JP2018522580A - 安定性が増加されたヒト繊維芽細胞成長因子−2変異体及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)前記形質転換体を培養するステップ;及び
(b)前記ステップ(a)で得られた培養液から変異体を分離するステップ。
(c)前記形質転換体を細胞破砕し、凝集体を分離するステップ;
(d)前記分離された凝集体を除去するステップ;
(e)前記凝集体が除去された上清をイオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いて分離精製するステップ;及び
(f)前記イオン交換樹脂後、高安定性塩基性繊維芽細胞成長因子変異体をヘパリン親和クロマトグラフィーを用いて分離精製するステップを含む。
DNAコンストラクション(construction)
タンパク質の発現ベクターであるpET21a(図1)と発現用E.coli菌株ではBL21(DE3)、Rosetta(DE3)をNovagenから購入し、クローニング用E.coli菌株はTop10を用いた。遺伝子組換え時に使用された制限酵素はすべてNEB(New England Biolabs)の製品であり、リガーゼはRoche社のT4 DNAリガーゼである。PCR時に使用されたEx taq DNAポリメラーゼはTakara社の製品であり、点突然変異に使用されたpfuUltraTMHF DNAポリメラーゼは、Agilent社の製品である。DNAゲル抽出キット、プラスミドミニプレップキットは(株)コスモジンテックの製品である。また、プライマーは(株)コスモジンテックで製作し、DNAシーケンシングも(株)コスモジンテックに依頼して行った。
発現誘導体であるIPTG(isopropyl−1−thio−β−D−galactopyranoside)と抗生剤として用いられたアンピシリンとクロラムフェニコールはすべてSigma社から購入した。E.coli培養LB培地を作製するときに使用したバクトトリプトン、酵母エキスはBD(Becton Dicknson)社から購入し、NaClはトクヤマ製品を使用した。
精製過程で使用される試薬は、可能な限り純度の高い製品を使用し、精製過程で使用した試薬は、以下の通りである。一塩基性リン酸ナトリウム(Sigma)、二塩基性リン酸ナトリウム(Sigma)、塩化ナトリウム(Sigma)である。FPLCで使用されたカラムはGE healthcareのSP−sephrose、ヘパリン親和性カラムを使用した。
FPLCはGE UPC−800を使用した。
CDはJasco社J−810 spectropolarimeterを使用した。
相同性モデリングはモデラー(Andrej Sali lab)を用いた。
エネルギーミニマイゼーションはキメラに含まれるAmber 99FF force filedを使用した。
ジスルフィド結合の形成による予測は、YASARA Web serverを用いた。
ジスルフィド結合が可能な距離を測定するploting programはProtein contact map visualization(Andreas Viklund.)を用いた。
PDBに登録された4FGF、1BLA 1BLDを用いた。
変異体bFGFを生産するための発現ベクターとしてpET21aベクター(Novagen)を使用した。天然型(wild type)bFGF遺伝子は(株)PnP biopharmから得、これを下記プライマーを用いてPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)を介して、天然型を増幅させた。このように得られたPCR産物をpET21aベクターに制限酵素であるNdeI,XhoIを処理した後、挿入して接合させた。
bFGFの安定性を増加させるために、タンパク質の構造(PDB:4FGF)と分子モデル方法を通じて変化させるアミノ酸部分を探し、下記プライマー(下記実施例4)を使用してpfu UltraTMDNAポリメラーゼを用いてQuikchange突然変異誘発法を用いて増幅させた。使用した天然型bFGF鋳型を除去するためにDpnI反応を進行してTop10に形質転換(transformation)させ、シーケンスを通じて変異体(mutant)を確認した。
bFGFが挿入された組換えベクターをE.coli BL21(DE3)に熱ショック法で形質転換させた。このE.coli菌株を50ug/mlアンピシリンを含む500ml LB培地に接種してO.D600値が0.6になるまで37℃で育てた。その後0.5mM IPTG(isopropyl−1−thio−β−D−galactopyranoside)を入れて4時間培養した後O.D600値が2.0以上になると8000rpmで10分間遠心分離してcellを取った。
