JP2018532703A - 改善された安定性および免疫原性を有するワクチン組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2015年9月3日に出願された米国仮出願第62/213,947号;2015年11月16日に出願された同第62/255,786号、2016年3月16日に出願された同第62/309,216号および2016年6月16日に出願された同第62/350,973号の開示内容を、全ての目的のためにそれらの全体について取り込む。
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参考として本明細書に援用される:配列表のコンピュータで読み込み可能な形式のコピー(ファイル名:NOVV_060_03US_SeqList_ST25.txt、記録日:2016年9月6日;ファイルサイズ:91キロバイト)。
技術分野
本開示は、免疫応答を刺激するために有用なナノ粒子に全般に関する。ナノ粒子は、界面活性剤コアと会合している抗原、例えば糖タンパク質抗原を提供し、典型的には組換えアプローチを使用して産生される。ナノ粒子は、安定性が改善され、エピトープ提示が増強されている。本開示は、ナノ粒子を含有する組成物、それらを産生するための方法および免疫応答を刺激する方法も提供する。
を含み、および第3のRSV Fナノ粒子タイプは異方性ロッドと球状オリゴマーとの中間体を含む。
Fナノ粒子の一部の実施形態では、各RSV Fタンパク質三量体は、配列番号2の残基137〜146に対応する1から10アミノ酸の欠失を有するRSV Fタンパク質からなる群より選択されるRSV Fタンパク質を含有する。RSV Fナノ粒子の一部の実施形態では、各RSV Fタンパク質三量体は、配列番号2の残基137〜146に対応する1から10アミノ酸の欠失および不活性化主要融合切断部位を有するRSV Fタンパク質からなる群より選択されるRSV Fタンパク質を含有する。
Fナノ粒子を含有するワクチン製剤は、何らかの全長ペプチドを有する成熟ペプチド(配列番号8)から実質的になる。経時的に少量のトランケート型RSV Fペプチドがタンパク質分解のために生じる場合がある。しかし有利には、本明細書に開示のRSV Fナノ粒子は、そのような分解を最小化し、長期の安定性を提供する。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「a」、「an」および「the」は、内容が明らかに他を示す場合を除いて複数の参照物を含む。それにより例えば「タンパク質(a protein)」を参照することは、1つのタンパク質またはそのようなタンパク質の混合物を指す場合があり、「方法(the method)」を参照することは、当業者に公知の等価のステップおよび/または方法を参照することを含み、他も同様である。
病原体由来抗原は、安定性が改善され、優れた免疫原性を有する、界面活性剤コアを囲むナノ粒子を提供するために非イオン性界面活性剤と組み合わされる。本開示は、病原体に対して被験体にワクチン接種するための方法および組成物も提供する。特定の態様では、病原体は、ウイルスである。抗原は、典型的にはタンパク質、しばしば糖タンパク質である。同様に、ワクチン組成物としての使用が見出されたナノ粒子を含有する組成物が開示される。ナノ粒子を産生するおよびワクチン組成物を産生する方法も開示される。
本開示のナノ粒子は、非イオン性界面活性剤コアと会合している抗原を含む。図6上パネルは、界面活性剤コアと会合している複数のRSV F抗原の例を例示している。図35は、エボラナノ粒子を示している。有利にはナノ粒子は、それらが安定性の増強を提供するように環境ストレスへの耐性が改善されている。
ナノ粒子は、外側に突出したヘッド領域および疎水性領域を含み、PS80界面活性剤が抗原によって囲まれた中央コアを形成している、マルチオリゴマー糖タンパク質−PS80タンパク質−界面活性剤ナノ粒子にアセンブルした抗原を含有してよい。
本開示のナノ粒子は、天然に存在しない産生物であり、その構成成分は天然では一緒には存在しない。一般に本明細書に開示の方法は、第1の界面活性剤がタンパク質を単離するために使用され、次いでその第1の界面活性剤がナノ粒子を形成するために第2の界面活性剤に交換される界面活性剤交換アプローチを使用する。
ni細胞、例えばハイファイブ細胞およびDrosophila S2細胞である。
。別の実施形態では、バイオリアクターは、予め滅菌されたプラスチックバッグ(例えばCellbag(登録商標)、Wave Biotech、Bridgewater、N.J.)である。他の実施形態では、予め滅菌されたプラスチックバッグは、約50Lから3500Lのバッグである。
宿主細胞の増殖後、タンパク質は界面活性剤および精製プロトコールを使用して宿主細胞から収集されてよい。宿主細胞が48から96時間増殖された後、細胞は培地から単離され、界面活性剤含有溶液が細胞膜を可溶化し、タンパク質を界面活性剤抽出物中に放出するために加えられる。Triton X−100および、NP−9としても公知のtergitolは、それぞれ抽出のための好ましい界面活性剤である。界面活性剤は、約0.1%から約1.0%の最終濃度で加えられてよい。例えば濃度は、約0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.5%、約0.7%、約0.8%または約1.0%であってよい。ある特定の実施形態では、範囲は、約0.1%から約0.3%であってよい。好ましくは濃度は約0.5%である。
、Tergitol15−S−7型、Tergitol15−S−9型、TergitolNP−10型、TergitolNP−4型、TergitolNP−40型、TergitolNP−7型、TergitolNP−9型、TergitolTMN−10型、TergitolTMN−6型、Triton X−100またはこれらの組み合わせであってよい。
ナノ粒子を形成するために、宿主細胞からタンパク質を抽出するために使用される第1の界面活性剤は、ナノ粒子構造に達する第2の界面活性剤で実質的に置き換えられる。NP−9は、好ましい抽出界面活性剤である。典型的にはナノ粒子は、HPLCによって測定された場合検出可能なNP−9を含有しない。第2の界面活性剤は、PS20、PS40、PS60、PS65およびPS80からなる群より典型的には選択される。好ましくは第2の界面活性剤はPS80である。ナノ粒子製剤の安定性を維持するために、第2の界面活性剤とタンパク質との比は、ある特定の範囲内に維持される。
体または四量体であってよい糖タンパク質オリゴマーを有するナノ粒子を提供すると考えられる。
理論に束縛されることなく、抗原を非イオン性界面活性剤コアと会合させることは、優れた安定性および抗原提示を提供すると考えられる。本明細書で開示のナノ粒子は、驚くほど良好な安定性および免疫原性を提供する。有利な安定性は、適切な保存ができない国々で使用されるワクチンについて特に有用であり;例えばアフリカのある特定の場所では冷蔵できない場合があり、それによりエボラウイルスおよびRSVなどの、保存条件の困難さに直面している地域で流行している疾患に対するワクチンは、安定性の改善が特に役立つ可能性がある。さらに中性pHアプローチを使用して産生されたHAインフルエンザナノ粒子は、公知の組換えインフルエンザワクチンよりも優れたフォールディングを示す。
ケート型F1タンパク質の形成を測定することによって決定できる。有利には本明細書に開示のRSV−Fナノ粒子は、図12に示すとおり、pH(pH3.7)、高pH(pH10)、温度上昇(50℃、2週間)およびさらに過酸化物による酸化を含む種々のストレスへの応答において対照RSV−Fタンパク質と比べてペプチドマッピングによって90から100%と測定される存在量でインタクトな抗原性部位IIを有利に保持している。
典型的な実施形態では、ナノ粒子を産生するために使用される抗原は、ウイルスタンパク質である。一部の態様では、タンパク質は、改変されてよいが、天然ペプチドに対する免疫応答を刺激する能力を保持している。一部の態様では、タンパク質は、界面活性剤コアへのタンパク質の会合を促進する膜貫通ドメインを本質的に含有する、または含有するように適合されている。しばしばタンパク質は、天然の糖タンパク質である。
一態様では、ウイルスは、呼吸器多核体ウイルス(RSV)であり、ウイルス抗原は融合(F)糖タンパク質である。RSV Fタンパク質の構造および機能は、十分に特徴付けられている。野生型構造の例として図1を参照されたい。本明細書に記載の組成物における使用のために好適なRSV−Fタンパク質は、A2、Long、ATCC VR−26、19、6265、E49、E65、B65、RSB89−6256、RSB89−5857、RSB89−6190およびRSB89−6614などのRSV株由来であってよい。ある特定の実施形態では、RSV Fタンパク質は、それらの天然改変体と比べて変異されている。これらの変異は、タンパク質発現の改善、免疫原性の増強などの望ましい特徴を付与する。RSV−Fタンパク質構造を記載する追加的情報は、Swansonら、A Monomeric Uncleaved Respiratory Syncytial Virus F Antigen Retains Prefusion−Specific Neutralizing Epitopes. Journal of Virology、2014年、88巻、11802〜11810頁、Jason
S. McLellanら、Structure of RSV Fusion Glycoprotein Trimer Bound to a Prefusion−Specific Neutralizing Antibody. Science、2013年、340巻、1113〜1117頁に見出すことができる。
μg/mLの範囲のRSV Fと共に含有してよい。他の態様では、ナノ粒子薬物製品は、組成物中に約0.035%から約0.04%のPS80を300μg/mLから約500μg/mLのRSV Fと共に含有してよい。さらに他の態様では、ナノ粒子薬物製品は、組成物中に約0.035%から約0.04%のPS80を350〜500μg/mLのRSV Fと共に含有してよい。
Fの分子量は65kDである。モル比は、次のとおり算出される:(PS80濃度×10×65000)÷(1310×RSV F濃度(mg/mL))。それにより例えば図13に示すとおり、タンパク質によって測定されるナノ粒子濃度は、270μg/mLであり、PS80濃度は0.015%および0.03%である。これらは、PS80のRSV Fタンパク質に対するモル比、27:1(すなわち、0.015×10×65000/(1310×0.27))および55:1をそれぞれ有する。
