JP2023113642A - ペプチド核酸コンジュゲート - Google Patents

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Abstract

【課題】生物のゲノムによって発現される多数のタンパク質の特徴づけおよび定量化のためのＰＮＡコンジュゲートを提供する。【解決手段】本開示は、特異的結合体およびオリゴマーのコンジュゲート、すなわち、［特異的結合体］－［オリゴマー］ｎ（ｎは、１から１２の範囲の整数である）を対象とし、ここで、オリゴマーは、一部の実施形態では、ガンマ炭素の位置に少なくとも１つの置換基を有するＰＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ガンマ炭素の位置における置換基、例えば、アミノ酸、ペプチド、ｍｉｎｉＰＥＧ、またはポリマーは、少なくとも１つのレポーター部分を含む。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１２月１８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／６６９７６号の出願日の利益、また、２０１７年１２月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／５９９，８１０号の出願日の利益を主張する。
免疫組織化学（ＩＨＣ）およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析（ＩＳＨ）を含む細胞染色法は、組織学的診断および組織形態学の研究における有用な手段である。ＩＨＣは、組織試料中に存在し得る目的の抗原を検出するために、抗体などの特異的結合剤または部分を用いる。ＩＨＣは、特定の病態または状態を診断するためなど、臨床および診断適用に広く使用されている。例えば、対象から得た試料中の特定のマーカー分子の存在に基づいて、特定のがんの種類を診断することができる。ＩＨＣはまた、様々な組織内のバイオマーカーの分布および局在化を理解するために、基礎研究にも広く使用されている。生物学的試料はまた、ＩＳＨと総称される、銀ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）、クロモジェニックｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）および蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技法を使用して検査することもできる。ＩＨＣが組織中のタンパク質を検出するのに対して、ＩＳＨは組織中の核酸を検出するという点で、ＩＨＣと異なっている。
生物のゲノムによって発現される多数のタンパク質の特徴づけおよび定量化は、プロテオミクスの注目の的である。多重免疫組織化学（ｍＩＨＣ）は、パラフィン包埋ホルマリン固定組織中の多変量タンパク質標的を、研究および診断に広範に適用して検出および分析するための、満たされていない大きな技法的ニーズを表している。多重免疫組織化学（ｍＩＨＣ）技法は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織中の多変量タンパク質標的の検出および分析のニーズに対処しようと試みている。効果的なｍＩＨＣ技法は、研究および診断に広範な適用を有する。しかしながら、組織内の複数のタンパク質標的を同時かつ定量的に検出可能にする効率的かつ再現可能な方法は、存在するとしても、ごくわずかである。
臨床治験設定におけるトランスレーショナルリサーチのキーとなる制約は、バイオマーカー分析を実施するための組織の量が限られていることが多いということである。さらには、この組織は、頻繁にアーカイブに入れられ、ＦＦＰＥブロックに格納される。遺伝子発現分析の伝統的な方法は、臨床応用に限界がある。例えば、ＲＴ－ＰＣＲは、一度に１つの遺伝子の発現を測定するが、何千もの転写産物をカバーするマイクロアレイなどの多重発現プロファイリング技法は高価であることが多く、ＦＦＰＥに由来するものなど、低品質のＲＮＡ試料を評価する場合には、柔軟性および再現性に欠ける。これらのアッセイの評価は、半定量的かつ本質的に主観的なものである。このため、単一のアッセイで複数のマーカーのプロファイリングを可能にする、定量的かつ高度に多重化されたアッセイの開発への注目が高まっている。したがって、限られた量の質の悪い材料からのバイオマーカーの多重分析を可能にするプラットフォームは、非常に魅力的である。
核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）の直接自動検出を可能にするＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ技法は、様々な臨床および研究適用に採用されている比較的新しい技法である。通常、標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、ビオチン化ＤＮＡ鎖（捕捉鎖）にハイブリダイズされ、核酸をｎＣｏｕｎｔｅｒカートリッジの内側のストレプトアビジン表面および蛍光標識されたＤＮＡ鎖（レポーター鎖、７Ｋｂ、そのうちの約５０塩基が標的核酸に対して相補的である）への固定化が可能となる。蛍光標識されたレポーター鎖の自動化されたデジタル読み出しは、１つの試料内の最大８００の核酸標的の非増幅測定を可能にすると考えられている。
ＤＮＡ抗体のバーコード化は、固有の分子タグとして使用することができる切断可能なＤＮＡ鎖で抗体を標識することからなる。ＤＮＡ抗体のバーコード化とＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ技法とを組み合わせることにより、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ技法を拡張して、多重化タンパク質分析に関与する適用を包含させた。
遺伝子配列中の選択された標的に対して高い親和性および配列特異性で結合することができる合成分子は、医学的および生物工学的状況において興味深いものである。それらは、遺伝子療法剤の開発、遺伝子分析のための診断装置、および核酸操作のための分子ツールとして有望である。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、天然核酸の糖リン酸骨格が、通常、Ｎ－（２－アミノ－エチル）－グリシン単位から形成される合成ペプチド骨格によって置き換えられている核酸類似体であり、アキラルおよび非荷電の模倣体をもたらす。それは化学的に安定であり、加水分解的（酵素的）切断に対して抵抗性であり、よって、生細胞内では分解されないことが期待されると考えられている。ＰＮＡは、ワトソン－クリックの水素結合スキームに従うＤＮＡおよびＲＮＡの配列特異的認識が可能であり、ハイブリッド複合体は、並外れた熱安定性および固有のイオン強度効果を示す。ＰＮＡは、電荷を含有しないことから、ＰＮＡとＤＮＡの間の結合ハイブリダイゼーションは、同じ配列についてのＤＮＡとＤＮＡとの結合ハイブリダイゼーションよりも強い。
本開示の一態様は、式（ＩＡ）の構造を有するコンジュゲートである：
Figure 2023113642000002
［式中、
「特異的結合体」は、抗体（例えば、一次抗体または二次抗体）、抗体断片、薬物／抗体複合体、および核酸からなる群から選択され；
「リンカー」は、２から８０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
Ｚは、ガンマ炭素の位置に置換基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むＰＮＡ配列、非荷電性ＤＮＡ配列、ならびに荷電性および非荷電性の塩基を含むＤＮＡ配列からなる群から選択され；
Ｘは、標識であり；
Ｙは、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
ｍは、０または１から６の範囲の整数であり；
ｚは、０または１であり；
ｎは、１から１２の範囲の整数である］。
一部の実施形態では、Ｘは、ビオチン、酵素、色素原、フルオロフォア、ハプテン、または質量分析タグである。
一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体である。一部の実施形態では、「特異的結合体」は、二次抗体である。一部の実施形態では、「特異的結合体」は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。
一部の実施形態では、Ｚは、非荷電のＤＮＡ塩基のみを含むＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、Ｚは、荷電性塩基および非荷電性塩基の混合物を含むＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、Ｚは、ＤＮＡ配列中の塩基の少なくとも５０％が非荷電性であるＤＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、Ｚは、ガンマ位置に置換基を有する少なくとも２つのＰＮＡ塩基を有するＰＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、Ｚは、ガンマ位置に置換基を有する少なくとも３つのＰＮＡ塩基を有するＰＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、Ｚは、ガンマ位置に置換基を有する少なくとも４つのＰＮＡ塩基を有するＰＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列の少なくとも１つの置換されたヌクレオチドは、リジン残基またはレポーター部分を含むリジン残基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列の少なくとも１つの置換されたヌクレオチドは、少なくとも１つのレポーター部分を含むｍｉｎｉＰＥＧを含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列の少なくとも１つの置換されたヌクレオチドは、少なくとも１つのレポーター部分を有するポリマーを含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列の少なくとも１つの置換されたヌクレオチドは、少なくとも１つのレポーター部分を含むペプチド（例えば、色素原、フルオロフォア）を含む。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から２０塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から１５塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から１０塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約１５塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約１０塩基を含む。
一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、Ｚは、ＰＮＡ配列またはガンマ位置に１つまたは複数の置換基を有するＰＮＡ配列である。一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、Ｚは、１０ヌクレオチドを有するＰＮＡ配列である。一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、Ｚは、ガンマ位置に１つまたは複数の置換基を有するＰＮＡ配列である。
一部の実施形態では、「リンカー」は、切断可能な基、例えば、光開裂性基、酵素的に切断可能な基、化学的に切断可能な基、特定のｐＨで切断可能な基を含む。一部の実施形態では、「リンカー」は、本明細書に開示されている水溶性を付与する１つまたは複数の基（例えば、１つまたは複数のＰＥＧ基）を含む。
本開示の別の態様は、式（ＩＩＢ）の構造を有するコンジュゲートである：
Figure 2023113642000003
［式中、
「特異的結合体」は、抗体、抗体断片、薬物／抗体複合体、および核酸からなる群から選択され；
「リンカー」は、２から８０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
「ＰＮＡ」は、ガンマ炭素の位置に置換基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むＰＮＡ配列であり；
Ｘは、標識であり；
Ｙは、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
ｍは、０または１から６の範囲の整数であり；
ｚは、０または１であり；
ｎは、１から１２の範囲の整数である］。
一部の実施形態では、Ｘは、ビオチン、酵素、色素原、フルオロフォア、ハプテン、および質量分析タグである。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基を有する。一部の実施形態では、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基のそれぞれは、同じアミノ酸、ｍｉｎｉＰＥＧ、ペプチド、またはポリマーで置換されている。一部の実施形態では、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基のそれぞれは、異なるアミノ酸、ｍｉｎｉＰＥＧ、ペプチド、またはポリマーで置換されている。一部の実施形態では、アミノ酸、ｍｉｎｉＰＥＧ、ペプチド、またはポリマーは、少なくとも１つのレポーター部分（例えば、フルオロフォア、色素原）を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも３つのガンマＰＮＡ塩基を有する。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも４つのガンマＰＮＡ塩基を有する。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から２０塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から１５塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から１０塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約１５塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約１０塩基を含む。
一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体である。一部の実施形態では、「特異的結合体」は、二次抗体である。一部の実施形態では、Ｘは、ビオチンである。一部の実施形態では、ｍは、０であり、ｚは、０であり、ｎは、１より大きい。一部の実施形態では、ｎは、２から６の範囲の整数である。一部の実施形態では、「リンカー」は、少なくとも１つのＰＥＧ基を含む。
一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、ＰＮＡ配列は、１０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、ＰＮＡ配列は、ガンマ位置に置換基を有する少なくとも２つのヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、「リンカー」は、式（ＩＶＡ）に示される構造を有する：
Figure 2023113642000004
［式中、
ｄおよびｅは、それぞれ独立して、２から２０の範囲の整数であり；
Ｑは、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；
ＲａおよびＲｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌ、またはＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；
ＲｃおよびＲｄは、独立して、ＣＨ３またはＨであり；
ＡおよびＢは、独立して、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基である］。
一部の実施形態では、ｄおよびｅは、２から６の範囲の整数である。一部の実施形態では、ＡまたはＢの少なくとも一方は、切断可能な部分を含む。一部の実施形態では、切断可能な部分は、光開裂性基である。一部の実施形態では、切断可能な部分は、化学的に切断可能な基である。一部の実施形態では、「特異的結合体」は、抗体であり、「リンカー」は、少なくとも１つのＰＥＧ基を含み、ｍは、０であり、ｚは、０であり、ｎは、１より大きい。一部の実施形態では、「特異的結合体」は、抗体であり、「リンカー」は、少なくとも１つのＰＥＧ基を含み、ｎは、１より大きい。一部の実施形態では、「リンカー」は、少なくとも１つの切断可能な基をさらに含む。一部の実施形態では、Ｘは、ハプテンである。
本開示の別の態様は、式（ＩＩＩ）の構造を有するオリゴマーである：
Figure 2023113642000005
［式中、
Ｔは、１から４個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳで置換されていてもよく、末端反応性部分を有する基であり；
「リンカー」は、２から８０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
「ＰＮＡ」は、ガンマ炭素の位置に置換基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むＰＮＡ配列であり；
Ｘは、標識であり；
Ｙは、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
ｍは、０または１から６の範囲の整数であり；
ｚは、０または１である］。
一部の実施形態では、Ｘは、ビオチン、酵素、色素原、フルオロフォア、ハプテン、および質量分析タグである。
一部の実施形態では、Ｘは、ビオチンである。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基を有する。
一部の実施形態では、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基のそれぞれは、同じアミノ酸、ｍｉｎｉＰＥＧ、ペプチド、またはポリマーで置換されている。一部の実施形態では、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基のそれぞれは、異なるアミノ酸、ｍｉｎｉＰＥＧ、ペプチド、またはポリマーで置換されている。一部の実施形態では、アミノ酸、ｍｉｎｉＰＥＧ、ペプチド、またはポリマーは、少なくとも１つのレポーター部分（例えば、フルオロフォア、色素原）を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも３つのガンマＰＮＡ塩基を有する。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも４つのガンマＰＮＡ塩基を有する。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列の少なくとも１つの置換されたヌクレオチドは、リジン残基、ペプチド、またはｍｉｎｉＰＥＧを含み、リジン残基、ペプチド、またはｍｉｎｉＰＥＧのそれぞれは、それに連結した１つまたは複数のレポーター部分を有していてもよい。
一部の実施形態では、ガンマ位置に１つまたは複数の置換基を有するＰＮＡ配列を含むＰＮＡ配列は、約５から２０塩基を含む。一部の実施形態では、ガンマ位置に１つまたは複数の置換基を有するＰＮＡ配列を含むＰＮＡ配列は、約５から１５塩基を含む。一部の実施形態では、ガンマ位置に１つまたは複数の置換基を有するＰＮＡ配列を含むＰＮＡ配列は、約５から１０塩基を含む。一部の実施形態では、ガンマ位置に１つまたは複数の置換基を有するＰＮＡ配列を含むＰＮＡ配列は、約１５塩基を含む。一部の実施形態では、ガンマ位置に１つまたは複数の置換基を有するＰＮＡ配列を含むＰＮＡ配列は、約１０塩基を含む。
一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、ＰＮＡ配列は、１０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、ＰＮＡ配列は、１つのガンマ位置に少なくとも１つの置換基を含む。
一部の実施形態では、ｍは、０であり、ｚは、０であり、ｎは、１より大きい。
一部の実施形態では、ｎは、２から６の範囲の整数である。一部の実施形態では、「リンカー」は、少なくとも１つのＰＥＧ基を含む。一部の実施形態では、「リンカー」は、式（ＩＶＡ）に示される構造を有する：
Figure 2023113642000006
［式中、
ｄおよびｅは、それぞれ独立して、２から２０の範囲の整数であり；
Ｑは、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；
ＲａおよびＲｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌ、またはＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；
ＲｃおよびＲｄは、独立して、ＣＨ３またはＨであり；
ＡおよびＢは、独立して、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基である］。
一部の実施形態では、ｄおよびｅは、２から６の範囲の整数である。一部の実施形態では、ＡまたはＢの少なくとも一方は、切断可能な部分を含む。一部の実施形態では、切断可能な部分は、光開裂性基である。一部の実施形態では、切断可能な部分は、化学的に切断可能な基である。
本開示の別の態様は、試料中の標的を検出する方法であって、
（ａ）試料を第１のコンジュゲートと接触させることであって、第１のコンジュゲートが、式（ＩＡ）：
Figure 2023113642000007
［式中、
「特異的結合体」は、抗体、抗体断片、薬物／抗体複合体、および核酸からなる群から選択され；
「リンカー」は、２から８０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
Ｚは、ガンマ炭素の位置に置換基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むＰＮＡ配列、非荷電性ＤＮＡ配列、ならびに荷電性および非荷電性の塩基を含むＤＮＡ配列からなる群から選択され；
Ｘは、標識であり；
Ｙは、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
ｍは、０または１から６の範囲の整数であり；
ｚは、０または１であり；
ｎは、１から１２の範囲の整数である］
の構造を有する、接触させることと；
（ｂ）試料を第１の検出試薬と接触させて、第１のコンジュゲートの検出を容易にすること
とを含む、方法である。
一部の実施形態では、方法は、試料を式（ＩＡ）の第２のコンジュゲートと接触させることであって、第１および第２のコンジュゲートが異なる（例えば、異なる特異的結合体および／または異なる標識を含む）、接触させることを含む。
一部の実施形態では、Ｘは、ビオチン、酵素、色素原、フルオロフォア、ハプテン、および質量分析タグからなる群から選択される。
一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、Ｚは、ＰＮＡ配列またはガンマＰＮＡ配列である。一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、Ｚは、１０ヌクレオチドを有するＰＮＡ配列である。一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、Ｚは、ガンマＰＮＡ配列である。
一部の実施形態では、Ｚは、非荷電のＤＮＡ塩基のみを含むＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、Ｚは、荷電性塩基および非荷電性塩基の混合物を含むＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、Ｚは、ＤＮＡ配列中の塩基の少なくとも５０％が非荷電性であるＤＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基を有する。一部の実施形態では、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基のそれぞれは、同じアミノ酸、ｍｉｎｉＰＥＧ、ペプチド、またはポリマーで置換されている。一部の実施形態では、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基のそれぞれは、異なるアミノ酸、ｍｉｎｉＰＥＧ、ペプチド、またはポリマーで置換されている。一部の実施形態では、アミノ酸、ｍｉｎｉＰＥＧ、ペプチド、またはポリマーは、少なくとも１つのレポーター部分（例えば、フルオロフォア、色素原）を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも３つのガンマＰＮＡ塩基を有する。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも４つのガンマＰＮＡ塩基を有する。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から２０塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から１５塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から１０塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約１５塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約１０塩基を含む。
本開示の別の態様は、試料中の標的を検出する方法であって、
（ａ）試料を第１のＰＮＡコンジュゲートと接触させることであって、第１のＰＮＡコンジュゲートが、式（ＩＩＢ）：
Figure 2023113642000008
［式中、
「特異的結合体」は、抗体、抗体断片、薬物／抗体複合体、および核酸からなる群から選択され；
「リンカー」は、２から８０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
「ＰＮＡ」は、ガンマ炭素の位置に置換基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むＰＮＡ配列であり；
Ｘは、標識であり；
Ｙは、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
ｍは、０または１から６の範囲の整数であり；
ｚは、０または１であり；
ｎは、１から１２の範囲の整数である］
の構造を有する、接触させることと；
（ｂ）試料を第１の検出試薬と接触させて、ＰＮＡコンジュゲートの検出を容易にすること
とを含む、方法である。
一部の実施形態では、方法は、試料を第２のＰＮＡコンジュゲート（例えば、式（ＩＩＢ）の別のコンジュゲート）と接触させることであって、第１のＰＮＡコンジュゲートおよび第２のＰＮＡコンジュゲートが異なる、すなわち、異なる少なくとも１つの成分または部分を有する、接触させることを含む。
一部の実施形態では、Ｘは、ビオチン、酵素、色素原、フルオロフォア、ハプテン、および質量分析タグからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基を有する。一部の実施形態では、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基のそれぞれは、同じアミノ酸、ｍｉｎｉＰＥＧ、ペプチド、またはポリマーで置換されている。一部の実施形態では、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基のそれぞれは、異なるアミノ酸、ｍｉｎｉＰＥＧ、ペプチド、またはポリマーで置換されている。一部の実施形態では、アミノ酸、ｍｉｎｉＰＥＧ、ペプチド、またはポリマーは、少なくとも１つのレポーター部分（例えば、フルオロフォア、色素原）を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも３つのガンマＰＮＡ塩基を有する。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも４つのガンマＰＮＡ塩基を有する。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から２０塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から１５塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から１０塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約１５塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約１０塩基を含む。
一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、一次抗体は、第１の標的に特異的である。一部の実施形態では、「特異的結合体」は、二次抗体であり、方法は、試料を第１のコンジュゲートと接触させる前に、試料を第１の標的に特異的な一次抗体と接触させる工程をさらに含み、第１のコンジュゲートは、第１の一次抗体に特異的である。一部の実施形態では、第１の検出試薬は、コンジュゲートの標識に特異的な抗標識抗体である。一部の実施形態では、標識は、ハプテンであり、抗標識抗体は、抗ハプテン抗体である。一部の実施形態では、検出試薬は、第１のコンジュゲートのＰＮＡ配列またはガンマＰＮＡ配列に対して相補的なＰＮＡ、ガンマＰＮＡまたはＤＮＡ配列を含み、相補的ＰＮＡ、ガンマＰＮＡまたはＤＮＡ配列は、レポーター部分にコンジュゲートしている。一部の実施形態では、レポーター部分は、フルオロフォアである。一部の実施形態では、レポーター部分は、色素原である。一部の実施形態では、レポーター部分は、酵素である。一部の実施形態では、レポーター部分は、ハプテンであり、方法は、試料を相補的ＰＮＡ、ガンマＰＮＡまたはＤＮＡ配列のハプテンに特異的な抗ハプテン抗体と接触させることをさらに含む。
本開示の別の態様は、試料中の標的を検出する方法であって、
（ａ）試料を第１のＰＮＡコンジュゲートと接触させることであって、第１のＰＮＡコンジュゲートが、式（ＩＩＢ）：
Figure 2023113642000009
［式中、
「特異的結合体」は、抗体（例えば、一次抗体または二次抗体）、抗体断片、薬物／抗体複合体、および核酸からなる群から選択され；
「リンカー」は、２から８０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり、切断可能な基または部分を含み；
「ＰＮＡ」は、ガンマ炭素の位置に置換基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むＰＮＡ配列であり；
Ｘは、標識であり；
Ｙは、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
ｍは、０であり；
ｚは、０であり；
ｎは、１から１２の範囲の整数である］
の構造を有する、接触させることと；
（ｂ）試料を試薬（または光源、選択される切断可能な基に応じて決まる）と接触させて、「リンカー」上の切断可能な基を切断することと；（ｃ）切断された「ＰＮＡ」配列またはガンマＰＮＡ配列の量を定量すること
とを含む、方法である。
当業者は、多重アッセイを提供するために、異なるＰＮＡコンジュゲート（例えば、式（ＩＩＢ）の任意のコンジュゲート）を用いて、上記特定された工程を何回も繰り返してよいことを認識するであろう。
一部の実施形態では、「特異的結合体」は、抗体である。
一部の実施形態では、切断可能な基は、光開裂性基、化学的に切断可能な基、または酵素的に切断可能な基からなる群から選択される。一部の実施形態では、切断可能な基は、ジスルフィド結合である。
一部の実施形態では、Ｘは、ビオチン、酵素、色素原、フルオロフォア、ハプテン、および質量分析タグからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｘは、ビオチンである。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列の量の定量は、本明細書に記載されるものなど、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ技術を使用して行われる。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列の量の定量は、本明細書に記載されるものなど、Ｇｙｒｏｌａｂ技術を使用して行われる。
一部の実施形態では、ＰＮＡの切断後、抗体結合組織切片を免疫組織化学または免疫蛍光などの従来の方法で再染色して、ＰＮＡタグによってコードされたマーカーの空間分布の視覚化を可能にする。
一部の実施形態では、方法は、式（ＩＩＢ）のコンジュゲートのＰＮＡ配列に対して相補的な一本鎖ＤＮＡまたはＰＮＡ配列を導入することをさらに含む。一部の実施形態では、相補的一本鎖ＤＮＡまたはＰＮＡ配列は、レポーター部分にコンジュゲートしている。一部の実施形態では、相補的一本鎖ＤＮＡまたはＰＮＡ配列は、ハプテンにコンジュゲートしている。一部の実施形態では、相補的一本鎖ＤＮＡまたはＰＮＡ配列は、ジゴキシゲニンにコンジュゲートしている。
