JP2018520641A - 多重侵入切断アッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年5月1日に出願された米国仮出願番号第62/156,043号の利益を主張しており、その内容は、本明細書によって本明細書中に援用される。
本開示は、一般に、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本開示は、単一チャネル蛍光モニタリングを使用する時間的区別を用いる複数の標的核酸の独立した検出を可能にする多重侵入切断アッセイに関する。
標的増幅および/またはハイブリダイゼーションに基づくシグナル増幅を使用する特異的核酸配列の検出は、生物、単一ヌクレオチド多型、突然変異などを同定するための柔軟な手法である。核酸増幅技術は、等温増幅(例えば、転写媒介性増幅、または「TMA」)反応、および熱サイクリングを含む反応(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、または「PCR」)を含む。これらの他に、検出の前に標的コピーレベルを増加させる必要性を迂回することさえできるシグナル増幅反応もある。侵入切断反応は、例示的なシグナル増幅反応の代表である。
増幅された核酸の多重検出のために設計されたいくつかのアッセイは、複数の標的核酸の検出のための単一のリポーターに依拠してきた。例えば、米国特許出願公開第2012/0003646A1号は、同一のアクリジニウムエステル標識を担持する異なるプローブを使用した増幅された内部対照(IC)と増幅されたウイルス標的配列との検出を開示した。両方の増幅産物は、単一セットのアッセイ条件下で同時に検出されたが、これは、結果が独立に、またはシグナルの起源を区別する様式で集積されないことを意味する。示差閾値分析を適用して、ICのみ、または組合せとしての内部対照と標的との組合せの存在を確立した。この手法により、ウイルス分析物を検出することができたが、内部対照および分析物に起因する個々の寄与は依然として曖昧であった。
本開示の態様は、複数の異なる標的核酸のうちのどれが試験試料中に存在するかを決定する方法に関する。一態様では、方法は、試験試料に由来する核酸を含有する反応混合物中で、多重侵入切断アッセイの複数の二次反応を連続的に起こさせるステップであって、それぞれの二次反応が異なる温度条件下で活性であり、それぞれの二次反応がただ1つの標的核酸に特異的である、ステップを含む。方法は、それぞれの異なる温度条件下で蛍光シグナルの産生について反応混合物をモニタリングするステップであって、それぞれの異なる温度条件がただ1つの二次反応を可能にし、それぞれの二次反応が同じ蛍光シグナルを産生する、ステップをさらに含む。さらに、方法は、それぞれの異なる温度条件下、反応混合物中で産生された蛍光シグナルに基づいて、標的核酸のうちのどれが試験試料中に存在するかを決定するステップを含む。第1の好ましい実施形態では、試験試料は、核酸増幅反応の産物を含み、それぞれの複数の標的核酸は、核酸増幅反応の産物である。第2の好ましい実施形態では、試験試料は、多重核酸増幅反応の産物を含み、それぞれの複数の標的核酸は、多重核酸増幅反応の産物である。一般的に好ましい実施形態によれば、反応混合物は、熱安定性DNAポリメラーゼ酵素を含む。別の一般的に好ましい実施形態によれば、それぞれの異なる温度条件は、互いに5℃〜30℃異なる。好ましくは、それぞれの異なる温度条件は、互いに5℃〜15℃異なってもよい。別の一般的に好ましい実施形態によれば、決定ステップは、それぞれの異なる温度条件下、反応混合物中で産生された蛍光シグナルの量に基づいて、標的核酸のうちのどれが試験試料中に存在するかを決定することを含む。別の一般的に好ましい実施形態によれば、決定ステップは、それぞれの異なる温度条件下、反応混合物中での蛍光シグナルの産生率に基づいて、標的核酸のうちのどれが試験試料中に存在するかを決定することを含む。
本明細書で使用される用語「試料」とは、目的の分析物(例えば、微生物、ウイルス、遺伝子などの核酸、または分析物中の、もしくはそれに由来する核酸配列を含むその成分)を含有してもよい標本を指す。試料は、生物標本または環境起源などの任意の起源に由来するものであってもよい。生物標本は、分析物または分析物中の、もしくはそれに由来する核酸を含有してもよい生きている生物または死んだ生物に由来する任意の組織または材料を含む。生物試料の例としては、膣スワブ試料、呼吸器組織、滲出液(例えば、気管支肺胞洗浄)、生検、痰、末梢血、血漿、血清、リンパ節、胃腸組織、糞便、尿、または他の流体、組織もしくは材料が挙げられる。環境試料の例としては、水、氷、土壌、スラリー、デブリ、生物膜、浮遊微小粒子、およびエアロゾルが挙げられる。試料は、濾過、遠心分離、沈降化、またはマトリックスもしくは支持体などの媒体への付着を使用することによる試料の処置から得られるものなどの、プロセッシングされた標本または材料であってもよい。試料の他のプロセッシングは、組織、細胞凝集物、または細胞を物理的または機械的に破壊して、核酸を含む細胞内成分を、酵素、緩衝液、塩、界面活性剤などの他の成分を含有してもよい溶液中に放出させるための処理を含んでもよい。ときには、分析物の存在について試験される試料を、「試験試料」と呼んでもよい。
本開示による侵入切断アッセイのオリゴヌクレオチド成分を、図1A〜1B中の図によって例示する。アッセイは、標的核酸の存在を必要とする侵入切断構造を形成するための手段を提供する。アッセイはさらに、侵入切断構造を切断して、別個の切断産物を遊離することを含む。例えば、FEN酵素を使用して、標的依存的侵入切断構造を切断し、それによって、試料中の特定の標的核酸配列の存在を示す切断産物を得る。2つのオリゴヌクレオチドが標的核酸鎖にハイブリダイズし、それらが以下に記載されるような重複侵入切断構造を形成する場合、侵入切断は周知の機構によって起こり得る。切断剤(例えば、FEN酵素)と上流のオリゴヌクレオチド(すなわち、侵入プローブ)との相互作用により、別個の断片が産生されるように、切断剤に、内部部位で下流のオリゴヌクレオチド(すなわち、一次プローブ)を切断させることができる。次いで、「切断された5’フラップ」と呼ばれることもある断片は、検出可能なシグナル(例えば、蛍光シグナル)を生成するその後の反応に侵入プローブとして参加することができる。そのような実施形態は、米国特許第5,846,717号、第5,985,557号、第5,994,069号、第6,001,567号、および第6,090,543号、WO97/27214、WO98/42873、Nat.Biotech.、17巻:292頁(1999年)、PNAS、97巻:8272頁(2000年)に記載されており、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。実際、これらの参考文献に開示されたINVADERアッセイは、本明細書に開示される技術における侵入切断アッセイとしての使用にとって非常に好ましい。より具体的には、単一の反応混合物中で混合した場合、およびFRETカセットを標識するために共通のフルオロフォアを使用した場合、複数のINVADER反応が、本明細書に開示される多重適用にとって非常に好ましい。
本開示による多重化侵入切断アッセイは多重化侵入切断アッセイにより生成される蛍光シグナルを検出するためにただ1つの検出チャネルを用い、好ましくは、シグナル生成のために同じフルオロフォアを使用するが、フルオロフォアの同一性は変動してもよい。開示される技術のFRETカセットにおける使用のための好適なフルオロフォアとしては、限定されるものではないが、フルオレセイン、ローダミン、Redmond Red色素、Yakima Yellow色素、ヘキサクロロ−フルオレセイン、TAMRA色素、ROX色素、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、およびCy7、4,4−ジフルオロ−5,7−ジフェニル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−プロピオン酸、4,4−ジフルオロ−5,p−メトキシフェニル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−プロピオン酸、4,4−ジフルオロ−5−スチリル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−S−インダセン−プロピオン酸、6−カルボキシ−X−ローダミン、N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン、テキサスレッド、エオシン、フルオレセイン、4,4−ジフルオロ−5,7−ジフェニル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−プロピオン酸、4,4−ジフルオロ−5,p−エトキシフェニル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン3−プロピオン酸および4,4−ジフルオロ−5−スチリル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−S−インダセン−プロピオン酸、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、2’,4’,1,4−テトラクロロフルオレセイン(TET)、21,4’,51,7’,1,4−ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、2’,7’−ジメトキシ−4’,5’−ジクロロ−6−カルボキシローダミン(JOE)、2’−クロロ−5’−フルオロ−7’,8’−融合フェニル−1,4−ジクロロ−6−カルボキシフルオレセイン(NED)、2’−クロロ−7’−フェニル−1,4−ジクロロ−6−カルボキシフルオレセイン(VIC)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、5,6−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンザ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル(NBD)、クマリン、ダンシルクロリド、アミノ−メチルクマリン(AMCA)、エリスロシン、BODIPY色素、CASCADE BLUE色素、OREGON GREEN色素、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、QUANTUM DYE、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロダイマーなどが挙げられる。
図2は、一次および二次反応が同じ反応温度で同時に起こるように設計された、図1Aに示されるオリゴヌクレオチド成分を使用して実行される典型的な侵入切断アッセイの温度プロファイルを示す。一般的に言えば、侵入切断反応のための最適温度(すなわち、図2に示される曲線の最大値に対応する)は、サイクリングプローブ(例えば、一次プローブまたは切断された5’フラップ)のTmで、またはその3℃以内に存在する。同じ指針は、一次および二次侵入切断反応が異なる最適温度条件下で起こる侵入切断アッセイにも適用される。図2に示される例では、標的核酸への侵入プローブのハイブリダイゼーションに関するTmは、約68℃であった。標的核酸への一次プローブのハイブリダイゼーションに関するTmは、約62℃であった。FRETカセットへの切断された5’フラップのハイブリダイゼーションに関するTmは、約62℃であった。シグナル生成反応を、異なる温度で標準的な試薬および手順を使用して実行した後、蛍光終点読取り値を、標的核酸を含まない同様の反応からの結果と比較した場合(すなわち、シグナルノイズ比として)、図面に示されるベル状の曲線が得られた。再度、重要な知見は、最大の反応活性が実質的にはTmで起こり、Tmは曲線のピークに一致したことであった。同様に、曲線上の肩は急勾配であり、Tm、または曲線のピークの約5℃上および下でほぼバックグラウンドまで減少した。アッセイは、明らかに温度依存的であり、反応温度が、反応中でサイクリングするオリゴヌクレオチドのTmの±3℃以内にある場合、最大蛍光シグナルを生成した。この例では、一次プローブの標的アニーリング領域、および切断された5’フラップは、それぞれ、標的核酸およびFRETカセットのサイクリングをオンおよびオフにした。本発明者らは、5〜10℃離れた曲線ピークを有する、2つの侵入切断反応を、同じ反応混合物中のそれぞれのTmに対応する温度で、またはそれに近い温度で独立に行うことができることをこれから引き出した。
本開示は、試験試料中に含有される複数の標的核酸配列を、リポーターとしてのわずか1つの型の蛍光部分の単一チャネル検出を使用して、単一の反応混合物中で検出することができる、多重侵入切断アッセイの使用を提供する。一部の実施形態では、多重侵入切断アッセイは、再度、リポーターとしての単一の型の蛍光部分の検出を使用する単一の反応混合物中での複数の標的核酸配列の検出を含む定量アッセイである。
一般的に言えば、異なる標的配列を検出するための多重アッセイにおいて使用される第1および第2のFRETカセットは、等価であり、同一であってもよいドナー部分(例えば、フルオロフォア)を含むべきである。これにより、第2の切断反応が起こったことを示す単一チャネル検出が容易になる。より具体的には、検出機器の単一チャネルにおける蛍光放出によって検出される部分は、等価物(すなわち、等価なフルオロフォア)である。等価なドナー部分が外部エネルギー源によって直接励起されるかどうか、またはそれらがエネルギー移動関係にある近隣の第2の部分からエネルギーを受け取るかどうかは、設計選択の問題である。注目すべきことに、第1のフルオロフォアから第2のフルオロフォアへのエネルギー移動、次いで、第2のフルオロフォアからの検出可能な波長の放出の詳細は、米国特許第6,150,097号で考察されており、その開示は参照により組み込まれる。