ナノ粒子プラットホームは、インフルエンザ抗原を被験体の免疫系に提示するために特に有用である。インフルエンザナノ粒子ワクチンを産生するための以前のアプローチは、界面活性剤を除去するために疎水性相互作用カラムを使用した、または産生物精製の際に生じる非特異的相互作用を低減するために最小量のみの界面活性剤を含有した。しかし、界面活性剤交換ステップを実施することによって、優れた特性を有する非イオン性界面活性剤コアを有するナノ粒子を産生できることがここに発見された。ナノ粒子は、環境ストレスによる分解への耐性によって証明される優れた安定性を示し、ワクチンのための特に有用な特性として長期の保存期間を可能にする。加えて、ナノ粒子構造は、抗原を特に有利な様式で提示するものである。
る。例えばナノ粒子は、サブタイプH1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15およびH16から選択されるHAタンパク質を含有する場合がある。ナノ粒子は、サブタイプN1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8およびN9から選択されるNAタンパク質を含有する場合がある。系統学的にHAおよびNAタンパク質は、群に分けられる。HAについて群1はH1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13およびH16を含有し、群2はH3、H4、H7、H10、H14およびH15を含有する。NAも2つの群を形成し:群1はN1、N4、N5およびN8を含有し、群2はN2、N3、N6、N7およびN9を含有する。ある特定の態様では、抗原は、天然インフルエンザHAタンパク質またはNAタンパク質に少なくとも90%同一性、少なくとも95%同一性、少なくとも97%同一性または少なくとも99%を有してよい。
本開示は、エボラウイルス感染および/または疾患を処置する、好転させる、または予防するための方法および組成物も提供する。具体的には組成物は、ワクチン組成物である。有利には本明細書に開示のワクチン組成物は、動物モデルにおける致死性チャレンジに100%生存を提供する。組成物は、ウイルス核酸を検出するためにRT−PCRを使用する場合、ほぼ検出限界またはそれ未満のウイルス量も維持する。
ナノ粒子を調製するために使用されるエボラ抗原は、典型的にはエボラ糖タンパク質(GP)抗原である。抗原は、様々な株由来であってよい。本明細書で開示の組成物は、1個、2個、3個、4個、5個または6個の別々のエボラ株由来のナノ粒子を含有してよい。例えば株は、Makona、Sudan、Zaire、Restonであってよい。他の態様では、エボラGPは、1つまたは複数のこれらの株とアミノ酸または核酸同一性を共有してよい。例えばGPは、Makona、Sudan、ZaireまたはRestonウイルス由来の1つまたは複数のGPと約80%同一、約85%同一、約90%同一、約95%同一、約97%同一、約98%同一または約99%同一であってよく、ここで同一性はタンパク質または核酸の全長にわたって測定される。一部の態様では、エボラGPは、配列番号27もしくは28またはこれらに同一性を有するタンパク質を含んでよいまたはこれらからなっていてもよい。
virus challenge in nonhuman primates immunized with rabies virus based bivalent
vaccine. PLoS Pathog.2013年;9巻(5号):は、非ヒト霊長類(NHP)の狂犬病/EBOVキメラワクチンモデルにおいて、抗体アイソタイプがウイルス中和およびエボラウイルスチャレンジに対する防御において役割を演じることを示した。マウスIgG2a抗体は、IgG−Fc受容体(FcγR)および補体(C1q)に効率的に結合するヒトIgG1抗体の等価物であり(Bruhns, P. Properties of mouse and human IgG receptors and their contribution to disease models Blood.2012年;119巻:5640〜5649頁;Vidarsson G、Dekkers G、Rispens T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Front. Immunol.2014年;5巻:520頁)、例えば抗体依存性細胞媒介細胞傷害性を通じてウイルス感染の消散を助けることができる。in vivoで完全に防御的であった全ての抗体は、IgG2aサブクラスであり;すなわちヒトIgG1と同じであった。したがって本明細書で開示の組成物は、防御免疫応答の一部としてIgG1抗体の産生を刺激する。
s infection」、Viruses.2012年10月23日;4巻(10号):2400〜16頁;Geisbertら、「Pathogenesis of Ebola hemorrhagic fever in cynomolgus macaques: evidence that dendritic cells are early and sustained targets of infection」、Am J Pathol.2003年12月;163巻(6号):2347〜70頁を参照されたい。したがって本開示の一部の態様では、防御効果は、ウイルス曝露後約7日、約10日、約14日または約21日後に検出するRT−PCRの能力より低いウイルス量の低減を含む。
本明細書で開示の抗原は、これらの抗原の変種および変異体を包含する。ある特定の態様では、抗原は、開示の抗原に同一性を共有してよい。一般に、具体的に同定された抗原の内容において具体的に定義されない限り、同一性百分率は、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%または少なくとも98%であってよい。同一性百分率は、www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/で入手可能なアラインメントプログラムClustalW2を使用して算出できる。次の初期設定パラメーターがペアワイズアラインメントのために使用されてよい:タンパク質重量マトリクス=Gonnet;ギャップオープン=10;ギャップ伸長=0.1。
、約30アミノ酸、約50アミノ酸、約75アミノ酸、約100アミノ酸または約200アミノ酸だけトランケートされてよい。C末端は、N末端の代わりにまたは追加でトランケートされてよい。例えばC末端は、約10アミノ酸、約30アミノ酸、約50アミノ酸、約75アミノ酸、約100アミノ酸または約200アミノ酸だけトランケートされてよい。トランケーションを有するタンパク質との同一性を算出する目的のために、同一性はタンパク質の残余部分にわたって測定される。
本明細書において使用される組み合わせナノ粒子は、2つまたはそれより多くの異なる病原体に対して免疫応答を誘導するナノ粒子を指す。特定の組み合わせに応じて病原体は、同じ種の異なる株もしくはサブタイプであってよく、または病原体は異なる種であってよい。組み合わせナノ粒子を調製するために複数の病原体由来の糖タンパク質は、界面活性剤交換段階でそれらを結合させることによって単一のナノ粒子に組み合わされてよい。カラムへの糖タンパク質の結合に続く界面活性剤交換は、複数の糖タンパク質タイプが界面活性剤コアの周りに形成し、組み合わせナノ粒子を提供することを可能にする。
本明細書で開示の組成物は、予防的または治療的のいずれで使用されてもよいが、典型的には予防的である。したがって本開示は、感染を処置するまたは予防するための方法を含む。方法は、本開示の免疫原性組成物の治療的または予防的量を被験体に投与するステップを含む。好ましくは薬学的組成物は、防御効果を提供するワクチン組成物である。他の態様では、防御効果は、曝露集団の百分率での感染に関連する症状の好転を含んでよい。例えば病原体に応じて、組成物は、未処置被験体と比べて:発熱疲労、筋肉痛、頭痛、咽頭炎、嘔吐、下痢、皮疹、腎臓および肝臓の機能障害の症状、内出血ならびに外出血から選択される1つまたは複数のウイルス疾患症状を予防または低減できる。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示の組成物は、免疫応答を増強するために1つまたは複数のアジュバントと組み合わされてよい。他の実施形態では、組成物は、アジュバントを含まずに調製され、それによりアジュバント不含有組成物として投与されるように利用可能である。有利には本明細書に開示のアジュバント不含有組成物は、単一用量として投与された場合に防御免疫応答を提供できる。強い免疫応答を誘導するミョウバン不含有組成物は、約60歳およびそれより年長の成人で特に有用である。
一部の実施形態では、アジュバントは、ミョウバン(例えばAlPO4またはAl(OH)3)であってよい。典型的にはナノ粒子は、ミョウバンに実質的に結合している。例えばナノ粒子は、ミョウバンに少なくとも80%結合、少なくとも85%結合、少なくとも90%結合または少なくとも95%結合してよい。しばしばナノ粒子は組成物中でミョウバンに92%から97%結合している。用量当たりに存在するミョウバンの量は、典型的には約400μgから約1250μgの間の範囲にある。例えばミョウバンは、用量当たり約300μgから約900μg、約400μgから約800μg、約500μgから約700μg、約400μgから約600μgまたは約400μgから約500μgの量で存在してよい。典型的にはミョウバンは、120μgのタンパク質ナノ粒子の用量当たり約400μgで存在する。
サポニンを含有するアジュバントは、本明細書で開示の免疫原と組み合わされてもよい
。サポニンは、樹木Quillaja saponaria Molinaの樹皮由来グリコシドである。典型的にはサポニンは、複数の画分をもたらす多ステップ精製工程を使用して調製される。本明細書において使用される用語「Quillaja saponaria Molina由来サポニン画分」は、Quillaja saponariaの半精製もしくは規定のサポニン画分またはその実質的に純粋な画分を記載するために総称的に使用される。
サポニン画分を産生するためのいくつかのアプローチは好適である。画分A、BおよびCは、米国特許第6,352,697号に記載されており、次のとおり調製できる。Quil A由来の親油性画分、粗水性Quillaja saponaria Molina抽出物は、クロマトグラフィーによって分離され、親油性画分を回収するために水中70%アセトニトリルで溶出される。次いでこの親油性画分は、酸性水中25%から60%アセトニトリルへの勾配を使用する溶出で半分取HPLCによって分離される。本明細書で「画分A」または「QH−A」と称される画分は、およそ39%アセトニトリルで溶出される画分である、またはこれに対応する。本明細書で「画分B」または「QH−B」と称される画分は、およそ47%アセトニトリルで溶出される画分である、またはこれに対応する。本明細書で「画分C」または「QH−C」と称される画分は、およそ49%アセトニトリルで溶出される画分である、またはこれに対応する。画分の精製に関する追加的情報は、米国特許第5,057,540号に見出される。本明細書に記載のとおり調製される場合、Quillaja saponaria Molinaの画分A、BおよびCは、定義できる特性を有して化学的に密接に関連する分子の群またはファミリーをそれぞれ表す。それらが得られたクロマトグラフィー条件は、溶出プロファイルおよび生物学的活性に関してバッチごとの再現性が高度に一致しているものである。
