JP2018517436A - 染色体異常の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
間期インサイチュハイブリダイゼーションとして前記インサイチュハイブリダイゼーションを実施し、
それぞれ第1検出標識で標識された相互に異なる少なくとも4本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いて前記インサイチュハイブリダイゼーションを実施し、特に、少なくとも1点の混合シグナルを生成するために前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも1つを、前記各座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに関して前記第1検出標識とは異なる少なくとも1種の追加検出標識で標識することでシグナルパターンを生成し、そして前記シグナルパターンを用いて存在する染色体異常を特定し、且つ/または染色体領域および/またはDNA領域に割り当てる
前記方法を提唱する。
本発明によると、染色体異常という用語は同義語として染色体不規則とも呼ばれ、特に構造的および数的染色体異常を意味することが理解される。構造的染色体異常の場合、染色体の構造に変異が存在し、そのためにこれは染色体変異とも呼ばれる。特に、この染色体異常は逆位、転座、欠失、部分重複、挿入、重複、または増幅を含み得る。対照的に、数的染色体異常は染色体の数の変化に至る。ゲノム変異という用語が同義的に使用される。数的染色体異常、すなわちゲノム変異の場合、これらの染色体異常は特に異数性または倍数性を含み得る。本発明の方法は構造的染色体異常の検出に特に適切である。
本発明の方法の好ましい実施形態を以下において詳しく説明する。
(a)検出標識Aで標識された第1座位特異的ハイブリダイゼーションプローブおよび検出標識Bで標識された第2座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが染色体部分、特に切断点領域に隣接し、且つ、インサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて融合シグナルA−Bを生成し、
(b)2〜12本の追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブがさらに6か所の染色体部分、特に切断点に隣接し、同様に、一つの染色体部分、特に切断点領域に隣接する2本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの1つずつを検出標識Aで標識し、且つ、一つの染色体部分、特に切断点領域に隣接する2本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの1つずつを検出標識Bで標識し、それにより染色体部分、特に切断点領域にそれぞれ隣接する前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブがインサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて融合シグナルA−Bを生成し、且つ
(c)それらの座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも1つ、好ましくは複数のプローブを少なくとも1種の追加検出標識Xで標識し、それにより少なくとも1種の追加検出標識で標識されたそれらの座位特異的ハイブリダイゼーションプローブがインサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて融合および混合シグナルA−B/Xを生成し、
染色体異常の場合での前記融合および混合シグナルA−B/Xは、インサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて混合シグナルA/Xおよび/または混合シグナルB/Xに変化し、且つ/または
染色体異常の場合での前記融合シグナルA−Bは、インサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて単独のシグナルAおよび/またはシグナルBに変化し、それにより、そのインサイチュハイブリダイゼーションによって生成された前記シグナルパターンを用いて染色体異常を2本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが隣接する染色体領域および/またはDNA領域および/または染色体部分、特に切断点領域に割り当てる
ことが規定され得る。
(a)検出標識Aで標識された第1座位特異的ハイブリダイゼーションプローブおよび検出標識Bで標識された第2座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが第1染色体部分、特に第1切断点領域に隣接し、且つ、インサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて融合シグナルA−Bを生成し、
(b)検出標識Aで標識された第3座位特異的ハイブリダイゼーションプローブおよび検出標識Bで標識された第4座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが第2染色体部分、特に第2切断点領域に隣接し、且つ、インサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて融合シグナルA−Bを生成し、且つ
(c)その第3座位特異的ハイブリダイゼーションプローブおよび/または第4座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが追加の検出標識X1で標識されており、且つ、インサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて融合および混合シグナルA−B/X1を生成し、
