JP2019097423A - XPA pre−mRNAのプロセシングにおけるエクソン3のスキッピングを誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents
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[1] 配列番号1で表されるヌクレオチド配列中の連続する少なくとも15個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、XPA pre-mRNAのプロセシングにおけるエクソン3のスキッピングを誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[2] 配列番号2〜7のいずれかで表されるヌクレオチド配列中の連続する少なくとも15個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、[1]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[3] 15〜40個のヌクレオチドからなる、[1]又は[2]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[4] 前記相補的なヌクレオチド配列が配列番号8〜23のいずれかで表されるヌクレオチド配列(但し、チミンはウラシルであってもよい)である、[1]〜[3]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[5] 前記相補的なヌクレオチド配列が配列番号24〜44のいずれかで表されるヌクレオチド配列(但し、チミンはウラシルであってもよい)である、[1]〜[3]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[6] 糖−リン酸骨格の1種以上の修飾を含む、[1]〜[5]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[7] 2’−O,4’−C−エチレン架橋核酸を含む、[6]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[8] 全ヌクレオチドの1/3以上が2’−O,4’−C−エチレン架橋核酸である、[7]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[9] 配列番号45又は46で表されるヌクレオチド配列からなる、[1]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[10] [1]〜[9]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる、XPA pre-mRNAのプロセシングにおけるエクソン3のスキッピング誘導用試薬。
[11] [1]〜[9]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる、色素性乾皮症の治療剤。
[12] 前記色素性乾皮症がXPA遺伝子のIVS3-1G>C変異に起因する、[11]に記載の剤。
[13] 哺乳動物に対し、[1]〜[9]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする、該哺乳動物における色素性乾皮症の治療方法。
[14] 色素性乾皮症の治療に使用するための、[1]〜[9]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
本発明は、XPA pre-mRNAのエクソン3のESE又はスプライス部位に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、XPAのエクソン3のスキッピングを誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチド(以下「本発明のAON」と略記する場合がある)を提供する。
本発明のAONは、前述のように、XPAのエクソン3のスキッピングを誘導することができる。従って、本発明のAONは、XPAのエクソン3のスキッピング誘導用試薬(以下「本発明の試薬」と略記する場合がある)として用いることができる。また、本発明の試薬が2種以上のAONを含む場合や、その他の試薬類を含む場合、該試薬は、各AON、試薬類を別個の試薬中に含む試薬キットとして提供され得る。本発明の試薬に含まれるAONは、AON分子の形態であってもよく、上述したようにAONをコードする核酸やベクター等の形態でもあってもよく、これらの形態が混合していてもよい。
本発明のAONは、XPAのエクソン3のスキッピングを誘導することができるため、該AONを含有する医薬(以下「本発明の医薬」と略記する)は、XPA遺伝子の変異が関与する疾患の治療に用いることができる。本発明において、「治療」には、症状の軽減や改善、病気や症状の進行、あるいは症状の顕在化の予防、遅延や停止も包含される。このような疾患として、色素性乾皮症が挙げられる。本発明の医薬は、XPA遺伝子のIVS3-1G>C変異に起因する色素性乾皮症に治療に好適に用いることができる。該変異を有する対象が、本発明のAONが標的とする配列に変異を有している場合には、これらの変異に合わせて(例えば、AONが該変異箇所の塩基に対して相補的な塩基となるように)、適宜AONの配列を設計することができる。このような変異としては、例えば、既報のC108F(G323T)変異、E111X(G331T)変異、Y116X(T348A)変異、C126Y(G377A)変異、R130K(G389A)変異、XPAのORFの349番目から353番目の5塩基(CTTAT)が欠失した変異、374番目のCが欠失した変異や、アミノ酸の置換を伴わないサイレント変異(例:T306C変異、C315T変異、T348C変異等)などが挙げられる。ここで記載した変異は、単なる例示であって、具体的な変異に限定されるものではなく、これらの変異以外の変異(既知の変異及び今後発見される変異を含む)に合わせて、適宜AONの配列を設計することができる。