一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、方法は、一次抗体に特異的な二次抗体を導入することをさらに含む。一部の実施形態では、二次抗体は、レポーター部分にコンジュゲートしている。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基を有する。一部の実施形態では、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基のそれぞれは、同じアミノ酸、ｍｉｎｉＰＥＧ、ペプチド、またはポリマーで置換されている。一部の実施形態では、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基のそれぞれは、異なるアミノ酸、ｍｉｎｉＰＥＧ、ペプチド、またはポリマーで置換されている。一部の実施形態では、アミノ酸、ｍｉｎｉＰＥＧ、ペプチド、またはポリマーは、少なくとも１つのレポーター部分（例えば、フルオロフォア、色素原）を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも３つのガンマＰＮＡ塩基を有する。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも４つのガンマＰＮＡ塩基を有する。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から２０塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から１５塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から１０塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約１５塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約１０塩基を含む。
ＤＮＡと異なり、ＰＮＡは電荷を含有しないため、ＰＮＡとＤＮＡの間の結合は、ＤＮＡとＤＮＡの間の結合よりも強く、よって、ＤＮＡ－コンジュゲートでは不可能な結合親和性および特異性を達成する一方で、抗体を標識するための比較的短いＰＮＡ配列の使用を可能にすると考えられる。より短いＰＮＡ配列は、抗体－抗原結合および組織非特異的結合に対する干渉を最小限とする助けになり得ることもまた予測される。したがって、本明細書に開示されているＰＮＡ－抗体コンジュゲートは、抗体の結合特異性を維持し、一方、ＰＮＡオリゴマーは、シグナル生成分子とのハイブリダイゼーションによってスライド（ＩＦまたはＩＨＣ）上で、ｉｎ ｓｉｔｕで可視化することができるか、またはＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ技術、Ｇｒｙｏｓ技術、もしくは質量分析法（図１Ａを参照されたい）などのハイスループット技術によってスライドから定量することができる、固有の分子タグとして機能すると予想される。加えて、事実上無制限の固有の配列／タグは、ほぼ同じ条件下で容易に生成および検出され、個々のコンジュゲートを最適化する必要性を排除することができる。重要なことに、切断可能なリンカー（光開裂性または化学的に切断可能）は、ＰＮＡオリゴマーと抗体の間に配置することができ（図１Ａを参照されたい）、オフスライドのタンパク質プロファイリング（多重定量）のための容易な試料収集を可能にする。
本特許または出願の書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を有するこの特許公報または特許出願公開公報の複写は、請求および必要な料金の支払いに応じて特許庁に提供される。
ＰＮＡコンジュゲートの構造ならびに試料内の標的の可視化（定性的）および結合した抗体から切断したＰＮＡタグの定量的評価の両方におけるそれらの使用の概要を提供する。 ヘテロ二官能性架橋剤およびＰＮＡ配列の化学構造を提供する。 ＰＮＡコンジュゲーション前のＵＶ－Ｖｉｓ吸光度に基づく抗体および対応するＰＮＡコンジュゲートの特徴付けを示す。黒および赤のトレースは、例としての２つの異なる抗体を表す。 ＰＮＡコンジュゲーション後のＵＶ－Ｖｉｓ吸光度に基づく抗体および対応するＰＮＡコンジュゲートの特徴付けを示す。黒および赤のトレースは、例としての２つの異なる抗体を表す。 ビオチン化ＰＮＡのＩＨＣ検出を示す。図は、ウサギ抗ＣＤ４５抗体で処理し、その後、ＰＮＡをコンジュゲートしたＧＡＲ、ＧＡＭ、およびＧＡＭでそれぞれ処理した扁桃スライドを示す。次いで、ビオチンをＳＡ－ＨＲＰおよびＤＡＢ沈着によって検出した。 ビオチン化ＰＮＡのＩＨＣ検出を示す。図は、マウス抗Ｋｉ６７抗体で処理し、その後、ＰＮＡをコンジュゲートしたＧＡＲ、ＧＡＭ、およびＧＡＭでそれぞれ処理した扁桃スライドを示す。次いで、ビオチンをＳＡ－ＨＲＰおよびＤＡＢ沈着によって検出した。 ビオチン化ＰＮＡのＩＨＣ検出を示す。図は、一次抗体なしで処理し、その後、ＰＮＡをコンジュゲートしたＧＡＲ、ＧＡＭ、およびＧＡＭでそれぞれ処理した扁桃スライドを示す。次いで、ビオチンをＳＡ－ＨＲＰおよびＤＡＢ沈着によって検出した。 本開示の一部の実施形態に従って、ビオチン化ＰＮＡを使用する検出ストラテジーを示す。 膜マーカーとしてのビオチン化ＰＮＡのＩＨＣ検出を示す。扁桃スライドを、「ハプテン化」一次抗体（すなわち、ハプテンで標識された抗体）で処理し、その後、それぞれのハプテンに対する対応するＰＮＡ－コンジュゲートで処理した。次いで、ＰＮＡコンジュゲート中のビオチンをＳＡ－ＨＲＰおよびＤＡＢ沈着によって検出した。 核マーカーとしてのビオチン化ＰＮＡのＩＨＣ検出を示す。扁桃スライドを、「ハプテン化」一次抗体で処理し、その後、それぞれのハプテンに対する対応するＰＮＡ－コンジュゲートで処理した。次いで、ＰＮＡコンジュゲート中のビオチンをＳＡ－ＨＲＰおよびＤＡＢ沈着によって検出した。 ＰＮＡタグの化学的切断を示す。扁桃スライドを、マウス抗Ｋｉ６７抗体で処理し、ＳＡ－ＨＲＰおよびＤＡＢ沈着によってさらに処理した。 ＰＮＡタグの化学的切断を示す。扁桃スライドを、マウス抗Ｋｉ６７抗体で処理し、ＳＡ－ＨＲＰインキュベーションおよびＤＡＢ沈着の前に、約２０ｍＭのＴＣＥＰによってさらに処理した。 ＰＮＡタグの化学的切断を示す。扁桃スライドを、ウサギ抗ＣＤ４５抗体で処理し、ＳＡ－ＨＲＰおよびＤＡＢ沈着によってさらに処理した。 ＰＮＡタグの化学的切断を示す。扁桃スライドを、ウサギ抗ＣＤ４５抗体で処理し、ＳＡ－ＨＲＰインキュベーションおよびＤＡＢ沈着の前に、約２０ｍＭのＴＣＥＰによってさらに処理した。 ビオチン化ＰＮＡの蛍光検出を示す。扁桃スライドを、マウス抗Ｋｉ６７抗体で処理し、その後、ＰＮＡをコンジュゲートしたＧＡＭで処理した。スライドをＳＡ－ＦＩＴＣと共にさらにインキュベートした。 ビオチン化ＰＮＡの蛍光検出を示す。扁桃スライドを、一次抗体なしで処理し、その後、ＰＮＡをコンジュゲートしたＧＡＭで処理した。スライドをＳＡ－ＦＩＴＣと共にさらにインキュベートした。 ビオチン化ＰＮＡを利用する蛍光に基づく検出スキームを示す。 切断されたＰＮＡ－ＳＡ－ＦＩＴＣ蛍光強度に基づいたスライド当たりの抗体の定量化された測定値を示す。具体的には、棒グラフは、マウス抗ＣＤ４５、ＰＮＡをコンジュゲートしたＧＡＭ、続いて、ＳＡ－ＦＩＴＣで処理し、最後に、２０ｍＭのＴＣＥＰと共にインキュベートした扁桃スライドから切断されたＰＮＡ－ＳＡ－ＦＩＴＣの蛍光強度を示す。コントロールは、実験と同じ処理をしたが一次抗体なしの扁桃スライドである。 切断されたＰＮＡ－ＳＡ－ＦＩＴＣ蛍光強度に基づいたスライド当たりの抗体の定量化された測定値を示す。具体的には、実験およびコントロールスライドから切断されたＰＮＡ－ＳＡ－ＦＩＴＣの濃度を決定するために使用される標準曲線である。試料およびコントロールの蛍光強度は、平均±ＳＴＤＥＶ（Ｎ＝３）として示される。 蛍光標識された相補ＤＮＡによるＰＮＡ検出を示す。扁桃スライドをウサギ抗Ｋｉ６７で処理し、その後、ＰＮＡをコンジュゲートしたＧＡＲで処理した。次いで、スライドを、ＰＮＡタグを相補する蛍光標識されたＤＮＡ配列と共にインキュベートした。ＦＩＴＣで標識したＤＮＡ配列を利用した。 蛍光標識された相補ＤＮＡによるＰＮＡ検出を示す。一次抗体で処理しなかった、よって、ネガティブコントロールとしての役割を果たす扁桃スライド。次いで、スライドをＰＮＡタグを相補する蛍光標識されたＤＮＡ配列と共にインキュベートした。ＦＩＴＣで標識したＤＮＡ配列を利用した。 蛍光標識された相補ＤＮＡによるＰＮＡ検出を示す。扁桃スライドをウサギ抗Ｋｉ６７で処理し、その後、ＰＮＡをコンジュゲートしたＧＡＲで処理した。次いで、スライドをＰＮＡタグを相補する蛍光標識されたＤＮＡ配列と共にインキュベートした。ローダミンで標識したＤＮＡ配列を利用した。一次抗体を含まないが、他は同一条件のネガティブコントロールを、それぞれ、図８Ｂおよび図８Ｄに示した。 蛍光標識された相補ＤＮＡによるＰＮＡ検出を示す。一次抗体で処理しなかった、よって、ネガティブコントロールとしての役割を果たす扁桃スライド。次いで、スライドをＰＮＡタグを相補する蛍光標識されたＤＮＡ配列と共にインキュベートした。ローダミンで標識したＤＮＡ配列を利用した。 図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、および８Ｄの画像を生成する際に利用される検出方法の概略図を提供する。 相補ハプテン化ＤＮＡによる発色検出を示す。扁桃スライドを一次マウス抗ＣＤ２０で処理し、次いで、ＰＮＡをコンジュゲートしたＧＡＭとインキュベートし、その後、ＰＮＡタグに対して相補するＤＩＧ標識化ＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションした。最後に、スライドを抗ＤＩＧ：ＨＲＰ抗体およびＤＡＢ沈着と共にインキュベートした。 相補ハプテン化ＤＮＡによる発色検出を示す。扁桃スライドをウサギ抗Ｋｉ６７で処理し、次いで、ＰＮＡをコンジュゲートしたＧＡＭとインキュベートし、その後、ＰＮＡタグに対して相補するＤＩＧ標識化ＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションした。最後に、スライドを抗ＤＩＧ：ＨＲＰ抗体およびＤＡＢ沈着と共にインキュベートした。 図９Ａおよび９Ｂに表した組織と同様に処理したが、一次抗体なしであり、よって、ネガティブコントロールとしての役割を果たす扁桃スライドを示す。 図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃの画像を生成する際に利用される検出方法の概略図を示す。 光開裂性ヘテロ二官能性架橋剤の可能な合成スキームを示す。 光開裂性ＰＮＡを合成するために使用される光分解性リンカーの化学構造を示す。 ＰＮＡの光切断を示す。スライドをＫｉ６７で処理し、次いで、ＧＡＲ－ＰＬ－ＰＮＡで処理した。スライドを手持ち式のＵＶランプで０分間照射した。 ＰＮＡの光切断を示す。スライドをＫｉ６７で処理し、次いで、ＧＡＲ－ＰＬ－ＰＮＡで処理した。スライドを手持ち式のＵＶランプで５分間照射した。 ＰＮＡの光切断を示す。スライドをＫｉ６７で処理し、次いで、ＧＡＲ－ＰＬ－ＰＮＡで処理した。スライドを手持ち式のＵＶランプで１０分間照射した。 選択的ＰＮＡ光切断を示す。扁桃スライドをＫｉ６７で処理し、次いで、ＧＡＲ－ＰＬ－ＰＮＡで処理した。次いで、表示領域にレーザーキャプチャーマイクロダイセクション機器からのＵＶ光を照射した。ＬＣＭ スライドを洗浄して切断したＰＮＡを除去した後、ＳＡ－ＨＲＰおよびＤＡＢ検出によって染色を完了した。同じスライド上の非照射胚中心と比較して、ＵＶ照射胚中心は色を失った。 本開示のＰＮＡコンジュゲートを使用して、試料中の標的を検出する様々な方法を概説するフローチャートを示す。 本開示のＰＮＡコンジュゲートを使用して、試料中の標的を検出する様々な方法を概説するフローチャートを示す。 本開示のＰＮＡコンジュゲートを使用して、試料中の標的を検出する様々な方法を概説するフローチャートを示す。 ＰＮＡ抗体コンジュゲートの安定性を示す。扁桃スライドを、一次抗体（抗ＣＤ４５および抗Ｋｉ６７）、その後、それぞれＧＡＭ－ＰＮＡおよびＧＡＲ－ＰＮＡと共にインキュベートし、ＳＡ－ＨＲＰおよびＤＡＢ沈着によって検出した。コンジュゲート安定性を評価するために示されたものと同じ抗体－ＰＮＡコンジュゲートを後で使用した。 ガンマ炭素に置換基（「Ｒ」基で示されるが、非限定的である）を有するＰＮＡとガンマ炭素に置換基を有さないＰＮＡの間の差を示す。 分岐したＰＮＡ配列を示す。主要なＰＮＡ配列（赤色で示した）は、４つの置換されたＰＮＡ塩基を有する。主要なＰＮＡ配列の置換基は、ガンマＰＮＡ配列（黒色で示した）である。各ＰＮＡ配列は、４つの置換基を有する。４つのガンマＰＮＡヌクレオチドを含むように示されているこれらの置換基は、それぞれ、ｍｉｎｉＰＥＧまたは他のレポーター部分で置換されている。各ｍｉｎｉＰＥＧは、１つまたは複数の標識またはレポーター部分を含み得る。 カップリングに「クリックケミストリー」を利用した、ＰＮＡオリゴマーへの抗体のコンジュゲーションを示す概略図である。ここでは、還元型抗体をＤＢＣＯ基で官能化し、次いで、アジド基を含むＰＮＡオリゴマーに連結させる。ＰＮＡオリゴマーは、ガンマ炭素に置換基を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含み得る。 抗Ｋｉ６７一次抗体（ウサギｍＡｂ）およびＧＡＲ－ＰＮＡ（クリックケミストリーとコンジュゲートした）二次抗体と共にインキュベートし、ＳＡ－ＨＲＰで検出した扁桃組織を示す。画像は、ＰＮＡがクリックケミストリーを介して抗体にコンジュゲートするのに成功したことを示す。 マレイミド部分を介したＰＮＡオリゴマーへの抗体のコンジュゲーションを示す概略図である。 抗Ｋｉ６７、次いで、ＧＡＲ－短ＰＮＡ（先のスライドに示した配列）と共にインキュベートし、ＳＡ－ＨＲＰで検出した扁桃組織を示す。短ＰＮＡ配列上のビオチンの検出。画像は、短ＰＮＡがＡｂ上にコンジュゲートするのに成功していることを示す。 抗Ｋｉ６７、次いで、ＧＡＲ－ＨＲＰと共にインキュベートした扁桃組織を示す。画像は、短ＰＮＡがＡｂ上にコンジュゲートするのに成功していることを示す。これは、基準検出（図２１Ｂ）をＧＡＲ－短ＰＮＡをベースとした検出（図２１Ａ）と比較するために使用される。 ＣＤ３－短ＰＮＡと共にインキュベートし、ＳＡ－ＨＲＰで検出した扁桃を示す。一次抗体とコンジュゲートした短ＰＮＡのＩＨＣ。使用したＡｂ－短ＰＮＡコンジュゲートの濃度は５μｇ／ｍＬであった（ＰＮＡ配列：ビオチン－ｏ－ＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧ－Ｌｙｓ（ＳＭＣＣ）配列（配列番号１９））。 一次抗体－短ＰＮＡコンジュゲートの第２の例（ＣＤ８－短ＰＮＡ）と共にインキュベートした扁桃を示す。 一次抗体－短ＰＮＡコンジュゲートの第３の例（ＣＤ３４－短ＰＮＡ）と共にインキュベートした扁桃を示す。 一次抗体－短ＰＮＡコンジュゲートの第４の例（Ｋｉ６７－短ＰＮＡ）と共にインキュベートした扁桃を示す。 配列：ビオチン－ｏ－ＴＴＡＧＴＣＣＡＡＣ－Ｌｙｓ（ＳＭＣＣ）（配列番号２０）を有するｓＰＮＡ２と称される（１０塩基）ＰＮＡ配列にコンジュゲートしたＣＤ３による発色染色を示す。ＰＮＡ配列上のビオチン部分を標的とするために、扁桃組織をＰＮＡをコンジュゲートしたＡｂ、その後、ＳＡ－ＨＲＰで染色している。染色は局在化し、ＰＮＡコンジュゲーションによってＡｂの機能性が変更されなかったことを証明する。 ＰＮＡ配列がビオチン－ｏ－ＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧ－Ｌｙｓ（Ｃ６ＳＨ）（配列番号２１）であったｓＰＮＡ２（１０塩基）にコンジュゲートしたＣＤ８による発色染色を示す。ＰＮＡ配列上のビオチン部分を標的とするために、扁桃組織をＰＮＡをコンジュゲートしたＡｂ、その後、ＳＡ－ＨＲＰで染色している。染色は局在化し、ＰＮＡコンジュゲーションによってＡｂの機能性が変更されなかったことを証明する。 抗Ｋｉ６７およびＧＡＲ－短ＰＮＡ、その後、ＤＮＡ－ＤＩＧ（その末端にＤＩＧを有する、ＡＢ１４と呼ばれる短ＰＮＡタグに対して相補的なＤＮＡ配列）と共にインキュベートした扁桃組織を示す。抗ＤＩＧ－ＨＲＰ抗体を検出のために加えた。この事例では、ＰＮＡタグに相補的なＤＮＡが検出された。２つの異なる濃度の相補的ＤＮＡ－ＤＩＧが示されている。 ＤＮＡコンジュゲーションによる蛍光二本鎖形成を示す。図は、ハイブリダイゼーションによる検出をさらに示しているが、今回は蛍光によるものである。相補的ＤＮＡは、１つまたは複数の蛍光タグを含む。２つの一次抗体ＣＤ３およびＣＤ８は、それぞれ２つの異なる短ＰＮＡタグにコンジュゲートしている。２つの相補的ＤＮＡ配列のそれぞれは、フルオロフォアを有する。 抗ＣＤ３－短ＰＮＡ１と抗ＣＤ８－短ＰＮＡ２の混合物（短ＰＮＡ１および短ＰＮＡ２にそれぞれコンジュゲートしている抗ＣＤ３および抗ＣＤ－８）と共にインキュベートし、その後、ＡＢ１５およびＡＢ１９と称される、それぞれ、ｓＰＮＡ１およびｓＰＮＡ２に相補的な２つのＤＮＡ配列と共にインキュベートした扁桃組織スライドを示す。ＡＢ１５はその末端にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を有し、一方、ＡＢ１９はその末端にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を有する。２つの蛍光標識ＤＮＡ配列は、組織上のそれらの相補的ＰＮＡ配列に結合し、蛍光染色された組織スライドが生じる。蛍光染色した組織は、蛍光顕微鏡で撮像する。緑色のチャネル（図２７Ａ）は、ＣＤ３陽性細胞上のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を示している。 抗ＣＤ３－短ＰＮＡ１と抗ＣＤ８－短ＰＮＡ２の混合物（短ＰＮＡ１および短ＰＮＡ２にそれぞれコンジュゲートしている抗ＣＤ３および抗ＣＤ－８）と共にインキュベートし、その後、ＡＢ１５およびＡＢ１９と称される、それぞれ、ｓＰＮＡ１およびｓＰＮＡ２に相補的な２つのＤＮＡ配列と共にインキュベートした扁桃組織スライドを示す。ＡＢ１５はその末端にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を有し、一方、ＡＢ１９はその末端にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を有する。２つの蛍光標識ＤＮＡ配列は、組織上のそれらの相補的ＰＮＡ配列に結合し、蛍光染色された組織スライドが生じる。蛍光染色した組織は、蛍光顕微鏡で撮像する。赤色のチャネル（図２７Ｂ）は、同じ視野で、ＣＤ８陽性細胞上のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を示している。 抗ＣＤ３－短ＰＮＡ１と抗ＣＤ８－短ＰＮＡ２の混合物（短ＰＮＡ１および短ＰＮＡ２にそれぞれコンジュゲートしている抗ＣＤ３および抗ＣＤ－８）と共にインキュベートし、その後、ＡＢ１５およびＡＢ１９と称される、それぞれ、ｓＰＮＡ１およびｓＰＮＡ２に相補的な２つのＤＮＡ配列と共にインキュベートした扁桃組織スライドを示す。ＡＢ１５はその末端にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を有し、一方、ＡＢ１９はその末端にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を有する。２つの蛍光標識ＤＮＡ配列は、組織上のそれらの相補的ＰＮＡ配列に結合し、蛍光染色された組織スライドが生じる。蛍光染色した組織は、蛍光顕微鏡で撮像する。２つの画像のマージ（図２７Ｃ）は、赤色の細胞（ＣＤ８陽性）がすべて緑色（ＣＤ３陽性）でもあることを示しており、これは、ＣＤ８を発現する細胞のすべてがＣＤ３を発現するためである。すべてのＣＤ３細胞がＣＤ８である訳ではないため、いくつかの緑色の細胞は赤色ではない。ＣＤ８は、ＣＤ３の亜集団である。 抗Ｋｉ６７（ウサギｍＡｂ）、その後、ＧＡＲ－ガンマ－ＰＮＡ（ガンマ－ＰＮＡにコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ）、最終的に、ガンマ－ＰＮＡの末端でビオチンに結合することになるストレプトアビジン－ＨＲＰと共にインキュベートした扁桃組織を示す。シグナルは予期された通りであり、非特異的シグナルは観察されなかった。 ガンマ－ＰＮＡにコンジュゲートした一次抗体と共にインキュベートされ、ＳＡ－ＨＲＰで検出された扁桃組織を示す。異なる濃度のＣＤ３－ガンマ－ＰＮＡ（１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ）が２つの倍率（２０×および４０×）で示されている。これは、一次抗体がガンマＰＮＡにもコンジュゲートされ、直接的に検出され得ることを示している。 異なる濃度（１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ）でガンマＰＮＡにコンジュゲートした一次抗体（ＣＤ８）の別の例を提供する。 異なる濃度（１．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ）でガンマ－ＰＮＡにコンジュゲートした一次抗体（ＰＤ－Ｌ１）の別の例を提供する。 ＧＡＲ－ＰＮＡおよびＧＡＲ－ガンマＰＮＡコンジュゲートのＵＶ吸光度を示す。ここで、抗体は、２８０ｎｍの光を主に吸収するが；一方、ＰＮＡは、２６０ｎｍの光を主に吸収する。ＰＮＡが抗体にコンジュゲートすると、２６０ｎｍの吸光度が増大する。２６０ｎｍ／２８０ｎｍの比は、コンジュゲーション効率を評価するために使用される。２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比の増加は、ＰＮＡ負荷がより高いことを示し、ガンマ－ＰＮＡがいずれのガンマ置換基を有さなくてもＰＮＡより親水性が高いことが期待される。非コンジュゲート抗体（純粋な抗体）の２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比はおよそ０．５８であり、ＰＮＡにコンジュゲートした場合は１．１まで、ガンマ－ＰＮＡにコンジュゲートした場合は１．３まで増加する。 ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比で、ＧＡＲ、ＣＤ３およびＣＤ８－短ＰＮＡコンジュゲートのＵＶ吸光度を示す。ＰＮＡが抗体にコンジュゲートするにつれて、２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比が増加することが示されている。 ＰＮＡの定量化のためにＧｒｙｏｓ技術の使用を用いる原理を示す。 Ｇｒｙｏｓ技術を使用して切断されたＰＮＡタグを定量化する工程、およびＰＮＡタグによってコードされた同じマーカーの可視化を可能にするためにＩＨＣによってスライドを再染色する工程を示す概略図を提供する。 ＰＮＡ－抗体コンジュゲートからＰＮＡ配列またはガンマＰＮＡ配列を切断した後のタンパク質標的のＩＨＣ染色を示す。 ＰＮＡ－抗体コンジュゲートからＰＮＡ配列またはガンマＰＮＡ配列を切断した後のタンパク質標的のＩＨＣ染色を示す。 Ｇｒｙｏｓ技術を使用する異なるＰＮＡオリゴマーおよびＤＮＡオリゴマーの検出の比較を提供する。 Ｇｒｙｏｓ技術を使用して検出したＰＮＡのシグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比を示す。 Ｋｉ６７（ウサギＡｂ）、次いで、ＰＮＡ配列（ＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧ）にコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）で染色した扁桃を示す。シグナルの非存在（ここで示されているように）は、実験条件（２００ｎＭのＤＮＡ、３７℃、３０分）で、ＤＮＡがハイブリダイズしなかったことを示した。ＤＮＡ ＰＮＡ親和性は、実験条件でこのような短いＰＮＡ配列とのハイブリダイゼーションを確保する程には強くない。 Ｋｉ６７（ウサギＡｂ）、次いで、ガンマＰＮＡ配列にコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）で染色した扁桃を示す。ＤＮＡガンマＰＮＡ親和性は、ハイブリダイゼーションを確保する程に強く、よって、褐色のシグナルを生じると考えられる。
一般に、本開示は、コンジュゲート、例えば、ＰＮＡコンジュゲート、および生物学的試料、例えば、組織試料における１つまたは複数の標的を検出するためにコンジュゲートを用いる方法を対象とする。いずれの特定の理論に拘束されることも望むものではないが、コンジュゲートは、アッセイにおいて使用される場合、タンパク質標的を含む多数の標的の定性的および定量的評価を同時に可能にすると考えられる（図１Ａを参照されたい）。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでないことが示されない限り、複数の指示対象を含む。同様に、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、「または」という単語は、「および」を含むことを意図する。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、包括的である、すなわち、少なくとも１つの要素を含むが、複数の要素または要素のリスト、および任意選択で、リストに含まれていない追加の項目を、１を超えて含むものと解釈されるものとする。「１つのみ」もしくは「ちょうど１つ」、または特許請求の範囲で使用される場合には「からなる」など、そうではないことが明確に示されている用語のみが、複数の要素または要素のリストのうちの厳密に１つの要素を包含することを指す。一般に、「または」という用語は、本明細書で使用される場合、「いずれか」、「１つ」、「１つのみ」または「ちょうど１つ」など、排他的な用語が先行する場合にのみ、排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であって、両方ではない」）を示すと解釈されることになる。「から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。
「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」などの用語は、互換的に使用され、同じ意味を有する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」なども互換的に使用され、同じ意味を有する。具体的には、それぞれの用語は、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という一般的な米国特許法の定義と一致して定義され、したがって、「少なくとも次のもの」を意味するオープンタームと解釈され、また追加の特徴、制限、態様などを除外しないと解釈される。よって、例えば、「構成要素ａ、ｂ、およびｃを有する装置」は、その装置が少なくとも構成要素ａ、ｂおよびｃを含むことを意味する。同様に、「工程ａ、ｂ、およびｃを含む方法」という句は、その方法が少なくとも工程ａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。さらには、工程およびプロセスは、本明細書で特定の順序で概説され得るが、当業者は、工程およびプロセスの順序が異なり得ることを認識するであろう。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つまたは複数の要素のリストに関して「少なくとも１つ」という句は、要素のリストの要素のうちのいずれか１つまたは複数から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、必ずしも、要素のリスト内に具体的に列挙されているありとあらゆる要素のうちの少なくとも１つを含み、要素のリスト内の要素の任意の組合せを排除する訳ではないことが理解されるべきである。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が指す要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が、具体的に特定された要素に関連するかしないかにかかわらず、任意選択で存在し得ることを可能にする。よって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも一方」（または同等に、「ＡまたはＢの少なくとも一方」、または、同等に、「Ａおよび／またはＢの少なくとも一方」）とは、一実施形態では、Ｂが存在せず（Ｂ以外の要素を含んでもよい）、１つより多いＡを含んでもよい、少なくとも１つのＡを指すことができ；別の実施形態では、Ａが存在せず（Ａ以外の要素を含んでもよい）、１つより多いＢを含んでもよい、少なくとも１つのＢを指すことができ；さらに別の実施形態では、１つより多いＡを含んでもよい、少なくとも１つのＡ、および、１つより多いＢを含んでもよい（他の要素を含んでもよい）、少なくとも１つのＢ；などを指すことができる。
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、完全に飽和した（二重結合も三重結合もない）炭化水素基を含む直鎖状または分岐状炭化水素鎖を指す。アルキル基は、置換されていても置換されていなくてもよい。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、限定されないが、例として、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、それらの組合せを含む、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子、ならびに任意の脊椎動物（例えば、ヒト、ヤギ、ウサギおよびマウスなどの哺乳動物）の免疫応答中に生成される類似の分子、ならびに他の分子への結合の実質的排除のために、目的の分子（または非常に類似する目的の分子の基）に特異的に結合する、抗体断片（当技術分野で知られているＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片およびＦａｂ断片、組換え抗体断片（例えば、ｓＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、二重特異性ｓＦｖ断片、二重特異性ｄｓＦｖ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、ダイアボディ、およびトリアボディ（当技術分野で知られている）、ならびにラクダ抗体など）を指す。さらに、抗体は、抗原のエピトープを特異的に認識し、結合する、軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を少なくとも含む、ポリペプチドリガンドを指す。抗体は、そのそれぞれが可変重（ＶＨ）領域および可変軽（ＶＬ）領域と呼ばれる可変領域を有する、重鎖および軽鎖から構成され得る。ＶＨ領域とＶＬ領域はともに、抗体によって認識される抗原に結合することを担う。抗体という用語はまた、無傷の免疫グロブリン、ならびに当技術分野で周知のそれらの変異体および部分も含む。
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、抗体分子またはＴ細胞受容体などの特異的な体液性または細胞性免疫の産生物が特異的に結合することができる化合物、組成物、または物質を指す。抗原は、例えば、ハプテン、単純な中間代謝産物、糖類（例えば、オリゴ糖）、脂質、およびホルモン、ならびに複合糖質（例えば、多糖）、リン脂質、核酸およびタンパク質などの巨大分子を含む、任意の種類の分子であり得る。
本明細書で使用される場合、「生物学的試料」または「組織試料」という用語は、限定されないが、とりわけ、細菌、酵母、原生動物、およびアメーバなどの単細胞生物、多細胞生物（健康なもしくは見かけ上健康なヒト対象またはがんなどの診断または検査を受けるべき状態または疾患に罹患したヒト患者に由来する試料を含む、植物または動物）を含む、あらゆる生物から得られた、それによって排出された、またはそれによって分泌された任意の固体または液体の試料である。例えば、生物学的試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、腹水、唾液、脳脊髄液、房水もしくは硝子体液、または任意の体分泌物、浸出液、滲出液（例えば、膿瘍、またはいずれかの他の感染もしくは炎症部位から得られた液体）、または関節（例えば、正常な関節または疾患に冒された関節）から得られた体液であり得る。生物学的試料はまた、任意の臓器または組織から得られる試料（腫瘍生検などの生検または剖検標本を含む）であり得るか、あるいは細胞（初代細胞または培養細胞であるかどうかにかかわらず）または任意の細胞、組織、もしくは臓器によって順化される培地を含み得る。試料は、黒色腫、腎細胞癌、および非小細胞肺がん由来のものを含む腫瘍試料であり得る。一部の実施形態では、試料は、組織試料内のバイオマーカー（例えば、タンパク質または核酸配列）を含む標的を検出することによって、がんなどの病状について分析される。開示された方法の記載された実施形態はまた、「正常な」試料または「コントロール」試料と称される、異常、疾患、障害などを有しない試料に適することができる。例えば、複数の場所から組織試料を採取することによって、がんについて対象を試験することは有用であり得、これらの試料をコントロールとして使用し、後の試料と比較して、特定のがんがその主要起源を超えて広がっているかどうかを決定することができる。一部の実施形態では、試料は、従来のタンパク質抽出方法によって、細胞溶解物、組織、または生物体全体から抽出および精製されたタンパク質であり得る。本開示の文脈では、次いで、抽出されたタンパク質を、抗体が特定のタンパク質に結合するに至ったＰＮＡコンジュゲート抗体と混合することができる。次いで、ＰＮＡを放出させ、計数して、タンパク質を定量する。
本明細書で使用される場合、「ａ」および「ｂ」が整数である「ＣａからＣｂ」とは、アルキル、アルケニルまたはアルキニル基内の炭素原子の数、またはシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニルもしくはアリール基の環内の炭素原子の数、またはヘテロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリールもしくはヘテロアリシクリル基内の炭素原子とヘテロ原子の合計数を指す。すなわち、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルの環、シクロアルケニルの環、シクロアルキニルの環、アリールの環、ヘテロアリールの環またはヘテロアリシクリルの環は、「ａ」から「ｂ」までの炭素原子を包括的に含有し得る。よって、例えば、「Ｃ１からＣ４アルキル」基は、１から４個の炭素を有するすべてのアルキル基、すなわち、ＣＨ３－、ＣＨ３ＣＨ２－、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２－、（ＣＨ３）２ＣＨ－、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－および（ＣＨ３）３Ｃ－を指す。アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロアリシクリル基に関して「ａ」および「ｂ」が指定されていない場合、これらの定義に記載されている最も広い範囲が想定されるべきである。