前記シグナルパターンにおいて、単独のシグナルAおよび/またはシグナルBによって第1染色体部分、特に第1切断点領域の染色体異常が特定され、および/または混合シグナルA/X1および/またはB/X1によって第2染色体部分、特に第2切断点領域の染色体異常が特定され、且つ/または第2染色体部分、特に第2切断点領域に割り当てられる
ことがさらに規定され得る。
ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)肺癌標本および乳癌標本であって、以前にERBB2遺伝子の増幅がそれぞれ診断されていない標本と診断された標本の3〜5μm厚の切片を被覆ガラス支持体上に配置し、58℃で一晩にわたって焼き付けたものに対してFISHを実施した。
Hela細胞株(ATCC(登録商標)CCL−2(商標))、HCC78細胞株(ゲッティンゲンのシルトハウス教授により提供された)、およびH3122細胞株(ゲッティンゲンのシルトハウス教授により提供された)のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)細胞の3〜5μm厚の切片を被覆ガラス支持体上に配置し、58℃で一晩にわたって焼き付けたものに対してFISHを実施した。
カバーグラスを取り除いた後、洗浄バッファー(1×ウォッシュバッファーA、ZytoVision GmbH)中において37℃でそれぞれ5分間のストリンジェントな洗浄を2回行った。その後、濃度上昇エタノールシリーズ中で標本を脱水(RTで70%、90%、96%のエタノール中においてそれぞれ1分間)し、そして風乾し、そのときに試料を直射光から保護した。対比染色用色素(20μlのDAPI DuraTectソリューション、ZytoVision GmbH)をアプライした後、空気の泡が無いようにカバーガラスをかけ、標本を光から保護してRTで少なくとも30分間にわたって定温放置した。
ZytoVision GmbH社の四重FISHプローブ「ZytoLight SPEC ALK & ROS1ブレイク・アパート・シングルミックスNG−FISHプローブ」を使用して6q22にあるROS1領域の転座を検出するためのFISH分析を実施した。そのプローブは4本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに基づく混合物であり、その混合物は、2p23にあるALK切断点領域の近位に位置する配列と6q22にあるROS1切断点領域の近位に位置する配列に対する緑色標識ポリヌクレオチド(503nmでの吸光、および528nmでの発光)、2p23にあるALK切断点領域の遠位に位置する配列と6q22にあるROS1切断点領域の遠位に位置する配列に対するオレンジ色標識ポリヌクレオチド(547nmでの吸光、および572nmでの発光)、ならびに領域6q22にあるROS1切断点領域の近位に位置する配列に対する青色標識ポリヌクレオチド(426nmでの吸光、および480nmでの発光)からなった。
さらに、ZytoVision GmbH社の四重CISHプローブ「ZytoDot SPEC ALK & ROS1ブレイク・アパート・シングルミックスNG−FISHプローブ」を使用して2p23にあるALK領域の転座を検出するためのCISH分析を実施した。そのプローブは4本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに基づく混合物であり、その混合物は、2p23にあるALK切断点領域の近位に位置する配列と6q22にあるROS1切断点領域の近位に位置する配列に対するジゴキシゲニン標識ポリヌクレオチド、2p23にあるALK切断点領域の遠位に位置する配列と6q22にあるROS1切断点領域の遠位に位置する配列に対するDNP標識ポリヌクレオチド、ならびに領域6q22にあるROS1切断点領域の遠位に位置する配列に対するビオチン標識ポリヌクレオチドからなった。それらの標識の検出は一次(非標識)抗体(抗DIG/抗DNP/抗BIO)によって行われ、それらの一次抗体は二次ポリマー化酵素結合抗体(HRPポリマー/APポリマー/βGAL)ならびに基質(AP−RED/HRP−GREEN/βGAL−BLUE)の酵素反応によって検出され、その酵素反応は強い恒久的な赤色、緑色、および青色のシグナルの形成につながり、例えば40倍のドライレンズを使用する顕微鏡観察によりそれらのシグナルを表示することが可能であった。
最後に、ZytoVision社の五連FISHプローブ「ZytoLight SPEC ERBB2, EGFR, FGFR1, MET & SOX2 FiveCheck(商標)NG−FISHプローブ」を使用してERBB2領域の増幅を検出するためのFISH分析を実施した。そのプローブは5本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに基づく混合物であり、その混合物は、ERBB2遺伝子の領域17q11.2−q12、EGFR遺伝子の領域7p12、FGFR1遺伝子の領域8p11.23−p11.22、MET遺伝子の領域7q31、およびSOX2遺伝子の領域3q26.3−q27に対する緑色標識ポリヌクレオチド(503nmでの吸光、および528nmでの発光)、ならびにEGFR遺伝子の領域とSOX2遺伝子の領域に対する青色標識ポリヌクレオチド(426nmでの吸光、および480nmでの発光)、FGFR1遺伝子の領域に対するゴールデンイエロー標識ポリヌクレオチド(532nmでの吸光、および553nmでの発光)、およびMET遺伝子の領域とSOX2遺伝子の領域に対する赤色標識ポリヌクレオチド(580nmでの吸光、および599nmでの発光)からなった。
第1態様:
第1態様によると、本発明は、直接的または間接的に標識された核酸断片(プローブ)に基づいた、(複数の)構造的および/または数的染色体異常を検出(および識別)するために細胞内の複数の異なる染色体領域またはDNA領域を検出する方法であって、4〜24本の座位特異的プローブを1〜24種の異なる標識のうちの1つでそれぞれ標識し、且つ、また同時に少なくとも1本の座位特異的プローブを少なくとも1種の追加標識(最大で6種の追加標識)で標識し、それにより混合シグナルがこれらの混合標識によって生じ、所望により、同じ混合標識を有する個々のプローブを個々の標識の異なる比率に基づいて生じる異なる混合シグナルによって識別することもでき、染色体異常の場合の異常シグナルパターンを、影響を受けた座位に明確に割り当てることができ、すなわち、異常の影響を受けた座位をその混合シグナルパターンに基づいて特定することができ、a)プローブの全ての断片、または所望によりプローブの個々の断片のみを複数の標識で標識する、および/またはb)同一の断片を異なる標識で標識する、および/またはc)交互に断片を異なる標識で標識する場合に混合シグナルが生じることができ、前記断片をスーパーインポーズすることもでき、または前記断片がゲノム領域に最大で2Mbpの長さを有することもできることを特徴とする前記方法に関する。
追加の態様によると、本発明は、同時に少なくとも2本、所望により3本、所望により4本、所望により5本、所望により6本、所望により7本、所望により8本、所望により9本、および所望により10本の座位特異的プローブを少なくとも1種の追加標識、最大で6種の追加標識で標識することによりこれらの混合標識によって混合シグナルが生じる第1態様に記載の方法に関する。
追加の態様によると、本発明は、少なくとも5〜24本、所望により6〜24本、所望により7〜24本、および所望により8〜24本の座位特異的プローブを1〜24種の異なる標識のうちの1つでそれぞれ標識する第1態様に記載の方法に関する。
追加の態様によると、本発明は、直接的または間接的に標識された核酸断片(プローブ)に基づいた、構造的染色体異常を検出するために細胞内の複数の異なる染色体領域またはDNA領域を検出するための方法であって、
標識Aで標識された第1プローブ(プローブ1)および標識Bで標識された第2プローブ(プローブ2)が切断点領域1に隣接し、それらのプローブが融合シグナルA−Bを形成すること、および
同じ原理に基づいて2〜12本の追加のプローブ(プローブ3〜14)が1〜6つの追加の切断点領域(切断点領域2〜7)に隣接し、それらも融合シグナルA−Bをそれぞれ形成すること、および
同時に前述のプローブうちの少なくとも1本の追加のプローブを追加の標識でも、特に標識C〜Fから選択される標識でも標識するか、または所望によりこれらの標識の相互に異なる比率で標識し,それによりそれらのプローブが特定の融合および混合シグナルA−B/Xを形成し、
a)Xである標識Cおよび/または標識Dおよび/または標識Eおよび/または標識Fはそれぞれ異なる比率であってよく、およびb)特定の融合および混合シグナルA−B/Xが染色体異常の場合に変化して新しい分離した混合シグナルA/XまたはB/Xが形成され、c)加えて、所望により(プローブペアに追加の標識Xが使用されていない場合に)特定の融合シグナルが変化して新しい分離したシグナルAまたはBが形成され、d)影響を受けた切断点領域がこれらの変化したシグナルパターンに基づいて明確に検出され得る
ことを特徴とする前記方法に関する。
追加の態様によると、本発明は、直接的または間接的に標識された核酸断片(プローブ)に基づいた、構造的染色体異常を検出するために細胞内の複数の異なる染色体領域またはDNA領域を検出するための方法であって、
標識Aで標識された第1プローブ(プローブ1)および標識Bで標識された第2プローブ(プローブ2)が切断点領域1に隣接し、それらのプローブが融合シグナルA−Bを形成すること、および
標識Aで標識された第3プローブ(プローブ3)および標識Bで標識された第4プローブ(プローブ4)が切断点領域2に隣接し、これも融合シグナルA−Bを形成し、且つ、プローブ3および/またはプローブ4が同時に追加の標識Cでも標識され、それにより融合シグナルA−B/Cを形成し、
前述のシグナルが染色体異常の場合に変化して分離したシグナルAおよび/またはシグナルB(切断点1)または融合シグナルA/Cおよび/またはB/C(切断点2)が形成される
を特徴とする前記方法に関する。
追加の態様によると、本発明は、適切なフィルターを使用すると標識Aおよび/または標識Bだけを用いることでシグナルAおよび/またはシグナルBだけがまず考慮され、およびAおよび/またはBの異常なシグナルパターンが存在する場合にのみ影響を受けた染色体領域の明確のために追加の標識C〜Fが考慮される、前述の態様のいずれか1つに記載の方法に関する。
追加の態様によると、本発明は、座位特異的プローブによって検出されるゲノム領域が5Mbp未満、所望により2Mbp未満、所望により1Mbp未満、所望により750kb未満、所望により500kb未満、所望により250kb未満、所望により100kb未満、所望により10kb未満、および所望により1kb未満である、前述の態様のいずれか1つに記載の方法に関する。
追加の態様によると、本発明は、異なる標識を有する複数の同じプローブであって、所望により少なくとも90%、所望により少なくとも80%、所望により少なくとも70%、所望により少なくとも60%、および所望により少なくとも50%一致する場合に同じものであると見なされるそれらの同じプローブを一本のプローブの混合標識の代わりに使用する、前述の態様のいずれか1つに記載の方法に関する。
追加の態様によると、本発明は、悪性腫瘍、好ましくは癌腫、好ましくは肉腫、および好ましくは白血病において染色体異常が検出され得ることが好ましい、前述の態様のいずれか1つに記載の方法に関する。
追加の態様によると、本発明は、プローブがポリヌクレオチド、修飾型ポリヌクレオチド、または修飾型核酸断片、またはオリゴヌクレオチド、または修飾型オリゴヌクレオチドである、前述の態様のいずれか1つに記載の方法に関する。