Molina Spikoside(lsconova AB、Ultunaallen 2B、756 51 Uppsala、Sweden)に記載されている。EP03632279B2の画分QA−1、QA−2、QA−3、QA−4、QA−5、QA−6、QA−7、QA−8、QA−9、QA−10、QA−11、QA−12、QA−13、QA−14、QA−15、QA−16、QA−17、QA−18、QA−19、QA−20、QA−21およびQA−22、特にQA−7、QA−17、QA−18およびQA−21は使用できる。それらは、EP03632279B2に、特に6頁ならびに8および9頁の実施例1に記載のとおり得られる。
サポニン画分は、ISCOM(免疫刺激複合体(Immune Stimulating COMplex))と称されるケージ様粒子の形態で投与されてよい。ISCOMは、EP0109942B1、EP0242380B1およびEP0180546B1に記載のとおり調製できる。特定の実施形態では、EP9600647−3(PCT/SE9
7/00289)に記載のとおり輸送および/またはパッセンジャー抗原は使用されてよい。
一部の態様では、ISCOMは、ISCOMマトリクス複合体である。ISCOMマトリクス複合体は、少なくとも1つのサポニン画分および脂質を含む。脂質は、コレステロールなどの少なくとも1つのステロールである。特定の態様では、ISCOMマトリクス複合体は、リン脂質も含有する。ISCOMマトリクス複合体は、必ずしもグリコシドではない1つまたは複数の他の免疫調節性(アジュバント活性)物質も含有する場合があり、EP0436620B1に記載のとおり産生できる。
る。他の実施形態では、Quillaja saponaria Molina由来サポニン画分は、QA1〜21のいずれか1つから選択される。
らびにそれらの使用は、その開示について参照により組み込まれる米国特許第5,057,540号;第6,231,859号;第6,352,697号;第6,524,584号;第6,846,489号;第7,776,343号および第8,173,141号に記載されている。
一部の組成物では、追加でまたは代替として他のアジュバントが使用されてよい。全ての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれるVogelら、「A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients(第2版)」に記載の任意のアジュバントの含有は、本開示の範囲内であると想定される。他のアジュバントは、完全フロイントアジュバント(死菌Mycobacterium tuberculosisを含有する免疫応答の非特異的刺激因子)、不完全フロイントアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントを含む。他のアジュバントは、GMCSP、BCG、thur−MDPおよびnor−MDPなどのMDP化合物、CGP(MTP−PE)、脂質A、およびモノホスホリル脂質A(MPL)、MF−59、細菌から抽出された3種の構成成分を含有するRIBI、MPL、トレハロースジミコレート(TDM)ならびに2%スクアレン/Tween(登録商標)80乳剤中の細胞壁骨格(CWS)を含む。一部の実施形態では、アジュバントは、少層(paucilamellar)脂質小胞;例えばNovasome(登録商標)であってよい。Novasome(登録商標)は、約100nmから約500nmの範囲の少層非リン脂質小胞である。それらは、Brij72、コレステロール、オレイン酸およびスクアレンを含む。Novasomeは、有効なアジュバントであることが示されている(米国特許第5,629,021号、第6,387,373号および第4,911,928号を参照されたい。
本明細書で開示の組成物は、全身性経路もしくは粘膜経路もしくは経皮的経路を介して、または特定の組織に直接投与されてよい。本明細書において使用される用語「全身性投与」は、非経口投与経路を含む。具体的には、非経口投与は、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内または胸骨内注射、静脈内または腎臓透析注入技術を含む。典型的には全身性、非経口投与は筋肉内注射である。本明細書において使用される用語「粘膜投与」は経口、鼻腔内、膣内、直腸内、気管内、腸管および眼への投与を含む。好ましくは投与は、筋肉内である。
一部の態様では、小児用用量は、約30μgから約90μgの範囲であってよい。ある特定の集団は、アジュバントを含んでまたは含まずに投与されてよい。例えば年長者に投与する場合、好ましくはミョウバンは含まれない。ある特定の態様では、組成物は、追加のアジュバントを含まなくてよい。そのような環境では用量は、約10%増加されてよい。
RSV Fタンパク質の発現および精製
配列番号8を有するRSV Fタンパク質をバキュロウイルス発現系において発現させ、RSV Fタンパク質を発現している組換えプラークを選び、確認した。次いで、組換えウイルスを、Sf9昆虫細胞の感染により増幅させた。昆虫細胞の培養物は、バキュロウイルスでおよそ3MOI(感染多重度=ウイルスffuまたはpfu/細胞)で感染させた。培養物および上清を、感染48〜72時間後に採取した。粗細胞採取物、およそ30mLを、およそ800×gで15分間の遠心分離により清澄化した。RSV Fタンパク質を含有する、得られた粗細胞採取物を下記の通り精製した。
とインキュベートした。RSV Fタンパク質を、高濃度のMMPによってレンズマメレクチンカラムから溶出した。溶出後に、RSV Fタンパク質三量体を、RSV Fタンパク質三量体および界面活性剤コア中に含有されるPS80で構成されるミセルナノ粒子にアセンブルさせる。界面活性剤交換後に、低pH不活性化ステップがあり、続いて0.1% PS80を含む緩衝液の存在下に硫酸カラム上でインキュベーションした。
ワクチン組成物の調製
投与するワクチン産物のためのナノ粒子を得るために、原薬を、PS80:RSVタンパク質モル比約50を持つ薬物製品に希釈した。原薬を解凍し、希釈し、投与前に2〜8℃で保存するためにガラスバイアルまたは予備充填した注射器に充填した。ナノ粒子は、ミョウバンアジュバントに結合した。ミョウバンアジュバントを添加し、混合して、ナノ粒子の約95%がミョウバンに結合していることを確実にし、このことは、0.5mL体積中でRSV Fナノ粒子の120μg用量当たり約0.4mgであることを意味する。
ナノ粒子におけるRSV F糖タンパク質の特徴付け
様々な分析技術によりナノ粒子におけるタンパク質構造を分析した。図3は、産生されたRSV Fタンパク質の最も高いピークが、パルミトレイン酸を含有することを示す(ピーク2A)。2番目に大きいピークは、パルミチン酸を含有する(ピーク2B)。残りのピークは、いずれの脂肪酸も欠き(ピーク5)および可溶型(ピーク1)で得られた。SDS−PAGEゲルでの分析により、F1+2タンパク質、F1、F1A、F1BおよびF1C部分ならびにF2を含めた追加の改変体が分離された。図4を参照のこと。ペプチド構造の分析を、ペプチドマッピングを使用して実施した。図5を参照のこと。RSV
F糖タンパク質上のグリカン構造を評価するために、HPLC−FLDを実施した。結果は、主要なグリカン構造がフコシル化されていることを実証した。
電子顕微鏡検査によるRSV Fナノ粒子の検査
実施例1において調製したナノ粒子を、電子顕微鏡により可視化した。結果から、界面活性剤コアを囲むRSV F糖タンパク質を含有するナノ粒子の形成を確認した。界面活性剤コアの正確な組成は、不明なままである。図6は、得られたナノ粒子のタイプを例示する。RSV Fタンパク質は、界面活性剤交換後でも三量体構造を維持した。三量体/ナノ粒子の数および形態が変動するいくつかのタイプのナノ粒子が得られた。図6は、複数の三量体を界面活性剤コアの周りに見ることができることを示す。強調された部分では、7つの三量体が、界面活性剤を囲んで示される。図6の主パネルは、産生された界面活性剤コアの周りの三量体の範囲を例示する。下段左パネルにおけるRSV Fタンパク質三量体の模式図構造は、界面活性剤コアと会合する底部を持つ三量体の配向を例示し、これは、各RSV F糖タンパク質に付着している脂肪酸により促進される。
RSV Fナノ粒子の粒子特徴付け
動的光散乱(DLS)を活用して、ブラウン運動における粒子の光散乱パターンの変化を測定することによりナノ粒子のサイズ分布プロファイルを決定した。ナノ粒子サイズは、RSV Fナノ粒子の濃度に対するイオン性界面活性剤の濃度の線形関数として決定することができた(図7および8を参照のこと)。
ナノ粒子の安定性の増強:分子特徴付け
活用した5つのストレッサーは、50℃で48時間、1週間および2週間時点での熱ストレス;低pH(25℃で3.7)48時間、4日間および1週間時点;高pH(25℃で10)、24時間、48時間および1週間時点;25℃で過酸化水素酸化、12時間、48時間および1週間時点;ならびに25℃で物理的撹拌、4時間、24時間および1週間時点であった。
ナノ粒子の安定性の増強:維持された免疫原特性
実施例6に記載されるストレスを受けたワクチン組成物を、マウスモデルにおいて免疫原性について評価した。ワクチンを、RSV Fタンパク質0.15、0.45、1.3、4および12μg/mLからなるRSV F用量の範囲にわたって2回の筋肉内注射によってマウスに投与した。以下の条件:50℃で2週間、25℃でpH10を1週間、25℃で0.5%過酸化水素を1週間、でストレスを加えたRSV F組成物を、対照(−70℃での保存から解凍した)を伴って投与した。
ンパク質免疫原性に有意な影響を及ぼさなかった。ストレスを受けた試料は、ストレスを受けていないRSV Fナノ粒子ワクチン組成物対照のそれと類似の抗RSV F IgG抗体力価ならびに同程度の機能性PCAおよびRSV A中和力価を誘導した。(図12A〜12Dを参照のこと)。まとめると、これらの強制的な分解研究は、激しい環境ストレスに曝露してもナノ粒子が強力な免疫応答を誘導することを示す。
ナノ粒子のプロテアーゼ耐性