本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」は、より大きい構築物へと共有結合により連結している２つ以上の分子（および／またはナノ粒子などの材料）を指す。
本明細書で使用される場合、「連結する（ｃｏｕｐｌｅ）」または「連結すること（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）」という用語は、１つの分子または原子の別の分子または原子への接合、結合（例えば、共有結合）、または連結を指す。
本明細書で使用される場合、「検出プローブ」という用語は、特定の標的（例えば、核酸配列、タンパク質など）に結合する核酸プローブまたは一次抗体を含む。検出プローブは、放射性同位元素、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光剤または蛍光剤、ハプテン（ＤＮＰを含むがこれに限定されない）、および酵素などの直接検出用の標識を含み得る。あるいは、検出プローブは、標識またはタグを含有しなくてもよく、間接的に（例えば、検出プローブに特異的である二次抗体を用いて）検出される場合もある。
本明細書で使用される場合、「ガンマＰＮＡ」および「ガンマＰＮＡ配列」という用語は、ガンマ位置に、すなわち、ガンマ炭素の位置に置換基を含む少なくとも１つのヌクレオチドを含む任意のＰＮＡ配列を指す。図１６は、ＰＮＡヌクレオチドとガンマ炭素の位置に置換基を有するものとの間の差を示し、ここで、「Ｒ」基は、例示を目的とするためのものに過ぎず、非限定的である。
本明細書で使用される場合、「ハプテン」という用語は、抗体と特異的に結合する（ｃｏｍｂｉｎｅ）ことができる低分子であるが、典型的には、キャリアー分子との組合せを除き、免疫原性であることが実質的に不可能である。一部の実施形態では、ハプテンとしては、ピラゾール（例えば、ニトロピラゾール）；ニトロフェニル化合物；ベンゾフラザン；トリテルペン；尿素（例えば、フェニル尿素）；チオ尿素（例えば、フェニルチオ尿素）；ロテノンおよびロテノン誘導体；オキサゾール（例えば、オキサゾールスルホンアミド）；チアゾール（例えば、チアゾールスルホンアミド）；クマリンおよびクマリン誘導体；ならびにシクロリグナンが挙げられるが、これらに限定されない。ハプテンの追加の非限定的な例としては、チアゾール；ニトロアリール；ベンゾフラン；トリペルペン；およびシクロリグナンが挙げられる。ハプテンの具体例としては、ジニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、およびフルオレセイン、ならびにそれらの任意の誘導体または類似体が挙げられる。他のハプテンは、その開示がその全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，８４６，３２０号；同第８，６１８，２６５号；同第７，６９５，９２９号；同第８，４８１，２７０号；および、同第９，０１７，９５４号に記載されている。ハプテン自体は直接検出に対して好適であり得る、すなわち、それらは検出に対して好適なシグナルを発することができる。
本明細書で使用される場合、「ハロゲン原子」または「ハロゲン」という用語は、元素周期表の第７欄の放射線安定原子のいずれか１つ、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を意味する。
本明細書で使用される場合、「免疫組織化学」という用語は、抗原の、抗体などの特異的結合剤との相互作用を検出することによって、試料中の抗原の存在または分布を決定する方法を指す。抗体－抗原結合を可能にする条件下で、試料を抗体と接触させる。抗体－抗原結合は、抗体にコンジュゲートした検出可能な標識（直接検出）によって、または一次抗体に特異的に結合する二次抗体にコンジュゲートした検出可能な標識（間接検出）によって、検出することができる。
本明細書で使用される場合、「多重」、「多重化」、または「多重化すること」という用語は、試料中の複数の標的を同時に、実質的に同時に、または逐次的に検出することを指す。多重化することは、複数の別個の核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）およびポリペプチド（例えば、タンパク質）の両方を個々に、ならびに任意およびすべての組合せで、同定および／または定量することを含み得る。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、あらゆる形態の核酸分子を包含するために本明細書において使用される。限定されないが、このカテゴリーには、それぞれ修飾を伴うか伴わないかにかかわらず、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびそれらの誘導体が含まれる。
本明細書で使用される場合、「一次抗体」という用語は、組織試料中の標的タンパク質抗原に特異的に結合する抗体を指す。一次抗体は、一般的に、免疫組織化学的手順において使用される第１の抗体である。よって、一次抗体は、組織試料内の標的を検出するための「検出プローブ」として作用し得る。
本明細書で使用される場合、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」という用語は、糖－リン酸骨格が偽ペプチド骨格で置き換えられているオリゴヌクレオチド類似体である。ＰＮＡは、高い特異性および選択性でＤＮＡおよびＲＮＡに結合し、対応する核酸複合体よりも安定であると考えられるＰＮＡ－ＲＮＡおよびＰＮＡ－ＤＮＡハイブリッドをもたらす。核酸に対するＰＮＡの結合親和性および選択性は、ＰＮＡ骨格へと立体中心（Ｄ－Ｌｙｓベースの単位など）を導入することによって修飾することができる。ＰＮＡは、オリゴマー、連結ポリマーまたはキメラオリゴマーであり得る。ＰＮＡの化学合成およびアセンブリのための方法は、その開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、および同第５，７８６，５７１号に記載されている。「ＰＮＡ」という用語は、全体を通して使用される場合、ガンマ位置で置換されている１つまたは複数の塩基を有するＰＮＡ配列を含み（「ガンマＰＮＡ」）、すなわち、ＰＮＡまたはＰＮＡ配列という用語は、ガンマＰＮＡまたはガンマＰＮＡ配列を含む。
本明細書で使用される場合、全体を通して使用される場合、「反応性基」「（複数の）反応性基」という用語は、本明細書に記載されているように、第１の単位を第２の単位に連結するのに好適な様々な基（例えば、官能基）のいずれかを意味する。例えば、反応性基は、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、塩化スルホニルなどの酸塩化物、アルデヒドおよびグリコール、エポキシドおよびオキシラン、カーボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、ならびにそれらの組合せなどのアミン反応性基であり得る。好適なチオール反応性官能基としては、ハロアセチルおよびアルキルハライド、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化剤、ピリジルジスルフィド、ＴＮＢ－チオール、およびジスルフィド還元剤などのチオールジスルフィド交換試薬、ならびにそれらの組合せが挙げられる。好適なカルボキシレート反応性官能基としては、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル化合物、カルボニルジイミダゾール化合物、およびカルボジイミドが挙げられる。好適なヒドロキシル反応性官能基としては、エポキシドおよびオキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネートまたはＮ－ヒドロキシスクシンイミジルクロロホルメート、過ヨウ素酸酸化化合物、酵素酸化、アルキルハロゲン、およびイソシアネートが挙げられる。アルデヒドおよびケトン反応性官能基としては、ヒドラジン、シッフ塩基、還元的アミノ化生成物、マンニッヒ縮合生成物、およびそれらの組合せが挙げられる。活性水素反応性化合物としては、ジアゾニウム誘導体、マンニッヒ縮合生成物、ヨウ素化反応生成物、およびそれらの組合せが挙げられる。光反応性化学官能基としては、アリールアジド、ハロゲン化アリールアジド、ベンゾホノン、ジアゾ化合物、ジアジリン誘導体、およびそれらの組合せが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「レポーター部分」という語句は、試料中のＰＮＡコンジュゲートを含むコンジュゲートの存在（すなわち、定性分析）および／または濃度（すなわち、定量分析）を示す、検出可能な（視覚的に、電子的にまたはその他の方法で）シグナルを生成することができる分子または材料を指す。検出可能なシグナルは、光子の吸収、放出および／または散乱（無線周波数、マイクロ波周波数、赤外線周波数、可視周波数および紫外線周波数の光子を含む）を含む、いずれかの知られているまたはまだ発見されていない機構によって発生させることができる。
本明細書で使用される場合、ここでの「二次抗体」という用語は、検出プローブまたはその一部分（例えば、ハプテンまたは一次抗体）に特異的に結合し、それによって、検出プローブと、存在する場合にはその後の試薬（例えば、標識、酵素など）との間に架橋を形成する、抗体を指す。二次抗体を使用して、例えば、一次抗体などの検出プローブを間接的に検出することができる。二次抗体の例としては、それぞれ本明細書に記載される抗タグ抗体、抗種抗体、および抗標識抗体が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「特異的結合体」という用語は、特異的結合対のメンバーを指す。特異的結合対は、それらが他の分子への結合を実質的に排除して互いに結合することを特徴とする分子の対である（例えば、特異的結合対は、生物学的試料中の他の分子との結合対の２つのメンバーのいずれかについての結合定数よりも少なくとも１０３Ｍ－１大きい、１０４Ｍ－１大きいまたは１０５Ｍ－１大きい結合定数を有することができる）。特異的結合部分の例としては、特異的結合タンパク質（例えば、抗体、レクチン、ストレプトアビジンなどのアビジン、およびプロテインＡ）が挙げられる。特異的結合部分はまた、このような特異的結合タンパク質によって特異的に結合される分子（またはそれらの一部）も含み得る。特異的結合体には、上記の一次抗体、または核酸プローブが含まれる。
本明細書で使用する場合、本明細書で使用される「染色する（ｓｔａｉｎ）」、「染色（すること）（ｓｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、一般的に、生物学的検体中の特定の分子（脂質、タンパク質または核酸など）または特定の構造（正常もしくは悪性細胞、サイトゾル、核、ゴルジ体、または細胞骨格など）の存在、位置、および／または量（濃度など）を検出および／または識別する、生物学的検体の任意の処理を指す。例えば、染色により、特定の分子または特定の細胞構造と生物学的検体の周囲部分との間のコントラストがもたらされ得、染色の強度によって、検体内の特定の分子の量の尺度がもたらされ得る。染色は、明視野顕微鏡だけでなく、位相差顕微鏡、電子顕微鏡、および蛍光顕微鏡などの他の観察ツールも用いる、分子、細胞構造および生物の観察を補助するために使用することができる。システム２によって行われる染色の一部を使用して、細胞の輪郭を可視化することができる。システム２によって行われる他の染色は、他の細胞成分を染色せずに、または比較的ほとんど染色することなく、染色される特定の細胞成分（分子または構造など）に依存し得る。システム２によって行われる染色方法の種類の例としては、限定されないが、組織化学的方法、免疫組織化学的方法、および核酸分子間のハイブリダイゼーション反応などの分子間の反応（非共有結合による相互作用を含む）に基づいた他の方法が挙げられる。特定の染色方法としては、これらに限定されないが、一次染色方法（例えば、Ｈ＆Ｅ染色、Ｐａｐ染色など）、酵素結合免疫組織化学的方法、ならびに蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などのｉｎ ｓｉｔｕＲＮＡおよびＤＮＡハイブリダイゼーション法が挙げられる。
基または部分が「置換されている」または「置換されていてもよい」（または「有していてもよい」または「含んでもよい」）と記載されている場合は常に、その基は置換されていなくてもよく、または示されている置換基の１つまたは複数で置換されていてもよい。同様に、置換されている場合に、基が「置換または非置換」であると記載されている場合には、置換基は、示されている置換基の１つまたは複数から選択することができる。置換基が示されていない場合、示される「置換されていてもよい」または「置換された」基は、個別に独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、（ヘテロアリシクリル）アルキル、ヒドロキシ、保護ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、シアネート、ハロゲン、チオカルボニル、Ｏ－カルバミル、Ｎ－カルバミル、Ｏ－チオカルバミル、Ｎ－チオカルバミル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、Ｃ－カルボキシ、保護Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、ニトロ、シリル、スルフェニル、スルフィニル、スルホニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、トリハロメタンスルホニル、トリハロメタンスルホンアミド、アミノ、エーテル、アミノ（例えば、一置換アミノ基または二置換アミノ基）、およびそれらの保護化誘導体から選択される１つまたは複数の基で置換されてもよいことを意味する。上記の基のいずれも、Ｏ、Ｎ、またはＳを含む１つまたは複数のヘテロ原子を含み得る。例えば、部分がアルキル基で置換されている場合、そのアルキル基は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択されるヘテロ原子を含むことができる（例えば、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）－）。
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の全体または全体的に近い度合いまたは程度を示す、定性的条件を意味する。一部の実施形態では、「実質的に」は、約２０％以内を意味する。一部の実施形態では、「実質的に」は、約１５％以内を意味する。一部の実施形態では、「実質的に」は、約１０％以内を意味する。一部の実施形態では、「実質的に」は、約５％以内を意味する。
本明細書で使用される場合、「標的」という用語は、存在、位置および／または濃度を決定しているかまたは決定することができる、任意の分子を意味する。標的の例には、本明細書に開示されているものなど、核酸配列およびタンパク質が含まれる。
オリゴマーおよびコンジュゲート
本開示の一態様は、特異的結合体およびオリゴマーのコンジュゲート、すなわち、［特異的結合体］－［オリゴマー］ｎ（ｎは、１から１２の範囲の整数である）に関する。一部の実施形態では、コンジュゲートは、ＰＮＡコンジュゲート、すなわち、特異的結合体と、ＰＮＡ配列（ＰＮＡ塩基のガンマ炭素の位置に１つまたは複数の置換基を有するものなど）を含むオリゴマーとのコンジュゲートである。一部の実施形態では、特異的結合体とオリゴマーとは、リンカー（上記の式で示されていない）、例えば、切断可能な基または部分を含むリンカーを介して連結される。一部の実施形態では、オリゴマーは、ガンマＰＮＡ配列、非荷電性ＤＮＡ配列、または荷電性および非荷電性の塩基を含むＤＮＡ配列を含む。他の実施形態では、オリゴマーは、ガンマＰＮＡ配列を含む。さらに他の実施形態では、特異的結合体は抗体であり、オリゴマーはガンマＰＮＡ配列を含む。
一般に、本明細書に開示されるコンジュゲートは、免疫組織化学的アッセイまたは多重アッセイを含むｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイで使用するのに好適であり、それによって、組織試料内の標的を検出できるように検出プローブとして使用することができる。一部の実施形態では、コンジュゲートは、相補的ＰＮＡ、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは（ｉ）それ自体を直接検出することができるか；（ｉｉ）フルオロフォア、酵素（ＨＲＰ）などの直接検出することができる特定の実体を保有するか；もしくは（ｉｉｉ）別の抗体によって認識され得るハプテンを有することなどによって間接的に検出することができる同様の配列にハイブリダイズすることができる。本明細書に開示されているコンジュゲートはまた、定量分析において使用することができる分子「バーコード」として機能し得る。
一部の実施形態では、本開示のコンジュゲートは、式（ＩＡ）および（ＩＢ）の一般構造を有する：
Figure 2023113642000010
［式中、
「特異的結合体」は、抗体、抗体断片、薬物／抗体複合体、および核酸からなる群から選択され；
「リンカー」は、２から８０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
Ｚは、ガンマ位置に置換基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むＰＮＡ配列、非荷電性ＤＮＡ配列、ならびに荷電性および非荷電性の塩基を含むＤＮＡ配列からなる群から選択され；
Ｘは、標識（本明細書に記載のものなど）であり；
Ｙは、スペーサーであり；
ｍは、０または１から６の範囲の整数であり；
ｚは、０または１であり；
ｎは、１から１２の範囲の整数である］。
一部の実施形態では、Ｚは、非荷電の塩基のみを有するＤＮＡ配列を含む。他の実施形態では、Ｚは、荷電性の塩基と非荷電性の塩基の両方を有するＤＮＡ配列を含む。さらに他の実施形態では、Ｚは、ＤＮＡ配列の塩基の少なくとも５０％が非荷電性であるＤＮＡ配列を含む。さらに他の実施形態では、Ｚは、ＰＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、Ｚは、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基を有するガンマＰＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、Ｚは、少なくとも３つのガンマＰＮＡ塩基を有するガンマＰＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、Ｚは、少なくとも４つのガンマＰＮＡ塩基を有するガンマＰＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から６０塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から３０塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から２０塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から１５塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から１０塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約１５塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約１０塩基を含む。
一部の実施形態では、コンジュゲート式（ＩＡ）および（ＩＢ）は、特異的結合部分をＰＮＡまたはＤＮＡ含有オリゴマーに連結させるよう設計されたリンカー、例えば、多機能性リンカーを含む。一部の実施形態では、多機能性リンカーは、ヘテロ二機能性リンカー、すなわち、少なくとも２つの異なる反応性官能基を含むものである（例えば、本明細書で定義された基ＡおよびＢを参照されたい）。例えば、ヘテロ二機能性リンカーは、カルボン酸基およびアミン基を含んでもよく、カルボン酸基またはアミン基のうちの一方は、特異的結合体またはＰＮＡもしくはＤＮＡ配列のうちの１つと結合を形成することが可能であり、カルボン酸基またはアミン基のうちの他方は、特異的結合体またはＰＮＡもしくはＤＮＡ配列のうちの別のものと結合を形成することが可能である。一部の実施形態では、「リンカー」は、１つまたは複数の切断可能な基を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の切断可能な基は、光開裂性部分を含む。
一部の実施形態では、「リンカー」は、２から４０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基である。他の実施形態では、「リンカー」は、２から２０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基である。
一部の実施形態では、Ｙは、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基である。他の実施形態では、Ｙは、１から６個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基である。一部の実施形態では、Ｙは、「リンカー」に関して本明細書に記載されたものなどの切断可能な基を含む。一部の実施形態では、ｎは、１から９の範囲である。他の実施形態では、ｎは、１から６の範囲である。一部の実施形態では、Ｘは、色素原部分である。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、式（ＩＩＡ）の一般構造を有するＰＮＡコンジュゲートである：
Figure 2023113642000011
［式中、
「特異的結合体」は、抗体、抗体断片、薬物／抗体複合体、および核酸からなる群から選択され；
「ＰＮＡオリゴマー」は、ガンマ炭素の位置に置換基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むＰＮＡ配列を含み；
ｎは、１から１２の範囲の整数である］。
一部の実施形態では、単一のＰＮＡオリゴマーは、特異的結合体、例えば、抗体、核酸などに連結される。他の実施形態では、複数のＰＮＡオリゴマーは、特異的結合体に連結される。一部の実施形態では、ｎは、１から１０の範囲の整数である。他の実施形態では、ｎは、１から８の範囲の整数である。さらに他の実施形態では、ｎは、１から６の範囲の整数である。さらに他の実施形態では、ｎは、２から６の範囲の整数である。さらに他の実施形態では、ｎは、１から４の範囲の整数である。さらに他の実施形態では、ｎは、２から４の範囲の整数である。さらに他の実施形態では、ｎは、少なくとも２である。さらなる実施形態では、ｎは、少なくとも３である。
「ＰＮＡオリゴマー」はまた、本明細書においてさらに記載されているように、特異的結合体へのＰＮＡ配列またはガンマＰＮＡ配列の連結を容易にするように設計されたリンカーまたはスペーサーを含み得る。他の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーは、コンジュゲートの水溶性を高める基、例えば、ＰＮＡコンジュゲートの水溶性を高める機能性を含むリンカーまたはスペーサーを含み得る。
一部の実施形態では、「ＰＮＡオリゴマー」は、コンジュゲートまたは標的の直接的または間接的検出を可能にする少なくとも１つの標識を含む。
一部の実施形態では、ＰＮＡコンジュゲートは、式（ＩＩＢ）の構造を有する：
Figure 2023113642000012
［式中、
「特異的結合体」は、抗体、抗体断片、薬物／抗体複合体、および核酸からなる群から選択され；
リンカーは、２から８０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
「ＰＮＡ」は、ガンマ炭素の位置に置換基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むＰＮＡ配列であり；
Ｘは、標識であり；
Ｙは、スペーサーであり；
ｍは、０または１から６の範囲の整数であり；
ｚは、０または１であり；
ｎは、１から１２の範囲の整数である］。
一部の実施形態では、Ｙは、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基である。一部の実施形態では、Ｙは、１から６個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基である。一部の実施形態では、Ｙは、「リンカー」に関する本明細書に記載のものなど切断可能な基を含む。
一部の実施形態では、単一のＰＮＡオリゴマー、すなわち、－（リンカー－ＰＮＡ－［Ｙ］Ｚ－［Ｘ］ｍ）ｎ）は、特異的結合体に連結している。他の実施形態では、複数のＰＮＡオリゴマーは、特異的結合体に連結している。一部の実施形態では、ｎは、１から１０の範囲の整数である。他の実施形態では、ｎは、１から８の範囲の整数である。さらに他の実施形態では、ｎは、１から６の範囲の整数である。さらに他の実施形態では、ｎは、２から６の範囲の整数である。さらに他の実施形態では、ｎは、１から４の範囲の整数である。さらに他の実施形態では、ｎは、２から４の範囲の整数である。さらに他の実施形態では、ｎは、少なくとも２である。さらなる実施形態では、ｎは、少なくとも３である。
一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、ＰＮＡ配列は、少なくとも１つのガンマＰＮＡ塩基、すなわち、ガンマ位置で置換されている少なくとも１つのＰＮＡ塩基を有する。一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、ＰＮＡ配列は、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基を有する。一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、ＰＮＡ配列は、少なくとも３つのガンマＰＮＡ塩基を有する。一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、ＰＮＡ配列は、少なくとも４つのガンマＰＮＡ塩基を有する
一部の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、ＰＮＡ配列は、約１０塩基を含む。他の実施形態では、「特異的結合体」は、二次抗体であり、ＰＮＡ配列は、約１５塩基を含む。さらに他の実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、ＰＮＡ配列は、約１５塩基を含み、ＰＮＡ配列におけるヌクレオチドの少なくとも１つは、ガンマ炭素の位置に置換基を含む。さらなる実施形態では、「特異的結合体」は、一次抗体であり、ＰＮＡ配列は、約１５塩基を含み、ＰＮＡ配列におけるヌクレオチドの少なくとも２つは、ガンマ炭素の位置に置換基を含む。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基、すなわち、ガンマ炭素の位置に置換基を有する少なくとも２つの塩基を有する。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも３つのガンマＰＮＡ塩基を有する。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも４つのガンマＰＮＡ塩基を有する。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から６０個の塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から３０個の塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から２０個の塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から１５個の塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から１０個の塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約１５個の塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約１０個の塩基を含む。
他の実施形態では、式（ＩＩＣ）のＰＮＡコンジュゲートは、式（ＩＣ）の構造を有する：
Figure 2023113642000013
［式中、
「Ａｂ」は、一次抗体または二次抗体からなる群から選択され；
「リンカー」は、２から８０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
「ＰＮＡ」は、ガンマ炭素の位置に置換基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むＰＮＡ配列であり；
Ｘは、標識であり；
Ｙは、スペーサーであり；
ｍは、０または１から６の範囲の整数であり；
ｚは、０または１であり；
ｎは、１から１２の範囲の整数である］。
一部の実施形態では、Ｙは、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基である。一部の実施形態では、Ｙは、「リンカー」に関して上述されたものなどの切断可能な基を含む。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＰＮＡオリゴマー、すなわち、－（リンカー－ＰＮＡ－［Ｙ］ｚ－［Ｘ］ｍ）ｎ）は、一次または二次抗体に連結して、ＰＮＡ－抗体コンジュゲートを形成する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーは、一次抗体に連結する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーは、二次抗体に連結する。一部の実施形態では、ｎは、１から１０の範囲の整数である。他の実施形態では、ｎは、１から８の範囲の整数である。さらに他の実施形態では、ｎは、１から６の範囲の整数である。さらに他の実施形態では、ｎは、２から６の範囲の整数である。さらに他の実施形態では、ｎは、１から４の範囲の整数である。さらに他の実施形態では、ｎは、２から４の範囲の整数である。
任意の特定の一次または二次抗体に連結させることができるＰＮＡオリゴマーの数は、当然のことながら、選択された特定の抗体ならびにその物理的および／または化学的性質に応じて決まる。一部の実施形態では、抗体当たりのオリゴマー数の標識度は、約２から約１０の範囲である。他の実施形態では、標識度は、約１より大きい。他の実施形態では、標識度は、約２から約６の範囲である。さらに他の実施形態では、標識度は、約４である。比較的低い標識度は、抗体機能性（例えば、抗原結合または標識抗体の長期安定性）に関するあらゆる有害な影響を防止または軽減すると考えられる。この場合もやはり、抗体の安定性は、抗体自体に大きく依存すると考えられる。よって、抗体当たりのＰＮＡオリゴマーの数は、抗体が機能化に耐える能力に依存し得る。実際、複数の標識を含むＰＮＡオリゴマーを含むことさえ可能である（本明細書においてさらに記載される）。例えば、ＰＮＡオリゴマーは、１つまたは複数のフルオロフォアおよび／またはハプテンを含んでもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数のハプテンは、検出のために使用され得る。一部の実施形態では、１つまたは複数のフルオロフォアを使用して、ＰＮＡの抗体に対する結合をモニターすることができる。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基を有する。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも３つのガンマＰＮＡ塩基を有する。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも４つのガンマＰＮＡ塩基を有する。
一部の実施形態ではＰＮＡ配列は、約５から６０個の塩基を含む。一部の実施形態ではＰＮＡ配列は、約５から３０個の塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から２０個の塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から１５個の塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約５から１０個の塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約１５個の塩基を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、約１０個の塩基を含む。
一部の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーは、式（ＩＩＩ）の構造を有する：
Figure 2023113642000014
［式中、
Ｔは、末端反応性部分を有する基であり；
「リンカー」は、２から８０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
「ＰＮＡ」は、ガンマ炭素の位置に置換基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むＰＮＡ配列であり；
Ｘは、標識であり；
Ｙは、スペーサーであり；
ｍは、０または１から６の範囲の整数であり；
ｚは、０または１である］。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも２つのガンマＰＮＡ塩基を有する。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも３つのガンマＰＮＡ塩基を有する。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも４つのガンマＰＮＡ塩基を有する。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも１つのガンマＰＮＡ塩基を有し、少なくとも１つのガンマＰＮＡ塩基は、レポーター部分に直接的または間接的にコンジュゲートしている。
