抗体、腫瘍検出用マーカー、又は腫瘍検出用キットを、ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 法、CLEIA（化学発光酵素免疫測定）法、蛍光抗体法、酵素抗体法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法のいずれかに用いて腫瘍を検出することができる。
本発明に係る腫瘍検出方法は、具体的にELISA法のうちサンドイッチELISA法を例に挙げれば、被検体由来のサンプルに対する捕捉抗体を固相に吸着させる工程と、スキムミルク等で固相のブロッキングする工程と、固相に被検体由来のサンプル及びCADM1v9認識抗体を添加する工程とを含み、反応しなかった被検体由来のサンプル及びCADM1v9認識抗体を洗い流す工程をさらに含んでもよい。より詳細には、実施例に記載する方法が挙げられる。
本明細書において「被検体由来のサンプル」とは、細胞から遊離しているCADM1のv9断片が含まれ得るサンプルを意味する。被検体由来のサンプルの具体例としては、血清、血漿、胸水、尿、喀痰、腹膜液、膀胱洗浄物、分泌物（例えば、乳房分泌物）、口腔洗浄物、及び吸引液が挙げられるが、血清、血漿、及び胸水が、腫瘍検出の特異度及び感度により優れるため好ましい。
本発明に係る腫瘍検出方法は、腫瘍を検出するための迅速で、高特異度及び高感度の方法である。この方法は、例えば、小細胞肺がんを含む癌の疑いのある被験者のスクリーニング、及び、癌と診断された患者の腫瘍再発の監視に使用することができる。
〔治療剤又は予防剤〕
本発明に係る治療剤又は予防剤は、CADM1v9認識抗体を含み、上述した腫瘍検出用マーカーと同様の担体や添加物をさらに含んでいてもよい。
本発明に係る治療剤又は予防剤は、CADM1v9認識抗体を含み、上述した腫瘍検出用マーカーと同様の担体や添加物をさらに含んでいてもよい。
〔治療方法〕
本発明に係る治療方法又は予防方法は、CADM1v9認識抗体を用い、腫瘍を治療又は予防する。
本発明に係る治療方法又は予防方法は、CADM1v9認識抗体を用い、腫瘍を治療又は予防する。
以下、実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものでない。
＜材料と方法＞
マウスと細胞
野生型Balb/cマウスは日本クレアより購入した。Cadm1欠損マウス (Cadm1-/-) は公知の方法 (Yamada D et al, Mol Cell Biol, 2006) で作製し、Balb/cマウスへ10回戻し交配を行った。Balb/c系統のgp64-tg (トランスジェニック) マウスは公知の方法 (Saitoh R et al, J Immunol Methods, 2007) で作製した。これらのマウスを交配してBalb/c系統のCadm1-/-/gp64-tgマウスを作製した。
マウスと細胞
野生型Balb/cマウスは日本クレアより購入した。Cadm1欠損マウス (Cadm1-/-) は公知の方法 (Yamada D et al, Mol Cell Biol, 2006) で作製し、Balb/cマウスへ10回戻し交配を行った。Balb/c系統のgp64-tg (トランスジェニック) マウスは公知の方法 (Saitoh R et al, J Immunol Methods, 2007) で作製した。これらのマウスを交配してBalb/c系統のCadm1-/-/gp64-tgマウスを作製した。
SBC5細胞はJCRB 細胞バンク、293FT細胞はThermo Fisher Scientific、ATN-1細胞は理化学研究所バイオリソースセンター、NCI-H69及びNCI-H446細胞はAmerican Type Culture Collectionより購入した。SBC5細胞はEMEM (和光純薬工業)、293FT細胞はDMEM (ナカライテスク)、ATN-1、NCI-H69、NCI-H446細胞はRPMI1640 (ナカライテスク) に10% FBS (BioWest)、100 units/mLペニシリン及び100 mg/mLストレプトマイシン (Sigma-Aldrich) を加えて培養した。SBC5細胞のCADM1v8 (exon 7+8+11型) 及びCADM1v8/9 (exon 7+8+9+11型) の安定発現株は、それぞれのcDNAをpBactSTneoベクター (理化学研究所より供与) のSalIサイトにクローニングし、Lipofectamine LTX (Invitrogen) を用いて一過性にトランスフェクションした後に500 mg/mLのG418 (ナカライテスク) で選択することにより得た。
抗CADM1モノクローナル抗体の作製
抗CADM1抗体E9919 (配列番号：11〜18）、E9935 (配列番号：19〜26）は以下のように作製した。
免疫動物にはBalb/c系統のCadm1-/-/gp64-tgマウスを用いた。抗原にはCADM1v8/9を発現するバキュロウイルスを用いた。CADM1v8/9 のcDNAをpBlueBac4.5 (Invitrogen) にクローニングした後、組換えバキュロウイルスを公知の方法 (Masuda K et al, J Biol Chem, 2003) で作製した。ハイブリドーマは、免疫後に摘出した脾臓より得られた抗体産生細胞をマウスミエローマ由来のSP2/O細胞と細胞融合させることにより得た。CADM1を特異的に認識する抗体を培養上清中に産生するハイブリドーマのクローンは、CADM1の細胞外領域のC末端側にマウスIgGのFc領域を付加したCADM1 EC-Fc (Murakami S et al, PLoS One, 2014) に対する反応性をELISA法で評価し、選別した。
抗CADM1抗体E9919 (配列番号：11〜18）、E9935 (配列番号：19〜26）は以下のように作製した。
