JP2019089821A - Ｔａｌｅｎに基づく遺伝子修正 - Google Patents

Abstract

【課題】ＴＡＬＥＮに基づく遺伝子修正に係る組成物を提供する。【解決手段】遺伝子突然変異遺伝子により引き起こされる遺伝性疾患または障害の処置での使用のための組成物は、初代線維芽細胞、ヒト初代線維芽細胞、および二倍体ヒト線維芽細胞からなる群から選択された細胞中で標的遺伝子における部位特異的な２本鎖ＤＮＡ破壊を誘導可能な第１のＴＡＬＥＮタンパク質をコードする核酸と、核酸ドナー配列とを含む。ドナー配列は、標的遺伝子における遺伝子突然変異の修正のための鋳型であり、遺伝性疾患が表皮水疱症であり、さらに標的遺伝子がＣＯＬ７Ａ１である。【選択図】図１

Description

本願は、ＴＡＬＥＮに基づく遺伝子修正に関する。

表皮水疱症（ＥＢ：Ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ ｂｕｌｌｏｓａ）は、皮膚を非常に脆弱にし、容易に水疱形成を引き起こすようにする、一群の遺伝的状況である。水疱および皮膚びらんは、擦り合わせまたは引っ掻きなどの軽度損傷または擦過に反応して形成される。この疾患の最も重篤で古典的な形態である劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ：Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ ｂｕｌｌｏｓａ）は、皮膚および粘膜の広範囲の水疱形成および瘢痕化を特徴とする。ＲＤＥＢと関連するＣＯＬ７Ａ１突然変異は、表皮を真皮に連結させる７型コラーゲンの機能を損ない、続いて擦過または軽度損傷の結果として起こる表皮および真皮の分離によって、ＲＤＥＢに伴う重篤な水疱形成および皮膚の広範囲の瘢痕化が引き起こされる。ＲＤＥＢを有する者は、不治の、しばしば致命的な皮膚水疱形成を呈し、高悪性度の扁平上皮癌に対するリスクが上昇する１。遺伝子増強療法（ｇｅｎｅ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）は有望であるが、挿入突然変異誘発のリスクがある。最新の遺伝子治療ツール（例えば、ウイルスが介在する遺伝子付加）は、ゲノムに無作為または半無作為に組み込まれる治療用遺伝子の機能的コピーの提供に依存する。無作為組み込みの結果として、カーゴが着地する遺伝子座の撹乱が起こり、遺伝子不活性化または制御不全（オフターゲット効果）の可能性が生じる。これらの結果、患者に対して生命を脅かす副作用が起こり得る。したがって、例えばＲＤＥＢおよび他の遺伝性障害のある患者の細胞における正確なゲノム編集のための人工転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）を本明細書中で記載する。

本明細書中で引用される参考文献は全て、それらの全体が参照により組み込まれる。

ＴＡＬＥＮ標的化、ヌクレアーゼ構造およびＣＯＬ７Ａ１遺伝子の修飾を示す図。（ａ）３番染色体上のＣＯＬ７Ａ１標的部位およびＴＡＬＥＮアレイ結合。ヒト３番染色体、および標的とされたエクソン１３における領域の概要が示される。矢印は、その後の分析のために使用されるプライマーセットを示し、斑状の灰色のボックス付きの線は、（ｆ）で使用されるドナーである。（ｂ）ＣＯＬ７Ａ１標的部位およびヌクレアーゼ複合体のコア構成要素。ＴＡＬＥＮは、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）ＴＡＬＥの１５２残基のＮ末端欠失と、それに続く反復ドメイン、およびＦｏｋＩヌクレアーゼの触媒ドメインに融合される＋６３Ｃ末端サブ領域から構成される。（配列番号３３；配列番号３４）（ｃ）反復可変性二残基（ＲＶＤ：Ｒｅｐｅａｔ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）塩基認識。ＲＶＤ ＮＮ、ＮＩ、ＨＤおよびＮＧ（グアニン、アデニン、シトシンおよびチミンにそれぞれ結合）は、１ｂにおける対応する全長アレイに対してコードされる。（ｄ）ＴＡＬＥＮにより生じた（稲妻マーク）２本鎖ＤＮＡ破壊（ＤＳＢ：ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｂｒｅａｋ）の略図および破壊修復のために使用される、可能性のある細胞修復機構。（配列番号３５；配列番号３６）。（ｅ）ＴＡＬＥＮ処理細胞のサンガー配列決定によるエラープローン非相同末端結合評価。制限サイクルＰＣＲを行い、続いてショットガンクローニングを行い；７５クローンの配列決定を行い、６４個がゲノムデータベースに対して１００％アライメントを示し、１１個が、破線として示される非相同末端結合（ＮＨＥＪ：ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ）誘導性欠失を示した。ＴＡＬＥＮ左および右標的部位は、太字の大文字とし、スペーサ配列は小文字とする。欠失総塩基は右に示し、「ｄｅｌ」として符号を示し、続いて失われた塩基数を示す。（ｆ）相同組み換え修復（ＨＤＲ：Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）。１本鎖オリゴヌクレオチドドナー（ｓｓＯＤＮ：ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｏｎｏｒ）は、左アーム上に６５ｂｐのＣＯＬ７Ａ１遺伝子相同性を含有し、右に特有のプライマー部位（斑状、灰色ボックス）となる短い外来配列がある１０１ｂｐを含有した。３回のプライマーＰＣＲは、内在性プライマー対（ｉ．およびｉｉｉ．と表示される矢印で示される）での増幅をもたらす。ＯＤＮのＴＡＬＥＮ挿入は、プライマー対ｉｉ．およびｉｉｉ．により生成される第２のより小さいＰＣＲ産物サイズをもたらす。ＴＡＬＥＮ処理細胞の下部の数字はデンシトメトリーにより決定されるＨＤＲの比率を示す。（配列番号３７〜（配列番号４８）。 サーベイヤ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ）ヌクレアーゼアッセイにより評価したＣＯＬ７Ａ１遺伝子のＴＡＬＥＮ修飾を示す図。ＲＤＥＢ繊維芽細胞におけるサーベイヤヌクレアーゼによるＮＨＥＪ評価。約３５０ｂｐ断片の制限サイクルＰＣＲを行い、続いてサーベイヤミスマッチアッセイを行った。ＴＡＬＥＮ誘導ＮＨＥＪは、約２００および３００ｂｐの予想可能なバンドパターンにより証明される（矢印）。右は、対照細胞における非修飾ＣＯＬ７Ａ１遺伝子座である。 ＴＡＬＥＮ ＣＯＬ７Ａ１ドナー設計および相同組み換え修復を示す図。（ａ）星印により示された突然変異があるＣＯＬ７Ａ１遺伝子座。下はドナーであって、内在性遺伝子座との関係でアライメントされており、７０６ｂｐ長の左アームのＣＯＬ７Ａ１ゲノム配列から構成されるされているとともに該ゲノム遺伝子座に対して１００％相同である。左アームと右アームとの間には、ｌｏｘＰが導入されたＰＧＫピューロマイシンカセットが、エクソン１２とエクソン１３との間のイントロンにノックインされるように設計されている（ボックス、ｌｏｘｐ部位は隣接する矢印により示される）。右アームは、８０６ｂｐ長であるとともに５塩基の変化を含有した。これらのうち４個は、ＨＤＲに基づく事象の判定のためのマーカとして機能するサイレント点突然変異多型（ＳＰＭＰ：ｓｉｌｅｎｔ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）であり（上流および下流と呼ぶ）；最後のものは、未成熟な終止コドンを修正する正常化塩基であった。このボックスは、互いの１０ｂｐ内に置かれた３個のＳＰＭＰを表す。正常（すなわち突然変異復帰）塩基は、ボックスにより示され、ＡｐａＩ制限酵素部位を除去する末端（下流）ＳＰＭＰは、黒色のボックスにより表される。稲妻マークは、ＴＡＬＥＮ標的部位を示し、ＰＣＲプライマー（黒色の矢印）は、一方がドナーアーム内にあり、他方がその外側にあるように設計されており；示されるように分析のために利用される。（配列番号４９）。ＲＤＥＢ繊維芽細胞におけるＳＰＭＰ検出。ＴＡＬＥＮ処置およびＰＣＲ増幅とそれに続くＡｐａＩでの消化およびサンガー配列決定により、（ｂ）ドナー由来であるＡｐａＩ耐性ＳＰＭＰであって、ＴＡＬＥＮ切断および鋳型としての外来性ドナーを用いた相同組み換え修飾後にのみ存在し得る該ＡｐａＩ耐性ＳＰＭＰの存在、（配列番号５０）（ｃ）ヘテロ接合性ＨＤＲ事象が起こったことを示す非修飾塩基（ＡｐａＩ感受性）（配列番号５１）が示される。 ＰＧＫピューロマイシンのＣｒｅレコンビナーゼ切断を示す図。（ａ）ｌｏｘＰが導入されたＰＧＫピューロマイシンを伴うドナーの概要。ピューロマイシン耐性繊維芽細胞へのＣｒｅレコンビナーゼプラスミドの導入は、ピューロマイシン導入遺伝子の除去をもたらした。（ｂ）ゲノムｌｏｘｐ／ＣＯＬ７Ａ１結合。ＲＤＥＢ ＴＡＬＥＮ／ドナー処理細胞におけるエクソン１２とエクソン１３との間のイントロンにおけるｌｏｘＰフットプリント（三角／下の配列）の存在を明らかにするために、ＰＣＲを使用した。（配列番号５２）。 初期交叉事象配列分析を示す図。（ａ）ドナーに導入されるマーカ配列に対する凡例。矢印＝上流ＳＰＭＰ、線＝ＲＤＥＢに対する原因となる１８３７塩基、矢印＝下流ＳＰＭＰ。（配列番号５３）。上流交叉事象。サンガー配列決定は、（ｂ）上流ＳＰＭＰの組み込み、（ｃ）塩基１８３７での突然変異の維持（配列番号５４；（配列番号５５）、および（ｄ）下流ＳＰＭＰの不存在（配列番号５６；（配列番号５７）を示し、ＨＤＲがドナーから生じたが、突然変異を修正できなかったことを示唆する。Ｄ（配列番号５８；（配列番号５９）を含むために凡例を固定した。 推定初期交叉事象の概要を示す図。（ａ）ＴＡＬＥＮアレイが標的配列に結合することが示されるとともに、ドナーが下に示される。（ｂ）標的部位への結合およびＴＡＬＥＮ二量体形成が、２本鎖ＤＮＡ破壊（稲妻）、および修復鋳型としてドナーを用いたＨＤＲの刺激に介在する。（ｃ）理論的交叉事象。内在性ＤＮＡおよびドナーのアライメントの結果、上流ＳＰＭＰ（ボックス）が組み込まれるような態様で遺伝物質が交換される交叉事象（交叉＃１）が起こる一方で、第２の交叉（矢印／交叉＃２）事象が修正塩基の上流および下流ＳＰＭＲで起こる。（ｄ）突然変異塩基（ボックス）が維持される、部分的ドナー配列（線およびボックス）を含有する、分割されたゲノム配列。 ＨＤＲおよび正常ｍＲＮＡ産生の概要を示す図。（ａ）稲妻マークにより示されるＴＡＬＥＮ標的部位がある、突然変異内在性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子座。突然変異塩基が示され、下は、（ｂ）エクソン１２から、エクソン１５とエクソン１６との間のイントロンまでのドナー由来配列の永久的存在による遺伝子座の修復をもたらすドナーである。（ｃ）ｍＲＮＡ分析。表示されるプライマーは、同じアンプリコンで修正塩基（ボックスおよびＡｐａＩ ＳＰＭＰ黒色ボックス）を含有する生成物を増幅した。 ドナーのＴＡＬＥＮ切断の配列分析を示す図。（配列番号６０）。（ａ）直接サンガー配列決定によってＴＡＬＥＮ処理ＲＤＥＢ繊維芽細胞由来のｃＤＮＡを分析した。ＴＡＬＥＮ部位に対して赤いボックスで輪郭を描く（部位の残り部分が隣接イントロン内であるため、それが部分的ＴＡＬＥＮ配列であることに留意されたい。矢印はエクソン／エクソン境界を示す）。ＲＤＥＢ突然変異は下線が付され、野生型状態への復帰を示した（突然変異体＝Ｔ、正常＝Ｃ）。下流ＡｐａＩ ＳＰＭＰが存在し、それが示されている。配列アライメントは、上がドナーによりコードされると予想されるｃＤＮＡ配列のもの、および下が回復した配列のものである。破線／ギャップは、続くＮＨＥＪを誘導したＨＤＲ後ＴＡＬＥＮ切断に起因すると思われる欠失を示す（非相同末端結合）。（配列番号６１；配列番号６２）。 ＨＤＲを用いたＣＯＬ７Ａ１のＴＡＬＥＮ介在遺伝子編集ならびに得られた正常化遺伝子およびタンパク質発現を示す図。（ａ）野生型状態への突然変異の変換があるＴＡＬＥＮ修正細胞、（配列番号６４）および（ｂ）免疫蛍光により評価したＶＩＩ型コラーゲン産生の回復。（ｃ）同型接合ＲＤＥＢ未成熟終止コドンｃＤＮＡ配列決定、（配列番号６５）および（ｄ）ＶＩＩ型コラーゲンタンパク質産生の欠如。（ｅ）野生型ＣＯＬ７Ａ１遺伝子座のサンガー配列決定、（配列番号６６）および（ｆ）ＶＩＩ型コラーゲン発現。同時に細胞を染色し、共焦点顕微鏡露光時間および機器設定は同一であった。ＤＡＰＩで核を染色し、青色で示す。 ＴＡＬＥＮ修正繊維芽細胞からのｍＲＮＡのサンガー配列決定を示す図。（ａ）繊維芽細胞クローン１〜１９（配列番号６７；配列番号６８）および（ｂ）１〜２１は、修正された塩基（線）および下流ＳＰＭＰ（矢印）の存在を示した。（配列番号６９；配列番号７０）。 ＴＡＬＥＮ組み込みマッピングプロファイルを示す図。（ａ）ゲノム遺伝子座を永久的にマーキングするＧＦＰカーゴを受容するＴＡＬＥＮ誘導性ＤＮＡ破壊の概要。（ｂ）２９３細胞におけるＴＡＬＥＮおよびＩＤＬＶ同時発現の結果、安定したＧＦＰ細胞が得られた（ＴＡＬＥＮおよびＩＤＬＶ送達から６週間後にフローサイトメトリ分析を行った）。（ｃ）線形増幅が介在するＰＣＲに対する模式図。青色矢印はＬＡＭ ＰＣＲプライマーを示し、破線は、ＴＡＬＥＮ誘導性ＩＤＬＶゲノム融合断片を決定するために続いてクローニングし、マッピングした線形増幅の生成物を表す。（ｄ）（ｎｒ）ＬＡＭ ＰＣＲ／ＰＣＲにより組み込み体を同定した。ＬＡＭ ＰＣＲ配列回収およびゲノムデータベース検索によって、ＩＤＬＶが組み込まれた５つの部位が明らかになった。ＣＯＬ７Ａ１標的部位および、７、１６、１および５番染色体の４つのオフターゲット部位のスペーサ領域に配列がマッピングされた（後者の配列でコーディングエクソン由来のものはなかった）。（配列番号７１〜７５）。 インテグラーゼ欠損型レンチウイルスを示す図。（ａ）欠損型インテグラーゼを用いて作製されたＧＦＰウイルスカセットの概要。（ｂ）９日間の連続的分析にわたる、ＴＡＬＥＮの非存在下での２９３ ＩＤＬＶ ＧＦＰ発現経時変化から、ＧＦＰの急速な喪失が示される。 コンストラクトを示す図。 コンストラクトを示す図。