bFGFタンパク質を発現させたE.colilからタンパク質を得るために、細胞を破砕した。収集した細胞に20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁し、4℃で超音波破砕機で破砕した。この後、13000rpmで15分間、4℃で遠心分離して不溶性物質(inclusion body)を除去した後、上清を取ってSDS−PAGEで確認した。
超音波処理によって破砕された細胞溶解液を4℃で13000rpmで15分間遠心分離した。上清をとって0.45umフィルターを用いてフィルタリングをし、この溶液をFPLC(Fast performance liquid chromatography)SPカラムとヘパリンカラムを用いて精製した。このとき、精製条件は、20mMリン酸ナトリウム(pH7.0)緩衝液に100mM NaCl溶液Aと20mMリン酸ナトリウム(pH7.0)緩衝液に1M NaCl BをSPカラムに2ml/分の速度で0%Aから100%Bまで直線勾配で流して溶出させた後、約18KDaサイズのbFGFタンパク質を含む画分を集めた。その後、20mMリン酸ナトリウム(pH7.0)緩衝液に500mM NaCl溶液Aと20mMリン酸ナトリウム(pH7.0)緩衝液に2M NaCl Bをヘパリン親和性カラムに2ml/分の速度で0%Aから100%Bまで直線勾配で流して溶出させた後、約18KDaサイズのbFGFタンパク質を含む画分を集めた。このとき、bFGFを含む画分をSDS−PAGE分析法で確認した後、定量を行った。
PDBに登録されたタンパク質の構造である1BLA(NMR)を用いて、ジスルフィド結合が可能な候補群を設定した。タンパク質接触マップ可視化(Protein contact map visualization)プログラムを用いて、2個のアミノ酸のC−alpha炭素の距離が7Å以下、C−beta炭素の距離が5Åである残基をプロット(plot)を用いて分析した。その後Yasara energy minimization serverを用いて、ジスルフィド結合の生成の有無を分析し、キメラのAMBER force filed FF99を用いて、エネルギーミニマイゼーションを行った。その後、生成されたタンパク質の構造を天然型のbFGF整列(align)させてRMSDを測定0.5以下の値を有する構造を実験で行った。
天然型bFGFと変異体の構造分析及びTM測定のために、それぞれbFGFを20mMリン酸ナトリウム(pH7.0)に溶かし、最終濃度が0.2mg/mlとなるように一定にする。そして0.1cm cellに入れ190nm〜250nmの領域にバンド幅1nm、応答0.25秒、データピッチ0.1nm、スキャン速度20nm/分、セル長1cm、蓄積(accumulation)8回、温度は20℃の条件で構造を分析した。温度安定度を分析するために融解温度は、20℃と95℃での205nmの波長で0.1cm cellに0.2mg/mlの濃度で行った。条件は、1℃/分の条件で、20℃〜95℃まで測定した。
作製された天然型bFGFと変異体が実際に活性を示すか否かを確認するために、細胞増殖能力を用いた実験を(株)ジェネウェルに依頼して行った。実験に使用したNIH−3T3 cellは10%熱不活性化されたウシ胎児血清、100units/mlのペニシリン、100mg/mlのストレプトマイシンを含むDMEM完全培地を用いて維持した。96well培養プレートに2x103 cells/wellのNIH−3T3 cellを分株(seeding)した。24時間培養したNIH−3T3 cellは無血清DMEM培地で飢餓(starvation)させた後、0.5%FBSを含むDMEM培地にサンプル溶液をそれぞれの濃度別に処理し、72時間培養した。培養後、10ulのMTT[3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムブロミド]溶液を添加し、2時間反応させた後に用いて100ulのDMSOにホルマザン結晶を溶解させた。吸光度は分光光度計を用いて540nmの波長で測定した。薬剤に対する感受性は、薬剤を処理していないwell(対照群)の吸光度に対する薬剤処理wellでの割合で比較した。
室温で保管程度を確認するために、天然型bFGFと変異体のインキュベーションテストを行った。1XPBS(pH7.3)で、それぞれの天然型FGF−2と変異体を0.5mg/mlに溶かした後、37℃、50℃と60℃water bathでインキュベーションを行った。24時間単位でサンプリング(sampling)して13000rpmで15分間、4℃で遠心分離して上清のみを得てNano dropによる定量及びHPLC分析を行った。
ヒト単核細胞cDNAライブラリーを鋳型にしてプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応によりbFGFをコードするDNAを準備した。使用したプライマーの塩基配列は、以下の通りである:
