JP2018528425A - ケージドハプテンを使用するホルマリン固定パラフィン包埋組織におけるタンパク質近接アッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年2月29日に出願された米国仮特許出願第62/301,489号の出願日及び2015年8月28日に出願された米国仮特許出願第62/211,590号の出願日の利益を主張し、それらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、化学及び診断の分野における産業上の利用可能を有する。
[式中、
Yは、カルボニル反応基、アミン反応基又はチオール反応基から選択され;
Xは、結合であるか、又は、1から30個の炭素原子を有し、O、N、若しくはSからなる基より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり;
Aは、結合であるか、又は、1から15個の炭素原子を有し、O、N、若しくはSからなる基より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり;
「ケージング基」は、酵素基質及び任意選択的に脱離基を含み、脱離基部分は、置換又は無置換の5、6又は7員の芳香環又は複素環式環を含む。]
を有するケージドハプテンである。
[式中、
R1は、H、F、Cl、Br、I、−O−メチル、−O−−エチル、−O−n−プロピル、−O−−イソプロピル;−O−n−ブチル、−O−sec−ブチル、又は−O−イソ−ブチル;1から4の間の炭素原子を有する−S−アルキル基;1から4の間の炭素原子を有する−O−アルキル基;1から4の間の炭素原子を有する−N(H)−アルキル基;1から6の間の炭素原子を有する−N−(アルキル)2基;1から4の間の炭素原子を有し、N又はSで置換されていてもよいアルキル基;シアノ基;及びカルボキシル基から独立して選択され;
R2は酵素基質である。]
を有する。
[式中、R2は、リン酸基、エステル基、アミド基、硫酸基、グリコシド基、尿素基及びニトロ基からなる群より選択される。]
を有する。いくつかの実施態様では、各R1基は異なる。
[式中、R2は、リン酸基、エステル基、アミド基、硫酸基、グリコシド基、尿素基及びニトロ基からなる群より選択される。]の構造を有する、請求項43に記載のケージドハプテン。いくつかの実施態様において、各R1基は異なる。
[式中、R2は、リン酸基、エステル基、アミド基、硫酸基、グリコシド基、尿素基及びニトロ基からなる群より選択される。]を有する。
[式中、d及びeは、各々独立して4から18の範囲の整数であり;Qは、結合であり、O、S又はN(Rc)(Rd)であり;Ra及びRbは、独立してH、C1−C4アルキル基、F、Cl又はN(Rc)(Rd)であり;Rc及びRdは、独立してCH3又はHである。]の構造を有する。ある実施態様では、d及びeは、各々独立して1から24の範囲の整数である。
からなる群より選択される。
[式中、
Yは、カルボニル反応基、アミン反応基又はチオール反応基から選択され;
Xは、結合であるか、又は、1から30個の炭素原子を有し、O、N、若しくはSからなる基より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり;
Aは、結合であるか、又は、1から15個の炭素原子を有し、O、N、若しくはSからなる基より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり;
「ケージング基」は、酵素基質及び任意選択的に脱離基を含み、脱離基部分は、置換又は無置換の5、6又は7員の芳香環又は複素環式環を含む。]を有する。
[式中、Zは、結合であるか、又は、1から30個の炭素原子を有し、O、N、若しくはSからなる基より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり、
Aは、結合であるか、又は、1から15個の炭素原子を有し、O、N、若しくはSからなる基より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり;
qは、0又は1であり、
nは1から25の範囲の整数である。]
の構造を有する。
[式中、
R1は、H、F、Cl、Br、I、−O−メチル、−O−−エチル、−O−n−プロピル、−O−−イソプロピル;−O−n−ブチル、−O−sec−ブチル、又は−O−イソ−ブチル;1から4の間の炭素原子を有する−S−アルキル基;1から4の間の炭素原子を有する−O−アルキル基;1から4の間の炭素原子を有する−N(H)−アルキル基;1から6の間の炭素原子を有する−N−(アルキル)2基;1から4の間の炭素原子を有し、N又はSで置換されていてもよいアルキル基;シアノ基;及びカルボキシル基から独立して選択され;
R2は酵素基質である。]
を有する。
[式中、R2は、リン酸基、エステル基、アミド基、硫酸基、グリコシド基、尿素基及びニトロ基からなる群より選択される。]
を有する。いくつかの実施態様では、各R1基は異なる。
[式中、R2は、リン酸基、エステル基、アミド基、硫酸基、グリコシド基、尿素基及びニトロ基からなる群より選択される。]を有する。いくつかの実施態様では、R1基は異なる。
[式中、R2は、リン酸基、エステル基、アミド基、硫酸基、グリコシド基、尿素基及びニトロ基からなる群より選択される。]を有する。いくつかの実施態様では、各R1基は異なる。
本明細書で使用される場合、単数形「一つの(a)」、「一つの(an)」、及び「その(the)」は、文脈から判断して明らかにそうでないと分かる以外は、複数の指示物を含む。同様に、「又は(or)」という単語も、文脈が明らかに他を示さない限りは「及び」を含むことが意図される。用語「含む(includes)」は、「A又はBを含む」が、A、B、又はA及びBを含むことを意味するように、包括的に定義される。