ＰＮＡオリゴマーは、抗体の任意の部分に連結し得る。抗体中の３つの官能基は、共有結合的修飾のための部位である：アミン（－ＮＨ２）、チオール基（－ＳＨ）および炭水化物残基（Ｓｈｒｅｓｔｈａ Ｄら、２０１２）。そのため、本明細書に開示されているＰＮＡオリゴマーはいずれも、アミン残基、チオール残基、および炭水化物残基またはそれらの任意の組合せに連結され得る。一部の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーは、抗体のＦｃ部分に連結される。他の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーは、抗体のヒンジ領域に連結される。一部の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーは、抗体のＦｃ領域のうちの１つまたは複数および抗体のヒンジ領域のうちの１つまたは複数に連結される。実際に、本開示では任意の組合せが企図されている。
アミノ基は、主に、これらの部分が抗体中に豊富にあるために、一般的に好まれている。しかしながら、アミノ基のランダム性は、抗体が失活し得るという危険性をもたらす。（Ａｄａｍｃｚｙｋ Ｍら、１９９９、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ；ＪｅａｎｓｏｎＡら、１９８８、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ；ＶｉｒａＳら、２０１０、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ；Ｐｅａｒｓｏｎ ＪＥら、１９９８、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）。一部の実施形態では、１つまたは複数のＰＮＡオリゴマーは、抗体のアミノ基に連結される。
他方では、適切な反応条件下において、スルフヒドリル標識は、ヒンジ領域における抗体の２つの重鎖間のジスルフィド結合の高い特異性標的化をもたらす。ヒンジ領域は抗原結合部位から離れていることから、この修飾は、抗体の結合親和性をよりよく保持すると考えられる。一部の実施形態では、１つまたは複数のＰＮＡオリゴマーは、抗体のチオール基に連結される。
抗体のＦｃ部分に存在する炭水化物部分でのコンジュゲーションは、チオール基のコンジュゲーションと類似しており、その結果、修飾は、抗原結合部位から離れた－ＣＨＯ基で起こる。これもまた、特定の理論に拘束されることを望むものではないが、炭水化物におけるコンジュゲーションは、抗体の結合親和性に関する悪影響が少ないと考えられる。標識度は、特異的抗体のグリコシル化状態に応じて変わる。しかしながら、抗体親和性の喪失は、依然として、Ｊｅａｎｓｏｎ Ａら、１９８８、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓによって報告されていた。一部の実施形態では、１つまたは複数のＰＮＡオリゴマーは、抗体の炭水化物基に連結される。
一部の実施形態では、Ｔは、特異的結合体の官能基、例えば、抗体のアミノ基との直接的な結合、またはリンカー、例えば、ＤＢＣＯ－マレイミド二機能性リンカーを介して抗体のチオール基に結合したＰＮＡ配列上のアジドを介した間接的な結合を形成することが可能な反応基である。一部の実施形態では、Ｔは、ＮＨＳエステル、チオール、マレイミドまたはアジド基である。
他の実施形態では、Ｔは、求核置換（例えば、アミンおよびアルコールのハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）ならびに炭素－炭素および炭素－ヘテロ原子多重結合への付加（例えば、マイケル反応、ディールス－アルダー付加）に関与することが可能である反応性官能基を含む。これらおよび他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ、ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９６；およびＦｅｅｎｅｙら、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ、１９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、１９８２で議論されている。
一部の実施形態では、反応性官能基は、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化アシル、ハロゲン化シリル、アシルアジド、アシルニトリル、アクリルアミド、アミン、アルデヒド、ハロゲン化アルキル（ここで、ハロゲン化物は、求核基、例えば、アミン、カルボン酸アニオン、チオールアニオン、カルボアニオン、またはアルコキシドイオンなどで後に置き換えられ、それによって、ハロゲン原子の部位において新たな基の共有結合をもたらし得る）、ハロゲン化アリール、スルホン酸アルキル、スルホン酸エステル、無水物、アジド、アジリジン、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホロアミド酸、チオール（これは、一部の実施形態では、ハロゲン化アシルと反応したか、または金属に結合したジスルフィドに変換され得る）、ヒドロキシル（これは、エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換され得る）、ヒドラジンおよびアルキン（これは、例えば、環化付加、アシル化、マイケル付加を受け得る）である。一部の実施形態では、反応性官能基は、カルボキシル基または、これらに限定されないが、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｔｒｉａｚｏｌｅ）エステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ－ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステルを含むその様々な誘導体である。一部の実施形態では、反応性官能基は、ディールス－アルダー反応に関与することが可能であるジエノフィル基、例えば、マレイミド基などである。一部の実施形態では、反応性官能基は、次の誘導体化が、例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンもしくはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介するか、またはグリニャール付加もしくはアルキルリチウム付加のような機序を介して可能であるような、アルデヒドまたはケトン基である。
他の実施形態では、反応性官能基は、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化アシル、アミン、アルキルまたはハロゲン化アリール、無水物、アジド、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホロアミド酸、チオール、ヒドロキシルおよびアルキンから選択される。さらに他の実施形態では、反応性官能基は、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、アミン、アジド、ハロアセトアミド、ヒドラジン、イソシアネート、マレイミドおよびアルキンから選択される。
ＰＮＡ配列
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、均一である、すなわち、単一のヌクレオチド型を含んでいる。他の実施形態では、ＰＮＡ配列は、不均一である、すなわち、複数のヌクレオチド型を含んでおり、ヌクレオチドは、ランダムにまたは繰り返し基内で組織化され得る。さらに他の実施形態では、ＰＮＡ配列は、キャリアーとしてのみ機能するのとは対照的に、特定の情報、例えば、バーコードをコードするように設計され得る。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、２から６０個の塩基を含む。他の実施形態では、ＰＮＡ配列は、２から５０個の塩基を含む。さらに他の実施形態では、ＰＮＡ配列は、２から４０個の塩基を含む。さらなる実施形態では、ＰＮＡ配列は、２から４０個の塩基を含む。さらにさらなる実施形態では、ＰＮＡ配列は、１から３０個の塩基を含む。さらなる実施形態では、ＰＮＡ配列は、１から２０個の塩基を含む。他の実施形態では、ＰＮＡ配列は、２０から４０個の塩基を含む。さらに他の実施形態では、ＰＮＡ配列は、２０から３０個の塩基を含む。さらに他の実施形態では、ＰＮＡ配列は、３０から４０個の塩基を含む。さらに他の実施形態では、ＰＮＡ配列は、５から２０個の塩基を含む。さらに他の実施形態では、ＰＮＡ配列は、５から１５個の塩基を含む。さらに他の実施形態では、ＰＮＡ配列は、８から１２個の塩基を含む。さらに他の実施形態では、ＰＮＡ配列は、１２から１８個の塩基を含む。さらなる実施形態では、ＰＮＡ配列は、約１０個の塩基を含む。さらなる実施形態では、ＰＮＡ配列は、約１５個の塩基を含む。さらなる実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも１０個の塩基を含む。さらなる実施形態では、ＰＮＡ配列は、少なくとも１５０個の塩基を含む。
一部の実施形態では、いずれかのＰＮＡ配列のうちの１つまたは複数のＰＮＡヌクレオチドは、ヌクレオチドのガンマ炭素上の部位で、独立して誘導体化されるかまたは置換される（例えば、図１６を参照されたい）。ガンマＰＮＡのＴｍ（ガンマ置換基を有さないＰＮＡと比較して）は、単一のヌクレオチド置換当たり約５℃から約８℃高く、より高い親和性でより多くの配列特異的結合をもたらすと考えられる。また、ガンマＰＮＡ（ガンマ置換基を有さないＰＮＡと比較して）は、溶解度の改善、自己凝集の低下、より安定したＰＮＡ－ＤＮＡ二本鎖形成、ならびに多重標識および他の機能化に関する柔軟性などのいくつかの利点をもたらし得ると考えられる。例えば、ガンマ置換基は、アミノ酸、例えば、リジン、アラニン、アルギニン、グルタミン酸などで誘導体化され得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の荷電性部分は、リジンまたはその誘導体である。他の実施形態では、１つまたは複数の荷電性部分は、ｌ－（Ｓ）－リジンである。さらに他の実施形態では、１つまたは複数の荷電性部分は、ｄ－（Ｒ）－リジンである。さらなる実施形態では、ガンマ置換基は、チアリジンで誘導体化され得る。一部の実施形態では、リジンの導入によって、化学的コンジュゲーションがさらに容易になる。
一部の実施形態では、いずれかのＰＮＡ配列のうちの１つまたは複数のＰＮＡヌクレオチド（本明細書に記載のものなど）は、ＰＮＡ塩基のガンマ炭素上の荷電性部位で、独立して誘導体化される。一部の実施形態では、荷電性部分のうちの１つまたは複数は、リジンである。一部の実施形態では、荷電性部分のうちの１つまたは複数は、ペプチド（例えば、２から２０個のアミノ酸を有するペプチド、２から１０個のアミノ酸を有するペプチド、２から８個のアミノ酸を有するペプチド、または１から５個のアミノ酸を有するペプチド）である。例えば、ペプチドは、リジン－グアニン－リジンまたはリジン－グアニン－グアニン－グアニン－リジンであってもよい。別の例として、ペプチドは、リジン－［Ｕ］ｑ－リジンであってもよく、ここで、Ｕは、アミノ酸を表し、ｑは、０または１から２０の範囲の整数である。ｑが１またはそれより多い例では、Ｕは、均一または不均一な短いペプチド配列、すなわち、同じかまたは異なるアミノ酸を含むものを表し得る。一部の実施形態では、Ｕは、リジン、アラニン、アルギニン、グアニン、グルタミン酸またはそれらの任意の組合せから選択される。
一部の実施形態では、いずれかのＰＮＡ配列のうちの１つまたは複数のＰＮＡヌクレオチドは、ガンマ位置において、ポリマーで独立して置換される。一部の実施形態では、ポリマーは、ＰＮＡ配列またはＰＮＡオリゴマーに対して親水性を少なくとも部分的に付与するものである。一部の実施形態では、１つまたは複数のＰＮＡヌクレオチドは、ＰＮＡ配列の少なくとも１つのガンマ炭素において、短鎖オリゴエチレン部分で独立して誘導体化される。
一部の実施形態では、いずれかのＰＮＡ配列のうちの１つまたは複数のＰＮＡヌクレオチドは、ガンマ炭素の位置において、「ｍｉｎｉＰＥＧ」で独立して置換される。本開示の文脈では、「ｍｉｎｉＰＥＧ」という用語は、単一のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）単位または２～５０個のＰＥＧモノマーを含むＰＥＧのポリマーを指す。一実施形態によれば、ｍｉｎｉＰＥＧという用語は、限定されないが、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）ｑ－Ｏ－Ｐ基を含み、ここで、下付き文字ｑは、１から５０の間の整数であり、Ｐは、Ｈ、（Ｃ１～Ｃ８）アルキル、（Ｃ２～Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２～Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３～Ｃ８）アリール、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３～Ｃ８）アリール（Ｃ１～Ｃ６）アルキレンおよび（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１～Ｃ６）アルキレンからなる群から選択される。ｍｉｎｉＰＥＧ単位の例としては、限定されないが、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）１～４５ＯＨ、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）１～４０ＯＨ、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）１～３５ＯＨ、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）１～３０ＯＨ、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）１～２５ＯＨ、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）１～２０ＯＨ、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）１～１５ＯＨ、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）１～１０ＯＨ、および－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）１～５ＯＨ基が挙げられる。
分類ｍｉｎＰＥＧのさらなる例は、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）１～４５Ｏ（Ｃ１～Ｃ８）アルキル、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）１～４０（Ｃ１～Ｃ８）アルキル、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）１～３５Ｏ（Ｃ１～Ｃ８）アルキル、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）１～３０Ｏ（Ｃ１～Ｃ８）アルキル、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）１～２５Ｏ（Ｃ１～Ｃ８）アルキル、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）１～２０Ｏ（Ｃ１～Ｃ８）アルキル、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）１～１５Ｏ（Ｃ１～Ｃ８）アルキル、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）１～１０Ｏ（Ｃ１～Ｃ８）アルキル、および－ＣＨ２－（ＯＣＨ２－ＣＨ２）１～５Ｏ（Ｃ１～Ｃ８）アルキル基である。
ガンマ置換されたＰＮＡ、およびそれらの合成方法の追加の例は、その開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／００９６８６７号に開示されている。
一部の実施形態では、ガンマ位置における置換基は、それに直接的または間接的にコンジュゲートした少なくとも１つのレポーター部分をさらに含む。一部の実施形態では、ガンマ位置は、レポーター部分で直接的に置換されていてもよい。他の実施形態では、ガンマ位置は、短いリンカー基を介するなど、レポーター部分で間接的に置換されていてもよい。例えば、ガンマ位置がリジン残基で置換されている場合、レポーター部分はリジン残基にコンジュゲートされ得る。
一部の実施形態では、ガンマ炭素の位置におけるいずれかの置換基は、１つより多いレポーター部分を含む。例としてのみであるが、ガンマ位置がｍｉｎｉＰＥＧ、ポリマー、またはペプチドで置換されている場合、したがって、複数のレポーター部分がｍｉｎｉＰＥＧ、ポリマー、またはペプチド置換基にコンジュゲートされていてもよい（例えば、図１７を参照されたい）。一部の実施形態では、複数のＰＮＡヌクレオチドはそれぞれ、ガンマ位置に置換基を有し、分岐したＰＮＡオリゴマーをもたらし、各分岐は、ｍｉｎｉＰＥＧ、ポリマー、または複数のレポーター部分を有するペプチドを含む。一部の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーのガンマ炭素は、別のＰＮＡ配列またはガンマＰＮＡ配列で置換されていてもよい。
ＰＮＡ配列の非限定的な例を以下に提供する。一実施形態では、ＰＮＡは、配列ＧＴＣＡＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧ（配列番号１）を有し得る。別の実施形態では、ＰＮＡは、配列ＴＴＡＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＣＡ（配列番号２）を有し得る。別の実施形態では、ＰＮＡは、配列ＣＡＴＴＣＡＡＡＴＣＣＣＣＧＡ（配列番号３）を有し得る。別の実施形態では、ＰＮＡは、配列ＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧ（配列番号４）を有し得る。別の実施形態では、ＰＮＡは、配列ＴＴＡＧＴＣＣＡＡＣ（配列番号５）を有し得る。別の実施形態では、ＰＮＡは、配列ＣＡＴＴＣＡＡＡＴＣ（配列番号６）を有し得る。別の実施形態では、ＰＮＡは、配列ＣＡＴＣＣＴＧＣＣＧ（配列番号７）を有し得る。ＰＮＡ塩基は、荷電性ではない（ＤＮＡ塩基のように）ことから、ＰＮＡは、ＤＮＡと比較して疎水性であると考えられる。ＰＮＡ疎水性は、そのＰＮＡ配列を作製する塩基の数に比例するとも考えられる。このように、ＰＮＡ配列がより多くの塩基を有するほど、疎水性はより高くなる。結果として、例えば、１５塩基のＰＮＡ配列は、１０塩基のＰＮＡ配列よりも疎水性である。疎水性ＰＮＡ配列は水溶液に容易に溶解しないため、それらは、抗体にコンジュゲートすることがより困難であるとも考えられる。さらに、抗体上の疎水性ＰＮＡ配列のコンジュゲーションは、組織上のコンジュゲートの非特異的結合として現れるコンジュゲートの誤挙動を引き起こす。ＰＮＡ配列の塩基数を低減させると（例えば、１０塩基から１５塩基から）、より高いＰＮＡ負荷およびより安定なコンジュゲートが得られる。
配列番号１から７のいずれかは、置換基がＰＮＡ塩基のいずれかのガンマ位置に存在するように、当業者によって修飾されていてもよい。当然のことながら、各ガンマ位置は、同じまたは異なる置換基で修飾されていてもよい（例えば、１つの塩基は、第１の分子量を有するｍｉｎｉＰＥＧで置換されていてもよく、一方、別の塩基は、第２の分子量を有する別のｍｉｎｉＰＥＧで置換されていてもよくまたは代わりにリジンで置換されていてもよい）。例として、本明細書に列挙されている配列のいずれかは、ガンマ位置に１つまたは複数の置換基、例えば、ＧＴ＊ＣＡＡ＊ＣＣＡ＊ＴＣＴ＊ＴＣＡ＊Ｇ（ここで、「＊」は、ガンマ炭素の位置に置換基を含むＰＮＡヌクレオチドを示す）を含んでもよい。別の例として、配列番号２は、ガンマ位置に１つまたは複数の置換基、例えば、ＴＴ＊ＡＧＴ＊ＣＣＡ＊ＡＣＴ＊ＧＧＣ＊Ａ（ここで、「＊」は、ガンマ炭素の位置に置換基を含むＰＮＡヌクレオチドを示す）を含んでもよい。さらに別の例として、配列番号２は、ガンマ位置に１つまたは複数の置換基、例えば、Ｔ＊ＴＡＧＴＣ＊ＣＡ＊ＡＣＴ＊ＧＧＣ＊Ａ（ここで、「＊」は、ガンマ炭素の位置に置換基を含むＰＮＡヌクレオチドを示す）を含んでもよい。当然のことながら、ガンマ置換基のいずれかは、１つまたは複数のレポーター部分を含んでもよい。
リンカー
一般に、ならびに式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、（ＩＩＣ）、および（ＩＩＩ）に関して上記したように、「リンカー」は、２から８０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基である。一般に、リンカーは、約１ｇ／ｍｏｌから約３０００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。他の実施形態では、リンカーは、約２０ｇ／ｍｏｌから約２００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。一部の実施形態では、リンカーは、約０．５ｎｍから約２０ｎｍの範囲の長さを有する。他の実施形態では、リンカーは、約１５ｎｍ未満の長さを有する。さらに他の実施形態では、リンカーは、約１０ｎｍ未満の長さを有する。
一部の実施形態では、「リンカー」は、式（ＩＶＡ）に示される構造を有する：
Figure 2023113642000015
［式中、ｄおよびｅは、それぞれ独立して、２から２０の範囲の整数であり；Ｑは、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；ＲａおよびＲｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌ、またはＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；ＲｃおよびＲｄは、独立して、ＣＨ３またはＨであり；ＡおよびＢは、独立して、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基である］。一部の実施形態では、ｄおよびｅは、２から６の範囲の整数である。一部の実施形態では、本明細書においてさらに詳細に記載されているように、ＡまたはＢの少なくとも一方は、切断可能な部分を含む。
一部の実施形態では、「リンカー」は、式（ＩＶＢ）に示される構造を有する：
Figure 2023113642000016
［式中、
ｄおよびｅは、それぞれ独立して、２から２０の範囲の整数であり；
Ｑは、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；
ＲｃおよびＲｄは、独立して、ＣＨ３またはＨであり；
ＡおよびＢは、独立して、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基である］。
一部の実施形態では、「リンカー」は、式（ＩＶＣ）に示される構造を有する：
Figure 2023113642000017
［式中、
ｄおよびｅは、それぞれ独立して、２から２０の範囲の整数であり；
ＡおよびＢは、独立して、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基である］。他の実施形態では、ｄおよびｅは、２から１５の範囲の整数である。他の実施形態では、ｄおよびｅは、２から１０の範囲の整数である。さらに他の実施形態では、ｄおよびｅは、２から６の範囲の整数である。
一部の実施形態では、「リンカー」は、ＰＮＡコンジュゲートの水溶性を高めるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基などの可溶化基を含む。一部の実施形態では、リンカーは、約２から約２４個のＰＥＧ基を含む。一部の実施形態では、リンカーは、約２から約１８個のＰＥＧ基を含む。他の実施形態では、リンカーは、約２から約１２個のＰＥＧ基を含む。さらに他の実施形態では、リンカーは、約２から約６個のＰＥＧ基を含む。さらに他の実施形態では、リンカーは４つのＰＥＧ基を含む。さらに他の実施形態では、リンカーは８個のＰＥＧ基を含む。さらに他の実施形態では、リンカーは１２個のＰＥＧ基を含む。さらに他の実施形態では、リンカーは１６個のＰＥＧ基を含む。さらに他の実施形態では、リンカーは２４個のＰＥＧ基を含む。いずれの特定の理論に拘束されることも望むものではないが、このようなアルキレンオキシドリンカーの導入は、ＰＮＡコンジュゲートの親水性を高めると考えられる。当業者は、リンカー内のアルキレンオキシドの繰り返し単位数が増加するにつれて、ＰＮＡコンジュゲートの親水性もまた増加し得ることを認識するであろう。本開示のある特定の開示された実施形態を実践するのに有用な追加のヘテロ二機能性ポリアルキレングリコールリンカーは、それぞれの開示がその全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００６／０２４６５４２号および同第２００９／００１８１３９８号に記載されている。
一部の実施形態では、基ＡおよびＢは、一群の特異的結合体または一群のＰＮＡ配列と結合を形成することが可能である部分を含む。一部の実施形態では、ＡまたはＢの一方または両方がカルボニル反応性基である。好適なカルボニル反応性基としては、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体、およびアミンが挙げられる。他の実施形態では、ＡまたはＢの一方または両方がアミン反応性基である。好適なアミン反応性基としては、ＮＨＳまたはスルホ－ＮＨＳなどの活性エステル、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、スルホニルクロリド、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、ハロゲン化アリール、イミドエステル、無水物などが挙げられる。さらなる実施形態では、ＡまたはＢの一方または両方がチオール反応性基である。好適なチオール反応性基としては、非重合性マイケルアクセプター、ハロアセチル基（ヨードアセチルなど）、ハロゲン化アルキル、ＳＰＤＰ（スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）、マレイミド、アジリジン、アクリロイル基、ビニルスルホン、ベンゾキノン、芳香族基が挙げられ、これらは、フルオロベンゼン基（テトラおよびペンタフルオロベンゼン基など）、ならびにピリジルジスルフィド基などのジスルフィド基およびエルマン試薬で活性化されたチオールなどの求核置換を受けることができる。「Ｔ」部分に関する他の好適な反応性基は上記される。
一部の実施形態では、Ａおよび／またはＢは、紫外線（ＵＶ）または可視光の光開裂性基を含む。例えば、約２００ｎｍから約４００ｎｍ（ＵＶ）または約４００ｎｍから約８００ｎｍ（可視）の波長を有する電磁放射線源に曝露されると切断され得る基を導入することができる。一部の実施形態では、ＵＶまたは可視光の光開裂性基は、アリールカルボニルメチル基（４－アセチル－２－ニトロベンジル、ジメチルフェナシル（ＤＭＰ）、２－（アルコキシメチル）－５－メチル－α－クロロアセトフェノン、２，５－ジメチルベンゾイルオキシラン、およびベンゾイン基：３’，５’－ジメトキシベンゾイン（ＤＭＢ）を含む）、Ｏ－ニトロベンジル基（１－（２－ニトロフェニル）エチル（ＮＰＥ）、１－（メトキシメチル）－２－ニトロベンゼン、４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジル（ＤＭＮＢ）；α－カルボキシニトロベンジル（α－ＣＮＢ）、１－（２－ニトロフェニル）エチルオキシカルボニルおよび２－ニトロ－２－フェネチル誘導体を含むｏ－ニトロ－２－フェネチルオキシカルボニル基、ならびに、アシル化５－ブロモ－７－ニトロインドリンなどのｏ－ニトロアニリドを含む）；クマリン－４－イルメチル基（７－メトキシクマリン誘導体を含む）；ならびにアリールメチル基（ｏ－ヒドロキシアリールメチル基を含む）からなる群から選択される。
他の実施形態では、Ａおよび／またはＢは近赤外光開裂性基を含む。一部の実施形態では、約７００ｎｍから約１０００ｎｍの波長を有する電磁放射線源に曝露されると切断され得る基を導入することができる。好適な近赤外光開裂性基としては、Ｃ４－ジアルキルアミンで置換されたヘプタメチンシアニンを含むシアニン基が挙げられる。いずれの特定の理論に拘束されることも望むものではないが、光開裂性リンカーの導入は、ＰＮＡ放出に対する空間的制御および最終的にはマーカー発現の定量的測定を可能にすると考えられる。
さらに他の実施形態では、Ａおよび／またはＢは、還元剤を含む異なる化学反応物によって、またはｐＨ誘発性の変化によって（例えば、７未満のｐＨでの基の切断）切断され得る化学的に切断可能な基を含む。好適な化学的に切断可能な基としては、ジスルフィド系基；ジアゾベンゼン基（ナトリウムジチオナイトに対して感受性の２－（２－アルコキシ－４－ヒドロキシ－フェニルアゾ）安息香酸スキャホールドを含む）；エステル結合系基（高ｐＨ）；および酸性感受性リンカー（ジアルコキシジフェニルシランリンカーまたはアシルヒドラゾンなど）が挙げられる。隣接ジオール切断可能リンカーは、「Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２０１３年１月；１２（１）：２３７～４４．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｍｃｐ．Ｍ１１２．０２１０１４．Ｅｐｕｂ ２０１２年１０月１日などに記載されているように、ＮａＩＯ４で切断することができる。さらなる実施形態では、Ａおよび／またはＢは、酵素的に切断可能なリンカーを含む。好適な酵素的に切断可能な基としては、トリプシン切断可能な基およびＶ８プロテアーゼ切断可能な基が挙げられる。
一部の実施形態では、多機能性リンカーは、直交的に保護および脱保護することができるものから選択され、当業者が一度に多機能性リンカーに特異的結合体またはＰＮＡ部分の一方をコンジュゲートさせ、それによって、望ましくない副反応または副産物を防止する。
標識
一部の実施形態では、Ｘは、ハプテン、フルオロフォア、色素原、酵素、リガンド、リン光剤もしくは化学発光剤、量子ドット、質量分析タグまたは他の任意の適切な実体から選択される。選択される標識の種類は、合成されるＰＮＡオリゴマーまたはＰＮＡコンジュゲート、および適切な特異的結合体へのコンジュゲーションの後のＰＮＡコンジュゲートの最終的な役割に応じて決まる。例えば、一部の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーが抗体にコンジュゲートされる場合に、標識を直接検出できるように、標識を選択することができる（例えば、フルオレセインまたはフルオレセインの誘導体もしくは類似体）。他の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーが抗体にコンジュゲートされる場合に、標識を間接的に検出することができるように、標識を選択することができる（例えば、ハプテンに特異的な二次抗体を使用することによるハプテン標識の検出、ここで、二次抗体は、検出可能な部分にコンジュゲートされている）。様々な目的に適した標識の選択の手引きは、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８７）に論じられている。
フルオロフォアは、クマリン、フルオレセイン（またはフルオレセインの誘導体および類似体）、ローダミン、レゾルフィン、ルミノフォアおよびシアニンを含むいくつかの一般的なケミカルクラスに属する。蛍光分子の追加の例は、Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ－Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲに見出すことができる。
標識が酵素を含む場合、発色部分、蛍光発生化合物、または発光化合物などの検出可能な基質（すなわち、酵素の基質）を、酵素と組み合わせて使用して、検出可能なシグナルを生成することができる（このような多種多様な化合物は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲから市販されている）。発色性化合物／基質の特定の例としては、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４－ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ファストレッド、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファストレッド、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’－アジノ－ジ－［３－エチルベンゾチアゾリンスルホン酸］（ＡＢＴＳ）、ｏ－ジアニシジン、４－クロロナフトール（４－ＣＮ）、ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－ガラクトピラノシド（Ｘ－Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＭＵ－Ｇａｌ）、ｐ－ニトロフェニル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－グルクロニド（Ｘ－Ｇｌｕｃ）、３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルーおよびテトラゾリウムバイオレットが挙げられる。