（発明の概要）
本発明は、突然変異の部位特異的な修正を提供することによって、オフターゲット効果を克服する。突然変異の修正は、細胞の形質転換または遺伝子移入によって遂行され得る。細胞は、繊維芽細胞、ケラチン産生細胞、誘導型多能性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、造血子孫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、グリア細胞、神経細胞、神経膠前駆細胞、神経膠幹細胞、筋肉細胞、肺細胞、膵臓細胞、肝臓細胞および網内系の細胞からなる群から選択され得る。

ある実施形態は、遺伝子突然変異により引き起こされる遺伝性疾患または障害を処置するための方法であって、ＴＡＬＥＮをコードする１つ以上の核酸および核酸ドナー配列と細胞を接触させることを含み、ＴＡＬＥＮタンパク質がその細胞中で発現され、標的遺伝子において部位特異的な２本鎖ＤＮＡ破壊を誘導し、ドナー配列が、遺伝性疾患または障害を処置するために、遺伝子突然変異の修正をもたらすＤＮＡ修復のための鋳型であり、正確な遺伝子発現をもたらす、方法を提供する。ある実施形態において、細胞は、繊維芽細胞、ケラチン産生細胞、誘導型多能性、造血、間葉系または胚性幹細胞、造血子孫細胞（Ｔ細胞またはＢ細胞など）、グリアおよび神経細胞、神経膠前駆細胞および幹細胞、筋肉細胞、肺細胞、膵臓および／または肝臓細胞および／または網内系の細胞である。本発明は、遺伝子突然変異により引き起こされる遺伝性疾患または障害を処置するための１つ以上の核酸の使用であって、前記１つ以上の核酸が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）および核酸ドナー配列をコードし、ＴＡＬＥＮタンパク質が細胞において発現されて、標的遺伝子において部位特異的な２本鎖ＤＮＡ破壊を誘導し、ドナー配列が、遺伝性疾患または障害を処置するためにＤＮＡ修復のための鋳型であり、その結果、遺伝子突然変異の修正が起こり、正確な遺伝子発現をもたらす、使用をさらに提供する。

この一実施形態において、ＴＡＬＥＮは左ＴＡＬＥＮであり、標的遺伝子において２本鎖破壊をなすために左ＴＡＬＥＮと協働する右ＴＡＬＥＮをさらに含む。別の実施形態において、ＴＡＬＥＮをコードする核酸および／または核酸ドナー配列は、ベクターまたはプラスミドの一部である。ある実施形態において、ＴＡＬＥＮは、スペーサ（例えばスペーサ配列は１２〜３０ヌクレオチド長である）を含む。

ある実施形態において、標的遺伝子は、遺伝子変化／突然変異がある遺伝子である。例えば、ある実施形態において、標的遺伝子はＣＯＬ７Ａ１（例えばタンパク質の異常な発現を引き起こす突然変異があるもの）である。

ある実施形態において、遺伝性疾患は、表皮水疱症、骨形成不全症、先天性角化不全症、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）、ファンコニ貧血、スフィンゴリピドーシス、リポフスチン沈着症、副腎白質ジストロフィー、重症複合型免疫不全、鎌状赤血球貧血またはサラセミアである。

ある実施形態は、遺伝子突然変異により引き起こされる遺伝性疾患または障害を処置するための方法であって、ａ）細胞に（ｉ）第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ）エフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第１の核酸、（ｉｉ）第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第２の核酸および（ｉｉｉ）およびドナー配列を導入する工程であって、前記第１および第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体のそれぞれが、複数のＴＡＬエフェクター反復配列およびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを含み、前記複数のＴＡＬエフェクター反復配列のそれぞれが反復可変性二残基（ｒｅｐｅａｔ−ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）を含み、前記第１のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が、前記細胞内での標的ＤＮＡの第１のハーフサイト配列への結合能を含むとともに、前記第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が標的ＤＮＡの第２のハーフサイト配列に結合されるときに前記標的ＤＮＡを切断する能力を含み、前記標的ＤＮＡが、スペーサ配列によって分離される第１のハーフサイト配列および第２のハーフサイト配列を含み、前記第１および第２のハーフサイトが同じヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有し、前記ドナー配列が、少なくとも標的配列の５’および３’末端で標的に対する相同性および事前に選択された遺伝子変化を含み、かつ、遺伝子突然変異の修正をもたらすＤＮＡ修復のための鋳型である、該導入工程；および、（ｂ）突然変異を修正し、かつ、正確な遺伝子発現を復元するために、第１および第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が発現される条件下で細胞を培養する工程を含む、方法を提供する。第１および第２の核酸のそれぞれは、（スペーサ配列とは異なる）スペーサを含み得る。スペーサ配列は、複数のＴＡＬエフェクター反復配列とＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインとの間に置かれ得る。スペーサ配列は１２〜３０ヌクレオチドであり得る。さらなる実施形態において、本発明は、遺伝子突然変異により引き起こされる遺伝性疾患または障害を処置するための１つ以上の核酸の使用であって、（ｉ）第１の核酸が、第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードし、（ｉｉ）第２の核酸が、第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードし、（ｉｉｉ）およびドナー配列であり、前記第１および第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体のそれぞれが、複数のＴＡＬエフェクター反復配列およびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを含み、前記複数のＴＡＬエフェクター反復配列のそれぞれが反復可変性二残基を含み、前記第１のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が、前記細胞内での標的ＤＮＡの第１のハーフサイト配列への結合能を含み、かつ、前記第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が標的ＤＮＡの第２のハーフサイト配列に結合されるときの前記標的ＤＮＡに対する切断能を含み、前記標的ＤＮＡが、スペーサ配列によって分離される第１のハーフサイト配列および第２のハーフサイト配列を含み、前記第１および第２のハーフサイトが同じヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有し、前記ドナー配列が、少なくとも標的配列の５’および３’末端で標的に対する相同性および事前に選択された遺伝子変化を含み、かつ、遺伝子突然変異の修正をもたらすＤＮＡ修復のための鋳型であり；および（ｂ）突然変異を修正し、正確な遺伝子発現を修復するために、第１および第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が発現される条件下で細胞を培養することである、使用を提供する。

別の実施形態は、ドナー配列を含む核酸であって、このドナー配列が遺伝子突然変異の修正をもたらす部位特異的なＤＮＡ修復のための鋳型であり、このドナー配列は、少なくとも標的配列の５’および３’末端に対する相同性を含み、このドナー配列の一部分は、ＴＡＬＥＮタンパク質と併せて使用するための標的配列を修正するための修復配列を含む、核酸を提供する。ある実施形態において、ドナーは配列番号２２を含む。別の実施形態において、この標的はＣＯＬ７Ａ１（突然変異がある遺伝子）である。ある実施形態において、ドナーの５’および３’末端はそれぞれ標的に対する少なくとも１００塩基の配列同一性を有する。

別の実施形態において、核酸は、配列番号２９または３０を含む。ある実施形態は、ＴＡＬＥＮ核酸によりコードされるかまたは発現されるタンパク質を提供する。
ある実施形態は、ドナー配列を含むベクターまたはプラスミドであって、このドナー配列は、遺伝子突然変異の修正をもたらす部位特異的なＤＮＡ修復のための鋳型であり、このドナー配列は、少なくとも標的配列の５’および３’末端に対する相同性を含み、このドナー配列の一部分は、ＴＡＬＥＮタンパク質と併せて使用するための標的配列を修正するための修復配列を含む、ベクターまたはプラスミドを提供する。ある実施形態において、ドナーは配列番号２２を含む。ある実施形態において、標的はＣＯＬ７Ａ１（突然変異あり）である。ある実施形態において、ドナーの５’および３’末端はそれぞれ標的に対して少なくとも１００塩基の配列同一性を有する。ある実施形態は、配列番号２２、３１、２８、２９または３０のうち１つ以上を含むベクターまたはプラスミドを提供する。別の実施形態は、外来配列番号２２、３１、２８、２９もしくは３０のうち１つ以上またはこのような配列から発現されるタンパク質を含む、単離宿主細胞を提供する。別の実施形態は、配列番号２２、３１、２８、２９もしくは３０またはこのような配列から発現されるタンパク質を含む、遺伝子移入された細胞株を提供する。

ある実施形態は、遺伝子突然変異により引き起こされる遺伝性疾患または障害を処置するための方法であって、ＴＡＬＥＮをコードする核酸と細胞を接触させることを含み、このＴＡＬＥＮが突然変異を修正し、例えば、正確な遺伝子発現を修復するかまたは遺伝子発現を促進する、方法を提供する。ある実施形態において、細胞は繊維芽細胞である。別の実施形態において、ＴＡＬＥＮは左ＴＡＬＥＮであり、ＤＮＡ中で２本鎖切断をなすために左ＴＡＬＥＮと協働する右ＴＡＬＥＮをさらに含む。ある実施形態において、核酸分子はベクターである。別の実施形態において、核酸分子はプラスミドである。ある実施形態において、ＴＡＬＥＮはスペーサを含み、例えば１２〜３０ヌクレオチド長などである。ある実施形態において、遺伝性疾患は表皮水疱症である。

別の実施形態は、遺伝子突然変異により引き起こされる遺伝性疾患または障害を処置するための方法であって、ａ）（ｉ）第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第１の核酸および（ｉｉ）第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第２の核酸を細胞に導入する工程であって、前記第１および第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体のそれぞれが、複数のＴＡＬエフェクター反復配列およびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを含み、前記複数のＴＡＬエフェクター反復配列のそれぞれが反復可変性二残基を含み、第１のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が、細胞内での標的ＤＮＡの第１のハーフサイト配列への結合能を含み、かつ、第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が標的ＤＮＡの第２のハーフサイト配列に結合されるときの標的ＤＮＡの切断能を含み、前記標的ＤＮＡが、スペーサ配列によって分離される第１のハーフサイト配列および第２のハーフサイト配列を含み、前記第１および第２のハーフサイトが同じヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有する、該導入工程；および、（ｂ）突然変異を修正し、かつ、正確な遺伝子発現を復元するために、第１および第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が発現される条件下で細胞を培養する工程を含む、方法を提供する。

