JP2018522566A - 操作されたcrispr−cas9組成物及び使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国仮特許出願第62/202,715号(2015年8月7日出願、現在係属中)、及び米国仮特許出願第62/209,334号(2015年8月24日出願、現在係属中)の利益を主張し、これらの内容は、それら全体として参照により本明細書に加入される。
該当なし。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、かつその全体として参照により本明細書に加入される配列表を含む。2016年8月5日に作成されたASCIIコピーは、CBI017-30_ST25.txtという名称で51kbのサイズである。
本発明は、操作されたII型CRISPR-Cas9関連(Associated)分断ネクサス(split-nexus)ポリヌクレオチド、系、組成物、及び使用方法に関する。
ゲノム工学は、特定の核酸配列を欠失、挿入、変異又は置換することによりゲノムを変更することを含む。変更は、遺伝子特異的でも位置特異的でもよい。ゲノム工学は、DNAを切除するためにヌクレアーゼを使用することができ、それにより変更のための部位を生成する。特定の場合には、切除が標的DNAにおいて二本鎖切断を導入し得る。二本鎖切断は、例えば、内在性非相同末端結合(NHEJ)又は相同組換え修復(homology-directed repair)(HDR)により修復され得る。HDRは、修復のためのテンプレートの存在に依存する。ゲノム工学のいくつかの例において、ドナーポリヌクレオチド、又はその部分が切断部に挿入され得る。
A.らにより記載されるヘアピンモジュール)は、ヌクレアーゼローブの外面に結合するということを示した。彼らは、「活性に重要であると最近示されたネクサスモチーフ」(Wright, A. V.ら、2986頁、カラム1)が、ローブ間の中央の位置を占め、そして架橋螺旋と大きな相互作用を形成すると示した。この相互作用プロフィールに基づいて、Wright, A. V.らは、全長sgRNA及び5’末端又は3’末端のいずれかから選択的に切断された2つのより短いsgRNA構築物(重要なネクサスヘアピンに対する改変は行われなかった)を生成し、そして野生型Cas9、個々のα-螺旋及びヌクレアーゼローブ、並びに分断(split)-Cas9に対する親和性を決定した。
本発明の局面は、少なくとも2つのポリヌクレオチドがネクサスステムエレメントを形成するために必要とされる、操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系に関する。
的核酸に部位特異的結合することができる。さらに、本発明は、上記のII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド/Cas9タンパク質核タンパク質複合体並びに、例えば、緩衝液及び/又は使用についての指示書を含むキットを含む。本発明の方法は、標的核酸を切除する方法及び標的核酸を結合する方法を含む。一実施態様において、本発明は、標的核酸を含む核酸を、本発明のII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド/Cas9タンパク質核タンパク質複合体に接触させ、それによりII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド/Cas9タンパク質核タンパク質複合体の標的核酸への結合を促進すること、及びII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド/Cas9タンパク質核タンパク質複合体により標的核酸を切除することを含む、標的核酸を切除する方法に関する。別の実施態様において、本発明は、標的核酸を含む核酸を、本発明のII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド/Cas9タンパク質核タンパク質複合体と接触させ、それによりII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド/Cas9タンパク質核タンパク質複合体の標的核酸への結合を促進することを含む、標的核酸を結合する方法に関する。
図3Bは、2つのポリヌクレオチドII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系の例を説明する。図3B、326は、分断ネクサスエレメントの第一の部分を構成する第一のポリヌクレオチド(sn1-casPN)を説明する。図3B、302は、分断ネクサスエレメントの第二の部分を構成する第二のポリヌクレオチド(sn2-casPN)を説明する。示された配列間の塩基対水素結合を通して形成するポリヌクレオチド二次構造の例としては以下が挙げられる:sn1-casPN分断ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN分断ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、分断ネクサスステムエレメントを形成する;sn2-casPN第二のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN第二のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第二のステムエレメントを形成する;sn2-casPN第三のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN第三のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第三のステムエレメントを形成する;sn1-casPN第一のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn1-casPN第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第一のステムエレメントを形成し、下部ステムエレメントを形成するsn1-casPN下部ステムエレメントヌクレオチド配列I/sn1-casPN下部ステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む第一のステムエレメント、及びsn1-casPN上部ステムエレメントヌクレオチド配列I/sn1-casPN上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIは上部ステムエレメントを形成する。
図3Cは、3つのポリヌクレオチドのII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系の例を説明する。図3C、327は、分断ネクサスエレメントの第一の部分を構成する第一のポリヌクレオチド(sn1-casPN)を説明する。図3C、302は、分断ネクサスエレメントの第二の部分を構成する第二のポリヌクレオチド(sn2-casPN)を説明する。図3C、328は、スペーサーエレメントを構成する第三のポリヌクレオチド(sn3-casPN)を説明する。示された配列間の塩基対水素結合を通して形成するポリヌクレオチド二次構造の例としては以下が挙げられる:sn1-casPN分断ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN分断ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、分断ネクサスステムエレメントを形成する;sn2-casPN第二のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN第二のステムエレメントヌクレオチド配列IIは第二のステムエレメントを形成する;sn2-casPN第三のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN第三のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第三のステムエレメントを形成する;sn1-casPN第一のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn3-casPN第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第一のステムエレメントを形成する。
図3Dは、2つのポリヌクレオチドのII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系の例を説明する。図3D、329は、分断ネクサスエレメントの第一の部分を構成する第一のポリヌクレオチド(sn1-casPN)を説明する。図3D、302は、分断ネクサスエレメントの第二の部分を構成する第二のポリヌクレオチド(sn2-casPN)を説明する。示された配列間に塩基対水素結合を通して形成するポリヌクレオチド二次構造の例としては以下が挙げられる:sn1-casPN分断ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN分断ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、分断ネクサスステムエレメントを形成する;sn2-casPN第二のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN第二のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第二のステムエレメントを形成する;sn2-casPN第三のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN第三のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第三のステムエレメントを形成する;sn1-casPN第一のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn1-casPN第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第一のステムエレメントを形成する。
図3Eは、4つのポリヌクレオチドのII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系の例を説明する。図3E、301は、分断ネクサスエレメントの第一の部分を構成する第一のポリヌクレオチド(sn1-casPN)を説明する。図3E、302は、分断ネクサスエレメントの第二の部分を構成する第二のポリヌクレオチド(sn2-casPN)を説明する。図3E、330は第三のポリヌクレオチド(sn3-casPN)を説明する。図3E、331は、スペーサーエレメントを構成するスペーサーポリヌクレオチド(sn4-casPN)を説明する。示された配列感の塩基対水素結合を通して形成するポリヌクレオチド二次構造の例としては以下が挙げられる:sn1-casPN分断ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN分断ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、分断ネクサスステムエレメントを形成し;sn2-casPN第二のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN第二のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第二のステムエレメントを形成し;sn2-casPN第三のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN第三のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第三のステムエレメントを形成し;sn1-casPN第一のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn3-casPN第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第一のステムエレメントを形成し、第一のステムエレメントは、下部ステムエレメントを形成するsn1-casPN下部ステムエレメントヌクレオチド配列I/sn3-casPN下部ステムエレメントヌクレオチド配列II、及び上部ステムエレメントを形成するsn1-casPN上部ステムエレメントヌクレオチド配列I/sn3-casPN上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む。
図3Fは、3つのポリヌクレオチドのII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系の例を説明する。図3F、332は、分断ネクサスエレメントの第一の部分を構成する第一のポリヌクレオチド(sn1-casPN)を説明する。図3F、302は、分断ネクサスエレメントの第二の部分を構成する第二のポリヌクレオチド(sn2-casPN)を説明する。図3F、331は、スペーサーエレメントを構成するスペーサーポリヌクレオチド(sn4-casPN)を説明する。示された配列間の塩基対水素結合を通して形成するポリヌクレオチド二次構造の例としては以下が挙げられる:sn1-casPN分断ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN分断ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、分断ネクサスステムエレメントを形成する;sn2-casPN第二のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN第二のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第二のステムエレメントを形成する;sn2-casPN第三のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN第三のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第三のステムエレメントを形成する;sn1-casPN第一のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn1-casPN第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第一のステムエレメントを形成し、第一のステムエレメントは、下部ステムエレメントを形成するsn1-casPN下部ステムエレメントヌクレオチド配列I/sn1-casPN下部ステムエレメントヌクレオチド配列II、及び上部ステムエレメントを形成するsn1-casPN上部ステムエレメントヌクレオチド配列I/sn1-casPN上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む。