あるいは、酵素を金属組織学的検出スキームに使用することができる。金属組織学的検出法は、アルカリホスファターゼなどの酵素を、水溶性金属イオンおよび酵素の酸化還元不活性基質と組み合わせて使用することを含む。一部の実施形態では、基質は、酵素によって酸化還元活性剤へと変換され、酸化還元活性剤は、金属イオンを還元し、それによって検出可能な沈殿物を形成させる。（例えば、それらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、２００４年１２月２０日に出願された米国特許出願第１１／０１５，６４６号、ＰＣＴ公開第２００５／００３７７７号および米国特許出願公開第２００４／０２６５９２２号を参照されたい）。金属組織学的検出法は、やはり検出可能な沈殿物を形成するために、水溶性金属イオン、酸化剤および還元剤と共に、オキシドレダクターゼ酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）を使用することを含む。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６７０，１１３号を参照されたい）。
ハプテンの例は、本明細書に開示されている。ＰＮＡ配列を分析するために質量分析を使用する例は、「Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．１９９６年９月１５日；６８（１８）：３２８３～７頁に記載されている。
一部の実施形態では、Ｘは、ジニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ローダミン、またはそれらの組合せからなる群から選択される。他の実施形態では、Ｘは、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ロテノイド、クマリン、シクロリグナン、またはそれらの組合せからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、Ｘは、５－ニトロ－３－ピラゾールカルバミド、２－（３，４－ジメトキシフェニル）キノリン－４－カルボン酸）、３－ヒドロキシ－２－キノキサリンカルバミド、２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－５－カルバミド、および２－アセトアミド－４－メチル－５－チアゾールスルホンアミドからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、Ｘは、本明細書でさらに説明されるハプテン、クロモフォア、フルオロフォア、および酵素のいずれかから選択することができる（例えば、本明細書で「レポーター部分」として列挙されるものを参照されたい）。
他の好適な標識は、その開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１８／００２０１５に記載されている。例えば、好適な標識としては、互いに直接的または間接的に連結された少なくとも２つのクロモフォアを有する多色素コンジュゲートが挙げられる。
当然のことながら、一部の実施形態では、ＰＮＡコンジュゲートは、いかなる標識も含まない、すなわち、ＰＮＡコンジュゲートのＰＮＡオリゴマー部分は、ヌクレオチドで終端する。
ＰＮＡコンジュゲートの合成
ＰＮＡコンジュゲートは、当業者に公知であることが知られている任意の手段によって合成することができる。一部の実施形態では、ＰＮＡまたはガンマＰＮＡオリゴマー（例えば、リンカーまたはレポーター部分を含むもの）は、図１Ｂに示されているように、ＮＨＳエステル基を有する架橋剤（例えば、ＳＰＤＰ－ＰＥＧ８－ＮＨＳ）などのヘテロ二官能性架橋剤を介して特異的結合体に連結される。ヘテロ二官能性架橋剤の例としては、図１８に示されているＤＢＣＯ－ＰＥＧｎ－マレイミド、ＤＢＣＯ－ＰＥＧｎ－ＮＨＳ、Ｎ３－ＰＥＧｎ－ＮＨＳ、またはＮ３－ＰＥＧｎ－マレイミド（ｎは０～２０の範囲である）が含まれる。コンジュゲーションに適したＰＮＡ配列の非限定的な例には次のものが含まれる：
ＰＮＡ １：５’－ビオチン－ｏ－ＧＴＣＡＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧ－リジン（Ｃ６ＳＨ）－３’ （配列番号８）
ＰＮＡ ２：５’－ビオチン－ｏ－ＴＴＡＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＣＡ－Ｌｙｓ（Ｃ６ＳＨ）－３’（配列番号９）
ＰＮＡ ３：５’－ビオチン－ｏ－ＣＡＴＴＣＡＡＡＴＣＣＣＣＧＡ－ＰＬ－Ｌｙｓ（Ｃ６ＳＨ）－３’（配列番号１０）
ＰＮＡ ４：５’－ビオチン－ｏ－ＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＴＴＴＡＣ－Ｌｙｓ（Ｃ６ＳＨ）－３’（配列番号１１）
ＰＮＡ ５：５’－Ａｌｅｘａ４８８－ｏ－ＣＡＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＡＴＧ－Ｌｙｓ（Ｃ６ＳＨ）－３’（配列番号１２）
ＰＮＡ ６：５’－ビオチン－ｏ－ＧＴＣＡＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧ－Ａｒｇ－ｏ－Ｃｙｓ－３’（配列番号１３）
上記同定されたサイズのＰＮＡ配列は、それぞれ１５塩基を有しているが、当業者は、同様に官能化されたＰＮＡ配列が、例えば１０塩基など、任意の数の塩基を含むことができることを認識するであろう。例えば、ＰＮＡ配列は、ｓＰＮＡ４：ビオチン－ｏ－ＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧ－Ｌｙｓ（Ｃ６ＳＨ）であり得る。
一部の実施形態では、架橋剤のＮＨＳ側は、抗体のアミン基に結合してアミド結合を形成するために使用されるのに対し；架橋剤の（スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）（「ＳＰＤＰ」）側は、ＰＮＡ配列の３’末端（Ｃ末端）でスルフヒドリル基と反応してジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態では、ジスルフィド結合は、還元剤を用いて化学的に切断することができる。
本明細書に記載されているように、一部の実施形態では、切断されたＰＮＡ配列は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームを用いて検出および測定することができる。例えば、ＰＮＡ配列は、捕捉鎖を必要とせずに、ストレプトアビジン表面への直接的固定化を可能にするために、５’末端（Ｎ末端）にビオチンを含み得る（図１Ｂ）。この修飾は、レポーター鎖に直接ハイブリダイズさせ、さらにｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームによって分析される、はるかに短いＰＮＡ配列（約１５塩基）の使用を可能にすることが期待される。一部の実施形態では、約１５塩基を有するＰＮＡ配列は、検出中にレポーター配列に対して十分な結合親和性および特異性をもたらす。いずれの特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、１５－ｍｅｒのＰＮＡ－ＤＮＡ複合体のＴｍは、５０－ｍｅｒのＤＮＡ－ＤＮＡ複合体に類似していると考えられる。連結するのに好適なＰＮＡ配列の例を以下に提供する：
一部の実施形態では、光開裂性（ＰＣ）リンカーは、ＰＮＡの光誘発性の放出を可能にするために、ＰＮＡ配列と特異的結合体（例えば、抗体）との間に導入され得る（本明細書に定義されるＡまたはＢとして識別される基を参照されたい）。一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、光開裂性リンカーを用いて合成することができる：ビオチン－ｏ－ＣＡＴＴＣＡＡＡＴＣＣＣＣＧＡ－ＰＬ－Ｌｙｓ（Ｃ６ＳＨ）（配列番号１０）。光照射後に、ＰＮＡ配列を無傷で放出することができ、本明細書に記載の任意の技術を使用して測定することができる。あるいは、光開裂性二機能性リンカーを合成して（図１０）、ＰＮＡを抗体に連結するために使用することができる。
複数のＰＮＡオリゴマー（同じかまたは異なる配列を有する）は、異なるリンカーを介して抗体にコンジュゲートされ得る。このようなＰＮＡオリゴマーは、同じかまたは異なる切断可能な基を有し得る（例えば、ＰＮＡ配列は同じであってもよいが、切断可能な基を導入するリンカーは異なっていてもよい）。一部のＰＮＡオリゴマーは切断可能であってもよいが、他のものは切断可能ではない；または一部はある特定の条件下で切断可能であってもよいが、他のものは同じ条件下で切断可能ではない。
ＰＮＡコンジュゲートの合成中に、ＰＮＡ内に光開裂性リンカーを導入する手法は、より時間および費用対効果が高く、光開裂性リンカーがすべてのＰＮＡオリゴマー内に確実に導入されることから有利である。あるいは、光開裂性二機能性リンカーを合成して（図１０）、ＰＮＡ配列を抗体に連結するために使用することができる。この手法は、たとえＰＮＡが光開裂性であるように設計されなかったとしても、光開裂性二機能性リンカーを使用して任意のＰＮＡ配列を抗体に連結することができるため有利である。いずれの特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、この手法は、通常の（光開裂性ではない）および光開裂性抗体タグと同じＰＮＡ配列を使用することに関して、いくらかの柔軟性を提供することができる。一部の実施形態では、ジスルフィド結合は、合成された光開裂性ＰＮＡ内に依然として存在しており、光切断および化学的切断の両方を可能にする。一部の実施形態では、本明細書でさらに記載されているように、ビオチン部分もまた保持され、スライド上でのＳＡ－ＨＲＰおよびＤＡＢの検出を可能にする。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、図１８に示されているように、「クリックケミストリー」を使用して特異的結合部分および／またはリンカーに導入することができる。「クリック」反応を受けることが可能な反応性基（例えば、アジド）を有するＰＮＡ配列の非限定的な例を以下に提示する：
ＰＮＡ ７：５’－ビオチン－Ｏ－ＧＴＣＡＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧ－Ｌｙｓ（ｅｇ３－Ｎ３）－３’（配列番号１４）
当業者は、適切な反応基を含むＰＮＡ配列が、「クリック」反応を受けるように適切に官能化もされている別の分子と共にクリック付加物を形成することができることを認識するであろう。実際に、当業者は、一対のクリックコンジュゲートの一方のメンバーが、その一対のクリックコンジュゲートのもう一方のメンバーと反応し、それによって、共有結合を形成するために、一対のクリックコンジュゲートの２つのメンバーが、互いに反応することが可能な反応性官能基を有していなければならないことを認識するであろう。以下の表は、互いに反応して共有結合を形成する反応性官能基の異なる対を例示する。
Figure 2023113642000018
一部の実施形態では、抗体（例えば、一次または二次抗体）上に存在する基は、１つまたは複数のチオール基を有する抗体を提供するように、ジチオトレイトール（「ＤＴＴ」）の存在下で還元される。チオール基は、一対のクリックメンバーのうちの第１のメンバーと反応させることができ、第１のメンバーは、「クリックケミストリー」反応に関与することが可能な反応性官能基（例えば、ＤＢＣＯ基）を有する。一対のクリックコンジュゲートの第１のメンバーはまた、チオール化抗体と反応することが可能な第２の官能基（例えば、マレイミド）を含み得る。一対のクリックコンジュゲートの第１のメンバー上の第２の官能基は、クリック化学反応において反応することが不可能であるものである。図１８に示されているように、この工程により、「クリックケミストリー」連結に関与することが可能な第１の反応性官能基で抗体を官能化することが可能になる。次いで、「クリックケミストリー」反応に関与することが可能な第２の反応性官能基（例えば、アジド基）を含むＰＮＡ分子など、一対のクリックメンバーのうちの第２のメンバーが導入される。一対のクリックメンバーのうちの第２のメンバーはまた、標識またはレポーター部分を含み得る。図１８に示される実施形態では、ＰＮＡコンジュゲートが抗体に連結するように、ＤＢＣＯ基を有する抗体は、一対のクリックメンバーのうちの第２のメンバーのアジド基と連結することができる。この手順でコンジュゲートされたＰＮＡは、化学的に切断可能でも光開裂性でもない。
一部の実施形態では、ＰＮＡ配列は、「マレイミド」ケミストリーを使用して、特異的結合部分および／またはリンカーに導入することができる（図２０を参照されたい）。一部の実施形態では、この手順でコンジュゲートされたＰＮＡは、化学的に切断可能でも光開裂性でもない。
ＳＭＣＣ基を有するＰＮＡ配列の非限定的な例が以下に提示される：
ＰＮＡ ８：５’－ビオチン－Ｏ－ＧＴＣＡＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧ－Ｌｙｓ（ＳＭＣＣ）－３’（配列番号１５）
いずれの特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、クリックケミストリーまたはマレイミドケミストリーの使用は、より短いＰＮＡ配列、例えば、１０以下の塩基を有する配列の導入を可能にすると考えられる。
コンジュゲートの検出
一部の実施形態では、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のいずれかのコンジュゲートは、コンジュゲートの直接検出を容易にする標識を含み得る。例えば、コンジュゲートの標識がフルオロフォアまたはクロモフォアを含む場合、フルオロフォアまたはクロモフォアは、当業者に公知の方法に従って直接検出することができる。
他の実施形態では、特定の試薬を利用して、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のいずれかのコンジュゲートの検出を可能にし、したがって、組織試料中の標的の検出を可能にする。一部の実施形態では、本明細書でさらに記載されているように、コンジュゲートの特定の標識に特異的であるか、またはコンジュゲートのヌクレオチド配列（例えば、ＰＮＡ配列）に対して相補的である検出試薬が利用される。一部の実施形態では、検出試薬は、コンジュゲートの標識に特異的な二次抗体を含む、例えば、二次抗体は、標識（すなわち、本明細書における式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）における「Ｘ」）を含む抗標識抗体であってもよい。一部の実施形態では、二次抗体は、抗ハプテン抗体であり、標識は、ハプテンである。
一部の実施形態では、二次抗体または抗標識抗体は、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＣ）、（ＩＤ）、および（ＩＩ）のコンジュゲートの検出を達成するために「レポーター部分」にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、二次抗体のレポーター部分には、発色性、蛍光性、リン光性、および発光性の分子および材料、ある物質を別の物質に変換して検出可能な差異をもたらす（例えば、無色物質を着色物質に変換すること、もしくはその逆によって、または沈殿物の生成もしくは試料の濁度の増加によって）触媒（例えば、酵素）、追加の検出可能に標識された抗体コンジュゲートを使用する抗体－ハプテン結合相互作用を通して検出することができるハプテン、ならびに常磁性および磁性の分子または材料が含まれる。当然のことながら、レポーター部分は、それ自体、間接的に検出することもでき、例えば、レポーター部分がハプテンである場合には、当業者に知られているように、そのレポーター部分に特異的なさらに別の抗体をレポーター部分の検出に利用することができる。
一部の実施形態では、抗標識抗体は、ＤＡＢ；ＡＥＣ；ＣＮ；ＢＣＩＰ／ＮＢＴ；ファストレッド；ファストブルー；フクシン；ＮＢＴ；ＡＬＫ ＧＯＬＤ；カスケードブルーアセチルアジド；ダポキシルスルホン酸／カルボン酸スクシンイミジルエステル；ＤＹ－４０５；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５スクシンイミジルエステル；カスケードイエロースクシンイミジルエステル；ピリジルオキサゾールスクシンイミジルエステル（ＰｙＭＰＯ）；パシフィックブルースクシンイミジルエステル；ＤＹ－４１５；７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸スクシンイミジルエステル；ＤＹＱ－４２５；６－ＦＡＭホスホルアミダイト；ルシファーイエロー；ヨードアセトアミド；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０スクシンイミジルエステル；Ｄａｂｃｙｌスクシンイミジルエステル；ＮＢＤクロリド／フルオリド；ＱＳＹ ３５スクシンイミジルエステル；ＤＹ－４８５ＸＬ；Ｃｙ２スクシンイミジルエステル；ＤＹ－４９０；オレゴングリーン４８８カルボン酸スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８スクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３ Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＤＹ－４８０ＸＬ；ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ Ｃ５スクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ－Ｘスクシンイミジルエステル；ＤＹＱ－５０５；オレゴングリーン５１４カルボン酸スクシンイミジルエステル；ＤＹ－５１０ＸＬ；ＤＹ－４８１ＸＬ；６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＪＯＥ）；ＤＹ－５２０ＸＬ；ＤＹ－５２１ＸＬ；ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ Ｃ３スクシンイミジルエステル；エリスロシンイソチオシアネート；５－カルボキシ－２’，４’，５’，７’－テトラブロモスルホンフルオレセインスクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２スクシンイミジルエステル；６－カルボキシ－２’，４，４’，５’７，７’－ヘキサクロロフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＨＥＸ）；ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０ Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＤＹ－５３０；ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ－Ｘスクシンイミジルエステル；ＤＹ－５５５；ＤＹＱ－１；ＤＹ－５５６；Ｃｙ３スクシンイミジルエステル；ＤＹ－５４７；ＤＹ－５４９；ＤＹ－５５０；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６スクシンイミジルエステル；ＤＹ－５４８；ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８ Ｃ３スクシンイミジルエステル；ローダミンレッド－Ｘスクシンイミジルエステル；ＱＳＹ７スクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０ Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９ Ｃ３スクシンイミジルエステル；カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）；スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８スクシンイミジルエステル；ＤＹ－５９０；ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１ Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＤＹ－５９１；ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ－Ｘスクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４スクシンイミジルエステル；ＤＹ－５９４；カルボキシナフトフルオレセインスクシンイミジルエステル；ＤＹ－６０５；ＤＹ－６１０；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０スクシンイミジルエステル；ＤＹ－６１５；ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０－Ｘスクシンイミジルエステル；エリオグラシン；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５スクシンイミジルエステル，；ＤＹ－６３４；ＤＹ－６３０；ＤＹ－６３１；ＤＹ－６３２；ＤＹ－６３３；ＤＹＱ－２；ＤＹ－６３６；ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５－Ｘスクシンイミジルエステル；ＤＹ－６３５；Ｃｙ５スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７スクシンイミジルエステル；ＤＹ－６４７；ＤＹ－６４８；ＤＹ－６５０；ＤＹ－６５４；ＤＹ－６５２；ＤＹ－６４９；ＤＹ－６５１；ＤＹＱ－６６０；ＤＹＱ－６６１；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０スクシンイミジルエステル；Ｃｙ５．５スクシンイミジルエステル；ＤＹ－６７７；ＤＹ－６７５；ＤＹ－６７６；ＤＹ－６７８；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０スクシンイミジルエステル；ＤＹ－６７９；ＤＹ－６８０；ＤＹ－６８２；ＤＹ－６８１；ＤＹＱ－３；ＤＹＱ－７００；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００スクシンイミジルエステル；ＤＹ－７０３；ＤＹ－７０１；ＤＹ－７０４；ＤＹ－７００；ＤＹ－７３０；ＤＹ－７３１；ＤＹ－７３２；ＤＹ－７３４；ＤＹ－７５０；Ｃｙ７スクシンイミジルエステル；ＤＹ－７４９；ＤＹＱ－４；およびＣｙ７．５スクシンイミジルエステルからなる群から選択されるレポーター部分を含む。
フルオロフォアは、クマリン、フルオレセイン（またはフルオレセイン誘導体および類似体）、ローダミン、レゾルフィン、ルミノフォアおよびシアニンを含むいくつかの一般的なケミカルクラスに属する。蛍光分子の追加の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ－Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＴｈｅｒｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、第１１版に見出すことができる。他の実施形態では、フルオロフォアは、キサンテン誘導体、シアニン誘導体、スクアライン誘導体、ナフタレン誘導体、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体、アントラセン誘導体、ピレン誘導体、オキサジン誘導体、アクリジン誘導体、アリールメチン誘導体、およびテトラピロール誘導体から選択される。他の実施形態では、蛍光部分は、ＣＦ色素（Ｂｉｏｔｉｕｍから入手可能）、ＤＲＡＱおよびＣｙＴＲＡＫプローブ（ＢｉｏＳｔａｔｕｓから入手可能）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）、ＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ（例えば、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｅｒｃｅから入手可能）、ＡｔｔｏおよびＴｒａｃｙ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍから入手可能）、Ａｂｂｅｒｉｏｒ Ｄｙｅｓ（Ａｂｂｅｒｉｏｒから入手可能）、ＤＹおよびＭｅｇａＳｔｏｋｅｓ Ｄｙｅｓ（Ｄｙｏｍｉｃｓから入手可能）、Ｓｕｌｆｏ Ｃｙ染料（Ｃｙａｎｄｙｅから入手可能）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（ＡｎａＳｐｅｃから入手可能）、Ｓｅｔａ、ＳｅＴａｕおよびＳｑｕａｒｅ Ｄｙｅｓ（ＳＥＴＡ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓから入手可能）、ＱｕａｓａｒおよびＣａｌ Ｆｌｕｏｒ染料（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）、ＳｕｒｅＬｉｇｈｔ Ｄｙｅｓ（ＡＰＣから入手可能、ＲＰＥＰｅｒＣＰ、フィコビリソーム）（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＡＰＣ、ＡＰＣＸＬ、ＲＰＥ、ＢＰＥ（Ｐｈｙｃｏ－Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｒｅｅｎｓｅａ、Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｆｌｏｇｅｎから入手可能）から選択される。
他の実施形態では、抗標識抗体は、酵素にコンジュゲートしている。一部の実施形態では、好適な酵素としては、これらに限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼまたはβ－ラクタマーゼが挙げられる。他の実施形態では、酵素としては、オキシドレダクターゼまたはペルオキシダーゼ（例えば、ＨＲＰ、ＡＰ）が挙げられる。これらの実施形態では、抗標識抗体にコンジュゲートされた酵素は、標的に近位の試料または直接標的上にある試料に共有結合する反応性部分への発色基質の変換を触媒する。発色性化合物／基質の特定の非限定的な例としては、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４－ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ファストレッド、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファストレッド、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’－アジノ－ジ－［３－エチルベンゾチアゾリンスルホン酸］（ＡＢＴＳ）、ｏ－ジアニシジン、４－クロロナフトール（４－ＣＮ）、ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－ガラクトピラノシド（Ｘ－Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＭＵ－Ｇａｌ）、ｐ－ニトロフェニル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－グルクロニド（Ｘ－Ｇｌｕｃ）、３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー、テトラゾリウムバイオレット、Ｎ，Ｎ’－ビスカルボキシペンチル－５，５’－ジスルホナト－インド－ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、４－（ジメチルアミノ）アゾベンゼン－４’－スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯ Ｐｕｒｐｌｅ）およびローダミン１１０（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）が挙げられる。ペルオキシダーゼおよび過酸化水素の存在下で酸化されるＤＡＢは、酵素活性部位に褐色のアルコール不溶性沈殿物の沈着をもたらす。
一部の実施形態では、発色基質は、潜在的反応性部分および発色性部分を含むシグナル伝達コンジュゲートである。一部の実施形態では、シグナル伝達コンジュゲートの潜在的反応性部分は、触媒活性化を受けて、試料または他の検出成分と共有結合することができる反応性種を形成するように構成される。触媒活性化は、１つまたは複数の酵素（例えば、オキシドレダクターゼ酵素および西洋ワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ酵素）によって駆動され、反応性種の形成をもたらす。これらの反応性種は、それらの発生の近傍で、すなわち酵素の近くで、発色部分と反応することが可能である。シグナル伝達コンジュゲートの具体例は、その開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０２６０３７９号に開示されている。
標識がビオチンである実施形態では、ＰＮＡコンジュゲートを酵素（例えば、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）に連結したストレプトアビジンと接触させることができる。いずれの特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ストレプトアビジン－ＡＰまたはストレプトアビジン－ＨＲＰコンジュゲートは、ビオチンで標識したＰＮＡコンジュゲートに特異的および不可逆的に結合すると考えられる。次いで、ＰＮＡ－ビオチン－ストレプトアビジンコンジュゲートを、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼの発色基質（上記のものなど）を使用して可視化して、検出可能なシグナルを生成することができる。同様に、標識がビオチンである場合には、ＰＮＡコンジュゲートを、代替的に、フルオロフォア（例えば、ＦＴＩＣ）に連結したストレプトアビジンと接触させることができ、フルオロフォアについてのシグナルを検出することができる。
ＰＮＡタグが抗体コンジュゲートから切断される（本明細書中に記載の切断可能なリンカーを介して）実施形態では、コンジュゲートから切断されたＰＮＡ配列は、その開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる、「Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ． １９９６年９月１５日；６８（１８）：３２８３～７頁に記載の方法に従って検出され得る。同様に、ＰＮＡコンジュゲートのＰＮＡ配列は、当業者に公知の方法に従って、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）などの他の質量分析法によって同様に検出することができる。
相補的ＰＮＡまたはＤＮＡ配列を含む相補的ヌクレオチド配列を使用するコンジュゲートの検出
一部の実施形態では、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のコンジュゲートは、ＰＮＡ配列、ガンマＰＮＡ配列またはＤＮＡ配列のうちの１つをコンジュゲートのヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることによって検出することができ、ＰＮＡ配列またはＤＮＡ配列は、コンジュゲートのヌクレオチド配列に対して相補的である。例えば、ＰＮＡコンジュゲートのＰＮＡ配列に対して相補的なＰＮＡまたはＤＮＡ配列は、ＰＮＡコンジュゲートのＰＮＡ配列へのそのハイブリダイゼーション後に検出され得る。
一部の実施形態では、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のコンジュゲートは、標識を含まない。一部の実施形態では、コンジュゲートのヌクレオチド配列に対して相補的なＰＮＡまたはＤＮＡ配列は、本明細書に記載のものなどのレポーター部分を含む。一部の実施形態では、レポーター部分は、色素原である。他の実施形態では、レポーター部分は、フルオロフォアである（例えば、図８Ｅを参照されたい）。さらに他の実施形態では、レポーター部分は、ハプテン（例えば、図９Ｄにおけるようなジゴキシゲニン）である。さらなる実施形態では、レポーター部分は、酵素である。さらなる実施形態では、レポーター部分は、ナノ粒子（例えば、走査型電子撮像または量子ドットにおいて使用することができる金ナノ粒子）である。当然のことながら、ガンマＰＮＡ配列の場合には、本明細書に記載され、図１７に示されているように、複数のレポーター部分がコンジュゲート中に導入され得る。
当然のことながら、当業者は、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）の同じコンジュゲートを使用して、複数の画像モダリティを提供することができることを認識するであろう。例えば、蛍光標識された相補的ＤＮＡまたはＰＮＡ配列が提供される場合、それを蛍光イメージングに使用することができる。式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）の同じコンジュゲートを用いて、ハプテン化ＤＮＡまたはＰＮＡ配列もまた、効果的な発色イメージングに使用することができる。
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームを使用するコンジュゲートの検出および／または定量
一部の実施形態では、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のコンジュゲートは、分子「バーコード」として作用し得るヌクレオチド配列を有するオリゴマーを含む。例えば、２つのＰＮＡコンジュゲートは、類似するＰＮＡオリゴマー部分を含んでもよいが、ＰＮＡオリゴマー部分は、ＰＮＡ配列内のある特定の塩基が異なっていてもよい（例えば、１つのヌクレオチドの単一の変化でさえも）。このようにして、異なるＰＮＡ配列を有するＰＮＡコンジュゲートを、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームを使用することなどによって検出および／または定量化することができる。一部の実施形態では、ＰＮＡコンジュゲートは、ビオチン標識などのレポーター部分を含む。