本発明は、ＴＡＬＥＮをコードする核酸および核酸ドナー配列を提供し、ここで、ＴＡＬＥＮタンパク質が細胞において発現される場合、ＴＡＬＥＮタンパク質は標的遺伝子において部位特異的な２本鎖ＤＮＡ破壊を誘導し、さらに、ドナー配列は、遺伝性疾患または障害を処置するために、遺伝子突然変異の修正をもたらすＤＮＡ修復に対する鋳型であり、正確な遺伝子発現をもたらす。本発明は、核酸を提供し、ここで細胞は、繊維芽細胞、ケラチン産生細胞、誘導型多能性、造血、間葉系または胚性幹細胞、造血子孫細胞（Ｔ細胞またはＢ細胞など）、グリアおよび神経細胞、神経膠前駆および幹細胞、筋肉細胞、肺細胞、膵臓および／または肝臓細胞および／または網内系の細胞である。本発明は、核酸を提供し、ここでＴＡＬＥＮは左ＴＡＬＥＮであり、標的遺伝子において２本鎖破壊をなすために左ＴＡＬＥＮと協働する右ＴＡＬＥＮをさらに含む。右ＴＡＬＥＮは、この核酸または第２の核酸によりコードされ得る。左ＴＡＬＥＮおよび右ＴＡＬＥＮは、複数のＴＡＬエフェクター反復配列およびエンドヌクレアーゼドメインを含み得る。左および右ＴＡＬＥＮのそれぞれは、スペーサ（スペーサ配列とは異なる）を含み得る。スペーサ配列は、複数のＴＡＬエフェクター反復配列とエンドヌクレアーゼドメインとの間に置かれ得る。スペーサ配列は、１２〜３０ヌクレオチドの配列によりコードされ得る。本発明は、核酸を提供し、ここでＴＡＬＥＮをコードする核酸および／または核酸ドナー配列は、ベクターまたはプラスミドの一部である。本発明は、核酸を提供し、ここで標的遺伝子は、遺伝子変化／突然変異がある遺伝子である。本発明は、核酸を提供し、ここで標的遺伝子はＣＯＬ７Ａ１である。本発明は、核酸を提供し、ここでＴＡＬＥＮはスペーサを含む。本発明は、核酸を提供し、ここでスペーサ配列は１２〜３０ヌクレオチド長である。本発明は、核酸を提供し、ここで遺伝性疾患は、表皮水疱症、骨形成不全症、先天性角化不全症、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）、ファンコニ貧血、スフィンゴリピドーシス、リポフスチン沈着症、副腎白質ジストロフィー、重症複合型免疫不全、鎌状赤血球貧血またはサラセミアである。本発明は、核酸を提供し、ここで遺伝性疾患は表皮水疱症である。本発明は、少なくとも１つの核酸であって、（ｉ）第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第１の核酸、（ｉｉ）第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第２の核酸、および（ｉｉｉ）およびドナー配列を含み、前記第１および第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体のそれぞれは、複数のＴＡＬエフェクター反復配列およびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを含み、前記複数のＴＡＬエフェクター反復配列のそれぞれが反復可変性二残基を含み、前記第１のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体は、前記細胞内での標的ＤＮＡの第１のハーフサイト配列への結合能を含み、かつ、前記第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が標的ＤＮＡの第２のハーフサイト配列に結合されるときの前記標的ＤＮＡに対する切断能を含み、前記標的ＤＮＡは、スペーサ配列によって分離される第１のハーフサイト配列および第２のハーフサイト配列を含み、前記第１および第２のハーフサイトは同じヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有し、前記ドナー配列は、少なくとも標的配列の５’および３’末端で標的に対する相同性および事前に選択された遺伝子変化を含み、かつ、遺伝子突然変異の修正をもたらすＤＮＡ修復のための鋳型である、核酸と；（ｂ）突然変異を修正し、かつ、正確な遺伝子発現を復元するために、第１および第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が発現される条件下で細胞を培養することとを提供する。本発明は、核酸によりコードされるかまたは発現されるタンパク質を提供する。本発明は、核酸を含むベクターまたはプラスミドを提供する。本発明は、核酸を含む単離宿主細胞を提供する。

本発明は、遺伝子突然変異により引き起こされる遺伝性疾患または障害を処置するための、本発明の、核酸、ベクター、宿主細胞およびタンパク質の使用を提供する。
（発明の詳細な説明）
本発明は、易感染性の遺伝性障害がある患者を処置するためのヒトゲノムおよびヒト細胞との関連における、疾患を引き起こす突然変異の、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が介在するＤＮＡ編集を対象とする。これは、無作為または半無作為にゲノムに組み込む治療用遺伝子の機能的コピーの提供に依存する以前の遺伝子治療試行／ツールを上回る進歩である。以前の遺伝子治療法の結果として、カーゴが着地する遺伝子座の撹乱が起こり、遺伝子不活性化または制御不全が生じる可能性がある。これらの結果、生命を脅かす副作用が起こり得る。本明細書中に記載のアプローチは、例えばゲノムの残りの部分を元の状態に維持しながら突然変異スポットのみを修正する、ヒト遺伝子に対するテーラーメードのＴＡＬＥＮを使用することによって、安全性および有効性を最大化し、言い換えると、残りのゲノムを破壊せず、したがって既存の技術に付随するオフターゲット効果（例えばウイルスが介在する遺伝子付加）を排除する。これは新規アプローチであり、細胞、例えばヒト細胞中での疾患を引き起こす突然変異の、ＴＡＬＥＮが介在する、導入遺伝子を含まない修正による最初の個人向け遺伝子治療である。したがって、この技術は細胞、例えばヒト細胞などにおいて使用され得、正常な細胞機能の回復により機能喪失突然変異が継ぎ目なく修正され得るようになる。他の実施形態において、遺伝子発現が促進され得る。

定義
本発明を記載し、主張することにおいて、下記で示される定義に従い、次の技術用語を使用する。別段の定めがない限り、本明細書中で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書中に記載のものと同様または均等な何らかの方法および材料が使用され得る。ラジカル、置換基および範囲に対して下記で列挙される具体的なおよび好ましい値は単なる例示であり、ラジカルおよび置換基に対して定められる他の値または定められる範囲内の他の値を排除するものではない。

本明細書中で使用される場合、冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、冠詞の文法目的の、１つまたは複数、すなわち少なくとも１つを指す。例として、「１つの要素」は、１つの要素または複数の要素を意味する。

「約」という用語は、本明細書中で使用される場合、およそ、その範囲の、おおよそまたはその前後を指す。数字的な範囲と組み合わせて「約」という用語が使用される場合、これは、示される数値の上下で境界を拡大することによってその範囲を修飾する。一般に、「約」という用語は、本明細書中で、２０％の変動により述べられる値の上下で数値を修飾するために使用される。

「単離される」という用語は、因子、１つ以上の因子を伴わない１つまたは複数の細胞、因子を伴う細胞または１つ以上の細胞成分、１つまたは複数のインビボ細胞を指す。
「細胞」は、脊椎動物、例えばヒトを含む哺乳動物からの細胞であり、または「対象」は、脊椎動物、例えばヒトを含む哺乳動物である。哺乳動物としては、ヒト、家畜、競走用の動物および愛玩動物が挙げられるが限定されない。「動物」という用語に含まれるのは、イヌ、ネコ、魚、スナネズミ、モルモット、ハムスター、ウマ、ウサギ、ブタ、マウス、サル（例えば、類人猿、ゴリラ、チンパンジーまたはオランウータン）、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシおよびトリである。

「対照」対象は、同様のタイプの疾患など、試験対象と同じ特徴を有する対象である。対照対象は、例えば処置または試験されている試験対象と全く同時にまたは殆ど同時に試験され得る。対照対象はまた、例えば、試験対象が試験される時間と別の時間にも試験され得、対照対象の試験の結果は、記録された結果が試験対象の試験により得られる結果と比較され得るように、記録され得る。

「試験」対象は、処置されている対象である。
「疾患」は、ホメオスタシスを維持することができない対象の健康状態であり、疾患が改善されない場合、対象の健康が悪化し続ける。対して、対象における「障害」は、対象がホメオスタシスを維持できるが、対象の健康状態が障害がない場合よりも好ましくない健康状態である。しかし、上述のような「疾患」および「障害」の定義は、具体的な習慣性疾患または障害に関連する定義または一般的使用に優先するものではない。

疾患、状態または障害は、例えば疾患または障害の症状の重症度、患者にこのような症状が出る頻度、またはその両方が軽減する場合、「改善」されている。
本明細書中で使用される場合、「有効量」は、例えば、疾患または障害の症状の改善など、選択された効果を生じさせるのに十分な量を意味する。

「発現のレベルを測定する」または「発現のレベルを決定する」という用語は、本明細書中で使用される場合、例えば、関心のある遺伝子またはタンパク質の発現のレベルとアッセイの結果を相互比較するために使用され得る何らかの測定またはアッセイを指す。このようなアッセイには、ｍＲＮＡ、タンパク質レベルなどのレベルを測定することが含まれ、ノーザンおよびウエスタンブロット分析、結合アッセイ、免疫ブロットなどのアッセイによって行われ得る。発現のレベルは発現率を含み得、存在するｍＲＮＡまたはタンパク質の実際の量について測定され得る。

本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容可能な担体」という用語は、例えば標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション、例えば油／水または水／油エマルションなど、および様々なタイプの湿潤剤の何れをも含む。この用語はまた、米国連邦政府の規制官庁により承認されるかまたはヒトを含む動物での使用について米国薬局方で列挙される物質の何れをも包含する。

「医薬的に許容可能な塩」という用語は、例えば、本発明の化合物の生物学的有効性および特性を保持し、生物学的にまたは他の面で望ましくないものではない塩を指す。多くの場合において、本発明の化合物は、アミノおよび／またはカルボキシル基またはそれらと同様の基の存在によって、酸性および／または塩基性塩を形成可能である。

「特異的に結合する」という用語は、本明細書中で使用される場合、例えば、特異的な分子を認識し、それに結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識しないかまたはそれに結合しない分子を意味する。

「症状」という用語は、本明細書中で使用される場合、例えば、患者によって体験されるとともに疾患を示す、何らかの病的な現象、もしくは構造、機能または感覚における正常からの逸脱を指す。

本明細書中で使用される場合、「処置する」という用語は、具体的な疾患、障害または状態の予防または具体的な疾患、障害または状態に付随する症状の改善および／または症状の予防もしくは消去を含み得る。「予防的」処置は、例えば、疾患に付随する病態を発現するリスクを低下させる目的のために、疾患の徴候を呈さないかまたは疾患の初期の兆候のみを呈する対象に施される処置である。「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、本明細書中で「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」と交換可能に使用される。

「治療的」処置は、例えば、症状を軽減するかまたは消去する目的のために、病変の症状を呈する対象に施される処置である。
化合物の「治療的有効量」は、例えば化合物が投与される対象に有益な効果を提供するのに十分な化合物の量である。

本明細書中で使用される場合、「アミノ酸」は、次の表で示されるように、そのフルネームにより、それに対応する三文字コードにより、またはそれに対応する一文字コードにより、表される。
フルネーム 三文字コード 一文字コード
アスパラギン酸 Ａｓｐ Ｄ
グルタミン酸 Ｇｌｕ Ｅ
リジン Ｌｙｓ Ｋ
アルギニン Ａｒｇ Ｒ
ヒスチジン Ｈｉｓ Ｈ
チロシン Ｔｙｒ Ｙ
システイン Ｃｙｓ Ｃ
アスパラギン Ａｓｎ Ｎ
グルタミン Ｇｌｎ Ｑ
セリン Ｓｅｒ Ｓ
スレオニン Ｔｈｒ Ｔ
グリシン Ｇｌｙ Ｇ
アラニン Ａｌａ Ａ
バリン Ｖａｌ Ｖ
ロイシン Ｌｅｕ Ｌ
イソロイシン Ｉｌｅ Ｉ
メチオニン Ｍｅｔ Ｍ
プロリン Ｐｒｏ Ｐ
フェニルアラニン Ｐｈｅ Ｆ
トリプトファン Ｔｒｐ Ｗ
「アミノ酸」という表現は、本明細書中で使用される場合、天然および合成アミノ酸の両方ならびにＤおよびＬアミノ酸の両方を含むものとする。「標準的アミノ酸」は、天然のペプチドで一般に見られる２０種類の標準的なＬ−アミノ酸の何れかを意味する。「非標準的アミノ酸残基」は、それが合成により調製されるかまたは天然源由来であるかにかかわらず、標準的なアミノ酸以外の何らかのアミノ酸を意味する。本明細書中で使用される場合、「合成アミノ酸」はまた、化学的に修飾されたアミノ酸も包含し、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）および置換が挙げられるが限定されない。本発明のペプチド内に含有されるアミノ酸は、特にカルボキシまたはアミノ末端で、メチル化、アミド化、アセチル化またはそれらの活性に悪影響を与えることなくペプチドの循環半減期を変化させ得る他の化学基での置換により修飾され得る。さらに、ジスルフィド結合は、本発明のペプチド中に存在してもよく、または存在しなくてもよい。