本開示の一態様は、図1Bで説明されるような「ケージドハプテン」である。当業者が理解するように、ハプテンは、抗ハプテン抗体が生じる小分子である。「ケージドハプテン」は、適切な抗ハプテン抗体がもはや分子を認識せず、結合事象が生じないように修飾された構造のハプテンである。実際には、ハプテンの同定は「マスク化」又は「保護」である。本明細書で開示されるケージドハプテンは、それぞれのハプテン、すなわち非ケージド又は非マスク化ハプテンが酵素処理によって放出され、ネイティブハプテンを生成するように、酵素開裂ケージを考慮して設計されている(例えば、酵素処理を介したケージドハプテンの非マスク化を説明している図2を参照のこと)。したがって、適切な酵素の存在下で、ケージドハプテンは非マスク化され、抗ハプテン抗体はそれに結合しない。
[式中、
Xは、結合であるか、又は、1から30個の炭素原子を有し、O、N、若しくはSからなる基より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり;
Aは、1から15個の炭素原子を有し、O、N、若しくはSからなる基より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり;
Yは、別の基と共有結合を形成することができる反応基であり;
「ハプテン」及び「ケージング基」は、本明細書に記載される通りであり、
qは、0又は1である。]
の構造を有する。
のように、ハプテンに直接的に又は間接的に結合する酵素基質のみを含む。
[式中、
各R1は、H、F、Cl、Br、I、−O−メチル、−O−−エチル、−O−n−プロピル、−O−−イソプロピル;−O−n−ブチル、−O−sec−ブチル、又は−O−イソ−ブチル;1から4の間の炭素原子を有する−S−アルキル基;1から4の間の炭素原子を有する−O−アルキル基;1から4の間の炭素原子を有する−N(H)−アルキル基;1から6の間の炭素原子を有する−N−(アルキル)2基;1から4の間の炭素原子を有し、N又はSで置換されていてもよいアルキル基;シアノ基;及びカルボキシル基から独立して選択される。
R2は酵素基質である。]
を有する。
に説明するように、ケージング基をハプテンに結合させる基にパラで位置する。
の構造を有する。
の構造を有する。
構造を有する。
[式中、d及びeは、各々独立して4から18の範囲の整数であり;Qは、結合であり、O、S又はN(Rc)(Rd)であり;Ra及びRbは、独立してH、C1−C4アルキル基、F、Cl又はN(Rc)(Rd)であり;Rc及びRdは、独立してCH3又はHである。]
の構造を有する。ある実施態様では、d及びeは、各々独立して1から24の範囲の整数である。
[式中、d及びeは、各々独立して1から24の範囲の整数であり;Qは、結合、O、S又はN(Rc)(Rd)であり;Rc及びRdは、独立してCH3又はHである]
に示される構造を有する。他の実施態様では、QはOである。
[式中、d及びe は、各々独立して1から24の範囲の整数である。]
に示される構造を有する。いくつかの実施態様では、dは2であり、eは2から24の範囲の整数である。
[式中、d及びeは、各々独立して2から15の範囲の整数であり;Qは、結合であり、O、S又はN(Rc)(Rd)であり;Ra及びRbは、独立してH、C1−C4アルキル基、F、Cl又はN(Rc)(Rd)であり;Rc及びRdは、独立してCH3又はHである。]
の構造を有する。ある実施態様では、d及びeは、各々独立して1から12の範囲の整数である。
ケージドハプテンは、当業者に周知の任意の方法に従って合成されうる。例えば、ケージング基は、置換4−ヒドロキシベンズアルデヒドで出発して調製されうる。置換4−ヒドロキシベンズアルデヒドのヒドロキシル基は、リン酸基で置換され、その後、アルデヒドが還元され、結果として得られるベンジルアルコールがアッペル反応を通じてハロゲンで置換される。ケージング基は、その後、塩基性条件下で、ハロゲン置換ケージング基とハプテンの反応により、問題のハプテンに組み込まれうる(ハプテンが多数の求核基を含有する場合、ケージングのための所望の位置を選択するための保護化学を必要としうる)。ケージング基の保護されたリン酸基は、その後、臭化トリメチルシリルを使用して脱保護され、続いて、ケージドハプテンを反応基(すなわちマレイミド)と反応させて、抗体とのコンジュゲーションを容易にしうる。
スキーム1:置換4−ヒドロキシベンズアルデヒドで出発したケージドNPハプテンの合成
本開示は、ケージドハプテンを含む新規のコンジュゲートを提供する。いくつかの実施態様では、ケージドハプテンは、特異的結合実体、例えば抗体又は核酸プローブにコンジュゲートしている。他の実施態様では、ケージドハプテンは、式(IV):
[式中、
Aは、1から15個の炭素原子を有し、O、N、若しくはSからなる基より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり;
Qは、0又は1であり;
nは1〜25の範囲の整数であり;
Zは、結合であるか、又は、1から30個の炭素原子を有し、O、N、若しくはSからなる基より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基である。]のように抗体にコンジュゲートしている。いくつかの実施態様では、Zは、式(IIIA)、(IIIB)又は(IIIC)のいずれかの構造を有する基を含む。
本開示のコンジュゲートは、当業者に周知の任意の方法に従って合成することができる。
スキーム2:抗体(「Ab」)のアミノ基とトラウト試薬との間の反応、続いて、得られた中間体とケージドHQマレイミドの結合を説明する合成方法