軽症例XP-A群患者と重症例XP-A群患者から採取した皮膚より樹立した線維芽細胞5x104を35mm ペトリ皿に置いたカバーグラス上に播種し一昼夜(約18時間)培養した後、細胞を軽くPBSで洗った後、紫外線(UV-C)を30J/m2照射した。照射後の細胞に[3H]-チミジンを含有する培養液で3時間培養したのち、固定した。翌日、カバーグラスをスライドグラスに貼り付け、暗室でオートラジオグラフィー用の乳剤に浸したのち、冷暗所で10日おいた。スライドグラスを写真用の現像液で現像し、固定後水洗し、カバーグラス全体を大きめのカバーグラスで覆った。油浸レンズを用いて1000倍の対物レンズを装着して、一つの細胞あたりのグレイン数を数え、横軸にグレイン数、縦軸に細胞数をとってヒストグラムを作成すると同時に、百個の核についての平均グレイン数を出した。正常細胞のグレイン数を100%とした時の被験細胞でのグレイン数を%で表す。
聴力測定は両耳にヘッドホンを装着して音源から周波数(Hz)と音の強度(dB)の異なる音を出し、その音が聞こえたかどうかを右(○)と左(x)をそれぞれプロットしてオーデイオグラムを作成した。縦軸は20-120dBで、横軸は125-8000Hzを用いている。
<コンストラクトの作製>
N末端にFLAGタグを融合したヒトXPA(野生型または変異型)のcDNAを、レトロウイルス発現用ベクターpMMPに組み込んだ。このコンストラクトをFuGene HD (Promega) を用いて293GPG細胞にトランスフェクションし、組換えレトロウイルスを産生させた。pMMPベクター及び293GPG細胞は、Oryら [PNAS, 93, 11400-11406 (1996)] が報告したものを用いた。重症型XP-A群患者由来の皮膚線維芽細胞株XP2OSSVを親株に用い、Nafら [Mol Cell Biol, 18, 5952-5960 (1998)] の方法に従って、FLAG-XPA(野生型または変異型)を発現する組換えレトロウイルスの感染及び安定発現細胞の作製を行った。
AON1及びENA1のXP2OSSV細胞へのトランスフェクションは、FuGene HD (Promega) を用いて行った。
細胞株を12穴プレートの各穴に2.4 × 104個播種し、37℃で一晩培養した。紫外線をさまざまな線量照射した後、37℃で3日間培養した。培地を除いた後、CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent (Promega) を培地で6倍希釈した溶液を各穴に加えた。37℃でインキュベーションした後、各サンプルの490 nmの吸光度を測定し、各線量照射時の生存率を測定した。
細胞株を10 cmディッシュに播種し、約80%コンフルエントに達するまで培養した。培地に6 mM チミジンを添加して2時間培養してDNA複製を停止させた後、培地を取り除き、殺菌灯 (Toshiba, GL-15) を用いて紫外線 (UVC) を10 J/m2の線量に達するまで照射した。線量率は紫外線強度計 (Topcon) を用いて測定した。再び6 mM チミジンを含む培地でさまざまな時間培養した後、QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) を用いてゲノムDNAを精製した。ゲノムDNA中の6-4光産物の定量はMoriらの方法 [Photochem Photobiol, 54, 225-232 (1991)] に従い、損傷を特異的に認識するモノクローナル抗体 (6-4M2) を用いたELISA法により行った。
<ESE(exonic splicing enhancer)の候補配列の同定>
入力された塩基配列を解析し、Exon Splicing Enhancer (ESE。SRタンパク質が結合し、スプライシングを誘導する)の位置を表示するプログラムであるESE Finder(http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi?process=home; Smith, P. J et al. Hum. Mol. Genet. 15(16): 2490-2508, 2006、 2006CartegniL. et al. Nucleic Acid Research, 2003, 31(13): 3568-3571, 2003)、Intronと比してExon に高頻度に出現し、かつconsensus splice siteよりもnon-consensus splice sitesに高頻度に出現する、6ntの配列を検出するプログラムであるRescue ESE(http://genes.mit.edu/burgelab/rescue-ese/; FairbrotherWG et al. Science 297(5583):1007-1013, 2002)、及び
スプライシングに重要な部位を予測するプログラムであるHuman Splicing Finder(http://www.umd.be/HSF3/; Zhang XH and Chasin LAa, Genes Dev. 18, 1241-1250, 2004)を用いて、ESE(exonic splicing enhancer)の候補配列を同定した。
(1)4塩基以上の自己相補的配列を含まない、(2)目的の領域に特異的に結合する(BLASTでの検索結果が、ヒトXPAのエクソン3以外の領域を含まない)及び(3)オリゴヌクレオチドの長さが30nt前後である、との3条件、上記ESEの解析結果、並びに既知のXPAの変異に基づき、XPAのエクソン3のスキッピングを誘導し得るAONを設計した。その結果を図6に示す。