安定性が改善されたナノ粒子の形成は、ナノ粒子を産生するために使用するPS80の量に依存している。図13は、ナノ粒子を、0.03% PS80(すなわちモル比55)で形成した場合の、0.015%(すなわちモル比27)と比較した18カ月までの安定性の劇的な改善を例示する。左パネルは、時間0に2つの濃度で産生したナノ粒子のSDS−PAGEを示す。データは、参照調製物と類似の結果が、両方のナノ粒子調製物で得られたことを示す。特に、両方が、基本的に分解がないことを例示するF1およびF1+2の強いシグナルを示す。次いで、各調製物のアリコートを、4℃で18カ月間インキュベートし、次いでSDS−PAGEを再び行った。右パネルおよび表のデータは、粒子中に0.015%だけ含有するナノ粒子が、トランケート型F1を生じたことを例示する。対照的に、粒子中に0.03%で調製したナノ粒子は、プロテアーゼに対して優れた耐性を例示した。本発明者らは、界面活性剤およびタンパク質の正しい比を維持することにより、おそらくいくつかの立体障害メカニズムによって保護されるプロテアーゼ感受性部分を持つ糖タンパク質の配向を有するナノ粒子を得られると考える。本発明者らは、0.06%またはそれを超えるPS80の濃度が、凝集物形成を増加させることをさらに観察した。総合すれば、データは、ナノ粒子安定性に対する最適PS80レベルが、約0.03%〜約0.05%であることを示す。
HAナノ粒子の精製
TMAEカラムを、流量:91.7cm 30mL/分で緩衝液A1(25mM Tris pH7.5、70mM NaCl、0.02% NP9)0.5CVで前平衡化した。試料を、20mL/分(滞在時間25分間)でロードし、次いでEQ緩衝液A1(25mM Tris pH7.5、70mM NaCl、0.02% NP−9)で洗浄した。次いで精製試料を、15%緩衝液B(25mM Tris pH8、1M NaCl、0.02% NP9)1.25CV、続いて100% B 1.1cvを使用して溶出した。代表的なクロマトグラムを、図18Bに示す。TMAEカラムからの産物を、緩衝液A11:25mM リン酸ナトリウムpH6.0、10mM NaCl、0.05% PS80 3CV(流量:147cm/時間 13mL/分)で前平衡化したレンズマメレクチンアフィニティークロマトグラフィーカラムに加えた。試料を、滞在時間9.4分間、6.5mL/分、73.5cm/時間でロードした。ロード後、高塩洗浄を、緩衝液A12(25mM リン酸ナトリウムpH6.0、500mM NaCl、0.5% NP−9)3CVで実施した。第1の洗浄後に、界面活性剤交換を、緩衝液A11(25mM リン酸ナトリウムpH6.0、10mM NaCl、0.05% PS80)6CVでカラムを洗浄することにより実施した。次いでPS80を含有するナノ粒子を、100% B 3CV、B1:緩衝液B:25mM リン酸ナトリウムpH6.0、10mM NaCl、0.05% PS80、500mM メチル−アルファ−D−マンノピラノシドで溶出した。代表的なクロマトグラムトレースを、図18Cに示す。レンズマメレクチンカラムからの産物を、緩衝液A1(25mM リン酸ナトリウムpH6.0、10mM
NaCl、0.05% PS80)3CVで硫酸カラムに加え、緩衝液A1 2CVで洗浄し、次いで100%緩衝液B1(25mM リン酸ナトリウムpH7.5、500mM NaCl、0.05% PS80)で溶出した。次いで溶出産物を、50mMリン酸ナトリウムpH9と1:1で組み合わせ、濾過滅菌した。最終産物はpH7.2であった
。クロマトグラムを図18Dに示す。図18Eは、TMAEおよびLLカラムからの精製工程の間に得られた様々な産物のゲルおよびウエスタンブロットを提供する。図18FはS03−カラムからの溶出液を示す。
HAナノ粒子純度の分析
HAナノ粒子を、図17および18に概説するように調製した。様々な株から得られるHA配列を使用して複数のHAナノ粒子調製物の純度を測定した(A/ニューハンプシャー/1/2015、A/スイス/9715293/2013、A/香港/4801/2014、B/プーケット/3073/2013、およびB/ブリスベーン60/2008)。データは、全ての場合で高純度の調製物が得られたことを示した。ゲルデンシトメトリによる分析は、93%を超え、93%から97%の範囲の純度を示した。図19A〜19Hを参照のこと。RP−HPLCにより3つのAサブタイプ株の純度も分析し、純度が83%から85%であることが判明した。図19Iを参照のこと。加えて、ナノ粒子サイズを測定した。ナノ粒子は、22.0nmから29.9nmの直径を示した。図19を参照のこと。
HA超微細構造の分析
電子顕微鏡検査を実施して、HAナノ粒子の構造を評価した。他の糖タンパク質のように、HA糖タンパク質が、PS80界面活性剤コアと会合した三量体を形成することが判明した。各界面活性剤コアは、複数の三量体を含有した。図20を参照のこと。cryo−EM2次元クラス平均を使用して、ナノ粒子上へHA三量体をドッキングさせた。図21Aは、これらのin silicoドッキング実験の結果を示す。上パネルは、第1のナノ粒子上へのHA三量体のはめ込みを示す。下パネルは、ナノ粒子の別の軸(stalk)へのはめ込みを示す。
RSV Fナノ粒子と同時投与したHAナノ粒子の免疫原性分析
マウスモデルにおいてワクチン中のナノ粒子の免疫原性を評価した。2つの抗原(A/スイスH3サブタイプ由来インフルエンザHAタンパク質およびRSV Fタンパク質)を含有するナノ粒子の組み合わせを投与した。また各ナノ粒子を別々に投与した。ワクチンを単独でまたはアジュバントAlPO4もしくはマトリクスMサポニンアジュバントと共に投与した。図22は、群1〜10に投与した処置を示す。群10、対照は、処置しなかった。0および21日目に処置を投与した。異種および同種チャレンジに対するHAIを測定した。図23Aおよび23Bを参照のこと。図23Aは、マトリクスアジュバント化HAナノ粒子が、同種チャレンジに対して特に強い応答を刺激したことを示す。図23Bは、マトリクスMと投与した場合に強いHAI応答が、異種インフルエンザ株A/テキサス/50/2012に対しても得られたことを示し、この応答は、RSV Fナノ粒子との同時投与による影響を受けなかった。
700μg/mLの実質的な抗体力価を誘導したことを示す。RSV Fとインフルエンザナノ粒子の両方によって誘導した場合、アジュバントの非存在下またはAlPO4の存在下でおよそ20μg/mLから40μg/mLの低い応答が得られた。しかしながら、RSV F単独またはHAナノ粒子と組み合わせて投与した場合、マトリクスMの存在下でRSV F応答は強かった。RSV中和抗体の測定は、PCA抗体と類似のパターンを示した。図23Dを参照のこと。
トリプシン耐性ナノ粒子産生
インフルエンザを産生するための特定のアプローチにより、HAタンパク質のトリプシン感受性を得ることができ、その感受性は、免疫原性の減少およびワクチン製剤の安定性をもたらすフォールディングを改変する。トリプシン耐性HAナノ粒子を産生するために、中性pH緩衝液を利用する界面活性剤交換アプローチを使用した。図24A〜Cを参照のこと。
トリプシン耐性ナノ粒子分析
実施例13に記載される工程および産生を使用する様々な株からのHAナノ粒子を評価した。図25Aは、株A/ニューハンプシャー/1/2015(H1N1)の収量が約20mg/Lであったことを示す。B株インフルエンザナノ粒子も、優れた生産性および純度を有した。図25Bは、バルク原薬として評価したB株、B/ブリスベーン/60/08 HAの収量および純度を示す。収量は、約30mg/Lであった。図25Cは、H3N2株の収量を示し、工程が純度約96%および収量約20mg/Lを与えたことを示す。
図25Dは、実施例13におけるトリプシン耐性中性pHアプローチを使用して産生したHAナノ粒子と図18に示すような低pH精製ステップを使用するアプローチとの熱力学的プロファイル比較を提供する。示差走査熱量測定(DSC)方法を使用して、特に、制御された様式で温度を変動させることによって試料溶液と適切な参照(緩衝液/溶媒)との間の熱エネルギー取り込みの差異を測定することにより、溶液中の高分子の熱力学的プロファイルを決定した。Flu HA試料に関して、DSCにより、タンパク質の半分が変性/アンフォールド、半分が非変性/フォールド状態にある温度として定義される遷
移中点(Tm)を可視化できた。
図26は、ナノ粒子が、実施例13に記載の通り産生された場合に得られるトリプシン耐性の改善を例示する。トリプシン感受性を試験するために、HA試料を、0.24mg/mLまで希釈し、37℃で60分間トリプシンを低下させてインキュベートした。トリプシン阻害剤を添加して消化を停止させ、次いでSDS−PAGE分析を実施した。図26の左パネルと右パネルの比較は、トリプシン耐性の増強を例示する。Sf9昆虫細胞において製作した精製HAナノ粒子は、HA0である。トリプシンに曝露した場合、HA0は、H1中のArg AA344でHA1とHA2に切断される。正確にフォールドされたHA三量体は、トリプシンの濃度を増加させてインキュベートした場合にさらなる切断に耐えることになる。中性pHで精製したB/ブリスベーン/60/08はトリプシンに耐性であり、正確にフォールドされている(左パネル)。酸性pHで精製したB/ブリスベーン/60/08 HA1は、トリプシン感受性であり、ミスフォールドしている(右パネル)。図26Bおよび26Cは、トリプシン耐性が様々な株に対して達成されることを例示する。図26Bは、株A/香港/4801/2014を示す。中性pHで精製したA/香港/4801/2014(H3N2)はトリプシンに耐性であり、したがって正確にフォールドされている(左パネル)。酸性pHで精製したA/香港/4801/2014の(H3N2)HA1は、トリプシン感受性であり、正確にフォールドされていない(右パネル)。
組換えインフルエンザワクチンを産生するためのこれまでのアプローチは、幅広い成功を満たさなかった。卵産生または組換え産生インフルエンザワクチンが、トリプシン耐性を呈したかどうか調査するために、上記と同じプロトコールを使用して卵産生および組換えワクチン(それぞれ、Fluzone(登録商標)およびFlublok(登録商標))においてトリプシン感受性を比較した。特に、希釈していないワクチンを、様々な量のトリプシンと37℃で60分間インキュベートし、次いで、トリプシン阻害剤を添加し、
2×試料緩衝液を添加し、SDSページの前に70℃で10分間加熱した。
エボラウイルス糖タンパク質ナノ粒子の構築
2014Makonaエボラウイルスの野生型、全長、無改変EBOV糖タンパク質(GP)遺伝子を、組換えバキュロウイルスにクローニングし、Spodoptera frugiperda Sf9昆虫細胞において発現させた。発現後、N末端シグナルペプチドを切断し、成熟タンパク質を精製し、ナノ粒子を形成させる。精製エボラウイルスGP(EBOV/Mak GP)ナノ粒子は、球状粒子36±4nm(動的光散乱により測定して)にアセンブルした複数のGP三量体で構成される。組換えGPナノ粒子は、2〜9または最高15個の外側に広がる「杯様の」糖タンパク質1(GP1)三量体「付着サブユニット」と共に糖タンパク質2(GP2)「融合サブユニット」を含有するコア領域を有する。
免疫化およびプロトコール
Balb/cマウス(6〜8週齢;Harlan Laboratories Inc.Frederick、MD)を、10匹の群で飼育し、皮下(SC)または筋肉内(IM)投与により免疫化した。リン酸緩衝食塩水(PBS)をプラセボとして使用した。血清のための血液試料を、後眼窩経路によって採集した。採血の前に、動物をイソフルランで麻酔した。