いくつかの実施態様では、検出試薬は、ケージドハプテンコンジュゲート、又はケージドハプテンコンジュゲートと標的の複合体を検出することを可能にするために利用される。いくつかの実施態様では、用いられる検出試薬は、任意のケージドハプテン−コンジュゲートのケージドハプテンに相当するそれぞれの非マスク化ハプテンに特異的である。したがって、用語「それぞれの非マスク化ハプテン」又は「非マスク化ハプテン」は、適切な非マスキング酵素で「非ケージ」されて、「ネイティブ」ハプテン、すなわち、ケージドハプテンの酵素基質部分と反応する非マスキング酵素を示したケージドハプテンを指す。「非ケージング」又は「非マスキング」の工程は、本明細書でこれ以降に記載され、少なくとも図2に示される。本明細書に記載されるように、検出試薬はまた、シグナルを増加させるように設計された成分、例えばシグナル増幅成分又はシグナル増幅キットも含みうる。
本明細書でより詳細に記載されるように、本開示は、互いに近接したタンパク質ダイマー又はタンパク質の検出を可能にする。タンパク質−タンパク質相互作用の非限定的な例は、互いを伴うHer1/2/3/4タンパク質;PD−L1を伴うPD−1;及び/又は関連するリガンド(AREG、EREG)のいずれかを伴うPD−L2、EGFR(Her1)を含む。
本開示のアッセイ及び方法は自動化されてもよく、標本処理装置と組み合わされてもよい。標本処理装置は、Ventana Medical Systems、Inc.により販売されているBENCHMARK XT装置及びSYMPHONY装置などの自動装置とすることができる。Ventana Medical Systems、Inc.は、自動分析を実行するためのシステム及び方法を開示している、米国特許第5650327号、第5654200号、第6296809号、第6352861号、第6827901号及び第6943029号、並びに米国特許出願公開第20030211630号及び第20040052685号を含めた複数の米国特許の譲受人であり、これらの各々は、全体が参照により本明細書に援用される。あるいは、標本を手動で処理することもできる。
対比染色は、標的の構造が顕微鏡下でより容易に視覚化され得るように、一又は複数の標的を検出するための薬剤で既に染色した後の試料を後処理する方法である。例えば、対比染料をカバースリッピングの前に任意選択的に使用し、免疫組織化学染色をより明瞭にする。対比染料は、一次染料と色が異なる。多くの対比染料、例えばヘマトキシリン、エオシン、メチルグリーン、メチレンブルー、ギムザ、アルシアンブルー、及びニュークリアファストレッド(Nuclear Fast Red)がよく知られている。DAPI(4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)は、使用されうる蛍光性染料である。
本開示の実施態様のすべて又は特定の態様は、コンピュータ解析及び/又は画像解析システムによって自動化され、容易にされ得る。いくつかのアプリケーションでは、正確な色又は蛍光性の比率が測定される。いくつかの実施態様では、画像解析のために光学顕微鏡法が利用される。特定の本開示の実施態様は、デジタル画像を取得することを伴う。これは、デジタルカメラを顕微鏡に連結することにより行うことができる。染色した試料から得られたデジタル画像は、画像解析ソフトウェアを用いて解析する。色又は蛍光性は、いくつかの異なる方法で測定することができる。たとえば、色は、赤、青、緑の値;色相、彩度、強度の値として、及び/又はスペクトルイメージングカメラを使用して特定の波長又は波長の範囲を測定することによって測定することができる。また、試料を定性的及び半定量的に評価することができる。定性的評価は、染色強度を評価すること、陽性染色細胞及び染色に関与する細胞内区画を同定すること、試料全体又はスライドの品質を評価することを含む。試験試料に対して別々の評価が行われるため、この解析は、試料が異常な状態を表すかどうかを決定するための既知の平均値との比較を含み得る。
いくつかの実施態様では、本開示のケージされたハプテンコンジュゲートは、「検出キット」の一部として利用されうる。一般に、検出キットは、一又は複数のケージドハプテンコンジュゲート及び一又は複数のケージドハプテンコンジュゲートを検出するための検出試薬を含みうる。
試料は、生物学的成分を含み、一般に一又は複数の目的の標的分子を含むと思われる。標的分子は、細胞の表面上に存在し得、細胞は、懸濁液中又は組織切片中に存在し得る。標的分子はまた、細胞内に存在し得、プローブによる細胞溶解又は細胞侵入の際に検出され得る。当業者は、試料中の標的分子を検出する方法が使用される試料及びプローブの種類に応じて変化することを理解するであろう。試料を収集し調製する方法は、当技術分野で既知である。
2−ヒドロキシキノキサリン(HQ)ハプテンを、アルカリホスファターゼ(AP)により放出することができるケージング基、すなわち、ホスファターゼ酵素基質部分を含むケージング基で修飾した。二次抗種抗体(ヤギ抗ウサギ及びヤギ抗マウス)を、ケージドハプテン(cHQ)又はAPのいずれかで個別に標識した。したがって、ウサギ及びマウス一次抗体の任意の対を試験し、それらの互いとの近接性を決定することができた。以下に規定され、抗体とのコンジュゲーション(cHQ−MAL)のためのマレイミド(MAL)反応基を用いたケージドHQの調製を記載するスキーム1で説明される方法に従って、ケージドHQを合成した。
スキーム3:[4−({[3−({2−[3−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)プロパンアミド]エチル}カルバモイル)キノキサリン−2−イル]オキシ}メチル)−3,5−ジメトキシフェノキシ]ホスホン酸の合成