本明細書に開示される多重技術は、侵入切断アッセイのオリゴヌクレオチド成分の設計における柔軟性を利用する。侵入切断反応は、温度依存的であり、反応を実施するための使用される温度がサイクリングするように設計されるオリゴヌクレオチド配列(すなわち、標的核酸にハイブリダイズする一次プローブの配列;およびFRETカセットにアニーリングする切断された5’フラップの配列)のTmに実質的に一致する場合に時間の関数として増大するシグナルを生成する。サイクリングはこのTmより約5℃下では実質的に起こらず、したがって、実質的にシグナル生成はない。このTmより約5℃上では、オリゴは実質的にアニーリングせず、したがって、実質的にシグナル生成はない。この手法により、反応温度がシフトした後、特定の標的配列を示すシグナルが収集される期間にわたって一定に維持される場合、多重化侵入切断反応の活性を、時間的に分離することができる。
アッセイ設計の一般的特徴を、図3に例示される例を参照して理解することができる。この図面は、3つの反応温度条件を例示し、3つのアッセイがそれぞれ、異なる標的核酸を検出する、3つの多重化侵入切断アッセイの状態(例えば、多重アッセイを行うためのオリゴヌクレオチド試薬)を図式化する。異なる標的の存在を示すシグナルを検出するために使用されるFRETカセットは全て、同じフルオロフォアおよびクエンチャー対で標識される。3つの異なる侵入切断アッセイ(すなわち、「第1」、「第2」および「第3」の侵入切断アッセイ)は、それぞれ、63℃、53℃および43℃の最適温度を有すると示される。この例示において、特定の標的核酸の検出と関連する一次および二次切断反応は両方とも、同じ温度で起こる。実際、この例示における一次および二次切断反応は、異なる温度条件下では行われない。
一部の実施形態では、2またはそれ超の異なる侵入切断アッセイのための試薬を、単一の反応混合物中で組み合わせ、それらのそれぞれの一次反応を同時に(すなわち、同じ時間に、同じ温度条件下で)実行し、それらのそれぞれの二次反応を、異なる温度条件下で異なる時間に実行する。異なる一次反応から生じる切断された5’フラップは、それぞれ、同じフルオロフォア部分を担持する、そのそれぞれのFRETカセットに異なるTmでハイブリダイズする。図4に示されるように、そのそれぞれの最適温度での二次切断反応の実施により、2またはそれ超の侵入切断アッセイを独立にモニタリングすることができる。リポーターとしての単一のフルオロフォア、および蛍光モニタリング機器(例えば、蛍光光度計)の単一の検出チャネルを使用して、少なくとも2つの異なる結果を得ることができる。さらに、複数の標的特異的一次反応が同時に、また同じ温度で起こり得るとしても、本発明者らは、所定の速度を使用して全ての標的に関する定量結果をさらに得ることができる。速度は、酵素反応速度により支配され、酵素の初速は基質濃度に依存する。したがって、FRETが切断される率は、一次反応において作出されるフラップの数に依存し、次いで、標的の濃度に依存する。複数の一次反応を組み合わせる場合であっても、量的な差異は二次反応に依然として反映される。
自動化機器の単一のフルオロフォアおよび/または検出チャネルのみを用いる、多重化侵入切断アッセイを有利に使用して、複数の核酸増幅反応(例えば、PCR反応)のリアルタイムモニタリングを実行することができる。この手法により、2、3、4、さらには5つのリアルタイム実行曲線を、用いられるそれぞれの蛍光色素について得ることができる。本明細書に開示される方法を実行するための適切なソフトウェアにより構成された場合、従来の4チャネルのリアルタイムPCR機器は、単一の反応混合物から8〜20のリアルタイム実行曲線結果を生成することができる。
一部の実施形態では、異なる標的核酸に特異的な侵入切断反応により生成される蛍光シグナルに対応する、異なる温度ステップ中に取られる連続蛍光読取り値は、温度シフトが高温から低温に向かって順に起こる際に取られる。
多重化する能力を、反応条件(オリゴ濃度、酵素レベル、緩衝液、反応プロファイルなど)を調整することによってさらに増強することができる。この最適化は、蛍光色素あたり少なくとも3、より好ましくは4、おそらく5の回答を得る能力をもたらし得る。
一部の実施形態では、本開示は、少なくとも4〜6、もしくは10またはそれ超のヌクレオチドによって任意の切断部位から除去された位置で対応する標的配列と、1または複数(好ましくは、1)のミスマッチを有するオリゴヌクレオチドを提供する。開示される技術は、特定の機構に限定されない。実際、開示される技術を実行するために、その機構の理解は必要ない。それにも拘わらず、1または複数のミスマッチの存在は、オリゴヌクレオチドを標的に結合させるが、ミスマッチがない対応するオリゴヌクレオチドと比較して親和性が低下し、それによって、その標的核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのためのTmに影響することが企図される。
他の実施形態では、開示される技術は、結合効率を変化させるための電荷改変オリゴヌクレオチドを用いる(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,780,982号を参照されたい)。一部の実施形態では、電荷改変オリゴヌクレオチドは、「電荷タグ」を含む。正に荷電した部分は、常に正の電荷を担持する必要はない。本明細書で使用される用語「正に荷電した部分」とは、その意図される使用の反応条件下で(例えば、所望の反応条件のpHの下で目的の分子に結合する場合)、正味の正電荷を有する化学構造を指す。実際、本開示の一部の好ましい実施形態では、正に荷電した部分は、それが適切な反応条件に導入されるまで正電荷を担持しない。これはまた、「pH依存的」および「pH非依存的」正電荷と考えられる。pH依存的電荷は、ある特定のpH条件下でのみ電荷を有するものであるが、pH非依存的電荷は、pH条件とは関係なく電荷を有するものである。
オリゴヌクレオチド結合のハイブリダイゼーション強度を改変する任意の内部(例えば、オリゴヌクレオチドに対して)または外部因子が、本開示の方法および組成物と共に使用するのに好適である。それが侵入切断および/またはPCR化学に対して阻害的ではないか、または限られた阻害効果を有する限り、これが当てはまる。
さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を変化させるために、オリゴヌクレオチド長を変化させる。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率を変化させるために、二次構造が用いられる。例えば、一部の実施形態では、2またはそれ超のオリゴヌクレオチドが、同じ標的配列にハイブリダイズするように設計される。一方のオリゴヌクレオチドは、最小の二次構造を有するように設計される。標的配列認識を保持するが、二次構造を有するさらなるオリゴヌクレオチドが設計される。二次構造を有するオリゴヌクレオチドは、変化したハイブリダイゼーション特性を示すことが企図される。
さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション特性を変化させるために反応条件が改変される。核酸ハイブリダイゼーション条件に影響するパラメータの例としては、限定されるものではないが、イオン強度、緩衝液組成、pH、および添加剤(例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール、およびタンパク質)が挙げられる。
さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション特性を変化させるために隣接してハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが使用される。核酸の短い鎖がより長い鎖に沿って連続的に整列する場合、骨格が実際に連続している場合であっても、塩基対はヘリックスに沿って積み重なることができるため、それぞれのハイブリダイゼーションは、近隣の断片のハイブリダイゼーションによって安定化される。この結合の協調性は、より長い核酸に単独でハイブリダイズする断片について予想されるものを超える相互作用の安定性をそれぞれの断片に与えることができる。協調的結合における摂動の事象(例えば、連続二本鎖間の境目での、またはその近くでのミスマッチによる)においては、この協調性を減少させるか、または除去することができる。本開示の一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、1または複数の隣接してハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと異なる様式で協調するように構成され、異なるハイブリダイゼーション特性を提供する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、隣接オリゴヌクレオチドとの境目の近くに1または複数のミスマッチ塩基を含み、ミスマッチを欠くオリゴヌクレオチドと比較して、結合の協調性を変化させるか、または破壊する。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、隣接塩基との積み重ね相互作用を軽減するように選択された1または複数の塩基類似体を含む。さらに他の実施形態では、協調性を変化させ、かくして、ハイブリダイゼーション特性を変化させるために、1または複数のヌクレオチドのギャップ(例えば、トランケートされたプローブの使用による)を使用することが想定される。
オリゴヌクレオチドに特徴的なハイブリダイゼーションを変化させるための任意の他の方法を、開示される技術と共に使用することもできる。他の例としては、限定されるものではないが、緩衝液条件(例えば、グアノシンクオーターの使用)またはタンパク質/核酸相互作用(例えば、核酸配列に結合するか、またはそれを変化させる核酸結合タンパク質または酵素のための結合部位を作出することによる)に応答して、配列が異なるハイブリダイゼーション挙動の影響を受けやすくなるオリゴヌクレオチドまたは標的中での配列の使用;懸垂末端の使用(例えば、懸垂末端の安定化および積み重ねのため);磁場での核酸の濃縮を可能にする鉄または他の磁性剤の結合;特定のオリゴヌクレオチドを滴定する薬剤の使用などが挙げられる。
一部の実施形態では、開示される多重侵入切断アッセイは、温度制御されたインキュベータおよびそこに含有される試料をモニタリングするための付属の蛍光光度計を含む自動化核酸分析装置を使用して実行される。蛍光光度計は、蛍光放出を、好ましくは、反応時間の関数として測定する。
本明細書に開示される方法は、コンピュータまたは同様のプロセッシングデバイス(以後、「コンピュータ」)を使用して都合良く実装される。異なる好ましい実施形態では、多重侵入切断アッセイを実行および分析するためのソフトウェアまたは機械で実行可能な命令を、フリースタンド型コンピュータのメモリ構成要素、または好ましくは時間の関数として、分析を受けている蛍光シグナルの規模をモニタリングするために使用されるデバイスに連結されたコンピュータのメモリ構成要素中にロードするか、またはそうでなければ保持することができる。非常に好ましい実施形態では、多重侵入切断手順を実行するためのソフトウェアは、時間の関数として反応混合物中で生成された蛍光シグナルをモニタリングすることができるデバイスの統合部分に連結された、または統合部分であるコンピュータのメモリ構成要素中に保持される。リアルタイム核酸増幅を実施およびモニタリングするためのコンピュータ制御された機器を、適切なソフトウェア命令を用いる改変により、多重侵入切断アッセイを実行するために適合させることができる。
多重侵入切断アッセイからのデータをプロセッシングするコンピュータ中にロードおよび実装されるソフトウェアは、典型的には、ある特定のデータを「収集すること」を含む初期ステップを命令する。これは、データファイルから定量情報を回収すること、およびその情報がソフトウェアと共に動作する電子表計算に適切に入力されることを保証することを含む。ソフトウェアが試験またはプロセッシングを受ける反応混合物中の蛍光シグナルをモニタリングする(例えば、時間の関数として)蛍光光度計を装備した分析システムのコンピュータ構成要素中にロードされる場合、データを、直接または間接に(例えば、機械インタフェースにより)、機器の蛍光光度計から収集することができる。データを収集するステップはまた、ある特定のプロセッシングステップ、例えば、直線の勾配を算出するステップ、変化率を算出するステップなども包含する。そのようなプロセッシングステップの結果を、収集されたデータの一部と考えて、関連情報がソフトウェアによって指令されるその後の操作に利用可能であることを保証することができる。
多重侵入切断アッセイにおけるヒトおよび細菌の標的核酸の検出
様々な生物試料に由来するrRNAを検出するための完全反応混合物を、自動化in vitro診断試験のためにPanther(商標)システム(Hologic,Inc.)を使用して調製した。反応混合物は、試験試料中に存在し得るヒトまたはPrevotella細菌rRNAと相補的な第1鎖cDNAを合成するのに必要なオリゴヌクレオチドプライマーおよび試薬(例えば、4種のデオキシリボヌクレオチド、緩衝液、塩など)を含んでいた。反応混合物はさらに、2つの標的のそれぞれについて:1つの侵入プローブ;5’フラップ配列を含む1つの一次プローブ;およびフルオレセイン(FAM)フルオロフォアとEclipseクエンチャー(Epoch Biosciences,Inc.)との組合せで標識された1つのFRETカセットを含んでいた。かくして、それぞれのFRETカセットは、エネルギー移動関係にある同じ相互作用標識対を含み、フルオレセイン部分がクエンチャーとして同じFRETカセットに結合した場合に蛍光放出がクエンチされた。ヒト標的cDNAの、ヒト特異的侵入プローブおよび一次プローブとのハイブリダイゼーションのためのTmは、それぞれ、69℃および64℃であった。ヒト特異的一次プローブから切断された5’フラップの、FRETカセットへのハイブリダイゼーションのためのTmは、63℃であった。細菌標的cDNAと、細菌特異的侵入プローブおよび一次プローブとのハイブリダイゼーションのためのTmは、それぞれ、約68℃〜70℃(例えば、69℃)および約63℃〜65℃(例えば、64℃)の範囲であった。細菌特異的一次プローブから切断された5’フラップの、FRETカセットへのハイブリダイゼーションのためのTmは、43℃であった。