図3Gは、4つのポリヌクレオチドのII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系を説明する。図3G、327は、分断ネクサスエレメントの第一の部分を構成する第一のポリヌクレオチド(sn1-casPN)を説明する。図3G、302は、分断ネクサスエレメントの第二の部分を構成する第二のポリヌクレオチド(sn2-casPN)を説明する。図3G、333は、第三のポリヌクレオチド(sn3-casPN)を説明する。図3G、331は、スペーサーエレメントを構成するスペーサーポリヌクレオチド(sn4-casPN)を説明する。示された配列間の塩基対水素結合を通して形成するポリヌクレオチド二次構造の例としては以下が挙げられる:sn1-casPN分断ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN分断ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、分断ネクサスステムエレメントを形成し;sn2-casPN第二のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN第二のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第二のステムエレメントを形成し;sn2-casPN第三のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN第三のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第三のステムエレメントを形成し;sn1-casPN第一のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn3-casPN第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第一のステムエレメントを形成する。
図3Hは、3つのポリヌクレオチドのII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系の例を説明する。図3H、334は、分断ネクサスエレメントの第一の部分を構成する第一のポリヌクレオチド(sn1-casPN)を説明する。図3H、302は、分断ネクサスエレメントの第二の部分を構成する第二のポリヌクレオチド(sn2-casPN)を説明する。図3H、331は、スペーサーエレメントを構成するスペーサーポリヌクレオチド(sn4-casPN)を説明する。示された配列間の塩基対水素結合を通して形成するポリヌクレオチド二次構造の例としては以下が挙げられる:sn1-casPN分断ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN分断ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、分断ネクサスステムエレメントを形成し;sn2-casPN第二のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN第二のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第二のステムエレメントを形成し;sn2-casPN第三のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN第三のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第三のステムエレメントを形成し;sn1-casPN第一のステムエレメントヌクレオチド配列I/sn1-casPN第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第一のステムエレメントを形成する。
第一の付属ポリヌクレオチドを含むsn2-casPNを説明する。図4A、402、403、404は、第二の付属ポリヌクレオチドをさらに含むsn2-casPNを説明する。図4Aにおいて、5’の3つの点はさらなるポリヌクレオチド配列を表す。
いくつかの実施態様において、sn2-casPNは、以下の1つ又はそれ以上を含み得る:第一の付属ポリヌクレオチド、第二の付属ポリヌクレオチド、第二の補助ポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ。第一の付属ポリヌクレオチドは、以下の1つ又はそれ以上を含む:ループエレメントヌクレオチド配列、第二のステムエレメントヌクレオチド配列II、第三の連結ヌクレオチド配列、第三のステムエレメントヌクレオチド配列I、又はそれらの組み合わせ。第二の付属ポリヌクレオチドは、以下の1つ又はそれ以上を含む:ループエレメントヌクレオチド配列、第三のステムエレメントヌクレオチド配列II、3’ヌクレオチド配列、又はそれらの組み合わせ。
いくつかの実施態様において、sn1-casPNもsn2-casPNも補助ポリヌクレオチドを含まない。補助ポリヌクレオチドを含むsn1-casPN及び/又はsn2-casPNの組み合わせとしては、限定されないが、以下が挙げられる:sn1-casPN-第一の補助ポリヌクレオチド/sn2-casPN;sn1-casPN/sn2-casPN-第二の補助ポリヌクレオチド;又はsn1-casPN-第一の補助ポリヌクレオチド/sn2-casPN-第二の補助ポリヌクレオチド。さらに、第一の補助ポリヌクレオチドは、以下の1つ又はそれ以上を含む:リンカーエレメントヌクレオチド配列I、親和性ヌクレオチド配列I、エフェクター結合エレメントヌクレオチド配列I、又はそれらの組み合わせ。さらに、第二の補助ポリヌクレオチドは、以下の1つ又はそれ以上を含む:リンカーエレメントヌクレオチド配列II、親和性ヌクレオチド配列II、エフェクター結合エレメントヌクレオチド配列II、又はそれらの組み合わせ。
(配列が存在する場合に)配列間の塩基対水素結合を通して形成することができるポリヌクレオチド二次構造の例としては以下が挙げられる:sn1-casPN分断ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN分断ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、分断ネクサスステムエレメントを形成し;sn2-casPN第二のステムエレメントヌクレオチド配列I/第一の付属ポリヌクレオチド第二のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第二のステムエレメントを形成し;そして第一の付属ポリヌクレオチド第三のステムエレメントヌクレオチド配列I/第二の付属ポリヌクレオチド第三のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第三のステムエレメントを形成する。
さらに、いくつかの実施態様において、第一の補助ポリヌクレオチド及び第二の補助ポリヌクレオチドは、示された配列間の塩基対水素結合を通して二次構造を形成することができる、例えば、以下の1つ又はそれ以上を含む:sn1-casPN第一の補助ポリヌクレオチド/ sn2-casPN第二の補助ポリヌクレオチドは;sn1-casPN親和性ヌクレオチド配列I/sn2-casPN親和性ヌクレオチド配列II;sn1-casPN エフェクター結合エレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPN エフェクター結合エレメントヌクレオチド配列II;及びsn1-casPNリンカーエレメントヌクレオチド配列I/sn2-casPNリンカーエレメントヌクレオチド配列IIを形成する。
しかし、他の実施態様において、1つ又はそれ以上のこれらの配列間の塩基対水素結合は必要ではない。さらに、いくつかの実施態様において、二次構造は、示された配列間の塩基対水素結合を通して形成し、例えば、sn1-casPN第一の補助ポリヌクレオチドはヘアピンを含み得、かつ/又はsn2-casPN第二の補助ポリヌクレオチドはヘアピンを含み得る。
図4Aにおいて上で記載されたsn2-casPNの変異のさらなる改変としては、第二のステムエレメント及びループエレメントを含む第二のヘアピンエレメント、第三のステムエレメント及びループエレメントを含む第三のヘアピンエレメント、並びに第二のヘアピンエレメント及び第三のヘアピンエレメントの両方が挙げられる。例えば、第二のステムエレメントヌクレオチド配列I(図4A、408)の3’末端を第二のステムエレメントヌクレオチド配列II(図4A、409)の5’末端に接続することにより、第二のヘアピンエレメントが形成される。同様に、第三のステムエレメントヌクレオチド配列I(図4A、412)の3'末端を第三のステムエレメントヌクレオチド配列II(図4A、413)の5'末端に接続することにより、第三のヘアピンエレメントが形成される。
いくつかの実施態様において、sn2-casPNは、以下の1つ又はそれ以上を含み得る:第一の付属ポリヌクレオチド、第二の付属ポリヌクレオチド、第二の補助ポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ。第一の付属ポリヌクレオチドは、以下の1つ又はそれ以上を含む:ループエレメントヌクレオチド配列、第二のステムエレメントヌクレオチド配列II、第三の連結ヌクレオチド配列、第三のステムエレメントヌクレオチド配列I、又はそれらの組み合わせ。第二の付属ポリヌクレオチドは、以下の1つ又はそれ以上を含む:ループエレメントヌクレオチド配列、第三のステムエレメントヌクレオチド配列II、3’ヌクレオチド配列、又はそれらの組み合わせ。
本明細書において引用される全ての特許、刊行物、及び特許出願は、各個々の特許、刊行物、又は特許出願が具体的かつ個別に、全ての目的のためにその全体として参照により加入されると示されるように、本明細書において参照により加入される。
当然のことながら、本明細書において使用される用語は、特定の実施態様を記載する目的のみのためのものであり、限定することを意図されない。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈が明確にそうではないと指示していなければ、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「プライマー(a primer)」への言及は1つ又はそれ以上のプライマーを含み、「組み換え細胞(a recombinant cell)」への言及は1つ又はそれ以上の組み換え細胞を含み、「架橋剤(a cross-linking agent)」への言及は1つ又はそれ以上の架橋剤を含むなどである。
「改変された」及び「天然に存在しない」は、交換可能であり、そして意図的な人の操作を示す。
チドを生成することにより、ポリヌクレオチドをエクソヌクレアーゼ分解に対して安定化する。
(ii)第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドは、別々のポリヌクレオチドであり、それぞれ5’末端及び3’末端を含む。
おいて、リンカーエレメントポリヌクレオチドは、ネクサスエレメントヌクレオチド配列と補助ポリヌクレオチドとの間に挿入される。第一の補助ポリヌクレオチド及び/又は第二の補助ポリヌクレオチドは、単鎖RNA結合タンパク質のような単鎖ポリヌクレオチド結合タンパク質についての結合部位を含み得る。
in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 system」, Environ Microbiol.、81(7)、2506-14 (2015);Estrem、S.T.、et al.、「Bacterial promoter architecture:subsite structure of UP elements and interactions with the carboxy-terminal domain of the RNA polymerase alpha subunit」, Genes Dev.,15、13(16)、2134-47 (1999)を参照のこと)。
function in yeast」, Yeast、10、497 (1994);及びHarley、et al.、「Transmembrane
Protein Insertion Orientation in Yeast Depends on the Charge Difference across Transmembrane Segments、Their Total Hydrophobicity、and Its Distribution」, J. Biol. Chem.、273、24963 (1998)を参照のこと)。使用され得る他のベクター及びプロモーターとしては、PAP1502系統におけるYep URA3 leu2dベクターpPAP1488におけるハイブリッドGALl-CYCpプロモーターが挙げられる(例えば、Pedersen、et al.、 「Expression in High Yield of Pig α1β1 Na,K-ATPase and Inactive Mutants D369N and D807N in Saccharomyces cerevisiae」, J. Biol. Chem.、271、2514-222 (1996)を参照のこと)。この系統は、Trpl遺伝子座に組み込まれたプラスミドpPAP1488を有する。これは、GAL10プロモーターにより駆動されるGAL4遺伝子のさらなるコピーを生じ、そしてGAL発現が誘導される場合、高レベルのGal4p陽性活性化因子が産生される。
transcription can be regulated in Saccharomyces cerevisiae by the bacterial tetracycline repressor-operator system」, EMBO J.、11(4)、1487-92 (1992))。
により)。次いで導入遺伝子は、隣接配列の相同組み換えにより昆虫ゲノム中の相補的配列に組み込まれる。
ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)に基づくレンチウイルスベクターは、細胞分裂の存在しない場合に組み込みを可能にするさらなるアクセサリータンパク質を有する。HIV-1ベクターは、多数の安全性の懸念に対処するために設計された。これらは、複製可能なウイルスの生成をもたらす組み換え事象を防止するためにトランスでの(in trans)ウイルス遺伝子の別々の発現を含む。さらに、自己不活化(SIN)ベクターの発生は、隣接する遺伝子のトランス活性化の可能性を減少させ、そして遺伝子発現を特定の細胞型に標的化させる制御エレメントの組み込みを可能にする(例えば、Cooray、S.、et al.、「 Retrovirus
and lentivirus vector design and methods of cell conditioning」, Methods Enzymol.、507、29-57 (2012)を参照のこと)。
(Life Technologies、Grand Island、NY);カスタマイズ可能な発現ベクター、一過性ベクター、安定ベクター、及びレンチウイルスベクター(DNA 2.0、Menlo Park、CA);並びにpFN10A (ACT) Flexi(R)ベクター(Promega、Madison、WI)。さらに、以下のエレメントが、哺乳動物細胞における使用のためのベクターに組み込まれ得る: Cas9コード配列に作動可能に連結されたRNAポリメラーゼIIプロモーター;sn-casRNAのコード配列に作動可能に連結されたRNAポリメラーゼIIIプロモーター;選択可能マーカー(例えば、G418、ゲンタマイシン、カナマイシン及びZeocinTM (Life Technologies、Grand Island、NY))。核標的化配列もまた、例えばCas9タンパク質コード配列に付加され得る。
。いくつかの実施態様において、ベクターは、1つ若しくはそれ以上のRNAポリメラーゼIIIプロモーター(例えば、sn-casPNコード配列に作動可能に連結される)、1つ若しくはそれ以上のRNAポリメラーゼIIプロモーター(例えば、Cas9タンパク質コード配列に作動可能に連結される)、1つ若しくはそれ以上のRNAポリメラーゼIプロモーター、又はそれらの組み合わせを含む。上で示されたように、哺乳動物RNAポリメラーゼIIIプロモーターの例としては、限定されないが、以下が挙げられる:U6及びH1プロモーター。RNAポリメラーゼIIプロモーターの例は上で考察された。RNAポリメラーゼIプロモーターは当該分野で周知である。