実施例1のケージドハプテン−抗体コンジュゲートのケージング基が、抗−ハプテン抗体がそれぞれのネイティブ(すなわち、非マスク化)ハプテンに結合することを妨げたことを確認するため、cHQ コンジュゲートを単一IHC検出により試験した。図5はIHC染色スキームを説明しており、cHQにコンジュゲートしている二次抗体、すなわちcHQケージドハプテン−抗体コンジュゲート(103A)を用いて、単抗原(114)を検出した。cHQケージドハプテン−抗体コンジュゲート(103A)の導入に続いて、AP酵素(すなわち非コンジュゲートAP)(113)を導入し、ケージドハプテン−抗体コンジュゲートのハプテンを非マスクした。得られた非マスク化ハプテン(103B)は、抗−ハプテン抗体(115)により認識することができた。いくつかの実施態様では、抗−ハプテン抗体(115)は、一又は複数の酵素にコンジュゲートしている(図5は、3のHRP酵素への結合を説明する。)。
数多くの既知の陽性及び推定陰性系を調査し、開示されるコンジュゲートがタンパク質近接性を測定することを可能にする能力を試験した。E−カドヘリン及びベータ−カテニンは通常セルにおいて互いに近接していることを生物学が示しているため、これらのタンパク質を既知の陽性系として選択した。Her2/ベータ−カテニン及びEGFR/ベータ−カテニンを、同一セルコンパートメントに存在する(共局在化)が、互いに相互作用することが予想されていない(近接していない)タンパク質の対として選択し、したがって、任意の近接性アッセイにおいてシグナルを生成しないはずである。また、一のウサギ及び一のマウス一次抗体が抗種二次検出の使用を可能にするために存在するように、抗体対を選択した。
異なる検出可能なシグナル(例えば色)を提供する異なるHRP系を試験した。例えば、図11A及び11Bは、銀(11A)及びチラミド−TAMRA(11B)を用いた検出を説明する。これらの系はどちらも試料中の近接タンパク質標的を検出することができた。
図12は、一の総タンパク(標的2、AP−Yellow)及び近接タンパク質シグナル(標的1+標的2、HRP−Silver)の多重検出の概略図である。任意のタイプのHRP検出系を使用して、近接性シグナルを示すことができ、任意のAP検出系(例えばナフトールホスフェート/Fast Red、BCIP/NBT、キノンメチド(QM)−色素原)を使用して総タンパクを視覚化することができる。
リガンドPD−L1のその受容体PD−1への結合は、T細胞の活性化又は阻害を調節する。腫瘍細胞は、この相互作用を使用し、免疫系を回避しうる。PD−L1/PD−1複合体の検出は、いずれかのタンパク質のそれ自体による簡易測定よりも、主要内の免疫チェックポイントの阻止状態をよりよく示すことができる。
図19は、PD−L1及びPD−1に関するケージドハプテン近接性シグナルと扁桃腺組織中の別のバイオマーカーの後続の検出とを組み合わせる例を説明する。この場合、PD−L1/PD−1相互作用に関与したCD8細胞を視覚化するアッセイを生成するために、PD−L1/PD1複合体の後にCD8を検出した。多重化のために、先に記載したように、PD−1及びPD−L1の近接性を最初に検出した。以前に結合した原色の溶出を助けるために、スライドを8分間にわたって90℃に加熱した。ウサギ抗−CD8(SP57)(Ventana、p/n 790−4460)をスライドに適用し、37℃で16分間インキュベートした。UltraMap Rb AP(Ventana、p/n 760−4314)、その後DISCOVERY Yellow色素原を使用して、抗−CD8を検出した。Hematoxylin II(Ventana、p/n 790−2208)及びBluing Reagent(Ventana、p/n 760−2037)を用いてスライドを対比染色した。
ケージドハプテン近接アッセイを使用して、BT−474細胞株のFFPE事例を試験した。完全に自動化されたDISCOVERY ULTRA機器で事例を試験した。DISCOVERY EZ Prep(Ventana、p/n 950−100)又はDISCOVERY Wash(Ventana、p/n 950−510)の脱パラフィン化溶液を使用して、スライドを脱パラフィン化した。DISCOVERY CC1(Ventana、p/n 950−124)を使用して、95℃で、64分間にわたり、スライド上で熱誘導エピトープ回収を実行した。その後、DISCOVERY阻害剤(Ventana、p/n 760−4840)をスライドに適用し、試料中の任意の内因性のペルオキシダーゼをクエンチした。ウサギ抗−Her2(4B5)(Ventana、p/n 790−2991)を、マウス抗−Her3(SPM738)(Spring、p/n E19260)で、32分間にわたり37℃で共にインキュベートした。その後、30μg/mLのヤギ抗−マウスアルカリホスファターゼ コンジュゲートをスライドに適用し、12分間インキュベートした。スライドを洗い流し、ケージドハプテンヤギ抗−ウサギコンジュゲートの20μg/mLの溶液を16分間にわたってスライドに適用した。インキュベーション後、500mMのトリスバッファー溶液pH10.0及び490mMのMgCl2溶液をスライドに適用し、ケージドハプテンの脱ケージ化を可能にした。HQの脱ケージ化後、マウス−抗−HQ HRP(Ventana、p/n 760−4820)コンジュゲートをスライドに適用し、非ケージドHQを結合した。いくつかの場合において、Amp HQチラミド増幅キット(Ventana、p/n 760−052)を使用して、シグナル強度を増加させるのに役立てた。近接したタンパク質を、Chromomap DABキット(Ventana、p/n 760−159)を使用して視覚化し、続いて、Hematoxylin II(Ventana、p/n 790−2208)及びBluing Reagent(Ventana、p/n 760−2037)で対比染色した。
Claims (74)
- 第一の標的が第二の標的に近接しているかを決定するために試料を分析するための方法であって、
(a)第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体を形成すること;