「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と交換可能に使用され、遊離アミノ酸およびペプチドのアミノ酸残基を指し得る。この用語が遊離アミノ酸を指すかまたはペプチドの残基を指すかは、用語が使用される文脈から明らかとなる。

アミノ酸は、側鎖Ｒに基づき７つの群に分類され得る：（１）脂肪族側鎖；（２）ヒドロキシル（ＯＨ）基を含有する側鎖；（３）硫黄原子を含有する側鎖；（４）酸性基またはアミド基を含有する側鎖；（５）塩基性基を含有する側鎖；（６）芳香環を含有する側鎖；および（７）側鎖がアミノ基に融合されるプロリン、イミノ酸。

本明細書中で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」という用語は、次の５つの群のうち１つ内での交換として本明細書中で定義される。
Ｉ．小型、脂肪族、非極性または僅かに極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性、負荷電残基およびそれらのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．極性、正電荷残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
ＩＶ．大型、脂肪族、非極性残基：
Ｍｅｔ Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
Ｖ．大型、芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
本明細書中で使用される場合、「核酸」という用語は、ＲＮＡならびに１本、２本および３本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを包含する。さらに、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語および同様の用語はまた、核酸類似体、すなわちホスホジエステルバックボーン以外を有する類似体も含む。例えば、当技術分野で公知であり、バックボーン中でホスホジエステル結合のかわりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内とみなされる。「核酸」とはまた、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドから構成されるか、およびホスホジエステル結合または修飾結合、例えばホスホトリエステル、ホスホールアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホールアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホールアミデート、架橋ホスホールアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートまたはスルホン結合およびこのような結合の組み合わせから構成されるかに関わらず、あらゆる核酸も意味する。核酸という用語はまた、具体的に、５種類の生体に存在する塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基から構成される核酸も含む。ポリヌクレオチド配列を記載するために従来の表記法が本明細書中で使用され：１本鎖ポリヌクレオチド配列の左手の末端は５’末端であり；２本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写産物に対するヌクレオチドの５’から３’の付加方向は、転写方向と呼ばれる。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は「コード鎖」と呼ばれ；ＤＮＡ上の参照点に対して５’に位置するＤＮＡ鎖上の配列は「上流配列」と呼ばれ；ＤＮＡ上の参照点に対して３’にあるＤＮＡ鎖上の配列は「下流配列」と呼ばれる。

別段の断りがない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含み得る。

「相同」とは、本明細書中で使用される場合、２つのポリマー分子間、例えば２つの核酸分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子間または２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列類似性を指す。この２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体のサブユニットにより占有される場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおける位置がアデニンにより占有される場合、これらは、その位置において相同である。２つの配列間の相同性は、一致または相同位置の数の正の関数であり、例えば、２つの化合物配列中の位置の半分（例えば、１０サブユニット長のポリマー中の５つの位置）が相同である場合、この２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％、例えば１０のうち９が一致するかまたは相同である場合、この２つの配列は９０％相同性を共有する。例として、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＧＣは５０％相同性を共有する。

本明細書中で使用される場合、「相同性」は、「同一性」と同意語として使用される。
２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して遂行され得る。例えば、２つの配列を比較するのに有用な数学的アルゴリズムは、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）（１９９０年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８７巻、ｐ．２２６４〜２２６８）のアルゴリズムであり、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）（１９９３年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第９０巻、ｐ．５８７３〜５８７７）におけるように改変されている。このアルゴリズムは、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９０年、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第２１５巻、ｐ．４０３〜４１０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれ、例えば国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のワールドワイドウェブサイトで利用可能である。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、例えば、本明細書中に記載の核酸と相同であるヌクレオチド配列を得るために、次のパラメータ：ギャップペナルティー＝５；ギャップ伸長ペナルティー＝２；ミスマッチペナルティー＝３；一致報酬＝１；予想値１０．０；およびワードサイズ＝１１を用いて、ＮＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトでは「ｂｌａｓｔｎ」と呼ばれる）を用いて行い得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本明細書中に記載のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得るために、次のパラメータ：予想値１０．０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを用いて、ＸＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトでは「ｂｌａｓｔｎ」と呼ばれる）またはＮＣＢＩ「ｂｌａｓｔｐ」プログラムにより行い得る。比較目的に対してギャップ付きアライメントを得るために、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９７年、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．）、第２５巻、ｐ．３３８９〜３４０２）に記載のようにギャップ付きＢＬＡＳＴを利用し得る。あるいは、分子間の遠縁関係（Ｉｄ．）および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する繰り返し検索を行うために、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔまたはＰＨＩ−Ｂｌａｓｔを使用し得る。ＢＬＡＳＴを利用する場合、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔおよびＰＨＩ−Ｂｌａｓｔプログラム、個々のプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用し得る。

２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許可するか、または許可せずに、上記のものと同様の技術を用いて決定し得る。パーセント同一性の計算において、一般的には完全一致を計数する。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法においてそれらに帰するとみなされる意味を有し得、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る。本明細書中で使用される場合、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」などは、限定なく含むことを意味する。

ＴＡＬＥＮＳ
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより作製される人工的制限酵素である。これらの試薬は、効率的でプログラム可能で特異的なＤＮＡ切断を可能にし、インサイチューでのゲノム編集のための強力なツールとなる。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、何らかのＤＮＡ配列を実際に結合させるために迅速に設計され得る。ＴＡＬＥＮという用語は、本明細書中で使用される場合、幅広く、別のＴＡＬＥＮなく自力で２本鎖ＤＮＡを切断し得る単量体のＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語はまた、同じ部位でＤＮＡを切断するために一緒に機能するように設計されるＴＡＬＥＮのペアの片方または両方のメンバーを指すためにも使用される。一緒に機能するＴＡＬＥＮは、ＤＮＡの掌性を基準として、左ＴＡＬＥＮおよび右ＴＡＬＥＮとも呼ばれ得る。全て参照によりその全体が組み込まれる、米国特許出願第１２／９６５，５９０号明細書；米国特許出願第１３／４２６，９９１号明細書（米国特許第８，４５０，４７１号明細書）；米国特許出願第１３／４２７，０４０号明細書（米国特許第８，４４０，４３１号明細書）；米国特許出願第１３／４２７，１３７号明細書（米国特許第８，４４０，４３２号明細書）；および米国特許出願第１３／７３８，３８１号明細書を参照されたい。

ＴＡＬエフェクターは、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）菌により分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、１２番目および１３番目のアミノ酸を除き、保存性が高い３３〜３４アミノ酸配列を含有する。これらの２つの位置は、非常に可変性であり（反復可変性二残基）（ＲＶＤ））、特異的なヌクレオチド認識との強い相関を示す。アミノ酸配列とＤＮＡ認識との間のこの単純な関係性によって、適切なＲＶＤを含有する繰り返しセグメントの組み合わせを選択することにより、特異的なＤＮＡ結合ドメインの設計が可能となる。

酵母アッセイにおいて活性であるハイブリッドヌクレアーゼを構築するために、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの末端由来の非特異的なＤＮＡ切断ドメインを使用することができる。これらの試薬はまた、植物細胞において、および動物細胞においても活性がある。最初のＴＡＬＥＮ実験は野生型ＦｏｋＩ切断ドメインが使用されたが、数回のその後のＴＡＬＥＮ実験では、切断特異性および切断活性を向上させるように設計された突然変異があるＦｏｋＩ切断ドメイン変異体も使用された。ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、正しい方向およびスペーシングで標的ゲノム中の部位に対する特有のＤＮＡ結合ドメインを有する２つのコンストラクトを必要とする。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基数および２つの個別のＴＡＬＥＮ結合部位間の塩基数の両方が、高い活性レベルを達成するためのパラメータとなる。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基数は、複数のＴＡＬエフェクター反復配列とＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインとの間へのスペーサ（スペーサ配列とは異なる）の導入によって変更され得る。スペーサ配列は１２〜３０ヌクレオチドであり得る。

ＴＡＬＥＮ結合ドメインのアミノ酸配列とＤＮＡ認識との間の関係によって、設計可能なタンパク質が得られる。この場合、人工的遺伝子合成は、ＴＡＬＥ結合ドメインで見られる反復配列の不正確なアニーリングのために問題となる。これに対するある解決策としては、公開されているソフトウェアプログラム（ＤＮＡＷｏｒｋｓ）を使用して２段階ＰＣＲにおいてアセンブリに適切なオリゴヌクレオチドを推定し；オリゴヌクレオチドアセンブリに続き、全遺伝子増幅を行うことである。また、設計された（人工）ＴＡＬＥコンストラクトを作製するための多くのモジュラーアセンブリスキームも報告されている。両方の方法から、ジンクフィンガーＤＮＡ認識ドメインを生成させるためのモジュラーアセンブリ法と概念的に同様の、ＤＮＡ結合ドメインを設計することに対する体系的なアプローチが与えられる。

ＴＡＬＥＮ遺伝子がアセンブリされると、それらはプラスミド内に挿入され；次いで、そうしたプラスミドは、標的細胞に遺伝子移入するために使用され、この標的細胞において、遺伝子産物が発現されて核に侵入しゲノムに接近する。ＴＡＬＥＮは、２本鎖破壊（ＤＳＢ）を誘導することによりゲノムを編集するために使用され得、細胞が修復機構によって反応する。このようにして、これらは、例えば疾患を引き起こすゲノム中の突然変異を修正するために使用され得る。

ベクターおよび核酸
遺伝子の発現を得るために、様々な核酸が細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、核酸という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび核酸類似体ならびに２本鎖または１本鎖である核酸（すなわちセンスまたはアンチセンス１本鎖）を含む。核酸類似体は、例えば核酸の安定性、ハイブリッド形成または溶解度を改善するために、塩基部分、糖部分またはリン酸バックボーンにおいて修飾され得る。塩基部分での修飾には、デオキシチミジンに対するデオキウリジンおよびデオキシシチジンに対する５−メチル−２’−デオキシシチジンおよび５−ブロモ−２’−ドキシシチジン（ｄｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）が含まれる。糖部分の修飾としては、２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリル糖を形成させるための、リボース糖の２’ヒドロキシルの修飾が挙げられる。デオキシリボースリン酸バックボーンは、モルホリノ核酸を生成させるために修飾され得、各塩基部分は、６員の、モルホリノ環またはペプチド核酸に連結され、デオキシリン酸バックボーンはシュードペプチドバックボーンにより置換され、４個の塩基が保持される。サマートン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ）およびウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ）著、１９９７年、アンチセンス・ヌクレイック・アシッド・ドラッグ・デベロップメント（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．）、第７巻（３）、ｐ．１８７；およびハイラップ（Ｈｙｒｕｐ）ら著、１９９６年、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー（Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）、第４巻、ｐ．５を参照されたい。さらに、デオキシリン酸バックボーンは、例えばホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートバックボーン、ホスホロアミダイトまたはアルキルホスホトリエステルバックボーンで置換され得る。

核酸配列は、プロモータなどの制御領域に操作可能に連結され得る。制御領域は、あらゆる種由来であり得る。本明細書中で使用される場合、操作可能に連結されるとは、標的核酸の転写を許可または促進するような核酸配列に対する制御領域の配置を指す。あらゆるタイプのプロモータが核酸配列に操作可能に連結され得る。プロモータの例としては、組織特異的なプロモータ、構成的プロモータおよび特定の刺激に反応性があるかまたは非反応性であるプロモータ（例えば誘導性プロモータ）が挙げられるが限定されない。

核酸コンストラクトにおいて有用であり得るさらなる制御領域としては、ポリアデニル化配列、翻訳調節配列（例えば、内部リボソーム進入セグメント、ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｅｇｍｅｎｔ）、エンハンサー、誘導性エレメントまたはイントロンが挙げられるが限定されない。このような制御領域は必要でない場合があるが、これらは、転写、ｍＲＮＡの安定性、翻訳効率などに影響を及ぼすことによって発現を向上させ得る。このような制御領域は、細胞における核酸の最適な発現を得るために必要な場合、核酸コンストラクトに含まれ得る。しかし、このようなさらなるエレメントなく、十分な発現を得ることができることもある。