含有するPBSに懸濁した。
Molecular Devices)を使用して、濃度応答を4パラメーター適合曲線に当てはめた。抗体力価を、50%の最大抗体結合(EC50)応答がある最も高い希釈の逆数と定義した。血清IgG力価が、低い検出範囲外にある場合、力価(開始希釈)<100を記録し、値50を試料に割り当てて、群幾何平均力価(GMT)を算出した。IBT Bioservices(Gaithersburg、MD)からのマウス抗EBOV/Mak GPモノクローナル抗体(mAb)(4F3)を、陽性対照として使用した。
単一細胞懸濁物を、注射器のプランジャを使用して組織を穏やかに粉砕することにより個々の脾臓から調製した。単一骨髄細胞懸濁物を、21ゲージ針の注射器を使用して2%
FBSを含有するPBSを骨に流すことにより調製した。細胞を、2% FBSを含有するPBSで2回洗浄し、計数した。IFNγ ELISPOTアッセイを、製造業者の手順に従ってマウスIFNγ ELISPOTキット(eBioscience、San
Diego、CA)を使用して実施した。簡潔には、抗IFNγ抗体(PBS中に15μg/ml)を使用して、ELISPOTプレート(Millipore、Darmstadt、Germany)を100μl/ウェルで、4℃で終夜コーティングした。プレートを、PBSで4回洗浄し、RPMI1640培地+5% FBSを用いて室温で1〜2時間ブロッキングした。体積200μl中の合計3×105個の脾細胞を、完全なEBOV GP配列を網羅する11個の重なり合ったアミノ酸を含む15マーのEBOV GPペプチドプール(2.5μg/ml)で刺激した。イオノマイシン(200ng/ml)を加えたホルボールミリステートアセテート(PMA)(50ng/ml)を陽性対照としておよび培地を陰性対照として使用した。各刺激条件を、3つ組で実施した。アッセイプレートを、5% CO2インキュベータ中で、37℃で終夜インキュベートし、シグナルを、製造業者の指示に基づいて発色させた。スポットを、ELISPOTリーダーおよびImmunospotソフトウェア(Cellular Technology,Ltd.、Shaker Heights、OH)を使用して計数し、分析した。エボラGP特異的スポット数を、GPペプチド刺激したウェルから培地対照のバックグラウンド数を減算することにより得た。グラフに示すデータは、3つ組のウェルの平均である。GP特異的IgG分泌細胞を測定するために、ELISPOTプレートを、EBOV/Mak
GP(PBS中に2.5μg/ml)でコーティングし、4℃で終夜インキュベートした。プレートを洗浄し、上記の通りブロッキングした。ウェル当たり3〜5×105個の脾細胞または骨髄細胞の3つ組を平板培養し、プレートを37℃で終夜インキュベートした。2日目にプレートを洗浄し、ヤギ抗マウスIgG−HRPを添加し、1.5時間インキュベートした。スポットを発色させ、上記の通り計数した。3つ組ウェルから平均スポット数を算出し、示した。
表面染色の場合、細胞を、抗CD16/32抗体(クローン2.4G2)と最初にインキュベートして、Fc受容体をブロッキングした。胚中心細胞を特徴付けるために、新鮮な脾細胞1×106個を、以下の抗体:B220−PerCP、CD19−APC、GL7−BV421、CD95−PE−Cy7(BD Biosciences、CA)の混合物および黄色LIVE/DEAD(登録商標)色素(Life Technologies、NY)と4℃で30分間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、分析のために2% FBSを含有するPBSに懸濁した。濾胞性ヘルパーT細胞を染色するために、1×106個の新鮮な脾細胞を、CXCR5−ビオチンとインキュベートし、2回洗浄し、次いでCD3−BV650、B220−PerCP、CD4−PE−Cy7、ストレプトアビジン−BV421、PD−1−APC、CD69−FITCおよびCD49b−PE(BD Biosciences、CA)を含む抗体の混合物ならびに黄色LIVE/DE
AD(登録商標)色素(Life Technologies)とインキュベートした。細胞を2回洗浄し、分析のために2% FBSを含有するPBSに懸濁した。
Pharmingen、CA)を含む細胞表面マーカーに対する抗体の混合物ならびに黄色LIVE/DEAD(登録商標)色素(Life Technologies、NY)と4℃で20分間インキュベートした。2回の洗浄後、細胞をCytofix/Cytoperm(BD Biosciences)により4℃で30分間固定し、続いてBD
Perm/Wash(商標)(BD Biosciences)で2回洗浄した。細胞を、IFNγ−APC、IL−2−BV 421およびTNFα−PE(BD Biosciences)に対する抗体と4℃で終夜インキュベートした。細胞を洗浄し、データ取得のために1×BD Perm/Wash緩衝液に再懸濁した。全ての染色試料を、LSR−Fortessaフローサイトメーター(Becton Dickinson、San Jose、CA)を使用して取得し、データをFlowjoソフトウェアバージョンXv10(Tree Star Inc.Ashland、OR)で分析した。
EBOV/Mak GP誘導抗体応答および防御効力
EBOV/Mak GPナノ粒子ワクチンの免疫原性を、マウスモデルにおいて、アジュバントありおよびなしで評価した。0、14および28日目に、マウスを、EBOV/Mak GP単独またはマトリクスMもしくはAlPO4アジュバント中に製剤化したEBOV/Mak GP 5μgでSC注射によりワクチン接種した。28日目(第2の免疫化の14日後)に得られた血清の分析は、マトリクスMアジュバント化EBOV/Mak GPが、幾何平均力価(GMT)26,991でMayinga GPに対する高レベルの抗原特異的IgG抗体を誘導したことを示した。マトリクスMを含むEBOV/Mak GPによる免疫化後に得られた応答は、EBOV/Mak GP単独(GMT=266、p=0.001)またはAlPO4でアジュバント化したEBOV/Mak GP(GMT=436、p=0.0001)により誘導されるそれより有意に高かった(図28A)。AlPO4アジュバントは、EBOV/Mak GP単独との比較において抗EBOV/Mak GP IgGのわずかな増加しか提示しなかった。
エボラGP IgG、IgG1およびIgG2a応答の動態
マトリクスMアジュバント化EBOV/Mak GPに対する免疫応答をさらにより詳細に特徴付けるために、Balb/cマウス(10匹/群)の2つの群を、マトリクスM
2.5または5μgいずれかでアジュバント化したEBOV/Mak GP 5μgで注射した。PBS、EBOV/Mak GP単独またはAlPO4を含むEBOV/Mak GPで注射したマウスの群を対照として使用した。14、21、28および60日目に、EBOV/Mak GP特異的IgGおよびIgGサブクラス(IgG1およびIgG2a)を、ELISAにより測定した。
CD4+、CD8+および多機能性T細胞応答
ELISPOTアッセイにおいてEBOV/Mak GPペプチドによる脾臓細胞のex vivo刺激後のIFNγ分泌T細胞の数を測定することにより、異なるEBOV/Mak GP製剤に対するT細胞応答を次に評価した。28日目に、IFNγ分泌細胞は、マトリクスMを含むEBOV/Mak GPで免疫化したマウス由来の脾臓においてマトリクスM用量依存的な様式で増加した(図30A、30B)。マトリクスM 5.0および2.5μgを含むEBOV/Mak GPを受けた群におけるIFNγ分泌細胞の平均数は、EBOV/Mak GP単独を受けた群よりそれぞれ17倍および10倍高く、AlPO4を含むEBOV/Mak GPを受けた群よりそれぞれ8倍および5倍高かった(図30A)。
胚中心および濾胞性ヘルパーT細胞応答
脾臓におけるGC B細胞の頻度および絶対数を、フローサイトメトリーによる染色により分析した(図31A)。分析は、28日目(第2のワクチン注射の7日後)に、マトリクスM 2.5および5μgでアジュバント化したEBOV/Mak GPが、プラセボ、EBOV/Mak GP単独またはAlPO4を含むEBOV/Mak GP(それぞれ、0.38、0.41および0.44%)と比較してそれぞれ1.22および2.12%のGC頻度で応答を誘導したことを示した(図31B)。したがって、脾臓におけるGC細胞絶対数も、マトリクスMを受けた群で増加した(図31C)。60日目までに、頻度および絶対数は、バックグラウンドレベルに戻った(図31Dおよび31E)。
と比較してマトリクスMを含むEBOV/Mak GPによって増強された(図32C)。60日目までに、TFH細胞の頻度および絶対数は、バックグラウンドに近いレベルに後退した(図32Dおよび32E)。
EBOV/Mak GP特異的形質細胞
EBOV/Mak GP特異的形質細胞に対するマトリクスMの影響を評価するために、脾臓および骨髄中のIgG産生細胞の数を、免疫化後60日目に分析した。60日目における分析は、マトリクスMアジュバント化EBOV/Mak GPワクチンで免疫化したマウス由来の脾臓中のごく少数のEBOV/Mak GP特異的IgG分泌細胞(<6/106個脾細胞)を実証した(図33A)。IgG分泌細胞は、EBOV/Mak GP単独およびAlPO4を含むEBOV/Mak GPで免疫化したマウス由来の脾臓中には検出されなかった(図33A)。対照的に、多数のEBOV/Mak GP特異的IgG分泌細胞が、マトリクスMアジュバント化EBOV/Mak GPを受けたマウス由来の骨髄に見られ(図33B)、長命形質B細胞の形成が実証された。
ナノ粒子に対する抗体結合の特徴付け
ナノ粒子に結合するいくつかの抗エボラ抗体の能力を試験した。抗体は、13C6、13F6、6D8およびKZ52である。EC50曲線および値を図36に示し、追加の結合動態データを図37に示す。図38は、参照として13C6を使用した有効性データを示す。4つの抗体のうちの3つは、GPに対して優れた結合を呈した。
非ヒト霊長類研究:ヒヒ
非ヒト霊長類モデルにおいてマウスで得られた結果を確認するために、ヒヒ研究を実施した。研究を、図39に示すように設計した。4つの群を形成した。群1は、対照であった。群2は、AlPO4を含む抗原を受けた。群2および3は、50μgのマトリクスMとともに抗原をそれぞれ60μgおよび5μg受けた。ヒヒを、0および21日目に免疫化した。強い応答が、Makona GPおよびMayinga GP両方に対して得られた。図40を参照のこと。追加の分析により、応答が長く続くことを確認した。図41は、後の時点でのMakonaに対するIgGのEC50値を示す。データは、応答が持続的であることを確立する。
非ヒト霊長類研究:マカク研究1