(b)第一の標的−ケージドハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること;
(c)第一の標的−ケージドハプテン−抗体コンジュゲート複合体のケージドハプテンを非マスク化し、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること;
(d)試料を第一の検出試薬と接触させ、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体又は第一の標的を標識すること;及び
(e)標識された第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体又は標識された第一の標的を検出すること
を含む方法。 - 第一の検出試薬が(i)第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体複合体を第一の酵素で標識するように第一の酵素にコンジュゲートしている二次抗体であって、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体複合体の非マスク化ハプテンに特異的な二次抗体;及び(ii)第一の酵素の第一の基質を含む、請求項1に記載の方法。
- 第一の基質が発色性基質又は蛍光性基質である、請求項2に記載の方法。
- 第一の検出試薬が、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体の非マスク化酵素を複数の第一のレポーター部分で標識するための増幅成分を含む、請求項1に記載の方法。
- 複数の第一のレポーター部分がハプテンである、請求項4に記載の方法。
- 第一の検出試薬が、それぞれ第二のレポーター部分にコンジュゲートしている二次抗体であって、複数の第一のレポーター部分に特異的な二次抗体をさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 第二のレポーター部分が増幅酵素又はフルオロフォアからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 第二のレポーター部分が増幅酵素であり、第一の検出試薬が増幅酵素の第一の発色性基質又は蛍光性基質をさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 試料を第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体の非マスキング酵素に特異的な第二の基質と接触させることと、第二の基質と非マスキング酵素との間の反応の生成物に相当するシグナルを検出することとをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 第一の標的が第二の標的に近接しているかを決定するために試料を分析するための方法であって、
(a)第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体を形成すること;
(b)第一の標的−ケージドハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること;
(c)第一の標的−ケージドハプテン−抗体コンジュゲート複合体のケージドハプテンを非マスク化し、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること;
(d)シグナル増幅工程を実施し、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体を複数のレポーター部分で標識すること;及び
(e)複数のレポーター部分を検出すること
を含む方法。 - 複数のレポーター部分がハプテンであり、それぞれ第二のレポーター部分にコンジュゲートしている二次抗体であって、複数の第一のレポーター部分に特異的な二次抗体を導入することをさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 第二のレポーター部分が増幅酵素であり、増幅酵素の発色性基質又は蛍光性基質を導入することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 試料中の標的の総量を検出することをさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 第一の標的が第二の標的に近接しているかを決定するために試料を分析するための方法であって、
(a)第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体を形成すること;
(b)第一の標的−ケージドハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること;
(c)第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体の非マスキング酵素が第一の標的−ケージドハプテン−抗体コンジュゲート複合体の酵素基質部分と反応するように、脱ケージ化工程を実施し、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること;
(d)試料を第一の検出試薬と接触させ、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体又は第一の標的を標識すること;及び
(e)標識された第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体又は標識された第一の標的を検出すること
を含む方法。 - 脱ケージ化工程が試料の温度を変化させることを含む、請求項14に記載の方法。
- 脱ケージ化工程が試料のpHを変更することを含む、請求項14に記載の方法。