免疫動物にはBalb/c系統のCadm1-/-/gp64-tgマウスを用いた。抗原にはCADM1v8/9を発現するバキュロウイルスを用いた。CADM1v8/9 のcDNAをpBlueBac4.5 (Invitrogen) にクローニングした後、組換えバキュロウイルスを公知の方法 (Masuda K et al, J Biol Chem, 2003) で作製した。ハイブリドーマは、免疫後に摘出した脾臓より得られた抗体産生細胞をマウスミエローマ由来のSP2/O細胞と細胞融合させることにより得た。CADM1を特異的に認識する抗体を培養上清中に産生するハイブリドーマのクローンは、CADM1の細胞外領域のC末端側にマウスIgGのFc領域を付加したCADM1 EC-Fc (Murakami S et al, PLoS One, 2014) に対する反応性をELISA法で評価し、選別した。
抗CADM1v9抗体の作製
抗CADM1v9抗体F1222 (配列番号：3〜10, 31-38）、F1315は以下のように作製した。
免疫動物にはBalb/c系統のCadm1-/- マウスを用いた。抗原にはCADM1v8/9断片のC末端から12アミノ酸を含むペプチドCDTTATTEPAVHD (配列番号：2）のシステイン残基にKLHを付加したものを使用した。ペプチド合成及びKLH付加は株式会社蛋白精製工業に依頼して行った。免疫は腹腔内に抗原を注射することにより行い、ハイブリドーマは脾臓細胞をマウスミエローマ由来のSP2/O細胞と細胞融合させることにより得た。CADM1v9断片を認識する抗体を産生するクローンの選択は、SBC5細胞のCADM1v8/9安定発現株の培養上清より精製したCADM1v8/9断片タンパク質に対する反応性をELISA 法で評価し、選別した。
抗CADM1v9抗体F1222 (配列番号：3〜10, 31-38）、F1315は以下のように作製した。
免疫動物にはBalb/c系統のCadm1-/- マウスを用いた。抗原にはCADM1v8/9断片のC末端から12アミノ酸を含むペプチドCDTTATTEPAVHD (配列番号：2）のシステイン残基にKLHを付加したものを使用した。ペプチド合成及びKLH付加は株式会社蛋白精製工業に依頼して行った。免疫は腹腔内に抗原を注射することにより行い、ハイブリドーマは脾臓細胞をマウスミエローマ由来のSP2/O細胞と細胞融合させることにより得た。CADM1v9断片を認識する抗体を産生するクローンの選択は、SBC5細胞のCADM1v8/9安定発現株の培養上清より精製したCADM1v8/9断片タンパク質に対する反応性をELISA 法で評価し、選別した。
CADM1v9断片の精製
CADM1v9断片精製タンパク質は以下の方法によって得た。SBC5細胞のCADM1v8/9安定発現株を15 cm dish (TPP) に培養し、セミコンフルエントに達した時点で無血清培地に交換して一晩培養し、上清を回収した。次に、Protein A sepharose (Thermo Fisher Scientific) と抗CADM1抗体E9935のクロスリンクを行った。Protein AとE9935を混合して一晩4°Cで反応させた後、0.15 M sodium borate (MP biomedicals) に溶解した40 mM DMP (Thermo Fisher Scientific) と室温で30分反応させクロスリンクした。0.2 M Glycine (pH8) と室温で2時間反応させることによりクロスリンクを停止させ、PBSで洗浄した。培養上清にE9935をクロスリンクしたProtein A sepharoseを添加し、4°Cで一晩反応させた。PBSで4回洗浄した後、Protein A sepharoseに0.1M Glycine (pH2) を添加し、氷上で1時間反応させることによりCADM1v9断片を溶出し、1M Tris-HCl (pH9) を添加することにより中和した。得られたCADM1v9断片の収量及び純度は、ポリアクリルアミド電気泳動を行った後にSilver Stain MS Kit (和光純薬工業) を用いて銀染色を行うことにより確認した。
CADM1v9断片精製タンパク質は以下の方法によって得た。SBC5細胞のCADM1v8/9安定発現株を15 cm dish (TPP) に培養し、セミコンフルエントに達した時点で無血清培地に交換して一晩培養し、上清を回収した。次に、Protein A sepharose (Thermo Fisher Scientific) と抗CADM1抗体E9935のクロスリンクを行った。Protein AとE9935を混合して一晩4°Cで反応させた後、0.15 M sodium borate (MP biomedicals) に溶解した40 mM DMP (Thermo Fisher Scientific) と室温で30分反応させクロスリンクした。0.2 M Glycine (pH8) と室温で2時間反応させることによりクロスリンクを停止させ、PBSで洗浄した。培養上清にE9935をクロスリンクしたProtein A sepharoseを添加し、4°Cで一晩反応させた。PBSで4回洗浄した後、Protein A sepharoseに0.1M Glycine (pH2) を添加し、氷上で1時間反応させることによりCADM1v9断片を溶出し、1M Tris-HCl (pH9) を添加することにより中和した。得られたCADM1v9断片の収量及び純度は、ポリアクリルアミド電気泳動を行った後にSilver Stain MS Kit (和光純薬工業) を用いて銀染色を行うことにより確認した。
サンドイッチELISAのプロトコル
CADM1v9断片の検出はサンドイッチELISA法により行った。捕捉抗体には抗CADM1抗体E9935を、検出抗体はCADM1v8/9断片の検出には抗CADM1v9抗体F1222を用い、全てのCADM1断片の検出には抗CADM1抗体E9919を用いた。検出抗体はPeroxidase Labeling Kit-NH2 (同仁化学研究所) を用いてHRP標識を行った。
CADM1v9断片の検出はサンドイッチELISA法により行った。捕捉抗体には抗CADM1抗体E9935を、検出抗体はCADM1v8/9断片の検出には抗CADM1v9抗体F1222を用い、全てのCADM1断片の検出には抗CADM1抗体E9919を用いた。検出抗体はPeroxidase Labeling Kit-NH2 (同仁化学研究所) を用いてHRP標識を行った。