追加の態様によると、本発明は、標識が色素、色素基質、化学発光色素(例えばアクリジニウム)、放射性同位体、スピン標識、酵素(例えばアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、大豆ペルオキシダーゼおよび/またはβガラクトシダーゼ)、ハプテン(例えばジゴキシゲニン、ビオチン、5(6)−カルボキシフルオレセイン、ローダミン、ブロモデオキシウリジン、アセチルアミノフルオレン、トリニトロフェノール、トリニトロフェノール誘導体、エストラジオール、および/またはDNP)、カンタムドット、ビーズ、アミノヘキシル類、ピレン類および蛍光色素(例えばフルオレセイン、フルオレセイン誘導体、5(6)−カルボキシフルオレセイン、クマリン、クマリン誘導体、ローダミン、ローダミン誘導体、テトラメチルローダミン、リサミン、テキサスレッド、AMCA、TRITC、IR色素、Alexa色素、Dyomics色素、フィコエリトリン類、カスケードブルー、オレゴングリーン488、パシフィックブルーおよび/またはローダミングリーン)からなる群より選択される、前述の態様のいずれか1つに記載の方法に関する。
追加の態様によると、本発明は、完全可視光領域、赤外線領域、および紫外線領域向けの、好ましくは緑色、オレンジ色/赤色、赤色、金色、および青色の発光領域向けの直接的に組み込まれた蛍光色素を使用するFISH法によって本方法が実施される、前述の態様のいずれか1つに記載の方法に関する。
追加の態様によると、本発明は、抗体結合アルカリホスファターゼ、抗体結合ペルオキシダーゼ、および抗体結合βガラクトシダーゼと組み合わせてビオチン、ジゴキシゲニンおよびDNPを使用するBrISH法によって本方法が実施される、前述の態様のいずれか1つに記載の方法に関する。
追加の態様によると、本発明は、遺伝子ALK、ROS1、RET、NRG1、NTRK1、CARS、EML4、FGFR2、FGFR3、KIF5B、TGF、BCR、ABL、ALK、BCL2、BCL6、BIRC3、CCND1、EGR1、ETV6、FGFR1、FGFR3、IGH、KMT2A、MYC、PML、RARA、RUNX1、RUNX1T1、EWSR1、CHOP、FUS、COL1A1、DDIT3、JAZF1、NR4A3、FOXO1、FUS、PAX3、PAX7、PDGFB、SS18、TFE3、USP6、WT1、HER2/ERBB2、FGFR1、ALK、CCND1、CDK4、CD274、PDCD1LG2、EGR1、EGFR、ESR1、ETV1、FGF3、4、19、FGFR2、FGFR3、FHIT(RCC)、KRAS、MDM2、MDM4、MET、MYB、MYC、MYCN、PIK3CA、PTEN、SMARCB1、SOX2、TERT、TOP2A、TP53、TYMSおよび/またはVHLが染色体異常について検査される、前述の態様のいずれか1つに記載の方法に関する。
追加の態様によると、本発明は、直接的または間接的に標識された核酸断片(プローブ)に基づいた、好ましくは複数の構造的および/または数的染色体異常を検出および識別するために細胞内の複数の異なる染色体領域またはDNA領域を検出するための調製物であって、
4〜24本の座位特異的プローブが1〜24種の異なる標識のうちの1つでそれぞれ標識されており、且つ
同時に少なくとも1本の座位特異的プローブが少なくとも1種の追加標識、最大で6種の追加標識でも標識されており、それによりこれらの混合標識によって混合シグナルが生じ、所望により、同じ混合標識を有する個々のプローブを個々の標識の異なる比率に基づいて生じる異なる混合シグナルによって識別することもでき、それにより染色体異常の場合の異常シグナルパターンを、影響を受けた座位に明確に割り当てることができ、且つ/またはそれにより異常の影響を受けた座位をその混合シグナルパターンに基づいて特定することができ、a)プローブの全ての断片、または所望によりプローブの個々の断片のみを複数の標識で標識する、および/またはb)同一の断片を異なる標識で標識する、および/またはc)交互に断片を異なる標識で標識する場合に混合シグナルが生じることができ、前記断片をスーパーインポーズすることもでき、または前記断片がゲノム領域に最大で2Mbの長さを有することもできる
前記調製物に関する。
追加の態様によると、本発明は、プローブが第1態様から第13態様に従って構成される、第15態様に記載の調製物に関する。
Claims (15)
- 生体試料内、好ましくは1つ以上の細胞内および/または1つ以上の細胞核内の染色体領域および/またはDNA領域の検出によるインサイチュハイブリダイゼーションにより染色体異常、特に構造的および/または数的染色体異常、好ましくは構造的染色体異常の検出方法であって、
前記インサイチュハイブリダイゼーションを間期インサイチュハイブリダイゼーションとして実施すること
それぞれ第1検出標識で標識された相互に異なる少なくとも2本、特に少なくとも3本、好ましくは少なくとも4本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いて前記インサイチュハイブリダイゼーションを実施し、特に、少なくとも1点の混合シグナルを生成するために前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも1つを、前記各座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに関して前記第1検出標識とは異なる少なくとも1種の追加検出標識で標識し、それによりシグナルパターンを生じさせること、および
前記シグナルパターンを用いて存在する染色体異常を特定すること、および/または存在する染色体異常を染色体領域および/またはDNA領域に割り当てること
を特徴とする前記方法。 - 前記第1検出標識がそれぞれ同一であるか、または相互に異なっており、且つ/または