一部の実施形態では、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のいずれかのコンジュゲートは、切断可能なリンカーを含む。式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のいずれかのコンジュゲートを試料に導入した後、化学試薬、酵素、および／または放射線（例えば、ＵＶ、ＩＲなど）を試料に導入して、切断可能なリンカーの基を切断し、それによって、コンジュゲートのヌクレオチド配列（例えば、ＰＮＡ－抗体配列またはガンマＰＮＡ配列）を放出する。これは、当然のことながら、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のいずれかの異なるコンジュゲートについて繰り返すことができる。すべてのヌクレオチド配列（例えば、ＰＮＡ配列またはガンマＰＮＡ配列）が放出されたら、それらは、本明細書に記載されるように検出および定量化され得る。当業者はまた、異なるコンジュゲートが、異なる切断可能なリンカーを含むことができ、よって、異なるヌクレオチド配列を異なる試薬／放射線の導入後の異なる時間に放出することができ、よって、段階的な検出および／または定量化が可能となることを認識するであろう。一部の実施形態では、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のいずれかのコンジュゲートは、ＰＮＡコンジュゲートである、すなわち、コンジュゲートは、ＰＮＡ配列またはガンマＰＮＡ配列を含むオリゴマーを含む。
例として、ＰＤ－Ｌ１およびＫｉ６７マーカーの両方が同じ組織切片上に存在する場合、抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＮＡ１コンジュゲートおよび抗Ｋｉ６７ ＰＮＡ２コンジュゲートを使用して、組織切片を染色することができる。ＰＮＡ１およびＰＮＡ２オリゴマー部分は、２つの異なるＰＮＡ配列を含んでもよいが、それでもなお両方は、本明細書に記載されているように、コンジュゲート内の切断可能な部分によって、化学的に切断可能である。組織を２つのコンジュゲート抗体と共にインキュベートし、注意深くすすいで、未結合のＰＮＡコンジュゲート抗体を除去した後に、２つの異なるＰＮＡがコンジュゲートから切断される。２つの異なるＰＮＡは、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でカウントされ、切断されたＰＮＡの数を決定することができる。ＰＮＡ１とＰＮＡ２の数の間の差は、ＰＤ－Ｌ１とＫｉ６７マーカーのタンパク質発現レベルの差を反映する。
これらの実施形態では、検出スキームがレポーター鎖の標的オリゴマー（ＤＮＡまたはＰＮＡであり得る）へのハイブリダイゼーションに基づくことから、ＰＮＡコンジュゲートのＰＮＡ配列は、ＤＮＡと同様の方法で検出および／または定量化され得る。しかしながら、ＰＮＡコンジュゲートは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームによって典型的に検出される標準的なＤＮＡ標的（約７０～１００塩基長である）よりも短い。しかしながら、ＰＮＡの３’末端上のビオチンの存在によって、捕捉鎖を使用する必要性が排除される。さらに、ＤＮＡ対ＤＮＡと比較して、ＰＮＡ対ＤＮＡのより高い結合親和性は、比較的短いＰＮＡ／ＤＮＡレポーター二本鎖に対して十分な安定性をもたらす。ＰＮＡ配列は、ＰＮＡ配列に対する相補体となるように設計されているレポーター鎖と混合される。未結合のＰＮＡを除去した後、ＰＮＡ／レポーター構築物をストレプトアビジン被覆カートリッジ上でインキュベートし、次いで、電場を使用して整列させる。ｎＣｏｕｎｔｅｒは、レポーター鎖の読み取りおよびカウントに使用されることになる。同じ手順を、複数のＰＮＡ配列についても行うことができる。
Ｇｙｒｏｓを使用するコンジュゲートの検出および／または定量化
Ｇｙｒｏｓは、並行処理およびレーザー誘起蛍光検出を用いるアフィニティーフロースルーフォーマットを使用したイムノアッセイプラットフォームである。アッセイは、液体の送達および移動のための遠心力および毛管作用を使用する、１００ナノリットルを超えるスケールのチャネルを含有するコンパクトディスク（ＣＤ）中で行われる。
典型的な非限定的実験では、ビオチン化エピトープペプチドを、ストレプトアビジン被覆ビーズからなる１５ｎＬのアフィニティーキャプチャーカラムに最初に結合させる。すすいだ後に、エピトープペプチドに特異的な一次抗体は、カラム内を流れ、ペプチドに結合する。次いで、蛍光色素（例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７）で標識された二次抗体は、一次抗体に結合し、次いで、これを、レーザー誘起蛍光を使用して検出および定量化する。本開示のオリゴマーの検出のために、ビオチン化ＰＮＡオリゴマー（図３Ｄを参照されたい）は、レポーター部分（例えば、ジゴキシゲニンを含むがこれに限定されないハプテン）にコンジュゲートした相補的一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズされる。ハイブリダイズした核酸鎖中のビオチンは、Ｇｙｒｏｓ ＣＤ内のストレプトアビジン被覆ビーズに結合する。次いで、ハイブリッドの他方の端にあるＤＩＧ標識は、Ｍｓ－抗ＤＩＧ抗体、その後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７で標識されたヤギ抗マウス抗体（ＧＡＭ）によって検出され、これは、元のオリゴマーの定量的測定を容易にする。定量化にＧｙｒｏｓ技術を使用する原理が図３２に示されている。Ｇｙｒｏｓ技術デバイスおよびその使用方法に関する追加情報は、その開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，１３３，４３８号および同第８，５９２，２１９号に記載されている。Ｇｙｒｏｓ技術デバイスおよびその使用方法に関する追加情報は、その開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／０１１６９７２号、同第２０１１／０１９５５２４号、および同第２００７／０２４１０６１号にも記載されている。
式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）の任意のコンジュゲートは、コンジュゲートが切断可能なリンカー（例えば、ジスルフィド基を含むリンカー）を含むことを条件に、Ｇｙｒｏｓプラットフォームを使用する定量化に使用することができる。試料への式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のいずれかのコンジュゲートの導入後に、化学試薬、酵素、および／または放射線が試料に導入されて、切断可能なリンカーの基を切断し、それによって、コンジュゲートのヌクレオチド配列（例えば、ＰＮＡ配列またはガンマＰＮＡ配列）を放出する。次いで、定量化は上記のように進行し得る。
一部の実施形態では、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のいずれかのコンジュゲートは、ＰＮＡコンジュゲートである、すなわち、コンジュゲートは、ＰＮＡ配列またはガンマＰＮＡ配列を含むオリゴマーを含み、ＰＮＡコンジュゲートは、本明細書に記載されているように、ＰＮＡオリゴマーにコンジュゲートしている一次抗体を含む。一部の実施形態では、導入された一本鎖ＤＮＡは、ＰＮＡコンジュゲートのＰＮＡ配列に対して相補的であり、ＰＮＡ配列とハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態では、相補的一本鎖ＤＮＡ配列は、レポーター部分にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、相補的一本鎖ＤＮＡ配列は、ハプテンにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、相補的一本鎖ＤＮＡ配列は、ジゴキシゲニンにコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、複数の異なるＰＮＡコンジュゲートを同時にまたは逐次的に導入することができる。当業者はまた、異なるＰＮＡコンジュゲートが異なる切断可能な部分を含んでもよく、よって、異なるＰＮＡ配列が異なる試薬／放射線の導入後に異なる時間で放出されてもよく、よって、段階的な定量化を可能にすることも認識するであろう。
一部の実施形態では、Ｇｙｒｏｓプラットフォームを用いた定量化の後に、組織は、当技術分野で一般的に使用されている方法に従って染色される。例えば、ＰＮＡコンジュゲートからのＰＮＡ配列またはガンマＰＮＡ配列の切断後、ＰＮＡコンジュゲートが結合した組織は、図３３に示されているように、レポーター部分を含む抗一次抗体を導入することによって染色することができる。このように、定量化は、生物学的試料中の標的の可視化と組み合わせることができる。
ＰＮＡコンジュゲートを含む検出キットおよびＰＮＡコンジュゲートを検出するための検出試薬
一部の実施形態では、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のコンジュゲートは、「検出キット」の一部として利用することができる。一般に、任意の検出キットは、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）の１つまたは複数のコンジュゲート、および１つまたは複数のコンジュゲートを検出するための検出試薬を含み得る。
一部の実施形態では、検出キットは、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のいずれかのコンジュゲートを含む第１の組成物と、コンジュゲートが検出キットを介して検出され得るような、第１の組成物に特異的な検出試薬を含む第２の組成物とを含み得る。一部の実施形態では、検出キットは、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）の複数のコンジュゲート（例えば、緩衝液中で一緒に混合されるもの、または個々の輸送コンテナまたは区画に提供されるもの）を含み、ここで、検出キットは、複数のコンジュゲートのそれぞれに特異的な検出試薬も含む。
例として、キットは、第１の標的に特異的な第１のＰＮＡコンジュゲート、第１のＰＮＡオリゴマー部分を有するＰＮＡコンジュゲート、および第２のＰＮＡオリゴマー部分を有する第２の標的に特異的な第２のＰＮＡコンジュゲートを含むことができ、ここで、第１および第２のＰＮＡオリゴマーの少なくとも一部は異なっている。キットは、異なるＰＮＡコンジュゲートのそれぞれに特異的な検出試薬をさらに含んでもよい。
別の例として、キットは、第１のＰＮＡオリゴマー部分を有する第１のＰＮＡコンジュゲート（および標識を含まないもの）を含むことができ、キットは、第１のＰＮＡオリゴマー部分のＰＮＡ配列に対して相補的なＰＮＡまたはＤＮＡ配列をさらに含むことができる。
さらに別の例として、キットは、一連の異なるＰＮＡコンジュゲートを含むことができ、各ＰＮＡコンジュゲートは、異なる標的に特異的であり、異なるＰＮＡオリゴマー部分を有する。キットのそれぞれ異なるＰＮＡコンジュゲートは、定性的および／または定量的分析に使用することができる、異なる分子「バーコード」としての役割を果たすことができる。
当然のことながら、いずれのキットも、手動または自動の標的検出に必要な場合には、緩衝液；対比染色剤；酵素不活性化組成物；脱パラフィン溶液；などを含む他の薬剤を含んでもよい。検出キットはまた、他の特異的結合体（例えば、ＩＳＨ用の核酸プローブ；未修飾（天然）抗体、および抗体コンジュゲート）ならびにそれらの他の特異的結合体を検出するための検出試薬を含み得る。例えば、キットは、１つまたは複数のＰＮＡコンジュゲート；１つまたは複数のＰＮＡコンジュゲートを検出するための１つまたは複数の抗標識抗体；少なくとも１つの未修飾抗体（すなわち、ＰＮＡ配列に連結していない天然の抗体）；および、少なくとも１つの未修飾抗体を検出するための検出試薬を含むことができる。一部の実施形態では、例えば、ＭＩＨＣアッセイなどのアッセイで使用するための、ＰＮＡコンジュゲートおよびキットの他の構成要素を使用するための説明書が提供される。
式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のいずれかのコンジュゲートを用いた標的の検出方法ならびに検出試薬
本開示はまた、本明細書に記載の式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のコンジュゲートのいずれかを使用して、組織試料内の１つまたは複数の標的を検出する方法を提供する。一部の実施形態では、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のいずれかのコンジュゲートをシンプレックスアッセイに使用して、組織試料内の特定の標的を直接的または間接的に検出することができる（例えば、ＣＤ６８、Ｋｉ６７、ＣＤ２０など）。
一部の実施形態では、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のいずれかのコンジュゲートは、一次抗体（例えば、ＣＤ６８、Ｋｉ６７、ＣＤ２０などに特異的な抗体）を含む。これらの実施形態では、一次抗体を含むコンジュゲートを使用して、標的をコンジュゲートで直接「標識」することができる。他の実施形態では、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のいずれかのコンジュゲートは、二次抗体を含む。これらの実施形態では、本明細書でより詳細に論じるように、標的（例えば、タンパク質標的または核酸標的）は、一次抗体（ＩＨＣ用）または核酸コンジュゲート（例えば、ＩＳＨでは、ハプテンに連結した核酸配列）で標識することができ、次いで、一次抗体または核酸コンジュゲートを、二次抗体を含むコンジュゲートで「標識化」してもよい。これらおよび他の実施形態は本明細書でさらに説明される。
一部の実施形態では、ＰＮＡコンジュゲートは、ＰＮＡ－一次抗体コンジュゲートが目的の標的に特異的である場合、および組織試料へのＰＮＡ－一次抗体コンジュゲートの適用の際に、標的－ＰＮＡ－一次抗体コンジュゲート複合体が形成される場合には、一次抗体を含む（例えば、図２２Ａ～２２Ｄ、および図２６を参照されたい）。ＰＮＡ－一次抗体コンジュゲートの適用に続いて、標的－ＰＮＡ－一次抗体コンジュゲート複合体を検出することができるように、検出試薬（例えば、抗標識抗体）をその後に適用することができる。一部の実施形態では、検出試薬は、ＰＮＡ－一次抗体コンジュゲートの特定の標識に特異的な抗標識抗体を含み、ここで、抗標識抗体は、レポーター部分を含む。次いで、単一の標的を可視化するかまたは他の方法で検出することができる。
他の実施形態では、組織試料を、最初に、一次抗体または核酸プローブと接触させて、標的－一次抗体複合体または標的－核酸プローブ複合体のいずれかを形成する。次に、二次抗体を含むＰＮＡコンジュゲートが組織試料に導入され、ＰＮＡコンジュゲートの二次抗体部分は、（ｉ）一次抗体、（ｉｉ）一次抗体にコンジュゲートした標識、または（ｉｉｉ）核酸プローブにコンジュゲートした標識のいずれかに特異的である。ＰＮＡ－二次抗体コンジュゲートの適用は、二次複合体の形成を可能にし、標的を「標識化」可能にする。ＰＮＡ－二次抗体コンジュゲートの適用および二次複合体の形成の後に、二次複合体を検出することができるように、検出試薬（例えば、抗標識抗体）を適用することができる。一部の実施形態では、検出試薬は、ＰＮＡ－二次抗体コンジュゲートの特定の標識に特異的な抗標識抗体を含み、ここで、抗標識抗体は、レポーター部分を含む。次いで、標的を可視化するか、または他の方法で検出することができる。
さらに他の実施形態では、組織試料を、最初に、ＰＮＡ－一次抗体コンジュゲートと接触させる；または、最初に、一次抗体と接触させ、その後、ＰＮＡ－二次抗体コンジュゲートを導入する。それぞれのＰＮＡコンジュゲートの導入後に、試料を、ＰＮＡコンジュゲートのＰＮＡ配列に対して相補的なＤＮＡまたはＰＮＡ配列と接触させることができ、相補的ＤＮＡまたはＰＮＡ配列は、１つまたは複数のレポーター部分（例えば、色素原、フルオロフォア、酵素、またはハプテン）を含む。相補的ＤＮＡまたはＰＮＡ配列が色素原またはフルオロフォアを含む実施形態では、「標識された」標的複合体は直接検出することができる。他方では、相補的ＤＮＡまたはＰＮＡ配列がハプテンを含む場合、「標識された」標的複合体の最終的な検出を容易にするために、レポーター部分にコンジュゲートした抗ハプテン抗体を導入しなければならない。
当然のことながら、代替的な実施形態として、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のいずれかのコンジュゲートのＤＮＡまたはＰＮＡ配列は、コンジュゲートからのＤＮＡまたはＰＮＡ配列の切断後に、本明細書に記載のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ法またはＧｙｒｏｓ技術などを用いて定量することができる。一部の実施形態では、コンジュゲートは、切断可能な基とビオチン標識とを含む。これらの方法は、さらなる検出試薬のいずれの使用も必要としないであろう。
本開示の一部の態様では、自動多重検出を含む多重検出の方法が提供される。図１４Ａは、標的の多重検出のための一方法を示すフローチャートを提供し、ここで、組織試料を複数のＰＮＡコンジュゲートと同時に接触させ（工程１００）、各ＰＮＡコンジュゲートは特定の標的に特異的であり、各ＰＮＡコンジュゲートは異なるＰＮＡオリゴマー（すなわち、異なるＰＮＡ配列および／または異なる標識を有するＰＮＡオリゴマー）を含む。図１４Ａは、ＰＮＡコンジュゲートの適用を示しているが、当業者は、ＰＮＡコンジュゲートが、試料内の標的（例えば、一次抗体ＰＮＡコンジュゲートによって認識される核酸配列、タンパク質標的、または二次抗体ＰＮＡコンジュゲートによって認識される事前に沈着した一次抗体）に応じて、ＰＮＡ－核酸コンジュゲート、ＰＮＡ－一次抗体コンジュゲート、およびＰＮＡ－二次抗体コンジュゲートを含み得ることを理解するであろう。当然のことながら、任意のＰＮＡコンジュゲートは、本明細書に記載されている任意の数のヌクレオチドを有するＰＮＡ配列を有し得る。同様に、任意のＰＮＡコンジュゲートは、ガンマ位置に置換基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むＰＮＡ配列、すなわち、ガンマＰＮＡを有し得る。
一部の実施形態では、試料を２つのＰＮＡコンジュゲートと接触させることができ、ここで、各ＰＮＡコンジュゲートは、特定の標的に特異的であり、各ＰＮＡコンジュゲートは異なるＰＮＡオリゴマー部分を含む。他の実施形態では、試料を３つのＰＮＡコンジュゲートと接触させることができ、ここで、各ＰＮＡコンジュゲートは、特定の標的に特異的であり、各ＰＮＡコンジュゲートは異なるＰＮＡオリゴマー部分を含む。
ＰＮＡコンジュゲートは、特定のアッセイに必要なＰＮＡコンジュゲートのそれぞれを含む「プール」または「カクテル」として組織試料に供給することができる。ＰＮＡコンジュゲートは、少なくとも、いずれの交差反応性も染色性能を妨げない程度まで、互いに交差反応性ではないと考えられるため、ＰＮＡコンジュゲートのプールは可能であると考えられる。各ＰＮＡコンジュゲートは、それぞれの標的に結合し、検出可能な標的－ＰＮＡコンジュゲート複合体を形成することになる。一部の実施形態では、ＰＮＡコンジュゲートの適用後に、ブロッキング工程が行われる。
ＰＮＡコンジュゲートの同時適用（工程１００）の後に、複数の検出試薬が組織試料に同時に適用され（工程１１０）、ここで、各検出試薬は、最初に適用されたＰＮＡコンジュゲート（工程１００）の１つの検出を容易にし、各検出試薬は、異なるレポーター部分を含む。一部の実施形態では、検出試薬は、フルオロフォア、クロモフォア、またはハプテンにコンジュゲートしたストレプトアビジンである。他の実施形態では、検出試薬は、ＰＮＡコンジュゲートの標識に特異的な二次抗体（例えば、ＰＮＡコンジュゲートのハプテンに特異的な抗ハプテン抗体）である。さらに他の実施形態では、検出試薬は、ＰＮＡコンジュゲートのＰＮＡオリゴマー部分のＰＮＡ配列に対して相補的なＤＮＡまたはＰＮＡ配列である。抗標識抗体が用いられる実施形態では、抗標識抗体は、標的－ＰＮＡコンジュゲート複合体の検出に必要な抗標識抗体のそれぞれを含むプールまたはカクテルとして、組織試料に供給され得る。検出試薬の適用の後に、一部の実施形態では、組織試料を対比染色で染色することができる。標識および／またはレポーター部分のそれぞれからのシグナルは、視覚化することができ、あるいは他の方法で検出することができる（例えば、同時に可視化または検出される）。
ＰＮＡコンジュゲートを利用する多重アッセイの一例は次の通りである。第１のＰＮＡオリゴマーを含み、第１の標的に特異的（例えば、ＣＤ６８、Ｋｉ６７、ＣＤ２０などのうちの１つに特異的）である、第１のＰＮＡ－抗体コンジュゲートを組織試料に導入する。一部の実施形態では、第１のＰＮＡ－抗体コンジュゲートは、検出可能な第１の標的－ＰＮＡ－抗体コンジュゲート複合体を形成する。同時に、第２のＰＮＡオリゴマーを含み、第２の標的（例えば、ＣＤ６８、Ｋｉ６７、ＣＤ２０などの別のもの）に特異的な第２のＰＮＡ－抗体コンジュゲートを試料に導入して、第２の標的－ＰＮＡ－抗体コンジュゲート複合体を形成する。他の標的に対する、異なるＰＮＡ配列および／または標識を有する、第３、第４、および第ｎの追加のＰＮＡ－抗体コンジュゲート（「ｎ」個の標的－検出プローブ複合体を形成する）をさらに、第１および第２のＰＮＡ－抗体コンジュゲートと同時に導入することができる。
ＰＮＡ－抗体コンジュゲートの沈着後に、当然のことながら、それらを、それらの構成に応じて直接的または間接的に検出することができる。一部の実施形態では、標的－ＰＮＡ－抗体コンジュゲート複合体のそれぞれの検出を可能にするために、抗標識抗体が導入される。一部の実施形態では、抗標識抗体は、ＰＮＡコンジュゲートの異なる標識に特異的であり、抗標識抗体は、異なるレポーター部分にそれぞれコンジュゲートしている。一部の実施形態では、検出可能な試薬は、それぞれがフルオロフォアにコンジュゲートしている抗標識抗体である。一部の実施形態では、第１、第２、および第ｎの抗標識抗体は同時に導入され、ここで、第１、第２、および第ｎの検出試薬のそれぞれは、異なるＰＮＡ－抗体コンジュゲートに特異的であり、各抗標識抗体はフルオロフォアにコンジュゲートしている。他の実施形態では、第１、第２、および第ｎの抗標識抗体は逐次的に導入され、第１、第２、および第ｎの検出試薬のそれぞれは、異なるＰＮＡ－抗体コンジュゲートに特異的であり、各抗標識抗体は酵素にコンジュゲートしている。
あるいは、ＰＮＡ－抗体コンジュゲートは、導入されたＰＮＡコンジュゲートのＰＮＡオリゴマー部分のＰＮＡ配列に対して相補的なＰＮＡまたはＤＮＡ配列を導入することによって検出され得る。各相補的ＰＮＡまたはＤＮＡ配列は、酵素、フルオロフォア、ハプテン、またはナノ粒子を含む、本明細書に詳述されるレポーター部分を含み得る。相補的ＰＮＡまたはＤＮＡ配列がハプテンを含む場合、相補的ＰＮＡまたはＤＮＡ配列、よって、試料内の標的の検出を容易にするために、追加の検出試薬（例えば、酵素またはフルオロフォアにコンジュゲートした抗ハプテン抗体）を導入することができる。
本開示による多重アッセイのさらなる例として、第１の標的に特異的な、第１の標識を有する第１のＰＮＡ－抗体コンジュゲート（例えば、ＣＤ３、Ｋｉ６７、ＰＤ－Ｌ１、または免疫細胞マーカー）が、組織試料に導入される。一部の実施形態では、第１のＰＮＡ－抗体コンジュゲートは、検出可能な第１の標的－ＰＮＡ－抗体コンジュゲート複合体を形成する。同時にまたは次に、第２の標的に特異的な、第２の標識を有する第２のＰＮＡ－抗体コンジュゲート（例えばＣＤ３、Ｋｉ６７、ＰＤ－Ｌ１の別のもの）を試料に導入して、第２の標的－ＰＮＡ－抗体コンジュゲート複合体を形成する。他の標的に対してそれぞれ特異的な第３、第４、および第ｎの追加のＰＮＡ－抗体コンジュゲート（「ｎ」個の標的－ＰＮＡ－抗体コンジュゲート複合体を形成する）を、逐次的にまたは第１および／または第２のＰＮＡ－抗体コンジュゲートと同時に、さらに導入することができ、ここで、第３、第４および第ｎのＰＮＡ－抗体コンジュゲートはそれぞれ、さらに異なる標識を有している。ＰＮＡ－抗体コンジュゲートの沈着後に、それらを検出することができる。一部の実施形態では、標的の検出を可能にするために追加の検出試薬が導入され、追加の検出試薬には、本明細書に記載のもの（例えば発色検出試薬）が含まれる。一部の実施形態では、第１、第２、および第ｎの検出試薬が逐次的に導入され、ここで、第１、第２、および第ｎの検出試薬のそれぞれは、（ｉ）ＰＮＡ－抗体コンジュゲートの標識のそれぞれに特異的な二次抗体、すなわち抗標識抗体であって、二次抗体が酵素にコンジュゲートしている、二次抗体；および、（ｉｉ）発色基質であって、第１、第２、および第ｎの発色基質のそれぞれは異なっている発色基質を含む。他の実施形態では、第１、第２、および第ｎの検出試薬は逐次的に導入され、ここで、第１、第２、および第ｎの検出試薬のそれぞれが、ＰＮＡコンジュゲートのそれぞれのＰＮＡオリゴマー部分のＰＮＡ配列に対して相補的なＰＮＡまたはＤＮＡ配列を含み、各相補的ＰＮＡまたはＤＮＡ配列はレポーター部分を含む。
本開示による多重アッセイのさらなる例として、第１の標的に特異的な第１の一次抗体（例えば、ＣＤ３、Ｋｉ６７、ＰＤ－Ｌ１、または免疫細胞マーカー）が組織試料に導入される（第１の一次抗体は、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＣ）、（ＩＤ）、および（ＩＩ）のいずれのコンジュゲートでもない）。次に、第１の一次抗体にコンジュゲートしている第１の一次抗体または標識に特異的な第１の二次抗体－ＰＮＡコンジュゲートが導入され、第１の二次抗体－ＰＮＡコンジュゲートは、第１のＰＮＡ配列を有する第１のＰＮＡオリゴマーを含む。一部の実施形態では、第１の二次抗体－ＰＮＡ－抗体コンジュゲートは、検出可能な第１の標的－二次抗体－ＰＮＡ－抗体コンジュゲート複合体を形成する。次に、二次抗体－ＰＮＡコンジュゲートの第１のＰＮＡ配列は、コンジュゲートから切断される。
次に、第２の標的に特異的な第２の一次抗体（例えば、ＣＤ３、Ｋｉ６７、ＰＤ－Ｌ１の別のもの）が試料に導入される。次に、第２の一次抗体にコンジュゲートしている第２の一次抗体または標識に特異的な第２の二次抗体－ＰＮＡコンジュゲートが導入され、第２の二次抗体－ＰＮＡコンジュゲートは、第２のＰＮＡ配列を有する第２のＰＮＡオリゴマーを含む。一部の実施形態では、第２の二次抗体－ＰＮＡ－抗体コンジュゲートは、検出可能な第２の標的－二次抗体－ＰＮＡ－抗体コンジュゲート複合体を形成する。次に、二次抗体－ＰＮＡコンジュゲートの第２のＰＮＡ配列は、コンジュゲートから切断される。当業者は、任意の数の一次抗体および二次抗体ＰＮＡコンジュゲートを逐次的に導入し、その後、それぞれの二次抗体－ＰＮＡコンジュゲートのＰＮＡオリゴマーからＰＮＡ配列を切断することができることを認識するであろう。最後に、異なるＰＮＡ配列のすべてを測定することができ、標的を定量することができる。
さらに他の実施形態では、多重検出法は、次の工程を含む（ｉ）生物学的試料を第１のＰＮＡ－抗体コンジュゲートと接触させて、第１の標的抗体－ＰＮＡコンジュゲート複合体を形成すること；（ｉｉ）生物学的試料を第１の標識コンジュゲートと接触させることであって、第１の標識コンジュゲートが第１の酵素を含む（ここで、第１の標識コンジュゲートは、第１のＰＮＡ－抗体コンジュゲートに特異的に結合する抗標識抗体であり、標的を酵素で標識するように構成される）、接触させること；（ｉｉｉ）生物学的試料を、第１の潜在的反応性部分および第１の発色性部分を含む第１のシグナル伝達コンジュゲートと接触させること（例えば、その開示がシグナル伝達コンジュゲートおよびそれらの構成成分の説明のために、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／８４９，１６０号を参照されたい）；（ｉｖ）生物学的試料に含有される第１の酵素を実質的に不活性化または完全に不活性化するために、試料を第１の酵素不活性化組成物と接触させることなどによる、第１の酵素を不活性化すること。
第１の酵素が不活性化された後（任意選択的）、多重方法は、以下の工程をさらに含む（ｖ）生物学的試料を第２のＰＮＡ－抗体コンジュゲートと接触させて、第２の標的－ＰＮＡ－抗体コンジュゲート複合体を形成する工程；（ｖｉ）生物学的試料を第２の標識化コンジュゲートと接触させる工程であって、第２の標識化コンジュゲートが第２の酵素を含む（ここで、第２の標識化コンジュゲートは、第２のＰＮＡ－抗体コンジュゲートに特異的に結合し、標的を酵素で標識するように構成される抗標識抗体である）、接触させる工程；（ｖｉｉ）生物学的試料を、第２の潜在的反応性部分および第２の発色性部分を含む第２のシグナル伝達コンジュゲートと接触させる工程；（ｖｉｉｉ）生物学的試料に含有される第１の酵素を実質的に不活性化または完全に不活性化するために、試料を第１の酵素不活性化組成物と接触させることなどによって、第２の酵素を不活性化する工程。
第２の酵素が不活性化された後、他の標的の検出を達成するために、追加のＰＮＡ－抗体コンジュゲートを追加の検出試薬と共に導入することができるように、本方法を繰り返してもよい。すべてのＰＮＡ－抗体コンジュゲート（および他の検出プローブ）およびそれぞれの検出試薬またはキットを導入した後、本方法は、試料を対比染色することおよび／または第１、第２、および第ｎの発色性部分に由来するシグナルを検出すること（手動でまたは自動化された方法によって）をさらに含み、第１、第２、および第ｎの発色性部分のそれぞれは、それぞれ異なっている。あるいは、ＰＮＡ－抗体コンジュゲートのそれぞれは、同時にまたは逐次的に、しかしながら、任意の標識コンジュゲートを添加する前に、添加することができる。別の例として、３つのＰＮＡ－抗体コンジュゲートを最初に、任意の検出試薬の導入前に逐次的に適用し、次いで、各検出試薬を逐次的に添加することができる。
複数の標的が逐次的に検出され、検出が酵素の使用を採用する多重アッセイの関連では、連続する検出工程の間に任意の試薬または内因性酵素を不活性化することが望ましい。結果として、いずれか１つの検出工程に存在する酵素は、後の検出工程に存在する酵素と干渉しないと考えられる。これが次に、多重アッセイで使用される、異なる検出可能部分の可視化および検出を改善すると考えられる。当技術分野で公知の任意の酵素不活性化組成物をこの目的に使用することができる。一部の実施形態では、各検出工程の後に試薬または内因性酵素を不活性化するために、酵素不活性化組成物が適用される。例示的な酵素不活性化組成物は、その開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる、同時係属中の米国特許出願第６２／１５９，２９７号に開示されている。
一部の実施形態では、変性工程は、検出試薬の第１のセットで使用される酵素が、第２の基質に作用することを妨げる。一部の実施形態では、変性剤は、第１の検出試薬セット中の酵素を変性させる物質である。一部の実施形態では、変性剤は、例えば、ホルムアミド、アルキル置換アミド、尿素もしくは尿素系変性剤、チオ尿素、塩酸グアニジン、またはそれらの誘導体である。アルキル置換アミドの例としては、これらに限定されないが、Ｎ－プロピルホルムアミド、Ｎ－ブチルホルムアミド、Ｎ－イソブチルホルムアミド、およびＮ、Ｎ－ジプロピルホルムアミドが挙げられる。一部の実施形態では、変性剤は、緩衝液中に提供される。例えば、ホルムアミドは、２０ｍＭ硫酸デキストラン（５０～５７％のホルムアミド（ＵｌｔｒａＰｕｒｅホルムアミドストック）、２×ＳＳＣ（０．３Ｍのクエン酸塩および３ＭのＮａＣｌを含有する２０×ＳＳＣストック）、２．５ｍＭのＥＤＴＡ（０．５ＭのＥＤＴＡストック）、５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４（１ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４のストック）、０．０５％Ｂｒｉｊ－３５（ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルを含有する１０％ストック）、ｐＨ７．４を含む、ハイブリダイゼーション緩衝液で提供することができる。一部の実施形態では、試料は、第１の標的プローブ検出酵素、例えば、アルカリホスファターゼを変性させるのに十分な期間および条件下、変性剤で処理される。一部の実施形態では、試料は、約３７℃で約１５から約３０分間、好ましくは約２０から２４分間、変性剤で処理される。一部の実施形態では、試料は、ある期間および標的に対する第２の核酸プローブのハイブリダイゼーションを維持しながら標的酵素を変性させるのに十分な条件下で、変性剤で処理される。
酵素にコンジュゲートした抗標識抗体を用いるこれらの実施形態では、生物学的試料と共にシグナル伝達コンジュゲートまたは発色基質を導入するのに好適な条件が使用され、条件は、典型的には、過酸化物（例えば、過酸化水素）を含み、酵素がその所望の機能を果たすことを可能にするかまたは促進するのに好適な塩濃度およびｐＨを有する、反応緩衝液または溶液を提供することを含む。一般に、本方法のこの工程は、約３５℃から約４０℃の範囲の温度で行われるが、当業者は、選択された酵素およびシグナル伝達コンジュゲートに適した適切な温度範囲を選択することができる。例えば、これらの条件は、酵素と過酸化物が反応して、シグナル伝達コンジュゲートの潜在的反応性部分でのラジカル形成を促進することを可能にすると考えられる。潜在的反応性部分および、したがって、全体としてのシグナル伝達コンジュゲートは、生物学的試料、特に、固定化された酵素コンジュゲートに近接する１つまたは複数のチロシン残基、酵素コンジュゲートの酵素部分のチロシン残基、および／または酵素コンジュゲートの抗体部分のチロシン残基の上に共有結合的に沈着する。次いで、生物学的試料に光を照射し、シグナル伝達コンジュゲートの発色部分によって生じる光の吸光度を通して標的を検出することができる。
他の特異的結合体と併せて式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のいずれかのコンジュゲートを用いる検出方法
本開示の一部の態様では、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のいずれかのコンジュゲートは、組織試料中の標的の多重検出を行うために、他の特異的結合体と併せて使用される。当業者は、上記特定された方法および手順のいずれも、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、および（ＩＩＣ）のいずれかと他の特異的結合体との両方のコンジュゲートを用いる任意のアッセイに応じて適合させることができることを認識するであろう。