リアルタイムモニタリングと終点検出の両方を使用する多重侵入切断アッセイとの統合型多重PCR
Mx3005PリアルタイムPCR機器(Stratagene)上での使用のために、単一の反応混合物を調製した。反応混合物は、以下の3つのヒト遺伝子配列:第II因子、第V因子、およびMTHFR1298のSNP含有断片を増幅するためのPCRプライマー対の独立したセットを含有していた。同様に、反応混合物は、一次プローブ対のセット(一方は野生型配列に特異的な各セットの一次プローブであり、他方は同じ増幅遺伝子中の突然変異SNP配列に特異的である)と共に、3つの標的遺伝子のそれぞれのための増幅産物中で高度に保存された配列を指向する侵入プローブを含んでいた。したがって、反応混合物は、それぞれ、異なる5’フラップ配列を有する6つの一次プローブを含有していた。一次プローブの1つから切断された5’フラップがただ1つのFRETカセットに見出される相補的配列にハイブリダイズすることができる、それぞれの一次プローブのための、3つの対になったセットのFRETカセットも存在していた。Redmond Red色素およびEclipseクエンチャーで標識されたFRETカセットを、野生型第II因子および第V因子、ならびに突然変異型MTHFR1298を検出する侵入切断アッセイのために使用した。これらのFRETカセットの切断により生成される蛍光放出シグナルを、PCR機器のROXチャネルにおいて検出した。FAMおよびEclipseクエンチャーまたはBlackBerry(登録商標)クエンチャーBBQ−650(登録商標)−dTで標識されたFRETカセットを、突然変異型第II因子および第V因子、ならびに野生型MTHFR1298を検出する侵入切断アッセイのために使用した。より具体的には、第II因子およびMTHFR1298標的核酸の存在を示す切断された5’フラップを検出するためのFRETカセットはBBQ−650(登録商標)−dTクエンチャーを担持していたが、第V因子標的核酸の存在を示す切断された5’フラップを検出するためのFRETカセットはEclipseクエンチャーを担持していた。これらのFRETカセットの切断により生成される蛍光放出シグナルは、PCR機器のFAMチャネル中で検出された。MTHFR677標的核酸を増幅および検出するためのオリゴヌクレオチドを省略したことを除いて、オリゴヌクレオチドの配置は本質的には図6に図示される。最後に、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、pH緩衝剤、および塩に加えて、熱安定性Taq DNAポリメラーゼおよびCleavase(登録商標)2.0酵素を含有させて、反応混合物を完成させた。
時間依存的様式とは無関係の複数の多重化侵入切断アッセイのモニタリング
分析物標的核酸について試験される試料と、既知量の第1の較正標準との両方を含有する反応混合物を調製する。本実施例において使用される既知量の第1の較正標準は、1,000コピー/mlである。反応混合物を単一のチューブに入れ、蛍光光度計を装備し、コンピュータに接続された熱サイクリング機器のブロック中に入れる。コンピュータは、熱サイクリングのプロファイルを制御し、特定の温度間隔中に特定の期間にわたって蛍光読取り値を記録する。第1の較正標準は、異なる侵入切断アッセイの使用により区別することができるヌクレオチドの差異を除いて、増幅される分析物標的核酸の部分と実質的に類似する核酸配列を含む。増幅された第1の較正標準を検出するが、増幅された分析物標的核酸を検出しない第1の侵入切断アッセイは、侵入プローブ、第1の5’フラップを含む第1の一次プローブ、およびフルオレセイン部分と、Eclipseクエンチャーなどの、適切なクエンチャー部分とを含む第1のFRETカセットを含む。増幅された分析物標的核酸を検出するが、増幅された第1の較正標準を検出しない第2の侵入切断アッセイは、同じ侵入プローブ、第2の5’フラップを含む第2の一次プローブ、およびフルオレセイン部分と、Eclipseクエンチャーなどの適切なクエンチャー部分とを含む第2のFRETカセットを含む。反応混合物は、熱安定性DNAポリメラーゼおよびCleavase(登録商標)酵素(Hologic,Inc.)をさらに含む。侵入切断アッセイの異なる二次反応のための最適温度は、少なくとも10℃異なる。第1の侵入切断アッセイの一次および二次反応は、72℃の最適温度を有する。第2の侵入切断アッセイは、72℃の最適温度を有する一次反応、および58℃の最適温度を有する二次反応を用いる。分析物標的核酸および第1の較正標準は、熱安定性DNAポリメラーゼおよび実質的に類似するDNAプライマーセットを使用して反応混合物中で同時に増幅される。熱サイクリング条件は、核酸を変性させるための94℃で5秒間;72℃で20秒間;および58℃で20秒間の40サイクルを含む。72℃のステップは、全ての核酸増幅産物の合成を可能にする;全ての一次侵入切断反応を起こさせる;および第1の較正標準に特異的な二次反応(分析物標的核酸に特異的な二次反応ではない)を起こさせる。58℃のステップは、分析物標的核酸に特異的な二次反応(第1の較正標準に特異的な二次反応ではない)を起こさせる。フルオレセイン放出波長の蛍光読取り値を、PCR機器の蛍光光度計を使用して、72℃および58℃の温度サイクル中に取る。コンピュータは、蛍光データ入力を受信し、情報をプロセッシングする。
分析物標的核酸を定量するための複数の多重化侵入切断アッセイの使用
実施例3の下で記載された手順を、10,000コピー/mlの第2の較正標準を含むように改変する。第2の較正標準を、第1の較正標準および分析物標的核酸を増幅するものと同じプライマーセットを使用して増幅する。第2の較正標準の構造は、第1の較正標準と分析物標的核酸とを区別する位置の1または複数のヌクレオチドがユニークである(すなわち、第1の較正標準および分析物標的核酸のそれぞれにおいてその位置のヌクレオチドと異なる)ことを除いて、第1の較正標準の構造と実質的に同一である。多重反応混合物中の第3の侵入切断アッセイを使用して、分析物標的核酸または第1の較正標準ではなく、第2の較正標準を検出する。第3の侵入切断アッセイは、侵入プローブ、第3の5’フラップを含む第3の一次プローブ、およびフルオレセイン部分と、Eclipseクエンチャーなどの適切なクエンチャー部分とを含む第3のFRETカセットを含む。第2の較正標準を検出する侵入切断アッセイの一次および二次反応の最適温度は43℃であり、したがって、他の侵入切断アッセイの最適温度と少なくとも10℃異なる。分析物標的核酸、第1の較正標準、および第2の較正標準を、同じDNAプライマーセットを使用して反応混合物中で同時に増幅する。熱サイクリング条件は、核酸を変性させるための94℃で5秒間;72℃で20秒間;58℃で20秒間;および43℃で20秒間の40サイクルを含む。72℃のステップは、全ての核酸増幅産物の合成を可能にする;全ての一次侵入切断反応を起こさせる;および第1の較正標準に特異的な二次反応(分析物標的核酸、または第2の較正標準に特異的な二次反応ではない)を起こさせる。58℃のステップは、分析物標的核酸に特異的な二次反応(第1の較正標準、または第2の較正標準に特異的な二次反応ではない)を起こさせる。43℃のステップは、第2の較正標準に特異的な二次反応(第1の較正標準、または分析物標的核酸に特異的な二次反応ではない)を起こさせる。フルオレセイン放出波長の蛍光読取り値を、PCR機器の蛍光光度計を使用して72℃、58℃、および43℃の温度サイクル中に取る。コンピュータは、蛍光データ入力を受信し、情報をプロセッシングする。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
複数の異なる標的核酸のうちのどれが試験試料中に存在するかを決定する方法であって、
(a)前記試験試料に由来する核酸を含有する反応混合物中で、多重侵入切断アッセイの複数の二次反応を連続的に起こさせるステップであって、それぞれの前記二次反応が異なる温度条件下で活性であり、それぞれの二次反応がただ1つの前記標的核酸に特異的である、ステップ;
(b)それぞれの前記異なる温度条件下で蛍光シグナルの産生について前記反応混合物をモニタリングするステップであって、それぞれの前記異なる温度条件がただ1つの前記二次反応を可能にし、それぞれの前記二次反応が同じ蛍光シグナルを産生する、ステップ;および
(c)それぞれの前記異なる温度条件下、前記反応混合物中で産生された前記蛍光シグナルに基づいて、前記標的核酸のうちのどれが前記試験試料中に存在するかを決定するステップ
を含む方法。
(項目2)
前記試験試料が核酸増幅反応の産物を含み、前記複数の標的核酸のそれぞれが前記核酸増幅反応の産物である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記試験試料が多重核酸増幅反応の産物を含み、前記複数の標的核酸のそれぞれが前記多重核酸増幅反応の産物である、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記反応混合物が、熱安定性DNAポリメラーゼ酵素を含む、項目1、2または3のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
前記異なる温度条件のそれぞれが、他とは5℃〜30℃異なる、項目1から4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記異なる温度条件のそれぞれが、他とは5℃〜15℃異なる、項目5に記載の方法。
(項目7)
ステップ(c)が、それぞれの前記異なる温度条件下、前記反応混合物中で産生された前記蛍光シグナルの量に基づいて、前記標的核酸のうちのどれが前記試験試料中に存在するかを決定することを含む、項目1から6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
ステップ(c)が、それぞれの前記異なる温度条件下、前記反応混合物中での前記蛍光シグナルの産生率に基づいて、前記標的核酸のうちのどれが前記試験試料中に存在するかを決定することを含む、項目1から6のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
試験試料が第1の標的核酸と、第2の標的核酸の一方または両方を含有するかどうかを決定する方法であって、
(a)(i)前記試験試料、
(ii)前記第1の標的核酸の検出に特異的な第1の侵入切断アッセイを行うためのオリゴヌクレオチドの第1のセットであって、前記第1の侵入切断アッセイが、一次反応と二次反応とを含み、前記オリゴヌクレオチドの第1のセットが、
前記第1の標的核酸に特異的な第1の侵入プローブ、
前記第1の標的核酸に特異的な第1の一次プローブ、および
第1のFRETカセット
を含む、第1のセット、
(iii)前記第2の標的核酸の検出に特異的な第2の侵入切断アッセイを行うためのオリゴヌクレオチドの第2のセットであって、前記第2の侵入切断アッセイが一次反応と二次反応とを含み、前記オリゴヌクレオチドの第2のセットが、
前記第2の標的核酸に特異的な第2の侵入プローブ、
前記第2の標的核酸に特異的な第2の一次プローブ、および
第2のFRETカセット
を含み、前記第1および第2のFRETカセットはそれぞれ、ドナー部分とアクセプター部分が両方とも同じFRETカセットに結合する場合に、前記ドナー部分からの放出がクエンチされるようなエネルギー移動関係にある前記ドナー部分と前記アクセプター部分とを含み、
前記第1のFRETカセットの前記ドナー部分は、前記第2のFRETカセットの前記ドナー部分と同一である、第2のセット、および
(iv)フラップエンドヌクレアーゼ(FEN)酵素
のそれぞれを組み合わせることにより反応混合物を調製するステップ;
(b)第1の温度で第1の期間にわたって前記反応混合物をインキュベートするステップであって、前記第1の温度が前記第1の侵入切断アッセイの前記一次および二次反応を可能にし、それにより、前記試験試料が前記第1の標的核酸を含む場合、前記第1のFRETカセットの前記ドナー部分と関連する第1のシグナルが生成される、ステップ;
(c)ステップ(b)中に生成された可能性がある前記第1のシグナルのいずれかを、前記試験試料中の前記第1の標的核酸の存在の指示として測定するステップ;
(d)第2の温度で第2の期間にわたって前記反応混合物をインキュベートするステップであって、前記第2の温度が前記第2の侵入切断アッセイの前記二次反応を可能にし、それにより、前記試験試料が前記第2の標的核酸を含む場合、前記第2のFRETカセットの前記ドナー部分と関連する第2のシグナルが生成される、ステップ;
(e)ステップ(d)中に生成された可能性がある前記第2のシグナルのいずれかを、前記試験試料中の前記第2の標的核酸の存在の指示として測定するステップ;ならびに
(f)前記試料が前記第1の標的核酸を含有するかどうかを、ステップ(c)で測定された前記第1のシグナルから、および前記試料が前記第2の標的核酸を含有するかどうかを、ステップ(e)で測定された前記第2のシグナルから決定するステップであって、