前記染色体異常が相互無関係の染色体異常であり、且つ/または前記染色体異常が相互的染色体異常ではなく、且つ/または前記染色体異常が相互的染色体異常および/または相互関連染色体異常と関係および/または関連しておらず、且つ/または
少なくとも1例の染色体異常、特に相互に異なる複数の染色体異常が複数のあり得る染色体異常の中から前記試料中に検出および/または判定され、且つ/または少なくとも2例の染色体異常、特に相互に異なる複数の染色体異常が複数のあり得る染色体異常の中から一緒に、特に同時に前記試料中に検出および/または判定され、且つ/または前記方法が相互に異なる複数の染色体異常の同時検出のための多重方法として実施される、
請求項1に記載の方法。 - 染色体異常が前記少なくとも1点の混合シグナル、特に複数の混合シグナルによるシグナルパターンとして特定され、且つ/または検出される前記染色体領域および/またはDNA領域に割り当てられ、且つ/または
少なくとも1種の追加検出標識を用いて追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの標識を行い、追加の検出標識で標識された前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブがシグナルパターンとして相互に異なる混合シグナルをそれぞれ生成し、且つ/または少なくとも1種の追加検出標識を用いて追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの標識を行い、少なくとも1種の追加検出標識で標識されている各座位特異的ハイブリダイゼーションプローブによって染色体領域および/またはDNA領域に特異的な混合シグナルがシグナルパターンとして生成され、且つ/または少なくとも1種の追加検出標識を用いて追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの標識を行い、特定の混合シグナルによるシグナルパターンとしての各検出染色体異常が検出染色体領域および/または検出DNA領域に割り当てられ、且つ/または
少なくとも2本、特に少なくとも3本、好ましくは少なくとも4本、好ましくは少なくとも5本、特に好ましくは少なくとも6本、非常に特に好ましくは少なくとも7本の追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを前記第1検出標識とは異なる少なくとも1種の追加検出標識で標識し、且つ/または染色体領域および/またはDNA領域に特異的な混合シグナルが少なくとも2本、特に少なくとも3本、好ましくは少なくとも4本、好ましくは少なくとも5本、特に好ましくは少なくとも6本、非常に特に好ましくは少なくとも7本の追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブによってシグナルパターンとして生成される
請求項1または請求項2に記載の方法。 - それぞれ2本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが染色体部分、特に切断点領域に隣接し、染色体部分、特に切断点領域に隣接するそれぞれ2本の前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを相互に異なる検出標識で標識し、それによりそれぞれ染色体部分、特に切断点領域に隣接する前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが、特に染色体異常が存在しない場合にシグナルパターンとして融合シグナルを生成し、
特に、前記第1検出標識とは異なる少なくとも1種の追加検出標識で標識された前記ハイブリダイゼーションプローブが染色体部分、特に切断点領域に隣接する前記第2座位特異的ハイブリダイゼーションプローブと共に、特に染色体異常が存在しない場合にシグナルパターンとして混合および融合シグナルを生成し、且つ/または
特に、前記第1検出標識とは異なる少なくとも1種の追加検出標識で標識された前記ハイブリダイゼーションプローブ、および染色体部分、特に切断点領域に隣接する前記第2座位特異的ハイブリダイゼーションプローブがそれぞれシグナルパターンとして単一のシグナルを生成し、特に少なくとも1種の追加検出標識で標識されている前記ハイブリダイゼーションプローブが、特に染色体異常が存在する場合にシグナルパターンとして混合シグナルをさらに生成し、且つ/または
特に、前記シグナルパターンにおいて混合シグナルによって検出染色体領域および/または検出DNA領域、および/または染色体部分、特に切断点領域に染色体異常を割り当てる
請求項1から請求項3のいずれか1項に記載の方法。 - 一つの染色体部分、特に切断点領域毎にそれぞれ2本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが隣接する少なくとも6本、好ましくは少なくとも8本、好ましくは少なくとも10本、特に好ましくは少なくとも12本、さらにより好ましくは少なくとも14本の異なる座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用し、且つ/または一つの染色体部分、特に切断点領域毎にそれぞれ2本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが隣接する最多でも24本の異なる座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用し、且つ/または
各隣接染色体部分、特に切断点領域、ならびに/または検出される各染色体領域および/もしくはDNA領域が、シグナルパターンとして融合および混合シグナルによって特定および/または割り当てられ得るように第1検出標識とは異なる少なくとも1種の追加検出標識で追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの標識を行う、