- 脱ケージ化工程が一又は複数の洗浄工程を導入することを含む、請求項14に記載の方法。
- 脱ケージ化工程が非マスキング酵素の補助因子を添加することを含む、請求項14に記載の方法。
- 試料中の標的の総量を検出することをさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 第一の標的が第二の標的に近接しているかを決定するために試料を分析するための方法であって、
(a)試料を第一の標的に特異的なケージドハプテン−抗体コンジュゲートと接触させ、第一の標的−ケージドハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること;
(b)試料を第二の標的に特異的な非マスキング酵素−抗体コンジュゲートと接触させ、第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体を形成することであって、非マスキング酵素−抗体コンジュゲートの非マスキング酵素がケージドハプテン−抗体コンジュゲートの酵素基質部分と反応することができるように選択され、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること;
(c)試料を第一の検出試薬と接触させ、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体又は第一の標的を標識すること;及び
(d)標識された第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体又は標識された第一の標的を検出すること
を含む方法。 - ケージドハプテン−抗体コンジュゲートのケージドハプテン部分が、DCC、ビオチン、ニトロピラゾール、チアゾールスルホンアミド、ベンゾフラザン、及び2−ヒドロキシキノキサリンからなる群より選択されるハプテンに由来する、請求項20に記載の方法。
- 非マスキング酵素−抗体コンジュゲートの非マスキング酵素が、アルカリホスファターゼ、B−グルコシダーゼ、B−ガラクトシダーゼ、B−グルクロニダーゼ、リパーゼ、スルファターゼ、アミダーゼ、プロテアーゼ、ニトロレダクターゼ、ベータ−ラクタマーゼ&ノイラミニダーゼ、及びウレアーゼからなる群より選択される、請求項20に記載の方法。
- 第一の検出試薬が(i)第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体複合体を第一の酵素で標識するように第一の酵素にコンジュゲートしている二次抗体であって、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体複合体の非マスク化ハプテンに特異的な二次抗体;及び(ii)第一の発色性基質又は蛍光性基質を含む、請求項20に記載の方法。
- 第一の酵素が非マスキング酵素とは異なる、請求項23に記載の方法。
- 第一の酵素がペルオキシダーゼである、請求項24に記載の方法。
- 第一の発色性基質が、3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)、3−アミノ−9−エチルカルバゾール(AEC)、HRP−Silver、及びチラミド−色素原からなる群より選択される、請求項23に記載の方法。
- 試料を第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体の非マスキング酵素に特異的な第二の発色性基質又は蛍光性基質と接触させることをさらに含み、第一の発色性基質と第二の発色性基質が異なる、請求項26に記載の方法。
- 第一の検出試薬が、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体に導入される標識の量を増幅させるための成分を含む、請求項20に記載の方法。
- 第一の標的がPD−1又はPD−L1の一方であり、第二の標的がPD−1又はPD−L1のもう一方である、請求項20に記載の方法。
- 第一の標的が第二の標的に近接しているかを決定するために試料を分析するための方法であって、
(a)試料をケージドハプテン−抗体コンジュゲート又は非マスキング酵素−抗体コンジュゲートの一方を含む第一の検出プローブと接触させること;
(b)試料をケージドハプテン−抗体コンジュゲート又は非マスキング酵素−抗体コンジュゲートのもう一方を含む第二の検出プローブと接触させること;
(c)試料を少なくとも第一の検出試薬と接触させ、形成された非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート標的複合体を標識すること;及び
(d)標識された非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート標的複合体からシグナルを検出すること
を含む方法。 - 試料中の標的の総量を検出する工程をさらに含む、請求項30に記載の方法。
- 第一の検出試薬が、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体の非マスク化酵素を複数の第一のレポーター部分で標識するための増幅成分を含む、請求項30に記載の方法。
- 複数の第一のレポーター部分がハプテンである、請求項32に記載の方法。
- 第一の検出試薬が、それぞれ第二のレポーター部分にコンジュゲートしている二次抗体であって、複数の第一のレポーター部分に特異的な二次抗体をさらに含む、請求項33に記載の方法。
- 第二のレポーター部分が増幅酵素又はフルオロフォアからなる群より選択される、請求項34に記載の方法。
- 第二のレポーター部分が増幅酵素であり、第一の検出試薬が増幅酵素の第一の発色性基質又は蛍光性基質をさらに含む、請求項34に記載の方法。
- 脱ケージ化工程をさらに含む、請求項30に記載の方法。
- 第一の標的が第二の標的に近接しているかを決定するために試料を分析するための方法であって、