前記第1の侵入切断アッセイの前記二次反応は、ステップ(d)における前記第2の温度でバックグラウンドシグナルよりも大きいシグナルを実質的に生成せず、
前記第2の侵入切断アッセイの前記二次反応は、ステップ(b)における前記第1の温度でバックグラウンドシグナルよりも大きいシグナルを実質的に生成しない、ステップ
を含む方法。
(項目10)
前記第2の侵入切断アッセイの前記一次反応が、ステップ(b)における前記第1の温度またはステップ(d)における前記第2の温度で起こる、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記第2の侵入切断アッセイの前記一次反応が、ステップ(b)における前記第1の温度で起こり、ステップ(d)における前記第2の温度では起こらない、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記第2の侵入切断アッセイの前記一次反応が、ステップ(d)における前記第2の温度で起こり、ステップ(b)における前記第1の温度では起こらない、項目10に記載の方法。
(項目13)
前記ドナー部分がフルオロフォアである、項目9に記載の方法。
(項目14)
前記インキュベートするステップにおける前記第1および第2の温度が5〜30℃異なる、項目9に記載の方法。
(項目15)
前記インキュベートするステップにおける前記第1および第2の温度が5〜15℃異なる、項目14に記載の方法。
(項目16)
ステップ(e)が、ステップ(d)中に生成された可能性がある前記第2のシグナルのいずれかを経時的に測定することを含み、それにより、ステップ(d)で生成された前記シグナルの変化率が確立される、項目9または14に記載の方法。
(項目17)
ステップ(c)が、ステップ(b)中に生成された可能性がある前記第1のシグナルの規模を同定することを含み、
ステップ(f)が、前記同定された規模が前記第1の標的核酸を検出するための規模閾値を超える場合、前記第1の標的核酸が前記試料中に存在すると決定することをさらに含む、
項目9に記載の方法。
(項目18)
ステップ(c)が、ステップ(b)中に生成された可能性がある前記第1のシグナルの規模を同定することを含み、
ステップ(f)が、前記同定された規模が前記第1の標的核酸を検出するための規模閾値を超えない場合、前記第1の標的核酸が前記試料中に存在しないと決定することをさらに含む、
項目9に記載の方法。
(項目19)
ステップ(e)が、ステップ(d)中に生成された可能性がある前記第2のシグナルのいずれかを経時的に測定することを含み、
それにより、ステップ(d)で生成された前記シグナルの変化率が確立され、
ステップ(f)が、前記変化率が前記第2の標的核酸を検出するための速度閾値を超える場合、前記第2の標的核酸が前記試料中に存在すると決定することをさらに含む、
項目9に記載の方法。
(項目20)
ステップ(e)が、ステップ(d)中に生成された可能性がある前記第2のシグナルのいずれかを経時的に測定することを含み、
それにより、ステップ(d)で生成された前記シグナルの変化率が確立され、
ステップ(f)が、前記変化率が前記第2の標的核酸を検出するための速度閾値を超えない場合、前記第2の標的核酸が前記試料中に存在しないと決定することをさらに含む、
項目9に記載の方法。
(項目21)
前記変化率が、時間依存的な変化率である、項目16に記載の方法。
(項目22)
前記変化率が、サイクル依存的な変化率である、項目16に記載の方法。
(項目23)
前記第2の標的を検出するための閾値が閾値速度である、項目16に記載の方法。
(項目24)
ステップ(b)の前記第1の温度が、ステップ(d)の前記第2の温度よりも高い、項目9から23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
ステップ(f)において前記第1の標的核酸を検出するための閾値が、閾値規模である、項目9から24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
ステップ(b)〜(e)が、ステップ(f)を実施する前に複数回連続的に反復される、項目9から25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
試験試料が第1の標的核酸または第2の標的核酸を含有するかどうかを、反応混合物中で実行される多重侵入切断アッセイを用いて決定するためのコンピュータプログラム製品であって、
(a)前記多重侵入切断アッセイの前記反応混合物中のフルオロフォアからの放出を検出する蛍光光度計を用いて、
(i)第1の侵入切断アッセイが前記第1の標的核酸の存在を示すために前記フルオロフォアを使用する、前記第2の標的核酸ではなく、前記第1の標的核酸に特異的な前記第1の侵入切断アッセイの二次反応、および
(ii)第2の侵入切断アッセイが前記第2の標的核酸の存在を示すために前記フルオロフォアを使用する、前記第1の標的核酸ではなく、前記第2の標的核酸に特異的な前記第2の侵入切断アッセイの二次反応
により生成された蛍光シグナルをモニタリングすることにより、試験データのセットを収集するステップであって、
前記第1の侵入切断アッセイの前記二次反応は、前記第2の侵入切断アッセイの前記二次反応による蛍光シグナルの生成を実質的に可能にしない第1の温度で進行し、
前記第2の侵入切断アッセイの前記二次反応は、前記第1の侵入切断アッセイの前記二次反応による蛍光シグナルの生成を実質的に可能にしない第2の温度で進行し、
試験データの前記セットが
前記第1の侵入切断アッセイの前記二次反応が実質的に完了した後、および前記第2の侵入切断アッセイの前記二次反応が実質的に始まる前に測定された第1のバックグラウンドシグナル、および
前記第2の侵入切断アッセイの前記二次反応が前記第2の温度で始まった後に収集された少なくとも1つのさらなるシグナル
を含む、ステップ;
(b)試験データの前記セットの前記少なくとも1つのさらなるシグナルがどれぐらい迅速に前記第1のバックグラウンドシグナルを超えて増加するかを示す速度を算出するステップ、
(c)ステップ(b)の試験データの前記セットおよび前記速度を、対照データのセットとを比較するステップであって、対照データの前記セットが、前記第1の標的核酸または前記第2の標的核酸を含まなかった対照反応混合物を、蛍光光度計を用いてモニタリングすることによって生成された結果を含み、
対照データの前記セットが、
対照バックグラウンドシグナル、
一定期間にわたる前記第2の温度での前記対照反応混合物のインキュベーション後に収集された少なくとも1つのさらなるシグナル、および
対照データの前記セットの前記少なくとも1つのさらなるシグナルがどれぐらい迅速に前記対照バックグラウンドシグナルを超えて増加するかを示す算出された速度
を含む、ステップ、ならびに
(d)以下の決定のうちの1つ:
(i)前記第1のバックグラウンドシグナルが前記対照バックグラウンドシグナルより実質的に大きい場合、前記試験試料が前記第1の標的核酸を含有する、
(ii)前記第1のバックグラウンドシグナルが前記対照バックグラウンドシグナルと実質的に同じである場合、前記試験試料が前記第1の標的核酸を含有しない、
(iii)ステップ(b)で算出された前記速度が対照データの前記セットからの前記算出された速度を超える場合、前記試験試料が前記第2の標的核酸を含有する、および
(iv)ステップ(b)で算出された前記速度が対照データの前記セットからの前記算出された速度を超えない場合、前記試験試料が前記第2の標的核酸を含有しない
を出力するステップ
をコンピュータに実行させる非一時的な命令を含むコンピュータプログラム製品。
(項目28)
ステップ(d)が、表示デバイスに、前記決定の有形記録を作成するように命令することを含む、項目27に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目29)
ステップ(b)が、直線の勾配を算出することを含む、項目28に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目30)
前記表示デバイスがプリンターであり、前記有形記録が印刷された記録である、項目28に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目31)
ステップ(a)が、試験データの前記セットに関する数値を受け取ること、次いで、前記数値を電子表計算中で選別することを含む、項目27に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目32)
ステップ(b)で算出された前記速度が、RFU/分の単位である、項目27に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目33)
ステップ(b)が、直線の勾配を算出することを含む、項目27に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目34)
ステップ(b)で算出された前記速度が、RFU/分の単位である、項目33に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目35)
ステップ(c)の前記蛍光光度計が、ステップ(a)の前記蛍光光度計である、項目27に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目36)
前記反応混合物が、核酸を増幅および検出する機器中に配置された反応ベッセル中に含有され、収集ステップ(a)がただ1つの温度で実施される、項目27に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目37)
前記コンピュータプログラム製品が、前記コンピュータ中にロードされ、収集ステップ(a)が、1より多い温度で生成された蛍光シグナルを時間の関数としてモニタリングすることにより、試験データの前記セットを収集することを含まない、項目27に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目38)
コンピュータに、
(a)試験試料中の第1の標的核酸を検出する第1の侵入切断アッセイの二次反応におけるフルオロフォアからの放出をモニタリングすることによって蛍光シグナルデータの第1のセットを収集するステップであって、前記第1の侵入切断アッセイが、反応混合物中の前記フルオロフォアを使用する、他の二次反応による蛍光シグナルの生成を実質的に可能にしない第1の温度の前記反応混合物中で行われ、
蛍光シグナルデータの前記第1のセットが、
前記反応混合物中の前記フルオロフォアから増大した蛍光を生成する任意の先行する二次反応が行われた後であるが、前記第1の侵入切断アッセイの前記二次反応が実質的に始まる前に決定された第1のバックグラウンドシグナル、および
前記第1の侵入切断アッセイの前記二次反応が始まった後に収集された少なくとも1つのさらなるシグナル
を含む、ステップ;
(b)前記試験試料中の第2の標的核酸を検出する第2の侵入切断アッセイの二次反応における前記フルオロフォアからの放出をモニタリングすることによって蛍光シグナルデータの第2のセットを収集するステップであって、前記第2の侵入切断アッセイが、前記反応混合物中の前記フルオロフォアを使用する、他の二次反応による蛍光シグナルの生成を実質的に可能にしない第2の温度の前記反応混合物中で行われ、
蛍光シグナルデータの前記第2のセットが、
前記反応混合物中の前記フルオロフォアから増大した蛍光を生成する任意の先行する二次反応が行われた後であるが、前記第2の侵入切断アッセイの前記二次反応が実質的に始まる前に決定された第2のバックグラウンドシグナル、および
前記第2の侵入切断アッセイの前記二次反応が始まった後に収集された少なくとも1つのさらなるシグナル
を含む、ステップ;
(c)それぞれの、蛍光シグナルデータの第1および第2のセットから、第1の改変されたデータセットおよび第2の改変されたデータセットのそれぞれを調製するステップであって、
前記改変された第1のデータセットが、蛍光シグナルデータの前記第1のセットの前記少なくとも1つのさらなるシグナルのそれぞれから、前記第1のバックグラウンドシグナルを減算することにより調製され、前記改変された第1のデータセットが、前記試験試料中の前記第1の核酸の存在に起因する蛍光シグナルを示し、
前記改変された第2のデータセットが、蛍光シグナルデータの前記第2のセットの前記少なくとも1つのさらなるシグナルのそれぞれから、前記第2のバックグラウンドシグナルを減算することにより準備され、前記改変された第1のデータセットが、前記試験試料中の前記第1の核酸の存在に起因する蛍光シグナルを示す、
ステップ;ならびに
(d)それぞれ、前記改変された第1および第2のデータセットに基づいて、前記第1の標的核酸および第2の標的核酸のそれぞれの有無を示す結果を出力するステップ
を実行させる非一時的な命令を含むコンピュータプログラム製品。
(項目39)
ステップ(a)および(b)が、前記それぞれの、蛍光シグナルデータの第1および第2のセットに関する数値を受け取ること、次いで、前記数値を、電子表計算中で選別することを含む、項目38に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目40)
前記第1の温度が、前記第2の温度よりも高い、項目38に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目41)
前記第1の温度が、前記第2の温度よりも低い、項目38に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目42)
ステップ(d)が、表示デバイスに、前記結果の有形記録を作成するように命令することを含む、項目38に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目43)