請求項4に記載の方法。 - (a)検出標識Aで標識された第1座位特異的ハイブリダイゼーションプローブおよび検出標識Bで標識された第2座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが染色体部分、特に切断点領域に隣接し、且つ、インサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて融合シグナルA−Bを生成し、
(b)2〜12本の追加の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブがさらに6か所の染色体部分、特に切断点に隣接し、同様に、一つの染色体部分、特に切断点領域に隣接する2本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの1つずつを検出標識Aで標識し、且つ、一つの染色体部分、特に切断点領域に隣接する2本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの1つずつを検出標識Bで標識し、それにより染色体部分、特に切断点領域にそれぞれ隣接する前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブがインサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて融合シグナルA−Bを生成し、且つ、
(c)前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも1つ、好ましくは複数のプローブを少なくとも1種の追加検出標識Xで標識し、それにより少なくとも1種の追加検出標識で標識された前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブがインサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて融合および混合シグナルA−B/Xを生成し、
染色体異常の場合での前記融合および混合シグナルA−B/Xは、インサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて混合シグナルA/Xおよび/または混合シグナルB/Xに変化し、且つ/または
染色体異常の場合での前記融合シグナルA−Bは、インサイチュハイブリダイゼーションによって生成される前記シグナルパターンにおいて単独のシグナルAおよび/またはシグナルBに変化し、
それにより、前記インサイチュハイブリダイゼーションによって生成された前記シグナルパターンを用いて染色体異常を2本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが隣接する染色体領域および/またはDNA領域および/または染色体部分、特に切断点領域に割り当て、
特に前記検出標識Xを単一の検出標識、特に検出標識X1により形成し、且つ/または
特に、前記検出標識Xを相互に異なる複数の検出標識、好ましくはX1、X2、...および/またはXnからなる群より選択される検出標識により形成し、指数「n」は1から20まで、特に1から10、好ましくは1から5までの自然数を表し、特に前記検出標識X1、X2、...および/またはXnを使用して相互に異なる混合シグナル、特に互いに対して比率が異なる特定の混合シグナルを生成し、且つ/または
特に、前記検出標識Xを相互に異なる複数の検出標識、好ましくは前記検出標識X1、X2、X3、X4、X5および/またはX6からなる群より選択される複数の検出標識により形成し、特に前記検出標識X1、X2、X3、X4、X5および/またはX6を使用して相互に異なる混合シグナル、特に互いに対して比率が異なる特定の混合シグナルを生成し、且つ/または
第1ステップにおいて、前記第1検出標識によって生成された前記融合シグナルが検出および/または分析され、そして後続のステップにおいて単独のシグナルが生じる場合は前記混合シグナルの検出および/または分析と検出された染色体領域および/またはDNA領域への前記混合シグナルの割り当てを行い、且つ/またはコンピューター支援分析により前記シグナルパターンの検出を行う、
請求項4または請求項5に記載の方法。 - 単一の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブによって検出される前記染色体領域および/またはDNA領域が5Mbp未満、特に2Mbp未満、好ましくは1Mbp未満、好ましくは750kbp未満、特に好ましくは500kbp未満の長さを有し、且つ/または単一の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブによって検出される前記染色体領域および/またはDNA領域が少なくとも500bp、特に少なくとも1kbp、好ましくは少なくとも5kbp、好ましくは少なくとも10kbpの長さを有し、且つ/または単一の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブによって検出される前記染色体領域および/またはDNA領域が500bpから5Mbpまでの範囲、特に1kbpから2Mbpまでの範囲、好ましくは5kbpから1Mbpまでの範囲、好ましくは10kbpから750kbpまでの範囲、特に好ましくは10kbpから500kbpまでの範囲の長さであり、且つ/または
前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが核酸断片の形態、特にポリヌクレオチド、修飾型ポリヌクレオチド、修飾型核酸断片、オリゴヌクレオチド、および/またはオリゴヌクレオチドの形態で存在し、且つ/または前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが、検出予定の前記染色体領域および/またはDNA領域をそれぞれ包含する単一の核酸断片によってそれぞれ形成され、且つ/または