ナノ粒子による防御効果をさらに確認するために、図45に表示するようにマカク研究を実施した。示した通り0および21日目にマカクをワクチンで筋肉内に免疫化し、42日目にチャレンジした。抗GP応答を、0および28日目に測定した。図46が示すように、免疫化したマカクは抗IgG抗体の劇的な誘導を示した。免疫応答を、図47に示すように特徴付けた。様々なペプチドプールに応答するIFNγ分泌細胞を、0、3および5週目に測定した。結果は、免疫化されたマカクが、免疫化されたマカクにおいてIFN
γ分泌細胞を誘導したことを実証する。
非ヒト霊長類研究:マカク研究2
第2の研究を、マカクにおいて実施した。0週目に、動物にGP 5μg+マトリクスM 50μgを投薬し、3週目または6週目のいずれかに追加のブーストを行った。次いで、免疫化した動物を、それぞれ9週目および12週目に野生型エボラウイルスでチャレンジした。図49。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
(i)非イオン性界面活性剤コアおよびウイルス糖タンパク質を含むナノ粒子であって、前記ウイルス糖タンパク質は、前記コアと会合しており、界面活性剤は、約0.03%から約0.05%で存在する、ナノ粒子;ならびに
(ii)薬学的に許容される緩衝液
を含むワクチン組成物であって、前記非イオン性界面活性剤は、PS20、PS40、PS60、PS65およびPS80からなる群より選択される、ワクチン組成物。
(項目2)
前記ウイルス糖タンパク質が、RSV Fタンパク質、エボラ糖タンパク質、狂犬病ウイルスGタンパク質、インフルエンザHAタンパク質、インフルエンザNAタンパク質およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、項目1に記載のワクチン組成物。
(項目3)
前記ウイルス糖タンパク質がRSV Fタンパク質であり、非イオン性界面活性剤のウイルス糖タンパク質に対するモル比が約30:1から約60:1である、項目2に記載のワクチン組成物。
(項目4)
前記RSV Fタンパク質が、配列番号2のアミノ酸137〜146に対応する10アミノ酸の欠失および配列番号2のアミノ酸131から136に対応する不活性化主要フューリン切断部位を含み、前記主要フューリン切断部位が変異によって不活性化されている、項目3に記載のワクチン組成物。
(項目5)
いかなる他の界面活性剤も実質的に含まない、項目4に記載のワクチン組成物。
(項目6)
前記RSV−Fタンパク質が、配列番号1〜13、およびN末端シグナルペプチドの一部または全体を欠いている配列番号1〜13の改変体からなる群より選択される、項目4に記載のワクチン組成物。
(項目7)
前記RSV Fタンパク質が、配列番号19を含む、項目6に記載のワクチン組成物。
(項目8)
前記RSV Fタンパク質が配列番号19からなる、項目6に記載のワクチン組成物。
(項目9)
前記非イオン性界面活性剤がPS80である、項目8に記載のワクチン組成物。
(項目10)
前記モル比が約50である、項目9に記載のワクチン組成物。
(項目11)
前記薬学的に許容される緩衝液が、
(i)15mMから25mMのリン酸ナトリウム;
(ii)約150mMのNaCl;
(iii)0.25%から2%w/vのヒスチジン
を含み、前記組成物のpHは、5.8から6.4の間である、項目1に記載のワクチン組成物。
(項目12)
前記薬学的に許容される緩衝液が、
(i)約22mMのリン酸ナトリウム;
(ii)約150mMのNaCl;
(iii)約1%のヒスチジン
を含み、前記組成物のpHは、約6.2である、項目11に記載のワクチン組成物。
(項目13)
前記RSV Fタンパク質が前記タンパク質に連結された脂肪酸をさらに含む、項目1から12のいずれかに記載のワクチン組成物。
(項目14)
前記ナノ粒子が約20nmから約60nmのZ平均直径を有する、項目1に記載のワクチン組成物。
(項目15)
RSV Fタンパク質を約60μg/mLから約290μg/mLの間の濃度で含む、項目2に記載のワクチン組成物。
(項目16)
前記ナノ粒子の形状が球状オリゴマーまたは異方性ロッドである、項目1に記載のワクチン組成物。
(項目17)
分析用超遠心分離法によって決定して、いかなる他の界面活性剤も実質的に含まない、項目1から16のいずれかに記載のワクチン組成物。
(項目18)
各ナノ粒子が4個から7個の間のRSV Fタンパク質三量体を含む、項目10に記載のワクチン組成物。
(項目19)
項目1から18のいずれかに記載のワクチン組成物を被験体に投与するステップを含む、ウイルス感染を予防する方法。
(項目20)
組成物が筋肉内投与される、項目19に記載の方法。
(項目21)
各用量が約30μgから約150μgの間のRSV Fタンパク質からなる、項目19に記載の方法。
(項目22)
単一用量の前記組成物が投与される、項目19に記載の方法。
(項目23)
前記被験体が、成人、年長の成人、妊娠中の女性、小児、新生児、および乳児からなる群より選択される、項目19に記載の方法。
(項目24)
前記組成物がアジュバントを含む、項目19に記載の方法。
(項目25)
前記アジュバントがミョウバンアジュバントであり、前記アジュバントの少なくとも80%が前記ナノ粒子に結合している、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記組成物が追加的アジュバントを含有しない、項目19に記載の方法。
(項目27)
前記用量が約0.5mLの体積である、項目22に記載の方法。
(項目28)
少なくとも3つのRSV Fナノ粒子タイプの異種集団を含む組成物であって、各ナノ粒子が、PS80を含む界面活性剤含有コアを囲む少なくとも1つのRSV Fタンパク質三量体を含み;そして
第1のRSV Fナノ粒子タイプが異方性ロッドを含み、
第2のRSV Fナノ粒子タイプが球状オリゴマーを含み、そして
第3のRSV Fナノ粒子タイプが異方性ロッドと球状オリゴマーとの中間体を含む、
組成物。
(項目29)
各RSV F三量体が、配列番号2の残基137〜146に対応する1から10アミノ酸の欠失を有するRSV Fタンパク質およびその混合物からなる群より選択される、項目28に記載の組成物。
(項目30)
各RSV F三量体が、(i)配列番号2の残基137〜146に対応する1から10アミノ酸の欠失および(ii)不活性化主要融合切断部位を有するRSV Fタンパク質ならびにその混合物を含む、項目28に記載の組成物。
(項目31)
前記RSV Fタンパク質が、配列番号1〜13、およびN末端シグナルペプチドの一部または全体を欠いている配列番号1〜13の改変体から選択される、項目29に記載の組成物。
(項目32)
前記RSV Fタンパク質が配列番号19を含む、項目31に記載の組成物。
(項目33)
前記RSV Fタンパク質が配列番号19からなる、項目31に記載の組成物。
(項目34)
第1の界面活性剤を使用して宿主細胞からRSV Fタンパク質抽出物を調製するステップ、および前記第1の界面活性剤を第2の界面活性剤に交換するステップを含む、RSV Fタンパク質ナノ粒子を製造する方法であって、前記第2の界面活性剤はPS80であり、約0.03%から約0.05%の量のPS80中で維持される場合に前記ナノ粒子は安定性の増強を示す、方法。
(項目35)
前記第1の界面活性剤がNP−9である、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記安定性の増強が、プロテアーゼ耐性、酸化ストレス耐性、熱ストレス耐性、および撹拌への耐性の1つまたは複数から選択される、項目34に記載の方法。
(項目37)
前記PS80が、前記RSV Fタンパク質に対するモル比約30から約60で存在する、項目34に記載の方法。
(項目38)
PS80界面活性剤コアと会合したウイルスタンパク質三量体を含むナノ粒子であって、前記PS80:前記ウイルスタンパク質三量体のモル比は、約30から約60、好ましくは約50である、ナノ粒子。
(項目39)
前記ウイルスタンパク質三量体がRSV Fタンパク質三量体である、項目38に記載のナノ粒子。
(項目40)
動的光散乱によって測定される約20nmから約60nmの平均直径(Z平均)を有する、項目38に記載のナノ粒子。
(項目41)
各RSV Fタンパク質三量体が、配列番号2の残基137〜146に対応する1から10アミノ酸の欠失を有するRSV Fタンパク質からなる群より選択されるRSV Fタンパク質を含有する、項目38に記載のナノ粒子。
(項目42)
不活性化主要融合切断部位をさらに含む、項目41に記載のナノ粒子。
(項目43)
前記RSV Fタンパク質が、配列番号1〜13のいずれか、またはN末端シグナルペプチドの一部もしくは全体を欠いている配列番号1〜13の配列を有する、項目39に記載のナノ粒子。
(項目44)
前記RSV Fタンパク質が、配列番号2の残基137〜146に対応する10アミノ酸の欠失ならびに133、135、および136位のアルギニン残基のグルタミンへの変異による主要フューリン切断部位の不活性化を含む、項目39に記載のナノ粒子。
(項目45)
前記RSV Fタンパク質が配列番号19を含む、項目44に記載のナノ粒子。
(項目46)
前記RSV Fタンパク質が配列番号19からなる、項目44に記載のナノ粒子。
(項目47)
非イオン性界面活性剤コアを囲むタンパク質抗原を含むナノ粒子を産生する方法であって、
(i)第1の界面活性剤を含むタンパク質抽出物をタンパク質精製カラムに結合させるステップ;
(ii)前記第1の界面活性剤を第2の界面活性剤で実質的に置き換えることによって界面活性剤交換を実施するステップ;および
(iii)前記第2の界面活性剤の存在下で前記カラムから前記タンパク質抽出物を溶出し、前記ナノ粒子を提供するステップ
を含み、
前記第2の界面活性剤:タンパク質のモル比が約30から約60であり;ならびに前記第2の界面活性剤が、PS20、PS40、PS60、PS65およびPS80からなる群より選択される、
方法。
(項目48)
前記タンパク質抗原がウイルス糖タンパク質である、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記非イオン性界面活性剤がPS80である、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記第1の界面活性剤がNP−9である、項目47に記載の方法。
(項目51)
前記タンパク質抗原がRSV−F糖タンパク質である、項目47に記載の方法。
(項目52)
前記モル比が約45から約60である、項目47に記載の方法。
(項目53)
前記モル比が約45である、項目52に記載の方法。
(項目54)
(iv)前記ナノ粒子をミョウバンアジュバントと組み合わせ、組成物中の前記ナノ粒子の少なくとも80%が前記ミョウバンに結合している、ナノ粒子を含む組成物を提供するステップをさらに含む、項目47に記載の方法。
(項目55)
前記ナノ粒子の少なくとも90%が前記ミョウバンに結合している、項目54に記載の方法。
(項目56)