シグナルペプチドまたは選択可能マーカをコードする核酸コンストラクトが使用され得る。コードされるポリペプチドが特定の細胞内の位置（例えば細胞表面）に向けられるように、シグナルペプチドが使用され得る。選択可能マーカの非限定例としては、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ：ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ：ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ：ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ：ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ：ｘａｎｔｈｉｎ−ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が挙げられる。このようなマーカは、培養中で安定な形質転換体を選択するために有用である。他の選択可能マーカとしては、蛍光ポリペプチド、例えば緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質が挙げられる。

様々な技術を用いて、あらゆるタイプの細胞に核酸コンストラクトが導入され得る。技術の非限定例としては、トランスポゾン系、細胞に感染し得る組み換えウイルスもしくはリポソーム、または細胞への核酸送達が可能な他の非ウイルス法、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはリン酸カルシウム沈殿などの使用が挙げられる。

核酸はベクターに組み込まれ得る。ベクターは、担体から標的ＤＮＡへ移動するために設計される何らかの特異的なＤＮＡセグメントを含む広義の用語である。ベクターは、発現ベクターまたはベクター系と呼ばれ得、これは、ゲノムまたは他の標的とされるＤＮＡ配列へのＤＮＡ挿入を引き起こすのに必要とされる一連の要素であり、例えばエピソーム、プラスミド、またはさらにはウイルス／ファージＤＮＡセグメントなどである。ベクターは、多くの場合、１つ以上の発現調節配列を含む１つ以上の発現カセットを含有し、ここで発現調節配列は、それぞれ、別のＤＮＡ配列またはｍＲＮＡの転写および／または翻訳を調節および制御するＤＮＡ配列である。

多くの異なるタイプのベクターが知られている。例えば、プラスミドおよびウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターが知られている。哺乳動物発現プラスミドは、一般に、複製起点、適切なプロモータおよび任意のエンハンサーを有し、また何らかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列および５’フランキング非転写配列も有する。ベクターの例としては、プラスミド（別のタイプのベクターの担体でもあり得る）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（例えば、改変ＨＩＶ−１、ＳＩＶまたはＦＩＶ）、レトロウイルス（例えば、ＡＳＶ、ＡＬＶまたはＭｏＭＬＶ）およびトランスポゾン（例えばスリーピングビューティ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）、Ｐ−エレメント、Ｔｏｌ−２、フロッグプリンス（Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ）、ピギーバック（ｐｉｇｇｙＢａｃ））が挙げられる。

治療用途
ＴＡＬＥＮに基づく遺伝子修正は、多くの臨床および前臨床（例えば研究）適用を有する。例えば、ＴＡＬＥＮに基づく遺伝子修正は、突然変異が疾患へとつながる遺伝子を修正するために使用され得る。例えば、表皮水疱症、骨形成不全症、先天性角化不全症、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）、ファンコニ貧血、スフィンゴリピドーシス、リポフスチン沈着症、副腎白質ジストロフィー、重症複合型免疫不全、鎌状赤血球貧血、サラセミアなどであるが限定されない、挿入および欠失を含む小さな塩基変化を特徴とする何らかの疾患である。

ある実施形態において、疾患は表皮水疱症である。劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）は、ＶＩＩ型コラーゲン（ＣＯＬ７Ａ１）遺伝子における遺伝子欠損によるＶＩＩ型コラーゲンタンパク質の機能障害を特徴とする。この遺伝子は、ＶＩＩ型コラーゲンのα鎖をコードする。３本の同一のαコラーゲン鎖から構成されるＶＩＩ型コラーゲン原線維は、重層扁平上皮の下の基底ゾーンに限定されている。これは、外側の上皮と下層の基質との間のアンカー原線維として機能する。この遺伝子における突然変異は、栄養障害性表皮水疱症のすべての型に関連する。

ＣＯＬ７Ａ１は、３ｐ２１．３１で示される染色体領域のヒト３番染色体の短腕に位置する（Ｅｎｓｅｍｂｌ番号：ＥＮＳＧ０００００１１４２７０）。この遺伝子は、およそ３１，０００塩基対のサイズであり、そのコード配列は、１１８個のエクソンに断片化されており、配列番号３２を参照されたい。

ＣＯＬ７Ａ１は、９，２８７塩基対のｍＲＮＡ（ヒトｍＲＮＡおよびタンパク質に対する受入番号はそれぞれＮＭ＿００００９４およびＮＰ＿００００８５）に転写される。皮膚において、ＶＩＩ型コラーゲンタンパク質は、ケラチン産生細胞および皮膚繊維芽細胞によって合成される。マウスにおけるオルソロガス遺伝子に対するシンボルはＣｏｌ７ａ１である（マウスｍＲＮＡおよびタンパク質に対する受入番号はそれぞれＮＭ＿００７３８およびＮＰ＿０３１７６４である）。

ＲＤＥＢを有する者は、不治の、しばしば致命的な皮膚水疱形成を呈し、高悪性度の扁平上皮癌に対するリスクが上昇する^１。遺伝子増強療法は有望であるが、挿入突然変異誘発のリスクがある。したがって、ＲＤＥＢ患者の細胞における正確なゲノム編集のための人工転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を本明細書中で記載する。外来性ドナー鋳型からの相同組み換え修飾（ＨＤＲ）につながる部位特異的な２本鎖ＤＮＡ破壊（ＤＳＢ）を誘導するＴＡＬＥＮの能力が本明細書中に記載されている。このプロセスは、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子突然変異修正ならびに正常遺伝子およびタンパク質発現の復元をもたらした。この試験は、個人向けゲノム薬に対する構想の実証を提供し、これは、繊維芽細胞における内在性ヒト遺伝子の最初のＴＡＬＥＮ介在性インサイチュー修正である。

ＴＡＬＥＮに基づく遺伝子修正により修飾しようとする細胞は、患者から、またはドナーから得ることができる。この細胞は、繊維芽細胞、ケラチン産生細胞、誘導型多能性、造血、間葉系および胚性幹細胞、造血子孫細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞など、グリアおよびニューロン、神経膠前駆および幹細胞、筋肉細胞、肺細胞、膵臓および肝臓細胞および／または網内系の細胞）などのあらゆるタイプであり得る。ＴＡＬＥＮに基づく遺伝子修正により修飾されると、細胞を増大させ、および／または疾患を処置するために患者に投与し得る。

マトリクスは、特異的な解剖学的部位に本発明の細胞を送達するために使用され得る。ここで、特定の増殖因子が、マトリクスに組み込まれてもそうでなくともよく、または細胞による取り込みのためにマトリクスに組み込まれるプラスミド上にコードされてもそうでなくともよく、最初の細胞集団の増殖を誘導するために使用され得る。サイトカイン、増殖因子またはホルモンをコードするプラスミドＤＮＡは、ポリマー遺伝子活性化マトリクス担体内に封じ込められ得る。そうした生体分解性ポリマーは、処置が所望される部位の付近にその後移植される。

本明細書中に記載の目的のために、本発明の自己の、同種のまたは異種の（ｘｅｏｎｇｅｎｉｃ）細胞の何れかが、事前に選択された部位への、全身的または受容可能なマトリクスの表面上もしくはその周囲への直接注射によって、または医薬的に許容可能な担体と組み合わせて、患者に投与され得る。

さらに、核酸コンストラクトまたはタンパク質は、例えば医薬的に許容可能な担体とともに、対象に局所的にまたは全身的に投与され得る。
細胞の増殖／増大
ＴＡＬＥＮに基づく遺伝子修正により修飾しようとする細胞は、患者から、またはドナーから得ることができる。この細胞は、繊維芽細胞などのあらゆるタイプの細胞であり得る。ＴＡＬＥＮに基づく遺伝子修正により修飾されると、細胞は、疾患を処置すべく、増殖されおよび／または患者に投与され得る。

細胞は、当技術分野で確立されており、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および他の会社から市販されている培養液中で培養し得る。このような培地としては、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ Ｆ１２培地、イーグル最小必須培地、Ｆ−１２Ｋ培地、イスコブ変法ダルベッコ培地、ノックアウトＤ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられるが限定されない。使用される細胞に対して必要とされる場合、培地および／または培地サプリメントの濃度を変更するかまたは調整することは、当業者の技術の範囲内である。ピルビン酸ナトリウムを含むかまたは含まない低グルコース処方物として多くの培地が利用可能であることも明らかである。

細胞培養液に哺乳動物血清を補給することも企図される。血清は、生存能および増大に必要とされる細胞性因子および成分を含有することが多い。血清の例としては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、ウシ血清（ＢＳ：ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、仔ウシ血清（ＣＳ：ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ：ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）、新生仔ウシ血清（ＮＣＳ：ｎｅｗｂｏｒｎ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）、ヤギ血清（ＧＳ：ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）、ウマ血清（ＨＳ：ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ）、ヒト血清、ニワトリ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ラット血清（ＲＳ：ｒａｔ ｓｅｒｕｍ）、血清代替物（ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ：ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を含むが限定されない）およびウシ胎仔体液が挙げられる。補体カスケードの成分を不活性化するために必要とされるとみなされる場合、５５〜６５℃で血清を熱不活性化し得ることが理解される。１つ以上の所望の細胞タイプの生存を促進するために、血清濃度の変更または培養液からの血清の除去も使用され得る。ある実施形態において、ＦＢＳ／または種細胞タイプに特異的な血清の存在下で細胞を培養する。例えば、細胞は、単離され得、および／または約５％〜約１５％以上、例えば約２０％、約２５％または約３０％などを含む、約０．５％〜約５％以上の総血清（例えばＦＢＳ）または血清代替物濃度で増大させられ得る。血清の濃度は経験的に決定され得る。

最適増殖および増大のための微量要素を細胞に補給するために、さらなるサプリメントも使用され得る。このようなサプリメントとしては、インスリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウムおよびそれらの組み合わせが挙げられる。これらの成分は、ハンクス平衡塩類溶液（商標）（ＨＢＳＳ：Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、アール塩溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（商標）、抗酸化剤サプリメント、ＭＣＤＢ−２０１（商標）サプリメント、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ：ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ニコチンアミド、アスコルビン酸および／またはアスコルビン酸−２−ホスフェートならびにさらなるアミノ酸などであるが限定されない塩溶液中に含まれ得る。多くの細胞培養液はアミノ酸を既に含有するが、しかし、一部のものは細胞を培養する前に補給を必要とする。このようなアミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イノシトール、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンおよびＬ−バリンが挙げられるが限定されない。

細菌、マイコプラズマおよび真菌混入を減ずるために抗生物質もまた一般に細胞培養中で使用される。一般に、使用される抗生物質または抗真菌性化合物はペニシリン／ストレプトマイシンの混合物であるが、アンホテリシン（ファンギゾン（商標））、アンピシリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ナリジクス酸、ネオマイシン、ナイスタチン、パロモマイシン、ポリミキシン、ピューロマイシン、リファンピシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、タイロシンおよびゼオシンも挙げられ得るが限定されない。

ホルモンもまた、細胞培養において有利に使用され得、Ｄ−アルドステロン、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ：ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ）、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロラクチン、プロゲステロン、ソマトスタチン／ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ：ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）、甲状腺刺激ホルモン、チロキシンおよびＬ−チロニンが挙げられるが限定されない。β−メルカプトエタノールも細胞培養液に補給され得る。

細胞のタイプおよび分化細胞に応じて、細胞培養液に補給するために脂質および脂質担体も使用され得る。このような脂質および担体としては、とりわけ、サイクロデキストリン（α、β、γ）、コレステロール、アルブミンに結合されたリノール酸およびオレイン酸、非結合リノール酸、アルブミンに結合されたリノール−オレイン−アラキドン酸、アルブミンに結合されないかまたは結合されたオレイン酸が挙げられ得るが限定されない。アルブミンは、脂肪酸不含処方において同様に使用され得る。

培養中の細胞は、懸濁液中か、または、細胞外マトリクス成分や合成ポリマーまたはバイオポリマーなどの固体支持体に付着させるかの何れかで維持され得る。細胞は、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＶ型コラーゲン、コンカナバリンＡ、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、「スーパーフィブロネクチン」および／またはフィブロネクチン様ポリマー、ゼラチン、ラミニン、ポリ−Ｄおよびポリ−Ｌ−リジン、マトリゲル（商標）、トロンボスポンジンおよび／またはビトロネクチンなど、固体支持体へのそれらの付着を促すさらなる因子（例えば付着因子）を必要とすることが多い。