まずNunc MaxiSorp 96-wellプレート (Thermo Fisher Scientific) へ1 mg/mLに炭酸バッファー (15 mM Na2CO3、35 mM NaHCO3、0.2% NaN3) で希釈した捕捉抗体を100 mL添加し、4°Cで一晩静置することにより固相化した。PBS-T (137 mM NaCl、8.1 mM Na2PO4、2.68 mM KCl、1.47 mM KH2PO4、0.05% Tween20) を用いて2回洗浄し、1%/ BSA (和光純薬工業) /PBS-Tを200 mL添加して室温で1時間静置することによりブロッキングを行った。PBS-Tで2回洗浄後、検量線作成用のスタンダードと培養上清、血清、または胸水を添加し、室温で1時間インキュベーションした。PBS-Tで4回洗浄し、100 ng/mLに1% BSA/PBS-Tで希釈した検出抗体を100 mL添加し、室温で1時間インキュベーションした。PBS-Tで6回洗浄した後、TMB Soluble Reagent (ScyTek Laboratories) を100 mL添加して発色させ、さらにTMB Stop Buffer (ScyTek Laboratories) を100 mL添加し反応を停止した。最後に、Ensightプレートリーダー (PerkinElmer) を用いて450 nmの波長を測定した。
検量線作成用のスタンダードには、SBC5細胞のCADM1v8/9安定発現株の培養上清より精製したCADM1v9 断片タンパク質を用いた。血清におけるCADM1v9断片を測定する場合においては、Normal human serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories) の値を0として補正した。
血清及び胸水の取得
ある患者における血液および胸水を研究材料とした。診断・治療のために必要と判断されて採血検査を行う際に、研究に用いる血液10 mLも併せて採取した。胸水穿刺検査を行う際には、臨床判断にて採取した胸水のうち10 mLを研究用として利用した。血液・胸水は遠心分離にかけ、細胞成分を除去し、血液の場合は血清を研究材料として用いた。
ある患者における血液および胸水を研究材料とした。診断・治療のために必要と判断されて採血検査を行う際に、研究に用いる血液10 mLも併せて採取した。胸水穿刺検査を行う際には、臨床判断にて採取した胸水のうち10 mLを研究用として利用した。血液・胸水は遠心分離にかけ、細胞成分を除去し、血液の場合は血清を研究材料として用いた。
抗CADM1v9抗体のエピトープの決定法
抗CADM1v9抗体F1222、F1315はあらかじめPeroxidase Labeling Kit-NH2 (同仁化学研究所) を用いてHRP標識を行い、ELISA法によりエピトープの絞り込みを行った。ペプチド合成は東レリサーチセンターに依頼した。ペプチドは10% DMSO/PBSに溶解させ、1 mg/mLに調製した。Nunc MaxiSorp 96-wellプレート (Thermo Fisher Scientific) へ10 mg/mLに炭酸バッファーで希釈したペプチドを100 mL添加し、4°Cで一晩静置することにより固相化した。PBS-Tを用いて2回洗浄し、1%/ BSA/PBS-Tを200 mL添加して室温で1時間静置することによりブロッキングを行った。PBS-Tで2回洗浄し、100 ng/mLに1% BSA/PBS-Tで希釈したHRP標識抗体を100 mL添加し、室温で1時間インキュベーションした。PBS-Tで4回洗浄した後、TMB Soluble Reagent (ScyTek Laboratories) を100 mL添加して発色させ、さらにTMB Stop Buffer (ScyTek Laboratories) を100 mL添加し反応を停止した。最後に、Ensightプレートリーダー(PerkinElmer) を用いて450 nmの波長を測定した。
抗CADM1v9抗体F1222、F1315はあらかじめPeroxidase Labeling Kit-NH2 (同仁化学研究所) を用いてHRP標識を行い、ELISA法によりエピトープの絞り込みを行った。ペプチド合成は東レリサーチセンターに依頼した。ペプチドは10% DMSO/PBSに溶解させ、1 mg/mLに調製した。Nunc MaxiSorp 96-wellプレート (Thermo Fisher Scientific) へ10 mg/mLに炭酸バッファーで希釈したペプチドを100 mL添加し、4°Cで一晩静置することにより固相化した。PBS-Tを用いて2回洗浄し、1%/ BSA/PBS-Tを200 mL添加して室温で1時間静置することによりブロッキングを行った。PBS-Tで2回洗浄し、100 ng/mLに1% BSA/PBS-Tで希釈したHRP標識抗体を100 mL添加し、室温で1時間インキュベーションした。PBS-Tで4回洗浄した後、TMB Soluble Reagent (ScyTek Laboratories) を100 mL添加して発色させ、さらにTMB Stop Buffer (ScyTek Laboratories) を100 mL添加し反応を停止した。最後に、Ensightプレートリーダー(PerkinElmer) を用いて450 nmの波長を測定した。
図1は、CADM1スプライスバリアントv8/9のmRNA及びタンパク質の構造を示す。(A) CADM1遺伝子は12個のエクソンから成り、脳に発現するv(-)、上皮に発現するv8、精巣及びSCLCに発現するv8/9の3つの主たるスプライスバリアントが存在する。CADM1v8/9にのみエクソン9 が含まれている。(B) CADM1v8/9に特異的なアミノ酸配列は細胞膜直上にあり、ADAM17による切断を受けて遊離する。この部位の周辺はスレオニン残基に富み、O型糖鎖による修飾を受ける。Ig-V及びIg-C2は免疫グロブリン様ループ構造を指す。
＜結果＞