前記表示デバイスがプリンターであり、前記有形記録が紙に印刷された記録である、項目42に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目44)
前記コンピュータが、前記反応混合物を、前記第1の温度から前記第2の温度まで複数回サイクリングさせる装置の構成要素である、項目38に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目45)
前記コンピュータプログラム製品が前記コンピュータ中にロードされ、前記コンピュータが、前記反応混合物を、前記第1の温度から前記第2の温度まで複数回サイクリングさせる装置の構成要素である、項目38に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目46)
反応混合物中で実行される多重侵入切断アッセイを使用して第1および第2の分析物標的核酸のそれぞれの有無を独立に決定するためのシステムであって、
(a)前記反応混合物を含有する反応ベッセルを受容する温度制御されたインキュベータであって、前記多重侵入切断アッセイの第1の二次反応を起こさせる第1の期間にわたって第1の温度で前記反応混合物をインキュベートした後、前記多重侵入切断アッセイの第2の二次反応を起こさせる第2の期間にわたって第2の温度で前記反応混合物をインキュベートするように構成された、温度制御されたインキュベータ;
(b)前記それぞれの第1および第2の期間中に前記第1および第2の温度のそれぞれにおいて前記反応混合物中で生成され得る所定の波長範囲の任意の蛍光シグナルを、単一の検出チャネル中で測定する蛍光光度計;
(c)前記蛍光光度計と連絡するコンピュータであって、前記コンピュータが、それぞれの前記期間中に生成された測定された蛍光シグナル増加を、異なる1つの前記分析物標的核酸の存在と関連付けるようにプログラムされ、
前記コンピュータが、前記第1の期間中の任意の測定された蛍光シグナル増加を、前記第1の分析物標的核酸の存在と関連付け、前記第2の分析物標的核酸の存在とは関連付けず、
前記コンピュータが、前記第2の期間中の任意の測定された蛍光シグナル増加を、前記第2の分析物標的核酸の存在と関連付け、前記第1の分析物標的核酸の存在とは関連付けない、
コンピュータ;ならびに
(d)前記第1および第2の分析物標的核酸のそれぞれの有無を示す有形記録を生成する、前記コンピュータと連絡する出力デバイス
を含むシステム。
(項目47)
前記第1および第2の温度が5℃〜30℃異なる、項目46に記載のシステム。
(項目48)
前記温度制御されたインキュベータが、サーマルサイクラーを含む、項目46または47に記載のシステム。
(項目49)
前記温度制御されたインキュベータが、1または複数の温度制御されたチャンバを含む、項目46または47に記載のシステム。
(項目50)
前記1または複数の温度制御されたチャンバのそれぞれが一定の温度を維持する、項目49に記載のシステム。
(項目51)
前記出力デバイスがプリンターであり、前記出力デバイスにより生成される前記有形記録が紙に印刷される、項目46から50のいずれか一項に記載のシステム。
(項目52)
前記温度制御されたインキュベータが複数の温度制御されたチャンバを含み、前記システムが前記複数の温度制御されたチャンバ内の前記反応ベッセルの位置の変化を指令するコントローラをさらに含む、項目46または47に記載のシステム。
(項目53)
前記反応混合物を含有する前記反応ベッセルが、複数ウェルプレート、個々のチューブ、またはチューブの線形アレイを含む複数チューブユニットのいずれかである、項目46から52のいずれか一項に記載のシステム。
(項目54)
前記単一の検出チャネルが、フルオレセインの蛍光放出を測定するが、ROXの蛍光放出は測定しない、項目46から53のいずれか一項に記載のシステム。
(項目55)
前記単一の検出チャネルが、ROXの蛍光放出を測定するが、フルオレセインの蛍光放出は測定しない、項目46から53のいずれか一項に記載のシステム。
(項目56)
前記温度制御されたインキュベータが、前記第1の期間にわたって前記第1の温度で前記反応混合物をインキュベートし、前記第2の期間にわたって前記第2の温度で前記反応混合物をインキュベートするように、前記多重侵入切断アッセイに特異的なソフトウェア命令によって構成される、項目46から55のいずれか一項に記載のシステム。
(項目57)
前記第1の温度が、前記第2の温度よりも高い、項目46から56のいずれか一項に記載のシステム。
(項目58)
前記第1の温度が、前記第2の温度よりも低い、項目46から56のいずれか一項に記載のシステム。
(項目59)
前記蛍光光度計が複数の検出チャネルを含み、前記第1および第2の分析物標的核酸を独立に検出するためにただ1つの前記検出チャネルが使用される、項目46から58のいずれか一項に記載のシステム。
(項目60)
温度依存的多重侵入切断アッセイを実施するためのキットであって、1または複数のレセプタクル中に含有される第1および第2のFRETカセットを含み、前記第1および第2のFRETカセットのそれぞれが、異なる5’フラップハイブリダイジング配列を有し、前記第1および第2のFRETカセットのそれぞれが、ドナー部分とアクセプター部分とを含み、前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、等価なドナー部分である、キット。
(項目61)
前記第1および第2のFRETカセットが、単一のレセプタクル中に含有される、項目60に記載のキット。
(項目62)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が同一である、項目60または61に記載のキット。
(項目63)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が同一のフルオロフォアである、項目62に記載のキット。
(項目64)
前記第1および第2のFRETカセットの前記アクセプター部分が同一である、項目60から63のいずれか一項に記載のキット。
(項目65)
前記第1および第2のFRETカセットの前記アクセプター部分が同一のクエンチャー部分である、項目64に記載のキット。
(項目66)
1または複数のさらなるレセプタクル中に、第1および第2の一次プローブをさらに含み、前記第1および第2の一次プローブのそれぞれが3’標的ハイブリダイジング配列および5’フラップ配列を含み、
前記第1の一次プローブの前記3’標的ハイブリダイジング配列が第1の標的核酸の第1の領域と相補的であり、前記第2の一次プローブの前記3’標的ハイブリダイジング配列が第2の標的核酸の第1の領域と相補的であり、
前記第1および第2の一次プローブの前記3’標的ハイブリダイジング配列が互いに異なり、
前記第1および第2の一次プローブの前記5’フラップ配列が、それぞれ、前記第1および第2のFRETカセットの前記5’フラップハイブリダイジング配列と相補的であり、
前記第1および第2の一次プローブの前記5’フラップ配列が互いに異なり、そして
前記第1のFRETカセットの前記5’フラップハイブリダイジング配列と、前記第1の一次プローブの前記5’フラップ配列の切断形態との間に形成される第1のハイブリッドの融解温度が、前記第2のFRETカセットの前記5’フラップハイブリダイジング配列と、前記第2の一次プローブの前記5’フラップ配列の切断形態との間に形成される第2のハイブリッドの融解温度と少なくとも5℃異なる、
項目60から65のいずれか一項に記載のキット。
(項目67)
前記第1および第2のハイブリッドの融解温度が5℃〜30℃異なる、項目66に記載のキット。
(項目68)
前記第1および第2のハイブリッドの融解温度が5℃〜15℃異なる、項目67に記載のキット。
(項目69)
前記第1および第2のFRETカセットと、前記第1および第2の一次プローブとが単一のレセプタクル中に含有される、項目66から68のいずれか一項に記載のキット。
(項目70)
1または複数のさらなるレセプタクル中に、第1および第2の侵入プローブをさらに含み、前記第1の侵入プローブが前記第1の標的核酸の第2の領域と相補的であり、前記第1の標的核酸の前記第1および第2の領域が互いに隣接して配置され、前記第2の侵入プローブが、前記第2の標的核酸の第2の領域と相補的であり、前記第2の標的核酸の前記第1および第2の領域が互いに隣接して配置される、項目66から69のいずれか一項に記載のキット。
(項目71)
前記第1および第2のFRETカセットと、前記第1および第2の侵入プローブとが単一のレセプタクル中に含有される、項目70に記載のキット。
(項目72)
前記FRETカセットまたは前記一次プローブを含有しないレセプタクル中に、フラップエンドヌクレアーゼ(FEN)酵素をさらに含む、項目60から71のいずれか一項に記載のキット。
(項目73)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、500nm〜750nmの範囲内の測定可能な強度を有する放出スペクトルを示す、項目60から72のいずれか一項に記載のキット。
(項目74)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、510nm〜530nm、560nm〜580nm、610nm〜650nm、675nm〜690nm、または705nm〜730nmの範囲内の測定可能な強度を有する放出スペクトルを示す、項目73に記載のキット。
(項目75)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、0nm〜15nm異なるピーク放出波長を有する放出スペクトルを示す、項目60から74のいずれか一項に記載のキット。
(項目76)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、0nm〜10nm異なるピーク放出波長を有する放出スペクトルを示す、項目75に記載のキット。
(項目77)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、0nm〜5nm異なるピーク放出波長を有する放出スペクトルを示す、項目76に記載のキット。
(項目78)
前記第1および第2のFRETカセットがそれぞれ、溶液中で遊離している、項目60から77のいずれか一項に記載のキット。
(項目79)
第1および第2のFRETカセットの混合物を含む物質の組成物であって、前記FRETカセットのそれぞれが異なる5’フラップハイブリダイジング配列を有し、前記第1および第2のFRETカセットのそれぞれがドナー部分とアクセプター部分とを含み、前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が等価なドナー部分である、組成物。
(項目80)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が同一である、項目79に記載の組成物。
(項目81)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が同一のフルオロフォアである、項目80に記載の組成物。
(項目82)
前記第1および第2のFRETカセットの前記アクセプター部分が同一である、項目79から81のいずれか一項に記載の組成物。
(項目83)
前記第1および第2のFRETカセットの前記アクセプター部分が同一のクエンチャー部分である、項目82に記載の組成物。
(項目84)
前記第1のFRETカセットの前記5’フラップハイブリダイジング配列と、完全に相補的な第1の5’フラップ配列との間に形成される第1のハイブリッドの融解温度が、前記第2のFRETカセットの前記5’フラップハイブリダイジング配列と、完全に相補的な第2の5’フラップ配列との間に形成される第2のハイブリッドの融解温度と少なくとも5℃異なり、前記第1および第2の5’フラップ配列が互いに異なる、項目79から83のいずれか一項に記載の組成物。
(項目85)
前記第1および第2のハイブリッドの融解温度が5℃〜30℃異なる、項目84に記載の組成物。
(項目86)
前記第1および第2のハイブリッドの融解温度が5℃〜15℃異なる、項目85に記載の組成物。
(項目87)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、500nm〜750nmの範囲内の測定可能な強度を有する放出スペクトルを示す、項目79から86のいずれか一項に記載の組成物。
(項目88)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、510nm〜530nm、560nm〜580nm、610nm〜650nm、675nm〜690nm、または705nm〜730nmの範囲内の測定可能な強度を有する放出スペクトルを示す、項目87に記載の組成物。
(項目89)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、0nm〜15nm異なるピーク放出波長を有する放出スペクトルを示す、項目79から88のいずれか一項に記載の組成物。
(項目90)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、0nm〜10nm異なるピーク放出波長を有する放出スペクトルを示す、項目89に記載の組成物。
(項目91)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、0nm〜5nm異なるピーク放出波長を有する放出スペクトルを示す、項目90に記載の組成物。
(項目92)
フラップエンドヌクレアーゼ(FEN)酵素をさらに含む、項目79から91のいずれか一項に記載の組成物。
(項目93)
前記第1および第2のFRETカセットのそれぞれが溶液中で遊離している、項目79から92のいずれか一項に記載のキット。
(項目94)