al.、「Generation of Transgenic Mice」, Current Protocols in Cell Biology;Chapter.Unit-19.11 (2009))。最初に、トランスジェニック構築物(例えば、sn-casPN及びCas9タンパク質のポリヌクレオチド配列を含む発現カセット、さらに標的化ベクター)の精製。第二に、ドナー接合体を収集する。第三に、トランスジェニック構築物のマウス接合体への微量注入。第四に、微量注入された接合体の偽妊娠レシピエントマウスへの移植。第五に、樹立マウスにおいて樹立されたゲノムDNAの改変の遺伝子型同定及び分析を行う。
シン、G418、ブレオマイシン、またはハイグロマイシン)に対する抵抗性、除草剤(ビアラホス抵抗性をコードするbar遺伝子;グリホサート抵抗性をコードする変異体EPSP合成酵素遺伝子;ブロモキシニルに対するを付与するニトリラーゼ遺伝子;イミダゾリノンまたはスルホニル尿素抵抗性を付与する変異体アセト乳酸合成酵素遺伝子(ALS))またはメトトレキサート(メトトレキサート抵抗性DHFR遺伝子)に対する抵抗性を与え得る。発現ベクターはまた、発現されるポリペプチドの検出または操作を促進するように設計されたタグ配列を含み得る。タグ配列は、一般的に、コードされるポリペプチドとの融合物として発現され得る。タグ配列の例としては、限定されないが、以下が挙げられる:ルシフェラーゼ、ベータ-グルクロニダーゼ(GUS)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、ポリヒスチジン、c-myc、赤血球凝集素、またはエピトープ(例えば、FLAG(R)エピトープ、Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)。このようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端を含む、ポリペプチド内のいずれかの箇所に挿入され得る。
参照のこと)。
ーテンプレートDNAまたはオリゴヌクレオチドは、標的DNA配列における二本鎖切断の修復に使用され、DNAにおける二本鎖切断の部位でドナーテンプレートDNAまたはオリゴヌクレオチドから遺伝情報(すなわち、ポリヌクレオチド配列)の移動を生じる。したがって、新しい遺伝情報(すなわち、ポリヌクレオチド配列)は、標的DNA部位で挿入またはコピーされ得る。
オリゴヌクレオチド配列(例えば、図13に示されるプライマー配列)は、合成のために市販の製造者に提供された(Integrated DNA Technologies、Coralville、IA;又はEurofins、Luxembourg)。
sn-casRNA成分の製造
この実施例は、3つのポリヌクレオチドのII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系(例えば、図3Aにおいて説明される系と同様)の製造を記載した。
Cas9切断アッセイにおける使用のための二本鎖DNA標的領域の製造
インビトロCas9切断アッセイにおける使用のための標的二本鎖DNAを、ゲノムDNAから標的領域のPCR増幅を使用して製造した。
25μl中20ng/μL gDNAを使用して、以下の条件下で選択された標的領域を増幅した:98℃2分間;98℃で20秒、60℃で20秒、72℃で20秒の35サイクル;そして72℃で2分間の最終伸長。PCR産物を、Spin SmartTM PCR精製チューブ(Denville Scientific、South Plainfield、NJ)を使用して精製し、そしてNanodropTM 2000 UV-Vis分光光度計(Thermo Scientific、Wilmington、DE)を使用して定量化した。
Cas9切断アッセイ
この実施例は、選択された二本鎖DNA標的配列と比較して、選択されたsn-casRNAs/Cas9タンパク質複合体の切断パーセントを評価及び比較するためのインビトロCas9切断アッセイにおける、本発明の3つのポリヌクレオチドのII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系の使用を説明する。
真核細胞における標的改変の検出のためのディープシーケンシング分析
この実施例は、選択された二本鎖DNA標的配列と比較して、選択されたsn-casRNA/Cas9タンパク質複合体のインビボでの切断パーセントを評価及び比較するためのディープシーケンシングの使用を説明する。
化膿性連鎖球菌(S. pyogenes)Cas9は、C末端で2つの各局在化配列(NLS)でタグ化され、そしてE. coliで組み換え発現された。リボ核タンパク質(RNP)複合体は、2つの濃度、50pmol Cas9:150pmol sn-casRNAsEX及び200pmol Cas9:600pmol sn-casRNAsEXで三連で設定された。等モル量の3つのsn-casRNAsEX (sn1-casRNAEX、sn2-casRNAEX、sn3-casRNAEX-AAVS1)成分を全て、アニーリング緩衝液(1.25mM HEPES、0.625mM MgCl2、9.375mM KCl pH7.5)中で混合して最終体積5μL所望の濃度にし(150pmol又は600pmol)、2分間95℃でインキュベートし、サーモサイクラーから取り出して室温まで平衡化させた。Cas9タンパク質を結合緩衝液(20mM HEPES、100mM KCl、5mM MgCl2、1mM DTT、及び5% グリセロールpH7.4)中で最終体積5μLで適切な濃度まで希釈し、そして熱変性sn-casRNAs EX 5μLと混合し、続いて37℃で30分間インキュベートした。
RNP複合体をK562細胞(アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、Manassas、VA)に、Nucleofector(R) 96ウェルShuttleシステム(Lonza、Allendale、NJ)を使用してプロトコルに従ってトランスフェクトした。RNP複合体を、10μL最終体積で 96ウェルプレートの個々のウェルに分配した。培地に懸濁されたK562細胞を、培養フラスコから50mLコニカルチューブに移した。細胞を3分間200 x gでの遠心分離によりペレット化し、培養培地を吸引し、そして細胞をカルシウム及びマグネシウムを含まないPBSで1回洗浄した。次いでK562細胞を、3分間200 x gでの遠心分離によりペレット化し、PBSを吸引し、そして細胞ペレットを、カルシウム及びマグネシウムを含まないPBS 10mL中に再懸濁した。
gDNAを、RNPトランスフェクションの48時間後に、1ウェルあたり50μL QuickExtract DNA抽出溶液(Epicentre、Madison、WI)を使用してK562細胞から単離し、続いて反応を止めるために37℃で10分間、65℃で6分間、そして95℃で3分間インキュベートした。次いで単離されたgDNAを水50μLで希釈し、そしてサンプルを-80℃で貯蔵した。
PCR反応混合物を、配列決定のための増幅産物のSPRIselect(Beckman Coulter、Pasadena、CA)ビーズベースのクリーンアップのための単一微量遠心管にプールした。
増幅産物ライブラリーを、Nanodrop値及び増幅産物のサイズから計算して4 nモル濃度に正規化した。ライブラリーをMiSeqシーケンサー(Illumina、San Diego、CA)でMiSeq試薬キットv2 (Illumina、San Diego、CA)を用いて300サイクルの間、2つの151サイクルペアエンドランと2つの8サイクルの指標読み取りデータを用いて分析した。
配列解析データにおける産物のアイデンティティを、PCRのバーコードラウンドで増幅産物に適合された指標バーコード配列に基づいて決定した。以下のタスクを実行することによりMiSeqデータを処理するために計算スクリプトを使用した:
・ Bowtie (bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml)ソフトウェアを使用してヒトゲノム(ビルドGRCh38/38)に読み取りデータを整列させた。
・ 整列させた読み取りデータを、期待された野生型AAVS-1遺伝子座配列と比較し、AAVS-1遺伝子座といずれの部分も整列しない読み取りデータは破棄した(表12、「その他」)。・ 野生型AAVS-1配列(表12、「WT」)とマッチする読み取りデータを記録した。
・ インデル(塩基の挿入又は欠失)を含む読み取りデータをインデル型により分類し、そして記録した(表12、「インデル」)。
・ 総インデル読み取りデータを、野生型読み取りデータの合計で割、そしてインデル読み取りデータにより変異した読み取りデータのパーセントが得られた。
Csy4*はsn-casRNA/Cas9タンパク質切断を促進した
この実施例は、本発明のsn-casRNA及びエフェクタータンパク質、H29A変異を有するヌクレアーゼ欠損緑膿菌(P. aeruginosa)Csy4タンパク質(Csy4*)の、Csy4 RNA結合配列を増強した2つのsn-casRNAの使用を説明する。
Csy4結合配列を含む特定のsn-casRNAEXCsy成分のための二本鎖DNAテンプレートを、sn-casRNAEXCsy成分に対応するDNA配列を含有する3’オーバーラッププライマーを使用するPCRにより構築した。アセンブリにおいて使用されるオリゴヌクレオチドを表13に示す。
インビトロCas9切断アッセイにおける使用のための標的二本鎖DNAを、本明細書における実施例2に記載されるようにPCR増幅を使用して製造した。gDNAからの増幅のために使用される順方向及び逆方向プライマーは以下のとおりであった: AAVS-1オリゴヌクレオチドはJ及びK(図13)であり、AAVS-1についての増幅された二本鎖DNA標的は288bpであった;CD34 (造血前駆細胞抗原)オリゴヌクレオチドはAD及びAEであり(図13)、CD34について増幅された二本鎖DNA標的は258bpであった;CD151(血小板-内皮細胞テトラスパニン抗原)オリゴヌクレオチドはAF及びAG(図13)であり、増幅されたCD151二本鎖DNA標的は272bpであった;そして、JAK-1 (ヤヌスキナーゼ1)オリゴヌクレオチドはAH及びAIであり(図13)、増幅されたJAK-1二本鎖DNA標的は298bpであった。
sn-casRNAEXCsyを、Cas9を加える前に、Csy4*タンパク質250nMを反応混合物に加え、そしてsn-casRNAsEXCsy及びCsy4*を37℃で5分間インキュベートした点を改変して、本明細書における実施例3に記載されるように生化学アッセイにおける使用のために製造した。インキュベーション後に、Cas9を加え、そして生化学的反応を実施例3に記載されるように行った。無Csy4*対照が含まれた。
sn1-CasRNA/sn2-casRNA/Cas9切断活性
この実施例は、選択された二本鎖DNA標的配列と比較して、選択されたsn1-casRNA/sn2-casRNA/Cas9タンパク質複合体の切断を評価及び比較するためのインビトロCas9切断アッセイにおける、本発明の2つのポリヌクレオチドのII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系の使用を説明する。
sn1-CasRNA EX3Csy /sn2-casRNA EX3Csy /Cas9切断活性
この実施例は、選択された二本鎖DNA標的配列と比較して、それらのパーセント切断活性を評価及び比較するための、本発明の2つの異なる2つのポリヌクレオチドのII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチドの使用を説明する。
トランス活性化CRISPR RNAの同定及びスクリーニング
この実施例は、CRISPR-Cas9 II型系を有する種のトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNAs)が同定され得る方法を説明する。ここで示される方法は、Chylinski、et. al.、「The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems」, RNA Biol.、10(5)、726-37 (2013)から適合される。以下の工程の全てがスクリーニングに必要というわけではなく、工程の順序が示された通りでなくてはならないということもない。
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST、blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)を使用して、様々な種のゲノムの検索を行い、Cas9又はCas9様タンパク質を同定した。CRISPR-Cas9系は、種にわたる配列において高い多様性を示すが、Cas9オルソログは、中央HNHエンドヌクレアーゼドメイン及び分断RuvC/RNase Hドメインの保存されたドメイン構造を示す。一次BLAST結果を同定されたドメインについてフィルタリングした;不完全又は短縮された配列は破棄され、そしてCas9オルソログを同定した。
推定抗反復領域は、Rho-独立転写終結因子(TransTerm HP、transterm.cbcb.umd.edu/)について推定抗反復の5’及び3’を精査される。
コンピュータで同定された推定tracrRNAを、RNA配列決定(RNAseq)を使用してさらに検証する。
cDNAライブラリーの配列決定読み出しを、以下の方法を使用して処理する。
真核細胞における標的改変の検出のためのT7E1アッセイ
この実施例は、選択された二本鎖DNA標的配列と比較して、sn-casPNs/Cas9タンパク質系のインビボでの切断パーセントを評価及び比較するためのT7E1アッセイの使用を説明する。
sn-casPNを、構成的にSpyCas9-GFP融合物(HEK293-Cas9-GFP)を発現するHEK293細胞に、Nucleofector(R) 96ウェルShuttleシステム(Lonza、Allendale、NJ)及び以下のプロトコルを使用してトランスフェクトした。当モル量のCas ポリヌクレオチド成分を、アニーリング緩衝液(1.25mM HEPES、0.625mM MgCl2、9.375mM KCl pH7.5)中で調製し、2分間95℃でインキュベートし、サーモサイクラーから取り出し、室温まで平衡化させ、そして10μL最終体積で96ウェルプレートに分配した。培地をHEK293-Cas9-GFP細胞から吸引し、そして細胞をカルシウム及びマグネシウムを含まないPBSで1回洗浄し、次いでTrypLE (Life Technologies、Grand Island、NY)を加えることによりトリプシン処理し、次いで37℃で3〜5分間インキュベートした。トリプシン処理された細胞を、穏やかにピペットで上下して単細胞懸濁液を形成させ、そして10% FBS (Fisher Scientific、Pittsburgh、PA)を含有し、ペニシリン及びストレプトマイシン(Life Technologies、Grand Island、NY)を追加したDMEM培地(Life Technologies、Grand Island、NY)から構成されるDMEM完全培地に加えた。
gDNAを、HEK-293-SpyCas9細胞から、Cas ポリヌクレオチド成分のトランスフェクションから48時間後に、1ウェルあたり50μL QuickExtract DNA抽出溶液(Epicentre、Madison、WI)を使用して単離し、続いて37℃で10分間、65℃で6分間、そして95℃で3分間インキュベートして反応を停止させた。次いでgDNAを水150μLで希釈し、そしてサンプルを-80℃で保存した。