図2は、細胞培養上清におけるCADM1v9断片の検出結果を示す。SCLCその他の細胞の培養上清に分泌される全てのCADM1断片量 (A) 及びCADM1v9断片量 (B) をサンドイッチELISA法により測定した。捕捉抗体には抗CADM1マウスモノクローナル抗体 E9935を用いた。検出抗体には、抗CADM1抗体E9919及び抗CADM1v8/9抗体F1222をHRP標識したものを使用した。CADM1を発現しないSBC5細胞にCADM1v8 (上皮型) とCADM1v8/9 (SCLC・精巣型) を安定発現させた細胞をそれぞれ作製したところ、CADM1v8/9発現細胞において培養上清にCADM1v9断片の分泌が認められた。また、内在性にCADM1v8を発現するヒト胎児腎細胞由来の293FT及び成人T細胞白血病由来のATN-1の培養上清からはCADM1v9断片はほとんど検出されないが、SCLC細胞であるNCI-H69及びNCI-H446細胞の培養上清からはCADM1v9断片が検出された。したがって、CADM1v8/9を発現する細胞の培養上清にのみCADM1v9断片を検出したことから、CADM1v8/9は確かに切断を受けて断片が遊離すること、またCADM1v9断片を検出するサンドイッチELISAの特異性が高いことが示された。
図2は、細胞培養上清におけるCADM1v9断片の検出結果を示す。SCLCその他の細胞の培養上清に分泌される全てのCADM1断片量 (A) 及びCADM1v9断片量 (B) をサンドイッチELISA法により測定した。捕捉抗体には抗CADM1マウスモノクローナル抗体 E9935を用いた。検出抗体には、抗CADM1抗体E9919及び抗CADM1v8/9抗体F1222をHRP標識したものを使用した。CADM1を発現しないSBC5細胞にCADM1v8 (上皮型) とCADM1v8/9 (SCLC・精巣型) を安定発現させた細胞をそれぞれ作製したところ、CADM1v8/9発現細胞において培養上清にCADM1v9断片の分泌が認められた。また、内在性にCADM1v8を発現するヒト胎児腎細胞由来の293FT及び成人T細胞白血病由来のATN-1の培養上清からはCADM1v9断片はほとんど検出されないが、SCLC細胞であるNCI-H69及びNCI-H446細胞の培養上清からはCADM1v9断片が検出された。したがって、CADM1v8/9を発現する細胞の培養上清にのみCADM1v9断片を検出したことから、CADM1v8/9は確かに切断を受けて断片が遊離すること、またCADM1v9断片を検出するサンドイッチELISAの特異性が高いことが示された。
図3は、肺がん及び炎症性肺疾患患者血清におけるCADM1v9断片の検出結果を示す。上述した患者より採血した血液を遠心分離し、細胞成分を除いて得られた血清を用いてCADM1v8/9断片の検出を行った。小細胞肺がん (SCLC) 患者30名、非小細胞肺がん (NSCLC) 患者32名 (うち腺がん20名、扁平上皮がん12名)、炎症性肺疾患 (Inflammatory lung diseases) 患者18名について検討した結果、SCLC患者においてのみCADM1v9断片量が高い症例が認められた。閾値を3 ng/mLとすると、特異度92% (46/50) における感度は47% (14/30) であり、CADM1v9断片の腫瘍マーカーとしての有用性が示された。
下記表は、SCLC患者血清におけるCADM1v9断片 (配列番号:27) の検出率を示す。閾値を3 ng/mLとすると、CADM1v8/9陽性の症例はSCLC全体で47% (14/30) であり、限局型 (病変が同側胸郭内、対側縦隔、対側鎖骨上窩リンパ節までに限られており、悪性胸水及び心嚢水を有さないもの) では3/12 (25%)、進展型 (病変が同側胸郭内、対側縦隔、対側鎖骨上窩リンパ節までに限られないものか、悪性胸水又は心嚢水を有すもの) では10/13 (77%) であり、比較的早期の限局型SCLCにおいてもCADM1v9断片の検出が可能であることが示された。
図4は、SCLC患者血清におけるProGRPとCADM1v9断片との比較を示す。SCLC患者血清30例におけるProGRPをHuman Pro-Gastrin-releasing Peptide DuoSet Kit (R&D Systems) を用いて測定し、CADM1v9断片と比較を行った。ProGRPは閾値を46 pg/mLとすると14例 (47%) で陽性であり、CADM1v9断片は閾値を3 ng/mLとすると同様に14例 (47%) で陽性であった。ProGRP陽性かつCADM1v8/9陰性、またProGRP陰性かつCADM1v8/9陽性の症例がそれぞれ5例 (17%) ずつ存在したことから、ProGRPとCADM1v8/9断片を腫瘍マーカーとして併用することにより、検出率の向上が見込まれる。なお、図中ではProGRPが300 pg/mL以上、CADM1v8/9断片が20 ng/mL以上の値を省略して表示している。
図5は、SCLCの治療効果とCADM1v9断片量との相関を示す。治療の前後に複数回採血を行ったSCLC症例に関し、治療効果とCADM1v8/9断片量との相関について検討した。(A) Partial Response (PR; 腫瘍の大きさが30%以上減少した状態) と判定された6症例のうち4症例においてはCADM1v9断片量の著名な低下を認め、残り2症例においても微減であった。 (B) Progressive Disease (PD; 腫瘍の大きさが20%以上かつ5 mm以上増加、あるいは新病変が出現した状態) と判定された2症例の両方においてCADM1v9断片量の増加を認めた。 (C) 再発を認めた1症例に関して、治療によりPRとなった場合にはCADM1v9断片量が減少し、再発時にはCADM1v9断片量の増加が認められた。以上のことから、腫瘍の大きさの変化と血清中のCADM1v9断片量は相関し、CADM1v9断片は病勢を反映するマーカーとして有用であることが示された。
図6は、CADM1のエクソン8及び9のコードするアミノ酸配列とプロテアーゼによる切断部位を示す。CADM1のスプライスバリアントv8 及びv8/9のコードするアミノ酸の一部を図示した。CADM1v8はADAM10、CADM1v8/9はADAM17によってそれぞれ切断される (Nagara et al, Biochem Biophys Res Commun, 2012; Shirakabe et al, Sci Rep, 2017)。