多重侵入切断アッセイにおける2またはそれ超の標的核酸を検出するための反応混合物であって、
(a)第1および第2のFRETカセットがそれぞれ、異なる5’フラップハイブリダイジング配列を有し、前記第1および第2のFRETカセットがそれぞれ、ドナー部分とアクセプター部分とを含み、前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が等価なドナー部分である、前記第1および第2のFRETカセット;ならびに
(b)第1および第2の一次プローブがそれぞれ、3’標的ハイブリダイジング配列および5’フラップ配列を含み、
前記第1の一次プローブの前記3’標的ハイブリダイジング配列が第1の標的核酸の第1の領域と相補的であり、前記第2の一次プローブの前記3’標的ハイブリダイジング配列が第2の標的核酸の第1の領域と相補的であり、
前記第1および第2の一次プローブの前記3’標的ハイブリダイジング配列が互いに異なり、
前記第1および第2の一次プローブの前記5’フラップ配列が、それぞれ、前記第1および第2のFRETカセットの前記5’フラップハイブリダイジング配列と相補的であり、
前記第1および第2の一次プローブの前記5’フラップ配列が互いに異なる、
前記第1および第2の一次プローブ;ならびに
(c)第1の侵入プローブが前記第1の標的核酸の第2の領域と相補的であり、前記第1の標的核酸の前記第1および第2の領域が互いに隣接して配置され、第2の侵入プローブが前記第2の標的核酸の第2の領域と相補的であり、前記第2の標的核酸の前記第1および第2の領域が互いに隣接して配置される、前記第1および第2の侵入プローブ
を含む、反応混合物。
(項目95)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が同一である、項目94に記載の反応混合物。
(項目96)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が同一のフルオロフォアである、項目95に記載の反応混合物。
(項目97)
前記第1および第2のFRETカセットの前記アクセプター部分が同一である、項目94から96のいずれか一項に記載の反応混合物。
(項目98)
前記第1および第2のFRETカセットの前記アクセプター部分が同一のクエンチャー部分である、項目97に記載の反応混合物。
(項目99)
前記第1のFRETカセットの前記5’フラップハイブリダイジング配列と、前記第1の一次プローブの前記5’フラップ配列の切断形態との間に形成される第1のハイブリッドの融解温度が、前記第2のFRETカセットの前記5’フラップハイブリダイジング配列と、前記第2の一次プローブの前記5’フラップ配列の切断形態との間に形成される第2のハイブリッドの融解温度と少なくとも5℃異なる、項目94から98のいずれか一項に記載の反応混合物。
(項目100)
前記第1および第2のハイブリッドの融解温度が5℃〜30℃異なる、項目99に記載の反応混合物。
(項目101)
前記第1および第2のハイブリッドの融解温度が5℃〜15℃異なる、項目100に記載の反応混合物。
(項目102)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、500nm〜750nmの範囲内の測定可能な強度を有する放出スペクトルを示す、項目94から101のいずれか一項に記載の反応混合物。
(項目103)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、510nm〜530nm、560nm〜580nm、610nm〜650nm、675nm〜690nm、または705nm〜730nmの範囲内の測定可能な強度を有する放出スペクトルを示す、項目102に記載の反応混合物。
(項目104)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、0nm〜15nm異なるピーク放出波長を有する放出スペクトルを示す、項目94から103のいずれか一項に記載の反応混合物。
(項目105)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、0nm〜10nm異なるピーク放出波長を有する放出スペクトルを示す、項目104に記載の反応混合物。
(項目106)
前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、0nm〜5nm異なるピーク放出波長を有する放出スペクトルを示す、項目105に記載の反応混合物。
(項目107)
前記第1および第2のFRETカセットがそれぞれ溶液中で遊離しており、前記第1および第2のFRETカセットの前記5’フラップハイブリダイジング配列がそれぞれ一本鎖状態にある、項目94から106のいずれかに記載の反応混合物。
(項目108)
フラップエンドヌクレアーゼ(FEN)酵素をさらに含む、項目94から107のいずれかに記載の反応混合物。
Claims (108)
- 複数の異なる標的核酸のうちのどれが試験試料中に存在するかを決定する方法であって、
(a)前記試験試料に由来する核酸を含有する反応混合物中で、多重侵入切断アッセイの複数の二次反応を連続的に起こさせるステップであって、それぞれの前記二次反応が異なる温度条件下で活性であり、それぞれの二次反応がただ1つの前記標的核酸に特異的である、ステップ;
(b)それぞれの前記異なる温度条件下で蛍光シグナルの産生について前記反応混合物をモニタリングするステップであって、それぞれの前記異なる温度条件がただ1つの前記二次反応を可能にし、それぞれの前記二次反応が同じ蛍光シグナルを産生する、ステップ;および
(c)それぞれの前記異なる温度条件下、前記反応混合物中で産生された前記蛍光シグナルに基づいて、前記標的核酸のうちのどれが前記試験試料中に存在するかを決定するステップ
を含む方法。 - 前記試験試料が核酸増幅反応の産物を含み、前記複数の標的核酸のそれぞれが前記核酸増幅反応の産物である、請求項1に記載の方法。
- 前記試験試料が多重核酸増幅反応の産物を含み、前記複数の標的核酸のそれぞれが前記多重核酸増幅反応の産物である、請求項1に記載の方法。
- 前記反応混合物が、熱安定性DNAポリメラーゼ酵素を含む、請求項1、2または3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異なる温度条件のそれぞれが、他とは5℃〜30℃異なる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異なる温度条件のそれぞれが、他とは5℃〜15℃異なる、請求項5に記載の方法。
- ステップ(c)が、それぞれの前記異なる温度条件下、前記反応混合物中で産生された前記蛍光シグナルの量に基づいて、前記標的核酸のうちのどれが前記試験試料中に存在するかを決定することを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)が、それぞれの前記異なる温度条件下、前記反応混合物中での前記蛍光シグナルの産生率に基づいて、前記標的核酸のうちのどれが前記試験試料中に存在するかを決定することを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 試験試料が第1の標的核酸と、第2の標的核酸の一方または両方を含有するかどうかを決定する方法であって、
(a)(i)前記試験試料、
(ii)前記第1の標的核酸の検出に特異的な第1の侵入切断アッセイを行うためのオリゴヌクレオチドの第1のセットであって、前記第1の侵入切断アッセイが、一次反応と二次反応とを含み、前記オリゴヌクレオチドの第1のセットが、
前記第1の標的核酸に特異的な第1の侵入プローブ、
前記第1の標的核酸に特異的な第1の一次プローブ、および
第1のFRETカセット
を含む、第1のセット、
(iii)前記第2の標的核酸の検出に特異的な第2の侵入切断アッセイを行うためのオリゴヌクレオチドの第2のセットであって、前記第2の侵入切断アッセイが一次反応と二次反応とを含み、前記オリゴヌクレオチドの第2のセットが、
前記第2の標的核酸に特異的な第2の侵入プローブ、
前記第2の標的核酸に特異的な第2の一次プローブ、および
第2のFRETカセット
を含み、前記第1および第2のFRETカセットはそれぞれ、ドナー部分とアクセプター部分が両方とも同じFRETカセットに結合する場合に、前記ドナー部分からの放出がクエンチされるようなエネルギー移動関係にある前記ドナー部分と前記アクセプター部分とを含み、
前記第1のFRETカセットの前記ドナー部分は、前記第2のFRETカセットの前記ドナー部分と同一である、第2のセット、および
(iv)フラップエンドヌクレアーゼ(FEN)酵素
のそれぞれを組み合わせることにより反応混合物を調製するステップ;
(b)第1の温度で第1の期間にわたって前記反応混合物をインキュベートするステップであって、前記第1の温度が前記第1の侵入切断アッセイの前記一次および二次反応を可能にし、それにより、前記試験試料が前記第1の標的核酸を含む場合、前記第1のFRETカセットの前記ドナー部分と関連する第1のシグナルが生成される、ステップ;
(c)ステップ(b)中に生成された可能性がある前記第1のシグナルのいずれかを、前記試験試料中の前記第1の標的核酸の存在の指示として測定するステップ;
(d)第2の温度で第2の期間にわたって前記反応混合物をインキュベートするステップであって、前記第2の温度が前記第2の侵入切断アッセイの前記二次反応を可能にし、それにより、前記試験試料が前記第2の標的核酸を含む場合、前記第2のFRETカセットの前記ドナー部分と関連する第2のシグナルが生成される、ステップ;
(e)ステップ(d)中に生成された可能性がある前記第2のシグナルのいずれかを、前記試験試料中の前記第2の標的核酸の存在の指示として測定するステップ;ならびに
(f)前記試料が前記第1の標的核酸を含有するかどうかを、ステップ(c)で測定された前記第1のシグナルから、および前記試料が前記第2の標的核酸を含有するかどうかを、ステップ(e)で測定された前記第2のシグナルから決定するステップであって、
前記第1の侵入切断アッセイの前記二次反応は、ステップ(d)における前記第2の温度でバックグラウンドシグナルよりも大きいシグナルを実質的に生成せず、
前記第2の侵入切断アッセイの前記二次反応は、ステップ(b)における前記第1の温度でバックグラウンドシグナルよりも大きいシグナルを実質的に生成しない、ステップ
を含む方法。 - 前記第2の侵入切断アッセイの前記一次反応が、ステップ(b)における前記第1の温度またはステップ(d)における前記第2の温度で起こる、請求項9に記載の方法。
- 前記第2の侵入切断アッセイの前記一次反応が、ステップ(b)における前記第1の温度で起こり、ステップ(d)における前記第2の温度では起こらない、請求項10に記載の方法。
- 前記第2の侵入切断アッセイの前記一次反応が、ステップ(d)における前記第2の温度で起こり、ステップ(b)における前記第1の温度では起こらない、請求項10に記載の方法。
- 前記ドナー部分がフルオロフォアである、請求項9に記載の方法。
- 前記インキュベートするステップにおける前記第1および第2の温度が5〜30℃異なる、請求項9に記載の方法。
- 前記インキュベートするステップにおける前記第1および第2の温度が5〜15℃異なる、請求項14に記載の方法。
- ステップ(e)が、ステップ(d)中に生成された可能性がある前記第2のシグナルのいずれかを経時的に測定することを含み、それにより、ステップ(d)で生成された前記シグナルの変化率が確立される、請求項9または14に記載の方法。
- ステップ(c)が、ステップ(b)中に生成された可能性がある前記第1のシグナルの規模を同定することを含み、
ステップ(f)が、前記同定された規模が前記第1の標的核酸を検出するための規模閾値を超える場合、前記第1の標的核酸が前記試料中に存在すると決定することをさらに含む、
請求項9に記載の方法。 - ステップ(c)が、ステップ(b)中に生成された可能性がある前記第1のシグナルの規模を同定することを含み、
ステップ(f)が、前記同定された規模が前記第1の標的核酸を検出するための規模閾値を超えない場合、前記第1の標的核酸が前記試料中に存在しないと決定することをさらに含む、
請求項9に記載の方法。 - ステップ(e)が、ステップ(d)中に生成された可能性がある前記第2のシグナルのいずれかを経時的に測定することを含み、
それにより、ステップ(d)で生成された前記シグナルの変化率が確立され、
ステップ(f)が、前記変化率が前記第2の標的核酸を検出するための速度閾値を超える場合、前記第2の標的核酸が前記試料中に存在すると決定することをさらに含む、
請求項9に記載の方法。 - ステップ(e)が、ステップ(d)中に生成された可能性がある前記第2のシグナルのいずれかを経時的に測定することを含み、
それにより、ステップ(d)で生成された前記シグナルの変化率が確立され、
ステップ(f)が、前記変化率が前記第2の標的核酸を検出するための速度閾値を超えない場合、前記第2の標的核酸が前記試料中に存在しないと決定することをさらに含む、
請求項9に記載の方法。 - 前記変化率が、時間依存的な変化率である、請求項16に記載の方法。
- 前記変化率が、サイクル依存的な変化率である、請求項16に記載の方法。
- 前記第2の標的を検出するための閾値が閾値速度である、請求項16に記載の方法。
- ステップ(b)の前記第1の温度が、ステップ(d)の前記第2の温度よりも高い、請求項9から23のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)において前記第1の標的核酸を検出するための閾値が、閾値規模である、請求項9から24のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)〜(e)が、ステップ(f)を実施する前に複数回連続的に反復される、請求項9から25のいずれか一項に記載の方法。