前記タンパク質抽出物が、Sf9宿主細胞中に前記タンパク質を組換え発現させること、および前記宿主細胞を前記第1の界面活性剤で処理し、タンパク質抽出物を提供することを含むステップによって調製され、前記Sf9細胞がカテプシンLもしくはキチナーゼについてシングルノックアウトである、またはカテプシンLおよびキチナーゼの両方についてダブルノックアウトである、項目47に記載の方法。
(項目57)
前記タンパク質精製カラムがレンズマメレクチンカラムである、項目47に記載の方法。
(項目58)
非イオン性界面活性剤コアおよび少なくとも2つのウイルスタンパク質を含む組み合わせナノ粒子であって、各ウイルスタンパク質が前記コアと会合しており、非イオン性界面活性剤:少なくとも1つのウイルスタンパク質のモル比が約30から約60である、組み合わせナノ粒子。
(項目59)
インフルエンザHAタンパク質およびRSV Fタンパク質を含む、項目58に記載の組み合わせナノ粒子。
(項目60)
インフルエンザHAタンパク質およびインフルエンザNAタンパク質を含む、項目58に記載の組み合わせナノ粒子。
(項目61)
前記HAタンパク質および前記NAタンパク質が、同じインフルエンザサブタイプ由来である、項目60に記載の組み合わせナノ粒子。
(項目62)
前記HAタンパク質および前記NAタンパク質が、異なるインフルエンザサブタイプ由来である、項目60に記載の組み合わせナノ粒子。
(項目63)
前記HAタンパク質および前記NAタンパク質の少なくとも1つが群1または群2インフルエンザ由来である、項目60に記載の組み合わせナノ粒子。
(項目64)
前記HAタンパク質および前記NAタンパク質の少なくとも1つがB型インフルエンザ由来である、項目60に記載の組み合わせナノ粒子。
(項目65)
項目1に記載の組成物を被験体に投与するステップを含む、免疫応答を誘導する方法。
(項目66)
前記被験体がヒト女性である、項目65に記載の方法。
(項目67)
前記ヒト女性が妊娠中である、項目66に記載の方法。
(項目68)
抗RSV F抗体を保有する乳児に項目1に記載の組成物を投与するステップを含む、乳児において免疫応答をブーストする方法。
(項目69)
組換えトリプシン耐性インフルエンザHAナノ粒子を調製する方法であって、
(i)第1の界面活性剤を含むタンパク質抽出物をタンパク質精製カラムに結合させるステップ;
(ii)前記第1の界面活性剤を第2の界面活性剤で実質的に置き換えることによって界面活性剤交換を実施するステップ;および
(iii)前記第2の界面活性剤の存在下で前記カラムから前記タンパク質抽出物を溶出し、前記ナノ粒子を提供するステップ
を含み、
示差走査熱量測定によって測定される前記ナノ粒子の遷移中点(Tm)が少なくとも約60であり、7.0未満のpHを有する緩衝液は調製中に使用されない、
方法。
(項目70)
項目69の方法により調製された組換えトリプシン耐性HAナノ粒子。
(項目71)
項目70に記載のナノ粒子および薬学的に許容される担体を含むワクチン組成物。
(項目72)
アジュバントを含む、項目71に記載のナノ粒子を含むワクチン組成物。
(項目73)
前記第1の界面活性剤の前記交換が、HPLCによって検出されるNP−9の量が約0.1%未満、約0.01%未満、約0.001%未満であるまたは検出不能であるように実質的に完了される、項目35に記載の方法。
(項目74)
非イオン性界面活性剤コアと会合したエボラウイルスGP三量体を含むエボラウイルス糖タンパク質(GP)ナノ粒子。
(項目75)
前記コア中の非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート−80(PS80)を含む、項目74に記載のナノ粒子。
(項目76)
平均直径約20nmから約40nmを有する、項目74に記載のナノ粒子。
(項目77)
前記エボラウイルスGP三量体の複数のコピーを含有する、項目74に記載のナノ粒子。
(項目78)
15個までの三量体を含有する、項目77に記載のナノ粒子。
(項目79)
Sf9細胞で産生される、項目74に記載のナノ粒子。
(項目80)
前記エボラウイルスGPのアミノ酸配列が、配列番号29と約85%同一、約90%同一、約95%同一、約97%同一または約98%同一である、項目74に記載のナノ粒子。
(項目81)
前記エボラウイルスGPのアミノ酸配列が配列番号29を含む、項目74に記載のナノ粒子。
(項目82)
前記エボラウイルスGPのアミノ酸配列が配列番号29からなる、項目74に記載のナノ粒子。
(項目83)
項目74から82のいずれかに記載のナノ粒子およびサポニンアジュバントを含むワクチン組成物であって、前記サポニンアジュバントがマトリクスAおよびマトリクスCからなる、ワクチン組成物。
(項目84)
前記マトリクスAおよび前記マトリクスCが85:15の比で存在する、項目83に記載のワクチン組成物。
(項目85)
ヒトにおけるエボラウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、
エボラウイルス糖タンパク質(GP)ナノ粒子およびサポニンアジュバントを含む組成物を前記ヒトに投与するステップを含み、
前記サポニンアジュバントは、マトリクスAおよびマトリクスCからなり、
前記ナノ粒子は、非イオン性界面活性剤コアに付着したエボラウイルスGP三量体を含む、
方法。
(項目86)
前記マトリクスAサポニンアジュバントおよび前記マトリクスCサポニンアジュバントが85:15の比で存在する、項目85に記載の方法。
(項目87)
前記エボラウイルスGPのアミノ酸配列が配列番号29と約85%同一、約90%同一、約95%同一、約97%同一または約98%同一である、項目85に記載の方法。
(項目88)
前記組成物が筋肉内投与される、項目85に記載の方法。
(項目89)
前記免疫応答が:IgG1抗体の誘導、IgG2a抗体の誘導、長命形質B細胞の形成、濾胞性ヘルパーT細胞(T FH )応答、CD4+T細胞応答およびCD8+T細胞応答の1つまたは複数を含む、項目85に記載の方法。
(項目90)
前記組成物が、ナノ粒子1個当たり2個から6個の三量体を有するGPナノ粒子の不均一な集団を含む、項目85に記載の方法。
(項目91)
項目83に記載のワクチン組成物をヒトに筋肉内投与するステップを含む、前記ヒトにおけるエボラウイルス感染または疾患を予防する方法。
(項目92)
配列番号29を含むまたはそれからなるエボラタンパク質をコードする核酸。
(項目93)
項目92に記載の核酸を含むSf9宿主細胞。
Claims (93)
- (i)非イオン性界面活性剤コアおよびウイルス糖タンパク質を含むナノ粒子であって、前記ウイルス糖タンパク質は、前記コアと会合しており、界面活性剤は、約0.03%から約0.05%で存在する、ナノ粒子;ならびに
(ii)薬学的に許容される緩衝液
を含むワクチン組成物であって、前記非イオン性界面活性剤は、PS20、PS40、PS60、PS65およびPS80からなる群より選択される、ワクチン組成物。 - 前記ウイルス糖タンパク質が、RSV Fタンパク質、エボラ糖タンパク質、狂犬病ウイルスGタンパク質、インフルエンザHAタンパク質、インフルエンザNAタンパク質およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載のワクチン組成物。
- 前記ウイルス糖タンパク質がRSV Fタンパク質であり、非イオン性界面活性剤のウイルス糖タンパク質に対するモル比が約30:1から約60:1である、請求項2に記載のワクチン組成物。
- 前記RSV Fタンパク質が、配列番号2のアミノ酸137〜146に対応する10アミノ酸の欠失および配列番号2のアミノ酸131から136に対応する不活性化主要フューリン切断部位を含み、前記主要フューリン切断部位が変異によって不活性化されている、請求項3に記載のワクチン組成物。
- いかなる他の界面活性剤も実質的に含まない、請求項4に記載のワクチン組成物。
- 前記RSV−Fタンパク質が、配列番号1〜13、およびN末端シグナルペプチドの一部または全体を欠いている配列番号1〜13の改変体からなる群より選択される、請求項4に記載のワクチン組成物。
- 前記RSV Fタンパク質が、配列番号19を含む、請求項6に記載のワクチン組成物。
- 前記RSV Fタンパク質が配列番号19からなる、請求項6に記載のワクチン組成物。
- 前記非イオン性界面活性剤がPS80である、請求項8に記載のワクチン組成物。
- 前記モル比が約50である、請求項9に記載のワクチン組成物。
- 前記薬学的に許容される緩衝液が、
(i)15mMから25mMのリン酸ナトリウム;
(ii)約150mMのNaCl;
(iii)0.25%から2%w/vのヒスチジン
を含み、前記組成物のpHは、5.8から6.4の間である、請求項1に記載のワクチン組成物。 - 前記薬学的に許容される緩衝液が、
(i)約22mMのリン酸ナトリウム;
(ii)約150mMのNaCl;
(iii)約1%のヒスチジン
を含み、前記組成物のpHは、約6.2である、請求項11に記載のワクチン組成物。 - 前記RSV Fタンパク質が前記タンパク質に連結された脂肪酸をさらに含む、請求項1から12のいずれかに記載のワクチン組成物。
- 前記ナノ粒子が約20nmから約60nmのZ平均直径を有する、請求項1に記載のワクチン組成物。
- RSV Fタンパク質を約60μg/mLから約290μg/mLの間の濃度で含む、請求項2に記載のワクチン組成物。
- 前記ナノ粒子の形状が球状オリゴマーまたは異方性ロッドである、請求項1に記載のワクチン組成物。
- 分析用超遠心分離法によって決定して、いかなる他の界面活性剤も実質的に含まない、請求項1から16のいずれかに記載のワクチン組成物。
- 各ナノ粒子が4個から7個の間のRSV Fタンパク質三量体を含む、請求項10に記載のワクチン組成物。
- 請求項1から18のいずれかに記載のワクチン組成物を被験体に投与するステップを含む、ウイルス感染を予防する方法。
- 組成物が筋肉内投与される、請求項19に記載の方法。
- 各用量が約30μgから約150μgの間のRSV Fタンパク質からなる、請求項19に記載の方法。
- 単一用量の前記組成物が投与される、請求項19に記載の方法。
- 前記被験体が、成人、年長の成人、妊娠中の女性、小児、新生児、および乳児からなる群より選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記組成物がアジュバントを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記アジュバントがミョウバンアジュバントであり、前記アジュバントの少なくとも80%が前記ナノ粒子に結合している、請求項24に記載の方法。
- 前記組成物が追加的アジュバントを含有しない、請求項19に記載の方法。
- 前記用量が約0.5mLの体積である、請求項22に記載の方法。
- 少なくとも3つのRSV Fナノ粒子タイプの異種集団を含む組成物であって、各ナノ粒子が、PS80を含む界面活性剤含有コアを囲む少なくとも1つのRSV Fタンパク質三量体を含み;そして
第1のRSV Fナノ粒子タイプが異方性ロッドを含み、