様々な密度で細胞を培養し得、例えば、細胞は、様々な密度で培養皿に播種が行われ得るか、または維持され得る。例えば、約２０００個細胞／１２ウェルプレートのウェルよりも低い濃度（例えば、１２ウェル平底増殖面積：３．８ｃｍ２ ウェル体積：６．０ｍＬまたはウェルＩＤ×深さ（ｍｍ）２２．１×１７．５；ウェル容量（ｍＬ）６．５、増殖面積（ｃｍ２）３．８）を含むが限定されない密度であり、約１５００個細胞／１２ウェルプレートのウェルよりも低い濃度、約１，０００個細胞／１２ウェルプレートのウェルよりも低い濃度、約５００個細胞／１２ウェルプレートのウェルよりも低い濃度、または約２００個細胞／１２ウェルプレートのウェルよりも低い濃度を含む。細胞はまた、より高密度で播種または維持され得、例えば、約２，０００個細胞／１２ウェルプレートのウェルよりも高い濃度、約２，５００個細胞／１２ウェルプレートのウェルよりも高い濃度、約３，０００個細胞／１２ウェルプレートのウェルよりも高い濃度、約３，５００個細胞／１２ウェルプレートのウェルよりも高い濃度、約４，０００個細胞／１２ウェルプレートのウェルよりも高い濃度、約４，５００個細胞／１２ウェルプレートのウェルよりも高い濃度、約５，０００個細胞／１２ウェルプレートのウェルよりも高い濃度、約５，５００個細胞／１２ウェルプレートのウェルよりも高い濃度、約６，０００個細胞／１２ウェルプレートのウェルよりも高い濃度、約６，５００個細胞／１２ウェルプレートのウェルよりも高い濃度、約７，０００個細胞／１２ウェルプレートのウェルよりも高い濃度、約７，５００個細胞／１２ウェルプレートのウェルよりも高い濃度または約８，０００個細胞／１２ウェルプレートのウェルよりも高い濃度である。

［実施例］
次の例は、本発明のある一定の実施形態および態様を明らかにし、さらに説明するために提供されるものであり、その範囲を限定するものと解釈すべきものではない。

（実施例１）
材料および方法。
試験対象および細胞株誘導。

親権者のインフォームドコンセントを得た後、本発明者らは、同型接合ｃ．１８３７Ｃ＞Ｔ未成熟終止コドン突然変異を有する男性ＲＤＥＢ患者の皮膚からパンチ生検を得た。ミネソタ大学治験審査委員会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）から、ヒト対象における試験に対する承認が得られた。初代繊維芽細胞の細胞株を得て、低酸素濃度条件で維持した。

ＴＡＬＥＮおよびドナー構築。
図１Ａに記載のＴＡＬＥＮ候補を、ゴールデンゲートアセンブリ（Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）法を介して作製し、記載されるようなＣＡＧＧプロモータ駆動性ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのホモ二量体に挿入した［１、２］。表１で示されるＬＡＦおよびＬＡＲプライマーを用いて左ドナーアームを増幅させた。記載のように重複オリゴヌクレオチドアセンブリストラテジーを用いて２個の断片（内側および外側）において右アームを合成した［３、４］。表１に全プライマーセットを示す。ｌｏｘＰが導入されたＰＧＫピューロマイシンカセットに左および右アームをクローニングした。

遺伝子導入。

全てのＴＡＬＥＮ処置は、次の機器設定：１５００Ｖ、２０ｍｓパルス幅および単一パルスでの、ネオン（Ｎｅｏｎ）遺伝子移入系（ライフサイエンシーズ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））を介した、２．５μｇの各ＴＡＬＥＮおよび１０μｇ量のドナーの送達から構成された。遺伝子導入から４８時間後、３１Ｃで細胞を温置した［５］。

細胞培養。
細胞を、２０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ非必須アミノ酸、並びに各０．１ｍｇ／ｍＬのペニシリンおよびストレプトマイシン（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））がそれぞれ補給されたＤＭＥＭから構成される増殖培地中に維持し、２％Ｏ_２、５％ＣＯ_２および３７Ｃで培養した。

サーベイヤヌクレアーゼ。
ゲノムＤＮＡを、ＴＡＬＥＮ遺伝子導入から４８時間後に単離するとともに、サーベイヤＦプライマーおよびサーベイヤＲプライマーを用いて３０サイクル増幅させ、記載のようにサーベイヤヌクレアーゼ処理に供した［６］。１０％ＴＢＥ ＰＡＧＥゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））上で生成物を分離した。オフターゲットのアンプリコンについて、ＰＣＲ反応を３５サイクル進めており、プライマーは全て表１に列挙されている。

相同組み換え修復分析。
ＨＤＲの定量のために、ＴＡＬＥＮおよび５μＬの４０μＭの１本鎖オリゴヌクレオチドドナーを細胞に遺伝子移入し、３種類のプライマー：サーベイヤＦ、サーベイヤＲおよびリンカーフォワードプライマーを用いて、４８時間でＰＣＲによりスクリーニングした。記載のように、デンシトメトリーを行った［６］。遺伝子修正のために、各２．５μｇのＴＡＬＥＮ ＤＮＡとともに１０μｇのドナープラスミドを導入し、次に記載のように選択を行った。

選択。
細胞を、０．２μｇ／ｍＬピューロマイシンにおいてバルクで選択し、サブプールに分離し、ＨＤＲについてスクリーニングし、次いで１０ｃｍ^２皿中に低密度（２５０〜７５０個の総細胞）で播種した。１０ｎｇ／ｍＬ上皮増殖因子および０．５ｎｇ／ｍＬ繊維芽細胞増殖因子を補給した基礎培地の存在下で、シリコーングリース付きのクローニングディスク（全てコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）から）を単一細胞上に置いた。連続的に容器を大きくして、細胞を増大させた。アデノウイルスｃｒｅレコンビナーゼを２０のＭＯＩで添加してＰＧＫピューロマイシンカセット（ベクターバイオラボズ（Ｖｅｃｔｏｒ ＢｉｏＬａｂｓ））を除去した。

細胞修正分子スクリーニング。
Ｃ７ＧＴ１およびＣ７ＧＴ２プライマー対を使用して、ドナーからの連結部を内在性遺伝子座へと増幅させた（上流ＳＰＭＰスクリーニング）。ＡｐａＩ ＳＰＭＰ領域を、Ｃ７ＡＰＡＦおよびＣ７ＧＴ２でのＰＣＲ増幅前および後にＡｐａＩで処理したゲノムＤＮＡ上で評価した。クローン性単離株からのメッセンジャーＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、ＲＴ１およびＲＴ２によりスクリーニングし、次いでＡｐａＩで消化した。ＡｐａＩ耐性アンプリコンをクローニングし、サンガー配列決定を行った。

細胞増大分析。
遺伝子修正した繊維芽細胞を、Ｔ１５０フラスコ中で増大させ、トリプシン処理して単一細胞懸濁液を得た。次いで１００μＬ ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋ヨウ化プロピジウム（イーバイオサイエンシーズ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））中で細胞を再懸濁し、続いて等体積のＰＫＨ２６参照マイクロビーズ（シグマ（ＳＩＧＭＡ））を添加した。５０００個のビーズ事象を回収し、製造者のプロトコール（シグマ（ＳＩＧＭＡ））に従い、明白な生存可能細胞数を算定した。

ｉＰＳＣ作製および奇形腫アッセイ。
遺伝子修正された繊維芽細胞（または対照としての未修正細胞）を、［７、８］に記載のようにｉＰＳＣに対して再プログラムし、次いで可視的な塊が形成されるまでＳＣＩＤマウスの側腹部に入れた。包埋し染色するために塊を切除した。

免疫蛍光。
遺伝子修正した細胞を、チャンバースライド上に置き、２４時間後に４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸにより浸透処理し、１％ＢＳＡでブロッキング処理し、ポリクローナル抗ＶＩＩ型コラーゲン抗体（１：１５００；デビッド・ウッドリー（Ｄａｖｉｄ Ｗｏｏｄｌｅｙ）博士およびメイ・チェン（Ｍｅｉ Ｃｈｅｎ）博士より厚意で提供された）で染色した。二次抗体染色は、ロバ抗ウサギＩｇＧ Ｃｙ３（１：５００；ジャクソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））で行った。アイソタイプ対照染色は、全分子ウサギＩｇＧ（ジャクソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））を用いて行った。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））で核を染色した。画像は、オリンパスＢＸ６１ ＦＶ５００共焦点顕微鏡（オリンパス株式会社）で７４５のＰＭＴ電圧を用いて撮影し、フルオビュー（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ）ソフトウェアバージョン４．３を用いて分析した。ライカ顕微鏡上で光学顕微鏡検査を実施した。

ＩＤＬＶおよびＬＡＭ−ＰＣＲ／ｎｒＬＡＭ ＰＣＲ。
ＣＭＶ−ＧＦＰ導入ベクター、Ｄ６４Ｖインテグラーゼ突然変異を有するｐＣＭＶ−ΔＲ８．２パッケージングプラスミド［９、１０］、およびｐＭＤ２．ＶＳＶ−Ｇエンベロープをコードするプラスミドについての、脂質ベース同時遺伝子導入（リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を介して、インテグラーゼ欠損型レンチウイルス（ＩＤＬＶ：Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）粒子を２９３Ｔ細胞において生成させた。ＴＡＬＥＮを用いたＨＥＫ２９３細胞のヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）によって遺伝子タグ付加を行い、続いて２４時間後、７のＭＯＩでＧＦＰ ＩＤＬＶの導入を行った。酵素ＭｓｅＩおよびＴｓｐ５０９Ｉを用いたＬＡＭ−ＰＣＲ［１１］およびｎｒＬＡＭ−ＰＣＲ［１２］によって１００ｎｇのゲノムＤＮＡを二重分析し、ＩＤＬＶ組み込み部位のゲノム全域にわたる回復を確認した。（ｎｒ）ＬＡＭ−ＰＣＲアンプリコンを、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）／４５４ピロシーケンスプラットフォームによって配列決定し、ＨＩＳＡＰパイプラインを用いて組み込み部位データを分析した［１３］、［１４］、［１５］。パターン・マッチャー・スキャン・フォー・マッチーズ（ｐａｔｔｅｒｎ ｍａｔｃｈｅｒ ｓｃａｎ−ｆｏｒ−ｍａｔｃｈｅｓ）を用いて、潜在的ＴＡＬＥＮオフターゲット結合部位について、近距離で＞１ ＩＳを有するゲノム位置をスキャンした［１３］。

結果／考察
真皮表皮接合部（ＤＥＪ：ｄｅｒｍａｌ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）でのＶＩＩ型コラーゲンタンパク質の喪失は、皮膚の構造完全性の損失をもたらす。同種由来の全身造血細胞または局所繊維芽細胞移植によるＤＥＪでのＶＩＩ型コラーゲンの蓄積の復元は、症状を改善し得る［１６〜１８］。しかし、毒性、感染および移植失敗のリスクのために同種細胞移植の有効性は最適とは言えないため、新規の自己細胞に基づく治療の開発の推進が急がれる。したがって、本明細書中でＴＡＬＥＮ技術に基づくＣＯＬ７Ａ１修正に対するゲノム編集ストラテジーを記載する。繊維芽細胞は、その誘導が容易なことおよび培養において増殖停止に対して低感受性であることならびにそれらのＤＥＪでのＶＩＩ型コラーゲン沈着能ゆえに、理想的な細胞タイプである［１８、１９］。ＴＡＬＥＮは、使用者が定めたゲノム遺伝子座で２本鎖ＤＮＡ破壊を誘導し得、したがってＨＤＲを刺激する人工ヌクレアーゼであり、それらの標的化能および作製が容易なことにおいて他のヌクレアーゼよりも優れている［２０、２１］。

ＴＡＬエフェクター−ヌクレオチド・ターゲッタ（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔａｒｇｅｔｅｒ）ソフトウェア［２２、２３］は、ヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子座について６８個の潜在的ＴＡＬＥＮ部位を同定し、ＲＤＥＢおよび突然変異配列の位置および数の不均一性を呈する他の疾患を考慮すると、ＴＡＬＥＮに対する高い標的化能を強調する大きな一連のヒト遺伝子に関する最近の実験データ［２１］を裏付ける。ＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン１４中の未成熟終止コドンの近位にある患者特異的なヌクレアーゼを作製するために、ゴールデンゲートクローニング法を使用した（図１Ａ）。ＴＡＬＥＮは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合される人工ＴＡＬＥ反復アレイから構成され（図１Ｂ）；アレイにおけるＴＡＬＥ反復の結合特異性は、各反復内の２つの超可変残基の識別により決定される（図１Ｃ）。ＴＡＬＥＮ処理ＲＤＥＢ繊維芽細胞を、誤りがちな（エラープローン）非相同末端結合（ＮＨＥＪ）およびＨＤＲという２つの主要なＤＮＡ修復経路による修復の証明のために分析した。分析した全部で７５個のうち１１個の突然変異対立遺伝子を示したサーベイヤヌクレアーゼアッセイおよびサンガー配列決定は、ＮＨＥＪと一致した（図２Ａおよび２Ｅ）。ＴＡＬＥＮ切断はまた、ＤＮＡ破壊部位においてオリゴヌクレオチド二本鎖の捕捉をもたらした（図２Ｂ〜Ｆ）［２４］。これらのデータは、標的部位においてヌクレアーゼが活性であることを立証した。次に、ＴＡＬＥＮおよびオリゴヌクレオチドドナー（ＯＤＮ：ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｏｎｏｒ）の同時送達に続いてＲＤＥＢ細胞がＨＤＲを受け得るか否かを確認した（図１Ｆ）。このオリゴヌクレオチドドナーは、短いドナーアームによって挟まれた特有のプライマー配列を含有している。次いで、修飾および非修飾対立遺伝子を同時に検出する３−プライマーＰＣＲアプローチにより、ＴＡＬＥＮプラスミドおよびＯＤＮが遺伝子移入されたＲＤＥＢ繊維芽細胞を分析した。このアッセイは、ＯＤＮドナーからの外来性配列を組み込むためにＲＤＥＢ細胞中のＴＡＬＥＮがＨＤＲを刺激し得ることを示し（図１Ｇ）、ＮＨＥＪの１４．６％の比率およびＨＤＲの２．１％の比率は、ヒト繊維芽細胞の高レベル修飾に対するＴＡＬＥＮ使用の有効性を示す。