T7E1アッセイのためのPCR増幅された標的二本鎖DNAを、95℃で10分間変性し、次いで25℃に-0.5℃/秒でサーマルサイクラーにて冷却することにより再アニーリングさせた。再アニーリングしたDNAを、0.5μL T7エンドヌクレアーゼIとともに1x NEBuffer 2緩衝液(New England Biolabs、Ipswich、MA)中で総体積15μLで25分間37℃にてインキュベートした。T7E1反応を、Fragment AnalyzerTMシステム(Advanced Analytical Technologies、Inc.、Ames、IA)及びDNF-910二本鎖DNA試薬キット(Advanced Analytical Technologies、Inc.、Ames、IA)を使用して分析した。Fragment AnalyzerTMシステムにより、各切断フラグメントの濃度、及び切断後に残留している標的二本鎖DNAの濃度が得られた。
同定されたtracrRNAの分断ネクサス試験
この実施例は、例えば、当該分野で公知であるか又は実施例8に記載の方法により同定されたcrRNA/tracrRNAに基づく、tracrRNAにおける分断ネクサス改変の生成及び試験を記載する。
DNA標的結合配列を含む複数のsn-casRNAのスクリーニング
この実施例は、ヒトゲノムDNAに存在する標的を改変し、そしてそれらの部位での切断活性のレベルを測定するための本発明のsn-casRNAの使用を説明する。標的部位は、最初にゲノムDNAから選択され、次いでsn-casRNAを、それらの選択された配列を標的化するように設計する。次いで、起こった標的切断のレベルを決定するために測定を行う。以下の工程の全て全てのスクリーニングに必要なわけではなく、工程の順序が示されるとおりでなくてはならないということもなく、そしてスクリーニングは他の実験と連結されても、より大きな実験の一部を形成してもよい。
選択されたゲノム領域内の全てのPAM配列(例えば、「NGG」)を同定する。
sn-casRNA-DNAtbs/sn-casRNA系に関連するインビトロ切断パーセンテージ及び特異性を、例えば、以下のような、実施例3のCas9切断アッセイを使用して比較した:
(a) 単一の標的DNA配列のみが同定されるか又は選択される場合、DNA標的領域に対する切断パーセンテージ及び特異性が決定される。それが望まれる場合、切断パーセンテージ及び/又は特異性は、さらなる実験において、RNAを改変すること、エフェクタータンパク質/エフェクタータンパク質結合配列又はリガンド/リガンド結合部分を導入することを含むがこれらに限定されない本発明の方法を使用して変更される。
(a) 標的DNA配列のみが同定される場合、DNA標的領域についての切断パーセンテージ及び特異性が決定される。それが望まれる場合、切断パーセンテージ及び/又は特異性は、さらなる実験において、RNAを改変すること、エフェクタータンパク質/エフェクタータンパク質結合配列又はリガンド/リガンド結合部分を導入することを含むがこれらに限定されない本発明の方法を使用して変更される。
機能ゲノミクススクリーニング
この実施例は、本発明の分断ネクサスポリヌクレオチド(sn-casPN)の、機能スクリーニング法及び配列データを利用して遺伝子の機能的役割を同定するための使用を記載する。
sn1-casRNAのウイルスライブラリーを、レンチウイルス産生のための転移プラスミドにクローン化するための普遍的タグ配列に付けられた設計されたスペーサー配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することにより生成する(例えば、pD2107-CMV -DNA 2.0、Menlo Park、CA)。オリゴヌクレオチドライブラリーを、プログラム可能なマイクロアレイ上に合成し、そしてアレイ製造者によりマイクロアレイから切断する(例えば、Agilent Technologies、Santa Clara、CA)。全長オリゴヌクレオチドを、Q5ポリメラーゼ(NEB)及び普遍的タグ配列を含有するDNAを増幅するように設計されたプライマーを使用してPCRにより増幅する。転移ベクターへのクローン化を、当業者に公知の標準的な技術を使用して行う。一例は、単鎖オーバーハングを明らかにするためにII型制限酵素(例えば、BsbI)でベクターを消化すること、アルカリホスファターゼ(Fermentas)で処理すること、及び切除されたベクターを未切除のものからゲル精製により精製することを含む。オリゴヌクレオチドライブラリーを、適合性の末端を明らかにするために制限酵素で消化し、そしてDNAリガーゼ(Fermentas)を使用してベクターに連結する。
HEK293T細胞を約40%コンフルエンスでトランスフェクションの24時間前に10%ウシ胎仔
血清(FBS)を追加したDMEM(Life Technologies、Grand Island、NY)中にて播種した。細胞を血清低減OptiMEM (Life Technologies、Grand Island、NY)中に移し、そしてリポフェクタミン2000及びPlus試薬を製造者の指示に従って使用してトランスフェクトした。トランスフェクションのために、レンチウイルス転移ベクターを、Lenti-XTM HTXパッケージング系(Takara Clontech、Mountain View、CA)のようなレンチウイルスパッケージングのためのプラスミドと、製造者の指示に従って混合した。
A375 (ATCC CRL-1619)細胞を、American Type Cell Culture (Manassas、VA)から入手し、そして10% FBS (Life Technologies、Grand Island、NY)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)、20 mM HEPES (Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)を追加したR8758培地(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)で培養した。
ウイルスベクターライブラリーについての感染多重度(MOI)を、所定のウイルス量を有する細胞の形質導入に基づいて標準的な方法を使用して決定した。約3x106のA375細胞を、8 μg/mlポリブレン(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)を追加した適切な培地で12ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。細胞を所定のウイルス量と混合し、0.3〜0.5の間の感染多重度(MOI)を同定した。プレーティングした細胞を、2,000 rpmで2時間37℃で遠心分離し、その後、培地を吸引し、そして各細胞型にポリブレンを含まない新鮮な培地を加えた。細胞を24時間37℃、5% CO2でインキュベートした。非形質導入対照が含まれる。
試験した各条件について1ウェルあたり2x106の細胞をプレーティングした。各ウェルの細胞を、30%の形質導入効率に達するまでライブラリー10ulで形質導入した(ライブラリーにおける1クローンあたり最少3〜400細胞)。ピューロマイシンを、形質導入の24時間後にウェルに加え、そして細胞を7日間維持した。複製ウェルあたり最少2x 107の細胞で薬物条件で二連で細胞を分割した。1つのウェルに2uM薬物化合物(例えばPLX4032、Thermo Fisher Scientific、South San Francisco、CA)を追加し、そして他方はDMSO(Thermo Fisher Scientific、South San Francisco、CA)を用いた。細胞を37℃、5% CO2で14日間インキュベートし、そして必要に応じてPLX4032又はDMSOのいずれかを追加した新鮮な培地に2〜3日毎に継代した。14日後に、ゲノムDNA(gDNA)を、製造者の指示通りにQuickExtract DNA抽出溶液(Illumina、San Diego、CA)を使用して細胞から調製した。
PCRプライマーを、ゲノムDNAからレンチウイルスsn1-casPN標的配列を増幅するように
設計した。単離されたgDNAを使用して、第一のPCRを、ヘラクレスII融合DNAポリメラーゼ(Agilent、Santa Clara、CA)を使用して、アダプター配列及びレンチウイルスsn1-casPNカセットに特異的な配列を含むプライマーを用いて行った。第二のPCRを、第二のPCR反応体積の20分の1で第一ラウンドの増幅物を使用して行った。第二のPCRは、以下を含む第二のプライマーセットを使用した:第一のプライマー対の普遍的アダプター配列に相補的な配列、各サンプルに独特のバーコードインデックス配列、及びフローセルアダプター配列。各形質導入サンプルの300x配列決定範囲を確実にするためにPCR反応混合物をプールした。プールしたPCR反応混合物を、2% TBEゲルで分析し、期待される増幅産物サイズのバンドを、QIAEX IIゲル抽出キット(Qiagen、Venlo、Netherlands)を使用してゲル精製した。精製された増幅産物の濃度を、dsDNA BRアッセイキット及びQubitシステム(Life Technologies、Grand Island、NY)を使用して評価し、そしてライブラリー品質をAgilent DNA100Chip及びAgilentバイオアナライザ2100システム(Agilent、Santa Clara、CA)を使用して決定した。プールされたライブラリーをMiSeq 2500 (Illumina、San Diego、CA)で配列決定した。
生配列決定読み出しを、sn1-casPNカセット配列のみを含有するように処理した。sn1-casPN読み出しを、レンチウイルススクリーニングライブラリ内に含まれる標的配列に整列させ、そして独特な標的配列の数をそれぞれ計数した。標的配列あたりの計数された読み出しを、標的あたりの読み出しをサンプル中の術tネオ標的についての整列された読み出しの合計でわって106を掛けて1を加えることにより正規化した。
抑制/活性化
この実施例は、ヒト細胞における内在性遺伝子の抑制又は活性化のための、本発明の分断ネクサスポリヌクレオチド(sn-casPN)の使用を記載する。
変異D10A及びH840Aを有するヌクレアーゼ欠損化膿性連鎖球菌(S. pyogenes)Cas9(dCas9)を、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化し、そしてSV40各局在化シグナル及びクルッペル関連ボックス(Kruppel Associated box)(KRAB)抑制ドメイン(dCas9-KRAB)又は転写活性化因子VP16の4つのコピー(dCas9-VP64)のいずれかでC末端をタグ化する。dCas9-KRAB及びdCas9-VP64の両方を、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターのような適切な哺乳動物プロモーターに隣接させてベクターに挿入する。1つのこのようなベクター、pJ607-03 (DNA2.0、Menlo Park、CA)が市販されている。
sn1-casRNA-CD71配列は、トランスフェリン受容体CD71の上流未翻訳領域(UTR)に対して標的化された20ヌクレオチドのスペーサー配列を含む。sn1-casRNA-CD71配列を、独立したsn2-casRNA配列も含む適切なベクター中に構築した。各配列は、RNAポリメラーゼIIIによる転写を方向づけるヒトU6プロモーターによる独立した制御下にある。1回、sn1-casRNA及びsn2-casRNA配列の発現のために適切なベクター骨格はpRSFDuet-1ベクター(Novagen、Merck、Darmstadt、Germany)である。
HeLa (ATCC CCL-2)細胞を、American Type Cell Culture (Manassas、VA)から入手し、そして10% FBS (Life Technologies、Grand Island、NY)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)、2 mMグルタミン(Life Technologies、Grand Island、NY)を加えたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Life Technologies、Grand Island、NY)で培養し、37℃、5% CO2で培養した。
HeLa細胞を、等質量のCas9含有プラスミド及びsn1-casRNA-CD71ベクターを用いてTransIT-LT1 (Mirus、Madison、WI)を使用して一過性トランスフェクトした。非トランスフェクト対照が含まれた。トランスフェクションの72時間後に、細胞をトリプシン処理し(Life Technologies、Grand Island、NY)、そして10nM EDTA-PBS(Lonza、Allendale、NJ)を用いて解離させた。FITCフルオロフォア(eBioscience、San Diego、CA)に結合された抗ヒトCD71特異的抗体の存在下でフローサイトメトリー染色緩衝液(eBioscience、San Diego、CA)中にて細胞をインキュベートした。トランスフェクトされた細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)を、CD71-FITC抗体の検出のためにブルーレーザー(励起488nm)の使用及びLSR IIフローサイトメーター(BD Biosciences、Franklin Lakes、NJ)を使用して行った。
産業上の利用のためのCHO細胞の改変
この実施例は、CHO細胞のゲノムを改変するための本発明の分断ネクサスポリヌクレオチド(sn-casPN)の使用を記載する。産業上の利用における将来の使用(すなわち、抗体の製造)のためのsn-casPN改変細胞の配列検証及び選択についての概略も本実施例に含まれる。
化膿性連鎖球菌(S. pyogenes)Cas9配列を、CHO細胞における発現のためにコドン最適化し、そしてSV40核局在化シグナルでC末端をタグ化し、そしてサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターのような適切な哺乳動物プロモーターに隣接させてベクターに挿入した。1つのこのようなベクター、pJ607-03 (DNA2.0、Menlo Park、CA)は市販されている。
CHO-K1細胞を、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関 (Manassas、VA)から入手し、そしてCHO-K1 F-12K培地(American Type Culture Collection、Manassas、VA)、10% FBS (Life Technologies、Grand Island、NY)及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)で培養した。CHO-K1細胞を、等質量のCas9含有プラスミド及びsn1-casRNA-FUT8/sn2-casRNAを含むベクターを用いて、Nucleofector 2b装置(Lonza、Allendale、NJ)及びAmaxa細胞株NucleofectorキットV(Lonza、Allendale、NJ)を製造者の推奨のようにトランスフェクトした。細胞を、30℃、5% CO2で最初の24時間インキュベートし、次いで37℃、5% CO2でさらに24時間インキュベートした。
Cas9ベクター及びsn1-casRNA-FUT8のトランスフェクションの5日後に、50 μg/mL レンズ豆(Lens culinaris)アグルチニン(LCA、Vector Laboratories、Burlingame、CA)を加えることによりFUT8ノックアウト細胞を選択した。細胞をLCAで7日間の選択にかけ、細胞を継代し、そして2〜3日ごと又は必要に応じてLCAを含む新鮮な培地を加えた。Fut8遺伝子にsn-casPN系によって生じた分裂を有する細胞のみがLCAに対する抵抗性を有する。