第2のRSV Fナノ粒子タイプが球状オリゴマーを含み、そして
第3のRSV Fナノ粒子タイプが異方性ロッドと球状オリゴマーとの中間体を含む、組成物。 - 各RSV F三量体が、配列番号2の残基137〜146に対応する1から10アミノ
酸の欠失を有するRSV Fタンパク質およびその混合物からなる群より選択される、請求項28に記載の組成物。 - 各RSV F三量体が、(i)配列番号2の残基137〜146に対応する1から10アミノ酸の欠失および(ii)不活性化主要融合切断部位を有するRSV Fタンパク質ならびにその混合物を含む、請求項28に記載の組成物。
- 前記RSV Fタンパク質が、配列番号1〜13、およびN末端シグナルペプチドの一部または全体を欠いている配列番号1〜13の改変体から選択される、請求項29に記載の組成物。
- 前記RSV Fタンパク質が配列番号19を含む、請求項31に記載の組成物。
- 前記RSV Fタンパク質が配列番号19からなる、請求項31に記載の組成物。
- 第1の界面活性剤を使用して宿主細胞からRSV Fタンパク質抽出物を調製するステップ、および前記第1の界面活性剤を第2の界面活性剤に交換するステップを含む、RSV Fタンパク質ナノ粒子を製造する方法であって、前記第2の界面活性剤はPS80であり、約0.03%から約0.05%の量のPS80中で維持される場合に前記ナノ粒子は安定性の増強を示す、方法。
- 前記第1の界面活性剤がNP−9である、請求項34に記載の方法。
- 前記安定性の増強が、プロテアーゼ耐性、酸化ストレス耐性、熱ストレス耐性、および撹拌への耐性の1つまたは複数から選択される、請求項34に記載の方法。
- 前記PS80が、前記RSV Fタンパク質に対するモル比約30から約60で存在する、請求項34に記載の方法。
- PS80界面活性剤コアと会合したウイルスタンパク質三量体を含むナノ粒子であって、前記PS80:前記ウイルスタンパク質三量体のモル比は、約30から約60、好ましくは約50である、ナノ粒子。
- 前記ウイルスタンパク質三量体がRSV Fタンパク質三量体である、請求項38に記載のナノ粒子。
- 動的光散乱によって測定される約20nmから約60nmの平均直径(Z平均)を有する、請求項38に記載のナノ粒子。
- 各RSV Fタンパク質三量体が、配列番号2の残基137〜146に対応する1から10アミノ酸の欠失を有するRSV Fタンパク質からなる群より選択されるRSV Fタンパク質を含有する、請求項38に記載のナノ粒子。
- 不活性化主要融合切断部位をさらに含む、請求項41に記載のナノ粒子。
- 前記RSV Fタンパク質が、配列番号1〜13のいずれか、またはN末端シグナルペプチドの一部もしくは全体を欠いている配列番号1〜13の配列を有する、請求項39に記載のナノ粒子。
- 前記RSV Fタンパク質が、配列番号2の残基137〜146に対応する10アミノ
酸の欠失ならびに133、135、および136位のアルギニン残基のグルタミンへの変異による主要フューリン切断部位の不活性化を含む、請求項39に記載のナノ粒子。 - 前記RSV Fタンパク質が配列番号19を含む、請求項44に記載のナノ粒子。
- 前記RSV Fタンパク質が配列番号19からなる、請求項44に記載のナノ粒子。
- 非イオン性界面活性剤コアを囲むタンパク質抗原を含むナノ粒子を産生する方法であって、
(i)第1の界面活性剤を含むタンパク質抽出物をタンパク質精製カラムに結合させるステップ;
(ii)前記第1の界面活性剤を第2の界面活性剤で実質的に置き換えることによって界面活性剤交換を実施するステップ;および
(iii)前記第2の界面活性剤の存在下で前記カラムから前記タンパク質抽出物を溶出し、前記ナノ粒子を提供するステップ
を含み、
前記第2の界面活性剤:タンパク質のモル比が約30から約60であり;ならびに前記第2の界面活性剤が、PS20、PS40、PS60、PS65およびPS80からなる群より選択される、
方法。 - 前記タンパク質抗原がウイルス糖タンパク質である、請求項47に記載の方法。
- 前記非イオン性界面活性剤がPS80である、請求項48に記載の方法。
- 前記第1の界面活性剤がNP−9である、請求項47に記載の方法。
- 前記タンパク質抗原がRSV−F糖タンパク質である、請求項47に記載の方法。
- 前記モル比が約45から約60である、請求項47に記載の方法。
- 前記モル比が約45である、請求項52に記載の方法。
- (iv)前記ナノ粒子をミョウバンアジュバントと組み合わせ、組成物中の前記ナノ粒子の少なくとも80%が前記ミョウバンに結合している、ナノ粒子を含む組成物を提供するステップをさらに含む、請求項47に記載の方法。
- 前記ナノ粒子の少なくとも90%が前記ミョウバンに結合している、請求項54に記載の方法。
- 前記タンパク質抽出物が、Sf9宿主細胞中に前記タンパク質を組換え発現させること、および前記宿主細胞を前記第1の界面活性剤で処理し、タンパク質抽出物を提供することを含むステップによって調製され、前記Sf9細胞がカテプシンLもしくはキチナーゼについてシングルノックアウトである、またはカテプシンLおよびキチナーゼの両方についてダブルノックアウトである、請求項47に記載の方法。
- 前記タンパク質精製カラムがレンズマメレクチンカラムである、請求項47に記載の方法。
- 非イオン性界面活性剤コアおよび少なくとも2つのウイルスタンパク質を含む組み合わ
せナノ粒子であって、各ウイルスタンパク質が前記コアと会合しており、非イオン性界面活性剤:少なくとも1つのウイルスタンパク質のモル比が約30から約60である、組み合わせナノ粒子。 - インフルエンザHAタンパク質およびRSV Fタンパク質を含む、請求項58に記載の組み合わせナノ粒子。
- インフルエンザHAタンパク質およびインフルエンザNAタンパク質を含む、請求項58に記載の組み合わせナノ粒子。
- 前記HAタンパク質および前記NAタンパク質が、同じインフルエンザサブタイプ由来である、請求項60に記載の組み合わせナノ粒子。
- 前記HAタンパク質および前記NAタンパク質が、異なるインフルエンザサブタイプ由来である、請求項60に記載の組み合わせナノ粒子。
- 前記HAタンパク質および前記NAタンパク質の少なくとも1つが群1または群2インフルエンザ由来である、請求項60に記載の組み合わせナノ粒子。
- 前記HAタンパク質および前記NAタンパク質の少なくとも1つがB型インフルエンザ由来である、請求項60に記載の組み合わせナノ粒子。
- 請求項1に記載の組成物を被験体に投与するステップを含む、免疫応答を誘導する方法。
- 前記被験体がヒト女性である、請求項65に記載の方法。
- 前記ヒト女性が妊娠中である、請求項66に記載の方法。
- 抗RSV F抗体を保有する乳児に請求項1に記載の組成物を投与するステップを含む、乳児において免疫応答をブーストする方法。
- 組換えトリプシン耐性インフルエンザHAナノ粒子を調製する方法であって、
(i)第1の界面活性剤を含むタンパク質抽出物をタンパク質精製カラムに結合させるステップ;
(ii)前記第1の界面活性剤を第2の界面活性剤で実質的に置き換えることによって界面活性剤交換を実施するステップ;および
(iii)前記第2の界面活性剤の存在下で前記カラムから前記タンパク質抽出物を溶出し、前記ナノ粒子を提供するステップ
を含み、
示差走査熱量測定によって測定される前記ナノ粒子の遷移中点(Tm)が少なくとも約60であり、7.0未満のpHを有する緩衝液は調製中に使用されない、
方法。 - 請求項69の方法により調製された組換えトリプシン耐性HAナノ粒子。
- 請求項70に記載のナノ粒子および薬学的に許容される担体を含むワクチン組成物。
- アジュバントを含む、請求項71に記載のナノ粒子を含むワクチン組成物。
- 前記第1の界面活性剤の前記交換が、HPLCによって検出されるNP−9の量が約0.1%未満、約0.01%未満、約0.001%未満であるまたは検出不能であるように実質的に完了される、請求項35に記載の方法。
- 非イオン性界面活性剤コアと会合したエボラウイルスGP三量体を含むエボラウイルス糖タンパク質(GP)ナノ粒子。
- 前記コア中の非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート−80(PS80)を含む、請求項74に記載のナノ粒子。
- 平均直径約20nmから約40nmを有する、請求項74に記載のナノ粒子。
- 前記エボラウイルスGP三量体の複数のコピーを含有する、請求項74に記載のナノ粒子。
- 15個までの三量体を含有する、請求項77に記載のナノ粒子。
- Sf9細胞で産生される、請求項74に記載のナノ粒子。
- 前記エボラウイルスGPのアミノ酸配列が、配列番号29と約85%同一、約90%同一、約95%同一、約97%同一または約98%同一である、請求項74に記載のナノ粒子。
- 前記エボラウイルスGPのアミノ酸配列が配列番号29を含む、請求項74に記載のナノ粒子。
- 前記エボラウイルスGPのアミノ酸配列が配列番号29からなる、請求項74に記載のナノ粒子。
- 請求項74から82のいずれかに記載のナノ粒子およびサポニンアジュバントを含むワクチン組成物であって、前記サポニンアジュバントがマトリクスAおよびマトリクスCからなる、ワクチン組成物。
- 前記マトリクスAおよび前記マトリクスCが85:15の比で存在する、請求項83に記載のワクチン組成物。
- ヒトにおけるエボラウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、
エボラウイルス糖タンパク質(GP)ナノ粒子およびサポニンアジュバントを含む組成物を前記ヒトに投与するステップを含み、
前記サポニンアジュバントは、マトリクスAおよびマトリクスCからなり、
前記ナノ粒子は、非イオン性界面活性剤コアに付着したエボラウイルスGP三量体を含む、
方法。 - 前記マトリクスAサポニンアジュバントおよび前記マトリクスCサポニンアジュバントが85:15の比で存在する、請求項85に記載の方法。
- 前記エボラウイルスGPのアミノ酸配列が配列番号29と約85%同一、約90%同一、約95%同一、約97%同一または約98%同一である、請求項85に記載の方法。
- 前記組成物が筋肉内投与される、請求項85に記載の方法。
- 前記免疫応答が:IgG1抗体の誘導、IgG2a抗体の誘導、長命形質B細胞の形成、濾胞性ヘルパーT細胞(TFH)応答、CD4+T細胞応答およびCD8+T細胞応答の1つまたは複数を含む、請求項85に記載の方法。
- 前記組成物が、ナノ粒子1個当たり2個から6個の三量体を有するGPナノ粒子の不均一な集団を含む、請求項85に記載の方法。
- 請求項83に記載のワクチン組成物をヒトに筋肉内投与するステップを含む、前記ヒトにおけるエボラウイルス感染または疾患を予防する方法。
- 配列番号29を含むまたはそれからなるエボラタンパク質をコードする核酸。
- 請求項92に記載の核酸を含むSf9宿主細胞。
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