アンチセンスプライマー3’−TGATGAGGATCCTCATCAGCTCTTAGCAGACAT−5’(配列番号4)。
発現プラスミドpSSB−bFGFでE.coli BL21(DE3)に熱ショックで形質転換させた。形質転換後、固体培地に生じる、アンピシリンに耐性のあるコロニーを選別して、10mlのLB培地(LB/アンピシリン)に接種した。37℃で12時間培養した後、100%グリセロール(glycerol)と1:1で混ぜて−70℃にストックを保管した。
実施例2で作製したストックを10mlのLB培地(LB/アンピシリン)に接種した後、12時間以上培養した。その後、500mlのLB培地(LB/アンピシリン)に移し、600nmで吸光度がO.D0.4〜0.5のときにIPTG(isopropyl−1−thio−β−D−galactopyranoside)を最終濃度が0.5mMになるように入れた。37℃で4時間、200rpmの速度で振とう培養した後、8000rpmで10分間遠心分離して大腸菌ペレット(pellet)を得た。このペレットを25mlの20mMリン酸ナトリウム(pH7.0)緩衝液に懸濁させた後、超音波処理方法で細胞を破砕した。
天然型のpSSB−bFGFプラスミドを鋳型としてpfuUltraTMHF DNAポリメラーゼを用いて、それぞれの変異体に該当する二つの相補的なプライマーを用いてPCRによりpSSB−bFGF変異体プラスミドを作製した。そしてDpnIを用いて、鋳型であった天然型のpSSB−bFGFプラスミドを切断した後、E.coli Top10に熱ショックで形質転換させた。形質転換後、固体培地に生じるアンピシリンに耐性のあるコロニーを選別して、10mlのLB培地(LB/アンピシリン)に接種した。37℃で16時間培養した後、DNA prepを実施して得られたDNAをシーケンシングを通してpSSB−bFGF変異体プラスミドを確認した。このとき使用したプライマーの塩基配列は、以下の通りである:
前記bFGF変異体の発現プラスミドのそれぞれに、実施例2と同じ方法でE.coli BL21(DE3)に形質転換させ、ストックを作製し、LB培地(LB/アンピシリン)500mlに培養して、実施例3と同じ方法で精製して、それぞれ約18KDaの大きさのbFGFを得た。このとき得られた変異体の量は、変異体によってその差があり、変異体によって約4〜12mgのbFGFを得ることができ、純度は98%以上であった。
J−810分光計(JASCO)を使用して円偏光二色性分析を通じて、実施例5の精製されたbFGF変異体の構造と熱安定性を測定した。天然型bFGFは、実施例3で精製されたbFGFを使用した。構造分析のために、それぞれのbFGFを20mMリン酸ナトリウム(pH7.0)に溶かし、最終濃度が0.1mg/mlになるように一定にする。そして0.1cm cellに入れ190nm〜250nmの領域にバンド幅1nm、応答0.25秒、データピッチ0.1nm、スキャン速度20nm/min、セル長1cm、蓄積(accumulation)8回、温度は20℃の条件で構造を分析した。
作製された天然型bFGFと変異体のうち可溶性と円偏光二色性を用いた構造とTmの結果の分析を通じて、良い結果をbFGFを選定して、細胞増殖検定を実施した。細胞増殖検定は、(株)ジェネウェルに依頼してbFGFの敏感な皮膚細胞であるNIH3T3細胞株をもって行った。実験方法としては、NIH−3T3 cellを10%熱不活性化されたウシ胎児血清、100units/mlのペニシリン、100mg/mlのストレプトマイシンを含むDMEM完全培地を用いて維持した。96well培養プレートに2×103cells/wellのNIH−3T3 cellを播種した。24時間培養したNIH−3T3 cellは無血清DMEM培地で飢餓させた後、0.5%FBSが含まれたDMEM培地にサンプル溶液をそれぞれの濃度別に処理し、72時間培養した。培養後、10ulのMTT[3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムブロミド]溶液を添加し、2時間反応させた後に用いて、100ulのDMSOにホルマザン結晶を溶解させた。吸光度は分光光度計を用いて540nmの波長で測定した。薬剤に対する感受性は、薬剤を処理していないwell(対照群)の吸光度に対する薬剤処理wellでの割合で比較した。図6及び図12に示すようにbFGF変異体が天然型bFGFと同様の細胞増殖能力を示している。