図7は、SCLC患者の胸水におけるCADM1v9断片の検出結果を示す。SCLC患者9名より採取した胸水におけるCADM1v9断片を測定したところ、血清と同様にCADM1v9断片量の高い症例が認められた。血液だけでなく胸水を用いてもSCLCに由来するCADM1v9断片を検出することができ、胸水を用いた診断が可能であることを示している。
図8は、CADM1v9断片の精製タンパク質の取得結果を示す。SBC5細胞のCADM1v8/9安定発現株の培養上清より、抗CADM1抗体を用いてCADM1v9断片を精製した。精製タンパク質の収量及び純度はSDS-PAGEの後に銀染色を行うことにより測定した。矢頭で示す位置 (約80 kDa) にCADM1v9断片の精製タンパク質が認められた。BSAは濃度測定の標準タンパク質として用いた。
図9は、抗CADM1v9抗体のエピトープの絞り込みの結果を示す。抗CADM1v9抗体のエピトープを絞り込むために、免疫原として用いた全長13アミノ酸のペプチド（配列番号:2）と、これを短く区切ったペプチド（配列番号：28〜30）を合成し、ELISA法を用いて抗CADM1v9抗体との反応性を検討した。その結果、F1222及びF1315抗体はともに全長のペプチドに反応したが、7アミノ酸ずつに区切ったペプチドとは反応せず、7アミノ酸より長いエピトープを有することが示された。
図１０〜１２は、それぞれ実施例で作製して用いた抗体について、F1222抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列及び塩基配列、E9919抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列、E9935抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列、を示す。
配列番号：１は、CADM1のエクソン9のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２は、F1222抗体及びF1315抗体の作製に用いた抗原のアミノ酸配列を表す。
配列番号：３は、F1222抗体の重鎖CDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号：４は、F1222抗体の重鎖CDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号：５は、F1222抗体の重鎖CDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号：６は、F1222抗体の軽鎖CDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号：７は、F1222抗体の軽鎖CDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号：８は、F1222抗体の軽鎖CDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号：９は、F1222抗体の重鎖に含まれるアミノ酸配列を表す。
配列番号：１０は、F1222抗体の軽鎖に含まれるアミノ酸配列を表す。
配列番号：１１は、E9919抗体の重鎖CDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１２は、E9919抗体の重鎖CDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１３は、E9919抗体の重鎖CDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１４は、E9919抗体の軽鎖CDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１５は、E9919抗体の軽鎖CDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１６は、E9919抗体の軽鎖CDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１７は、E9919抗体の重鎖に含まれるアミノ酸配列を表す。
配列番号：１８は、E9919抗体の軽鎖に含まれるアミノ酸配列を表す。
配列番号：１９は、E9935抗体の重鎖CDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２０は、E9935抗体の重鎖CDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２１は、E9935抗体の重鎖CDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２２は、E9935抗体の軽鎖CDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２３は、E9935抗体の軽鎖CDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２４は、E9935抗体の軽鎖CDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２５は、E9935抗体の重鎖に含まれるアミノ酸配列を表す。
配列番号：２６は、E9935抗体の軽鎖に含まれるアミノ酸配列を表す。
配列番号：２７は、ヒトCADM1v9断片のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２８は、7アミノ酸のペプチドのアミノ酸配列を表す。
配列番号：２９は、7アミノ酸のペプチドのアミノ酸配列を表す。
配列番号：３０は、7アミノ酸のペプチドのアミノ酸配列を表す。
配列番号：３１は、F1222抗体の重鎖CDR1の塩基配列を表す。