上記で設計したAONの内、配列番号45(ATCCATAAATTCTTTCCCACATTCTTCGCA)で表される配列からなるAON(以下「AON1」と略記する)を400nM、800nM又は1600nM用いて、エクソン3スキッピングの誘導効果を検証した。まず、XP2OSSV細胞に上記のさまざまな濃度のAON1をトランスフェクションし、24時間後に全RNAを抽出してエクソン3のスキッピングを検出するプライマーセットを用いてRT-PCRを行った。増幅されたDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、臭化エチジウムで蛍光染色した結果を図7に示す。対照としてb-アクチンのcDNAを増幅するプライマーセットを用いて、同様にRT-PCRを行った。AON1を導入しなかった対照細胞(C)と比較して、特に1600 nMのAON1を用いた場合に、エクソン3がスキップされたmRNA量の増加が見られた。
次に、AON1の一部(2、5、8、11、14、17、20、23、26、29番目のヌクレオチド残基)のヌクレオシド構造をENAに置換したAON(以下「ENA1」と略記する)(配列番号46(A(T)CC(A)TA(A)AT(T)CT(T)TC(C)CA(C)AT(T)CT(T)CG(C)A)で表される)を用いて、エクソン3スキッピングの誘導効果を検討した。該配列中、括弧書きの塩基はENA修飾ヌクレオチド残基を示す。XP2OSSV細胞にさまざまな濃度のENA1をトランスフェクションし、24時間後に全RNAを抽出してエクソン3のスキッピングを検出するプライマーセットを用いてRT-PCRを行った(図8左)。その結果、ENA1はAON1よりも低濃度(400 nM)でエクソン3のスキッピングを誘導できることが示された。さらにENA1を200 nM又は400 nMの濃度でXP2OSSV細胞にトランスフェクションし、1日後(Day1)及び2日後(Day2)にエクソン3のスキッピングを検出したところ、Day1の方がより高い効果が見られた(図8右)。
ENA1を0 nM又は400 nMの濃度でXP2OSSV細胞にトランスフェクションし、1日後(Day1)又は2日後(Day2)に細胞抽出液を調製して抗XPA抗体によりウエスタンブロッティングを行った結果を図10に示す。野生型XPAタンパク質を発現するU2OS細胞(レーン1)及びエクソン3がスキップされたXPAのcDNAを導入して、変異タンパク質を安定発現させたXP2OSSV細胞(レーン6)を同時に解析した。各レーンにロードされた細胞抽出液量の比較のため、aチューブリン(TUBA)の検出を合わせて行った。
Claims (14)
- 配列番号1で表されるヌクレオチド配列中の連続する少なくとも15個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、XPA pre-mRNAのプロセシングにおけるエクソン3のスキッピングを誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 配列番号2〜7のいずれかで表されるヌクレオチド配列中の連続する少なくとも15個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 15〜40個のヌクレオチドからなる、請求項1又は2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 前記相補的なヌクレオチド配列が配列番号8〜23のいずれかで表されるヌクレオチド配列(但し、チミンはウラシルであってもよい)である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 前記相補的なヌクレオチド配列が配列番号24〜44のいずれかで表されるヌクレオチド配列(但し、チミンはウラシルであってもよい)である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 糖−リン酸骨格の1種以上の修飾を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 2’−O,4’−C−エチレン架橋核酸を含む、請求項6に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 全ヌクレオチドの1/3以上が2’−O,4’−C−エチレン架橋核酸である、請求項7に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 配列番号45又は46で表されるヌクレオチド配列からなる、請求項1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる、XPA pre-mRNAのプロセシングにおけるエクソン3のスキッピング誘導用試薬。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる、色素性乾皮症の治療剤。
- 前記色素性乾皮症がXPA遺伝子のIVS3-1G>C変異に起因する、請求項11に記載の剤。
- 哺乳動物に対し、請求項1〜9のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする、該哺乳動物における色素性乾皮症の治療方法。
- 色素性乾皮症の治療に使用するための、請求項1〜9のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
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EMBO MOLECULAR MEDICINE, 2013, VOL.5, PP.1128-1145, JPN6021037553, ISSN: 0004600590 * |
PNAS, 2005, VOL.102, PP.198-203, JPN6021037555, ISSN: 0004600588 * |
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THE JOURNAL OF GENE MEDICINE, 2002, VOL.4, PP.644-654, JPN6021037554, ISSN: 0004600589 * |
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