前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが、検出予定の前記染色体領域および/またはDNA領域をそれぞれ包含する複数の核酸断片(「プローブ断片」)によってそれぞれ形成され、特に座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの前記個々の核酸断片(「プローブ断片」)が5〜2,000bpまでの範囲、特に10〜1,500bpまでの範囲、好ましくは50〜1,000bpまでの範囲の長さであり、且つ/または
混合シグナルを生成するために座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの核酸断片(「プローブ断片」)が前記第1検出標識で標識されると共に、前記第1検出標識とは異なる1種の追加検出標識で標識され、且つ/または
混合シグナルを生成するために座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの核酸断片(「プローブ断片」)が前記第1検出標識で標識されると共に、前記第1検出標識とは異なる複数の検出標識、特に2〜20種の検出標識、好ましくは2〜10種の検出標識、好ましくは2〜5種の検出標識で標識され、特に相互に異なる量で前記検出標識が使用される、
請求項1から請求項6のいずれか1項に記載の方法。 - (i)ハイブリダイゼーション特異的プローブの個々の核酸断片がたった1種の検出標識で標識され、特にこの検出標識が前記第1検出標識および/または他のあらゆる検出標識であり得、且つ/または
(ii)ハイブリダイゼーション特異的プローブの個々の核酸断片が相互に異なる複数の検出標識で標識され、特にこの検出標識が前記第1検出標識および/または他のあらゆる検出標識であり得、
特に、前記可能性(i)と(ii)の組合せによっても混合シグナルが生じ、且つ/または
特に、最大で3Mbp、特に最大で2.5Mbp、好ましくは最大で2Mbp、好ましくは最大で1Mbp、特に好ましくは最大で500kb、さらにより好ましくは最大で200kbの距離であっても、少なくとも1種の追加検出標識で標識されている座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの個々のハイブリダイズした核酸断片を用いて混合シグナルが生成され、且つ/または
特に、相互に異なる座位特異的ハイブリダイゼーションプローブにおいて相互に異なる量比で同じ検出標識を使用することにより、相互に識別可能である混合シグナルを生成することができる
請求項1から請求項7のいずれか1項に記載の方法。 - 前記検出標識が色素;色素基質、化学発光色素、特にアクリジニウム;放射性同位体;スピン標識;酵素、特にアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、大豆ペルオキシダーゼおよび/またはβガラクトシダーゼ;ハプテン、特にジゴキシゲニン、ビオチン、2,4−ジニトロフェノール、5(6)−カルボキシフルオレセイン、ローダミン、ブロモデオキシウリジン、アセチルアミノフルオレン、トリニトロフェノール、トリニトロフェノール誘導体、エストラジオールおよび/または2,4−ジニトロフェノール;カンタムドット;ビーズ;アミノヘキシレン;ピレン類;且つ/または蛍光色素、特にフルオレセイン、フルオレセイン誘導体、5(6)−カルボキシフルオレセイン、クマリン、クマリン誘導体、ローダミン、ローダミン誘導体、テトラメチルローダミン、リサミン、テキサスレッド、AMCA、TRITC、IR色素、Alexa色素、Dyomics色素、フィコエリトリン類、カスケードブルー、オレゴングリーン488、パシフィックブルーおよび/またはローダミングリーンからなる群より選択され、且つ/または
前記インサイチュハイブリダイゼーションが前記ハイブリダイゼーションプローブの直接標識によって、特に蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)によって行われ、且つ/または前記インサイチュハイブリダイゼーションが、蛍光色素、特に可視光領域、赤外線領域、および/または紫外線領域向けの蛍光色素、好ましくは緑色、オレンジ色/赤色、赤色、金色および/または青色の発光領域向けの蛍光色素での前記ハイブリダイゼーションプローブの標識によって行われ、且つ/または前記インサイチュハイブリダイゼーションが前記ハイブリダイゼーションプローブの間接標識によって、特に明視野インサイチュハイブリダイゼーション(BrISH)によって行われ、且つ/または前記インサイチュハイブリダイゼーションがハプテン、特にビオチン、ジゴキシゲニン、および/またはDNPでの前記ハイブリダイゼーションプローブの標識と後続の抗体結合アルカリホスファターゼ、抗体結合ペルオキシダーゼ、および/または抗体結合βガラクトシダーゼによる検出によって行われ、且つ/または
前記染色体異常が転座、逆位、部分重複、欠失、挿入、重複、異数性および増幅、特に転座および/または逆位であり、且つ/または
前記染色体異常が疾患、特に悪性腫瘍、好ましくは癌腫、肉腫、および/または白血病と関連し、且つ/または
前記染色体異常が以下の遺伝子、ALK、ROS1、RET、NRG1、NTRK1、CARS、EML4、FGFR2、FGFR3、KIF5B、TGF、BCR、ABL、ALK、BCL2、BCL6、BIRC3、CCND1、EGR1、ETV6、FGFR1、FGFR3、IGH、KMT2A、MYC、PML、RARA、RUNX1、RUNX1T1、EWSR1、CHOP、FUS、COL1A1、DDIT3、JAZF1、NR4A3、FOXO1、FUS、PAX3、PAX7、PDGFB、SS18、TFE3、USP6、WT1、HER2/ERBB2、FGFR1、ALK、CCND1、CDK4、CD274、PDCD1LG2、EGR1、EGFR、ESR1、ETV1、FGF3、4、19、FGFR2、FGFR3、FHIT(RCC)、KRAS、MDM2、MDM4、MET、MYB、MYC、MYCN、PIK3CA、PTEN、SMARCB1、SOX2、TERT、TOP2A、TP53、TYMS、および/またはVHLのうちの1つ以上に存在する、