- 試験試料が第1の標的核酸または第2の標的核酸を含有するかどうかを、反応混合物中で実行される多重侵入切断アッセイを用いて決定するためのコンピュータプログラム製品であって、
(a)前記多重侵入切断アッセイの前記反応混合物中のフルオロフォアからの放出を検出する蛍光光度計を用いて、
(i)第1の侵入切断アッセイが前記第1の標的核酸の存在を示すために前記フルオロフォアを使用する、前記第2の標的核酸ではなく、前記第1の標的核酸に特異的な前記第1の侵入切断アッセイの二次反応、および
(ii)第2の侵入切断アッセイが前記第2の標的核酸の存在を示すために前記フルオロフォアを使用する、前記第1の標的核酸ではなく、前記第2の標的核酸に特異的な前記第2の侵入切断アッセイの二次反応
により生成された蛍光シグナルをモニタリングすることにより、試験データのセットを収集するステップであって、
前記第1の侵入切断アッセイの前記二次反応は、前記第2の侵入切断アッセイの前記二次反応による蛍光シグナルの生成を実質的に可能にしない第1の温度で進行し、
前記第2の侵入切断アッセイの前記二次反応は、前記第1の侵入切断アッセイの前記二次反応による蛍光シグナルの生成を実質的に可能にしない第2の温度で進行し、
試験データの前記セットが
前記第1の侵入切断アッセイの前記二次反応が実質的に完了した後、および前記第2の侵入切断アッセイの前記二次反応が実質的に始まる前に測定された第1のバックグラウンドシグナル、および
前記第2の侵入切断アッセイの前記二次反応が前記第2の温度で始まった後に収集された少なくとも1つのさらなるシグナル
を含む、ステップ;
(b)試験データの前記セットの前記少なくとも1つのさらなるシグナルがどれぐらい迅速に前記第1のバックグラウンドシグナルを超えて増加するかを示す速度を算出するステップ、
(c)ステップ(b)の試験データの前記セットおよび前記速度を、対照データのセットとを比較するステップであって、対照データの前記セットが、前記第1の標的核酸または前記第2の標的核酸を含まなかった対照反応混合物を、蛍光光度計を用いてモニタリングすることによって生成された結果を含み、
対照データの前記セットが、
対照バックグラウンドシグナル、
一定期間にわたる前記第2の温度での前記対照反応混合物のインキュベーション後に収集された少なくとも1つのさらなるシグナル、および
対照データの前記セットの前記少なくとも1つのさらなるシグナルがどれぐらい迅速に前記対照バックグラウンドシグナルを超えて増加するかを示す算出された速度
を含む、ステップ、ならびに
(d)以下の決定のうちの1つ:
(i)前記第1のバックグラウンドシグナルが前記対照バックグラウンドシグナルより実質的に大きい場合、前記試験試料が前記第1の標的核酸を含有する、
(ii)前記第1のバックグラウンドシグナルが前記対照バックグラウンドシグナルと実質的に同じである場合、前記試験試料が前記第1の標的核酸を含有しない、
(iii)ステップ(b)で算出された前記速度が対照データの前記セットからの前記算出された速度を超える場合、前記試験試料が前記第2の標的核酸を含有する、および
(iv)ステップ(b)で算出された前記速度が対照データの前記セットからの前記算出された速度を超えない場合、前記試験試料が前記第2の標的核酸を含有しない
を出力するステップ
をコンピュータに実行させる非一時的な命令を含むコンピュータプログラム製品。 - ステップ(d)が、表示デバイスに、前記決定の有形記録を作成するように命令することを含む、請求項27に記載のコンピュータプログラム製品。
- ステップ(b)が、直線の勾配を算出することを含む、請求項28に記載のコンピュータプログラム製品。
- 前記表示デバイスがプリンターであり、前記有形記録が印刷された記録である、請求項28に記載のコンピュータプログラム製品。
- ステップ(a)が、試験データの前記セットに関する数値を受け取ること、次いで、前記数値を電子表計算中で選別することを含む、請求項27に記載のコンピュータプログラム製品。
- ステップ(b)で算出された前記速度が、RFU/分の単位である、請求項27に記載のコンピュータプログラム製品。
- ステップ(b)が、直線の勾配を算出することを含む、請求項27に記載のコンピュータプログラム製品。
- ステップ(b)で算出された前記速度が、RFU/分の単位である、請求項33に記載のコンピュータプログラム製品。
- ステップ(c)の前記蛍光光度計が、ステップ(a)の前記蛍光光度計である、請求項27に記載のコンピュータプログラム製品。
- 前記反応混合物が、核酸を増幅および検出する機器中に配置された反応ベッセル中に含有され、収集ステップ(a)がただ1つの温度で実施される、請求項27に記載のコンピュータプログラム製品。
- 前記コンピュータプログラム製品が、前記コンピュータ中にロードされ、収集ステップ(a)が、1より多い温度で生成された蛍光シグナルを時間の関数としてモニタリングすることにより、試験データの前記セットを収集することを含まない、請求項27に記載のコンピュータプログラム製品。
- コンピュータに、
(a)試験試料中の第1の標的核酸を検出する第1の侵入切断アッセイの二次反応におけるフルオロフォアからの放出をモニタリングすることによって蛍光シグナルデータの第1のセットを収集するステップであって、前記第1の侵入切断アッセイが、反応混合物中の前記フルオロフォアを使用する、他の二次反応による蛍光シグナルの生成を実質的に可能にしない第1の温度の前記反応混合物中で行われ、
蛍光シグナルデータの前記第1のセットが、
前記反応混合物中の前記フルオロフォアから増大した蛍光を生成する任意の先行する二次反応が行われた後であるが、前記第1の侵入切断アッセイの前記二次反応が実質的に始まる前に決定された第1のバックグラウンドシグナル、および
前記第1の侵入切断アッセイの前記二次反応が始まった後に収集された少なくとも1つのさらなるシグナル
を含む、ステップ;
(b)前記試験試料中の第2の標的核酸を検出する第2の侵入切断アッセイの二次反応における前記フルオロフォアからの放出をモニタリングすることによって蛍光シグナルデータの第2のセットを収集するステップであって、前記第2の侵入切断アッセイが、前記反応混合物中の前記フルオロフォアを使用する、他の二次反応による蛍光シグナルの生成を実質的に可能にしない第2の温度の前記反応混合物中で行われ、
蛍光シグナルデータの前記第2のセットが、
前記反応混合物中の前記フルオロフォアから増大した蛍光を生成する任意の先行する二次反応が行われた後であるが、前記第2の侵入切断アッセイの前記二次反応が実質的に始まる前に決定された第2のバックグラウンドシグナル、および
前記第2の侵入切断アッセイの前記二次反応が始まった後に収集された少なくとも1つのさらなるシグナル
を含む、ステップ;
(c)それぞれの、蛍光シグナルデータの第1および第2のセットから、第1の改変されたデータセットおよび第2の改変されたデータセットのそれぞれを調製するステップであって、
前記改変された第1のデータセットが、蛍光シグナルデータの前記第1のセットの前記少なくとも1つのさらなるシグナルのそれぞれから、前記第1のバックグラウンドシグナルを減算することにより調製され、前記改変された第1のデータセットが、前記試験試料中の前記第1の核酸の存在に起因する蛍光シグナルを示し、
前記改変された第2のデータセットが、蛍光シグナルデータの前記第2のセットの前記少なくとも1つのさらなるシグナルのそれぞれから、前記第2のバックグラウンドシグナルを減算することにより準備され、前記改変された第1のデータセットが、前記試験試料中の前記第1の核酸の存在に起因する蛍光シグナルを示す、
ステップ;ならびに
(d)それぞれ、前記改変された第1および第2のデータセットに基づいて、前記第1の標的核酸および第2の標的核酸のそれぞれの有無を示す結果を出力するステップ
を実行させる非一時的な命令を含むコンピュータプログラム製品。 - ステップ(a)および(b)が、前記それぞれの、蛍光シグナルデータの第1および第2のセットに関する数値を受け取ること、次いで、前記数値を、電子表計算中で選別することを含む、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
- 前記第1の温度が、前記第2の温度よりも高い、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
- 前記第1の温度が、前記第2の温度よりも低い、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
- ステップ(d)が、表示デバイスに、前記結果の有形記録を作成するように命令することを含む、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
- 前記表示デバイスがプリンターであり、前記有形記録が紙に印刷された記録である、請求項42に記載のコンピュータプログラム製品。
- 前記コンピュータが、前記反応混合物を、前記第1の温度から前記第2の温度まで複数回サイクリングさせる装置の構成要素である、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
- 前記コンピュータプログラム製品が前記コンピュータ中にロードされ、前記コンピュータが、前記反応混合物を、前記第1の温度から前記第2の温度まで複数回サイクリングさせる装置の構成要素である、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
- 反応混合物中で実行される多重侵入切断アッセイを使用して第1および第2の分析物標的核酸のそれぞれの有無を独立に決定するためのシステムであって、
(a)前記反応混合物を含有する反応ベッセルを受容する温度制御されたインキュベータであって、前記多重侵入切断アッセイの第1の二次反応を起こさせる第1の期間にわたって第1の温度で前記反応混合物をインキュベートした後、前記多重侵入切断アッセイの第2の二次反応を起こさせる第2の期間にわたって第2の温度で前記反応混合物をインキュベートするように構成された、温度制御されたインキュベータ;
(b)前記それぞれの第1および第2の期間中に前記第1および第2の温度のそれぞれにおいて前記反応混合物中で生成され得る所定の波長範囲の任意の蛍光シグナルを、単一の検出チャネル中で測定する蛍光光度計;
(c)前記蛍光光度計と連絡するコンピュータであって、前記コンピュータが、それぞれの前記期間中に生成された測定された蛍光シグナル増加を、異なる1つの前記分析物標的核酸の存在と関連付けるようにプログラムされ、
前記コンピュータが、前記第1の期間中の任意の測定された蛍光シグナル増加を、前記第1の分析物標的核酸の存在と関連付け、前記第2の分析物標的核酸の存在とは関連付けず、
前記コンピュータが、前記第2の期間中の任意の測定された蛍光シグナル増加を、前記第2の分析物標的核酸の存在と関連付け、前記第1の分析物標的核酸の存在とは関連付けない、
コンピュータ;ならびに
(d)前記第1および第2の分析物標的核酸のそれぞれの有無を示す有形記録を生成する、前記コンピュータと連絡する出力デバイス
を含むシステム。 - 前記第1および第2の温度が5℃〜30℃異なる、請求項46に記載のシステム。
- 前記温度制御されたインキュベータが、サーマルサイクラーを含む、請求項46または47に記載のシステム。
- 前記温度制御されたインキュベータが、1または複数の温度制御されたチャンバを含む、請求項46または47に記載のシステム。
- 前記1または複数の温度制御されたチャンバのそれぞれが一定の温度を維持する、請求項49に記載のシステム。
- 前記出力デバイスがプリンターであり、前記出力デバイスにより生成される前記有形記録が紙に印刷される、請求項46から50のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記温度制御されたインキュベータが複数の温度制御されたチャンバを含み、前記システムが前記複数の温度制御されたチャンバ内の前記反応ベッセルの位置の変化を指令するコントローラをさらに含む、請求項46または47に記載のシステム。
- 前記反応混合物を含有する前記反応ベッセルが、複数ウェルプレート、個々のチューブ、またはチューブの線形アレイを含む複数チューブユニットのいずれかである、請求項46から52のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記単一の検出チャネルが、フルオレセインの蛍光放出を測定するが、ROXの蛍光放出は測定しない、請求項46から53のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記単一の検出チャネルが、ROXの蛍光放出を測定するが、フルオレセインの蛍光放出は測定しない、請求項46から53のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記温度制御されたインキュベータが、前記第1の期間にわたって前記第1の温度で前記反応混合物をインキュベートし、前記第2の期間にわたって前記第2の温度で前記反応混合物をインキュベートするように、前記多重侵入切断アッセイに特異的なソフトウェア命令によって構成される、請求項46から55のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第1の温度が、前記第2の温度よりも高い、請求項46から56のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第1の温度が、前記第2の温度よりも低い、請求項46から56のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記蛍光光度計が複数の検出チャネルを含み、前記第1および第2の分析物標的核酸を独立に検出するためにただ1つの前記検出チャネルが使用される、請求項46から58のいずれか一項に記載のシステム。