ＲＤＥＢを引き起こすＣＯＬ７Ａ１突然変異が修正され得るとともに遺伝的に修正された細胞の集団が続いて増大するか否かを決定するために、遺伝子修正細胞の選択的検出および増大を可能にするであろう外来性ドナープラスミドを作製した。このドナーは、エクソン１２と１６との間のＣＯＬ７Ａ１遺伝子座の約１ｋｂにわたる相同性アームから構成された（図３Ａ）。ドナー内で、ｌｏｘＰ導入ＰＧＫピューロマイシンカセットは、エクソン１２とエクソン１３との間のイントロンにそれが挿入されるように方向付けられた。フランキングｌｏｘＰ部位により、Ｃｒｅレコンビナーゼでの選択可能マーカの除去が可能となり、イントロン内に小さなｌｏｘＰ「フットプリント」を残す（図４）。右ドナーアーム内で、５個の単一塩基対変化が設計された：すなわち、正常な遺伝子型を回復させる、突然変異部位での正常な塩基および、非修飾型に対するＨＤＲ修飾対立遺伝子の正確な位置を表すことを可能にする４個のサイレント点突然変異多型（ＳＰＭＰ）である（図３Ａ）。これらのＳＰＭＰのうち３個は標的塩基の上流であり、下流にある１個は、ＡｐａＩ制限部位を除去する（本明細書中で以後、上流または下流ＳＰＭＰと呼ばれる変化）。

分析した９個のクローンのうち、ＨＤＲの証拠を示す４個が得られた。１個のクローンにおいて、上流ＳＰＭＰの存在が明らかであったが、しかし、ＲＤＥＢ病原性ＣＯＬ７Ａ１突然変異は存続し、下流ＳＰＭＰは見られなかった（図５）。これらのデータは、ＨＤＲ交叉事象が、正常遺伝子型を回復させる領域の上流のドナーアーム内で起こったことを示唆する（図６）。しかし、残りの３個のクローンについては、下流ドナー挿入ＳＰＭＰが検出可能であり、これにより、一方の対立遺伝子がＨＤＲを受け、他方が受けず、その結果、ヘテロ接合性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子座が得られることが示された。（図３Ｂおよび３Ｃ）。

ＨＤＲは、突然変異塩基を復帰させ、正常遺伝子発現を回復させるはずである。したがって、介在イントロンからのスプライシング後に、同じ転写産物における正常塩基および下流ＳＰＭＰの検出のためにＲＴ−ＰＣＲストラテジーを用いてこれを評価した（図７）。興味深いことに、１つのクローンにおけるｃＤＮＡの直接配列決定から、ＴＡＬＥＮ標的部位での配列の欠失が示された（図８）。これらのデータは、ＴＡＬＥＮがＨＤＲ後に活性を有し、さらなるＮＨＥＪ介在性突然変異を誘導したことを示す。ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ：ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）での以前の実験から、ドナー配列でのサイレント突然変異が、こうした望ましくない事象の頻度を低下させ得ることが示されているが^１２、しかし、これは、ＴＡＬＥＮ部位がイントロン／エクソン境界にあり、スプライシングを妨害しないようにドナーＴＡＬＥＮ配列が撹乱されないようにすることが選択されたため、この実験において可能ではなかった。これは、１個のクローンの回復に負の影響を及ぼしたが、しかし、２個のクローンは、所望のＨＤＲに基づくドナー由来の正常転写産物を呈した（図９Ａ）。異常または正常転写産物それぞれを有する未処理ＲＤＥＢ突然変異体または野生型細胞と比較して、ＴＡＬＥＮ処置がＶＩＩ型コラーゲンタンパク質発現を回復させたか否かを次に確認した（図９Ｃおよび９Ｅ）。ＶＩＩ型コラーゲンの免疫蛍光に基づく検出から、ＴＡＬＥＮ処理細胞におけるＶＩＩ型コラーゲン産生のレスキューおよび未処理対照ＲＤＥＢ繊維芽細胞における完全欠損が明らかになった（図９Ｂおよび９Ｄ）。これらの結果から、ＴＡＬＥＮの、正常なｍＲＮＡおよびタンパク質産生の回復による疾患特異的な標的部位における遺伝子修飾媒介能が確認される。

オフターゲット効果のリスクは、ゲノム編集試薬の臨床使用における検討事項である。遺伝子編集ヌクレアーゼのオフターゲット部位をマッピングするための選択肢としては、次のものが挙げられる：（ｉ）各ヌクレアーゼの単量体のＤＮＡ結合タンパク質を一対で用いてインビトロで試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を行い、次に潜在的オフターゲット部位を予想するためにこのデータを使用すること［２５］、（ｉｉ）二量体のヌクレアーゼを使用してインビトロ切断部位選択を行い、次にヌクレアーゼ誘導性突然変異についての目的の細胞のゲノムで生じる、この選択由来の部位を調べること、（ｉｉｉ）組み込み欠損型レンチウイルス（ＩＤＬＶ）の傾向を利用してヌクレアーゼ誘導性ＤＳＢに組み込み、次いでＬＡＭ−ＰＣＲによって挿入点を同定すること［９］。方法（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が方法（ｉ）よりもヌクレアーゼオフターゲット部位の同定においてより優れていると思われるものの、前者の方法は、他法により予想されるオフターゲット部位を同定することができず、このことから、そのオフターゲット事象検出において網羅的である方法はないことが示唆される。ヌクレアーゼ生成ＤＳＢに捕捉され得る緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子とともにＩＤＬＶを用いて、方法（ｉｉｉ）を利用した（図１１Ａ）［９、２６］。ヒト胚性腎臓（２９３）細胞を加速的増殖能があるために使用したが、これにより非組み込みＩＤＬＶの迅速な希釈が促進され、無作為な組み込みが最小化されるはずである。さらに、２９３細胞のオープンクロマチン構造ゆえに、何らかのオフターゲット効果が初代細胞よりも大きい度合いまで顕在化し、オフターゲット事象のより感度の高いマッピングを可能にするという仮説が立てられた。ＧＦＰ ＩＤＬＶのみの導入は、２９３細胞におけるＧＦＰ発現の急速な喪失をもたらした（図１２）。ＩＤＬＶおよびＴＡＬＥＮの同時導入は、ＧＦＰ細胞の安定な集団をもたらし（図１１Ｂ）、非制限的直線状増幅介在（ｎｏｎｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ ｌｉｎｅａｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）ＰＣＲ（（ｎｒ）ＬＡＭ−ＰＣＲ）により組み込み部位をマッピングするためにこれを使用した（図１１Ｃ）。ＩＤＬＶと隣接ゲノム配列との間の接合部を示す５個の部位を回復させた（図１１Ｄ）。これらの事象は、予想外ではなく［９］、臨床試験で使用されるヌクレアーゼでさえオフターゲット効果を示し、回復された非コード領域は、このＴＡＬＥＮが、遺伝子発現に負の影響を与えないと予想される安全性プロファイルを保持することを示唆する。

ＬＡＭ−ＰＣＲ法の分解能において、本明細書中に記載のＴＡＬＥＮは、高率のオンターゲット活性を示す。さらに、これらの試験は、他と同様に、人工ヌクレアーゼについての潜在的な標的がドナーコンストラクト自体であることを示し、これらの試験により、所望のＨＤＲ事象の選択に役立ち得るマーカ配列を包含することの利点が強調される［２７］。

まとめると、ＲＤＥＢ患者の皮膚細胞を得て、この特有の突然変異を特異的に標的とするために、ドナーおよびＴＡＬＥＮ試薬（配列は下記に含まれる）を設計し、迅速に構築した。遺伝子編集ツールの適用の結果、直接増大または多能性となるように再プログラムし、続いて増大させた後、治療用途に適切な細胞である二倍体ヒト繊維芽細胞において、ＲＤＥＢ突然変異が修正され［７、８］、これは、ヒトゲノムにおける疾患遺伝子のＴＡＬＥＮ介在修正を初めて実例により示すものである。これらの実験は、臨床的に重要な個別化治療の開発においてＴＡＬＥＮが使用され得ることの証拠を提供する。

（実施例２）
ドナープラスミド配列の例は配列番号２２で示される。ドナー配列の左アームの例は配列番号３１で示される。ドナーのＬｏｘｐ部位の例は配列番号２３で示される。ドナーのＰＧＫプロモータの例は配列番号２４で示される。ドナー配列のピューロマイシン遺伝子の例は配列番号２５で示される。ドナーのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルの例は配列番号２６で示される。ドナーのＬｏｘｐ部位の例は配列番号２７で示される。ドナーの右アームの例は配列番号２８で示される。ＴＡＬＥＮ左（ｐＴＡＬ２８６）の例は配列番号２９で示される。ＴＡＬＥＮ右（ｐＴＡＬ２８７）の例は配列番号３０で示される。