(a)試料を第一の標的に特異的なケージドハプテン−抗体コンジュゲートと接触させ、第一の標的−ケージドハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること;
(b)試料を第二の標的に特異的な非マスキング酵素−抗体コンジュゲートと接触させ、第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体を形成することであって、非マスキング酵素−抗体コンジュゲートの非マスキング酵素がケージドハプテン−抗体コンジュゲートの酵素基質部分と反応することができるように選択され、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること;
(c)第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体に特異的に結合し、非マスキング酵素とは異なる第一の酵素を含む第一の標識化コンジュゲートと試料を接触させること;
(d)試料を第一の潜在的反応部分と第一の発色性又は蛍光性部分とを含む第一のシグナル伝達コンジュゲートと接触させること;並びに
(e)第一の発色性又は蛍光性部分からシグナルを検出することであって、第一のシグナルが近接した第一及び第二の標的を示すこと
を含む方法。 - 試料を第二の潜在的反応部分と第二の発色性又は蛍光性部分とを含む第二のシグナル伝達コンジュゲートと接触させることをさらに含み、第一及び第二の発色性又は蛍光性部分が異なるシグナルを提供する、請求項38に記載の方法。
- 第二の発色性部分からシグナルを検出することをさらに含み、第二の発色性又は蛍光性部分からのシグナルが総タンパク量を示す、請求項39に記載の方法。
- 式(I):
[式中、
Yは、カルボニル反応基、アミン反応基又はチオール反応基から選択され;
Xは、結合であるか、又は、1から30個の炭素原子を有し、O、N、若しくはSからなる基より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり;
Aは、結合であるか、又は、1から15個の炭素原子を有し、O、N、若しくはSからなる基より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり;
「ケージング基」は、酵素基質及び任意選択的に脱離基を含み、脱離基部分は、置換又は無置換の5、6又は7員の芳香環又は複素環式環を含む。]
を有するケージドハプテン。 - 5、6又は7員の芳香環又は複素環式環が、ハロゲン、1から4の間の炭素原子を有する−S−アルキル基;1から4の間の炭素原子を有する−O−アルキル基;1から4の間の炭素原子を有する−N(H)−アルキル基;1から6の間の炭素原子を有する−N−(アルキル)2基;及び1から4の間の炭素原子を有する分岐又は非分岐状で置換又は無置換のアルキル基からなる群より選択される部分で置換されている、請求項41に記載のケージドハプテン。
- ケージング基が、式(II):
[式中、
R1は、H、F、Cl、Br、I、−O−メチル、−O−−エチル、−O−n−プロピル、−O−−イソプロピル;−O−n−ブチル、−O−sec−ブチル、又は−O−イソ−ブチル;1から4の間の炭素原子を有する−S−アルキル基;1から4の間の炭素原子を有する−O−アルキル基;1から4の間の炭素原子を有する−N(H)−アルキル基;1から6の間の炭素原子を有する−N−(アルキル)2基;1から4の間の炭素原子を有し、N又はSで置換されていてもよいアルキル基;シアノ基;及びカルボキシル基から独立して選択され;
R2は酵素基質である。]
の構造を有する、請求項41に記載のケージドハプテン。 - 酵素基質が、リン酸基、エステル基、アミド基、硫酸基、グリコシド基、尿素基及びニトロ基からなる群より選択される、請求項43に記載のケージドハプテン。
- ケージング基が、式(IIB):
[式中、
R2は、リン酸基、エステル基、アミド基、硫酸基、グリコシド基、尿素基及びニトロ基からなる群より選択される。]
の構造を有する、請求項43に記載のケージドハプテン。 - 各R1基が異なる、請求項45に記載のケージドハプテン。
- ケージング基が、式(IIC):
[式中、
R2は、リン酸基、エステル基、アミド基、硫酸基、グリコシド基、尿素基及びニトロ基からなる群より選択される。]
の構造を有する、請求項43に記載のケージドハプテン。 - 各R1基が異なる、請求項47に記載のケージドハプテン。
- ケージング基が、式(IID):
[式中、
R2は、リン酸基、エステル基、アミド基、硫酸基、グリコシド基、尿素基及びニトロ基からなる群より選択される。]
の構造を有する、請求項43に記載のケージドハプテン。 - 各R1基が異なる、請求項49に記載のケージドハプテン。
- Xが式(IIIA):
[式中、
d及びeは、各々独立して4から18の範囲の整数であり;Qは、結合、O、S又はN(Rc)(Rd)であり;Ra及びRbは、独立してH、C1−C4アルキル基、F、Cl又はN(Rc)(Rd)であり;Rc及びRdは、独立してCH3又はHである。]
の構造を有する、請求項41に記載のケージドハプテン。いくつかの実施態様では、d及びeは、各々独立して1から24の範囲の整数である。 - からなる群より選択される、請求項41に記載のケージドハプテン。
- (i)特異的結合実体、及び(ii)請求項41から47のいずれか一項に記載のケージドハプテンのコンジュゲート。
- 特異的結合実体が抗体である、請求項53に記載のコンジュゲート。
- 式(IV):
[式中、
Zは、結合であるか、又は、1から30個の炭素原子を有し、O、N、若しくはSからなる基より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり、