一部の実施形態では、他の特異的結合体は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための核酸およびＩＨＣのための未修飾抗体を含む。本明細書で使用される場合、「（１つまたは複数の）未修飾抗体」という用語は、ヌクレオチド配列（例えば、本明細書で特定されるＤＮＡ、ＰＮＡヌクレオチド配列、またはガンマＰＮＡヌクレオチド配列）を含まないが、ハプテンまたは別の標識にコンジュゲートした抗体を含む、抗体を指す。本質的に、「未修飾抗体」は、ＩＨＣアッセイにおいて伝統的に使用される未変性抗体であり、これは、特定の標的（例えば、抗ＣＤ３抗体）に特異的であり、抗種二次抗体、または標識を含む場合には抗標識抗体などによって検出することができる。例として、ウサギ抗ＣＤ３抗体は、ヤギ抗ウサギ抗体を用いて検出することができる。同様に、ハプテンにコンジュゲートしたウサギ抗ＣＤ３抗体は、抗ハプテン抗体を用いて検出することができる。
図１４Ｂおよび１４Ｃは、組織試料を１つまたは複数の未修飾一次抗体に（同時にまたは逐次的に）接触させて（第１段階、２２０）、次いでその後に、１つまたは複数のＰＮＡコンジュゲートに（同時にまたは逐次的に）接触させる（第２段階、２５０）、標的の多重検出方法を示している。当業者は、第１段階２２０および第２段階２５０を逆にして、ＰＮＡコンジュゲートを最初に組織試料に適用し、その後、未修飾抗体を適用することができることを認識するであろう。当業者はまた、多重アッセイが、ＩＳＨおよびＩＨＣの工程または段階の両方を（任意の順序で）含むように、適切な核酸プローブ（標識にコンジュゲートしたものを含む）を未修飾抗体の代わりに使用してもよいことも認識するであろう。
図１４Ｂに示されるような一部の実施形態では、第１の未修飾一次抗体を組織試料に適用して、第１の標的－一次抗体複合体を形成することができる（工程２００）。次に、未修飾一次抗体に特異的な第１の検出試薬を組織試料に適用して、第１の標的－一次抗体複合体を検出する（工程２１０）。図１４Ｂの破線２０５は、未修飾の一次抗体を用いて組織試料内の複数の異なる標的の逐次多重検出を提供するために、第１段階２２０の工程２００および２１０を１回または複数回繰り返すことができることを示している。例えば、第２の未修飾一次抗体を組織試料に適用して、第２の標的－一次抗体複合体を形成し（２００）、その後、第２の未修飾一次抗体に特異的な第２の検出試薬を適用して、第２の標的－一次抗体複合体を検出する（２１０）。
図１４Ｃは、図１４Ｂに提示されたものと同様の二段階法を使用する、標的の多重検出のための代替的な方法を表す。図１４Ｃに示される方法では、工程２６０において、未修飾抗体コンジュゲートのそれぞれが、同時に組織試料に導入される。次に、工程２７０において、試料を検出試薬（例えば、抗種抗体または抗標識抗体）と接触させて、未修飾抗体の検出を達成する。代替的な実施形態では、未修飾の一次抗体のすべてを逐次的に適用することができ（工程２６０）、その後、それぞれの抗種抗体（または、適切な場合には、抗ハプテン抗体）を逐次的に適用してもよい（工程２７０）。
当業者は、未修飾抗体のための検出試薬が、利用された未修飾抗体に特異的な抗種抗体を含み得ることを認識するであろう。あるいは、未修飾抗体のための検出試薬は、未修飾抗体にコンジュゲートしたハプテンに特異的な抗ハプテン抗体を含み得る。当業者はまた、抗種抗体または抗ハプテン抗体がレポーター部分を含むことができ、レポーター部分が酵素である実施形態では、追加の発色基質が第１および第２の検出試薬と共に供給され得ることを認識するであろう。
多重アッセイ２２０の第１段階（図１４Ｂまたは１４Ｃ）に続いて、第２段階２５０が実施され、ここで、組織試料を、複数のＰＮＡコンジュゲートと同時にまたは逐次的に接触させ（工程２３０）、各ＰＮＡコンジュゲートは、特定の標的に特異的であり、各ＰＮＡコンジュゲートは異なるＰＮＡオリゴマー部分を含む。ＰＮＡコンジュゲートは、特定のアッセイに必要な各ＰＮＡコンジュゲートを含む「プール」または「カクテル」として組織試料に供給され得る。各ＰＮＡコンジュゲートは、特異的標的と共に検出可能な標的－ＰＮＡコンジュゲート複合体を形成する。ＰＮＡコンジュゲートの同時または逐次的適用（工程２３０）に続いて、抗標識抗体（二次抗体）が組織試料に同時に適用され（工程２４０）、ここで、各抗標識抗体は、適用されるＰＮＡコンジュゲートの１つに特異的であり、各抗標識抗体は異なるレポーター部分を含む。抗標識抗体は、標的－ＰＮＡ－抗体複合体の検出に必要な各抗標識抗体を含む「プール」または「カクテル」として組織試料に供給され得る。
あるいは、工程２３０でそれぞれのＰＮＡコンジュゲートを導入した後、工程２４０で、試料をＰＮＡコンジュゲートのＰＮＡ配列に対して相補的なＰＮＡ配列またはＤＮＡ配列と接触させることができ、ＤＮＡ配列は、レポーター部分（例えば、酵素、色素原、フルオロフォア、またはハプテン）を含む。ＤＮＡ配列が色素原またはフルオロフォアを含む実施形態では、「標識された」標的複合体を直接検出することができる。他方では、ＤＮＡ配列がハプテンを含む場合、「標識された」標的複合体の最終的な検出を容易にするために、レポーター部分にコンジュゲートした抗ハプテン抗体を導入しなければならない。
当然のことながら、代替的な実施形態として、それぞれのＰＮＡコンジュゲートのＰＮＡ配列は、本明細書に記載のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ法などを用いて定量することができる。
工程２５０の後に、一部の実施形態では、組織試料を対比染色で染色してもよい。各レポーター部分からの（例えば、抗種抗体または抗標識抗体からの）シグナルは、可視化または他の方法で検出することができる（例えば、同時に可視化または検出することができる）。
本開示による（ｉ）未修飾抗体と、（ｉｉ）ＰＮＡ－抗体コンジュゲートの両方を含む多重アッセイの例として、ハプテン標識を含む第１の抗体コンジュゲート（例えば、偶然に間接的にコンジュゲートした抗ＣＤ３抗体）を組織試料に導入して、標的－抗体－コンジュゲート複合体を形成する。同時に、未修飾抗体（例えば、ウサギ抗ＰＤＬ１抗体）を組織試料に導入して、標的－未修飾抗体複合体を形成する。次に、形成された標的－抗体－コンジュゲート複合体（例えば、抗ハプテン抗体）および形成された標的－未修飾－抗体複合体（例えば、ヤギ抗ウサギ抗体）を検出するために、検出試薬を（同時にまたは逐次的に）導入し、ここで、検出試薬のそれぞれは、異なるフルオロフォアにコンジュゲートしている。
多重アッセイの第二段階では、第１のＰＮＡオリゴマーを含み、第１の標的に特異的な（例えば、ＣＤ６８に特異的な）第１のＰＮＡ－抗体コンジュゲートが組織試料に導入される。一部の実施形態では、第１のＰＮＡ－抗体コンジュゲートは、検出可能な第１の標的－ＰＮＡ－抗体コンジュゲート複合体を形成する。逐次的にまたは同時に、第２のＰＮＡオリゴマーを含み、第２の標的に特異的な（例えば、Ｋｉ６７に特異的な）第２のＰＮＡ－抗体コンジュゲートを試料に導入して、第２の標的－ＰＮＡ－抗体コンジュゲート複合体を形成する。他の標的に特異的であり（「ｎ」個の標的－ＰＮＡ－抗体複合体を形成する）、異なるＰＮＡオリゴマーを有する、第３、第４、および第ｎの追加のＰＮＡ－抗体コンジュゲートを、第１および第２のＰＮＡ－抗体コンジュゲートと同時にさらに導入することができる。代替的な実施形態では、ＰＮＡ－抗体コンジュゲートを逐次的に添加してもよく、ＰＮＡ配列は、次のＰＮＡ－抗体コンジュゲートの導入前に、ＰＮＡ－抗体コンジュゲートから切断される。次いで、切断されたＰＮＡ配列を一緒に測定することができる。
ＰＮＡ－抗体コンジュゲートの沈着後に、当然のことながら、それらを、それらの構成に応じて直接的または間接的に検出することができる。一部の実施形態では、第１、第２、および第ｎの検出試薬は同時に導入され、ここで、第１、第２、および第ｎの検出試薬のそれぞれは、異なるＰＮＡ－抗体コンジュゲートに特異的である。他の実施形態では、第１、第２、および第ｎの検出試薬が逐次的に導入され、ここで、第１、第２、および第ｎの検出試薬のそれぞれは、異なるＰＮＡ－抗体コンジュゲートに特異的である。一部の実施形態では、標的－ＰＮＡ－抗体コンジュゲート複合体のそれぞれの検出を可能にするために、抗標識抗体が導入される。一部の実施形態では、検出試薬は、ＰＮＡ－抗体コンジュゲートの異なる標識に特異的な抗標識抗体であり、抗標識抗体は、それぞれが、レポーター部分、例えば、フルオロフォアまたは酵素にコンジュゲートしている。一部の実施形態では、検出可能な試薬は、それぞれが、フルオロフォアにコンジュゲートしている抗標識抗体である。他の実施形態では、検出可能な試薬は、それぞれが、酵素にコンジュゲートしている抗標識抗体である。さらに他の実施形態では、検出可能な試薬は、フルオロフォアにコンジュゲートした抗標識抗体と、酵素にコンジュゲートした抗標識抗体との組合せである。抗標識抗体が酵素にコンジュゲートしているこれらの実施形態では、検出（本明細書で前述したように）を行うために、酵素用の基質が提供される。他の実施形態では、標的－ＰＮＡ－抗体コンジュゲート複合体のそれぞれの検出を可能にするために、１つまたは複数のＰＮＡ配列に対して相補的であり、酵素、フルオロフォア、またはハプテンを含むＰＮＡまたはＤＮＡ配列が導入される。さらに他の実施形態では、検出試薬は、ＰＮＡコンジュゲートのＰＮＡオリゴマー部分のＰＮＡ配列に対して相補的なＰＮＡまたはＤＮＡ配列である。当業者は、ハプテンにコンジュゲートしている相補的なＰＮＡまたはＤＮＡ配列が提供される場合、相補的なＰＮＡまたはＤＮＡ配列の検出を容易にするために、さらなる試薬を試料に供給することができることを認識するであろう。代替的な実施形態では、ＰＮＡコンジュゲート抗体をｅｘ ｓｉｔｕで相補的ＰＮＡまたはＤＮＡ配列にハイブリダイズさせてもよく、次いで、複合体、すなわち、相補的ＰＮＡまたはＤＮＡ配列にハイブリダイズさせたＰＮＡコンジュゲート抗体を組織に導入して、試料内の標的の標識化を可能にすることができる。
自動化
多重アッセイおよび方法は自動化することができ、検体処理装置と組み合わせることができる。検体処理装置は、自動化装置、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．によって販売されているＢＥＮＣＨＭＡＲＫ ＸＴ機器およびＳＹＭＰＨＯＮＹ機器であってもよい。Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．は、そのそれぞれが全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６５０，３２７号、同第５，６５４，２００号、同第６，２９６，８０９号、同第６，３５２，８６１号、同第６，８２７，９０１号および同第６，９４３，０２９号、ならびに、米国特許出願公開第２００３／０２１１６３０号および同第２００４／００５２６８５号を含む、自動分析を実施するためのシステムおよび方法を開示している多数の米国特許の譲受人である。あるいは、検体は、手動で処理されてもよい。
検体処理装置は、検体に固定剤を適用することができる。固定剤としては、架橋剤（例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、およびグルタルアルデヒドなどのアルデヒド、ならびに非アルデヒド架橋剤）、酸化剤（例えば、四酸化オスミウムおよびクロム酸などの金属イオンおよび金属錯体）、タンパク質変性剤（例えば、酢酸、メタノール、およびエタノール）、未知の機序の固定剤（例えば、塩化水銀、アセトン、およびピクリン酸）、併用試薬（例えば、カルノア固定液、メタカン、ブアン液、Ｂ５固定液、ロスマン液、およびジャンドル液）、マイクロ波、およびその他の様々な固定剤（例えば、排除体積固定および蒸気固定）を挙げることができる。
検体がパラフィンに包埋された試料である場合、試料は、適切な脱パラフィン化液を使用して、検体処理装置で脱パラフィン化することができる。廃棄物除去剤によって脱パラフィン化液が除去された後に、任意の数の物質を検体に連続的に適用することができる。物質は、前処理（例えば、タンパク質架橋、核酸曝露など）、変性、ハイブリダイゼーション、洗浄（例えば、ストリンジェントな洗浄）、検出（例えば、視覚分子またはマーカー分子とプローブとの連結）、増幅（例えば、タンパク質、遺伝子などの増幅）、対比染色、カバースリップなどのためのものであり得る。
検体処理装置には、検体に対して広い範囲の物質を適用することができる。物質としては、限定されないが、染料、プローブ、試薬、リンス、および／またはコンディショナーが挙げられる。物質は、流体（例えば、気体、液体、または気体／液体混合物）などであり得る。流体は、溶媒（例えば、極性溶媒、非極性溶媒など）、溶液（例えば、水溶液または他のタイプの溶液）などであり得る。試薬としては、限定されないが、染料、湿潤剤、抗体（例えば、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体など）、抗原回復流体（例えば、水性または非水性系抗原賦活化液（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、抗原回復緩衝液など）などを挙げることができる。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子に付着した単離核酸または単離合成オリゴヌクレオチドであってもよい。標識は、放射性同位体、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光または蛍光剤、ハプテン、および酵素を含むことができる。
検体が処理された後、ユーザーは、検体を載せたスライドを撮像装置へと輸送することができる。本明細書で使用される撮像装置は、明視野イメージャースライドスキャナーである。明視野イメージャーの１つは、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．によって販売されているｉＳｃａｎ Ｃｏｒｅｏ（商標）明視野スキャナーである。自動化された実施形態では、撮像装置は、撮像システムおよび技術（ＩＭＡＧＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ）と題された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２７７２号（国際公開第ＷＯ／２０１１／０４９６０８号）に開示されているか、または撮像システム、カセット、およびその使用方法（ＩＭＡＧＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＣＡＳＳＥＴＴＥＳ，ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥ ＳＡＭＥ）と題された２０１１年９月９日出願の米国特許出願公開第２０１４／０１７８１６９号に開示されるようなデジタル病理学デバイスである。
対比染色
対比染色は、顕微鏡下において、それらの構造をより容易に可視化できるように、１つまたは複数の標的を検出するために、薬剤で既に染色された後に、試料を後処理する方法である。例えば、免疫組織化学的染色をより明確にするために、カバースリップをする前に、対比染色が使用されてもよい。対比染色は、一次染色とは色が異なる。ヘマトキシリン、エオシン、メチルグリーン、メチレンブルー、ギムザ、アルシアンブルー、およびＮｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄなど、多くの対比染色が周知である。ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）は、使用することができる蛍光染料である。
一部の例では、対比染色を生じさせるために、２つ以上の染料を一緒に混合することができる。これは、柔軟性と、染色を選択する能力とをもたらす。例えば、特定の属性を有するが、それでも異なる所望の属性を有しない混合物について、第１の染色を選択することができる。欠けている所望の属性を示す第２の染色を混合物に添加することができる。例えば、トルイジンブルー、ＤＡＰＩ、およびポンタミンスカイブルーを混ぜ合わせて、対比染色を形成することができる。
画像化
開示される実施形態のうちのある特定の態様、またはすべては、自動化することができ、コンピュータ解析および／または画像解析システムによって促進することができる。一部の適用では、正確な色または蛍光比が測定される。一部の実施形態では、光学顕微鏡が画像解析に利用される。ある特定の開示される実施形態は、デジタル画像の取得に関する。これは、デジタルカメラを顕微鏡に接続することによって行うことができる。染色された試料から得られたデジタル画像は、画像解析ソフトウェアを使用して解析される。色または蛍光は、いくつかの異なる方法で測定することができる。例えば、色は、赤、青、および緑の値として；色相、彩度、明度の値として；ならびに／または、分光撮像カメラを使用して、特定の波長または波長範囲を測定することによって、測定することができる。試料はまた、定性的および半定量的に評価することもできる。定性的評価には、染色強度の評価、陽性染色細胞および染色に関与する細胞内コンパートメントの識別、ならびに全体的な試料またはスライドの品質の評価が含まれる。別々の評価が、試験試料に関して実施され、この解析には、試料が異常状態を表すかどうかを決定するために、既知の平均値と比較することが含まれ得る。
試料および標的
試料は、生物学的成分を含み、一般的に、１つまたは複数の目的の標的分子を含むことが疑われる。標的分子は、細胞の表面上に存在してもよく、細胞は懸濁液中、または組織切片中に存在してもよい。標的分子はまた、細胞内に存在してもよく、細胞溶解またはプローブによる細胞の浸透の際に検出され得る。当業者は、試料中の標的分子を検出する方法が、使用される試料およびプローブの種類に応じて変わることを理解するであろう。試料を採取および調製する方法は当技術分野において公知である。
組織または他の生物学的試料など、本明細書に開示されている組成物を有する、方法の実施形態で使用するための試料は、当業者によって当技術分野で公知の任意の方法を使用して調製することができる。試料は、日常的なスクリーニングのために対象から、または遺伝的異常、感染、もしくは新生物などの障害を有することが疑われる対象から得ることができる。開示された方法の記載された実施形態はまた、「正常な」試料と称される、遺伝的異常、疾患、障害などを有しない試料に適用され得る。このような正常な試料は、他の試料と比較するためのコントロールとして、とりわけ有用である。試料は、多くの異なる目的で解析することができる。例えば、試料は、科学的研究においてまたは疑われる病気の診断のために、あるいは治療の成功、生存などのための予後指標として、使用することができる。
試料は、プローブまたはレポーター分子が特異的に結合することができる複数の標的を含み得る。標的は、核酸配列またはタンパク質であり得る。一部の例では、標的は、ウイルス、細菌、またはウイルスゲノムのような細胞内寄生生物などの病原体由来のタンパク質または核酸分子である。例えば、標的タンパク質は、疾患に関連する（例えば、疾患と相関する、原因として関与するなど）標的核酸配列から産生され得る。
当業者は、以下の標的のいずれかに特異的なＰＮＡコンジュゲートが開発され得ることを認識するであろう：
具体的な、非限定的な例では、標的タンパク質は、新生物（例えば、がん）に関連する標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）によって産生される。とりわけ、Ｂ細胞およびＴ細胞白血病などのがん細胞、リンパ腫、乳がん、結腸がん、神経がんなどの腫瘍性細胞において、多数の染色体異常（転座および他の再配列、増幅または欠失を含む）が同定されている。したがって、一部の例では、標的分子の少なくとも一部は、試料中の細胞の少なくともサブセットにおいて増幅または欠失された核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）によって産生される。
他の例では、標的タンパク質は、悪性細胞において欠失している（損失した）腫瘍抑制遺伝子である核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生される。例えば、染色体９ｐ２１上に位置するｐ１６領域（Ｄ９Ｓ１７４９、Ｄ９Ｓ１７４７、ｐ１６（ＩＮＫ４Ａ）、ｐ１４（ＡＲＦ）、Ｄ９Ｓ１７４８、ｐ１５（ＩＮＫ４Ｂ）、およびＤ９Ｓ１７５２を含む）は、ある特定の膀胱がんにおいて欠失している。第１染色体の短いアームの遠位領域（例えば、ＳＨＧＣ５７２４３、ＴＰ７３、ＥＧＦＬ３、ＡＢＬ２、ＡＮＧＰＴＬ１、およびＳＨＧＣ－１３２２を包含する）、および第１９染色体の動原体周辺領域（例えば、１９ｐ１３～１９ｑ１３）に関与する染色体欠失（例えば、ＭＡＮ２Ｂ１、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ４４、ＣＲＸ、ＧＬＴＳＣＲ２、およびＧＬＴＳＣＲ１を包含する）は、中枢神経系のある特定の種の固形腫瘍の特徴的な分子的特徴である。
腫瘍性形質転換および／または増殖と相関する多くの他の細胞遺伝学的異常が当業者に公知である。腫瘍性形質転換と相関しており、開示された方法において有用である、核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）によって産生される標的タンパク質は、ＥＧＦＲ遺伝子（７ｐ１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－０００００７、ヌクレオチド５５０５４２１９～５５２４２５２５）、Ｃ－ＭＹＣ遺伝子（８ｑ２４．２１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－０００００８、ヌクレオチド１２８８１７４９８～１２８８２２８５６）、Ｄ５Ｓ２７１（５ｐ１５．２）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）遺伝子（８ｐ２２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－０００００８、ヌクレオチド１９８４１０５８～１９８６９０４９）、ＲＢ１（１３ｑ１４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－００００１３、ヌクレオチド４７７７５９１２～４７９５４０２３）、ｐ５３（１７ｐ１３．１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－００００１７、相補体、ヌクレオチド７５１２４６４～７５３１６４２））、Ｎ－ＭＹＣ（２ｐ２４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－０００００２、相補体、ヌクレオチド１５１８３５２３１～１５１８５４６２０）、ＣＨＯＰ（１２ｑ１３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－００００１２、相補体、ヌクレオチド５６１９６６３８～５６２００５６７）、ＦＵＳ（１６ｐ１１．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－００００１６、ヌクレオチド３１０９８９５４～３１１１０６０１）、ＦＫＨＲ（１３ｐ１４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－００００１３、相補体、ヌクレオチド４００２７８１７～４０１３８７３４）、ならびに、例えば：ＡＬＫ（２ｐ２３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－０００００２、相補体、ヌクレオチド２９２６９１４４～２９９９７９３６）、Ｉｇ重鎖、ＣＣＮＤ１（１１ｑ１３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－００００１１、ヌクレオチド６９１６５０５４．６９１７８４２３）、ＢＣＬ２（１８ｑ２１．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－００００１８、相補体、ヌクレオチド５８９４１５５９～５９１３７５９３）、ＢＣＬ６（３ｑ２７；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－０００００３、相補体、ヌクレオチド１８８９２１８５９～１８８９４６１６９）、ＭＡＬＦ１、ＡＰ１（１ｐ３２－ｐ３１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－０００００１、相補体、ヌクレオチド５９０１９０５１～５９０２２３７３）、ＴＯＰ２Ａ（１７ｑ２１－ｑ２２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－００００１７、相補体、ヌクレオチド３５７９８３２１～３５８２７６９５）、ＴＭＰＲＳＳ（２１ｑ２２．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－００００２１、相補体、ヌクレオチド４１７５８３５１～４１８０１９４８）、ＥＲＧ（２１ｑ２２．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－００００２１、相補体、ヌクレオチド３８６７５６７１～３８９５５４８８）；ＥＴＶ１（７ｐ２１．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－０００００７、相補体、ヌクレオチド１３８９７３７９～１３９９５２８９）、ＥＷＳ（２２ｑ１２．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－００００２２、ヌクレオチド２７９９４２７１～２８０２６５０５）；ＦＬＩ１（１１ｑ２４．１－ｑ２４．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－００００１１、ヌクレオチド１２８０６９１９９～１２８１８７５２１）、ＰＡＸ３（２ｑ３５－ｑ３７；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－０００００２、相補体、ヌクレオチド２２２７７２８５１～２２２８７１９４４）、ＰＡＸ７（１ｐ３６．２－ｐ３６．１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－０００００１、ヌクレオチド１８８３００８７～１８９３５２１９）、ＰＴＥＮ（１０ｑ２３．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－００００１０、ヌクレオチド８９６１３１７５～８９７１６３８２）、ＡＫＴ２（１９ｑ１３．１－ｑ１３．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－００００１９、相補体、ヌクレオチド４５４３１５５６～４５４８３０３６）、ＭＹＣＬ１（１ｐ３４．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－０００００１、相補体、ヌクレオチド４０１３３６８５～４０１４０２７４）、ＲＥＬ（２ｐ１３－ｐ１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－０００００２、ヌクレオチド６０９６２２５６～６１００３６８２）およびＣＳＦ１Ｒ（５ｑ３３－ｑ３５；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＣ－０００００５、相補体、ヌクレオチド１４９４１３０５１～１４９４７３１２８）も含む。
本明細書に提示される非限定的な例はそれぞれ、ＰＮＡコンジュゲートの使用を組み込む。出願人らは、本明細書に開示されているＰＮＡコンジュゲートが、ＩＨＣアッセイでの使用に好適であることを提示する。当然のことながら、本明細書に詳述されるように、ＰＮＡコンジュゲートは、他の検出可能な特異的結合体と併せて使用することができ、ＩＨＣとＩＳＨとを組み合わせたアッセイにおいて利用することができる。
実施例１
ＰＮＡ／抗体コンジュゲーション
ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）、ヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）、およびマウス抗ＤＩＧに対するＰＮＡの例示的なコンジュゲーションが、以下に記載される：
（１）１００マイクログラムの抗体（０．６６７ナノモル）を、ＰＢＳで２ｍｇ／ｍＬに希釈し、１５モル当量のＳＰＤＰ－ＰＥＧ－ＮＨＳ（１０ｍＭのＤＭＳＯストック溶液から１０ナノモル）で２時間処理した。ＳＰＤＰ－ＰＥＧ－ＮＨＳは、ＱｕａｎｔａＢｉｏｄｅｓｉｇｎ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡから入手可能であった（ＳＰＤＰ－ｄＰＥＧ８－ＮＨＳエステル、製品番号１０３７６）。
（２）標識した抗体を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからの７ＫＤ ＭＷカットオフＺｅｂａスピン脱塩カラム（製品番号８９８８２）を用いて精製した。
（３）２ナノモルのＰＮＡ（１：１（ｖ／ｖ）水ＤＭＦを溶解した２５１μＭのＰＮＡストック溶液から８μＬ）を、５μＬのＤＭＦ、および３５μＬのＰＢＳを添加すると共に、抗体溶液に添加し、合計約１００μＬの反応溶液を得た。混合物を室温で一晩インキュベートした。
（４）次いで、Ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用してコンジュゲートを精製し、次いで、反応混合物からＰＮＡコンジュゲート抗体を精製するために使用した。
精製したＰＮＡコンジュゲート抗体を、使用前に好適な希釈剤で希釈した。
実施例２
抗体－ＰＮＡコンジュゲートのＵＶ－Ｖｉｓ測定
ＰＮＡコンジュゲート抗体をＵＶ－Ｖｉｓ吸光度で特徴付けた。抗体－ＰＮＡコンジュゲートにおける２６０ｎｍでの吸光度の増加は、ＰＮＡの取り込みの成功を示した（図２Ａおよび２Ｂを参照されたい）。Ａ２６０対Ａ２８０の比は、コンジュゲーションの効率を定性的に評価し、抗体当たりのＰＮＡオリゴマーの数を潜在的に推定するために使用することができる。これは、図３０および３１でも示されている。
実施例３
ＳＡ－ＨＲＰを使用したＰＮＡ－抗体コンジュゲートの検出：
ＰＮＡオリゴマー（１５塩基のＰＮＡ、１０塩基のＰＮＡまたは１５塩基のガンマＰＮＡ）のコンジュゲーションが抗体の結合親和性および特異性に影響を及ぼさないことを証明するために、ＰＮＡ－コンジュゲート抗体（一次および二次）を使用して、異なるマーカーについて扁桃組織に関するＩＨＣアッセイを実施した。ＩＨＣアッセイはすべて、特定のアッセイに基づいて修正されたプロトコールを使用して、ＢｅｎｃｈｍａｒｋＸＴ（Ｖｅｎｔａｎａ社）で行われた。ＰＮＡ－コンジュゲート抗体を、滴定として１００μＬの体積で、適切な濃度で、手動で添加した。
ＰＮＡタグ上のビオチン標識を検出した。２つの扁桃スライドを、抗ＣＤ４５および抗Ｋｉ６７一次抗体と共にインキュベートし、その後、それぞれ、ＰＮＡをコンジュゲートしたＧＡＲおよびＧＡＭ二次抗体（１５塩基を有するＰＮＡ配列）と共にインキュベートした。次いで、スライドをストレプトアビジン－ＨＲＰ（ＳＡ－ＨＲＰ）と共にインキュベートし、続いて、ＤＡＢ沈着（発色検出）を行った。マーカーは、それらの予測される位置で観察された（図３ＡおよびＢ）。一次抗体をアッセイから除外した場合には、バックグラウンドシグナルは観察されなかった（図３Ｃ）。扁桃スライドもまた、ＣＫ５／６に対して、一次ハプテン化抗体（抗ＣＫ５／６：ＤＩＧ）および二次ＰＮＡコンジュゲート抗ハプテン抗体、続いて、ＳＡ－ＨＲＰおよびＤＡＢ沈着を使用して、染色することに成功した（図４Ａおよび４Ｂ）。同じ実験を１０塩基を有するＰＮＡ配列で実施した。扁桃組織を抗Ｋｉ６７で染色し、次いで、ＰＮＡ配列にコンジュゲートしたＧＡＲは１０塩基を有する。ＧＡＲにコンジュゲートした１０塩基を有するＰＮＡ配列の末端のビオチン部分を、ＳＡ－ＨＲＰ、続いて、ＤＡＢ沈着を使用して検出した（図２１Ａ）。比較として、扁桃組織をＧＡＲ－ＨＲＰを有するＫｉ６７について染色した（Ｖｅｎｔａｎａによる従来のＵｌｔｒａｖｉｅｗ検出）。この実験は、１０塩基ＰＮＡ配列コンジュゲーションによってＧＡＲの機能性が変化しなかったことを示した。
扁桃を抗Ｋｉ６７、次いで、ガンマＰＮＡ配列にコンジュゲートしたＧＡＲ（１５塩基）で染色した。ガンマＰＮＡ配列の末端のビオチンを、ＳＡ－ＨＲＰ、続いて、ＤＡＢ沈着によって検出した（図２８）。図は、ガンマＰＮＡが、いかなる局在化の誤りも生じさせずに、二次抗体にコンジュゲートすることに成功できることを示す。
これらの第１の実験は、様々なＰＮＡ配列長（１０塩基および１５塩基）および性質（従来のＰＮＡおよびガンマＰＮＡ）を二次抗体に効率的にコンジュゲートすることができ、コンジュゲーションは、扁桃スライド上の対応する一次抗体に対するそれらの結合親和性および特異性に影響を及ぼさないという強力な証拠を提供する。
ＰＮＡタグ（１０塩基のＰＮＡおよび１５塩基のガンマＰＮＡ）は、一次抗体に直接コンジュゲートされ、前述したように、ＰＮＡ配列上のビオチン部分によって検出された。扁桃スライドを、その末端にビオチンを有する、１０塩基を有するＰＮＡ配列（ｓＰＮＡ１と称される）にコンジュゲートした抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗ＣＤ３４、抗Ｋｉ６７一次抗体と共にインキュベートした。次いで、スライドをストレプトアビジン－ＨＲＰ（ＳＡ－ＨＲＰ）と共にインキュベートし、続いて、ＤＡＢ沈着（発色検出）を行った。すべてのマーカーは、それらの予測される位置で観察された。図２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｄは、扁桃スライドを、それぞれ、１０塩基のＰＮＡにコンジュゲートした抗ＣＤ３、１０塩基のＰＮＡにコンジュゲートした抗ＣＤ８、１０塩基のＰＮＡにコンジュゲートした抗ＣＤ３４、および１０塩基のＰＮＡにコンジュゲートした抗Ｋｉ６７で染色したことを示す。
図２３および２４は、扁桃スライドを、その末端にビオチンを有するｓＰＮＡ２と称され、前述されたように検出された様々な１０塩基のＰＮＡ配列にそれぞれコンジュゲートした抗ＣＤ３および抗ＣＤ８で染色したことを示す。