150bp〜200bpの間の増幅産物の配列決定を、sn1-casRNA-FUT8標的部位にわたるように設計した。以前に単離されたgDNAを使用して、第一のPCRを、ヘラクレスII融合DNAポリメラーゼ(Agilent、Santa Clara、CA)を使用して、アダプター配列及びFUT8標的部位に隣接する領域に特異的な配列を含むプライマーを用いて行った。第二のPCRを、第PCR反応体積の20分の1の体積で一回目のPCRの増幅産物をテンプレートして使用して行った。第二のPCRは、第一のプライマー対のアダプター配列に相補的な配列、各サンプルに独特なバーコードインデックス配列、及びフローセルアダプター配列を含む第二のセットを使用した。増幅産物をプールし、そして2% TBEゲル上で分析し、期待される増幅産物サイズのバンドを、QIAEX IIゲル抽出キット(Qiagen、Venlo、Netherlands)を使用してゲル精製した。精製された増幅産物の濃度を、二本鎖DNA BRアッセイキット及びQubitシステム(Life Technologies、Grand Island、NY)を使用して評価し、そしてライブラリー品質を、Agilent DNA100Chip及びAgilent バイオアナライザー2100システム(Agilent、Santa Clara、CA)を使用して決定した。ライブラリー品質の検証後に、ライブラリーを、MiSeqベンチトップシーケンサー(Illumina、San Diego、CA)でMiSeq試薬キットv2 (300サイクル、Illumina、San Diego、CA)を用いて製造者の指示に従って151bpペアエンド読み出しについて配列決定した。
配列決定データにおける産物のアイデンティティを、PCRの第二ラウンドにおいて増幅産物上に適応させたインデックスバーコード配列に基づいて分析した。コンピュータスクリプトを使用して、以下のタスクを実行することによりMiSeqデータを処理した:
1. fastq-join (Aronesty 2011:code.google.com/p/ea-utils)を用いてペアエンド読み出しを結合する
2. fastx_barcode_splitter(hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html)を使用して読み出し配列の5’末端及び3’末端の両方に存在する適切なプライマー配列について配列読み出しの検証。両末端に正確なプライマー配列を欠いている読み出しを廃棄する。
3. 読み出し配列を、期待される野生型FUT8配列と比較し、同一の読み出し配列を、同じインデル改変を有するとして分類する。
出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるゲノム操作
この実施例は、本発明の分断ネクサスポリヌクレオチド(sn-casPN)の、出芽酵母(S. cerevisiae)のゲノムを改変するための使用を記載する。
酵母細胞における発現のためにコドン最適化された化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9遺伝子を、SV40核局在化シグナルでC末端でタグ化し、そして誘導性プロモーター、例えば、GalLプロモーター配列に隣接する低コピー数ベクターに挿入する。ベクターはまた、URA3選択可能マーカーのような選択可能マーカーも含有する。1つのこのようなベクターであるp415-GalL-Cas9-CYC1t (Addgene、Cambridge、MA)は市販されている。Cas9遺伝子の発現は、GalLプロモーターの誘導性制御下にある。
KanMXオリゴヌクレオチド配列は、CAN1遺伝子座に対する50bpの相同性アームを用いてpFA6a-KanMX6プラスミドからPCR増幅され、これは酵母において遺伝子ノックアウトを生成するために一般的に使用されるものである。KanMXはドナーDNAとして使用される。KanMXオリゴヌクレオチドはG418抵抗性を付与し、そしてCAN1.Y関連PAM配列を分裂させるように設計される。組み込みの際に、このドナーDNAは、カナバニン抵抗性及びG418抵抗性を生じる。
トウモロコシにおける標的化変異誘発
この実施例は、植物においてゲノム改変を生じるための本発明の分断ネクサスポリヌクレオチド(sn-casPN)の使用を記載する。2成分sn-casRNA ポリヌクレオチド系が記載されるが、本発明の他の実施態様も同様に使用され得る(例えば、3成分sn-casRNA ポリヌクレオチド系)。
化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)M1 GAS (SF370)由来のCas9を、当該分野で公知の標準的技術に従ってトウモロコシコドン最適化した。ジャガイモST-LS1イントロンを、E. coli及びアグロバクテリウム(Agrobacterium)におけるその発現を排除するために導入した。トウモロコシ細胞におけるCas9タンパク質の核局在化は、それぞれCas9オープンリーディングフレームのアミノ末端及びカルボキシル末端に組み込まれたサルウイルス40(SV40)単節型(monopartite)及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)双節型(bipartite)VirD2 T-DNA境界エンドヌクレアーゼ核局在化シグナルにより促進され得る。Cas9遺伝子を、トウモロコシ構成性(例えば、植物ユビキチンプロモーター)又は調節されたプロモーターに、標準的な分子生物学的技術により作動可能に連結した。
3つの異なるトウモロコシゲノム標的配列を、sn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA/Cas9タンパク質系を使用する切断のために標的化する。3つの標的配列は、LIG遺伝子座(Liguleless 1遺伝子開始コドンの約600bp上流)に位置し、変異の存在についてディープシーケンシングにより試験される。各標的部位(LIGCas-1、LIGCas-2、及びLIGCas3)についてのスペーサー配列は、米国特許出願公開第2015-0059010号(2015年2月26日公開)に記載されるとおりである(米国特許出願公開第2015-0059010号(2015年2月26日公開)の表1に列挙されるトウモロコシゲノム標的配列のアンチセンス鎖に相補的なVTドメインを参照のこと)。得られたsn-casRNAは以下の通りである:sn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA-LIGCas-1;sn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA-LIGCas-2;及びsn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNA-LIGCas-3。
DP2(胚珠発生タンパク質2、AP2ドメイン転写因子;例えば、米国特許出願公開第2009-0328252号(2009年12月31日公開);米国特許出願公開第2011-0167516号(2011年7月7日公開)を参照のこと)を含有するベクターを用いて同時照射した(co-bombarded)。
トランスジェニックマウスの生成
この実施例は、動物においてゲノム改変を生じるための、本発明の分断ネクサスポリヌクレオチド(sn-casPNs)の使用を記載する。
T7プロモーターを、哺乳動物発現について最適化されたCas9コード領域に加えた(例えば、Cas9コード配列は、pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9;Addgene、Cambridge、MAからPCR増幅され得る)。T7プロモーターはPCR増幅により加えられる。T7-Cas9 PCR産物をゲル精製し、そしてmMESSAGE mMACHINE T7 ULTRAキット(Life Technologies、Grand Island、NY)を使用するインビトロ転写のためのテンプレートとして使用する。Cas9-mRNAを、MEGAclearキット(Life Technologies、Grand Island、NY)を使用して精製し、そしてRNase非含有水で溶出した。
全ての動物手順を、国立保健研究所(NIH)のガイドラインに従って行った。B6D2F1 (C57BL/6 X DBA2)雌性マウスを胚ドナーとして使用した。ICRマウス系統を代理母マウスとして使用した。過排卵した7〜8週齢の雌性B6D2F1マウスを、B6D2F1雄性マウスと交配させた。受精させた胚を卵管から集めた。Cas9 mRNA(約20 ng/ml〜約200 ng/mlの範囲にわたって個々の胚に投与される)、sn1-casRNA/sn2-casRNA (20 ng/ml〜50 ng/mlの範囲にわたって個々の胚に投与される)を、M2培地(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)中の受精した胚(十分に認識される前核を有する)の細胞質に注入した。
sn1-casRNA-Tet1/sn2-casRNA and sn1-casRNA-Tet2/sn2-casRNAを、上記のように接合体に同時注入した。子のゲノムDNAをRFLP (制限フラグメント長多型解析)、サザンブロット分析、及び配列解析により評価して、Tet1及びTet2遺伝子の4つの対立遺伝子全てで標的化変異を保有するマウスを同定した。これらの分析の結果は、2つの異なる遺伝子(すなわち、Tet1及びTet2遺伝子)において両アレル変異を保有する生後マウスが効率的に生成され得るということを実証するためのものである。
sn1-casRNA及びsn2-casRNA系を使用したインビボ遺伝子修復を評価するために、ドナーオリゴヌクレオチドを使用してTet1を標的化し、SacI制限部位の2つの塩基対を、EcoRI部位を生じるように変更した(Tet1オリゴヌクレオチド;126bp、配列については、Wangらの図3Aを参照のこと)。第二のドナーオリゴヌクレオチドを使用してTet2を標的化し、EcoRV部位の2つの塩基対をEcoRI部位に変更した(Tet2オリゴヌクレオチド;126bp、配列については、Wangらの図3Aを参照のこと)。胚盤胞は、Cas9 mRNA、sn1-casRNA-Tet1/sn2-casRNA、及びTet1オリゴヌクレオチド、Cas9 mRNA、sn1-casRNA-Tet2/sn2-casRNA、及びTet2オリゴヌクレオチド、並びにCas9 mRNA、sn1-casRNA-Tet1/sn2-casRNA、Tet1オリゴヌクレオチド、sn1-casRNA-Tet2/sn2-casRNA、及びTet2オリゴヌクレオチドを注入した接合体由来であった。
カチオン性分子を含む送達ベクターにおけるsn-casRNAs/Cas9タンパク質複合体
A. Cas9 mRNA及びsn1-casRNA/sn2-casRNA/sn3-casRNAの製造
哺乳動物発現のために最適化され、そして2つの核局在化配列(NLS)でC末端でタグ化されたCas9コード領域に、T7プロモーターを加える。T7プロモーターはPCR増幅により加えられる。T7-Cas9 PCR産物をゲル精製し、そして無細胞タンパク質発現のためのベクターにクローン化する(例えば、無哺乳動物細胞タンパク質発現のためのpT7CFE1-NFtagベクター、Life Technologies、Grand Island、NY)。Cas9タンパク質を発現させ、そして無細胞タンパク質発現系(例えば、1工程CHO 高収量 IVTキット、Life Technologies、Grand Island、NY)を使用して単離し、そして無RNase水中に懸濁させる。
リボ核タンパク質(RNP)複合体を、2つの濃度で製造した、50pmol Cas9:150pmol sn-casRNA及び200pmol Cas9:600pmol sn-casRNA。当モル量の3つのsn-casRNA成分全てをアニーリング緩衝液(1.25mM HEPES、0.625mM MgCl2、9.375mM KCl pH7.5)で混合して、最終体積5μLで所望の濃度(150pmol又は600pmol)にし、2分間95℃でインキュベートし、サーモサイクラーから取り外し、そして室温まで平衡化させた。Cas9タンパク質を、結合緩衝液(20mM HEPES、100mM KCl、5mM MgCl2、1mM DTT、及び5% グリセロールpH7.4)中最終体積5μLで適切な濃度に希釈し、そして熱変性sn-casRNA 5μLと混合し、続いて37℃で30分間インキュベートしてsn-casRNAs/Cas9タンパク質複合体を形成した。
SC12CDClickpropylamine (カチオン性ベータシクロデキストリン;O’Mahony A.M.、et
al.、「Cationic and PEGylated Amphiphilic Cyclodextrins:Co-Formulation Opportunities for Neuronal Sirna Delivery」, PLoS ONE 8(6)、e66413 (2013))を量り取り、そしてクロロホルム(約1 mg/ml)に溶解し、次いで適切な体積で一緒に混合して、カチオン性対PEG化シクロデキストリンのモル比を得た(米国特許出願公開第2014-0079770号(2014年3月20日公開)。溶媒を窒素気流下で除去して、乾燥シクロデキストリン(CD)組成物を得た。
リポソームをcasRNA/Cas9タンパク質複合体を用いずに形成してネガティブコントロール(空リポソーム)を得た。
リポソーム1:EPC (EtOH 溶液)及びコレステロール(EtOH溶液)を70/30のモル比で調製する。
以下のような標準的方法を使用して、上記の粒子組成物及びリポソーム組成物を特徴づけした(例えば、Laouini、A.、et al.、「Preparation、Characterization and Applications of Liposomes:State of the Art」, Journal of Colloid Science and Biotechnology、1、147-168 (2012))。
粒子及びリポソームのサイズを標準的な技術により評価する。いくつかの技術が、リポソームサイズ及びサイズ分布を評価するために利用可能であり、これらとしては、顕微鏡技術、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、フィールドフローフラクショネーション及び静的又は動的光散乱が挙げられる。さらに、粒子サイズは、非変性アガロースゲル(例えば、1.5%アガロース、SYBR(R) Safe、Life Technologies、Grand Island、NY)を使用して評価することができる。様々なサイズの粒子及びリポソームが様々な適用、例えば、培養での細胞トランスフェクション又は動物への治療的投与に有用である。
粒子及びリポソームの平均サイズ及び電荷は、動的光散乱(DLS)を使用してZetasizer Nano ZS (Malvern、Westborough、MA)を用いて測定される。懸濁液中の全ての粒子が大きな負の又は大きな正のゼータ電位を有する場合、それらは互いに反発する傾向がある。したがって、凝集の傾向を低減又は排除する。しかし、低いゼータ電位値を有する粒子は、粒子の凝結を防止する力を有していない。
組成物の形態は、透過電子顕微鏡法(TEM)、例えば、JEOL 2000 FXII透過電子顕微鏡(Jeol Ltd.、Tokyo、Japan)を使用して評価される。一般に、均一な粒子又はリポソーム形態を有する組成物が最も望ましい。
粒子及びリポソームの凝集に対する塩含有培地及び血清の効果を、Opti-MEM(R)トランスフェクション培地(Life Technologies、Grand Island、NY)又はウシ胎仔血清のいずれか中で24時間37℃にて複合体をインキュベートすることにより評価する。サイズ測定を、Zetasizer Nano ZSを使用して行う。凝集が存在しないことは、しばしば望ましい品質である。しかし、いくつかの適用(例えば、トランスフェクション実験)では、いくらかの凝集は望ましいかもしれない。