- 温度依存的多重侵入切断アッセイを実施するためのキットであって、1または複数のレセプタクル中に含有される第1および第2のFRETカセットを含み、前記第1および第2のFRETカセットのそれぞれが、異なる5’フラップハイブリダイジング配列を有し、前記第1および第2のFRETカセットのそれぞれが、ドナー部分とアクセプター部分とを含み、前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、等価なドナー部分である、キット。
- 前記第1および第2のFRETカセットが、単一のレセプタクル中に含有される、請求項60に記載のキット。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が同一である、請求項60または61に記載のキット。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が同一のフルオロフォアである、請求項62に記載のキット。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記アクセプター部分が同一である、請求項60から63のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記アクセプター部分が同一のクエンチャー部分である、請求項64に記載のキット。
- 1または複数のさらなるレセプタクル中に、第1および第2の一次プローブをさらに含み、前記第1および第2の一次プローブのそれぞれが3’標的ハイブリダイジング配列および5’フラップ配列を含み、
前記第1の一次プローブの前記3’標的ハイブリダイジング配列が第1の標的核酸の第1の領域と相補的であり、前記第2の一次プローブの前記3’標的ハイブリダイジング配列が第2の標的核酸の第1の領域と相補的であり、
前記第1および第2の一次プローブの前記3’標的ハイブリダイジング配列が互いに異なり、
前記第1および第2の一次プローブの前記5’フラップ配列が、それぞれ、前記第1および第2のFRETカセットの前記5’フラップハイブリダイジング配列と相補的であり、
前記第1および第2の一次プローブの前記5’フラップ配列が互いに異なり、そして
前記第1のFRETカセットの前記5’フラップハイブリダイジング配列と、前記第1の一次プローブの前記5’フラップ配列の切断形態との間に形成される第1のハイブリッドの融解温度が、前記第2のFRETカセットの前記5’フラップハイブリダイジング配列と、前記第2の一次プローブの前記5’フラップ配列の切断形態との間に形成される第2のハイブリッドの融解温度と少なくとも5℃異なる、
請求項60から65のいずれか一項に記載のキット。 - 前記第1および第2のハイブリッドの融解温度が5℃〜30℃異なる、請求項66に記載のキット。
- 前記第1および第2のハイブリッドの融解温度が5℃〜15℃異なる、請求項67に記載のキット。
- 前記第1および第2のFRETカセットと、前記第1および第2の一次プローブとが単一のレセプタクル中に含有される、請求項66から68のいずれか一項に記載のキット。
- 1または複数のさらなるレセプタクル中に、第1および第2の侵入プローブをさらに含み、前記第1の侵入プローブが前記第1の標的核酸の第2の領域と相補的であり、前記第1の標的核酸の前記第1および第2の領域が互いに隣接して配置され、前記第2の侵入プローブが、前記第2の標的核酸の第2の領域と相補的であり、前記第2の標的核酸の前記第1および第2の領域が互いに隣接して配置される、請求項66から69のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第1および第2のFRETカセットと、前記第1および第2の侵入プローブとが単一のレセプタクル中に含有される、請求項70に記載のキット。
- 前記FRETカセットまたは前記一次プローブを含有しないレセプタクル中に、フラップエンドヌクレアーゼ(FEN)酵素をさらに含む、請求項60から71のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、500nm〜750nmの範囲内の測定可能な強度を有する放出スペクトルを示す、請求項60から72のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、510nm〜530nm、560nm〜580nm、610nm〜650nm、675nm〜690nm、または705nm〜730nmの範囲内の測定可能な強度を有する放出スペクトルを示す、請求項73に記載のキット。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、0nm〜15nm異なるピーク放出波長を有する放出スペクトルを示す、請求項60から74のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、0nm〜10nm異なるピーク放出波長を有する放出スペクトルを示す、請求項75に記載のキット。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、0nm〜5nm異なるピーク放出波長を有する放出スペクトルを示す、請求項76に記載のキット。
- 前記第1および第2のFRETカセットがそれぞれ、溶液中で遊離している、請求項60から77のいずれか一項に記載のキット。
- 第1および第2のFRETカセットの混合物を含む物質の組成物であって、前記FRETカセットのそれぞれが異なる5’フラップハイブリダイジング配列を有し、前記第1および第2のFRETカセットのそれぞれがドナー部分とアクセプター部分とを含み、前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が等価なドナー部分である、組成物。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が同一である、請求項79に記載の組成物。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が同一のフルオロフォアである、請求項80に記載の組成物。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記アクセプター部分が同一である、請求項79から81のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記アクセプター部分が同一のクエンチャー部分である、請求項82に記載の組成物。
- 前記第1のFRETカセットの前記5’フラップハイブリダイジング配列と、完全に相補的な第1の5’フラップ配列との間に形成される第1のハイブリッドの融解温度が、前記第2のFRETカセットの前記5’フラップハイブリダイジング配列と、完全に相補的な第2の5’フラップ配列との間に形成される第2のハイブリッドの融解温度と少なくとも5℃異なり、前記第1および第2の5’フラップ配列が互いに異なる、請求項79から83のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1および第2のハイブリッドの融解温度が5℃〜30℃異なる、請求項84に記載の組成物。
- 前記第1および第2のハイブリッドの融解温度が5℃〜15℃異なる、請求項85に記載の組成物。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、500nm〜750nmの範囲内の測定可能な強度を有する放出スペクトルを示す、請求項79から86のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、510nm〜530nm、560nm〜580nm、610nm〜650nm、675nm〜690nm、または705nm〜730nmの範囲内の測定可能な強度を有する放出スペクトルを示す、請求項87に記載の組成物。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、0nm〜15nm異なるピーク放出波長を有する放出スペクトルを示す、請求項79から88のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、0nm〜10nm異なるピーク放出波長を有する放出スペクトルを示す、請求項89に記載の組成物。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、0nm〜5nm異なるピーク放出波長を有する放出スペクトルを示す、請求項90に記載の組成物。
- フラップエンドヌクレアーゼ(FEN)酵素をさらに含む、請求項79から91のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1および第2のFRETカセットのそれぞれが溶液中で遊離している、請求項79から92のいずれか一項に記載のキット。
- 多重侵入切断アッセイにおける2またはそれ超の標的核酸を検出するための反応混合物であって、
(a)第1および第2のFRETカセットがそれぞれ、異なる5’フラップハイブリダイジング配列を有し、前記第1および第2のFRETカセットがそれぞれ、ドナー部分とアクセプター部分とを含み、前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が等価なドナー部分である、前記第1および第2のFRETカセット;ならびに
(b)第1および第2の一次プローブがそれぞれ、3’標的ハイブリダイジング配列および5’フラップ配列を含み、
前記第1の一次プローブの前記3’標的ハイブリダイジング配列が第1の標的核酸の第1の領域と相補的であり、前記第2の一次プローブの前記3’標的ハイブリダイジング配列が第2の標的核酸の第1の領域と相補的であり、
前記第1および第2の一次プローブの前記3’標的ハイブリダイジング配列が互いに異なり、
前記第1および第2の一次プローブの前記5’フラップ配列が、それぞれ、前記第1および第2のFRETカセットの前記5’フラップハイブリダイジング配列と相補的であり、
前記第1および第2の一次プローブの前記5’フラップ配列が互いに異なる、
前記第1および第2の一次プローブ;ならびに
(c)第1の侵入プローブが前記第1の標的核酸の第2の領域と相補的であり、前記第1の標的核酸の前記第1および第2の領域が互いに隣接して配置され、第2の侵入プローブが前記第2の標的核酸の第2の領域と相補的であり、前記第2の標的核酸の前記第1および第2の領域が互いに隣接して配置される、前記第1および第2の侵入プローブ
を含む、反応混合物。 - 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が同一である、請求項94に記載の反応混合物。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が同一のフルオロフォアである、請求項95に記載の反応混合物。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記アクセプター部分が同一である、請求項94から96のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記アクセプター部分が同一のクエンチャー部分である、請求項97に記載の反応混合物。
- 前記第1のFRETカセットの前記5’フラップハイブリダイジング配列と、前記第1の一次プローブの前記5’フラップ配列の切断形態との間に形成される第1のハイブリッドの融解温度が、前記第2のFRETカセットの前記5’フラップハイブリダイジング配列と、前記第2の一次プローブの前記5’フラップ配列の切断形態との間に形成される第2のハイブリッドの融解温度と少なくとも5℃異なる、請求項94から98のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記第1および第2のハイブリッドの融解温度が5℃〜30℃異なる、請求項99に記載の反応混合物。
- 前記第1および第2のハイブリッドの融解温度が5℃〜15℃異なる、請求項100に記載の反応混合物。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、500nm〜750nmの範囲内の測定可能な強度を有する放出スペクトルを示す、請求項94から101のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、510nm〜530nm、560nm〜580nm、610nm〜650nm、675nm〜690nm、または705nm〜730nmの範囲内の測定可能な強度を有する放出スペクトルを示す、請求項102に記載の反応混合物。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、0nm〜15nm異なるピーク放出波長を有する放出スペクトルを示す、請求項94から103のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、0nm〜10nm異なるピーク放出波長を有する放出スペクトルを示す、請求項104に記載の反応混合物。
- 前記第1および第2のFRETカセットの前記ドナー部分が、0nm〜5nm異なるピーク放出波長を有する放出スペクトルを示す、請求項105に記載の反応混合物。
- 前記第1および第2のFRETカセットがそれぞれ溶液中で遊離しており、前記第1および第2のFRETカセットの前記5’フラップハイブリダイジング配列がそれぞれ一本鎖状態にある、請求項94から106のいずれかに記載の反応混合物。
- フラップエンドヌクレアーゼ(FEN)酵素をさらに含む、請求項94から107のいずれかに記載の反応混合物。
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