参考文献

全ての刊行物、特許および特許出願が参照により本明細書に組み込まれる。前述の明細書において、本発明の特定の好ましい実施形態と関連して本発明を記載し、多くの詳細を説明目的で示してきたが、当業者にとって明らかなように、本発明は、さらなる実施形態を受け入れることができ、本発明の基本的原理から逸脱することなく、本明細書中に記載の特定の詳細が大幅に変更され得る。
（付記）
好ましい実施形態として、上記実施形態から把握できる技術的思想について、記載する。
［項１］
標的遺伝子における遺伝子突然変異により引き起こされる遺伝性疾患または障害を処置するための方法であって、
複数のＴＡＬエフェクター反復配列およびエンドヌクレアーゼドメインを含むＴＡＬＥＮタンパク質をコードする１つ以上の核酸および
核酸ドナー配列
と細胞を接触させることを含み、
前記ＴＡＬＥＮタンパク質が前記細胞中で発現され、前記標的遺伝子において部位特異的な２本鎖ＤＮＡ破壊を誘導し、前記ドナー配列が、前記遺伝性疾患または障害を処置するために、遺伝子突然変異の修正をもたらすＤＮＡ修復のための鋳型であり、正確な遺伝子発現をもたらす、方法。
［項２］
前記細胞が、線維芽細胞、ケラチン産生細胞、誘導型多能性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、造血子孫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、グリア細胞、神経細胞、神経膠前駆細胞、神経膠幹細胞、筋肉細胞、肺細胞、膵臓細胞、肝臓細胞および網内系の細胞からなる群から選択される、項１に記載の方法。
［項３］
前記ＴＡＬＥＮタンパク質が左ＴＡＬＥＮであり、前記１つ以上の核酸が、前記標的遺伝子において前記２本鎖破壊をなすために前記左ＴＡＬＥＮと協働可能な右ＴＡＬＥＮをコードする核酸をさらに含む、項１に記載の方法。
［項４］
前記ＴＡＬＥＮをコードする前記核酸または前記核酸ドナー配列が、ベクターまたはプラスミドの一部である、項１に記載の方法。
［項５］
前記標的遺伝子が、遺伝子変化または突然変異を有する遺伝子である、項１に記載の方法。
［項６］
前記標的遺伝子がＣＯＬ７Ａ１である、項５に記載の方法。
［項７］
前記ＴＡＬＥＮタンパク質をコードする前記核酸が、前記複数のＴＡＬエフェクター反復配列と前記エンドヌクレアーゼドメインとの間にスペーサを含む、項１に記載の方法。［項８］
前記スペーサが、１２〜３０ヌクレオチド長である、項７に記載の方法。
［項９］
前記遺伝性疾患が、表皮水疱症、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）、骨形成不全症、先天性角化不全症、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）、ファンコニ貧血、スフィンゴリピドーシス、リポフスチン沈着症、副腎白質ジストロフィー、重症複合型免疫不全、鎌状赤血球貧血およびサラセミアからなる群から選択される、項１に記載の方法。
［項１０］
前記遺伝性疾患が表皮水疱症である、項１に記載の方法。
［項１１］
遺伝子突然変異により引き起こされる遺伝性疾患または障害を処置するための方法であって、
ａ）細胞に（ｉ）第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第１の核酸、（ｉｉ）第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第２の核酸、および（ｉｉｉ）およびドナー配列を導入する工程であって、前記第１および第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体のそれぞれが、複数のＴＡＬエフェクター反復配列およびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを含み、前記複数のＴＡＬエフェクター反復配列のそれぞれが反復可変性二残基を含み、前記第１のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が、前記細胞内での標的ＤＮＡの第１のハーフサイト配列への結合能を含むとともに、前記第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が前記標的ＤＮＡの第２のハーフサイト配列に結合されるときに前記標的ＤＮＡを切断する能力を含み、前記標的ＤＮＡが、スペーサ配列によって分離される前記第１のハーフサイト配列および前記第２のハーフサイト配列を含み、前記第１および第２のハーフサイトが同じヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有し、前記ドナー配列が、少なくとも前記標的配列の５’および３’末端で標的に対する相同性および事前に選択された遺伝子変化を含み、かつ、前記遺伝子突然変異の修正をもたらすＤＮＡ修復のための鋳型である、該導入工程；および
（ｂ）前記突然変異を修正し、かつ、正確な遺伝子発現を復元するために、前記第１および第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が発現される条件下で前記細胞を培養する工程、を含む方法。
［項１２］
ドナー配列を含む核酸であって、前記ドナー配列が遺伝子突然変異の修正をもたらす部位特異的なＤＮＡ修復のための鋳型であり、前記ドナー配列が、少なくとも標的配列の５’および３’末端に対する相同性を含み、前記ドナー配列の一部分が、ＴＡＬＥＮタンパク質と併せて使用するための前記標的配列を修正するための修復配列を含む、核酸。
［項１３］
ドナーが配列番号２２を含む、項１２に記載の核酸。
［項１４］
標的がＣＯＬ７Ａ１である、項１２に記載の核酸。
［項１５］
ドナーの５’および３’末端がそれぞれ標的に対する少なくとも１００塩基の配列同一性を有する、項１２に記載の核酸。
［項１６］
配列番号２９を含む、ＴＡＬＥＮタンパク質をコードする核酸。
［項１７］
配列番号３０を含む、ＴＡＬＥＮタンパク質をコードする核酸。
［項１８］
項１６に記載の核酸によりコードされるかまたは発現される、タンパク質。
［項１９］
項１７に記載の核酸によりコードされるかまたは発現される、タンパク質。
［項２０］
ドナー配列を含むベクターまたはプラスミドであって、前記ドナー配列が、遺伝子突然変異の修正をもたらす部位特異的なＤＮＡ修復のための鋳型であり、前記ドナー配列が、少なくとも標的配列の５’および３’末端に対する相同性を含み、前記ドナー配列の一部分が、ＴＡＬＥＮタンパク質と併せて使用するための前記標的配列を修正するための修復配列を含む、ベクターまたはプラスミド。
［項２１］
ドナーが配列番号２２を含む、項２０に記載のベクターまたはプラスミド。
［項２２］
標的がＣＯＬ７Ａ１である、項２０に記載のベクターまたはプラスミド。
［項２３］
ドナーの５’および３’末端がそれぞれ標的に対して少なくとも１００塩基の配列同一性を有する、項２０に記載のベクターまたはプラスミド。
［項２４］
配列番号２２、３１、２８、２９または３０のうち１つ以上を含む、ベクターまたはプラスミド。
［項２５］
外来配列番号２２、３１、２８、２９もしくは３０のうち１つ以上またはこのような配列から発現されるタンパク質を含む、単離宿主細胞。
［項２６］
配列番号２２、３１、２８、２９もしくは３０またはこのような配列から発現されるタンパク質を含む、遺伝子移入された細胞株。
［項２７］
細胞中で標的遺伝子における部位特異的な２本鎖ＤＮＡ破壊を誘導可能な第１のＴＡＬＥＮタンパク質をコードする核酸と、
前記標的遺伝子における遺伝子突然変異の修正のための鋳型である核酸ドナー配列と、
を含む組成物。
［項２８］
前記細胞が、繊維芽細胞、ケラチン産生細胞、誘導型多能性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、造血子孫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、グリア細胞、神経細胞、神経膠前駆細胞、神経膠幹細胞、筋肉細胞、肺細胞、膵臓細胞、肝臓細胞および網内系の細胞からなる群から選択される、項２７に記載の組成物。
［項２９］
前記第１のＴＡＬＥＮタンパク質が、左ＴＡＬＥＮであり、および前記核酸が、前記標的遺伝子において前記部位特異的な２本鎖ＤＮＡ破壊をなすために前記左ＴＡＬＥＮと協働する右ＴＡＬＥＮである第２のＴＡＬＥＮをさらにコードする、項２７に記載の組成物。
［項３０］
前記ＴＡＬＥＮタンパク質をコードする前記核酸または前記核酸ドナー配列がベクターまたはプラスミドの一部である、項２７に記載の組成物。
［項３１］
前記標的遺伝子がＣＯＬ７Ａ１である、項２７に記載の組成物。
［項３２］
前記第１のＴＡＬＥＮまたは前記第２のＴＡＬＥＮが、複数のＴＡＬエフェクター反復配列およびエンドヌクレアーゼドメインと、前記複数のＴＡＬエフェクター反復配列の間のスペーサとを含み、前記エンドヌクレアーゼドメインがスペーサを含む、項２９に記載の組成物。
［項３３］
前記スペーサが１２〜３０ヌクレオチド長である、項３２に記載の組成物。
［項３４］
遺伝性疾患が、表皮水疱症、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）、骨形成不全症、先天性角化不全症、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）、ファンコニ貧血、スフィンゴリピドーシス、リポフスチン沈着症、副腎白質ジストロフィー、重症複合型免疫不全、鎌状赤血球貧血およびサラセミアからなる群から選択される、項２７に記載の組成物。
［項３５］
前記遺伝性疾患が表皮水疱症である、項３４に記載の組成物。
［項３６］
少なくとも１つの核酸を含む組成物であって、
（ｉ）第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第１の核酸、
（ｉｉ）第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第２の核酸、および
（ｉｉｉ）およびドナー配列、
を含み、
前記第１および第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体のそれぞれが、複数のＴＡＬエフェクター反復配列およびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを含み、前記複数のＴＡＬエフェクター反復配列のそれぞれが反復可変性二残基を含み、前記第１のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が、細胞内で標的ＤＮＡの第１のハーフサイト配列に結合可能であり、前記標的ＤＮＡが遺伝子突然変異を有し、かつ、前記第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が前記標的ＤＮＡの第２のハーフサイト配列に結合されるときに前記第１のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が前記標的ＤＮＡを切断可能であり、前記標的ＤＮＡが、スペーサ配列によって分離される前記第１のハーフサイト配列および前記第２のハーフサイト配列を含み、前記第１および第２のハーフサイトが同じヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有し、前記ドナー配列が、少なくとも前記標的ＤＮＡの５’および３’末端で前記標的ＤＮＡと相同である領域を含み、かつ、前記標的ＤＮＡにおいて遺伝子突然変異の修正をもたらすＤＮＡ修復のための鋳型である、組成物。
［項３７］
項２７に記載の第１のＴＡＬＥＮタンパク質をコードする核酸によりコードされるかまたは発現される、タンパク質。
［項３８］
項３７に記載の第１の核酸または第２の核酸によりコードされるかまたは発現される、タンパク質。
［項３９］
項２７に記載の第１のＴＡＬＥＮタンパク質をコードする核酸を含むベクター。
［項４０］
項３７に記載の第１の核酸または第２の核酸を含むベクター。
［項４１］
第１のＴＡＬＥＮタンパク質をコードする核酸と、
核酸ドナー配列と、を含む組成物であって、
前記第１のＴＡＬＥＮタンパク質は、細胞中で、表皮水疱症を引き起こし得る遺伝子突然変異を有するＣＯＬ７Ａ１遺伝子において部位特異的な２本鎖ＤＮＡ破壊を誘導可能であり、
前記核酸ドナー配列は、前記ＣＯＬ７Ａ１遺伝子において前記遺伝子突然変異の修正のための鋳型である、組成物。

Claims (11)

1. 遺伝子突然変異遺伝子により引き起こされる遺伝性疾患または障害の処置での使用のための組成物であって、
   初代線維芽細胞、ヒト初代線維芽細胞、および二倍体ヒト線維芽細胞からなる群から選択された細胞中で標的遺伝子における部位特異的な２本鎖ＤＮＡ破壊を誘導可能な第１のＴＡＬＥＮタンパク質をコードする核酸と、
   核酸ドナー配列と、
   を含み、
   前記ドナー配列が前記標的遺伝子における遺伝子突然変異の修正のための鋳型であり、前記遺伝性疾患が表皮水疱症であり、さらに前記標的遺伝子がＣＯＬ７Ａ１である、組成物。
2. 前記第１のＴＡＬＥＮタンパク質が、左ＴＡＬＥＮであり、および前記核酸が、前記標的遺伝子において前記部位特異的な２本鎖ＤＮＡ破壊をなすために前記左ＴＡＬＥＮと協働する右ＴＡＬＥＮである第２のＴＡＬＥＮをさらにコードする、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ＴＡＬＥＮタンパク質をコードする前記核酸または前記核酸ドナー配列がベクターまたはプラスミドの一部である、請求項２に記載の組成物。
4. 前記第１のＴＡＬＥＮまたは前記第２のＴＡＬＥＮが、複数のＴＡＬエフェクター反復配列およびエンドヌクレアーゼドメインと、前記複数のＴＡＬエフェクター反復配列の間のスペーサとを含み、前記エンドヌクレアーゼドメインがスペーサを含む、請求項２または請求項３に記載の組成物。
5. 前記スペーサが１２〜３０ヌクレオチド長である、請求項４に記載の組成物。
6. 遺伝子突然変異遺伝子により引き起こされる遺伝性疾患または障害の処置での使用のための、少なくとも１つの核酸を含む組成物であって、
   （ｉ）第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第１の核酸、
   （ｉｉ）第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第２の核酸、および
   （ｉｉｉ）ドナー配列、
   を含み、
   前記第１および第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体のそれぞれが、複数のＴＡＬエフェクター反復配列およびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを含み、前記複数のＴＡＬエフェクター反復配列のそれぞれが反復可変性二残基を含み、前記第１のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が、初代線維芽細胞、ヒト初代線維芽細胞、および二倍体ヒト線維芽細胞からなる群から選択された細胞内で標的ＤＮＡの第１のハーフサイト配列に結合可能であり、前記標的ＤＮＡが遺伝子突然変異を有し、かつ、前記第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が前記標的ＤＮＡの第２のハーフサイト配列に結合されるときに前記第１のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が前記標的ＤＮＡを切断可能であり、
   前記標的ＤＮＡが、スペーサ配列によって分離される前記第１のハーフサイト配列および前記第２のハーフサイト配列を含み、前記第１および第２のハーフサイトが同じヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有し、前記ドナー配列が、少なくとも前記標的ＤＮＡの５’および３’末端で前記標的ＤＮＡと相同である領域を含み、かつ、前記標的ＤＮＡにおいて遺伝子突然変異の修正をもたらすＤＮＡ修復のための鋳型であり、
   前記ドナー配列が前記標的ＤＮＡにおける前記遺伝子突然変異の修正のための鋳型であり、前記遺伝性疾患が表皮水疱症であり、さらに前記標的ＤＮＡがＣＯＬ７Ａ１である、組成物。
7. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の第１のＴＡＬＥＮタンパク質をコードする核酸によりコードされるかまたは発現される、タンパク質。
8. 請求項６に記載の第１の核酸または第２の核酸によりコードされるかまたは発現される、タンパク質。
9. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の第１のＴＡＬＥＮタンパク質をコードする核酸を含むベクター。
10. 請求項６に記載の第１の核酸または第２の核酸を含むベクター。
11. 第１のＴＡＬＥＮタンパク質をコードする核酸と、
    核酸ドナー配列と、を含む組成物であって、
    前記第１のＴＡＬＥＮタンパク質は、初代線維芽細胞、ヒト初代線維芽細胞、および二倍体ヒト線維芽細胞からなる群から選択された細胞中で、表皮水疱症を引き起こし得る遺伝子突然変異を有するＣＯＬ７Ａ１遺伝子において部位特異的な２本鎖ＤＮＡ破壊を誘導可能であり、
    前記ドナー配列は、前記ＣＯＬ７Ａ１遺伝子における前記遺伝子突然変異の修正のための鋳型である、組成物。