配列番号：３２は、F1222抗体の重鎖CDR2の塩基配列を表す。
配列番号：３３は、F1222抗体の重鎖CDR3の塩基配列を表す。
配列番号：３４は、F1222抗体の軽鎖CDR1の塩基酸配列を表す。
配列番号：３５は、F1222抗体の軽鎖CDR2の塩基配列を表す。
配列番号：３６は、F1222抗体の軽鎖CDR3の塩基配列を表す。
配列番号：３７は、F1222抗体の重鎖に含まれる塩基配列を表す。
配列番号：３８は、F1222抗体の軽鎖に含まれる塩基配列を表す。
配列番号：２は、F1222抗体及びF1315抗体の作製に用いた抗原のアミノ酸配列を表す。
配列番号：３は、F1222抗体の重鎖CDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号：４は、F1222抗体の重鎖CDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号：５は、F1222抗体の重鎖CDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号：６は、F1222抗体の軽鎖CDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号：７は、F1222抗体の軽鎖CDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号：８は、F1222抗体の軽鎖CDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号：９は、F1222抗体の重鎖に含まれるアミノ酸配列を表す。
配列番号：１０は、F1222抗体の軽鎖に含まれるアミノ酸配列を表す。
配列番号：１１は、E9919抗体の重鎖CDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１２は、E9919抗体の重鎖CDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１３は、E9919抗体の重鎖CDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１４は、E9919抗体の軽鎖CDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１５は、E9919抗体の軽鎖CDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１６は、E9919抗体の軽鎖CDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１７は、E9919抗体の重鎖に含まれるアミノ酸配列を表す。
配列番号：１８は、E9919抗体の軽鎖に含まれるアミノ酸配列を表す。
配列番号：１９は、E9935抗体の重鎖CDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２０は、E9935抗体の重鎖CDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２１は、E9935抗体の重鎖CDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２２は、E9935抗体の軽鎖CDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２３は、E9935抗体の軽鎖CDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２４は、E9935抗体の軽鎖CDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２５は、E9935抗体の重鎖に含まれるアミノ酸配列を表す。
配列番号：２６は、E9935抗体の軽鎖に含まれるアミノ酸配列を表す。
配列番号：２７は、ヒトCADM1v9断片のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２８は、7アミノ酸のペプチドのアミノ酸配列を表す。
配列番号：２９は、7アミノ酸のペプチドのアミノ酸配列を表す。
配列番号：３０は、7アミノ酸のペプチドのアミノ酸配列を表す。
配列番号：３１は、F1222抗体の重鎖CDR1の塩基配列を表す。
配列番号：３２は、F1222抗体の重鎖CDR2の塩基配列を表す。
配列番号：３３は、F1222抗体の重鎖CDR3の塩基配列を表す。
配列番号：３４は、F1222抗体の軽鎖CDR1の塩基酸配列を表す。
配列番号：３５は、F1222抗体の軽鎖CDR2の塩基配列を表す。
配列番号：３６は、F1222抗体の軽鎖CDR3の塩基配列を表す。
配列番号：３７は、F1222抗体の重鎖に含まれる塩基配列を表す。
配列番号：３８は、F1222抗体の軽鎖に含まれる塩基配列を表す。
Claims (11)
- ＣＡＤＭ１のｖ９断片を認識する、抗体。
- ＣＡＤＭ１のｖ９断片が、ヒトＣＡＤＭ１のｖ９断片である、請求項１に記載の抗体。
- ＤＴＴＡＴＴＥＰＡＶＨのＣＡＤＭ１のエクソン９由来の配列番号：２で表されるアミノ酸配列を認識する、請求項１又は２に記載の抗体。
- 配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１と、
配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２と、
配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１と、
配列番号：７で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２と、
配列番号：８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３と、を含む、抗体。 - 配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖と、