Aは、結合であるか、又は、1から15個の炭素原子を有し、O、N、若しくはSからなる基より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり;
qは、0又は1であり、
nは1から25の範囲の整数である。]
の構造を有する、請求項53に記載のコンジュゲート。 - ケージング基が、ハロゲン、1から4の間の炭素原子を有する−S−アルキル基;1から4の間の炭素原子を有する−O−アルキル基;1から4の間の炭素原子を有する−N(H)−アルキル基;1から6の間の炭素原子を有する−N−(アルキル)2基;及び1から4の間の炭素原子を有する分岐又は非分岐状で置換又は無置換のアルキル基からなる群より選択される部分で置換されていてもよい、5、6又は7員の芳香環又は複素環式環である、請求項55に記載のコンジュゲート。
- ケージング基が、式(II):
[式中、
R1は、H、F、Cl、Br、I、−O−メチル、−O−−エチル、−O−n−プロピル、−O−−イソプロピル;−O−n−ブチル、−O−sec−ブチル、又は−O−イソ−ブチル;1から4の間の炭素原子を有する−S−アルキル基;1から4の間の炭素原子を有する−O−アルキル基;1から4の間の炭素原子を有する−N(H)−アルキル基;1から6の間の炭素原子を有する−N−(アルキル)2基;1から4の間の炭素原子を有し、N又はSで置換されていてもよいアルキル基;シアノ基;及びカルボキシル基から独立して選択され;
R2は酵素基質である。]
の構造を有する、請求項55に記載のコンジュゲート。 - 酵素基質が、リン酸基、エステル基、アミド基、硫酸基、グリコシド基、尿素基及びニトロ基からなる群より選択される、請求項57に記載のコンジュゲート。
- ケージング基が、式(IIB):
[式中、
R2は、リン酸基、エステル基、アミド基、硫酸基、グリコシド基、尿素基及びニトロ基からなる群より選択される。]
の構造を有する、請求項57に記載のコンジュゲート。 - 各R1基が異なる、請求項59に記載のコンジュゲート。
- ケージング基が、式(IIC):
[式中、
R2は、リン酸基、エステル基、アミド基、硫酸基、グリコシド基、尿素基及びニトロ基からなる群より選択される。]
の構造を有する、請求項57に記載のコンジュゲート。 - 各R1基が異なる、請求項61に記載のコンジュゲート。
- ケージング基が、式(IID):
[式中、
R2は、リン酸基、エステル基、アミド基、硫酸基、グリコシド基、尿素基及びニトロ基からなる群より選択される。]
の構造を有する、請求項57に記載のコンジュゲート。 - 各R1基が異なる、請求項63に記載のコンジュゲート。
- 抗体が二次抗体である、請求項55に記載のコンジュゲート。
- 抗体が一次抗体である、請求項55に記載のコンジュゲート。
- 一次抗体が、PD−L1/CD80(B7−1);CTLA−4/CD80(B7−1);CTLA−4/CD86(B7−1);PD−L2/PD−1;ErbBファミリー(Her1(EGFR)、Her2、Her3、Her4)の任意の組合せ;DNA混合マッチ修復タンパク質(MLH1、MLH3、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1及びPMS2)の任意の組合せ;翻訳後修飾(PTM)−リン酸化タンパク質(抗−ホスホチロシン/ホスホセリン/ホスホスレオニン/ホスホヒスチジン抗体と当該標的に対して特異的な抗体との組合せ);及びPTM−ユビキチン化タンパク質からなる群より選択される標的に特異的である、請求項66に記載のコンジュゲート。
- 試料中の複数の標的を検出するための方法であって、
(a)試料を第一の標的に特異的なケージドハプテン−抗体コンジュゲートと接触させ、第一の標的−ケージドハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること;
(b)試料を第二の標的に特異的な非マスキング酵素−抗体コンジュゲートと接触させ、第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体を形成することであって、非マスキング酵素−抗体コンジュゲートの非マスキング酵素がケージドハプテン−抗体コンジュゲートの酵素基質部分と反応することができるように選択され、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること;
(c)試料を第一の検出試薬と接触させ、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体又は第一の標的を標識すること;
(d)試料を第三の標的に特異的な第一の検出プローブと接触させ、第三の標的−検出プローブ複合体を形成すること;
(e)試料を第二の検出試薬と接触させ、第三の標的−検出プローブ複合体を標識すること;
(f)標識された第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体又は標識された第一の標的を検出すること;及び
(g)標識された第三の標的−検出プローブ複合体を検出すること
を含む方法。 - 試料中の総タンパクを検出する工程をさらに含む、請求項68に記載の方法。
- 第一の検出プローブが抗体を含む、請求項68に記載の方法。
- 第一の検出プローブが核酸プローブを含む、請求項68に記載の方法。
- 第四の標的に特異的な第二の検出プローブと共に試料をさらに含み、第四の標的−検出プローブ複合体を形成する、請求項68に記載の方法。
- 試料を第二の検出試薬と接触させる前に、非マスキング酵素を不活性化することをさらに含む、請求項68に記載の方法。
- 第一の標的に特異的な第一の検出プローブを導入する前に、試料を加熱する工程又は試料のpHを変更する工程をさらに含む、請求項68に記載の方法。
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