リポソーム調製物は、封入及び非封入CD-sn-casRNA/Cas9タンパク質又はsn-casRNA/Cas9タンパク質フラクションの混合物である。HPLC及びフィールドフローフラクショネーションを含むいくつかの技術は、封入効率の測定について知られている。典型的には、封入パーセントは、同じ初期濃度での参照標準に対する非封入ピーク面積の比として表される。この方法は、リポソームが製造後にいずれの精製も受けない場合に適用することができる。一般的な高度の封入効率は、治療適用におけるリポソームについての重要なパラメーターである。低封入効率は、非封入複合体を除去するために封入後の分離工程の組み込みを必要とする(例えば、透析、サイズ排除クロマトグラフィー又は限外濾過)。典型的には、45%より高い、より好ましくは80%より高い、そして最も好ましくは95%より高い封入効率が望ましい。
sn1-casRNA、sn2-casRNA、及びsn3-casRNA-AAVS-1を含む粒子組成物及びリポソーム組成物を、遺伝子修復のためにsn-casRNAs/Cas9タンパク質複合体を細胞中に送達するそれらの相対的能力について評価する。この実験のために、ドナーDNA分子を、粒子組成物及びリポソーム組成物のそれぞれの製造に含める。ドナーDNAは、AAVS1ポジティブコントロールEGIP 293Tレポーター細胞株(System Biosciences、Mountain View、CA)とともに使用するためのEGFPフラグメントである。他のレポーター系は、この分析における使用に適している。リポソーム組成物は、必要に応じて標準的技術を使用して濃縮される。
真核細胞における標的改変の検出のためのさらなるディープシーケンシング分析
この実施例は、ヒト細胞において6つの選択された二本鎖DNA標的配列を改変するための、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)CRISPR-Cas9 sgRNA及び2つの分断ネクサスポリヌクレオチド(本開示のsn1-casRNA及びsn2-casRNA)の使用を記載する。
6つの標的配列を、ヒトゲノムから編集のために選択した。標的部位は20ヌクレオチド長であり、ストレプトコッカス・サーモフィルス(S. thermophilus)CRISPR1/Cas9 PAM配列(5’ - NNAGAAW - 3’)の5’に存在し、ここで「N」は任意のヌクレオチドであり、そして「W」はアデニン、チミン、又はウラシル塩基である。選択された標的及びヒトゲノム座標(「Genome Reference Consortium」, National Center for Biotechnology Information、reference assembly GRCh37/hg19と比較して)を表20に示す。
A NLS-タグ化ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)Cas9タンパク質を、細菌発現ベクターから大腸菌(E. coli)(BL21 (DE3))において発現させて、そしてアフィニティイオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用してJinek、M.、et al.、(Science、337、816-21 (2012)に記載される方法に従って精製した。Cas9タンパク質のコード配列を、2つの核局在化配列(NLS)をC末端に含むように設計した。複合体を、三連で40pmol Cas9及びsgRNAS.th又はsn1-casRNAS.th/sn2-casRNAS.th 120pmolで構築した。sn1-casRNAS.th及びsn2-casRNAS.th成分を等モル量で混合して最終体積2.5μLで所望の濃度とし(120pmol)、2分間95℃でインキュベートし、サーモサイクラーから取り出して、室温まで平衡化させた。対照sgRNAsS.thを最終濃度(120pmol)に最終体積2.5μLで希釈し、2分間95℃でインキュベートし、サーモサイクラーから取り外し、そして室温まで並行化させた。Cas9タンパク質を結合緩衝液(20mM HEPES、100mM KCl、5mM MgCl2、1mM DTT、及び5% グリセロールpH7.4)中で適切な濃度に最終体積2.5μLで希釈し、そしてそれぞれ熱変性sgRNAS.th 又はsn1-casRNAS.th/sn2-casRNAS.th 2.5μLずつと混合し、続いて37℃で30分間インキュベートした。
sgRNAS.th/Cas9タンパク質又はsn1-casRNAS.th/sn2-casRNAS.th/Cas9タンパク質核タンパク質複合体を、were transfected into HEK293細胞(アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、Manassas、VA)に、Nucleofector(R) 96ウェルShuttleシステム(Lonza、Allendale、NJ)を使用してトランスフェクトした。標的改変の検出のためのNucleofection及びディープシーケンシングを、本質的に以前に記載されるように(実施例4)行った。
代替のsn-casPN設計
この実施例は、選択された核酸標的配列と比較して、sn-casPN/化膿性連鎖球菌(S. pyogenese)Cas9タンパク質系のインビトロでの切断パーセントを評価及び比較するための代替のsn-casPN設計の使用を説明する。代替のsn-casPN設計の各々についてネクサスエレメントにおける異なる位置にネクサス骨格中の独特の分裂を有する 3つのsn-casPNを作製した。3つのsn-casPN設計を、生化学的切断活性を3つのヒトゲノムDNA標的に方向づけるそれらの能力について試験紙た。
1. Cas9タンパク質と複合体を形成し、DNA標的結合配列を含まない第二のDNA配列と比較して、DNA標的配列を含む第一のDNA配列に、Cas9タンパク質を優先的に結合させることができる2つ又はそれ以上のポリヌクレオチドを含み、ここで2つ又はそれ以上のポリヌクレオチドの少なくとも2つは、ネクサスステムエレメントを形成するために必要である、操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
第一のネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iを含む第一のポリヌクレオチド及び第一のネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む第二のポリヌクレオチドを含み、ここで(i) 第一のネクサスステムエレメントヌクレオチド配列I及び第一のネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第一のネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iと第二のネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合によりネクサスステムエレメントを形成することができ、そして(ii) 第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドは、それぞれ5’末端及び3’末端を含む別々のポリヌクレオチドである、
実施態様1又は2に記載の操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む第二のポリヌクレオチド
[ここで、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列I及びネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iとネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合によりネクサスステムエレメントを形成することができる];並びに
5’から3’の方向に、DNA標的結合配列及び第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む第三のポリヌクレオチド、[ここで、第一のステムエレメントヌクレオチド配列I及び第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第一のステムエレメントヌクレオチド配列Iと第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により第一のステムエレメントを形成することができる];
を含み、
ここで、第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、及び第三のポリヌクレオチドは、それぞれ5’末端及び3’末端を含む別々のポリヌクレオチドである、
実施態様4又は5に記載された操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
Cas9タンパク質と複合体を形成し、PAM配列を含まないDNA配列と比較して、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列を含有するDNA配列に、Cas9タンパク質を優先的に結合させることができるtracrエレメントを含み、tracrエレメントは
(i) ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iを含む第一のポリヌクレオチド及びネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む第二のポリヌクレオチドを含み、ここで、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列I及びネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iとネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合によりネクサスステムエレメントを形成することができ、かつ(ii)第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドは、それぞれ5’末端及び3’末端を含む別々のポリヌクレオチドである、
操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
Cas9タンパク質と複合体を形成し、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列を含まないDNA配列と比較して、PAM配列を含有するDNA配列を、Cas9タンパク質優先的に結合させそして切除させることができるtracrエレメントを含み、tracrエレメントは、
(i)ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iを含む第一のポリヌクレオチド及びネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む第二のポリヌクレオチドを含み、ここでネクサスステムエレメントヌクレオチド配列I及びネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iとネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合によりネクサスステムエレメントを形成することができ、かつ(ii)第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドは、それぞれ5’末端及び3’末端を含む別々のポリヌクレオチドである、
操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
5’から3’の方向に、第一のステムエレメントヌクレオチド配列I及びネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iを含む第一のポリヌクレオチド、並びに
ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む第二のポリヌクレオチド、
[ここで、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列I及びネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iとネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合によりネクサスステムエレメントを形成することができる];並びに
5’から3’の方向に、DNA標的結合配列及び第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む第三のポリヌクレオチド、[ここで、第一のステムエレメントヌクレオチド配列I及び第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第一のステムエレメントヌクレオチド配列Iと第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により第一のステムエレメントを形成することができる]を含み;
ここで、第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、及び第三のポリヌクレオチドは、それぞれ5’末端及び3’末端を含む別々のポリヌクレオチドである、
操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
5’から3’の方向に、第一のステムエレメントヌクレオチド配列I及びネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iを含む第一のポリヌクレオチド、並びに
ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む第二のポリヌクレオチド
[ここで、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列I及びネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iとネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合によりネクサスステムエレメントを形成することができる];並びに
5’から3’の方向に、DNA標的結合配列及び第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む第三のポリヌクレオチド、[ここで、第一のステムエレメントヌクレオチド配列I及び第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第一のステムエレメントヌクレオチド配列Iと第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により第一のステムエレメントを形成することができる]を含み;
ここで、第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、及び第三のポリヌクレオチドは、それぞれ5’末端及び3’末端を含む別々のポリヌクレオチドである、
操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
5’末端及び3’末端を含む第二のポリヌクレオチド、[第二のポリヌクレオチドはネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIを含み、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、5’から3’の方向に、Ny-Nc2-Nc1-Nzを含み、ここでNyは第二の補助ポリヌクレオチドであり、ここでyは第二の補助ポリヌクレオチドの長さであり、そしてyは0より大きいか0に等しく、Nc2はN2に相補的であるヌクレオチドであり、Nc1はN1に相補的なヌクレオチドであり、そしてNzは第二の連結ヌクレオチド配列であり、ここでzは第二の連結ヌクレオチド配列であり、そしてzは0より大きいか又は0に等しい];