扁桃スライドを、１５塩基のガンマＰＮＡ配列にコンジュゲートした抗ＣＤ３、抗ＣＤ８および抗ＰＤ－Ｌ１でも染色した。ガンマＰＮＡ配列上のビオチン部分を、ＳＡ－ＨＲＰとのインキュベーション、続いて、ＤＡＢ沈着によって検出した。図２９Ａ、ＢおよびＣは、扁桃スライドを、それぞれ、異なる濃度の抗ＣＤ３、抗ＣＤ８および抗ＰＤ－Ｌ１で染色したことを示す。
実施例４Ａ
ＰＮＡオリゴの化学的切断
一部の実施形態では、ＰＮＡ－コンジュゲート抗体は、Ｇｙｒｏｓ技術またはＤＮＡ計数に基づくＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームなどの方法によるタンパク質発現の多重定量測定を可能にするように設計されている。したがって、ＰＮＡ配列を、ｅｘ ｓｉｔｕＰＮＡ計数を可能にするために組織に結合した後にＰＮＡコンジュゲート抗体から切断しなければならない。この特定の例では、ＰＮＡ配列は、ジスルフィド結合を介して抗体に結合し、これは、（例えば、ジスルフィド結合の還元によって）化学的に切断されて、ＰＮＡ配列の放出をもたらすことができる。
図５Ａから５Ｄは、一次抗体、続いて、ＰＮＡコンジュゲート抗種二次抗体を用いて、Ｋｉ６７およびＣＤ４５について染色し、ＳＡ－ＨＲＰ ＤＡＢ沈着によって検出した扁桃スライドを示す。ＳＡ－ＨＲＰ処理の前に、スライドを２０ｍＭのＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン、還元剤）と共にインキュベートすることによって、褐色の染色が完全に失われ、ＰＮＡタグが除去されたことを示した。
実施例４Ｂ
ＰＮＡオリゴの光切断
扁桃スライドを一次抗体（ウサギＫｉ６７）、二次抗体（ＧＡＲ－ＰＬ－ＰＮＡ、その上にビオチンを有する光開裂性ＰＮＡを有するヤギ抗ウサギ抗体）で処理した。次いで、スライドを、異なる時間の間、ＵＶ光（ハンドヘルドＵＶランプ、３６５ｎｍ）で照射した。コントロールスライドはＵＶ処理せず、比較のために使用した。次いで、すべてのスライドを検出用にＳＡ－ＨＲＰおよびＤＡＢで処理した。
図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃは、照射したスライドがＰＮＡ配列の光切断を示す色を有していないことを示している。この実験では、スライド全体にＵＶ光を照射した。スライド全体からのＰＮＡの切断は、ジスルフィド結合の化学的還元によって達成することができる。光照射は、スライド上の目的の特定領域を選択的に照射する可能性を与える。この概念を証明するために、本発明者らは、選択的照射を達成するためにレーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）システムを使用した。ＬＣＭによって、対物レンズ（高い空間精度）を通過するＵＶ光を使用して、組織の特定領域を（単一細胞に至るまで）切断した。本発明者らは、ＵＶを使用して、組織上の特定領域を選択的に照射し、ＰＮＡを光切断した。図１３は、照射された胚中心（染色なし）の隣に照射されなかった別の胚中心（陽性染色）がある、扁桃スライドを例示している。ＬＣＭのＵＶは３５５ｎｍである。
実施例５
ＳＡ－ＦＩＴＣを使用するＰＮＡ／抗体コンジュゲートの蛍光検出
発色検出の他に、コンジュゲート中のビオチンは、ＳＡ－フルオロフォアを使用して蛍光的にも検出され得る。図６Ａおよび６Ｂは、一次抗体、続いて、ＰＮＡをコンジュゲートした二次抗体を用いて、Ｋｉ６７について染色し、ＳＡ－ＦＩＴＣで検出した扁桃スライドの蛍光画像を示す。ＳＡ－ＦＩＴＣは、ＰＮＡ配列上のビオチンに結合する（図６Ｃを参照されたい）。蛍光シグナルは、Ｋｉ６７マーカーの局在と一致している。この実験によって、ＰＮＡコンジュゲート抗体がもたらす検出スキームの多様性が実証された。
実施例６
ＰＮＡの定量測定
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームは、最大８００種類の異なるＤＮＡ配列を潜在的に検出する能力を有しており、抗体ＰＮＡコンジュゲートを使用することで、ＩＨＣの非常に大きな多重化能力を可能にすることが報告されている。本発明者らは、検出スキームがレポーター鎖の標的オリゴ（おそらくはＤＮＡまたはＰＮＡであり得る）へのハイブリダイゼーションに基づいていることから、ＰＮＡはＤＮＡと同様の方式で検出することができると仮定している。ＰＮＡの３’末端上のビオチンの存在は、捕捉鎖を使用する必要性を排除するため、ＰＮＡオリゴマーは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームで典型的に使用される、標準的なＤＮＡ標的（典型的には約１００塩基長である）よりも著しく短くできると考えられる。さらに、ＤＮＡ対ＤＮＡと比較して、ＰＮＡ対ＤＮＡのより高い結合親和性は、比較的短いＰＮＡ／ＤＮＡレポーター二本鎖に対して十分な安定性をもたらすと考えられる。
概念の実証として、本発明者らは、本明細書の実施例８に記載される蛍光染色スライドをＴＣＥＰ（２０ｍＭ）と共にインキュベートして、ＰＮＡ－ＳＡ－ＦＩＴＣを除去することができることを示した。放出されたＰＮＡ－ＳＡ－ＦＩＴＣを蛍光強度に基づいて測定した。次いで、スライドに結合したＰＮＡコンジュゲート抗体の数を推定することができる（図７Ａおよび７Ｂ）。
実施例７
補体蛍光ＤＮＡを使用するＰＮＡの検出：
先の実験では、ＰＮＡはビオチン標識に対する染色によって検出された。異なる標識（発色性、蛍光発生性など）を担持する相補的ＤＮＡまたはＰＮＡ配列は、代替的な染色手法として使用することができる。この実験では、扁桃スライドを、ウサギ抗Ｋｉ６７一次抗体、その後、ＰＮＡをコンジュゲートしたＧＡＲと共にインキュベートした。次いで、スライドを蛍光標識を有するＰＮＡに対して相補的なＤＮＡ配列（例えば、ＦＩＴＣまたはローダミン）と共にインキュベートした。図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、および８Ｄは、スライドがＤＮＡハイブリダイゼーションによって染色されるのに成功したことを示している。蛍光染色は、マーカーの局在と一致し、バックグラウンドシグナルは観察されなかった。ＤＮＡ配列を、約１８５ｎＭの濃度および約１００μＬの容量の手動滴定として添加した。
ＤＮＡ配列：
１：５’－ＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＴＴＧＡＣ／ローダミン－３’（配列番号１６）
２：５’－ＦＡＭ／ＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＴＴＧＡＣ－３’（配列番号１７）
この実験は、抗体にコンジュゲートしたＰＮＡタグが活性であり、組織上の相補的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを通してアクセス可能であることを実証する。２つのＤＮＡ配列は、同じＰＮＡに対する相補体であり、それぞれが固有のフルオロフォアを有していた。２つのフルオロフォアをＤＮＡ配列の異なる末端に配置した（５’末端にＦＩＴＣ、および３’末端にローダミン）。その結果、ＰＮＡとのハイブリダイゼーション後、ＦＩＴＣは抗体から遠い方の末端に位置していたのに対し、ローダミンは抗体に近接して位置していた。両方の場合において陽性染色が観察され、相補的ＤＮＡ配列へのハイブリダイゼーションを用いてＰＮＡを検出する能力が証明された。
別の実験では、扁桃組織を、１０塩基のＰＮＡ配列１とコンジュゲートした抗ＣＤ３および１０塩基のＰＮＡ配列２とコンジュゲートした抗ＣＤ８で染色した（ＰＮＡ配列１は、ＰＮＡ配列２と異なる）。２つのＰＮＡコンジュゲート抗体を、カクテル（混合物）として同時に添加した。次いで、ＤＮＡ配列１が、ＰＮＡ配列１に対して相補的であり、その末端にＡｌｅｘａ４８８フルオロフォアを有し、ＤＮＡ配列２が、ＰＮＡ配列２に対して相補的であり、その末端にＡｌｅｘａ６４７フルオロフォアを有するように、２つのＰＮＡ配列に対して相補的な２つの１０塩基ＤＮＡ配列。２つのＤＮＡ配列をカクテル（混合物）として添加した。蛍光画像は、本発明者らが緑色のチャネルの下を見る場合に、すべてのＣＤ３陽性細胞が示され（図２７Ａ）、本発明者らが赤入りのチャネルの下を見る場合に、すべてのＣＤ８陽性細胞が示された（図２７Ｂ）ことを示す。併せた画像により、２つのマーカーの同時局在化が示される（図２７Ｃ）。
実施例８
補体ハプテン化ＤＮＡを使用するＰＮＡの検出
この実験では、相補的ＤＮＡをハプテン（ＤＩＧ）で標識した。２つの扁桃スライドを、ウサギ抗Ｋｉ６７およびマウス抗ＣＤ４５、その後、それぞれ、ＰＮＡコンジュゲートＧＡＲおよびＰＮＡコンジュゲートＧＡＭと共にインキュベートした。ＤＩＧで標識した相補的ＤＮＡを両方のスライドと共にインキュベートし、その後、ＨＲＰを抗ＤＩＧ抗体とコンジュゲートし、ＤＡＢ沈着を行った。ＤＮＡを、約１８５ｎＭの濃度および約１００μＬの容量および３７℃の温度で手動の滴定工程として添加した。
図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃは、スライドの染色に成功し、染色パターンがマーカーの局在化と一致したことを示している。一次抗体を省略した場合には、バックグラウンドシグナルは観察されなかった。
ＤＮＡ配列：５’－ＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＴＴＧＡＣ／ＤＩＧ／－３’（配列番号１８）
図２５は、より短いＰＮＡ配列（１０塩基）を用いて同様の実験を実施したことを示す。扁桃組織を、抗Ｋｉ６７、次いで、短ＰＮＡ（１０塩基）にコンジュゲートしたＧＡＲで染色し、続いて、１０塩基のＰＮＡタグに対して相補的な１０塩基のＤＮＡ配列と共にインキュベートした。ＤＮＡ配列を、抗ＤＩＧ－ＨＲＰ抗体で染色し、続いて、ＤＡＢ沈着によって可視化するために、ＤＩＧを使用して標識した。
実施例９
クリックケミストリーによるＰＮＡ Ａｂコンジュゲーション
ＰＮＡオリゴマーを抗体にコンジュゲートする工程は以下の通りである：
（１）スルフヒドリル基（チオール）を導入するための抗体還元：Ａｂ １００μｇに１ＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）２．５μＬを添加し、３０分間インキュベートする
（２）Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（７ＭＷＣＯ）で余分なＤＴＴを除去する
（３）ＤＢＣＯ－マレイミドヘテロ二機能性リンカー（クリックケミストリーツールＡ１０８－２５から）を１：１２のＡｂ：リンカー比で添加し、一晩インキュベートする
（４）Ｚｅｂａカラムで清澄化し、１：６のＡｂ：アジド－ＰＮＡ比でアジド－ＰＮＡを添加し、一晩インキュベートする。
（５）Ｚｅｂａカラムで清澄化する。
図１９は、抗Ｋｉ６７一次抗体（ウサギｍＡｂ）およびＧＡＲ－ＰＮＡ（クリックケミストリーとコンジュゲート）と共にインキュベートし、ＳＡ－ＨＲＰで検出した扁桃組織を示す。画像は、ＰＮＡがクリックケミストリーを介して抗体にコンジュゲートするのに成功したことを示している。
実施例１０
マレイミドケミストリーによるＰＮＡ Ａｂコンジュゲーション
ＰＮＡオリゴマーを抗体にコンジュゲートする工程は以下の通りである：
（１）スルフヒドリル基（チオール）を導入するための抗体還元：Ａｂ １００μｇに１ＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）２．５μＬを添加し、３０分間インキュベートする；
（２）Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（７ＭＷＣＯ）で余分なＤＴＴを除去する；
（３）マレイミド－ＰＮＡを１：６のＡｂ：マレイミドＤＮＡ比で添加し、一晩インキュベートする；および
（４）Ｚｅｂａカラムで清澄化する。
実施例１１
Ｇｙｒｏｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ技術を使用するＰＮＡ定量化
Ｇｙｒｏｓ技術を使用したＰＮＡの定量化を実証するため、約０．０２７４ｎＭから約２０ｎＭの範囲の濃度のビオチン化ＰＮＡオリゴ（Ｂｔ－ＰＮＡ）を試験した（表１）。各濃度について、１：２の比のＢｔ－ＰＮＡとのジゴキシゲニンで標識した相補的一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡ－ＤＩＧ）を、最初に室温でハイブリダイズさせた後、二連のＧｙｒｏｓによって解析した。検出は、Ｍｓ－抗ＤＩＧ、続いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７－ＧＡＭを使用して達成した。Ｇｙｒｏｓプログラムを使用して四点曲線（表１を参照されたい）を当てはめ、０．９９８を超えるＲ２を有する標準曲線を生成した。特に、最低ＰＮＡ濃度のシグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）は、約１０であり、ＰＮＡまたはｓｓＤＮＡによる非常に低いバックグラウンドシグナルが示唆された。
Figure 2023113642000019
抗体コンジュゲートから切断されたＰＮＡを定量化することができ、ＰＮＡの切断後に抗体をさらに染色することができることをさらに実証するために、図３３に示されている実験を実施した。３つの抗体（Ｋｉ６７、ＣＤ８およびＰＤ－Ｌ１）をＢｔ－ＰＮＡ－１とコンジュゲートさせ、正常な扁桃組織切片におけるそれぞれのマーカーの検出に使用した。ほとんどの組織処理工程を、Ｖｅｎｔａｎａ ＢｅｎｃｈＭａｒｋ ＸＴ自動染色機を使用して実施した。標準的な抗原賦活化の後、ＰＮＡで標識した一次抗体を組織に適用し、約３７℃で約１６分間インキュベートした。次いで、スライドを組織染色液から取り出し、反応緩衝液および水ですすいだ。各スライドに２０ｍＭのＴＣＥＰ溶液約１００μＬを添加し、湿度ボックス内で約２０分間インキュベートした。切断されたＰＮＡを含有する８０マイクロリットルの溶液を採取し、Ｇｙｒｏｓによって（本明細書に記載の技法を使用することによってなど）さらに定量化した。ＰＮＡ切断後のスライドを自動染色装置に戻し、Ｖｅｎｔａｎａ ＵｌｔｒａＶｉｅｗ ＤＡＢユニバーサル検出キットを使用して、一次抗体をさらに検出した。
切断されたＢｔ－ＰＮＡの定量化は、先に記載されたものと同じ手順に従って、過剰の相補的一本鎖ＤＮＡ－ジゴキシゲニンとのハイブリダイゼーションによって達成された。結果を表２にまとめた。結果は、組織染色のための抗体コンジュゲート由来のＰＮＡを切断することに成功し、Ｇｙｒｏｓ技術を使用してさらに定量化することができることを明確に示唆している。
表２:組織から切断されたPNAの定量
Figure 2023113642000020
ＰＮＡの切断後、図３４Ａおよび３４Ｂに示されているように、全く同じ組織切片上の抗体は、ＰＮＡでコードされたマーカーの可視化のために、標準ＩＨＣによって依然として染色することができる。各マーカーの特異的染色が観察され、切断条件が、組織に対するまたはマーカーへの抗体の結合に対する顕著なダメージを引き起こさなかったことが示唆された。この結果は、定量化と、ＦＦＰＥ組織中のバイオマーカーの空間分布の可視化とを組み合わせた新しい方法を示唆しており、これは抗体－ＰＮＡコンジュゲートの固有の利点である。
実施例１２－Ｇｙｒｏｓ技術によって検出した異なるＰＮＡオリゴマーの比較
実施例１１に示した手順を利用した。以下のＰＮＡオリゴマーおよびＤＮＡオリゴマーを比較した：
ＰＮＡ１：ビオチン－ｏ－ＧＴＣＡＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧ－Ｌｙｓ（Ｃ６ＳＨ）－３’
ｓＰＮＡ１：ビオチン－ｏ－ＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧ－Ｌｙｓ（ＳＭＣＣ）
ガンマＰＮＡ（ｇＰＮＡ）：ビオチン－Ｏ－ＧＴ＊－ＣＡＡ＊－ＣＣＡ＊－ＴＣＴ＊－ＴＣＡ＊－Ｇ－Ｌｙｓ（ＳＭＣＣ）
短ガンマＰＮＡ（ｓｇＰＮＡ）：ビオチン－Ｏ－ＣＣＡ＊－ＴＣＴ＊－ＴＣＡ＊－Ｇ－Ｌｙｓ（ＳＭＣＣ）
ＤＮＡ：ビオチン－ＧＴＣＡＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧ
検出用ｃＤＮＡ－ＤＩＧ：５’－ＤＩＧ－ＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧ－３’
試験したＰＮＡの最終濃度：２５０ｐＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭおよび２ｐＭ
検出用ｃＤＮＡ－ＤＩＧの最終濃度：２５ｎＭ
ＰＮＡまたはＤＮＡオリゴマーを、Ｇｙｒｏｓで解析する前に、室温で、ｃＤＮＡ－ＤＩＧと共にインキュベートした。解析の結果を図３５Ａおよび３５Ｂに示す。
図３５Ａに示されているように、すべてのＰＮＡオリゴマーは、最も低い濃度（２ｐＭ）で検出することができたが、ＤＮＡオリゴマーは同じ濃度で検出することができなかった（低いＳ／Ｂ比）。すべての濃度では、ＰＮＡオリゴマーからの応答は、ＤＮＡオリゴマーよりもはるかに高かった。このことは、ＰＮＡ－ＤＮＡハイブリッドの優れた安定性を実証した。異なるＰＮＡ間の応答の差は有意ではなかった。
図３５Ｂは、ＰＮＡオリゴマーのシグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比が、とりわけより低い濃度で、対応するＤＮＡオリゴマーよりもはるかに高かったことを示す（パネルの下方）。全体として、結果は、ＰＮＡオリゴマー（１０－ｍｅｒの配列でさえも）が、Ｇｙｒｏｓを使用して低いｐＭ濃度まで定量できることを示唆した。一方、同じ配列を有するＤＮＡオリゴマー（１５－ｍｅｒ）は、このような低いｐＭ濃度まで定量できなかった。さらに、ガンマＰＮＡオリゴマーは、対応するＰＮＡオリゴマーと比較してより高いＳ／Ｂ比をもたらした。
実施例１３Ａ
この実施例では、扁桃組織を、Ｋｉ６７（ウサギＡｂ）で、次いで、ＰＮＡ配列（ＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧ）にコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）抗体で染色した。ＰＮＡオリゴマーに対して相補的であり、その末端にＤＩＧレポーター部分を有するＤＮＡ配列を、スライド上で、ＧＡＲ－ＰＮＡと共にインキュベートした。洗浄後、抗ＤＩＧ：ＨＲＰ Ａｂを添加した。次に、ＤＡＢを沈着させて、褐色のシグナルを生じさせた。シグナルの存在は、シグナルがＤＮＡ上のＤＩＧの存在を必要とすることから、ＤＮＡがＰＮＡにハイブリダイズすることに成功したことを示す。シグナルの非存在（図３６Ａに示されているように）は、この実験条件で（２００ｎＭのＤＮＡ、３７℃、３０分）、ＤＮＡがハイブリダイズしなかったことを示した。ＤＮＡ ＰＮＡの親和性は、この実験条件では、このような短ＰＮＡ配列とのハイブリダイゼーションを確保する程には強くないと考えられる。
実施例１３Ｂ
この実験では、実施例１３ＡからのＰＮＡを、ガンマＰＮＡ（１５塩基であるが、１０塩基のみが同じＤＮＡ配列に対して相補的である）と置き換える。実施例１３Ａと同じ実験条件を適用した。実施例１２と比較すると、シグナルの存在は、ガンマＰＮＡ／ＤＮＡ二本鎖が、同じハイブリダイズ配列のおよび同じ条件でのＰＮＡ／ＤＮＡよりもさらにより安定であることを示す（図３６Ｂを参照されたい）。実際に、シグナルの存在は、ガンマＤＮＡがガンマＰＮＡにハイブリダイズし、褐色のシグナルを生じることを示した。実験条件が実施例１３Ａと同じであるため、この実験は、ガンマＰＮＡ ＤＮＡの親和性が、ＰＮＡ ＤＮＡよりも高いことを示し、これは、実施例１３Ａにおけるように、短ＰＮＡと比較して、ガンマＰＮＡの優位性を示すものである。
本明細書で言及されおよび／または出願データシートに列挙されている米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許文献はすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要に応じて、さらなる実施形態を提供するために様々な特許、出願および刊行物の概念を採用するように修正することができる。
本明細書の開示は、特定の実施形態を参照して説明されているが、これらの実施形態は、単に本開示の原理および用途の例示に過ぎないことが理解されるべきである。したがって、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、例示的な実施形態に対して多数の修正をなすことができ、他の構成を考案することができることが理解される。

Claims (47)

  1. 式（ＩＩＢ）の構造を有するＰＮＡコンジュゲート：
    Figure 2023113642000021
    ［式中、
    「特異的結合体」は、抗体、抗体断片、薬物／抗体複合体、および核酸からなる群から選択され；
    「リンカー」は、２から８０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
    「ＰＮＡ」は、ガンマ炭素の位置に置換基を含む少なくとも１つのヌクレオチドを有するＰＮＡ配列であり；
    Ｘは、ビオチン、酵素、色素原、フルオロフォア、ハプテン、および質量分析タグからなる群から選択され；
    Ｙは、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
    ｍは、０または１から６の範囲の整数であり；
    ｚは、０または１であり；
    ｎは、１から１２の範囲の整数である］。
  2. 「特異的結合体」が、抗体である、請求項１に記載のＰＮＡコンジュゲート。
  3. 少なくとも１つの置換されたヌクレオチドが、リジン残基、２０個未満のアミノ酸を有するペプチド配列、ポリマー、およびｍｉｎｉＰＥＧからなる群から選択される、請求項１または２に記載のＰＮＡコンジュゲート。
  4. 少なくとも１つのレポーター部分が、少なくとも１つの置換されたヌクレオチドに連結している、請求項３に記載のＰＮＡコンジュゲート。
  5. ｍが０であり、ｚが０であり、ｎが１より大きい、請求項１から４のいずれか一項に記載のＰＮＡコンジュゲート。
  6. ｎが、２から６の範囲の整数である、請求項５に記載のＰＮＡコンジュゲート。
  7. 「リンカー」が、少なくとも１つの親水性基を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のＰＮＡコンジュゲート。
  8. 「リンカー」が、式（ＩＶＡ）に示される構造を有する：
    Figure 2023113642000022
    ［式中、
    ｄおよびｅは、それぞれ独立して、２から２０の範囲の整数であり；
    Ｑは、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；
    ＲａおよびＲｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌ、またはＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；
    ＲｃおよびＲｄは、独立して、ＣＨ３またはＨであり；
    ＡおよびＢは、独立して、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基である］、請求項１から７のいずれか一項に記載のＰＮＡコンジュゲート。
  9. ｄおよびｅが、２から６の範囲の整数である、請求項８に記載のＰＮＡコンジュゲート。
  10. ＡまたはＢの少なくとも一方が、切断可能な部分を含む、請求項８に記載のＰＮＡコンジュゲート。
  11. 切断可能な部分が、光開裂性基である、請求項１０に記載のＰＮＡコンジュゲート。
  12. 切断可能な部分が、化学的に切断可能な基である、請求項１０に記載のＰＮＡコンジュゲート。
  13. 「特異的結合体」が、抗体であり、「リンカー」が、少なくとも１つのアルキレンオキシド基を含み、ｍが０であり、ｚが０であり、ｎが１より大きい、請求項１から１２のいずれか一項に記載のＰＮＡコンジュゲート。
  14. 「特異的結合体」が、抗体であり、「リンカー」が、少なくとも１つのアルキレンオキシド基を含み、ｎが１より大きい、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＰＮＡコンジュゲート。
  15. 「リンカー」が、少なくとも１つの切断可能な部分をさらに含む、請求項１４に記載のＰＮＡコンジュゲート。
  16. Ｘが、ハプテンである、請求項１５に記載のＰＮＡコンジュゲート。
  17. 式（ＩＩＩ）の構造を有するＰＮＡオリゴマー：
    Figure 2023113642000023
    ［式中、
    Ｔが、１から４個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳで置換されていてもよく、末端反応性部分を有する基であり；
    「リンカー」が、２から８０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
    「ＰＮＡ」が、ガンマ炭素の位置に置換基を含む少なくとも１つのヌクレオチドを有するＰＮＡ配列であり；
    Ｘが、ビオチン、酵素、色素原、フルオロフォア、ハプテン、および質量分析タグからなる群から選択され；
    Ｙが、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
    ｍが、０または１から６の範囲の整数であり；
    ｚが、０または１である］。
  18. 少なくとも１つの置換されたヌクレオチドが、リジン残基、２０個未満のアミノ酸を有するペプチド配列、ポリマー、およびｍｉｎｉＰＥＧからなる群から選択される、請求項１７に記載のＰＮＡオリゴマー。
  19. 少なくとも１つのレポーター部分が、少なくとも１つの置換されたヌクレオチドに連結している、請求項１７または１８に記載のＰＮＡコンジュゲート。
  20. ｍが０であり、ｚが０であり、ｎが１より大きい、請求項１７から１９のいずれか一項に記載のＰＮＡオリゴマー。
  21. ｎが、２から６の範囲の整数である、請求項１７から２０のいずれか一項に記載のＰＮＡオリゴマー。
  22. 「リンカー」が、式（ＩＶＡ）に示される構造を有する：
    Figure 2023113642000024
    ［式中、
    ｄおよびｅは、それぞれ独立して、２から２０の範囲の整数であり；
    Ｑは、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；
    ＲａおよびＲｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌ、またはＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；
    ＲｃおよびＲｄは、独立して、ＣＨ３またはＨであり；
    ＡおよびＢは、独立して、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基である］、請求項１７から２１のいずれか一項に記載のＰＮＡオリゴマー。
  23. ｄおよびｅが、２から６の範囲の整数である、請求項２２に記載のＰＮＡオリゴマー。
  24. ＡまたはＢの少なくとも一方が、切断可能な部分を含む、請求項２２に記載のＰＮＡオリゴマー。
  25. 切断可能な部分が、光開裂性基である、請求項２４に記載のＰＮＡオリゴマー。
  26. 切断可能な部分が、化学的に切断可能な基である、請求項２４に記載のＰＮＡオリゴマー。
  27. 請求項１７から２６のいずれか一項に記載のＰＮＡオリゴマーおよび特異的結合体を含むＰＮＡコンジュゲート。
  28. 特異的結合体が、一次抗体であり、ＰＮＡ配列またはガンマＰＮＡ配列が、５から３０個の塩基を含む、請求項２７に記載のＰＮＡコンジュゲート。
  29. 請求項１７から２６のいずれか一項に記載のＰＮＡオリゴマーを特異的結合体と反応させることを含む、ＰＮＡコンジュゲートを合成する方法。
  30. 試料中の標的を検出する方法であって、
    試料を第１のＰＮＡコンジュゲートと接触させることであって、第１のＰＮＡコンジュゲートが、式（ＩＩＢ）：
    Figure 2023113642000025
    ［式中、
    「特異的結合体」は、抗体、抗体断片、薬物／抗体複合体、および核酸からなる群から選択され；
    「リンカー」は、２から８０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
    「ＰＮＡ」は、ガンマ炭素の位置に置換基を含む少なくとも１つのヌクレオチドを有するＰＮＡ配列であり；
    Ｘは、ビオチン、酵素、色素原、フルオロフォア、ハプテン、および質量分析タグからなる群から選択され；
    Ｙは、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
    ｍは、０または１から６の範囲の整数であり；
    ｚは、０または１であり；
    ｎは、１から１２の範囲の整数である］
    の構造を有する、接触させることと；
    試料を第１の検出試薬と接触させて、ＰＮＡコンジュゲートの検出を容易にすること
    とを含む、方法。
  31. 「特異的結合体」が、一次抗体であり、一次抗体が、第１の標的に特異的である、請求項３０に記載の方法。
  32. 「特異的結合体」が、二次抗体であり、方法が、試料を第１のＰＮＡコンジュゲートと接触させる前に、試料を第１の標的に特異的な一次抗体と接触させる工程をさらに含み、第１のＰＮＡコンジュゲートは、第１の一次抗体に特異的である、請求項３０または３１に記載の方法。
  33. 第１の検出試薬が、ＰＮＡコンジュゲートの標識に特異的な抗標識抗体である、請求項３０から３２のいずれかに記載の方法。
  34. 標識が、ハプテンであり、抗標識抗体が、抗ハプテン抗体である、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 検出試薬が、第１のＰＮＡコンジュゲートのＰＮＡ配列またはガンマＰＮＡ配列に対して相補的なＰＮＡまたはＤＮＡ配列を含み、相補的なＰＮＡまたはＤＮＡ配列が、レポーター部分にコンジュゲートしている、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. レポーター部分が、フルオロフォアである、請求項３５に記載の方法。
  37. レポーター部分が、ハプテンであり、方法が、試料を相補的なＰＮＡまたはＤＮＡ配列のハプテンに特異的な抗ハプテン抗体と接触させることをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
  38. 試料中の標的を検出する方法であって、
    試料を第１のＰＮＡコンジュゲートと接触させることであって、第１のＰＮＡコンジュゲートが、式（ＩＩＢ）：
    Figure 2023113642000026
    ［式中、
    「特異的結合体」は、抗体、抗体断片、薬物／抗体複合体、および核酸からなる群から選択され；
    「リンカー」は、２から８０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり、「リンカー」は、切断可能な部分を含み；
    「ＰＮＡ」は、ガンマ炭素の位置に置換基を含む少なくとも１つのヌクレオチドを有するＰＮＡ配列であり；
    Ｘは、ビオチン、酵素、色素原、フルオロフォア、ハプテン、および質量分析タグからなる群から選択され；
    Ｙは、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
    ｍは、０であり；
    ｚは、０であり；
    ｎは、１から１２の範囲の整数である］
    の構造を有する、接触させることと；
    試料を試薬と接触させて、「リンカー」上の切断可能な部分を切断すること、
    切断された「ＰＮＡ」配列の量を定量すること
    とを含む、方法。
  39. ＰＮＡ配列の量の定量が、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ技術、Ｇｙｒｏｓ技術、または質量分析を使用して行われる、請求項３８に記載の方法。
  40. 切断可能な基が、光開裂性基、化学的に切断可能な基、または酵素的に切断可能な基からなる群から選択される、請求項３８または３９に記載の方法。
  41. ＰＮＡ配列が切断される特異的結合体を可視化することをさらに含む、請求項３８から４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 式（ＩＢ）のコンジュゲート：
    Figure 2023113642000027
    ［式中、
    「特異的結合体」は、抗体、抗体断片、薬物／抗体複合体、および核酸からなる群から選択され；
    「リンカー」は、２から８０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
    Ｚは、ガンマ炭素の位置に置換基を含む少なくとも１つのヌクレオチドを有するＰＮＡ配列であり；
    Ｘは、ビオチン、酵素、色素原、フルオロフォア、ハプテン、および質量分析タグからなる群から選択され；
    Ｙは、１から１２個の炭素原子を有し、１つまたは複数のＯ、Ｎ、またはＳヘテロ原子を有していてもよい、分岐または非分岐、直鎖または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の基であり；
    ｍは、０または１から６の範囲の整数であり；
    ｚは、０または１であり；
    ｎは、１から１２の範囲の整数である］。
  43. 「特異的結合体」が、一次抗体である、請求項４２に記載のコンジュゲート。
  44. ＰＮＡ配列が、約５から約３０個の塩基を有する、請求項４２または４３に記載のコンジュゲート。
  45. ＰＮＡ配列が、約１０個の塩基を有する、請求項４２から４４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  46. 少なくとも１つの置換されたヌクレオチドが、リジン残基、２０個未満のアミノ酸を有するペプチド配列、ポリマー、およびｍｉｎｉＰＥＧからなる群から選択される、請求項４２から４５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  47. 少なくとも１つのレポーター部分が、少なくとも１つの置換されたヌクレオチドに連結される、請求項４６に記載のコンジュゲート。
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