請求項1から請求項8のいずれか1項に記載の方法。 - インサイチュハイブリダイゼーション、特に生体試料内、好ましくは1つ以上の細胞内および/または1つ以上の細胞核内の染色体領域および/またはDNA領域の検出によるインサイチュハイブリダイゼーションにより、特に請求項1から請求項9のいずれか1項に記載の方法により染色体異常、特に構造的および/または数的染色体異常、好ましくは構造的染色体異常を検出するための組成物であって、それぞれ第1検出標識で標識された相互に異なる少なくとも2本、特に少なくとも3本、好ましくは少なくとも4本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを含み、且つ、前記の各座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに関して、前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも1本のプローブが前記第1検出標識とは異なる少なくとも1種の追加検出標識で標識されている、前記組成物。
- 染色体異常と関連する疾患、特に悪性腫瘍、好ましくは癌腫、肉腫、および/または白血病、特に好ましくは肺腫瘍、リンパ腫、白血病、肉腫、乳癌、および/または結腸癌の予防処置および/または治療処置および/または診断および/または予後判定に使用される組成物であって、
それぞれ第1検出標識で標識された相互に異なる少なくとも2本、特に少なくとも3本、好ましくは少なくとも4本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを含み、且つ、前記の各座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに関して、前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも1本のプローブが前記第1検出標識とは異なる少なくとも1種の追加検出標識で標識されている、前記組成物。 - 前記組成物が請求項10に従って構成されており、且つ/または前記組成物が請求項1から請求項9のいずれか1項に記載の方法の実施を目的とされており、且つ/またはその方法の実施のために使用される、請求項10または請求項11に記載の組成物。
- インサイチュハイブリダイゼーション、特に生体試料内、好ましくは1つ以上の細胞内および/または1つ以上の細胞核内の染色体領域および/またはDNA領域の検出によるインサイチュハイブリダイゼーションにより、特に請求項1から請求項9のいずれか1項に記載の方法により染色体異常、特に構造的および/または数的染色体異常、好ましくは構造的染色体異常を検出するための組成物の使用、特に請求項10から請求項12のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- それぞれ第1検出標識で標識された相互に異なる少なくとも2本、特に少なくとも3本、好ましくは少なくとも4本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブであって、前記の各座位特異的ハイブリダイゼーションプローブに関して、前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも1本のプローブが前記第1検出標識とは異なる少なくとも1種の追加検出標識で標識されている前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブの、染色体異常と関連する疾患、特に悪性腫瘍、好ましくは癌腫、肉腫、および/または白血病、特に好ましくは肺腫瘍、リンパ腫、白血病、肉腫、乳癌、および/または結腸癌の診断および/または予後判定のための好ましくは請求項1から請求項9のいずれか1項に記載の方法の範囲内での使用。
- インサイチュハイブリダイゼーション、特に生体試料内、好ましくは1つ以上の細胞内および/または1つ以上の細胞核内の染色体領域および/またはDNA領域の検出によるインサイチュハイブリダイゼーションにより染色体異常、特に構造的および/または数的染色体異常、好ましくは構造的染色体異常を検出するためのキット(部分キットまたはセット)であって、それぞれ第1検出標識で標識された相互に異なる少なくとも2本、特に少なくとも3本、好ましくは少なくとも4本の座位特異的ハイブリダイゼーションプローブを含み、前記の各ハイブリダイゼーションプローブに関して、前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも1本のプローブが前記第1検出標識とは異なる少なくとも1種の追加検出標識で標識されている前記キットであり、
特に、請求項1から請求項9のいずれか1項に記載の方法の実施を目的とされており、且つ/またはその方法のために使用される前記キットであり、特に、相互に異なる少なくとも2本、特に少なくとも3本、好ましくは少なくとも4本の前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが共通の組成物、特に請求項10に記載の組成物内に存在し、または相互に異なる少なくとも2本、特に少なくとも3本、好ましくは少なくとも4本の前記座位特異的ハイブリダイゼーションプローブが互いに分かれた別々の組成物内に存在する、前記キット。
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