天然型bFGFと変異体[配列番号1の69番目及び87番目のシステインのみがセリンに置換されたbFGF変異体(Cys→Ser変異体)、配列番号1の75番目のアラニンのみがシステインに置換されたbFGF変異体(天然型+ジスルフィド結合)及びK75変異体(Cys→Ser変異体+ジスルフィド結合、配列番号1の69番目及び87番目のシステインがセリンに置換され、75番目のアラニンがシステインに置換されたbFGF変異体)の安定性を確認するために、37℃短期間インキュベーションテストを行った。人体の状態に最も近いPBS(Phosphate buffer saline)状態で天然型bFGFと変異体を0.5mg/mlに溶かした後、37℃であるwater bathでインキュベーションした。48時間、7日、10日単位でサンプリングして13000rpmで15分間、4℃で遠心分離して上清のみを得、Nano dropを用いて、タンパク質を定量した。時間が経つにつれ、天然型bFGFと変異体の濃度を定量し、天然型bFGFが変異体に比べてより大きな減少を示した。前記の結果を表3に示した。
天然型bFGFとK75変異体(Cys→Ser変異体+ジスルフィド結合、配列番号1の69番目及び87番目のシステインがセリンに置換され、75番目のアラニンがシステインに置換されたbFGF変異体)及びHsbFGF K75変異体(Cys→Ser変異体+ジスルフィド結合、配列番号1の69番目及び87番目のシステインがセリンに置換され、75番目のアラニンがシステインに置換されて、50番目のヒスチジンがチロシンに置換されたbFGF変異体)の安定性を確認するために、50℃で1週間、60℃で5日間インキュベーションテストを行った。PBS(Phosphate buffer saline)でそれぞれの天然型bFGFと変異体を0.5mg/mlに溶かした後、50℃、60℃のwater bathでインキュベーションした。日付によるサンプリングをして13000rpmで15分間、4℃で遠心分離して上清のみを得てHPLC及びUV分光計を用いてタンパク質を分析した。
Claims (12)
- 配列番号1のアミノ酸配列内の2個以上のアミノ酸がセリンに置換され、1個以上のアミノ酸がシステインに置換された、高安定性塩基性繊維芽細胞成長因子(stable basic fibroblast growth factor、bFGF)変異体(mutant)。
- 前記変異体は、配列番号1の69番目及び87番目システインをセリンに置換した後、さらに他の残基をシステインに置換して、分子内ジスルフィド結合を誘導させた、請求項1に記載の変異体。
- 前記システインに置換されたアミノ酸は、配列番号1のアミノ酸配列で26番目リジン、34番目イソロイシン、40番目バリン、50番目ヒスチジン、52番目のリジン、75番目アラニン、76番目メチオニン、117番目アラニン、67番目グリシン、68番目バリン、70番目アラニン、82番目ロイシン、84番目アラニン、108番目セリン、136番目アラニン、137番目イソロイシン、138番目ロイシン及び144番目アラニンからなる群から選択された1種以上であることを特徴とする、請求項1に記載の高安定性bFGF変異体。
- 前記変異体は、配列番号1の69番目及び87番目システインがセリンに置換され、75番目アラニンがシステインに置換され、50番目ヒスチジンがチロシンに置換された、請求項1に記載のbFGF変異体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異体をコードする遺伝子。
- 前記遺伝子は、配列番号2のDNA塩基配列からなることを特徴とする、請求項5に記載の遺伝子。
- 請求項5に記載のDNA塩基配列を含む、発現ベクター。
- 請求項6に記載の発現ベクターによって形質転換された、形質転換体。
- 次のステップを含む高安定性塩基性繊維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor、bFGF)変異体(mutant)の生産方法:(a)請求項8に記載の形質転換体を培養するステップ;及び(b)前記ステップ(a)で得られた培養液から変異体を分離するステップ。
- 前記(b)ステップは、(c)前記形質転換体を細胞破砕し凝集体を分離するステップ;(d)前記分離された凝集体を除去するステップ;(e)前記凝集体が除去された上清をイオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いて分離精製するステップ;及び(f)イオン交換樹脂後に高安定性塩基性繊維芽細胞成長因子変異体をヘパリン親和クロマトグラフィーを用いて分離精製するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の高安定性bFGF変異体を有効成分として含む皮膚状態の改善用化粧料組成物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の高安定性bFGF変異体を有効成分として含む皮膚疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
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