を含む2つ又はそれ以上のポリヌクレオチドを含み、
ここで、(i)第一のネクサスステムエレメントヌクレオチド配列及び第二のネクサスステムエレメントヌクレオチド配列は、少なくともN1/Nc1とN2/Nc2との間の塩基対水素結合によりネクサスステムエレメントを形成することができ、かつ(ii)第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドは別々のポリヌクレオチドである、
操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
5’末端及び3’末端を含む第二のポリヌクレオチド、[第二のポリヌクレオチドは、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIを含み、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、5’から3’の方向に、Ny-Nc2-Nc1-Nzを含み、ここでNyは第二の補助ポリヌクレオチドであり、ここでyは第二の補助ポリヌクレオチドの長さであり、そしてyは0より大きいか又は0に等しく、Nc2はN2に相補的なヌクレオチドであり、Nc1はN1に相補的なヌクレオチドであり、そしてNzは第二の連結ヌクレオチド配列であり、ここでzは第二の連結ヌクレオチド配列の長さであり、そしてzは0より大きいか又は0に等しい];並びに
5’末端及び3’末端を含み、5’から3’の方向に、DNA標的結合配列及び第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む第三のポリヌクレオチド
を含み;
ここで、(i)第一のネクサスステムエレメントヌクレオチド配列I及び第一のネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、少なくともN1/Nc1とN2/Nc2との間の塩基対水素結合によりネクサスステムエレメントを形成することができ、(ii)第一のステムエレメントヌクレオチド配列I及び第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第一のステムエレメントヌクレオチド配列Iと第二のステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基
対水素結合により第一のステムエレメントを形成することができ、かつ(iii)第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、及び第三のポリヌクレオチドは別々のポリヌクレオチドである、
操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
ここで下部ステムエレメントはバルジエレメントに隣接しており、
バルジエレメントは上部ステムエレメントに隣接しており、
バルジエレメントは、下部ステムエレメントと上部ステムエレメントとの間に挿入され、そして
上部ステムエレメントは第一のヘアピンを含む、
実施態様13に記載の操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
5’から3’の方向に、DNA標的結合配列及び第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む第三のポリヌクレオチドをさらに含み、そして
第一のポリヌクレオチドは、5’から3’の方向に、第一のステムエレメントヌクレオチド配列I及びネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iをさらに含み、
ここで、第一のステムエレメントヌクレオチド配列I及び第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第一のステムエレメントヌクレオチド配列Iと第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により第一のステムエレメントを形成することができ、そして
第三ポリヌクレオチド、第一のポリヌクレオチド、及び 第二のポリヌクレオチドは、それぞれ5’末端及び3’末端を含む別々のポリヌクレオチドである、
実施態様3、7、8、又は11のいずれか1項に記載の操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
5’から3’の方向に、DNA標的結合配列、下部ステムエレメントヌクレオチド配列II、バルジエレメントヌクレオチド配列II、及び上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む第三のポリヌクレオチドをさらに含み、そして
第一のポリヌクレオチドは、5’から3’の方向に、上部ステムエレメントヌクレオチド配列I、バルジエレメントヌクレオチド配列I、下部ステムエレメントヌクレオチド配列I、及びネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iをさらに含み、
ここで、上部ステムエレメントヌクレオチド配列I及び上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIは、上部ステムエレメントヌクレオチド配列Iと上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により上部ステムエレメントを形成することができ、そして下部ステムエレメントヌクレオチド配列I及び下部ステムエレメントヌクレオチド配列IIは、下部ステムエレメントヌクレオチド配列Iと下部ステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により下部ステムエレメントを形成することができる、
実施態様3、7、8、又は11のいずれか1つに記載の操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
第一のポリヌクレオチドは、5’から3’の方向に、上部ステムエレメントヌクレオチド配列I;バルジエレメントヌクレオチド配列I;下部ステムエレメントヌクレオチド配列Iを含む第一のステムエレメントヌクレオチド配列I;及びネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iを含み;
ここで、上部ステムエレメントヌクレオチド配列I及び上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIは、上部ステムエレメントヌクレオチド配列Iと上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により上部ステムエレメントを形成することができ、そして下部ステムエレメントヌクレオチド配列I及び下部ステムエレメントヌクレオチド配列IIは、下部ステムエレメントヌクレオチド配列Iと下部ステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により下部ステムエレメントを形成することができる、
実施態様6、9、10、又は12のいずれか1つに記載の操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
DNA標的結合配列を含むスペーサーポリヌクレオチドをさらに含み、そして
第一のポリヌクレオチドは、5’から3’の方向に、下部ステムエレメントヌクレオチド配列I、バルジエレメントヌクレオチド配列I、上部ステムエレメントヌクレオチド配列I、ループエレメントヌクレオチド配列、上部ステムエレメントヌクレオチド配列II、バルジエレメントヌクレオチド配列II、下部ステムエレメントヌクレオチド配列II、及び第一のネクサスステムエレメントヌクレオチド配列をさらに含み、
ここで、上部ステムエレメントヌクレオチド配列I及び上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIは、上部ステムエレメントヌクレオチド配列Iと上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により上部ステムエレメントを形成することができ、そして下部ステムエレメントヌクレオチド配列I及び下部ステムエレメントヌクレオチド配列IIは、下部ステムエレメントヌクレオチド配列Iと下部ステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により下部ステムエレメントを形成することができる、
実施態様3、7、8、又は11のいずれか1つに記載の操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
DNA標的結合配列を含むスペーサーポリヌクレオチド、
第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む第三のポリヌクレオチドをさらに含み、そして
第一のポリヌクレオチドは、5’から3’の方向に、第一のステムエレメントヌクレオチド配列I及びネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iをさらに含み、
ここで、第一のステムエレメントヌクレオチド配列I及び第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第一のステムエレメントヌクレオチド配列Iと第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により第一のステムエレメントを形成することができる、
実施態様3、7、8、又は11のいずれか1つに記載の操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
DNA標的結合配列を含むスペーサーポリヌクレオチド、
5’から3’の方向に、下部ステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む第一のステムエレメントヌクレオチド配列II;バルジエレメントヌクレオチド配列II;及び上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む第三のポリヌクレオチド;
をさらに含み
第一のポリヌクレオチドは、5’から3’の方向に、上部ステムエレメントヌクレオチド配列I;バルジエレメント配列I;下部ステムエレメントヌクレオチド配列Iを含む第一のステムエレメントヌクレオチド配列I;及びネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iを含み、
ここで、上部ステムエレメントヌクレオチド配列I及び上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIは、上部ステムエレメントヌクレオチド配列Iと上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により上部ステムエレメントを形成することができ、そして下部ステムエレメントヌクレオチド配列I及び下部ステムエレメントヌクレオチド配列IIは、下部ステムエレメントヌクレオチド配列Iと下部ステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により下部ステムエレメントを形成することができる、
実施態様3、7、8、又は11のいずれか1つに記載の操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
クレオチド配列II、第二のステムエレメント、及び第三のステムエレメントを含み、ここで第三のステムエレメントはヘアピンを含む、実施態様27に記載の操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
第二のステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む第一の付属ポリヌクレオチド
をさらに含み、ここで第二のステムエレメントヌクレオチド配列I及び第二のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第二のステムエレメントヌクレオチド配列Iと第二のステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により第二のステムエレメントを形成することができる、実施態様3、又は6〜26のいずれか1つに記載の操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
第二の付属ポリヌクレオチドが、5’から3’の方向に、第三のステムエレメントヌクレオチド配列IIを含み、ここで第三のステムエレメントヌクレオチド配列I及び第三のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第三のステムエレメントヌクレオチド配列Iと第三のステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により第三のステムエレメントを形成することができる、
実施態様29又は30に記載の操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、2つの連続したヌクレオチドを含み、第一のヌクレオチド(Nc1)は第二のヌクレオチド(Nc2)と連続しており、ここでNc1はNc2の3’であり、
ここでネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IのN1-N2は、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIのNc1-Nc2に対して相補的である、
実施態様3、6〜10、又は13〜60のいずれか1つに記載の操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系。
を含む、1つ又はそれ以上の発現カセット。
を含む、医薬組成物。
を含む、医薬組成物。
を含む、医薬組成物。
DNAを改変する方法であって、
ここで、操作されたII型CRISPR-Cas9ポリヌクレオチド及びCas9タンパク質は複合体を形成し、該複合体が、DNA標的配列に結合して切除し、DNAの改変を生じる、上記方法。
ここで、第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、第三のポリヌクレオチド、及びCas9タンパク質は複合体を形成し、該複合体がDNA標的配列に結合して切除し、DNAの改変を生じる、
DNAを改変する方法。
遺伝子中のDNA標的配列を、実施態様1〜83のいずれか1つに記載の操作されたII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系、及びCas9タンパク質と接触させることを含み、
ここで、操作されたII型CRISPR-Cas9ポリヌクレオチド及びCas9タンパク質は複合体を形成し、該複合体はDNA標的配列に結合して遺伝子の発現の調節を生じる、上記方法。
遺伝子中のDNA標的配列を、実施態様6、9、10、12、15、16、17、19、又は20のいずれか1つに記載のII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド系、及びCas9タンパク質と接触させることを含み、
ここで、第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、第三のポリペプチド及びCas9タンパク質は複合体を形成し、該複合体は、DNA標的配列に結合して遺伝子の発現の調節を生じる、上記方法。
Claims (23)
- II型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド組成物であって:
5’から3’の方向に、第一のステムエレメントヌクレオチド配列I及びネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iを含む5’末端及び3’末端を含む第一のII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド(sn1-casPN);
5’から3’の方向に、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む5’末端及び3’末端を含む第二のII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド(sn2-casPN)[ここで、sn1-casPNのネクサスステムエレメントヌクレオチド配列I及びsn2-casPNのネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iとネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合によりネクサスステムエレメントを形成することができる];並びに
5’から3’の方向に、核酸標的結合配列及び第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む5’末端及び3’末端を含む第三のII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド(sn3-casPN)[ここで、sn1-casPNの第一のステムエレメントヌクレオチド配列I及びsn3-casPNの第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第一のステムエレメントヌクレオチド配列Iと第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により第一のステムエレメントを形成することができる]
を含む、上記組成物。 - sn1-casPNの第一のステムエレメントヌクレオチド配列Iが、5’から3’の方向に、上部ステムエレメントヌクレオチド配列I、バルジエレメントヌクレオチド配列I、及び下部ステムエレメントヌクレオチド配列Iをさらに含み、そして
sn3-casPNの第一のステムエレメントヌクレオチド配列IIが、5’から3’の方向に、下部ステムエレメントヌクレオチド配列II、バルジエレメントヌクレオチド配列II、及び上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIをさらに含み、こここで、sn1-casPNの上部ステムエレメントヌクレオチド配列I及びsn3-casPNの上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIは、上部ステムエレメントヌクレオチド配列Iと上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により上部ステムエレメントを形成することができ、そしてsn1-casPNの下部ステムエレメントヌクレオチド配列I及びsn3-casPNの下部ステムエレメントヌクレオチド配列IIは、下部ステムエレメントヌクレオチド配列Iと下部ステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により下部ステムエレメントを形成することができる、
請求項1に記載の組成物。 - 第二のステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む5’末端及び3’末端を含む第一の付属ポリヌクレオチドをさらに含み; ここで
sn2-casPNは、5’から3’の方向に、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列II及び第二のステムエレメントヌクレオチド配列Iを含み、かつ
sn2-casPNの第二のステムエレメントヌクレオチド配列I及び第一の付属ポリヌクレオチドの第二のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第二のステムエレメントヌクレオチド配列Iと第二のステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により第二のステムエレメントを形成することができる、
請求項1又は2に記載の組成物。 - 第一の付属ポリヌクレオチドは、5’から3’の方向に、ループエレメントヌクレオチド配列及び第二のステムエレメントヌクレオチド配列IIをさらに含み、そしてここで第一の付属ポリヌクレオチドの5’末端は、sn2-casPNの3’末端に共有結合で結合される、請求項3に記載の組成物。
- 第三のステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む5’末端及び3’末端を含む第二の付属ポリヌクレオチドをさらに含み;ここで
第一の付属ポリヌクレオチドは、5’から3’の方向に、ループエレメントヌクレオチド配列、第二のステムエレメントヌクレオチド配列II、及び第三のステムエレメントヌクレオチド配列Iを含み、かつ
第一の付属ポリヌクレオチドの第三のステムエレメントヌクレオチド配列I及び第二の付属ポリヌクレオチドの第三のステムエレメントヌクレオチド配列IIは、第三のステムエレメントヌクレオチド配列Iと第三のステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により第三のステムエレメントを形成することができる、
請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。 - 第二の付属ポリヌクレオチドが、5’から3’の方向に、ループエレメントヌクレオチド配列及び第三のステムエレメントヌクレオチド配列IIをさらに含み、ここで第二の付属ポリヌクレオチドの5’末端は、第一の付属ポリヌクレオチドの3’末端に共有結合で結合される、請求項5に記載の組成物。
- sn1-casPNが、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iと3’で隣接した第一の補助ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- sn2-casPNが、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIと5’で隣接した第二の補助ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- sn1-casPNは、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iと3’で隣接した第一の補助ポリヌクレオチドをさらに含み、そして第一の補助ポリヌクレオチドは、エフェクター結合エレメントヌクレオチド配列Iをさらに含み、
sn2-casPNは、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIと5’で隣接した第二の補助ポリヌクレオチドをさらに含み、そして第二の補助ポリヌクレオチドは、エフェクター結合エレメントヌクレオチド配列IIをさらに含み、かつ
第一の補助ポリヌクレオチドのエフェクター結合エレメントヌクレオチド配列I及び第二の補助ポリヌクレオチドのエフェクター結合エレメントヌクレオチド配列IIは、エフェクター結合エレメントヌクレオチド配列Iとエフェクター結合エレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合によりエフェクター結合エレメントを形成することができる、
請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。 - 第一の補助ポリヌクレオチドが、5’から3’の方向に、リンカーエレメントヌクレオチド配列I及びエフェクター結合エレメントヌクレオチド配列Iをさらに含み、
第二の補助ポリヌクレオチドが、5’から3’の方向に、エフェクター結合エレメントヌクレオチド配列II及びリンカーエレメントヌクレオチド配列IIを含み、そして第一の補助ポリヌクレオチドのリンカーエレメントヌクレオチド配列I及び第二の補助ポリヌクレオチドのリンカーエレメントヌクレオチド配列IIは、リンカーエレメントヌクレオチド配列Iとリンカーエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合によりリンカーエレメントを形成することができる、
請求項9に記載の組成物。 - エフェクター結合エレメントが二本鎖RNAであり、かつエフェクター結合エレメントがCsy4タンパク質結合部位を含む、請求項9又は10に記載の組成物。
- 第一の補助ポリヌクレオチドがヘアピンを含む、請求項7、9、又は10のいずれか1項に記載の組成物。
- 第二の補助ポリヌクレオチドがヘアピンを含む、請求項8、9、又は10のいずれか1項に記載の組成物。
- 第一の補助ポリヌクレオチドが、5’から3’の方向に、リンカーエレメントヌクレオチド配列I及びヘアピンをさらに含み、
第二の補助ポリヌクレオチドが、5’から3’の方向に、ヘアピン及びリンカーエレメントヌクレオチド配列IIをさらに含み、かつ
第一の補助ポリヌクレオチドのリンカーエレメントヌクレオチド配列I及び第二の補助ポリヌクレオチドのリンカーエレメントヌクレオチド配列IIは、リンカーエレメントヌクレオチド配列Iとリンカーエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合によりリンカーエレメントを形成することができる、
請求項13に記載の組成物。 - 5’から3’の方向に、上部ステムエレメントヌクレオチド配列I、バルジエレメントヌクレオチド配列I、下部ステムエレメントヌクレオチド配列I、及びネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iを含む5’末端及び3’末端を含む第一のII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド(sn1-casPN);
5’から3’の方向に、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列II、ヘアピンを含む第二のステムエレメント、及びヘアピンを含む第三のステムエレメントを含む5’末端及び3’末端を含む第二のII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド(sn2-casPN)[ここで、sn1-casPNのネクサスステムエレメントヌクレオチド配列I及びsn2-casPNのネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIは、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iとネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合によりネクサスステムエレメントを形成することができる];並びに
5’から3’の方向に、DNA標的結合配列、下部ステムエレメントヌクレオチド配列II、バルジエレメントヌクレオチド配列II、及び上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIを含む5’末端及び3’末端を含む第三のII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド(sn3-casPN)[ここで、sn1-casPNの上部ステムエレメントヌクレオチド配列I及びsn3-PNの上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIは、上部ステムエレメントヌクレオチド配列Iと上部ステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により上部ステムエレメントを形成することができ、かつsn1-PNの下部ステムエレメントヌクレオチド配列I及びsn3-PNの下部ステムエレメントヌクレオチド配列IIは、下部ステムエレメントヌクレオチド配列Iと下部ステムエレメントヌクレオチド配列IIとの間の塩基対水素結合により下部ステムエレメントを形成することができる]
を含む、II型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド組成物。 - sn1-casPNが、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列Iと3’で隣接した第一の補助ポリヌクレオチドをさらに含み、そしてsn2-casPNは、ネクサスステムエレメントヌクレオチド配列IIと5’で隣接した第二の補助ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項15に記載の組成物。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載のII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド組成物;及び
Cas9タンパク質又はCas9タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む、II型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド/Cas9タンパク質系。 - 請求項1〜14のいずれか1項に記載のII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド組成物;及び
薬学的に許容しうる添加剤
を含む、医薬組成物。 - 請求項1〜14のいずれか1項に記載のII型CRISPR-Cas9関連分断分断ネクサスポリヌクレオチド組成物;及び
Cas9タンパク質
を含むII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド/Cas9タンパク質核タンパク質複合体であって;
ここで、II型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド/Cas9タンパク質核タンパク質複合体は、核酸標的結合に相補的な標的核酸への部位特異的結合をすることができる、上記複合体。 - 標的核酸を切除する方法であって:
標的核酸を含む核酸を、請求項19に記載のII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド/Cas9タンパク質核タンパク質複合体と接触させ、それによりII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド/Cas9タンパク質核タンパク質複合体の標的核酸への結合を促進することを含み、ここで結合したII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド/Cas9タンパク質核タンパク質複合体が、標的核酸を切除する、上記方法。 - 標的核酸を結合する方法であって:
標的核酸を含む核酸を、請求項19に記載のII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド/Cas9タンパク質核タンパク質複合体と接触させ、それによりII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド/Cas9タンパク質核タンパク質複合体の標的核酸への結合を促進することを含む、上記方法。 - 請求項1〜14のいずれか1項に記載のII型CRISPR-Cas9関連分断ネクサスポリヌクレオチド組成物、及び
緩衝液
を含む、キット。 - Cas9タンパク質又はCas9タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項22に記載のキット。
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