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、抗体。 - 請求項１〜５のいずれか一項に記載される抗体を含む、腫瘍検出用マーカー。
- ＣＡＤＭ１のｖ９断片に関連する腫瘍の検出に用いられる、請求項６に記載の腫瘍検出用マーカー。
- ＣＡＤＭ１のｖ９断片に関連する腫瘍が、小細胞肺がんである、請求項６又は７に記載の腫瘍検出用マーカー。
- 血清、血漿、胸水のいずれかを生体試料とする、請求項６〜８のいずれか一項に記載される腫瘍検出用マーカー。
- 請求項１〜５のいずれか一項に記載される抗体、又は請求項６〜９のいずれか一項に記載される腫瘍検出用マーカー、を含む、腫瘍検出用キット。
- 前記抗体又は前記腫瘍検出用マーカーを、ＥＬＩＳＡ法、ＣＬＥＩＡ法、蛍光抗体法、酵素抗体法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法のいずれかに用いる、請求項１０に記載の腫瘍検出用キット。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018049435A JP7229503B2 (ja) | 2018-03-16 | 2018-03-16 | ＣＡＤＭ１ｖ９認識抗体 |
| EP19766985.6A EP3766898A4 (en) | 2018-03-16 | 2019-03-18 | Cadm1 v9-recognizing antibody |
| PCT/JP2019/011201 WO2019177173A1 (ja) | 2018-03-16 | 2019-03-18 | ＣＡＤＭ１ ｖ９認識抗体 |
| US16/979,442 US11891443B2 (en) | 2018-03-16 | 2019-03-18 | CADM1 V9-recognizing antibody |
| CN201980019653.5A CN111902425A (zh) | 2018-03-16 | 2019-03-18 | CADM1 v9识别抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018049435A JP7229503B2 (ja) | 2018-03-16 | 2018-03-16 | ＣＡＤＭ１ｖ９認識抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2019156809A true JP2019156809A (ja) | 2019-09-19 |
| JP7229503B2 JP7229503B2 (ja) | 2023-02-28 |
Family
ID=67907192
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018049435A Active JP7229503B2 (ja) | 2018-03-16 | 2018-03-16 | ＣＡＤＭ１ｖ９認識抗体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11891443B2 (ja) |
| EP (1) | EP3766898A4 (ja) |
| JP (1) | JP7229503B2 (ja) |
| CN (1) | CN111902425A (ja) |
| WO (1) | WO2019177173A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7270944B1 (ja) | 2022-09-13 | 2023-05-11 | 学校法人近畿大学 | 抗ｃａｄｍ１抗体またはその抗原結合断片 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20230062691A (ko) * | 2021-10-29 | 2023-05-09 | 주식회사 이뮤노로지컬디자이닝랩 | Cadm1에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101769160B1 (ko) * | 2009-03-05 | 2017-08-17 | 옥스포드 바이오테라퓨틱스 리미티드 | Ｃａｄｍ１에 특이적인 완전 인간 항체 |
| WO2012119989A2 (en) * | 2011-03-04 | 2012-09-13 | Oryzon Genomics, S.A. | Methods and antibodies for the diagnosis and treatment of cancer |
-
2018
- 2018-03-16 JP JP2018049435A patent/JP7229503B2/ja active Active
-
2019
- 2019-03-18 US US16/979,442 patent/US11891443B2/en active Active
- 2019-03-18 CN CN201980019653.5A patent/CN111902425A/zh active Pending
- 2019-03-18 WO PCT/JP2019/011201 patent/WO2019177173A1/ja unknown
- 2019-03-18 EP EP19766985.6A patent/EP3766898A4/en active Pending
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CANCER SCIENCE, vol. 103, no. 6, JPN6022004907, 2012, pages 1051 - 1057, ISSN: 0004841811 * |
| GENE, vol. 295, JPN6022004908, 2002, pages 7 - 12, ISSN: 0004841812 * |
| PLOS ONE, vol. vol.5, issue 9, e12892, JPN6022004909, 2010, pages 1 - 7, ISSN: 0004841813 * |
| THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 270, no. 15, JPN6022004910, 1995, pages 8397 - 8400, ISSN: 0004841814 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7270944B1 (ja) | 2022-09-13 | 2023-05-11 | 学校法人近畿大学 | 抗ｃａｄｍ１抗体またはその抗原結合断片 |
| WO2024058192A1 (ja) * | 2022-09-13 | 2024-03-21 | 学校法人近畿大学 | 抗ｃａｄｍ１抗体またはその抗原結合断片 |
| JP2024040996A (ja) * | 2022-09-13 | 2024-03-26 | 学校法人近畿大学 | 抗ｃａｄｍ１抗体またはその抗原結合断片 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3766898A1 (en) | 2021-01-20 |
| EP3766898A4 (en) | 2021-12-29 |
| JP7229503B2 (ja) | 2023-02-28 |
| US20210079092A1 (en) | 2021-03-18 |
| US11891443B2 (en) | 2024-02-06 |
| CN111902425A (zh) | 2020-11-06 |
| WO2019177173A1 (ja) | 2019-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107533051B (zh) | Hla-g作为car t细胞免疫疗法的新靶标 | |
| CN106999576B (zh) | 癌细胞特异性抗体、抗癌剂、及癌症的检查方法 | |
| WO2008146911A9 (ja) | IL13Ra2に対する抗体およびこれを含む診断・治療薬 | |
| KR101854110B1 (ko) | ＨＥ4ａ의 결정을 위해 사용되는 조성물들 및 방법들 | |
| US20180118831A1 (en) | Car t-cells for the treatment of b7-h4 expressing solid tumors | |
| KR20140006713A (ko) | Dll4에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 이의 용도 | |
| KR20110090985A (ko) | 인간 ｃｘｃｌ１ 단백질의 면역학적 측정 방법 | |
| CN108473552B (zh) | 检测外泌体蛋白eif3a的特异性自身抗体的抗原性组合物和使用其诊断肝癌的方法 | |
| WO2020026987A1 (ja) | 抗ｒｏｒ１モノクローナル抗体およびその機能的断片、遺伝子、薬剤デリバリー組成物、並びに、医薬組成物 | |
| RU2710439C2 (ru) | Новое антитело против пресепсина | |
| JP6491633B2 (ja) | 抗ヒトｃｌｃｐ１抗体とその用途 | |
| US10906972B2 (en) | Cancer cell specific anti-podocalyxin antibody and method for producing same | |
| TWI790992B (zh) | 抗ｔｍｅｍ-１８０抗體、抗癌劑、及癌之檢查方法 | |
| WO2019177173A1 (ja) | ＣＡＤＭ１ ｖ９認識抗体 | |
| US20200166512A1 (en) | Composition and methods for detecting cancer | |
| WO2022152236A1 (zh) | 抗trpv6单克隆抗体及其应用 | |
| JP2019050737A (ja) | Ｃｄ４４陽性ｔｍｅｍ−１８０陽性のがん細胞由来微粒子、これを用いた抗ｔｍｅｍ−１８０抗体療法が有効ながん患者の選別方法、選別された患者に対する抗ｔｍｅｍ−１８０抗体を含む抗がん剤、および前記方法に用いるキット | |
| JP6729917B2 (ja) | ＥｐｈＡ２ Ｎ末端フラグメント抗体 | |
| TW201840588A (zh) | 抗ｇｐｒ２０抗體 | |
| KR20230159454A (ko) | 악성 췌장 낭포성 종양의 판정 보조 방법 및 판정 보조용 키트 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210311 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220207 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220407 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220608 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220803 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220930 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221026 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230120 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230208 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7229503 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |