BR122015032159A2 - método para detectar câncer de próstata utilizando conjunto de sondas compreendendo sondas lócus específicas para myc e para homólogo de fosfatase e tensina (pten) e sondas centroméricas para cromossomos 7, 8 e 10, bem como conjunto de sondas e kit - Google Patents

Abstract

resumo "método para detectar câncer de próstata utilizando conjunto de sondas compreendendo sondas lócus específicas para myc e para homólogo de fosfatase e tensina (pten) e sondas centroméricas para cromossomos 7, 8 e 10, bem como conjunto de sondas e kit" a presente invenção fornece um método para detectar câncer de próstata compreendendo contatar uma amostra de células da próstata do paciente com um conjunto de sondas marcadas de modo detectável, sob condições de hibridização, e determinar a presença de anormalidades cromossômicas no tecido de tumor, pin (neoplasia intraepitelial), tecido histologicamente benigno e hiperplasia prostática benigna (bph); um método para combinar imunofluorescência e fish (if-fish) para facilitar a avaliação de anormalidades cromossômicas; um conjunto de sondas; e um kit compreendendo o conjunto de sondas e instruções para diagnosticar o câncer da próstata em um paciente.

Description

[001]Este pedido reivindica a prioridade ao pedido de patente provisório U.S. no. 61/582.212, que foi depositado em 30 de dezembro de 2011, e cujo conteúdo é, pelo presente, incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO [002]A presente divulgação refere-se aos métodos de diagnose, prognose e avaliação do tratamento terapêutico ou profilático de câncer, em particular câncer da próstata, a detecção de anormalidades fenotípicas e genotípicas, imunofluorescência, e hibridização in situ, bem como a um conjunto de sondas e um kit útil em tais métodos.

ANTECEDENTES [003]O câncer da próstata é a malignidade mais comum nos homens e, depois do câncer de pulmão, a segunda causa principal de morte nos homens. Havia uns 217.730 novos casos estimados em 2010, resultando em 32.050 mortes (www.cancer.gov). A maior parte dos tumores está confinada à próstata. Outros estão clinicamente localizados na área periprostática, porém se estendem através da cápsula prostática e podem envolver vesículas seminais. Os tumores restantes são metastáticos.

[004]A ausência de marcadores diagnósticos seguros que capacitem a detecção inicial e acurada dos tumores, quando eles estiverem confinados na próstata, bem como marcadores prognósticos que capacitem a predição da progressão da doença, é um problema fundamental no controle do câncer da próstata. A detecção e a diagnose iniciais do câncer da próstata atualmente se valem do exame retal digital (DRE), da medição do antígeno específico para próstata (PSA), da ultrassonografia

2/79 transretal (TRUS), e da biopsia com agulha transretal (TRNB). A abordagem diagnostica principal emprega uma combinação de DRE e medição do PSA no soro; entretanto, esta abordagem tem grandes limitações. A detecção de uma elevação no nível de PSA é mais sensível do que específica (Thompson e col., NEJM 350: 22392246 (2004)). Consequentemente, mais homens são desnecessariamente submetidos à biopsia com agulha devido ao exame de PSA e, infelizmente, a natureza focal do câncer da próstata resulta em erros de amostragem da biopsia com agulha com taxas de falso-negativos de 15-30% durante a diagnose (CamposFernandes e col., Eur. Urol. 55: 600-609 (2009)). Dos aproximadamente 1,2 milhões de pacientes que sofrem biopsia da próstata todos os nos E.U., 70-80% recebem resultados negativos, porém não podem ser tranquilizados porque um câncer poderia ter sido deixado escapar por erro de amostragem (Nonn e col., Prostate 69: 1470-1479 (2009)). Portanto, são necessárias biopsias repetidas (segunda, terceira ou quarta) por causa dos níveis de PSA elevados contínuos (Campos-Fernandes e col. (2009), supra).

[005]Além do PSA, outros marcadores e métodos foram identificados. Por exemplo, a medição do nível de amplificação do gene HER-2/neu por hibridização in situ fluorescente (FISH) foi divulgada ser um método de determinar a gravidade do câncer da próstata (Pub. do Ped. de Pat. Intern. No. WO 1998/045479). A determinação da presença de um segmento da banda do cromossomo 8q24.1-24.2 foi divulgada ser um método de diagnosticar a progressão do câncer da próstata (Pat. U.S. No. 5.658.730). A determinação da perda do lócus de 8p21-22, de um ganho do cromossomo 8, e de um aumento adicional do número de cópias de c-myc em relação ao número de cópias de centrômero foi divulgada ser um método de prognosticar o câncer da próstata (Pat. U.S. No. 6.613.510). A determinação do padrão de hibridização de um conjunto de sondas cromossômicas compreendendo uma sonda para o lócus de 8p, tal como 8p21-22, e uma sonda para o lócus 8q24 e correlacionando o padrão de hibridização com a diagnose do câncer da próstata

3/79 também foi divulgada (Pub. do Ped. de Pat. U.S. No. 2003/0091994). Um ganho de 8q24 (c-myc) e uma perda da heterozigosidade de 8p21-22 (LPL) (Bova et al., Cancer Res. 53: 3869-3873 (1993); Kagan e col., Oncogene 11: 2121-2126 (1995); e Emmert- Buck e col., Cancer Res. 55: 2959-2962 (1995)) e 10q23 (PTEN) (Yoshimoto e col., Br. J. Cancer 97(5): 678-685 (3 de set. de 2007; epub 14 de agosto de 2007) também foi descrito. O teste quanto à perda de heterozigosidade em um ou mais lócus sobre um ou mais dos cromossomos 1-22 foi divulgado como um método de detectar uma célula com um fenótipo neoplástico ou pré-neoplástico (Pub. do Ped. de Pat. U.S. No. 2003/0165895). A detecção de um aumento no nível de expressão do gene 20P1F12/TMPRSS2 foi divulgada como um método de identificar o câncer da próstata (Pat. U.S. No. 7.037.667). A detecção de uma quebra na sequência do cromossomo humano 12q24 no lócus do gene SMRT usando FISH foi divulgada como um método de determinar a probabilidade da metástase do câncer da próstata (Pat. U.S. No. 7.425.414). A determinação do nível de um constituinte, tal como PTEN RNA, foi divulgada como um método para avaliar a presença de câncer da próstata (Pub. do Ped. de Pat. Intern. No. WO 2008/121132). A detecção de uma fusão de gene ACSL3-ETS foi divulgada como um método de diagnosticar o câncer da próstata (Pub. do Ped. de Pat. Intern. No. WO 2009/144460). A detecção da presença de uma fusão de gene tendo uma parte em 5' a partir da região reguladora transcricional de um gene TMPRSS2 e uma parte em 3' de um gene ERG, ETV1 ou ETV4 foi divulgada como um método de identificar o câncer da próstata (Pat. U.S. No. 7.718.369), bem como predizer a recorrência, a progressão e o potencial metastático (Pub. do Ped. de Pat. Intern. No. WO 2010/056993). A detecção da superexpressão de PITX2 foi divulgada como um método para diagnosticar a presença ou o risco de câncer da próstata (Pub. do Ped. de Pat. Intern. No. WO 2010/099577). A identificação de um nível aumentado de um ácido nucléico ou polipeptídeo selecionado a partir de OCT3/4, Nanog, Sox2, c-myc,

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If4, queratina 8, e uPAR foi divulgada como um método de identificar um carcinoma da próstata (Pub. do Ped. de Pat. Intern. No. 2011/037643).

[006]Além do acima descrito, o efeito de campo do câncer da próstata tem sido estudado por diversos grupos. Usando a análise por imagem digital, os pesquisadores identificaram alterações sutis da morfologia nuclear no tecido histologicamente benigno, adjacente ao câncer da próstata(Qian e col., Hum. Pathol. 28: 143-148 (1997); e Veltri e col., Clin. Cancer Res. 10: 3465-3473 (2004)). Usando microarranjos de cDNA, foi descrita a diferença do perfil de expressão gênica entre o tecido normal adjacente de câncer de próstata e o tecido normal obtido de doadores de órgãos (Chandran e col., BMC Cancer 5(1): 45 (2005); Yu e col., J. Clin. Oncol. 22(14): 2790-2799 (2004); e Rizzi e col., PLoS ONE 3(10): e3617 (2008)). Usando imuno-histoquímica, foram observadas alterações da expressão da proteína de múltiplos biomarcadores em glândulas normais e de neoplasia intraepitelial prostática de alto grau (HGPIN) próximas e distantes. Estes marcadores incluem Mcm-2 e Ki67 (Ananthanarayanan e col., BMC Cancer 6: 73 (2006); Santinelli e col., Am. J. Clin. Pathol. 128(4): 657-666 (2007)), α-metilacil-CoA racemase (AMACR) (Santinelli e col. (2007), supra; e Ananthanarayanan e col., Prostate 63(4): 341-346 (2005)), e receptor de androgênio (AR) (Olapade-Olaopa e col., Clin. Cancer Res. 5(3): 569-576 (1999)), etc. Usando microdissecção de captura a laser e PCR específica para metilação quantitativa, o efeito de campo para o silenciamento do gene através de hipermetilação no carcinogênese da próstata foi também verificado por múltiplos grupos (Mehrothra e col., Prostate 68(2): 152-160 (2008); e Aitchison e col., Prostate 67(6): 638-644 (2007)). Os genes incluem GSTP1, APC, RASSF1A, HIN-1 e RARb2.

[007]Em vista do precedente, permanece uma necessidade por métodos diagnósticos e prognósticos mais seguros e informativos no controle do câncer da próstata. A presente divulgação busca proporcionar um conjunto de marcadores,

5/79 bem como métodos de usar e um kit compreendendo o conjunto de marcadores, para a diagnose, a prognose, e a avaliação do tratamento terapêutico ou profilático de câncer, em particular o câncer da próstata. Este e outros objetivos e vantagens, bem como características inventivas, tornar-se-ão aparentes a partir da descrição detalhada proporcionada neste documento.

RESUMO [008]Proporciona-se um método de detectar o câncer da próstata em um paciente. As anormalidades genômicas em um tumor da próstata (malignidade; designada neste documento região de interesse (ROI) de tumor) ou uma área aparentemente benigna, adjacente, de uma próstata (designada neste documento ROI benigna), tal como em uma ou mais seções do tecido de uma próstata, são identificadas e testadas de acordo com o método. Em uma modalidade, o método compreende contatar uma amostra de células da próstata do paciente com um conjunto de sondas marcadas de modo detectável que compreende uma sonda específica para um lócus para MYC, uma sonda específica para um lócus para o homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), uma sonda centromérica para o cromossomo 8, e uma sonda centromérica para o cromossomo 7, sob condições de hibridização, e determinar a presença de anormalidades cromossômicas, onde uma % de ganho de MYC (a % de ganho é a % de células com MYC > 2 sinais) de mais do que 35 (com uma faixa de 2 a 50), uma % de perda de PTEN (a % de perda é a % de células com < 2 sinais) de mais do que 33 (com uma faixa de 29 a 33), uma % de ganho de cromossomo 8 (a % de ganho é a % de células com > 2 sinais) de mais do que 34 (com uma faixa de 32 a 34), e uma % de anormal para o cromossomo 7 (a % de anormal é a % de células com > 2 ou < 2 sinais) maior do que 28 (com uma faixa de 24 a 29), em uma amostra de células da próstata de uma região de interesse (ROI) de tumor ou uma ROI benigna da próstata do paciente, indicam que o paciente tem câncer da próstata.

6/79 [009]Em outra modalidade, o método compreende contatar uma amostra de células da próstata do paciente com um conjunto de sondas marcadas de modo detectável que compreende uma sonda específica para um lócus para MYC, uma sonda específica para um lócus para lipoproteína lipase (LPL), uma sonda específica para um lócus para PTEN, e uma sonda centromérica para o cromossomo 8, sob condições de hibridização, e determinar a presença de anormalidades cromossômicas. Uma % de ganho de MYC/LPL (a % de ganho é a % de células com MYC/LPL > 1) de mais do que 14 (com uma faixa de 12 a 22), uma % de anormal para o cromossomo 8 (a % de anormal é a % de células com > 2 ou < 2 sinais) de mais do que 34 (com uma faixa de 26 a 40), uma % de perda de PTEN (a % de perda é a % de células com < 2 sinais) de mais do que 44 (com uma faixa de 22 a 54), ou uma % de ganho de MYC/cromossomo 8 (a % de ganho é a % de células com MYC/cromossomo 8 > 1) maior do que 16 (com uma faixa de 10 a 18), em uma amostra de células da próstata de uma região de interesse (ROI) de tumor da próstata do paciente, indica que o paciente tem câncer da próstata. Os cortes de % de Ganho de MYC/LPL ou % de Anorm. para CEP8 ou % de Perda de PTEN ou % de Ganho de MYC/CEP8 combinadas para os parâmetros de FISH da ROI foram escolhidos na região de desempenho-alvo: o quadrante entre 97,1% de sensibilidade e 96,2% de especificidade. Uma % de ganho de MYC/LPL de mais do que 18 (com uma faixa de 12 a 19), uma % de anormal para o cromossomo 8 de mais do que 32 (com uma faixa de 25 a 34), uma % de perda de PTEN de mais do que 26 (com uma faixa de 22 a 28), ou uma % de ganho de MYC/cromossomo 8 maior do que 16 (com uma faixa de 9 a 18), em uma amostra de células da próstata de uma ROI benigna da próstata do paciente, indica que o paciente tem câncer da próstata. Os cortes de % de Ganho de MYC/LPL ou % de Anorm. para CEP8 ou % de Perda de PTEN ou % de Ganho de MYC/CEP8 combinadas para os parâmetros de FISH da ROI benigna foram escolhidos na região de desempenho-alvo: o quadrante entre 80,8% de

7/79 sensibilidade e 82,4% de especificidade.

[010]A amostra de células da próstata pode ser uma seção da próstata do paciente. A seção pode ser fixada em formalina e embutida em parafina e colocada sobre uma lâmina de microscópio. Antes de determinar a presença de anormalidades cromossômicas, o método pode adicionalmente compreender avaliar morfologicamente a seção e identificar pelo menos uma ROI de tumor, pelo menos uma ROI benigna, ou pelo menos uma ROI de tumor e pelo menos uma ROI benigna. Alternativamente, antes de determinar a presença de anormalidades cromossômicas, o método pode adicionalmente compreender avaliar a seção por imunofluorescência e identificar pelo menos uma ROI de tumor. Avaliar a seção por imunofluorescência pode compreender contatar a seção com um anticorpo anti-αmetilacil-CoA racemase (AMACR) marcado de modo detectável e detectar a superexpressão da AMACR, onde a superexpressão da AMACR em uma região da seção indica a presença de uma ROI de tumor. Antes de avaliar a seção por imunofluorescência, o método pode adicionalmente compreender tratar a seção com recuperação de epítopo induzida por calor.

[011]Proporciona-se também um conjunto de sondas. Em uma modalidade, o conjunto de sondas compreende uma sonda específica para um lócus para MYC, uma sonda específica para um lócus para PTEN, uma sonda centromérica para o cromossomo 8, e uma sonda centromérica para o cromossomo 7, onde o conjunto de sondas opcional e adicionalmente compreende um anticorpo anti-AMACR, o qual pode ser marcado de modo detectável. Em outra modalidade, o conjunto de sondas compreende uma sonda específica para um lócus para MYC, uma sonda específica para um lócus para LPL, uma sonda específica para um lócus para PTEN, e uma sonda centromérica para o cromossomo 8. O conjunto de sondas opcional e adicionalmente compreende um anticorpo anti-AMACR, o qual pode ser marcado de modo detectável.

8/79 [012]Proporciona-se também um kit. Em uma modalidade, o kit compreende (a) um conjunto de sondas que capacita a diagnose do câncer da próstata em um paciente, onde o conjunto de sondas compreende uma sonda específica para um lócus para MYC, uma sonda específica para um lócus para PTEN, uma sonda centromérica para o cromossomo 8, e uma sonda centromérica para o cromossomo 7, e (b) instruções para diagnosticar o câncer da próstata em um paciente, onde as instruções compreendem determinar, em uma amostra de células da próstata obtidas do paciente, a presença de anormalidades cromossômicas. Uma % de ganho de MYC (a % de ganho é a % de células com MYC > 2 sinais) de mais do que 35 (com uma faixa de 2 a 50), uma % de perda de PTEN (a % de perda é a % de células com < 2 sinais) de mais do que 33 (com uma faixa de 29 a 33), uma % de ganho de cromossomo 8 (a % de ganho é a % de células com > 2 sinais) de mais do que 34 (com uma faixa de 32 a 34), e uma % de anormal para o cromossomo 7 (a % de anormal é a % de células com > 2 ou < 2 sinais) maior do que 28 (com uma faixa de 24 a 29), em uma amostra de células da próstata de uma região de interesse (ROI) de tumor ou uma ROI benigna da próstata do paciente, indicam que o paciente tem câncer da próstata. Em outra modalidade, o kit compreende (a) um conjunto de sondas que capacita a diagnose de câncer da próstata em um paciente, onde o conjunto de sondas compreende uma sonda específica para um lócus para MYC, uma sonda específica para um lócus para LPL, uma sonda específica para um lócus para PTEN, e uma sonda centromérica para o cromossomo 8 e (b) instruções para diagnosticar o câncer da próstata em um paciente, onde as instruções compreendem determinar, em uma amostra de células da próstata obtidas do paciente, a presença de anormalidades cromossômicas. Uma % de ganho de MYC/LPL (a % de ganho é a % de células com MYC/LPL > 1) de mais do que 14 (com uma faixa de 12 a 22), uma % de anormal para o cromossomo 8 (a % de anormal é a % de células com > 2 ou < 2 sinais) de mais do que 34 (com uma faixa de 26 a 40), uma % de perda de

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PTEN (a % de perda é a % de células com < 2 sinais) de mais do que 44 (com uma faixa de 22 a 54), ou uma % de ganho de MYC/cromossomo 8 (a % de ganho é a % de células com MYC/cromossomo 8 > 1) maior do que 16 (com uma faixa de 10 a 18), em uma amostra de células da próstata de uma região de interesse (ROI) de tumor da próstata do paciente, indica que o paciente tem câncer da próstata. Uma % de ganho de MYC/LPL de mais do que 18 (com uma faixa de 12 a 19), uma % de anormal para o cromossomo 8 de mais do que 32 (com uma faixa de 25 a 34), uma % de perda de PTEN de mais do que 26 (com uma faixa de 22 a 28), ou uma % de ganho de MYC/cromossomo 8 maior do que 16 (com uma faixa de 9 a 18), em uma amostra de células da próstata de uma ROI benigna da próstata do paciente, indica que o paciente tem câncer da próstata. O kit pode adicionalmente compreender instruções para avaliar morfologicamente uma seção de uma próstata de um paciente e identificar pelo menos uma ROI de tumor, pelo menos uma ROI benigna, ou pelo menos uma ROI de tumor e pelo menos uma ROI benigna, antes de determinar a presença de anormalidades cromossômicas. Alternativamente, o kit pode adicionalmente compreender instruções para avaliar uma seção de uma próstata de um paciente por imunofluorescência e identificar a presença de uma ROI de tumor, antes de determinar a presença de anormalidades cromossômicas, em cujo caso o kit pode adicionalmente compreender um anticorpo anti-AMACR, o qual pode ser marcado de modo detectável, e as instruções para avaliar uma seção de uma próstata de um paciente por imunofluorescência podem adicionalmente compreender contatar a seção com um anticorpo anti-AMACR marcado de modo detectável e detectar a superexpressão da AMACR, onde a superexpressão da AMACR em uma região da seção indica a presença de uma ROI de tumor. As instruções podem adicionalmente compreender o tratamento da seção com recuperação de epítopo induzida por calor, antes de avaliar a seção de uma próstata de um paciente por imunofluorescência.

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BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [013]A Fig. 1A é um gráfico da % de perda e da % de ganho versus lócus da sonda enumeradora de cromossomo (CEP) 8 na hiperplasia prostática benigna (BPH) e em amostras de câncer (região de interesse de tumor, ROI de tumor).

[014]A Fig. 1b é um gráfico da % de perda e da % de ganho versus lócus para a sonda enumeradora de cromossomo (CEP) 8 na BPH e em amostras de câncer (ROI benigna).

[015]A Fig. 2a é um gráfico da sensibilidade vs. especificidade-1 (curva característica de operação do receptor (ROC)) para a ROI de tumor, onde () é a porcentagem de anormal para a sonda enumeradora de cromossomo 8 (% de Anorm. para CEP 8), (▲) é a porcentagem de ganho de MYC/lipoproteína lipase (LPL) (% de Ganho de MYC/LPL), (·) é a porcentagem de ganho de MYC/CEP 8 (% de Ganho de MYC/CEP 8), e (□) é a porcentagem de perda de homólogo de fosfatase e tensina (PTEN) (% de Perda de PTEN), e (o) é o corte de combinação de CEP 8, MYC, LPL, e PTEN (corte de 4 sondas ).

[016]A Fig. 2b é um gráfico da sensibilidade vs. especificidade-1 (curva ROC) para a ROI benigna, onde ()é a porcentagem de anormal para a sonda enumeradora de cromossomo 8 (% de Anorm. para CEP 8), (A)é a porcentagem de ganho de MYC/lipoproteína lipase (LPL) (% de Ganho de MYC/LPL), (·) é a porcentagem de ganho de MYC/CEP 8 (% de Ganho de MYC/CEP8), e (□) é a porcentagem de perda de homólogo de fosfatase e tensina (PTEN) (% de Perda de PTEN), e (o) é o corte de combinação de CEP 8, MYC, LPL, e PTEN (corte de 4 sondas ).

[017]A Fig. 3 é uma tabela dos cortes diagnósticos para a % de Anorm. para CEP 8, a % de Ganho de MYC/LPL, a % de Ganho de MYC/CEP8, e a % de Perda de PTEN.

[018]A Fig. 4 é um gráfico da sensibilidade vs. especificidade-1 (curva ROC) para

11/79 os parâmetros individuais da FISH (% de Perda de PTEN, % de Anorm. para Cep 7, % de Ganho de MYC, e % de Ganho de CEP 8) e a combinação de quatro sondas. Os dados foram calculados a partir da avaliação por FISH das 17 amostras de ROI benigna e 26 de BPH. O gráfico ROC para a combinação de quatro sondas é baseado nas 33 amostras de ROI de tumor e nas 26 de BPH. As AUC máximas das curvas ROC são mostradas na tabela.

[019]A Fig. 5 é uma tabela de cortes diagnósticos para a % de Perda de PTEN, a % de Anorm. para Cep 7, a % de Ganho de MYC, e a % de Ganho de CEP 8.

DESCRIÇÃO DETALHADA [020]A presente divulgação proporciona um conjunto de marcadores, bem como um método de uso e um kit compreendendo o conjunto de marcadores, para a diagnose, a prognose, e a avaliação do tratamento terapêutico ou profilático de câncer, em particular, o câncer da próstata. Os termos a seguir são relevantes para a presente divulgação:

[021]Cerca de refere-se a aproximadamente uma variação de +/-10% a partir do valor apresentado. É para ser entendido que tal variação está sempre incluída em qualquer valor dado proporcionado neste documento, quer seja feita referência específica a ela, quer não seja.

[022]O biomarcador, como definido pelo National Institutes of Health, é uma característica que é objetivamente medida e avaliada como um indicador de processos biológicos normais, processos patogênicos, ou respostas farmacológicas a uma intervenção terapêutica.

[023]A sonda de enumeração de cromossomo (CEP) ou a sonda centrômica é qualquer sonda que possibilite que o número de cromossomos específicos em uma célula seja enumerado. Uma sonda de enumeração de cromossomo tipicamente reconhece e se liga a uma região próxima ao (referida como pericentromérica), ou no, centrômero de um cromossomo específico, tipicamente uma sequência de DNA

12/79 repetitiva (p.ex., DNA alfa satélite). O centrômero de um cromossomo é tipicamente considerado representar aquele cromossomo, visto que o centrômero é requerido para a segregação exata durante a divisão da célula. A remoção ou a amplificação de uma região cromossômica particular pode ser diferenciada da perda ou do ganho do cromossomo inteiro (aneusomia), dentro do qual normalmente reside, comparando-se o número de sinais correspondendo ao lócus particular (número de cópias) com o número de sinais correspondendo ao centrômero. Um método para fazer esta comparação é dividir o número de sinais representando o lócus pelo número de sinais representando o centrômero. As razões de menos do que um indicam perda ou remoção relativa do lócus, e as razões maiores do que um indicam ganho ou amplificação relativa do lócus. Similarmente, a comparação pode ser feita entre dois lócus diferentes sobre o mesmo cromossomo, por exemplo, sobre dois braços diferentes do cromossomo, para indicar ganhos ou perdas desequilibradas dentro do cromossomo. Em vez de uma sonda centromérica para um cromossomo, alguém de habilidade na técnica reconhecerá que uma sonda do braço cromossômico pode alternadamente ser usada para igualar a perda ou o ganho cromossômico. Entretanto, tais sondas não são tão acuradas na enumeração dos cromossomos, visto que a perda de sinais para tais sondas pode nem sempre indicar uma perda do cromossomo inteiro. Os exemplos de sondas de enumeração de cromossomos incluem as sondas CEP® comercialmente disponíveis da Abbott Molecular, Inc., Des Plaines, IL (anteriormente Vysis, Inc., Downers Grove, IL).

[024]O número de cópias é uma medição do DNA, quer seja de um único lócus, quer seja de um ou mais lócus, quer seja um genoma inteiro. Um número de cópias de dois é tipo selvagem em um ser humano (por causa da diploidia, exceto para os cromossomos sexuais). Um número de cópias de exceto dois em um ser humano (exceto pelos cromossomos sexuais) desvia-se do tipo selvagem. Tais desvios incluem as amplificações, i.e., os aumentos nos números de cópias, e as

13/79 remoções, i.e., as diminuições nos números de cópias e até a ausência de números de cópias.

[025]Marcado(a), marcado(a) com uma marca detectável e marcado(a) de modo detectável são usados de modo intercambiável neste documento para indicar que uma entidade (p.ex., uma sonda) pode ser detectada. A marca e a marca detectável significam uma porção unida a uma entidade para tornar a entidade detectável, tal como uma porção unida a uma sonda para tornar a sonda detectável ao se ligar a uma sequência-alvo. A porção, ela própria, pode não ser detectável, porém pode se tornar detectável com a reação com outra porção mais. Pretende-se que o uso do termo marcado(a) de modo detectável inclua tais marcações. A marca detectável pode ser selecionada de modo tal que a marca gere um sinal, o qual pode ser medido e cuja intensidade é proporcional à quantidade de entidade ligada. Uma ampla variedade de sistemas para marcar e/ou detectar moléculas, tais como os ácidos nucléicos, p.ex., as sondas, é bastante conhecida. Os ácidos nucléicos marcados podem ser preparados incorporando ou conjugando uma marca que é direta ou indiretamente detectável por meio espectroscópico, fotoquímico, bioquímico, imunoquímico, elétrico, óptico, químico ou outro meio. As marcas detectáveis adequadas incluem os radioisótopos, os fluoróforos, os cromóforos, os agentes quimioluminescentes, as micropartículas, as enzimas, as partículas magnéticas, as partículas densas de elétrons, as marcas de massa, as marcas de spin, os haptenos, e similares. Os fluoróforos e os agentes quimioluminescentes são preferidos neste documento.

[026]A sonda específica para um lócus e o identificador específico para um lócus (LSI) podem ser usados de modo intercambiável neste documento para referirem-se a uma sonda que se liga seletivamente a um lócus específico, em uma região sobre um cromossomo, p.ex., um lócus que tenha sido determinado sofrer ganho/perda na metástase. Uma sonda pode alvejar regiões de codificação ou de

14/79 não codificação, ou ambas, incluindo exons, introns, e/ou sequências reguladoras, tais como as sequências promotoras e similares.

[027]A amostra de ácido nucléico refere-se a uma amostra compreendendo ácido nucléico em uma forma adequada para a hibridização com uma sonda, tal como uma amostra compreendendo núcleos ou ácidos nucléicos isolados ou purificados de tais núcleos. A amostra de ácido nucléico pode compreender DNA genômico total ou parcial (p.ex., cromossomo(s) particular(es)), mRNA total ou parcial (p.ex., cromossomo(s) ou gene(s) particular(es)), ou sequência(s) selecionada(s). Os cromossomos condensados (tais como estão presentes na interfase ou na metáfase) são adequados para uso como alvos na hibridização in situ, tal como a FISH.

[028]O corte predeterminado e o nível predeterminado referem-se, em geral, a um valor de corte que é usado para avaliar os resultados da eficácia diagnóstica/prognóstica/terapêutica por comparação dos resultados do ensaio contra o corte/nível predeterminado, onde o corte/nível predeterminado já tenha estado ligado ou associado com diversos parâmetros clínicos (p.ex., gravidade da doença, progressão/não progressão/melhora, etc.).

[029]A sonda, no contexto da presente divulgação, é um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo que pode hibridizar seletivamente com pelo menos uma parte de uma sequência-alvo, sob condições que permitam ou promovam a hibridização seletiva. Em geral, uma sonda pode ser complementar à fita de codificação ou com sentido (+) de DNA ou complementar à fita de não codificação ou sem sentido (-) de DNA (algumas vezes referida como complementar reversa). As sondas podem variar significativamente no comprimento. Um comprimento de cerca de 10 a cerca de 100 nucleotídeos, tal como cerca de 15 a cerca de 75 nucleotídeos, p.ex., cerca de 15 a cerca de 50 nucleotídeos, pode ser preferido em algumas aplicações, enquanto um comprimento de cerca de 50-1x10⁵ nucleotídeos, pode ser preferido

15/79 para as sondas cromossômicas e um comprimento de cerca de 25.000 a cerca de 800.000 nucleotídeos pode ser preferido para as sondas específicas para o lócus.

[030]O câncer da próstata inclui todos os tipos de câncer da próstata, tais como adenocarcinoma, carcinoma de pequenas células, carcinoma de células escamosas, sarcoma, e carcinoma de células transicionais. A maior parte do câncer da próstata (em torno de 95%) é adenocarcinoma. O câncer da próstata é distinguido da neoplasia intraepitelial prostática (PIN, que é adicionalmente distinguida como grau baixo ou grau alto), que é uma precursora para o câncer da próstata. O carcinoma de pequenas células e o carcinoma de células escamosas tendem a ser de natureza muito agressiva e não resultam em um aumento no antígeno específico para próstata (PSA). O carcinoma de células transicionais raramente se desenvolve na próstata, porém deriva-se de tumores primários na bexiga e/ou na uretra.

[031]Hibridizar seletivamente com (bem como hibridização seletiva, hibridizar especificamente com e hibridização específica), no contexto da presente divulgação, refere-se à ligação, duplexação ou hibridização de uma molécula de ácido nucléico preferencialmente com uma sequência de nucleotídeos particular, sob condições severas. O termo condições severas refere-se a uma condição sob a qual uma sonda hibridizará preferencialmente com a sua sequência-alvo e, em menor proporção, ou de modo algum, com outras sequências que não sejam alvos. Uma hibridização severa e as condições severas de lavagem da hibridização, no contexto da hibridização de ácidos nucléicos (p.ex., como no arranjo, na hibridização Southern, na hibridização Northern, ou na FISH), são dependentes da sequência e diferem sob condições diferentes. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado, p.ex., em Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry e Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Cap. 2, Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, Elsevier, NY (1993) (Tijssen). Em geral, as condições de hibridização e lavagem altamente

16/79 severas são selecionadas para serem cerca de 5 °C m enores do que o ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica, em uma concentração iônica e pH definidos. O Tm é a temperatura (sob concentração iônica e pH definidos) na qual 50% da sequência-alvo hibridizam com uma sonda perfeitamente correlacionada. As condições muito severas são selecionadas para serem iguais ao Tm para uma sonda particular. Um exemplo de condições severas de hibridização para a hibridização de ácidos nucléicos complementares, que tenham mais do que 100 resíduos complementares, sobre um arranjo ou sobre um filtro em um Southern ou Northern blot, é 42 °C, usando soluções de hibridização padrões (ver, p.ex., Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^a ed., Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY (2001)).

[032]A sequência-alvo, a região-alvo e o alvo de ácido nucléico referem-se a uma sequência de nucleotídeos que reside em uma posição cromossômica específica, cuja perda e/ou ganho, por exemplo, está sendo determinado.

[033]A terminologia usada neste documento é para o propósito de descrever modalidades particulares somente e não é, de outro modo, pretendida para ser limitativa.

Métodos de Detectar, Diagnosticar, Prognosticar, e Monitorar a Eficácia do Tratamento Terapêutico/Profilático do Câncer da Próstata [034]Proporciona-se um método de detectar o câncer da próstata em um paciente. Em uma modalidade, o método compreende contatar uma amostra de células da próstata do paciente com um conjunto de sondas marcadas de modo detectável que compreende uma sonda específica para um lócus para MYC, uma sonda específica para um lócus para o homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), uma sonda centromérica para o cromossomo 8, e uma sonda centromérica para o cromossomo 7, sob condições de hibridização, e determinar a presença de anormalidades cromossômicas, onde uma % de ganho de MYC (a % de ganho é a

17/79 % de células com MYC > 2 sinais) de mais do que 35 (com uma faixa de 2 a 50), uma % de perda de PTEN (a % de perda é a % de células com < 2 sinais) de mais do que 33 (com uma faixa de 29 a 33), uma % de ganho de cromossomo 8 (a % de ganho é a % de células com > 2 sinais) de mais do que 34 (com uma faixa de 32 a 34), e uma % de anormal para o cromossomo 7 (a % de anormal é a % de células com > 2 ou < 2 sinais) maior do que 28 (com uma faixa de 24 a 29), em uma amostra de células da próstata de uma região de interesse (ROI) de tumor ou uma ROI benigna da próstata do paciente, indicam que o paciente tem câncer da próstata. Em outra modalidade, o método compreende contatar uma amostra de células da próstata, tal como uma seção do tecido ou células obtidas dela, do paciente com um conjunto de sondas marcadas de modo detectável que compreende uma sonda específica para um lócus para MYC, uma sonda específica para um lócus para lipoproteína lipase (lócus de LPL), uma sonda específica para um lócus para o lócus de PTEN, e uma sonda centromérica para o cromossomo 8, sob condições de hibridização, e determinar a presença de anormalidades cromossômicas. Uma % de ganho de MYC/LPL (a % de ganho é a % de células com MYC/LPL > 1) de mais do que 14 (com uma faixa de 12 a 22), uma % de anormal para o cromossomo 8 (a % de anormal é a % de células com > 2 ou < 2 sinais) de mais do que 34 (com uma faixa de 26 a 40), uma % de perda de PTEN (a % de perda é a % de células com < 2 sinais) de mais do que 44 (com uma faixa de 22 a 54), ou uma % de ganho de MYC/cromossomo 8 (a % de ganho é a % de células com MYC/cromossomo 8 > 1) maior do que 16 (com uma faixa de 10 a 18), em uma amostra de células da próstata de uma ROI de tumor da próstata do paciente, indica que o paciente tem câncer da próstata. Uma % de ganho de MYC/LPL de mais do que 18 (com uma faixa de 12 a 19), uma % de anormal para o cromossomo 8 de mais do que 32 (com uma faixa de 25 a 34), uma % de perda de PTEN de mais do que 26 (com uma faixa de 22 a 28), ou uma % de ganho de MYC/cromossomo 8

18/79 maior do que 16 (com uma faixa de 9 a 18), em uma amostra de células da próstata de uma ROI benigna da próstata do paciente, indica que o paciente tem câncer da próstata. Os cortes de % de Ganho de MYC/LPL ou % de Anorm. para CEP8 ou % de Perda de PTEN ou % de Ganho de MYC/CEP8 combinadas para os parâmetros de FISH da ROI de tumor foram escolhidos na região de desempenho-alvo: o quadrante entre 97,1% de sensibilidade e 96,2% de especificidade. Os cortes de % de Ganho de MYC/LPL ou % de Anorm. para CEP8 ou % de Perda de PTEN ou % de Ganho de MYC/CEP8 combinadas para os parâmetros de FISH da ROI benigna foram escolhidos na região de desempenho-alvo: o quadrante entre 80,8% de sensibilidade e 82,4% de especificidade.

[035]O conjunto de sondas pode adicionalmente compreender uma ou mais de uma sonda específica para um lócus para as fusões p16 (9p21), TMPRSS2- ERG ou ETV1 (lócus de 21q22;7p21), uma sonda centromérica para o cromossomo 3, uma sonda centromérica para o cromossomo 7, uma sonda centromérica para o cromossomo 10, e uma sonda centromérica para o cromossomo 17. O conjunto de sondas marcadas de modo detectável pode adicionalmente compreender uma ou mais de uma sonda específica para um lócus para o inibidor da cinase dependente de ciclina p27Kip1 (4q43), uma sonda específica para um lócus para a cinase dependente de ciclina 2 (CDK2; 12q13), uma sonda específica para um lócus para a ciclina E (CCNE1;19q12 e CCNE2; 8q22), uma sonda específica para um lócus para o retinoblastoma 1 (Rb1; 13q14), uma sonda específica para um lócus para a homeossequência de NK3 1 (NKX3.1; 8p21.2), uma sonda específica para um lócus para o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR; 7p11), uma sonda específica para um lócus para a fosfoinositida-3-cinase (PI3K; 3q26), uma sonda específica para um lócus para a cinase AKT1 (Akt1; 14q32), uma sonda específica para um lócus para FKHR (FOXO1; 13q14.11), uma sonda específica para um lócus para o homólogo da proteína de ligação p53 (MDM2; 12q14.3-12q15), uma sonda

19/79 específica para um lócus para p53 (17p13.1), uma sonda específica para um lócus para o homólogo do oncogene viral de sarcoma de rato Kirsten v-Ki-ras2 (KRAS; 12p12.1), uma sonda específica para um lócus para o homólogo de oncogene viral de sarcoma murino v-raf B1 (BRAF; 7q34), uma sonda específica para um lócus para ciclina D1 (CCND1; 11q13), uma sonda específica para um lócus para CLL/linfoma 2 de células B (BCL2; 18q21.3/18q21.33), e uma sonda específica para um lócus para o receptor de androgênio (AR; Xq12).

[036]Proporciona-se um método de pré-tratamento e hibridização de amostras histológicas para o câncer da próstata. As lâminas com as amostras histológicas FFPE (Fixadas em Formalina, Embutidas em Parafina) (seções) foram cozidas a 56C, por 2-24 h, então foram pré-tratadas duas a três vezes em Hemo-De (Scientific Safety Solvents) ou Xilina, por 5 a 10 minutos cada, na temperatura ambiente, seguido por dois enxágues de 1 minuto em 100% de etanol, na temperatura ambiente, incubação em ácido fórmico a 45%/peróxido de hidrogênio a 0,3%, por 15 minutos, na temperatura ambiente, e então se enxaguou em água deionizada por 3 - 10 minutos. As lâminas foram então incubadas na solução de prétratamento (1XSSC, PH6,3) a 80 +/- 5°C, por 35 - 50 minutos, enxaguadas por 3 minutos em água deionizada, incubadas 22 +/- 5 minutos em 0,15% de pepsina em solução de HCl a 0,1 N, a 37°C, e enxaguadas novamente por 3 minutos em água deionizada. As lâminas foram desidratadas por 1 minuto cada em 70%, 85%, e 100% de etanol e então secadas ao ar. Dez microlitros de cada mistura de hibridização de sondas respectiva (tampão LSI^®, DNA de bloqueio, sondas marcadas) foram adicionados às amostras, uma lamínula aplicada, e vedada com cola de borracha. As lâminas foram desnaturadas em conjunto por 5 minutos, a 73 +/- 2°C, e hibridizadas por 10-24 horas, a 37°C, so bre um ThermoBrite (Vysis/Abbott Molecular, Inc.). Após a hibridização, as lamínulas foram removidas. A amostra pôde ser colocada na solução de lavagem consistindo em 0,3x - 2x SSC e 0,3% -0.5% de

20/79

NP-40, e a temperatura da amostra pode ser elevada para cerca de 73°C, por cerca de 2-5 minutos. Então o suporte carregando a amostra pode ser contratingido com um corante de ligação ao DNA nuclear, tal como o 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), em solução, ou ao secar a amostra no escuro. Neste caso, a amostra é contratingida com cerca de 10 pL de DAPI, e uma nova lamínula é colocada sobre a amostra. A amostra pode então ser vista ou armazenada, p.ex., em torno de -20°C.

[037]Proporciona-se um método de IF-FISH em lâmina FFPE da próstata. Para o ensaio de FISH e Imunofluorescência (IF) simultâneas sobre as mesmas lâminas de tecido de tumor sólido da próstata FFPE, um protocolo de pré-tratamento da amostra/recuperação do antígeno foi desenvolvido e otimizado para melhores resultados sobre o tecido FFPE para IF-FISH.

[038]A primeira etapa deste procedimento é a recuperação do antígeno. Cozer as lâminas FFPE de câncer da próstata a 56°C, por duas horas até da noite para o dia. Desparafinizar por duas imersões em Hemo-De por 10 minutos cada. Incubar duas vezes em 100% de etanol por dois minutos cada. Hidratar colocando em 85%, 70%, 50%, e 30% de etanol por dois minutos cada. Afundar em água de grau molecular da Milli-Q por cinco minutos. Pré-aquecer o banho-maria com o vaso Coplin contendo tampão de citrato de sódio (Tampão de Citrato de Sódio: citrato de sódio a 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6,0) até a temperatura atingir 96 +/- 4 C. Incubar por 20 60 minutos. Esfriar na temperatura ambiente por 20-40 minutos sobre a bancada. Lavar as lâminas por cinco minutos em água da Milli-Q. Enxaguar uma vez por cinco minutos em solução salina tamponada com fosfato (PBS).

[039]A segunda etapa é a imunofluorescência (IF) com o anticorpo para AMACR e o Ensaio de Amplificação do Sinal de Tiramida (34). Usar o kit de Ensaio de Solução de Tiramida (TSA) e a seguir o kit de TSA (amplificação do sinal de tiramida) Alexa Fluor 488 número 2 (Invitrogen, Molecular Probes), seguindo as instruções do fabricante. A atividade da peroxidase endógena é bloqueada por

21/79 incubação em 3% de H2O2 por 30 minutos, na temperatura ambiente. Adicionar o reagente de bloqueio (100 pL/lâmina), com incubação, em uma caixa umidificada, por 30 minutos, na temperatura ambiente. Adicionar 100 uL de anticorpo de coelho para AMACR diluído (diluído em 1% de reagente de bloqueio a 1:100), com incubação, por uma hora, na temperatura ambiente. Lavar as lâminas três vezes em PBS/0,1% de Tween 20, por cinco minutos cada. Diluir a solução de conjugado de HRP de estoque a 1:100 em 1% de solução de bloqueio. Um volume de 100 pL desta solução de trabalho é suficiente para cobrir uma lamínula de 22 x 22 mm padrão. Incubar por 30 minutos, na temperatura ambiente. Lavar três vezes em PBS/0,1% de Tween 20 por cinco minutos cada. Lavar uma vez em PBS. Adicionar 100 pL de solução de tiramida por lâmina, seguido por incubação por 10 minutos, na temperatura ambiente, no escuro. Lavar as lâminas em PBS por cinco minutos. Lavar as lâminas por cinco minutos em água da Milli-Q. Seguir para a FISH.

[040]A terceira etapa é o ensaio de FISH. Desidratar as lâminas em álcool (70%, 85% e 100%, 1 min cada), e deixar secar completamente ao ar. Adicionar 10 pL de solução de sonda a cada lâmina, e vedar a lamínula sobre a lâmina com cola de borracha. Desnaturar em conjunto a sonda e o DNA-alvo a 73°C, por cinco minutos, seguido por hibridização durante a noite, a 37°C. A amostra pode ser colocada na solução de lavagem consistindo em 0,3x - 2x SSC e 0,3% - 0,5% de NP-40, e a temperatura da amostra pode ser elevada para cerca de 73°C, por cerca de 2-5 minutos. Então o suporte carregando a amostra pode ser contratingido com um corante de ligação ao DNA nuclear, tal como o 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), em solução, ou ao secar a amostra no escuro. Neste caso, a amostra é contratingida com cerca de 10 pL de DAPI, e uma nova lamínula é colocada sobre a amostra. A amostra pode então ser vista ou armazenada, p.ex., em torno de -20C.

[041]Com relação a todos os métodos acima mencionados, a natureza/o tamanho da sonda dependerá, pelo menos em parte, do método usado para determinar um

22/79 parâmetro particular, p.ex., número de cópias, razão do número de cópias, ou porcentagem de ganho de um gene de interesse. Quando um método diagnóstico/prognóstico acima mencionado for realizado por hibridização in situ, tal como a FISH, por exemplo, a sonda pode ser relativamente grande. Quando um método diagnóstico/prognóstico acima mencionado for realizado por outro método, a sonda pode ser menor, até substancialmente menor, do que a sonda usada para a hibridização in situ, tal como a FISH, em cujo caso a sonda preferivelmente hibridiza com uma sequência dentro do gene de interesse.

[042]Em vista do acima mencionado, uma sonda para detectar um parâmetro envolvendo MYC, por exemplo, tal como o número de cópias de MYC, uma razão do número de cópias envolvendo MYC, ou a porcentagem de ganho de MYC, por hibridização in situ, tal como a FISH, preferivelmente hibridiza com a região 8q24 do cromossomo 8, que compreende o gene MYC. A sonda também pode hibridizar com uma região adjacente localizada sobre o lado centromérico de 8q24, uma região adjacente localizada sobre o lado telomérico de 8q24, ou ambas. Uma sonda preferida cobre aproximadamente 820 kb, tal como 821 kb, de 8q24 e está concentrada sobre o gene MYC. Uma sonda para detectar um parâmetro envolvendo MYC por outro método pode ser menor, até substancialmente menor, do que a sonda usada para a hibridização in situ, tal como a FISH, em cujo caso a sonda preferivelmente hibridiza com uma sequência dentro do gene MYC (a informação sobre a sequência está disponível online a partir de fontes tais como GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) e GeneCards® (www.genecards.org)). O MYC é usado neste documento para referir-se a todas e quaisquer sondas que possam ser usadas para determinar um parâmetro que envolva MYC, quer seja o número de cópias, quer seja a razão do número de cópias, quer seja a porcentagem de ganho, e similar, independente do método particular usado para determinar o parâmetro.

23/79 [043]Como o MYC, a LPL é usada neste documento para referir-se a todas e quaisquer sondas que possam ser usadas para determinar um parâmetro que envolva a LPL, quer seja o número de cópias, quer seja a razão do número de cópias, quer seja a porcentagem de ganho, e similares, independente do método particular usado para determinar o parâmetro. A LPL inclui uma sonda que preferivelmente hibridiza com a região p22 do cromossomo 8, que compreende o gene LPL. A sonda LPL também pode hibridizar com uma região adjacente localizada sobre o lado centromérico de 8p22, uma região adjacente localizada sobre o lado telomérico de 8p22, ou ambas. Uma sonda LPL preferida cobre aproximadamente 170 kb de 8p22 e está concentrada sobre o gene LPL. O PTEN é usado neste documento para referir-se a todas e quaisquer sondas que possam ser usadas para determinar um parâmetro que envolva o PTEN, quer seja o número de cópias, quer seja a razão do número de cópias, quer seja a porcentagem de ganho, e similares, independente do método particular usado para determinar o parâmetro. O PTEN inclui uma sonda que preferivelmente hibridiza com a região q23 do cromossomo 10, que compreende o gene PTEN. A sonda PTEN também pode hibridizar com uma região adjacente localizada sobre o lado centromérico de 10q23, uma região adjacente localizada sobre o lado telomérico de 10q23, ou ambas. Uma sonda PTEN preferida cobre aproximadamente 365-370 kb, tal como 368 kb de 10q23 e está concentrada sobre o gene PTEN. As regiões adjacentes do gene PTEN incluem os marcadores de STS D10S215 sobre o lado centromérico e RH93626 sobre o lado telomérico. O uso das designações das sondas como explicado acima se aplica aos métodos, às sondas e aos kits discutidos neste documento. O mesmo uso se aplica às outras designações das sondas apresentadas neste documento. Conforme indicado acima para o gene MYC, a informação sobre a sequência para os genes apresentados neste documento está disponível online a partir de fontes tais como GenBank (www.ncbi. nlm.nih.gov/

24/79 qenbank) e GeneCards® (www.genecards.org)).

[044]A amostra de células da próstata é uma seção da próstata do paciente. A amostra, tal como uma seção do tecido, pode ser obtida por ressecção cirúrgica, biopsia com agulha, ressecção transuretral da próstata (TURP), ou uma técnica similar. A seção pode ser fixada em formalina e embutida em parafina e colocada sobre uma lâmina de microscópio. Alternativamente, pode ser usada uma seção conservada por outros meios, tais como o congelamento.

[045]Antes de determinar a presença de anormalidades cromossômicas, o método pode adicionalmente compreender avaliar morfologicamente a seção e identificar pelo menos uma ROI de tumor, pelo menos uma ROI benigna, ou pelo menos uma ROI de tumor e pelo menos uma ROI benigna. Alternativamente, antes de determinar a presença de anormalidades cromossômicas, o método pode adicionalmente compreender avaliar a seção por imunofluorescência e identificar pelo menos uma ROI de tumor. A avaliação da seção por imunofluorescência pode compreender contatar a seção com um anticorpo anti-oc-metilacil-CoA racemase (AMACR) marcado de modo detectável e detectar a superexpressão da AMACR, onde a superexpressão da AMACR em uma região da seção indica a presença de uma ROI de tumor. Antes de avaliar a seção por imunofluorescência, o método pode adicionalmente compreender tratar a seção com recuperação de epítopo induzida por calor.

[046]O método acima mencionado pode ser realizado usando qualquer método de detecção adequado, conhecido na técnica. De preferência, o método acima mencionado é realizado usando hibridização ín situ, tal como a hibridização ín situ fluorescente (FISH). De preferência, cada sonda é marcada de modo detectável com uma marca diferente, tal como um fluoróforo diferente. Alternativamente, podem ser usadas a detecção de nucleotídeo radiomarcado (hibridização ín situ (ISH)), a detecção por hibridização cromomérica, e similar, como descritas neste documento.

25/79 [047]Quando os métodos acima mencionados forem realizados por hibridização in situ, em que cada sonda é marcada de modo detectável com uma marca diferente, tal como por FISH, em que cada sonda é marcada com um fluoróforo diferente, os métodos podem ser realizados sobre uma amostra de células da próstata, as quais são novas, tais como as células novas de uma biopsia da próstata (as células novas podem ser cultivadas por 1-3 dias e um bloqueador, tal como o Colcemid, pode ser adicionado à cultura para bloquear as células na metáfase, durante o que os cromossomos estão altamente condensados e podem ser visualizados), congeladas, ou fixadas (p.ex., fixadas em formalina e embutidas em parafina), tratadas (p.ex., com RNase e pepsina) para aumentar a acessibilidade do ácido nucléico alvo (p.ex., o DNA) e reduzir a ligação não específica, e então submetidas à hibridização com uma ou mais sondas, lavagem para remover quaisquer sondas não ligadas, e detecção das sondas hibridizadas. Por exemplo, uma suspensão de células pode ser aplicada como uma única camada sobre uma lâmina, e a densidade da célula pode ser medida por um microscópio de luz ou de contraste de fases. As células podem também ser obtidas a partir de outras fontes, tais como os fluidos corpóreos, p.ex., urina ou sémen, conservadas em fixadores, tais como metanol-ácido acético (reagente de Carnoy), e aplicadas a uma lâmina ou suporte similar para o exame e a análise microscópicos.

[048]Alternativamente, uma seção (aproximadamente 4-6 pm de espessura) de tecido, tal como uma seção de uma amostra fixada em formalina, embutida em parafina (FFPE), de um tecido da próstata, pode ser colocada sobre uma lâmina, tal como uma lâmina positivamente carregada SuperFrost Plus (disponível da ThermoShandon, Pittsburgh, PA), cozida a 56 °C, 2 h oras a 24 horas (durante a noite). Para o ensaio de FISH, as seções são então desparafinizadas por prétratamento duas a três vezes em Hemo-De (Scientific Safety Solvents, Keller, TX) ou Xilina, por 5 a 10 minutos cada, na temperatura ambiente, seguido por enxágue

26/79 duas vezes em 100% de etanol, na temperatura ambiente, por um minuto cada enxágue, incubação em 45% de ácido fórmico/0,3% de peróxido de hidrogênio, por 15 minutos, na temperatura ambiente, e então enxágue em água deionizada por 310 minutos. As lâminas são então incubadas na solução de pré-tratamento (1XSSC, PH6,3) a 80 +/- 5°C, por 35 - 50 minutos, enxaguadas por 3 minutos em água deionizada, incubadas 22 +/- 5 minutos em 0,15% de pepsina em solução de HCl a 0,1 N, a 37°C, e enxaguadas novamente por 3 minutos em água deionizada. As lâminas são então desidratadas por 1 minuto cada em 70%, 85%, e 100% de etanol e então secadas ao ar.

[049]Dez microlitros de cada mistura de hibridização de sondas respectiva (tampão LSI^®, DNA de bloqueio, e sondas marcadas) são adicionados às amostras, e as lamínulas são aplicadas e vedadas com cola de borracha. As lâminas são desnaturadas em conjunto por cinco minutos, a 73 +/- 2°C, e hibridizadas por 10-24 horas, a 37°C, sobre um ThermoBrite (Vysis/Abbott M olecular, Inc.). Após a hibridização, as lamínulas são removidas. A amostra é colocada na solução de lavagem consistindo em 0,3x - 2x SSC e 0,3% -0,5% de NP-40, e a temperatura da amostra é elevada para cerca de 73°C, por cerca de 2-5 minutos. Então o suporte carregando a amostra pode ser contratingido com um corante de ligação ao DNA nuclear, tal como o 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), em solução, ou ao secar a amostra no escuro. Neste caso, a amostra é contratingida com cerca de 10 pL de DAPI, e uma nova lamínula é colocada sobre a amostra. A amostra pode então ser vista ou armazenada, p.ex., em torno de -20°C.

[050]Neste aspecto, a recuperação de epítopo induzida por calor (HIER) pode ser efetuada, permitindo a imunofluorescência e a FISH simultâneas. Para o ensaio de FISH e Imunofluorescência (IF) simultâneas sobre as mesmas lâminas de tecido de tumor sólido da próstata FFPE, um protocolo de pré-tratamento da amostra/recuperação do antígeno foi desenvolvido e otimizado para melhores

27/79 resultados sobre o tecido FFPE para IF-FISH.

[051]A primeira etapa deste procedimento é a recuperação do antígeno. As lâminas FFPE de câncer da próstata são cozidas a 56°C, por duas horas até da noite para o dia. As lâminas são então desparafinizadas por duas imersões em Hemo-De, por 10 minutos cada. As lâminas são então incubadas em 100% de etanol duas vezes, por dois minutos cada vez. As lâminas são hidratadas colocando-se em 85%, 70%, 50%, 30% de etanol por 2 minutos cada, e uma imersão final por 5 minutos em água de grau molecular da Milli-Q. Um banho-maria é pré-aquecido com um vaso Coplin contendo tampão de citrato de sódio (citrato de sódio a 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6,0) até a temperatura atingir 96 +/- 4 °C. As lâminas são então incubadas por 20-60 minutos, e esfriadas na temperatura ambiente por 20-40 minutos, sobre a bancada. As lâminas são lavadas por cinco minutos em água da Milli-Q e enxaguadas uma vez por cinco minutos em PBS.

[052]A segunda etapa é a imunofluorescência (IF) com o anticorpo para AMACR e o Ensaio de Amplificação do Sinal de Tiramida. O kit de Ensaio de Solução de Tiramida (TSA) e o kit de TSA (amplificação do sinal de tiramida) Alexa Fluor 488 número 2 (Invitrogen, Molecular Probes) são usados, seguindo as instruções do fabricante. A atividade da peroxidase endógena é bloqueada por incubação em 3% de H2O2 por 30 minutos, na temperatura ambiente. O reagente de bloqueio (100 pL/lâmina) é adicionado, e as lâminas são incubadas em uma caixa umidificada, por 30 minutos, na temperatura ambiente. Cem microlitros de anticorpo de coelho para AMACR diluído (diluído em 1% de reagente de bloqueio a 1:100) são adicionados, e as lâminas são incubadas por 1 hora, na temperatura ambiente. As lâminas são lavadas três vezes, por cinco minutos cada, em PBS/0,1% de Tween 20. A solução de conjugado de HRP de estoque é diluída a 1:100 em 1% de solução de bloqueio. Um volume de 100 pL desta solução de trabalho é suficiente para cobrir uma lamínula de 22 x 22 mm padrão. As lâminas são incubadas na temperatura

28/79 ambiente, por 30 minutos, e então lavadas três vezes em PBS/0,1% de Tween 20, por cinco minutos cada, seguido por uma lavagem em PBS. A solução de tiramida (100 pL) é adicionada a cada lâmina, e as lâminas são incubadas na temperatura ambiente, por dez minutos, no escuro. As lâminas são lavadas por cinco minutos em PBS e então lavadas por cinco minutos em água da Milli-Q.

[053]A terceira etapa é o ensaio de FISH. As lâminas são desidratadas em álcool (70%, 85% e 100%, 1 min cada), e deixadas secar ao ar completamente. A solução de sonda (10 pL) é adicionada a cada lâmina, e uma lamínula é vedada sobre a lâmina com cola de borracha. A sonda e o DNA-alvo são desnaturados, a 73°C, por cinco minutos, seguido por hibridização durante a noite, a 37°C. A amostra pode então ser colocada em uma solução de lavagem consistindo em 0,3x-2x SSC e 0,3%-0,5% de NP-40, e a temperatura da amostra pode ser elevada para cerca de 73°C, por cerca de 2-5 minutos. Então o suporte carregando a amostra pode ser contratingido com um corante de ligação ao DNA nuclear, tal como o 4',6-diamidino2-fenilindol (DAPI), em solução, ou ao secar a amostra no escuro. Neste caso, a amostra é contratingida com cerca de 10 pL de DAPI, e uma nova lamínula é colocada sobre a amostra. A amostra pode então ser vista ou armazenada, p.ex., em torno de -20°C.

[054]Antes da detecção, as amostras de células podem ser opcionalmente préselecionadas com base em anormalidades citológicas aparentes. A pré-seleção identifica células suspeitas, com isso permitindo que o exame seja concentrado sobre estas células. A pré-seleção permite o exame mais rápido e aumenta a probabilidade que um resultado positivo não seja omitido. De preferência, as regiões de interesse sobre as lâminas de amostras da próstata são identificadas detectandose a superexpressão da α-metilacil-CoA racemase (AMACR) usando IF e um anticorpo anti-AMACR. Alternativamente, as células de uma amostra biológica podem ser colocadas sobre uma lâmina de microscópio e varridas quanto às

29/79 anormalidades citológicas comumente associadas com as células displásicas e neoplásticas. Tais anormalidades incluem as anormalidades no tamanho nuclear, formato nuclear, e coloração nuclear, como avaliados contratingindo-se os núcleos com tintas ou corantes de ácidos nucléicos, tais como o iodeto de propídio ou o dicloridrato de 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), normalmente após a hibridização das sondas com seus DNAs-alvo. Tipicamente, as células neoplásticas abrigam núcleos que estão aumentados, são de formato irregular, e/ou mostram um padrão de coloração mosqueado. O iodeto de propídio, tipicamente usado em uma concentração de cerca de 0,4 pg/ml a cerca de 5 pg/ml, é um corante específico para DNA apresentando fluorescência vermelha, que pode ser observado em um comprimento de ondas de pico de emissão de 614 nm. O DAPI, tipicamente usado em uma concentração de cerca de 125 ng/ml a cerca de 1.000 ng/ml, é um corante específico para DNA apresentando fluorescência azul, que pode ser observado em um comprimento de ondas de pico de emissão de 452 nm, com um filtro de DAPI em baixa magnitude. Neste caso, somente aquelas células pré-selecionadas para a detecção são submetidas à contagem em relação às perdas e/ou ganhos cromossômicos. De preferência, as células pré-selecionadas, em número na ordem de pelo menos 20, e mais preferivelmente pelo menos 30-40, são escolhidas para avaliar as perdas e/ou os ganhos cromossômicos.

[055]Alternativamente, uma área mostrando algum nível de displasia ou uma lesão suspeita pode ser localizada usando o filtro de DAPI em baixa magnitude e inspecionada completamente quanto à presença de núcleos abrigando números de cópias anormais de qualquer sonda. Em uma célula normal, serão detectadas duas cópias de uma dada sonda. Em uma célula anormal, serão detectadas mais ou menos cópias de uma dada sonda. As áreas com as alterações mais significativas nos números de cópias são preferivelmente selecionadas para a enumeração. Sempre que possível, três áreas anormais são selecionadas e, dentro de cada área

30/79 anormal, 10 núcleos aleatórios são analisados, sob alta potência (objetiva de 64 x ou 100 x). De preferência, os núcleos são não sobrepostos e abrigam sinais suficientemente brilhantes.

[056]Alternativamente, as células para a detecção podem ser escolhidas independentes das características citológicas ou histológicas. Por exemplo, todas as células não sobrepostas em uma dada área, ou áreas, sobre uma lâmina de microscópio podem ser avaliadas em relação às perdas e/ou ganhos cromossômicos. Como um exemplo adicional, as células sobre a lâmina, p.ex., as células que mostram morfologia alterada, em número da ordem de pelo menos cerca de 50, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 100, que aparecem em ordem consecutiva sobre uma lâmina de microscópio, podem ser escolhidas para avaliar as perdas e/ou os ganhos cromossômicos.

[057]As cópias de MYC (8p24), LPL (8p22), PTEN (10q23), e cromossomo 8, sozinhas ou em combinação adicional com as cópias de um ou mais de p16 (9p21), cromossomo 3, cromossomo 7, cromossomo 10, e cromossomo 17, são contadas, bem como as Fusões de TMPRSS2- ERG ou ETV1 (21q22;7p21) e as suas remoções e/ou translocações. Adicionalmente, as cópias de uma ou mais de p27Kip1 (4q43), CDK2 (12q13), ciclina E (CCNE1;19q12 e CCNE2; 8q22), uma sonda específica para um lócus para retinoblastoma 1 (Rb1; 13q14), uma sonda específica para um lócus para a homeossequência de NK3 1 (NKX3.1; 8p21.2), uma sonda específica para um lócus para o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR; 7p11), uma sonda específica para um lócus para a fosfoinositida-3-cinase (PI3K; 3q26), uma sonda específica para um lócus para cinase AKT1 (Akt1; 14q32), uma sonda específica para um lócus para FKHR (FOXO1; 13q14.11), uma sonda específica para um lócus para o homólogo da proteína de ligação de p53 (MDM2; 12q14.3-12q15), uma sonda específica para um lócus para p53 (17p13.1), uma sonda específica para um lócus para o homólogo do oncogene viral de sarcoma de

31/79 rato Kirsten v-Ki-ras2 (KRAS; 12p12.1), uma sonda específica para um lócus para o homólogo de oncogene viral de sarcoma murino v-raf B1 (BRAF; 7q34), uma sonda específica para um lócus para ciclina D1 (CCND1; 11q13), uma sonda específica para um lócus para CLL/linfoma 2 de células B (BCL2; 18q21.3/18q21.33), e uma sonda específica para um lócus para o receptor de androgênio (AR; Xq12) são contadas.

[058]Desse modo, tais métodos compreendem contatar uma amostra de células da próstata, obtida de um paciente, p.ex., uma amostra de ácido nucléico, com um conjunto de sondas marcadas de modo detectável que compreende uma sonda específica para um lócus para MYC (8p24), uma sonda específica para um lócus para LPL (8p22), uma sonda específica para um lócus para PTEN (10q23), e uma sonda centromérica para o cromossomo 8, sozinhas ou em combinação adicional com uma ou mais de uma sonda específica para um lócus para p16 (9p21), Fusões de TMPRSS2- ERG ou ETV1 (21q22;7p21), uma sonda centromérica para o cromossomo 3, uma sonda centromérica para o cromossomo 7, uma sonda centromérica para o cromossomo 10, e uma sonda centromérica para o cromossomo 17, onde o conjunto de sondas marcadas de modo detectável pode compreender uma ou mais de uma sonda específica para um lócus para p27Kip1 (4q43), CDK2 (12q13), ciclina E (CCNE1;19q12 e CCNE2; 8q22), uma sonda específica para um lócus para retinoblastoma 1 (Rb1; 13q14), uma sonda específica para um lócus para a homeossequência de NK3 1 (NKX3.1; 8p21.2), uma sonda específica para um lócus para o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR; 7p11), uma sonda específica para um lócus para a fosfoinositida-3-cinase (PI3K; 3q26), uma sonda específica para um lócus para cinase AKT1 (Akt1; 14q32), uma sonda específica para um lócus para FKHR ( FOXO1; 13q14.11), uma sonda específica para um lócus para o homólogo da proteína de ligação de p53 (MDM2; 12q14.3-12q15), uma sonda específica para um lócus para p53 (17p13.1), uma sonda específica para um lócus

32/79 para o homólogo do oncogene viral de sarcoma de rato Kirsten v-Ki-ras2 (KRAS; 12p12.1), uma sonda específica para um lócus para o homólogo de oncogene viral de sarcoma murino v-raf B1 (BRAF; 7q34), uma sonda específica para um lócus para ciclina D1 (CCND1; 11q13), uma sonda específica para um lócus para CLL/linfoma 2 de células B (BCL2; 18q21.3/18q21.33), e uma sonda específica para um lócus para o receptor de androgênio (AR; Xq12)), sob condições que permitam (ou promovam) que a sonda se ligue seletivamente com a sua sequência de ácidos nucléicos alvo e forme um complexo de hibridização estável. Tais métodos adicionalmente compreendem detectar a formação do complexo de hibridização e contar o número de complexos de hibridização. Em vista do número de complexos de hibridização compreendendo MYC (8p24), LPL (8p22), PTEN (10q23), e cromossomo 8, sozinhos ou em combinação adicional com o número de complexos de hibridização de um ou mais de p16 (9p21), Fusões de TMPRSS2- ERG ou ETV1 (21q22;7p21), cromossomo 3, cromossomo 7, cromossomo 8, cromossomo 10, e cromossomo 17, sozinhos ou em vista adicionalmente do número de complexos de hibridização compreendendo uma ou mais de p27Kip1 (4q43), CDK2 (12q13), ciclina E (CCNE1;19q12 e CCNE2; 8q22), uma sonda específica para um lócus para retinoblastoma 1 (Rb1; 13q14), uma sonda específica para um lócus para a homeossequência de NK3 1 (NKX3.1; 8p21.2), uma sonda específica para um lócus para o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR; 7p11), uma sonda específica para um lócus para a fosfoinositida-3-cinase (PI3K; 3q26), uma sonda específica para um lócus para cinase AKT1 (Akt1; 14q32), uma sonda específica para um lócus para FKHR ( FOXO1; 13q14.11), uma sonda específica para um lócus para o homólogo da proteína de ligação de p53 (MDM2; 12q14.3-12q15), uma sonda específica para um lócus para p53 (17p13.1), uma sonda específica para um lócus para o homólogo do oncogene viral de sarcoma de rato Kirsten v-Ki-ras2 (KRAS; 12p12.1), uma sonda específica para um lócus para o homólogo de oncogene viral

33/79 de sarcoma murino v-raf B1 (BRAF; 7q34), uma sonda específica para um lócus para ciclina D1 (CCND1; 11q13), uma sonda específica para um lócus para CLL/linfoma 2 de células B (BCL2; 18q21.3/18q21.33), e uma sonda específica para um lócus para o receptor de androgênio (AR; Xq12), o método adicionalmente compreende determinar o número de cópias de MYC (8p24), LPL (8p22), PTEN (10q23; ver, p.ex., as Pats. U.S. Nos. 6.262.242; 6.482.795; e 7.217.795), e cromossomo 8, sozinhas ou em combinação adicional com o número de cópias de um ou mais de p16 (9p21), cromossomo 3, cromossomo 7, cromossomo 10, e cromossomo 17, bem como as Fusões de TMPRSS2- ERG ou ETV1 (21q22;7p21) e as suas remoções e/ou translocações, sozinhas ou em combinação adicional com o número de cópias de uma ou mais de p27Kip1 (4q43), CDK2 (12q13), ciclina E (CCNE1;19q12 e CCNE2; 8q22), uma sonda específica para um lócus para retinoblastoma 1 (Rb1; 13q14), uma sonda específica para um lócus para a homeossequência de NK3 1 (NKX3.1; 8p21.2), uma sonda específica para um lócus para o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR; 7p11), uma sonda específica para um lócus para a fosfoinositida-3-cinase (PI3K; 3q26), uma sonda específica para um lócus para cinase AKT1 (Akt1; 14q32), uma sonda específica para um lócus para FKHR (FOXO1; 13q14.11), uma sonda específica para um lócus para o homólogo da proteína de ligação de p53 (MDM2; 12q14.3-12q15), uma sonda específica para um lócus para p53 (17p13.1), uma sonda específica para um lócus para o homólogo do oncogene viral de sarcoma de rato Kirsten v-Ki-ras2 (KRAS; 12p12.1), uma sonda específica para um lócus para o homólogo de oncogene viral de sarcoma murino v-raf B1 (BRAF; 7q34), uma sonda específica para um lócus para ciclina D1 (CCND1; 11q13), uma sonda específica para um lócus para CLL/linfoma 2 de células B (BCL2; 18q21.3/18q21.33), e uma sonda específica para um lócus para o receptor de androgênio (AR; Xq12). Se desejado, o número de cópias pode ser comparado com um corte predeterminado, onde um número de

34/79 cópias maior do que o corte predeterminado (i.e., para um ganho) e um número de cópias menor do que o corte predeterminado (i.e., para uma perda), conforme apropriado, indica que o paciente tem câncer da próstata. Quando cerca de 20% ou mais das células da próstata examinadas de um paciente tiverem translocações e/ou remoções envolvendo as Fusões de TMPRSS2- ERG ou ETV1 (21q22; 7p21), o paciente é considerado ter câncer da próstata.

[059]Embora a desparafinização, o pré-tratamento, o tingimento, e a lavagem da lâmina de rotina também possam ser conduzidos de acordo com os métodos conhecidos na técnica, o uso de um sistema automatizado, entretanto, tal como o Processo VP 2000 (Abbott Molecular, Inc., Des Plaines, IL), diminui a quantidade de tempo necessária para preparar as lâminas para a avaliação. As lâminas podem ser preparadas em grandes lotes (p.ex., 50 lâminas), em oposição aos pequenos lotes (p.ex., 4 lâminas), quando os vasos Coplin padrões forem usados para a lavagem pós-hibridização. Além disso, a contagem das lâminas pode ser completamente automatizada usando imageamento automatizado, com isso reduzindo a quantidade de tempo de trabalho efetivo requerida para a análise da amostra. A automatização total também possibilita o uso de um algoritmo de imageamento que captura mais células anormais de modo mais frequente e consistente. Também, embora possa ser usado qualquer método adequado de preparação da lâmina, conhecido na técnica, as lâminas são preferivelmente preparadas usando ThinPrep 2000 (Hologic, Inc., Bedford, MA), que gera monocamadas de células mais uniformes e consistentes.

[060]Outros métodos já conhecidos na técnica ou atualmente sob desenvolvimento podem requerer ou preferir o uso de uma amostra de células da próstata que seja diferente das células fixadas em formalina e embutidas em parafina, p.ex., as células novas ou congeladas, as células homogeneizadas, as células lisadas, ou os ácidos nucléicos isolados ou purificados (p.ex., uma amostra de ácido nucléico', tal como o DNA) a partir de células da próstata (pretende-se que

35/79 a amostra de células da próstata, conforme usada neste documento, inclua todas as formas de uma amostra de células da próstata que possibilitem a determinação do número de cópias e ganho/perda). Os núcleos podem também ser extraídos das seções grossas das amostras embutidas em parafina para reduzir os artefatos de truncamento e eliminar o material embutido estranho. Tipicamente, as amostras biológicas, uma vez obtidas, são coletadas e processadas antes da hibridização usando métodos padrões, conhecidos na técnica. Tal processamento tipicamente inclui o tratamento com protease e a fixação adicional em uma solução de aldeído, tal como o formaldeído.

[061]Os exemplos dos métodos que podem ser usados neste documento incluem, porém não estão limitados à reação em cadeia por polimerase quantitativa (Q-PCR), Q-PCR em tempo real (Applied Biosystems, Foster City, CA), varredura densitométrica dos produtos da PCR, PCR digital, opcionalmente com préamplificação do(s) gene(s) e/ou região(ões) cromossômica(s) para a(s) qual(is) (o) número(s) de cópias é/são para ser determinado(s) (ver, p.ex., Vogelstein e col., PNAS USA 96: 9236-9241 (1999); Pub. de Ped. de Pat. U.S. No. 2005/0252773; e Pub. de Ped. de Pat. U.S. No. 2009/0069194), hibridização genômica comparativa (CGH; ver, p.ex., Kallioniemi e col., Science 258: 818-821 (1992); e Pub. de Ped. de Pat. Int. No. WO 93/18186), análise de microssatélite ou Southern de alelotipo, hibridização em pontos, arranjos, microarranjos (Carter, Nature Genetics Supplement 39: S16-S21 (julho de 2007)), hibridização da sonda amplificável multiplex (MAPH), amplificação da sonda dependente da ligação multiplex (MLPA; ver, p.ex., Schouten e col., Nucleic Acids Res. 30: e 57 (2002)), cromatografia líquida de alto desempenho de desnaturação (dHPLC; Kumar e col., J. Biochem. Biophys. Methods 64(3): 226-234 (2005)), hibridização específica para alelo dinâmica (DASH), medição dos comprimentos das sondas fluorescentes sobre DNA genômico em favo de mel (Herrick e col., PNAS 97(1): 222-227 (2000)), pirossequenciamento de

36/79 consulta de referência (RQPS; Liu e col., Cold Spring Harb. Protoc. doi: 10.1101/pdb.prot5491 (2010)), mapeamento das extremidades de fosmídios sobre uma sequência de referência (tecnologia baseada em capilar), sequenciamento microeletroforético e de nanoporos (ver, p.ex., Service, Science 311: 1544-1546 (2006); e Shendure e col., Nat. Rev. Genet. 5: 335-344 (2004)), e similares.

[062]A desnaturação dos alvos de ácidos nucléicos para a análise por hibridização in situ e métodos similares tipicamente é feita em um modo tal de modo a preservar a morfologia da célula. Por exemplo, o DNA cromossômico pode ser desnaturado por pH alto, calor (p.ex., temperaturas de cerca de 70-95 °C), solventes orgânicos (p.ex., formamida), e suas combinações. As sondas, por outro lado, podem ser desnaturadas por calor em uma questão de minutos.

[063]Após a desnaturação, efetua-se a hibridização. As condições para hibridizar especificamente as sondas com seus alvos de ácidos nucléicos em geral incluem as combinações de condições que são empregáveis em um dado procedimento de hibridização para produzir híbridos específicos, cujas condições podem facilmente ser determinadas por alguém de habilidade comum na técnica. Tais condições tipicamente envolvem a temperatura controlada, a fase líquida, e o contato entre uma sonda e um alvo. As condições de hibridização variam dependendo de muitos fatores, incluindo a concentração da sonda, o comprimento do alvo, o teor de alvo e sonda G-C, a composição do solvente, a temperatura, e a duração da incubação. Pelo menos uma etapa de desnaturação pode preceder o contato das sondas com os alvos. Alternativamente, a sonda e o alvo podem ser submetidos às condições de desnaturação conjuntamente enquanto em contato um com o outro, ou com contato subsequente da sonda com a amostra biológica. A hibridização pode ser obtida com a incubação subsequente da sonda/amostra em, por exemplo, uma fase líquida de aproximadamente uma mistura de 2-4 x SSC e formamida na razão de volumes de 50:50, em uma temperatura na faixa de cerca de 25 a cerca de 55° C, por um tempo

37/79 que esteja ilustrativamente na faixa de cerca de 0,5 a cerca de 96 horas, ou mais preferivelmente em uma temperatura de cerca de 32 a cerca de 40° C, por um tempo na faixa de cerca de 2 a cerca de 16 horas. Para aumentar a especificidade, pode ser usado um agente de bloqueio, tal como o ácido nucléico de bloqueio não marcado, conforme descrito na Pat. U.S. No. 5.756.696 (cujos conteúdos são aqui incorporados por referência em sua totalidade, e especificamente para a descrição do uso do ácido nucléico de bloqueio). Outras condições podem ser prontamente empregadas para hibridizar especificamente as sondas com seus alvos de ácidos nucléicos presentes na amostra, conforme seriam prontamente aparentes para alguém de habilidade na técnica. Os protocolos de hibridização são descritos, por exemplo, em Pinket e col., PNAS USA 85: 9138-9142 (1988); In situ Hybridization Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 33, Choo, ed., Humana Press, Totowa, NJ (1994); e Kallioniemi e col., PNAS USA 89: 5321-5325 (1992).

[064]Com o término de um período de incubação adequado, a ligação não específica das sondas cromossômicas com o DNA da amostra pode ser removida por uma série de lavagens. A temperatura e as concentrações de sais são adequadamente escolhidas para uma severidade desejada. O nível de severidade requerida depende da complexidade de uma sequência da sonda específica em relação à sequência genômica, e pode ser determinado hibridizando sistematicamente as sondas com as amostras de composição genética conhecida. Em geral, as lavagens de alta severidade podem ser realizadas em uma temperatura na faixa de cerca de 65 a cerca de 80°C, com cerca de 0,2 x a cerca de 2 x SSC e cerca de 0,1% a cerca de 1% de um detergente não iônico, tal como Nonidet P-40 (NP40). Se forem requeridas lavagens de severidade menor, as lavagens podem ser realizadas em uma temperatura menor, com uma concentração de sal aumentada.

[065]Quando forem usadas sondas ou composições de sondas marcadas com fluoróforos, o método de detecção pode envolver a microscopia com fluorescência, a

38/79 citometria de fluxo, ou outro meio para determinar a hibridização da sonda. Qualquer método de imageamento microscópico adequado pode ser usado, em combinação com os métodos descritos neste documento, para observar os múltiplos fluoróforos. No caso onde for empregada a microscopia com fluorescência, as amostras hibridizadas podem ser vistas sob luz adequada para a excitação de cada fluoróforo e com o uso de um filtro, ou filtros, apropriado. Alternativamente podem ser usados os sistemas de imageamento digital automatizados, tais como os sistemas MetaSystems, BioView ou Applied Imaging, juntamente com a enumeração dos sinais e os algoritmos de aquisição de dados.

[066]Dependendo do método empregado, pode ser usado um sistema de análise da imagem digital para facilitar a exibição dos resultados e melhorar a sensibilidade de detectar pequenas diferenças na intensidade da fluorescência. Um sistema ilustrativo é o QUIPS (um acrônimo para sistema de processamento de imagem quantitativo (quantitative image processing system)), que é um sistema de análise da imagem automatizado, baseado em um microscópio com fluorescência padrão, equipado com um estágio automatizado, controle de foco e roda de filtros (Ludl Electronic Products, Ltd., Hawthorne, NY). A roda de filtros é montada na via de excitação da fluorescência do microscópio para a seleção do comprimento de ondas de excitação. Filtros especiais (Chroma Technology, Brattleboro, VT) no bloco dicróico permitem a excitação dos múltiplos corantes, sem mudança do registro da imagem. O microscópio tem duas portas de câmeras, uma das quais tem uma câmera CCD intensificada (Quantex Corp., Sunnyvale, CA) para a exibição da imagem de vídeo em alta velocidade, sensível, que é usada para encontrar áreas interessantes sobre uma lâmina, bem como para focar. A outra porta de câmera tem uma câmera CCD esfriada (modelo 200 por Photometrics Ltd., Tucson, AZ), que é usada para a aquisição real de imagem em alta resolução e sensibilidade. A câmera CCD esfriada é interagida com uma estação de trabalho SUN 4/330 (SUN

39/79

Microsystems, Inc., Mountain View, CA) através de um VMEbus. A aquisição inteira das imagens multicores é controlada usando um pacote de software de processamento de imagem SCIL-Image (Delft Centre for Image Processing, Delft, Holanda).

[067]No arranjo CGH (aCGH), as sondas são imobilizadas em posições diferentes sobre um substrato e não são marcadas (ver, p.ex., a Pub. de ped. de Pat. Int. No. WO 96/17958). Ao contrário, os ácidos nucléicos de amostra, os quais compreendem o(s) ácido(s) nucléico(s) alvo, são marcados. Os ácidos nucléicos de amostra são marcados antes da hibridização ou os complexos de hibridização são marcados de modo detectável. No aCGH de cor dupla ou multicolor, o arranjo de sondas é simultânea ou sequencialmente hibridizado com dois ou mais conjuntos de ácidos nucléicos alvo diferentemente marcados.

[068]De preferência, a expressão do biomarcador é avaliada por imunofluorescência (IF) para localizar áreas para a análise por FISH. Os resultados da IF correlacionam-se estreitamente com as anormalidades da FISH, identificadas usando as sondas descritas neste documento, bem como a avaliação morfológica de um tumor.

[069]Os métodos acima mencionados podem ser usados para classificar os pacientes naqueles que necessitam de biopsia de repetição ou acompanhamento intensivo e naqueles que não. Os métodos acima mencionados também podem ser usados para distinguir o câncer da próstata de uma condição benigna, tal como a hiperplasia prostática benigna (BPH). Tais métodos podem ser usados em combinação com outros métodos, tais como a avaliação do tecido histológico, a detecção do antígeno específico para a próstata (PSA), o nomograma (p.ex., nomograma de Katan), a metilação, e a mutação. Com relação a isto, os métodos também podem ser usados para confirmar a diagnose após a prostatectomia radical e para distinguir o câncer da próstata de uma lesão pré-cancerosa (p.ex.,

40/79 proliferação acinar pequena atípica na próstata (ASAP), neoplasia intraepitelial da próstata (PIN) de baixo grau, e PIN de alto grau) na próstata e uma lesão précancerosa na próstata de uma condição benigna, tal como a BPH. Os métodos podem auxiliar na diagnose de adenocarcinoma em uma amostra obtida por biopsia, ressecção transuretral (TURP), ou cirurgia, p.ex., prostatectomia radical. Uma vantagem dos métodos acima mencionados, particularmente no contexto de detecção e diagnose, é que as anormalidades cromossômicas indicativas de câncer da próstata podem ser detectadas em células que circundam um tumor (i.e., as células de efeito de campo). Desse modo, mesmo se o tumor não for observado durante a biopsia, a sua presença pode ser detectada de acordo com os métodos acima mencionados, com isso reduzindo os resultados falso-negativos e a necessidade por biopsias de repetição. Os métodos também podem ser usados na prognose do câncer da próstata, no monitoramento da eficácia do tratamento profilático ou terapêutico (p.ex., terapia com hormônios ou radiação) do câncer da próstata, e no monitoramento da recorrência do câncer da próstata. Os métodos podem ser usados para confirmar os resultados obtidos com métodos de detecção baseados em urina ou sangue. O risco de câncer nos pacientes com lesões précancerosas pode ser avaliado usando tais métodos, bem como a agressividade do câncer (p.ex., mais anormalidades cromossômicas e/ou mais anormalidades cromossômicas difundidas nas células de efeito de campo). Tais métodos também podem ser usados para auxiliar nas decisões de tratamento, p.ex., fiscalização ativa, cirurgia, ou terapia com hormônios ou radiação, e nas decisões de tratamentos adjuvantes, tais como no contexto de prostatectomia radical.

[070]Desse modo, o método pode adicionalmente compreender diagnosticar, prognosticar, ou avaliar a eficácia de um tratamento terapêutico/profilático de um paciente de quem foi obtida a amostra de teste. Se o método adicionalmente compreender avaliar a eficácia de um tratamento terapêutico/profilático do paciente

41/79 de quem foi obtida a amostra de teste, o método opcional e adicionalmente compreende modificar o tratamento terapêutico/profilático do paciente, conforme necessário, para melhorar a eficácia. O método pode ser adaptado para uso em um sistema automatizado ou um sistema semiautomatizado.

[071]Em geral, pode ser empregado um nível predeterminado como uma referência contra a qual avaliar os resultados obtidos ao testar uma amostra de células da próstata quanto a anormalidades cromossômicas. Em geral, ao fazer tal comparação, o nível predeterminado é obtido efetuando-se um ensaio particular um número suficiente de vezes e sob condições apropriadas, de modo tal que possa ser feita uma ligação ou associação de uma anormalidade cromossômica particular (presença ou nível) com um estágio ou ponto final particular de uma doença, distúrbio ou condição (p.ex., pré-eclâmpsia ou doença cardiovascular) ou com indícios particulare. Tipicamente, o nível predeterminado é obtido com ensaios de pacientes (ou populações de pacientes) de referência.

[072]Em particular, em relação a um nível predeterminado, conforme empregado para monitorar a progressão e/ou o tratamento da doença, a anormalidade cromossômica (presença ou nível) pode ser inalterada, favorável (ou favoravelmente alterada), ou desfavorável (ou desfavoravelmente alterada). Elevado ou aumentado refere-se a um nível de anormalidade cromossômica em uma amostra de células da próstata que é maior do que um nível ou uma faixa típica ou normal (p.ex., nível predeterminado), ou é maior do que outro nível ou faixa de referência (p.ex., amostra inicial ou de linha de base). O termo diminuído ou reduzido refere-se a um nível de anormalidade cromossômica em uma amostra de células da próstata que é menor do que um nível ou uma faixa típica ou normal (p.ex., nível predeterminado), ou é menor do que outro nível ou faixa de referência (p.ex., amostra inicial ou de linha de base). O termo alterado refere-se a um nível de anormalidade cromossômica em uma amostra de células da próstata que está

42/79 alterado (aumentado ou diminuído) sobre um nível ou uma faixa típica ou normal (p.ex., nível predeterminado), ou sobre outro nível ou faixa de referência (p.ex., amostra inicial ou de linha de base).

[073]O nível ou a faixa típica ou normal para uma dada anormalidade cromossômica é definida de acordo com a prática padrão. Porque os níveis de anormalidades cromossômicas em algumas situações serão muito baixos, um assim chamado nível alterado ou alteração pode ser considerada ter ocorrido quando houver qualquer alteração líquida em comparação com o nível ou a faixa típica ou normal, ou o nível ou a faixa de referência, que não possa ser explicada por erro experimental ou variação da amostra. Desse modo, o nível medido em uma amostra particular será comparado com o nível ou a faixa de níveis determinados em amostras similares de um assim chamado paciente normal. Neste contexto, um paciente normal é um indivíduo sem nenhuma doença detectável, e um paciente ou população normal ou de controle é uma que não exibe nenhuma doença detectável, respectivamente, por exemplo. Além disso, dado que as anormalidades cromossômicas não são habitualmente encontradas em altos níveis na maior parte da população humana, um paciente normal pode ser considerado um indivíduo sem nenhum nível aumentado detectável substancial de uma dada anormalidade cromossômica, e um paciente ou população normal (algumas vezes chamada de controle) é uma que não exibe nenhum nível aumentado detectável substancial de uma dada anormalidade cromossômica. Um paciente aparentemente normal é um em que as anormalidades cromossômicas não foram ou estão sendo avaliadas. O nível de uma dada anormalidade cromossômica é dito estar elevado quando a anormalidade cromossômica for normalmente indetectável, porém é detectada em uma amostra de teste, bem como quando o analito estiver presente na amostra de teste em um nível maior do que o normal. Desse modo, inter alia, a divulgação proporciona um método de examinar um paciente tendo, ou correndo o risco de ter,

43/79 câncer da próstata.

[074]O método pode também envolver a detecção de outros marcadores e similares. Por exemplo, o método pode também envolver a detecção do antígeno específico para a próstata (PSA), por exemplo.

[075]Os métodos descritos neste documento também podem ser usados para determinar se um paciente tem ou está correndo o risco de desenvolver câncer da próstata. Especificamente, tal método pode compreender as etapas de:

(a) determinar as anormalidades cromossômicas em uma amostra de células da próstata de um paciente (p.ex., usando os métodos descritos neste documento, ou os métodos conhecidos na técnica); e (b) comparar os níveis de anormalidades cromossômicas na etapa (a) com os níveis predeterminados, onde, se os níveis de anormalidades cromossômicas determinadas na etapa (a) forem favoráveis em relação aos níveis predeterminados, então o paciente é determinado não ter ou estar correndo o risco de câncer da próstata. Entretanto, se os níveis de anormalidades cromossômicas determinadas na etapa (a) forem desfavoráveis em relação aos níveis predeterminados, então o paciente é determinado ter ou estar correndo o risco de câncer da próstata.

[076]Adicionalmente proporciona-se neste documento um método de monitorar a progressão do câncer da próstata em um paciente. De modo ideal, o método compreende as etapas de:

(a) determinar as anormalidades cromossômicas em uma amostra de células da próstata de um paciente;

(b) determinar os níveis de anormalidades cromossômicas em uma amostra posterior de células da próstata do paciente; e (c) comparar os níveis de anormalidades cromossômicas como determinados na etapa (b) com os níveis de anormalidades cromossômicas como determinadas na etapa (a), onde se os níveis na etapa (b) estiverem inalterados ou

44/79 forem desfavoráveis, quando comparados aos níveis determinados na etapa (a), então o câncer da próstata é determinado ter continuado, progredido ou piorado no paciente. Por comparação, se os níveis como determinados na etapa (b) forem favoráveis, quando comparados aos níveis como determinados na etapa (a), então o câncer da próstata é determinado ter descontinuado, regredido ou melhorado no paciente.

[077]Opcionalmente, o método adicionalmente compreende comparar os níveis de anormalidades cromossômicas como determinados na etapa (b), por exemplo, com níveis predeterminados. Além disso, opcionalmente, o método compreende tratar o paciente, p.ex., com uma ou mais composições farmacêuticas, radiação, e/ou terapia de hormônio, por um período de tempo, se a comparação mostrar que os níveis como determinados na etapa (b), por exemplo, estiverem desfavoravelmente alterados em relação aos níveis predeterminados.

[078]Ainda adicionalmente, os métodos podem ser usados para monitorar o tratamento em um paciente que recebe o tratamento, p.ex., com uma ou mais composições farmacêuticas, radiação, e/ou terapia de hormônio. Especificamente, tais métodos envolvem proporcionar uma primeira amostra de células da próstata de um paciente, antes do paciente ter sido tratado. A seguir, os níveis de anormalidades cromossômicas na primeira amostra de células da próstata são determinados (p.ex., usando os métodos descritos neste documento ou como conhecidos na técnica). Após os níveis de anormalidades cromossômicas serem determinados, opcionalmente os níveis são então comparados com os níveis predeterminados. Se os níveis como determinados na primeira amostra de células da próstata forem menores do que os níveis predeterminados, então o paciente não é tratado. Entretanto, se os níveis como determinados na primeira amostra de células da próstata forem maiores do que os níveis predeterminados, então o paciente é tratado por um período de tempo. O período de tempo que o paciente é

45/79 tratado pode ser determinado por alguém versado na técnica (por exemplo, o período de tempo pode ser de cerca de sete (7) dias a cerca de dois anos, preferivelmente de cerca de quatorze (14) dias a cerca de um (1) ano).

[079]Durante o curso do tratamento, a segunda amostra e as amostras subsequentes de células da próstata são então obtidas do paciente. O número de amostras e o tempo no qual as ditas amostras são obtidas do paciente não são críticos. Por exemplo, uma segunda amostra poderia ser obtida sete (7) dias após o paciente ser primeiramente tratado, uma terceira amostra poderia ser obtida duas (2) semanas após o paciente ser primeiramente tratado, uma quarta amostra poderia ser obtida três (3) semanas após o paciente ser primeiramente tratado, uma quinta amostra poderia ser obtida quatro (4) semanas após o paciente ser primeiramente tratado, etc.

[080]Após cada segunda amostra ou amostra subsequente ser obtida do paciente, os níveis de anormalidades cromossômicas na segunda amostra ou na amostra subsequente são determinados (p.ex., usando os métodos descritos neste documento ou como conhecidos na técnica). Os níveis como determinados em cada uma da segunda amostra e amostras subsequentes são então comparados com os níveis como determinados na primeira amostra (p.ex., a amostra que foi original e opcionalmente comparada com o nível predeterminado). Se os níveis como determinados na etapa (c) forem favoráveis, quando comparados aos níveis como determinados na etapa (a), então o câncer da próstata é determinado ter descontinuado, regredido ou melhorado, e o paciente deve continuar a ser tratado. Entretanto, se os níveis determinados na etapa (c) estiverem inalterados ou forem desfavoráveis, quando comparados aos níveis como determinados na etapa (a), então o câncer da próstata é determinado ter continuado, progredido ou piorado, e o paciente deve ser tratado com uma dosagem maior da composição farmacêutica, da radiação, ou do hormônio, por exemplo, ou o paciente deve ser tratado

46/79 diferentemente.

[081]Em geral, para os ensaios nos quais pode ser feito um teste de repetição (p.ex., monitoramento da progressão da doença e/ou da resposta ao tratamento), uma segunda amostra de teste ou amostra de teste subsequente é obtida em um período no tempo após a primeira amostra de teste ter sido obtida do paciente. Especificamente, uma segunda amostra de teste do paciente pode ser obtida minutos, horas, dias, semanas ou anos após a primeira amostra de teste ter sido obtida do paciente. Por exemplo, a segunda amostra de teste pode ser obtida do paciente em um período de tempo de cerca de 1 minuto, cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 15 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 45 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas, cerca de 24 horas, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 6 dias, cerca de 7 dias, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 7 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 9 semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 11 semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 13 semanas, cerca de 14 semanas, cerca de 15 semanas, cerca de 16 semanas, cerca de 17 semanas, cerca de 18 semanas, cerca de 19 semanas, cerca de 20 semanas, cerca de 21 semanas, cerca de 22 semanas, cerca de 23 semanas, cerca de 24 semanas, cerca de 25 semanas, cerca de 26 semanas, cerca de 27 semanas, cerca de 28 semanas, cerca de 29 semanas, cerca de 30 semanas, cerca de 31 semanas, cerca de 32 semanas, cerca de 33 semanas, cerca de 34 semanas, cerca de 35 semanas, cerca de 36 semanas, cerca de 37 semanas, cerca de 38 semanas, cerca de 39 semanas, cerca

47/79 de 40 semanas, cerca de 41 semanas, cerca de 42 semanas, cerca de 43 semanas, cerca de 44 semanas, cerca de 45 semanas, cerca de 46 semanas, cerca de 47 semanas, cerca de 48 semanas, cerca de 49 semanas, cerca de 50 semanas, cerca de 51 semanas, cerca de 52 semanas, cerca de 1,5 anos, cerca de 2 anos, cerca de 2,5 anos, cerca de 3,0 anos, cerca de 3,5 anos, cerca de 4,0 anos, cerca de 4,5 anos, cerca de 5,0 anos, cerca de 5,5 anos, cerca de 6,0 anos, cerca de 6,5 anos, cerca de 7,0 anos, cerca de 7,5 anos, cerca de 8,0 anos, cerca de 8,5 anos, cerca de 9,0 anos, cerca de 9,5 anos ou cerca de 10,0 anos após a primeira amostra de teste do paciente ser obtida.

[082]Além disso, a presente divulgação também se refere aos métodos de determinar se um paciente predisposto ao, ou sofrendo de, câncer da próstata beneficiar-se-á do tratamento. Em particular, a divulgação refere-se aos métodos diagnósticos e produtos concomitantes. Desse modo, o método de monitorar o tratamento da doença em um paciente, como descrito neste documento, adicional e idealmente também pode incluir selecionar ou identificar os candidatos para a terapia.

[083]Desse modo, nas modalidades particulares, a divulgação também proporciona um método de determinar se um paciente tendo, ou correndo o risco de, câncer da próstata é um candidato para a terapia. Em geral, o paciente é um que sentiu algum sintoma da doença ou que de fato tinha sido diagnosticado como tendo, ou correndo o risco de, tal doença, e/ou que demonstra níveis desfavoráveis de anormalidades cromossômicas, conforme descrito neste documento.

[084]O método opcionalmente compreende um ensaio conforme descrito neste documento, onde os níveis de anormalidades cromossômicas são avaliados antes e após o tratamento de um paciente. A observação de níveis desfavoráveis de anormalidades cromossômicas após o tratamento confirma que o paciente não se beneficiará de receber tratamento adicional ou continuado, enquanto a observação

48/79 de níveis favoráveis de anormalidades cromossômicas após o tratamento confirma que o paciente beneficiar-se-á de receber tratamento adicional ou continuado. Esta confirmação auxilia com o controle dos estudos clínicos, e o fornecimento de cuidado melhorado do paciente.

SONDAS [085]Também se proporciona um conjunto de sondas. Em uma modalidade, o conjunto de sondas compreende uma sonda específica para um lócus para MYC (8q24), uma sonda específica para um lócus para o homólogo de fosfatase e tensina (PTEN; 10q23), uma sonda centromérica para o cromossomo 8, e uma sonda centromérica para o cromossomo 7, onde o conjunto de sondas opcional e adicionalmente compreende um anticorpo anti-a-metilacil-CoA racemase (AMACR), que pode ser marcado de modo detectável. Em outra modalidade, o conjunto de sondas compreende uma sonda específica para um lócus para MYC (8q24), uma sonda específica para um lócus para lipoproteína lipase (LPL; 8p22), uma sonda específica para um lócus para PTEN, e uma sonda centromérica para o cromossomo 8. O conjunto de sondas opcional e adicionalmente compreende um anticorpo antiAMACR, o qual pode ser marcado de modo detectável. A sonda específica para um lócus para MYC (8q24) preferivelmente cobre aproximadamente 820 kb, tal como 821 kb, concentrada sobre o gene MYC e inclui o gene MYC inteiro, bem como as regiões adjacentes (ver a discussão de MYC na seção de métodos acima mencionada). A sonda específica para um lócus para LPL (8p22) preferivelmente cobre aproximadamente 170 kb, concentrada sobre o gene LPL e inclui o gene LPL inteiro, bem como as regiões adjacentes (ver a discussão de LPL na seção de métodos acima mencionada). A sonda específica para um lócus para PTEN (10q23) preferivelmente cobre aproximadamente 365 a 370 kb, tal como 368 kb, concentrada sobre gene PTEN e inclui o gene PTEN inteiro, bem como as regiões adjacentes, tais como os marcadores de STS D10S215 sobre o lado centromérico e RH93626

49/79 sobre o lado telomérico (ver a discussão de PTEN na seção de métodos acima mencionada). O conjunto de sondas pode opcional e adicionalmente compreender uma ou mais de uma sonda específica para um lócus para p16 (9p21), as fusões de TMPRSS2- ERG ou ETV1 (21q22; lócus 7p21), uma sonda centromérica para o cromossomo 3, uma sonda centromérica para o cromossomo 7, uma sonda centromérica para o cromossomo 10, e uma sonda centromérica para o cromossomo 17. O conjunto de sondas pode adicionalmente compreender uma ou mais de uma sonda específica para um lócus para inibidor da cinase dependente de ciclina p27Kip1 (4q43), uma sonda específica para um lócus para CDK2; 12q13), uma sonda específica para um lócus para ciclina E (CCNE1;19q12 e CCNE2; 8q22), uma sonda específica para um lócus para retinoblastoma 1 (Rb1; 13q14), uma sonda específica para um lócus para a homeossequência de NK3 1 (NKX3.1; 8p21.2), uma sonda específica para um lócus para o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR; 7p11), uma sonda específica para um lócus para a fosfoinositida-3-cinase (PI3K; 3q26), uma sonda específica para um lócus para a cinase AKT1 (Akt1; 14q32), uma sonda específica para um lócus para FKHR (FOXO1; 13q14.11), uma sonda específica para um lócus para o homólogo da proteína de ligação de p53 (MDM2; 12q14.3-12q15), uma sonda específica para um lócus para p53 (17p13.1), uma sonda específica para um lócus para o homólogo de oncogene viral de sarcoma de rato Kirsten v-Ki-ras2 (KRAS; 12p12.1), uma sonda específica para um lócus para o homólogo de oncogene viral de sarcoma murino v-raf B1 (BRAF; 7q34), uma sonda específica para um lócus para ciclina D1 (CCND1; 11q13), uma sonda específica para um lócus para CLL/linfoma 2 de células B (BCL2; 18q21.3/18q21.33), e uma sonda específica para um lócus para o receptor de androgênio (AR; Xq12).

[086]As sondas adequadas para uso como sondas específicas para um lócus hibridizam com uma região específica sobre um cromossomo contendo um gene. A

50/79 sonda específica para um lócus para o gene MYC (8p24) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene MYC em p24 sobre o cromossomo 8 (i.e., 8p24). A sonda específica para um lócus para o gene LPL (8p22) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene LPL em p22 sobre o cromossomo 8 (i.e., 8p22). A sonda específica para um lócus para o gene PTEN (10q23) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene PTEN em q23 sobre o cromossomo 10 (i.e., 10q23). Similarmente, a sonda específica para um lócus para p27Kip1 (4q43) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene p27Kip1 em q43 sobre o cromossomo 4 (i.e., 4q43), a sonda específica para um lócus para CDK2 (12q13) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene CDK2 em q13 sobre o cromossomo 12 (i.e., 12q13), a sonda específica para um lócus para a ciclina E (CCNE1;19q12 e CCNE2; 8q22) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene CCNE1 em q12 sobre o cromossomo 19 ou todo ou uma parte do gene CCNE2 em q22 sobre o cromossomo 8, uma sonda específica para um lócus para retinoblastoma 1 (Rb1; 13q14) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene Rb1 em q14 sobre o cromossomo 13, uma sonda específica para um lócus para a homeossequência de NK3 1 (NKX3.1; 8p21.2) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene NKX3.1 em p21.2 sobre o cromossomo 8, uma sonda específica para um lócus para o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR; 7p11) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene EGFR em p11 sobre o cromossomo 7, uma sonda específica para um lócus para a fosfoinositida-3-cinase (PI3K; 3q26) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene PI3K em q26 sobre o cromossomo 3, uma sonda específica para um lócus para a cinase AKT1 (Akt1; 14q32) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene Akt1 em q32 sobre o cromossomo 14, uma sonda específica para um lócus para FKHR (FOXO1; 13q14.11) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene FOXO1 em q14.11 sobre o cromossomo 13, uma sonda específica para um lócus para o homólogo da proteína de ligação de p53 (MDM2; 12q14.3-12q15) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene MDM2 em

51/79 q14.3-q15 sobre o cromossomo 12, uma sonda específica para um lócus para p53 (17p13.1) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene p53 em p13.1 sobre o cromossomo 17, uma sonda específica para um lócus para o homólogo do oncogene viral de sarcoma de rato Kirsten v-Ki- ras2 (KRAS; 12p12.1) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene KRAS em p12.1 sobre o cromossomo 12, uma sonda específica para um lócus para o homólogo de oncogene viral de sarcoma murino v-raf B1 (BRAF; 7q34) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene BRAF em q34 sobre o cromossomo 7, uma sonda específica para um lócus para ciclina D1 (CCND1; 11q13) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene CCND1 em q13 sobre o cromossomo 11, uma sonda específica para um lócus para CLL/linfoma 2 de células B (BCL2; 18q21.3/18q21.33) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene BCL2 em q21.3-q21.33 sobre o cromossomo 18, e uma sonda específica para um lócus para o receptor de androgênio (AR; Xq12) pode hibridizar com todo ou uma parte do gene AR em q12 sobre o cromossomo X.

[087]Uma sonda adequada para uso como uma sonda de desprendimento (break-away) hibridiza com TMPRSS2 (21q22), com isso possibilitando a detecção de translocações e/ou remoções.

[088]As sondas adequadas para uso como sondas cromossômicas hibridizam com DNA repetitivo associado com o centrômero de um cromossomo. Os centrômeros dos cromossomos de primatas contêm uma família complexa de repetições de DNA de extensão em série, que são compostas de um comprimento de repetição de monômero de cerca de 171 pares de bases (bp), que é referido como DNA α-satélite. As sondas cromossômicas são tipicamente cerca de 50-1x10⁵ nucleotídeos de comprimento. As sondas mais longas tipicamente são fragmentadas em aproximadamente 100-600 nucleotídeos de comprimento. A sonda para o cromossomo 3 pode hibridizar com o DNA alfa satélite localizado no centrômero do cromossomo 3, enquanto a sonda para o cromossomo 7 pode hibridizar com o DNA

52/79 alfa satélite localizado no centrômero do cromossomo 7, a sonda para o cromossomo 8 pode hibridizar com o DNA alfa satélite localizado no centrômero do cromossomo 8, a sonda para o cromossomo 10 pode hibridizar com o DNA alfa satélite localizado no centrômero do cromossomo 10, e a sonda para o cromossomo 17 pode hibridizar com o DNA alfa satélite localizado no centrômero do cromossomo 17. Os exemplos de tais sondas incluem CEP3, CEP7, CEP8, CEP 10 e CEP17.

[089]As sondas enumeradoras de cromossomos (CEP) e as sondas específicas para um lócus que alvejam uma região ou sub-região do cromossomo podem ser obtidas comercialmente ou prontamente preparadas por aqueles na técnica. Tais sondas podem ser comercialmente obtidas da Abbott Molecular, Inc. (Des Plaines, IL), Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR), ou Cytocell (Oxfordshire, UK). As sondas cromossômicas podem ser preparadas, por exemplo, a partir de ácidos nucléicos de proteínas (PNA), DNA humano clonado, tal como plasmídios, cromossomos artificiais bacterianos (BACs), e cromossomos artificiais PI (PACs) que contêm inserções de sequências de DNA humanas. Uma região de interesse pode ser obtida por meio de amplificação por PCR ou clonagem. Em outra modalidade, as sondas cromossômicas podem ser oligo sondas. Alternativamente, as sondas cromossômicas podem ser preparadas sinteticamente de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[090]Quando o alvejamento de um lócus de gene particular for desejado, as sondas que hibridizam ao longo do comprimento inteiro do gene alvejado podem ser preferidas, embora não requeridas. Uma sonda específica para um lócus pode ser projetada para hibridizar com um oncogene ou gene supressor de tumor, cuja aberração genética está correlacionada com a metástase, p.ex., MYC.

[091]As sondas podem ser preparadas por qualquer método conhecido na técnica. As sondas podem ser sintetizadas ou produzidas de modo recombinante. Tais sondas podem variar no comprimento a partir de cerca de 25.000 pares de

53/79 bases até cerca de 800.000 pares de bases.

[092]De preferência, as sondas são marcadas de modo detectável, e cada sonda é distintamente marcada. De preferência, as sondas são marcadas de modo detectável com fluoróforos, e cada sonda é marcada distintamente. Os exemplos de fluoróforos preferidos incluem, porém não estão limitados ao ácido 7-amino-4metilcumarina-3-acético (AMCA), 5-carbóxi-X-rodamina, 6-carbóxi-X-rodamina, lissamina rodamina B, 5-carboxifluoresceína, 6-carboxifluoresceína, fluoresceína-5isotiocianato (FITC), ácido 7-dietilaminocumarina-3-carboxílico, tetrametilrodamina-5isotiocianato, tetrametilrodamina-6- isotiocianato, 5-carboxiltetrametilrodamina, 6carboxitetrametilrodamina, ácido 7-hidroxicumarina-3-carboxílico, ácido N-4,4-diflúor5,7-dimeti-4-bora-3a,4a-diaza-3-indacenopropiônico, eosina-5-isotiocianato, eritrosina-5-isotiocianato, SpectrumRed (Abbott Molecular, Inc.), SpectrumGold (Abbott Molecular, Inc.), SpectrumGreen (Abbott Molecular, Inc.), SpectrumAqua (Abbott Molecular, Inc.), TEXAS RED (Molecular Probes, Inc.), amarelo Lucifer, e blue acetilazida CASCADE (Molecular Probes, Inc.). A marca particular usada não é crítica; desejavelmente, entretanto, a marca particular não interfere com a hibridização in situ da sonda e a detecção da marca sobre qualquer outra sonda. A marca desejavelmente é detectável em um número de cópias tão baixo quanto possível para maximizar a sensibilidade do ensaio e ser detectável acima de qualquer sinal de fundo. Também desejavelmente, a marca proporciona um sinal altamente localizado, com isso proporcionando um alto grau de resolução espacial.

[093]A ligação dos fluoróforos às sondas de ácidos nucléicos é bastante conhecida na técnica e pode ser efetuada por qualquer meio disponível. Os fluoróforos podem ser ligados covalentemente a um nucleotídeo particular, por exemplo, e o nucleotídeo marcado incorporado na sonda usando técnicas padrões, tais como a tradução de corte, a pré-ativação aleatória (Rigby e col., J. Mol. Biol. 113: 237 (1997)), a marcação por PCR, a marcação da extremidade, a marcação

54/79 direta por modificação química de resíduos particulares, tais como os resíduos de citosina (Pat. U.S. No. 5.491.224), e similares. Alternativamente, o fluoróforo pode ser covalentemente ligado aos nucleotídeos com os braços de ligadores ativados, que tenham sido incorporados na sonda, por exemplo, por meio de um ligador aos nucleotídeos de desoxicitidina da sonda que tenham sido transaminados. Os métodos para marcar as sondas são descritos na Pat. U.S. No. 5.491.224, e em Morrison e col., Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications, Capítulo 2, Labeling Fluorescence In Situ Hybridization Probes for Genomic Targets, págs. 2140, Fan, Ed., Humana Press (2002), ambos os quais são aqui incorporados por referência por suas descrições de sondas de marcação.

[094]Alguém de habilidade na técnica reconhecerá que outros agentes ou corantes podem ser usados, em vez dos fluoróforos, como porções contendo marcas. Os agentes luminescentes incluem, por exemplo, as porções contendo marcas radioluminescentes, quimioluminescentes, bioluminescentes, e fosforescentes. Os agentes que são detectáveis com luz visível incluem os corantes de cianina. Alternativamente, podem ser usadas porções de detecção que sejam visualizadas por meios indiretos. Por exemplo, as sondas podem ser marcadas com biotina ou digoxigenina usando métodos de rotina, conhecidos na técnica, e então adicionalmente processadas para a detecção. A visualização de uma sonda contendo biotina pode ser obtida por meio de ligação subsequente da avidina conjugada a um marcador detectável. O marcador detectável pode ser um fluoróforo, em cujo caso a visualização e a diferenciação das sondas podem ser obtidas conforme descrito abaixo.

[095]As sondas cromossômicas hibridizadas com regiões-alvo alternativamente podem ser visualizadas por reações enzimáticas de porções de marcas com substratos adequados, para a produção de produtos coloridos insolúveis. Cada sonda pode ser diferenciada de outras sondas dentro do grupo por escolha de uma

55/79 porção de marca distinta. Uma sonda contendo biotina dentro de um grupo pode ser detectada por meio de incubação subsequente com avidina conjugada à fosfatase alcalina (AP) ou peroxidase da raiz-forte (HRP) e um substrato adequado. O fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila e o nitro azul tetrazólio (NBT) servem como substratos para a fosfatase alcalina, enquanto o diaminobenzoato serve como um substrato para a HRP.

KIT [096]Proporciona-se também um kit. Em uma modalidade, o kit compreende (a) um conjunto de sondas que possibilita a diagnose do câncer da próstata em um paciente, onde o conjunto de sondas compreende uma sonda específica para um lócus para MYC, uma sonda específica para um lócus para o homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), uma sonda centromérica para o cromossomo 8, e uma sonda centromérica para o cromossomo 7, e (b) instruções para diagnosticar o câncer da próstata em um paciente, onde as instruções compreendem determinar, em uma amostra de células da próstata obtida do paciente, a presença de anormalidades cromossômicas. Uma % de ganho de MYC (a % de ganho é a % de células com MYC > 2 sinais) de mais do que 35 (com uma faixa de 2 a 50), uma % de perda de PTEN (a % de perda é a % de células com < 2 sinais) de mais do que 33 (com uma faixa de 29 a 33), uma % de ganho de cromossomo 8 (a % de ganho é a % de células com > 2 sinais) de mais do que 34 (com uma faixa de 32 a 34), e uma % de anormal para o cromossomo 7 (a % de anormal é a % de células com > 2 ou < 2 sinais) maior do que 28 (com uma faixa de 24 a 29), em uma amostra de células da próstata de uma região de interesse (ROI) de tumor ou uma ROI benigna da próstata do paciente, indicam que o paciente tem câncer da próstata. Em outra modalidade, o kit compreende (a) um conjunto de sondas que capacita a diagnose de câncer da próstata em um paciente e (b) instruções para detectar, diagnosticar, prognosticar, ou avaliar o tratamento terapêutico/profilático do câncer da próstata em um paciente.

56/79

Desse modo, o kit pode compreender (a) um conjunto de sondas que capacita a diagnose de câncer da próstata em um paciente, onde o conjunto de sondas compreende uma sonda específica para um lócus para MYC, uma sonda específica para um lócus para lipoproteína lipase (LPL), uma sonda específica para um lócus para PTEN, e uma sonda centromérica para o cromossomo 8 e (b) instruções para diagnosticar o câncer da próstata em um paciente, onde as instruções compreendem determinar, em uma amostra de células da próstata obtida do paciente, a presença de anormalidades cromossômicas. Uma % de ganho de MYC/LPL (a % de ganho é a % de células com MYC/LPL > 1) de mais do que 14 (com uma faixa de 12 a 22), uma % de anormal para o cromossomo 8 (a % de anormal é a % de células com > 2 ou < 2 sinais) de mais do que 34 (com uma faixa de 26 a 40), uma % de perda de PTEN (a % de perda é a % de células com < 2 sinais) de mais do que 44 (com uma faixa de 22 a 54), ou uma % de ganho de MYC/cromossomo 8 (a % de ganho é a % de células com MYC/cromossomo 8 > 1) maior do que 16 (com uma faixa de 10 a 18), em uma amostra de células da próstata de uma ROI de tumor da próstata do paciente, indica que o paciente tem câncer da próstata. Uma % de ganho de MYC/LPL de mais do que 18 (com uma faixa de 12 a 19), uma % de anormal para o cromossomo 8 de mais do que 32 (com uma faixa de 25 a 34), uma % de perda de PTEN de mais do que 26 (com uma faixa de 22 a 28), ou uma % de ganho de MYC/cromossomo 8 maior do que 16 (com uma faixa de 9 a 18), em uma amostra de células da próstata de uma ROI benigna da próstata do paciente, indica que o paciente tem câncer da próstata. O conjunto de sondas pode adicionalmente compreender uma ou mais de uma sonda específica para um lócus para p16 (9p21), fusões de TMPRSS2- ERG ou ETV1 (21q22; lócus 7p21), uma sonda centromérica para o cromossomo 3, uma sonda centromérica para o cromossomo 7, uma sonda centromérica para o cromossomo 10, e uma sonda centromérica para o cromossomo 17. O conjunto de sondas pode adicionalmente compreender uma ou mais de uma

57/79 sonda específica para um lócus para o inibidor da cinase dependente de ciclina p27Kip1 (4q43), uma sonda específica para um lócus para CDK2; 12q13), uma sonda específica para um lócus para ciclina E (CCNE1;19q12 e CCNE2; 8q22), uma sonda específica para um lócus para retinoblastoma 1 (Rb1; 13q14), uma sonda específica para um lócus para a homeossequência de NK3 1 (NKX3.1; 8p21.2), uma sonda específica para um lócus para o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR; 7p11), uma sonda específica para um lócus para a fosfoinositida-3-cinase (PI3K; 3q26), uma sonda específica para um lócus para a cinase AKT1 (Akt1; 14q32), uma sonda específica para um lócus para FKHR (FOXO1; 13q14.11), uma sonda específica para um lócus para o homólogo da proteína de ligação de p53 (MDM2; 12q14.3-12q15), uma sonda específica para um lócus para p53 (17p13.1), uma sonda específica para um lócus para o homólogo do oncogene viral de sarcoma de rato Kirsten v-Ki-ras2 (KRAS; 12p12.1), uma sonda específica para um lócus para o homólogo do oncogene viral de sarcoma murino v-raf B1 (BRAF; 7q34), uma sonda específica para um lócus para ciclina D1 (CCND1; 11q13), uma sonda específica para um lócus para CLL/linfoma 2 de células B (BCL2; 18q21.3/18q21.33), e uma sonda específica para um lócus para o receptor de androgênio (AR; Xq12). O kit pode adicionalmente compreender instruções para avaliar morfologicamente uma seção de uma próstata de um paciente e identificar pelo menos uma ROI de tumor, pelo menos uma ROI benigna, ou pelo menos uma ROI de tumor e pelo menos uma ROI benigna, antes de determinar a presença de anormalidades cromossômicas.

[097]Alternativamente, o kit pode adicionalmente compreender instruções para avaliar uma seção de uma próstata de um paciente por imunofluorescência e identificar a presença de uma ROI de tumor, antes de determinar a presença de anormalidades cromossômicas, em cujo caso o kit pode adicionalmente compreender um anticorpo anti-a-metilacil-CoA racemase (AMACR), que pode ser

58/79 marcado de modo detectável, e as instruções para avaliar uma seção de uma próstata de um paciente por imunofluorescência podem adicionalmente compreender contatar a seção com o anticorpo anti-AMACR marcado de modo detectável e detectar a superexpressão da AMACR, onde a superexpressão da AMACR em uma região da seção indica a presença de uma ROI de tumor. As instruções podem adicionalmente compreender tratar a seção com recuperação de epítopo induzida por calor, antes de avaliar a seção de uma próstata de um paciente por imunofluorescência. Tais kits podem adicionalmente compreender agentes de bloqueio ou outras sondas, diversas marcas ou agentes de marcação para facilitar a detecção das sondas, reagentes para a hibridização (p.ex., tampões), uma difusão da metáfase, e similares.

EXEMPLOS [098]Os exemplos a seguir servem para ilustrar a presente invenção. Os exemplos não são pretendidos para limitar de modo algum o escopo da invenção reivindicada.

EXEMPLO 1 [099]Este exemplo descreve a análise da amostra de próstata usando diversas combinações de sondas e a hibridização in situ fluorescente (FISH).

[0100]As amostras de prostatectomia radical de 16 pacientes com adenocarcinoma da próstata foram coletadas no Rush Medical Center, Chicago, IL. Dois conjuntos de lâminas fixadas em formalina, embutidas em parafina (FFPE) estavam disponíveis de nove pacientes: um conjunto contendo a área do tumor traçada por um patologista (região de interesse (ROI) de tumor) e o outro conjunto contendo uma área distante do tumor (ROI distante). As lâminas de 11 pacientes com hiperplasia prostática benigna (BPH) foram coletadas por ressecção transuretral da próstata (TURP) e usadas como controles.

[0101]As lâminas foram pré-tratadas por incubação em 1 x SSC (ácido cítrico a 15

59/79 mM e NaCI a 0,15 M) e digestão com pepsina subsequente. As lâminas foram hibridizadas por FISH multicor com os seguintes conjuntos de sondas: MYC, LPL, e sonda enumeradora de cromossomo (CEP) 8; PTEN, CEP10®, e CEP7®; fusões de TMPRSS2- ERG ou ETV1; e CEP3®, CEP7®, CEP17®, e p16. Foram avaliados diversos campos. Vinte e cinco a 50 células/amostra foram enumeradas quanto ao número de sinais fluorescentes para cada sonda no conjunto. Todos os padrões de rearranjo e alterações nos números de cópias foram observados e registrados para a sonda de desprendimento de TMPRSS2. As lâminas da ROI distante foram varridas para a maior parte dos padrões de sinais de FISH anormais, e os campos de visão contendo estes padrões e as regiões adjacentes foram enumerados.

[0102]A ROI de tumor nas amostras de prostatectomia radical continham anormalidades cromossômicas, incluindo amplificação/ganho de MYC, perda de LPL, perda de PTEN, rearranjo de TMPRSS2, e aneusomia. Foram também observadas anormalidades cromossômicas significativas nas lâminas benignas contendo ROI distante. Os resultados da enumeração foram analisados para determinar um corte para cada sonda individual ou para um classificador derivado, tal como uma razão de duas sondas, que melhor diferenciaria os padrões de anormalidades associadas com o câncer dos padrões em tecido aparentemente benigno nas amostras de BPH. O corte foi baseado na porcentagem de células contendo uma anormalidade genômica. Um corte fixo de uma contagem de sinal menor do que a contagem de sinal média benigna menos 3 desvios padrões foi usado para estabelecer uma perda, enquanto um corte fixo de uma contagem de sinal maior do que a contagem de sinal média benigna mais três desvios padrões foi usado para estabelecer um ganho. O corte para o rearranjo de TMPRSS2 era maior do que cerca de 20% das células dentro da região avaliada contendo o rearranjo. Com base nos cortes fixos, um ganho de MYC e a aneusomia foram verificados em 15/16 ROI de tumor e o rearranjo de TMPRSS2 foi verificado em 11/16 ROI de

60/79 tumor, enquanto um ganho de MYC e a aneusomia foram verificadas em 2/9 ROI distante e o rearranjo de TMPRSS2 foi verificado em 5/9 ROI distante. Os resultados da análise adicionalmente demonstraram que a detecção de diversas anormalidades cromossômicas nos cortes selecionados era altamente específica para as amostras de pacientes com adenocarcinoma.

EXEMPLO 2 [0103]Este exemplo descreve a análise das amostras de próstata com a FISH, usando diversas combinações de sondas.

[0104]Foi usado um total de seis sondas para a avaliação. Estas seis sondas consistiam em três sondas centroméricas (CEP®) para os cromossomos 7, 8, e 10, bem como três sondas identificadoras específicas para um lócus (LSI^®) (MYC (8q24), LPL (8p21-22), e PTEN (10q23)). A seleção das sondas foi baseada na revisão da literatura que revelou aberrações frequentes no câncer da próstata (Bova e col., Cancer Res. 53: 3869-3873 (1993); Kagan e col., Oncogene 11: 2121-2126 (1995); Emmert-Buck e col., Cancer Res. 55: 2959-2962 (1995); Yoshimoto e col. (2007), supra; e Kazunari e col., J. Nat'l Cancer Inst. 9(18): 1574-1580 (1999)). As sondas LSI^® e CEP^® foram obtidas da Vysis/Abbott Molecular, Inc. (Des Plaines, IL). As sondas incluídas para a avaliação subsequente foram combinadas em dois grupos de sondas. O primeiro conjunto de sondas era ProVysion^®, que consistia em MYC 8q24 (SpectrumGreen^®), LPL 8p21-22 (SpectrumOrange^®), e CEP8^® (SpectrumAqua^®). O segundo conjunto de sondas (grupo de PTEN) incluiu PTEN (SpectrumOrange®), CEP7® (SpectrumAqua), e CEP10® (SpectrumGreen).

[0105]Trinta e três amostras de prostatectomia radical (RP) de pacientes com adenocarcinoma da próstata foram obtidas da Rush University Medical Center, Chicago, IL. Para cada amostra, uma seção do tecido de 4-6 um foi traçada por um patologista para marcar a(s) região(ões) de tumor. Para 17 dos 33 casos de RP, uma segunda seção estava disponível com somente tecido histologicamente

61/79 benigno. Vinte e seis amostras de hiperplasia prostática benigna (BPH) serviram como controles (Nakayama e col., J. Cell Biochem. 91(3): 540-552 (2004)). Os sinais da FISH para cada uma das 6 sondas foram enumerados em 50-100 células por seção.

[0106]Para cada amostra, uma seção do tecido de 5 pm foi traçada por um patologista para marcar a(s) região(ões) do tumor, se presente(s). As lâminas das seções dos tecidos FFPE foram cozidas a 56°C, por 2 -24 horas, pré-tratadas três vezes em Hemo-De (Scientific Safety Solvents) por 5 minutos cada, na temperatura ambiente, enxaguadas duas vezes em 100% de etanol por um minuto cada, na temperatura ambiente, incubadas em 45% de ácido fórmico/0,3% de peróxido de hidrogênio por 15 minutos, na temperatura ambiente, e então enxaguadas em água deionizada por três minutos. As lâminas foram então incubadas na solução de prétratamento (1XSSC, pH 6,3), a 80°C, por 35 minutos, enxaguadas por três minutos em água deionizada, incubadas por 22 minutos em 0,15% de pepsina em solução de HCl a 0,1 N, a 37C, e enxaguadas novamente por três minutos em água deionizada. As lâminas foram desidratadas por 1 minuto cada em 70%, 85%, e 100% de etanol e então secadas ao ar. Dez microlitros de cada mistura de hibridização de sonda respectiva (tampão LSI^®, DNA de bloqueio, e sondas marcadas) foram adicionados às amostras, e uma lamínula foi aplicada e vedada com cola de borracha. As lâminas foram desnaturadas em conjunto por cinco minutos, a 73°C, e hibridizadas por 16-24 horas, a 37°C, sobre um ThermoBrite (Vysis/Abbott Molecular, Inc.). Após a hibridização, as lamínulas foram removidas, e as lâminas foram lavadas em 2X SSC/0,3% de NP-40, a 73°C, por dois minutos, e subsequentemente em 2X SSC/0,1% de NP-40 por um minuto, na temperatura ambiente. Dez microlitros de contracorante de DAPI I foram colocados sobre a lâmina, e uma lamínula foi aplicada.

[0107]Após a hibridização, a enumeração do sinal da FISH foi efetuada. Cada

62/79 amostra foi analisada sob microscópio com fluorescência, usando filtros individuais de banda passante (Abbott Molecular, Des Plaines, IL) específicos para DAPI (4,6diamidino-2-fenilindol), SpectrumOrange®, SpectrumGreen®, e SpectrumAqua®. O número de sinais da FISH para cada sonda foi registrado em um mínimo de 50 núcleos da interfase intactos, não sobrepostos, consecutivos (tais como os núcleos de cerca de 50-100 células) nas áreas de interesse, que foram identificadas por tingimento com DAPI dos núcleos com referência ao tecido tingido com H&D correspondente. Os parâmetros de anormalidade considerados para cada sonda foram como se segue: Ganho: [Contagem do Sinal] > 2, Perda: [Contagem do Sinal] <2, e Anormal: [Contagem do Sinal] > 2 ou <2. Os cortes fixos foram calculados como a média da % de contagens de células anormais em 26 amostras com BPH + 3 D.P.. A anormalidade da amostra foi definida como a % de células anormais > corte.

[0108]Os sinais anormais da FISH foram observados sobre as lâminas para MYC, LPL, CEP8^®, PTEN, CEP10^® e CEP7^®. As anormalidades cromossômicas para a amplificação/ganho de MYC, perda de LPL e PTEN, e aneusomia não somente foram observadas nas regiões de interesse (ROIs) de tumor das amostras da prostatectomia radical, como também em algumas das ROIs benignas. A Tabela 1 mostra o resumo dos dados de enumeração. Vinte e duas das 33 amostras tinham anormalidades que foram detectadas com o conjunto de sondas ProVysion^® (66,7%), e 20 das 33 amostras tinham anormalidades que foram detectadas com o conjunto de sondas para PTEN (60,6%). A anormalidade total detectada para a ROI de tumor com o conjunto de sondas ProVysion®+PTEN foi 23/33, que é 69,7%. De modo mais importante, um número significativo de anormalidades cromossômicas foi observado em 8 das 17 lâminas (8/17=47,1%; 4/17=23,5% para ProVysion®; 6/17=35,3% para o conjunto de sondas para PTEN) contendo ROI distante (ROI distante) de um tumor (Tabela 1). O ganho e a perda do Cromossomo 8 foram

63/79 observados simultaneamente em uma amostra entre a maior parte dos casos de câncer da próstata analisados.

TABELA 1. ANORMALIDADES CROMOSSÔMICAS A PARTIR DOS DADOS DE ENUMERAÇÃO DA FISH_____________________________

Número da Amostra	ROI de Tumor (33)	ROI Distante (17 de 33)
ProVysion®	Conjunto para PTEN	ProVysion®	Conjunto para PTEN
01	POS	POS	POS	POS
02	NEG	NEG	NEG	NEG
03	POS	POS	NA
04	NEG	NEG	NA
05	POS	POS	NEG	NEG
06	NEG	NEG	NA
07	NEG	NEG	NEG	NEG
08	NEG	NEG	NA
09	POS	NEG	NA
10	POS	POS	NA
11	NEG	NEG	NEG	NEG
12	NEG	NEG	NEG	NEG
13	POS	POS	NEG	NEG
14	POS	NEG	NEG	NEG
15	NEG	NEG	NEG	NEG
16	NEG	NEG	NA
17	POS	POS	NA

64/79

18	POS	POS	POS	NEG
19	POS	POS	NA
20	NEG	NEG	POS	NEG
21	NEG	POS	NA
22	POS	POS	NEG	NEG
23	POS	POS	NA
24	POS	NEG	NA
25	POS	POS	NEG	POS
26	POS	POS	NA
27	POS	POS	NEG	POS
28	POS	POS	NA
29	POS	POS	NEG	POS
30	POS	POS	NA
31	POS	POS	NA
32	POS	POS	POS	POS
33	POS	POS	NEG	POS

POS=positivo

NEG=negativo [0109]Os resultados da enumeração foram adicionalmente analisados por Característica de Operação do Receptor (curva ROC) usando SAS versão 8.2 (SCA no. S05020002). Para selecionar as sondas e determinar um algoritmo ideal de análise da FISH que produza as maiores sensibilidade e especificidade, os seguintes parâmetros foram considerados para cada sonda:

• % de Ganho, porcentagem de células com > 2 sinais, • % de Perda, porcentagem de células com < 2 sinais,

65/79 • % de Anormal, porcentagem de células com > 2 ou < 2 sinais, e • Para as razões de 2 sondas (sonda A/ sonda B), a % de Ganho foi a porcentagem de células com razão de A/B > 1, a % de Perda foi a porcentagem de células com razão de A/B < 1.

[0110]Uma combinação de parâmetros de % de Ganho de MYC/LPL, % de Perda de PTEN, % de Ganho de MYC/CEP8® e % de anormal para CEP8®, dentro das regiões de tumor traçadas, identificou adenocarcinoma em 97,1% (33/34) das amostras de RP, com uma especificidade de 96,2% (25/26) em relação à BPH (χ2 p< 0,001). Quando detectadas em regiões de histologia normal, estas anormalidades correlacionaram-se com o adenocarcinoma em 82,4% (14/17 amostras de RP, χ2 p< 0,001 em relação à BPH). A Tabela 2 é o Resumo da Análise por ROC da AUC (Área Sob a Curva), melhores especificidade e sensibilidade para cada sonda e combinação de sondas.

TABELA 2. ANÁLISE POR ROC

Sondas e Anormalidades	ROI de tumor	ROI benigna
AUC	Espec	Sens	AUC	Espec	Sens
% de Ganho de MYC/LPL OU CEP8 % de Anorm. OU % de Perda de PTEN OU % de Ganho de MYC/CEP8	0,98	96,2	97,1	0,85	82,4	80,8
% de Ganho de CEP7/CEP10	0,68	69,2	58,8	0,62	84,6	47,1
% de Ganho de MYC/CEP8	0,91	88,5	76,5	0,48	61,5	70,6
% de Perda de LPL/CEP8	0,85	84,6	82,4	0,60	84,6	47,1
% de Perda de PTEN/CEP10 * +	0,881	80,8	82,4	0,788	80,8	64,7
% de Ganho de MYC/LPL	0,90	96,2	79,4	0,69	80,8	58,8
% de Anorm. para CEP7 * +	0,896	80,8	88,2	0,845	80,8	76,5
% de Anorm. para CEP8 +	0,966	88,5	94,1	0,752	76,9	64,7
% de Anorm. para CEP10 +	0,865	80,8	79,4	0,775	73,1	76,5
% de Ganho de MYC * +	0,908	76,9	91,2	0,846	76,9	82,4
% de Anorm. para LPL +	0,945	92,3	79,4	0,736	76,9	64,7
% de Perda de PTEN * +	0,726	80,8	58,8	0,827	80,8	70,6
% de Ganho de CEP7 +	0,886	84,6	85,3	0,77	76,9	70,6

66/79

% de Ganho de CEP8 * +	0,853	76,9	79,4	0,871	76,9	82,4
% de Ganho de CEP10 +	0,93	84,6	94,1	0,786	84,6	76,5

AUC=área sob a curva

Espec=especificidade

Sens=sensibilidade [0111]Nós também usamos outro método para analisar o conjunto de dados que é primeiramente examinar as sondas da FISH importantes potenciais comparando-se diferentes grupos de amostras (ROI de tumor vs. BPH, e ROI benigna vs. BPH), usando o teste t de duas amostras. Os parâmetros da FISH com valores de p significativos (valor de p < 0,05) a partir do teste t foram selecionados para exame adicional.

[0112]Foram avaliados dezesseis parâmetros derivados do número de cópias genômicas detectado por FISH. Estes parâmetros eram % de Anormal para CEP10, % de Ganho de CEP10, % de Anormal para CEP7, % de Ganho de CEP7, % de Anormal para CEP8, % de Ganho de CEP8, % de Perda de CEP8, % de Ganho de MYC, % de Anormal para LPL, % de Perda de LPL, % de Perda de PTEN, % de Perda de PTEN/CEP10, % de Ganho de CEP7/CEP10, % de Perda de LPL/CEP8, % de Ganho de MYC/CEP8 e % de Ganho de MYC/LPL. Os resultados das análises do teste t demonstraram que para todos os 16 parâmetros da FISH, os seus valores médios eram estatisticamente diferentes entre os grupos de tumor e BPH (Tabela 3).

TABELA 3. TESTE t COMPARANDO O TUMOR E A BPH

Parâmetros da FISH	Tumor Média (DP)	BPH Média (DP)	valor de p
% de Anorm. para CEP10	40,03(16,9)	22,92(8,14)	<0,0001
% de Ganho de CEP10	17,21(20,49)	2,31(4,72)	0,0002
% de Anorm. para CEP7	37,83(16,99)	19,46(6,44)	<0,0001
% de Ganho de CEP7	15,87(22,22)	1,54(3,93)	0,0008
% de Anorm. para CEP8	47,55(16,02)	23(6,02)	<0,0001
% de Ganho de CEP8	19,97(23,73)	1,54(2,42)	<0,0001

67/79

% de Perda de CEP8	27,58(15,33)	21,46(5,78)	0,0383
% de Ganho de MYC	25,61(29,13)	1,85(2,71)	<0,0001
% de Anorm. para LPL	57,45(22,86)	22,69(8,58)	<0,0001
% de Perda de LPL	46,95(25,91)	21,62(8,69)	<0,0001
% de Perda de PTEN	35,38(23,37)	20,92(8,6)	0,0018
% de Perda de PTEN/CEP10	25,54(21,41)	7,85(4,86)	<0,0001
% de Ganho de CEP7/CEP10	19,72(13,49)	12,15(5,36)	0,0047
% de Perda de LPL/CEP8	35,89(28,69)	8,08(4,18)	<0,0001
% de Ganho de MYC/CEP8	26,12(20,53)	7,77(4,25)	<0,0001
% de Ganho de MYC/LPL	37,52(26,36)	8,08(4,75)	<0,0001

[0113]Os resultados do teste t dos dados de ROI benigna e BPH mostram que 10/16 parâmetros, como mostrados na Tabela 4, são estatisticamente diferentes do efeito de campo. Estes dez parâmetros da FISH eram % de Anormal para CEP10, % de Ganho de CEP10, % de Anormal para CEP7, % de Ganho de CEP7, % de Anormal para CEP8, % de Ganho de CEP8, % de Ganho de MYC, % de Anormal para LPL, % de Perda de PTEN, e % de Perda de PTEN/CEP10.

TABELA 4. TESTE t COMPARANDO E	ENIGNA E B	PH
Parâmetros da FISH	Benigna- Média (DP)	BPH- Média (DP)	valor de p	Indicador
% de Anorm. para CEP10	31,41(9,91)	22,92(8,14)	0,0038	Significativo
% de Ganho de CEP10	5,25(4,44)	2,31(4,72)	0,0469	Significativo
% de Anorm. para CEP7	29,82(8,57)	19,46(6,44)	<0,0001	Significativo
% de Ganho de CEP7	6,39(6,81)	1,54(3,93)	0,0139	Significativo
% de Anorm. para CEP8	31,37(12,92)	23(6,02)	0,0210	Significativo
% de Ganho de CEP8	7,93(6,93)	1,54(2,42)	0,0017	Significativo
% de Perda de CEP8	23,44(13)	21,46(5,78)	0,5611
% de Ganho de MYC	9,38(8,31)	1,85(2,71)	0,0019	Significativo
% de Anorm. para LPL	32,15(12,45)	22,69(8,58)	0,0052	Significativo
% de Perda de LPL	24,63(11,4)	21,62(8,69)	0,3312
% de Perda de PTEN	34,29(16,86)	20,92(8,6)	0,0064	Significativo

68/79

% de Perda de PTEN/CEP10	17,71(16,47)	7,85(4,86)	0,0275	Significativo
% de Ganho de CEP7/CEP10	16,65(10,26)	12,15(5,36)	0,1105
% de Perda de LPL/CEP8	11,73(9,45)	8,08(4,18)	0,1487
% de Ganho de MYC/CEP8	13,44(12,84)	7,77(4,25)	0,0951
% de Ganho de MYC/LPL	13,97(11,64)	8,08(4,75)	0,0618

[0114]Os dez parâmetros da FISH, que mostraram diferença significativa entre os grupos de BPH e ROI de tumor ou benigna, com base no teste t de duas amostras, foram selecionados para mais avaliação. O método de ROC foi aplicado para identificar o valor de corte ideal para estes parâmetros da FISH. A Tabela 5 resume a sensibilidade, a especificidade, e a AUC para cada um destes dez parâmetros da FISH em diferenciar a ROI de tumor da BPH, bem como em diferenciar a ROI benigna da BPH. Os cinco parâmetros individuais da FISH principais foram selecionados com base em seus valores de AUC em diferenciar as amostras de ROI benigna vs. BPH para o efeito de campo. Eles eram % de Perda de PTEN/CEP10, % de Perda de PTEN, % de Anormal para CEP7, % de Ganho de MYC e % de Ganho de CEP8, conforme mostrado na Tabela 5.

TABELA 5. SELEÇÃO DOS CINCO PARÂMETROS INDIVIDUAIS DA FISH

PRINCIPAIS

Parâmetros da FISH	Tumor - BPH	Benigna - BPH
Sensibilidade	Especificidade	AUC	Sensibilidade	Especificidade	AUC
% de Ganho de CEP8	0,794	0,769	0,853	0,824	0,769	0,871
% de Ganho de MYC	0,912	0,769	0,908	0,824	0,769	0,846
% de Anorm. para CEP7	0,882	0,808	0,896	0,765	0,808	0,845
% de Perda de PTEN	0,588	0,808	0,726	0,706	0,808	0,827
% de Perda de PTEN/CEP10	0,824	0,808	0,881	0,647	0,808	0,788
% de Ganho de CEP10	0,941	0,846	0,93	0,765	0,846	0,786
% de Anorm. para CEP10	0,794	0,808	0,865	0,765	0,731	0,775
% de Ganho de CEP7	0,853	0,846	0,886	0,706	0,769	0,77
% de Anorm. para CEP8	0,941	0,885	0,966	0,647	0,769	0,752
% de Anorm. para LPL	0,794	0,923	0,945	0,647	0,769	0,736

69/79 [0115]Os cinco parâmetros das sondas individuais principais foram agrupados em todas as combinações possíveis de grupos de quatro sondas, e então analisados por Característica de Operação do Receptor (curva ROC) usando SAS, com cortes variando de 5% a 35% por 1% nas amostras benignas para os valores de corte, a AUC, bem como o DFI mínimo. Para as combinações de múltiplas sondas, os cortes variados independentemente para cada parâmetro geram um campo de pontos sobre o gráfico, e os pontos com o valor de sensibilidade mais alto em cada valor de especificidade são usados para definir a curva ROC. Embora métodos estatísticos fossem usados para gerar combinações e valores de cortes possíveis, foi usada a avaliação científica para avaliar as diversas alternativas para resultar na decisão final de valores de cortes e combinações de sondas.

[0116]A análise na Tabela 6 mostrou que o conjunto de sondas 3 tem a maior AUC de 0,938, enquanto a AUC do conjunto de sondas 1 é a segunda maior de 0,917 com o menor DFI, e as melhores sensibilidade e especificidade. O conjunto de sondas 3 tem somente uma sonda LSI, a saber PTEN, enquanto o conjunto de sondas 1 tem duas sondas LSI, a saber PTEN e MYC. As sondas CEP são usadas para detectar a aneusomia, enquanto as sondas LSI são, em geral, usadas para detectar a remoção, a duplicação, ou a amplificação de genes específicos. Com base nesta análise, foi selecionado o conjunto de sondas 1, incluindo % de perda de PTEN, % de Anorm. para CEP7, % de ganho de MYC, e % de Ganho de CEP8. A sensibilidade e a especificidade correspondentes do conjunto de sondas 1 são 0,882 e 0,846, respectivamente.

TABELA 6. ANÁLISE POR ROC DAS COMBINAÇÕES DE QUATRO

SONDAS A PARTIR DOS CINCO PARÂMETROS DA FISH INDIVIDUAIS

PRINCIPAIS

Sondas	Combinação de Sondas	Corte 1	Corte 2	Corte 3	Corte 4	DFI	Sens.	Espec.	AUC
Conjunto de Sondas 1	% de Perda de PTEN, % de Anorm. para CEP7, % de Ganho de MYC, % de Ganho de CEP8	33	28	35	34	0,194	0,882	0,846	0,917

70/79

Conjunto de Sondas 2	% de Perda de PTEN/CEP10, % de Anorm. para CEP7, % de Ganho de	35	25	35	N/A	0,261	0,824	0,808	0,911
Conjunto de Sondas 3	% de Perda de PTEN/CEP10, % de Anorm. para CEP7, % de Ganho de CEP8	35	25	34	N/A	0,225	0,882	0,808	0,938
Conjunto de Sondas 4	% de Perda de PTEN/CEP10, % de Ganho de MYC, % de Ganho de C.EP8	35	5	35	N/A	0,371	0,647	0,885	0,834

[0117]As curvas ROC para a melhor combinação de quatro sondas e os quatro parâmetros da FISH individuais, incluindo a % de perda de PTEN, a % de Anorm. para CEP7, a % de ganho de MYC, a % de Ganho de CEP8, são mostradas na Figura 4. Os dados são obtidos a partir da avaliação por FISH das 17 amostras de ROI benigna e 26 de RPH. O cálculo da combinação de quatro sondas das 33 amostras de ROI de tumor e 26 de BPH é também mostrado sobre o gráfico de ROC. As AUCs das curvas ROC são mostradas na tabela sob o gráfico de ROC.

[0118]A Tabela 7 foi o resumo do desempenho da combinação de 4 sondas. Os valores de corte para quatro parâmetros das sondas individuais foram % de perda de PTEN > 33, % de Anormal para CEP7 > 28, % de ganho de MYC > 35, e % de Ganho de CEP8 > 34. A sensibilidade da combinação de 4 sondas foi 100% e a especificidade foi 84,6% para ROI de tumor vs. BPH. Embora comparando ROI benigna com BPH, a combinação de sondas produziu uma sensibilidade de 88,2% e uma especificidade de 84,6%.

TABELA 7. RESUMO DA COMBINAÇÃO DE QUATRO SONDAS COM

CORTES

Parâmetro da FISH	Tumor BPH**	Benigna BPH**
Sensibilidade	Especificidade	AUC	Sensibilidade	Especificidade	AUC
Combinação *	1,000	0,846	0,960	0,882	0,846	0,917

*Combinação: % de Perda de PTEN, % de Anorm. para CEP7, % de Ganho de MYC, % de Ganho de CEP8 **Corte 1 % de Perda de PTEN 33; Corte 2 % de Anorm. para CEP7 28;

Corte 3 % de Ganho de MYC 35; Corte 4 % de Ganho de CEP8 34 [0119]A análise da ROC mostrada na Figura 5 adicionalmente definiu a faixa de cortes para cada parâmetro da FISH individual do conjunto de sondas selecionado.

71/79 [0120]Comparando-se ao teste de PSA, a sensibilidade para os pacientes com um nível de PSA no soro acima de 4,0 ng/mL é cerca de 20% na série atual, e a especificidade do teste de PSA é aproximadamente 60% a 70% (Prostate-Specific Antigen Best Practice Statement, 2009 Update, American Urological Association). Com o teste de FISH, usando o grupo de 4 sondas selecionado neste estudo, foram atingidos 100% de sensibilidade e 84,6% de especificidade para as amostras de tumor. Desse modo, o ensaio de FISH tem o potencial de superar em desempenho o teste de PSA. Com alta sensibilidade, um resultado negativo pode excluir a possibilidade de câncer, e a biopsia adicional pode ser evitada. Além disso, o PSA tem capacidade de diferenciação mais insatisfatória nos homens com BPH sintomática (Meigs e col., J. Gen. Intern. Med. 11: 505 (1996)), enquanto o ensaio de FISH descrito neste documento tem o potencial de detectar ROIs benignas, com base no efeito de campo, com uma sensibilidade de 88,2% e uma especificidade de 84,6%.

[0121]Outro ensaio usado para a diagnose do câncer da próstata é o teste de PCA3 (Vlaeminck- Guillem e col., Urology 75: 447 (2010)). Em quatro estudos que avaliaram os pacientes com PSA indeterminado (2,5 a 10,0 ng/mL), a sensibilidade variou de 53 a 84 por cento e a especificidade variou de 71 a 80 por cento. Em três estudos com pelo menos 200 pacientes que proporcionaram dados sobre o desempenho do PCA3 após uma biopsia negativa prévia, a sensibilidade variou de 47 a 58 por cento, e a especificidade variou de 71 a 72 por cento. Embora o PCA3 tenha melhor desempenho do que o PSA em prognosticar independentemente uma biopsia positiva, o desempenho do ensaio de FISH de quatro sondas descrito neste documento é melhor que ambos os testes de PSA e PCA3, com 100% de sensibilidade e 84,6% de especificidade para as amostras de tumor, e 88,2% de sensibilidade e 84,6% de especificidade para as ROIs benignas.

[0122]Além do acima mencionado, o ensaio de FISH também pode ser usado

72/79 sobre as células de amostras congeladas ou amostras de citologia. A avaliação inclui a detecção do sinal por meio de microscopia ou aquisição de imagens, enumeração do sinal, e algoritmos de análises dos dados subsequentes. O ensaio de FISH utiliza DNA estável para a detecção de grandes alterações cromossômicas (remoção, amplificação, aneusomia, e translocação), permite que a avaliação molecular seja combinada com a morfologia do tecido, pode detectar anormalidades raras em cânceres multifocais e heterogêneos, pode detectar a presença de câncer em uma amostra da biopsia que não contém tumor verdadeiro, como acessado por avaliação histológica, pode ser usado como um teste independente ou como um teste adjunto ou outro teste (p.ex., histologia, PSA, nomograma, metilação, e mutação) e, por combinação das sondas, possibilita que um aumento na sensibilidade e na especificidade seja obtido em comparação com um ensaio de um único analito.

[0123]O método pode auxiliar a avaliação do tecido histológico em distinguir o câncer das condições benignas difíceis (BPH), em distinguir o tecido benigno das lesões pré-cancerosas, e pode auxiliar na diagnose do adenocarcinoma em amostras de biopsia, ressecção transuretral (TURP), ou cirúrgicas (prostatectomia radical).

[0124]Neste estudo com um grupo de amostras de RP, foram observadas anormalidades cromossômicas dentro das regiões de tumor, bem como dentro das regiões de histologia normal se estendendo para além do tumor histologicamente evidente, o que confirmou o efeito de cancerização de campo do câncer da próstata. A detecção por FISH da cancerização de campo pode reduzir a área de amostragem da biopsia diagnóstica, descobrindo-se anormalidades cromossômicas nas células de campo, sem considerar um câncer existente que não foi percebido pela biopsia. Portanto, um teste molecular baseado em FISH para medir MYC, CEP8, PTEN, e CEP7 pode permitir a detecção de câncer de outro modo não percebido pelo exame histopatológico e, desse modo, aperfeiçoar a diagnose do câncer da próstata por

73/79 redução do erro de amostragem das biopsias da próstata com agulha.

EXEMPLO 3 [0125]Este exemplo descreve a análise da amostra de próstata com imunofluorescência (IF) e FISH, usando diversas combinações de sondas.

[0126]As mesmas lâminas de tecido de tumor sólido da próstata FFPE (Korac e col., J. Clin. Pathol. 58: 1336-1338 (2005)) foram analisadas por imunofluorescência e FISH. Um protocolo de pré-tratamento da amostra/recuperação do antígeno foi desenvolvido e otimizado para melhores resultados sobre o tecido FFPE.

[0127]A primeira etapa deste procedimento foi a recuperação do epítopo induzida por calor (HIER). As lâminas FFPE foram tratadas com Hemo-De (Scientific Safety Solvents, Keller, TX) por 10 minutos, D-limoneno por 10 minutos, duas vezes com 100% de etanol por dois minutos, 85% de etanol por dois minutos, 70% de etanol por dois minutos, 50% de etanol por dois minutos, 30% de etanol por dois minutos, e água por cinco minutos. Depois, as lâminas foram aquecidas em tampão de citrato de sódio, pH 6,0, a 100 °C, por 30 minutos, esfriad as em tampão de citrato de sódio, pH 6,0, por 20 minutos, embebidas em água por 5 minutos, e então embebidas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por cinco minutos.

[0128]A segunda etapa foi a IF usando um anticorpo anti-a-metilacil-CoA racemase (AMACR) (Zhong e col., Am. J. Clin. Pathol. 123: 231-236 (2005)) e o Ensaio de Amplificação do Sinal de Tiramida (Sokolova e col., J. Molec. Diag. 9(5): 604-611 (2007)). O kit de Ensaio de Solução de Tiramida e o kit de TSA® (amplificação do sinal de tiramida) Alexa Fluor 488 número 2 com a peroxidase da raiz-forte (HRP) (no. do catálogo T20912; Invitrogen, Carlsbad, CA; Molecular Probes, Eugene, OR) foram usados de acordo com as instruções do fabricante. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada por incubação em 3% de H2O2 por 30 minutos, na temperatura ambiente. O reagente de bloqueio (100 pL/lâmina) foi adicionado, e as lâminas foram incubadas em uma caixa umidificada por 30 minutos,

74/79 na temperatura ambiente. O anticorpo anti-AMACR diluído (100 pL; coelho; P504S; clone 13H4; Sigma, St. Louis, MO) (diluído em 1% de reagente de bloqueio a 1:100) foi adicionado, e as lâminas foram incubadas por uma hora, na temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas três vezes, por cinco minutos, em PBS/0,1% de Tween 20. A solução de conjugado de HRP de estoque foi diluída a 1:100 em 1% de solução de bloqueio. Um volume de 100 uL desta solução de trabalho foi suficiente para cobrir uma lamínula de 22 x 22 mm padrão. As lâminas foram incubadas por 30 minutos na temperatura ambiente, lavadas três vezes, por cinco minutos, em PBS/0,1% de Tween 20, e lavadas uma vez em PBS. A solução de tiramida (100 uL por lâmina) foi adicionada a cada lâmina, e a lâmina foi incubada por 10 minutos, na temperatura ambiente, no escuro. As lâminas foram lavadas por cinco minutos em PBS e então lavadas por cinco minutos em água da Milli-Q.

[0129]A terceira etapa foi a FISH. As lâminas foram desidratadas em álcool (70%, 85% e 100%, um minuto cada), e deixadas secar ao ar completamente. A solução de sonda (10 pL) foi adicionada a cada lâmina, e uma lamínula foi vedada sobre a lâmina com cola de borracha. A sonda e o DNA-alvo foram desnaturados em conjunto, a 73°C, por cinco minutos, e hibridizados com as lâminas durante a noite, a 37°C. As lamínulas foram removidas embebendo-se em 2XSSC/0,1% de NP-40, na temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas em 2XSSC/0,3% de NP-40, a 73°C, por 2 minutos, 2XSSC/0,1% de NP-40 na temperatura ambiente, por um minuto, e então água, e deixadas secar ao ar completamente, no escuro. As lâminas foram contratingidas com DAPI.

[0130]Usando a IF mediada por Tiramida com o anticorpo anti-AMACR em combinação com as sondas da FISH PTEN (SpectrumOrange^®) e CEP7^® (SpectrumAqua^®), sete amostras foram processadas e avaliadas. A AMACR é um marcador específico para as células de câncer. Ela é consistentemente superexpressa no epitélio do câncer da próstata. A sua expressão é também

75/79 aumentada em lesões pré-malignas (neoplasia intraepitelial prostática) (Zhong e col. (2005, supra). A coloração da AMACR é fortemente positiva na ROI de tumor, indicando que a proteína AMACR é superexpressa. A maior parte das células desta região somente tem um alelo de PTEN pelo ensaio de FISH, indicando uma remoção de PTEN, e dois alelos de CEP 7, indicando que o cromossomo 7 está intacto. Os resultados da análise das sete amostras são mostrados na Tabela 8. A tabela mostra que 12 das 14 áreas (12/14 = 85,7%) de sete amostras da coloração da IF (AMACR positiva + ou negativa -) correlacionaram-se com as anormalidades do sinal da FISH das sondas testadas, bem como a avaliação morfológica do tumor por um patologista treinado. No câncer da próstata heterogêneo e multifocal, a coloração do anticorpo para AMACR identificou áreas de interesse para a avaliação por FISH.

TABELA 8. ANÁLISE DA IMUNOFLUORESCÊNCIA E DA FISH

Amostra	Tipo de Lâmina	Situação da AMACR	FISH (PTEN ou CEP7)
23	Área de tumor (traçada dentro)	+	Anormal
+	Normal
-	Normal
01	Benigna	-	Normal
+	Anormal
15	Tumor	-	Normal
03	Tumor	+	Anormal
25	Tumor (área traçada dentro)	+	Anormal
-	Normal
Tumor (área traçada fora)	+	Anormal
-	Normal
10	Tumor (área traçada dentro)	+	Anormal
Tumor (área traçada fora)	+	Anormal
18	Tumor	+	Normal

EXEMPLO 4 [0131]Este exemplo descreve um método de pré-tratamento e hibridização de amostra histológica para o câncer da próstata.

[0132]As lâminas com as amostras histológicas FFPE (fixadas em formalina, embutidas em parafina) (seções) foram cozidas a 56°C, por 2-24 h, então foram prétratadas duas a três vezes em Hemo-De (Scientific Safety Solvents) ou Xilina, por 5 a 10 minutos cada, na temperatura ambiente, seguido por dois enxágues de 1

76/79 minuto em 100% de etanol, na temperatura ambiente, incubação em ácido fórmico a 45%/peróxido de hidrogênio a 0,3%, por 15 minutos, na temperatura ambiente, e então um enxágue em água deionizada por 3 - 10 minutos. As lâminas foram então incubadas na solução de pré-tratamento (1 X SSC, pH 6,3) a 80 +/- 5°C, por 35-50 minutos, enxaguadas por 3 minutos em água deionizada, incubadas 22 +/- 5 minutos em 0,15% de pepsina em solução de HCl a 0,1 N, a 37°C, e enxaguadas novamente por 3 minutos em água deionizada. As lâminas foram desidratadas por 1 minuto cada em 70%, 85%, e 100% de etanol e então secadas ao ar. Dez microlitros de cada mistura de hibridização de sondas respectiva (tampão LSI^®, DNA de bloqueio, sondas marcadas) foram adicionados às amostras, e uma lamínula foi aplicada e vedada com cola de borracha. As lâminas foram desnaturadas em conjunto por 5 minutos, a 73 +/- 2°C, e hibridizadas por 10-24 horas, a 37°C, sobre um ThermoBrite (Vysis/Abbott Molecular, Inc.). Após a hibridização, as lamínulas foram removidas. A amostra foi colocada em uma solução de lavagem consistindo em 0,3x - 2x SSC e 0,3% -0.5% de NP-40, e a temperatura da amostra foi elevada para cerca de 73°C, por cerca de 2-5 minutos. Então o suporte carregando a amostra foi contratingido com um corante de ligação ao DNA nuclear, tal como o 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), em solução, ou ao secar a amostra no escuro. Neste caso, a amostra foi contratingida com cerca de 10 pL de DAPI, e uma nova lamínula foi colocada sobre a amostra. A amostra foi então vista ou armazenada, p.ex., em torno de -20°C.

EXEMPLO 5 [0133]Este exemplo descreve um método de procedimento de IF-FISH em lâminas FFPE da próstata.

[0134]Para o ensaio de FISH e Imunofluorescência (IF) simultâneas sobre as mesmas lâminas de tecido de tumor sólido da próstata FFPE, um protocolo de prétratamento da amostra/recuperação do antígeno foi desenvolvido e otimizado para melhores resultados sobre o tecido FFPE para IF-FISH.

77/79 [0135]A primeira etapa deste procedimento é a recuperação do antígeno. As lâminas FFPE de câncer da próstata foram cozidas a 56°C, por duas horas até da noite para o dia. As lâminas foram então desparafinizadas por duas imersões em Hemo-De, por 10 minutos cada. As lâminas foram então incubadas em 100% de etanol, por dois minutos, duas vezes. As lâminas foram hidratadas por colocação em 85%, 70%, 50%, e 30% de etanol por 2 minutos cada. Foi realizada uma imersão final por 5 minutos em água de grau molecular da Milli-Q. Um banho-maria foi préaquecido com um vaso Coplin contendo tampão de citrato de sódio (citrato de sódio a 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6,0) até que a temperatura atingisse 96 +/- 4 °C. As lâminas foram incubadas por 20-60 minutos. As lâminas foram esfriadas na temperatura ambiente por 20-40 minutos, sobre a bancada. As lâminas foram lavadas por cinco minutos em água da Milli-Q e enxaguadas uma vez por cinco minutos em PBS.

[0136]A segunda etapa é a imunofluorescência (IF) com o anticorpo para AMACR e o Ensaio de Amplificação do Sinal de Tiramida. O kit de Ensaio de Solução de Tiramida (TSA) e o kit de TSA (amplificação do sinal de tiramida) Alexa Fluor 488 número 2 (Invitrogen, Molecular Probes) foram usados seguindo as instruções do fabricante. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada por incubação em 3% de H2O2 por 30 minutos, na temperatura ambiente. O reagente de bloqueio (100 pL/lâmina) foi adicionado, com incubação em uma caixa umidificada por 30 minutos, na temperatura ambiente. 100 uL de anticorpo de coelho para AMACR diluído (diluído em 1% de reagente de bloqueio a 1:100) foram adicionados, com incubação por 1 hora, na temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas por cinco minutos, três vezes, em PBS/0,1% de Tween 20. A solução de conjugado de HRP de estoque foi diluída a 1:100 em 1% de solução de bloqueio. Um volume de 100 uL desta solução de trabalho é suficiente para cobrir uma lamínula de 22 x 22 mm padrão. As lâminas foram incubadas por 30 minutos na temperatura ambiente. As lâminas foram

78/79 lavadas por três vezes, por cinco minutos cada, em PBS/0,1% de Tween 20 e então lavadas uma vez em PBS. 100 uL de solução de tiramida por lâmina foram adicionados, seguidos por incubação por 10 minutos, na temperatura ambiente, no escuro. As lâminas foram então lavadas por cinco minutos em PBS e cinco minutos em água da Milli-Q.

[0137]A terceira etapa é o ensaio de FISH. As lâminas foram desidratadas em álcool (70%, 85% e 100%, um minuto cada), e deixadas secar ao ar completamente. 10 uL de solução de sonda foram adicionados a cada lâmina, e as lamínulas foram vedadas sobre as lâminas com cola de borracha. A sonda e o DNA-alvo foram desnaturados, a 73°C, por 5 minutos, seguido por hi bridização durante a noite, a 37°C. A amostra foi colocada na solução de lavagem consistindo em 0,3x-2x SSC e 0,3%-0,5% de NP-40, e a temperatura da amostra foi elevada para cerca de 73°C, por cerca de 2-5 minutos. Então o suporte carregando a amostra foi contratingido com um corante de ligação ao DNA nuclear, tal como o 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), em solução, ou ao secar a amostra no escuro. Neste caso, a amostra foi contratingida com cerca de 10 pL de DAPI, e uma nova lamínula foi colocada sobre a amostra. A amostra foi então vista ou armazenada, p.ex., em torno de -20°C.

[0138]Todas as patentes, publicações de pedidos de patentes, artigos de jornais, compêndios, e outras publicações, mencionados no relatório descritivo, são indicativos do nível de habilidade daqueles na técnica à qual diz respeito a divulgação. Todas as tais publicações são incorporadas neste documento por referência, na mesma proporção como se cada publicação individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência.

[0139]A invenção ilustrativamente descrita neste documento pode ser adequadamente praticada na ausência de qualquer(quaisquer) elemento(s) ou limitação(ões) que não esteja(m) especificamente divulgado(s) neste documento. Desse modo, por exemplo, cada caso aqui de quaisquer dos termos

79/79 compreendendo, consistindo essencialmente em e consistindo em pode ser substituído com quaisquer dos outros dois termos. Também, as formas singulares um, uma, o e a incluem as referências plurais, a não ser que o contexto dite claramente de outro modo. Desse modo, por exemplo, as referências ao método incluem um ou mais métodos e/ou etapas do tipo, os quais estão descritos neste documento e/ou os quais se tornarão aparentes para aqueles normalmente versados na técnica ao lerem a divulgação.

[0140]Os termos e as expressões que foram empregados são usados como termos de descrição e não de limitação. Com relação a isto, onde certos termos forem definidos sob DEFINIÇÕES e forem de outro modo definidos, descritos, ou discutidos alhures na DESCRIÇÃO DETALHADA, pretende-se que todas as tais definições, descrições, e discussões sejam atribuídas a tais termos. Também não há nenhuma intenção, no uso de tais termos e expressões, de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou as suas partes. Além disso, embora subtítulos, p.ex., DEFINIÇÕES, sejam usados na DESCRIÇÃO DETALHADA, tal uso é somente para a facilidade de referência e não é pretendido para limitar qualquer divulgação feita em uma seção àquela seção somente; em vez disso, pretende-se que qualquer divulgação feita sob um subtítulo constitua uma divulgação sob todos e quaisquer subtítulos.

[0141]Reconhece-se que são possíveis diversas modificações dentro do escopo da invenção reivindicada. Desse modo, deve ser entendido que, embora a presente invenção tenha sido especificamente divulgada no contexto das modalidades preferidas e das características opcionais, aqueles versados na técnica podem recorrer a modificações e variações dos conceitos divulgados neste documento. Tais modificações e variações são consideradas estarem dentro do escopo da invenção, como reivindicada neste documento.

Claims (14)

1. Método de detectar câncer de próstata em um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:

(a) contatar uma amostra de células da próstata do paciente com um conjunto de sondas marcadas de modo detectável sob condições de hibridização, em que o conjunto de sondas marcadas de modo detectável compreende:

(i) uma sonda lócus específica para MYC, uma sonda lócus específica para o homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), uma sonda centromérica para o cromossomo 10, e uma sonda centromérica para o cromossomo 7;

(ii) uma sonda lócus específica para PTEN, uma sonda centromérica para o cromossomo 10, uma sonda centromérica para o cromossomo 7, e uma sonda centromérica para o cromossomo 8, ou (iii) uma sonda lócus específica para PTEN, uma sonda centromérica para o cromossomo 10, uma sonda lócus específica para MYC, e uma sonda centromérica para o cromossomo 8, e (b) determinar a presença de perdas e/ou ganhos cromossômicos, em que para o conjunto (i), uma % de perda de PTEN/CEP10 (a % de perda é a % de células com PTEN/CEP10 < 1) superior a 35, uma % de cromossomo 7 anormal (a % anormal é a % de células com > 2 ou < 2 sinais) superior a 25, e uma % de perda de MYC (a % de perda é a % de células com > 2 sinais) superior a 35 indicam que o paciente tem câncer da próstata, em que para o conjunto (ii), uma % de perda de PTEN/CEP10 (a % de perda é a % de células com PTEN/CEP10 < 1) superior a 35, uma % de cromossomo 7 anormal (a % anormal é a % de células com > 2 ou < 2 sinais) superior a 25, e uma % de perda de cromossomo 8 (a % de perda é a % de células com > 2 sinais) superior a 34 indicam que o paciente tem câncer da próstata, e em que para o conjunto (iii), uma % de perda de PTEN/CEP10 (a % de per

2/5 da é a % de células com PTEN/CEP10 < 1) superior a 35, uma % de perda de MYC (a % de perda é a % de células com > 2 sinais) superior a 5, e uma % de perda de cromossomo 8 (a % de perda é a % de células com > 2 sinais) superior a 35 indicam que o paciente tem câncer da próstata, ao que o câncer de próstata no paciente é detectado.

2. Conjunto de sondas marcadas de modo detectável, CARACTERIZADO pelo fato de que consiste em:

(i) uma sonda lócus específica para o homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), uma sonda centromérica para o cromossomo 10, uma sonda centromérica para o cromossomo 7, uma sonda lócus específica para MYC e, opcionalmente, um anticorpo anti-a-metilacil-CoA racemase (AMACR);

(ii) uma sonda lócus específica para o homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), uma sonda centromérica para o cromossomo 10, uma sonda centromérica para o cromossomo 7, uma sonda centromérica para o cromossomo 8 e, opcionalmente, um anticorpo anti-a-metilacil-CoA racemase (AMACR); ou (iii) uma sonda lócus específica para o homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), uma sonda centromérica para o cromossomo 10, uma sonda centromérica para o cromossomo 8, uma sonda lócus específica para MYC e, opcionalmente, um anticorpo anti-a-metilacil-CoA racemase (AMACR).

3. Kit, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:

(a) um conjunto de sondas que capacita a diagnose do câncer de próstata em um paciente, em que o conjunto de sondas consiste em:

(i) uma sonda lócus específica para o homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), uma sonda centromérica para o cromossomo 10, uma sonda centromérica para o cromossomo 7, uma sonda lócus específica para MYC e, opcionalmente, um anticorpo anti-a-metilacil-CoA racemase (AMACR);

(ii) uma sonda lócus específica para o homólogo de fosfatase e tensina

3/5 (PTEN), uma sonda centromérica para o cromossomo 10, uma sonda centromérica para o cromossomo 7, uma sonda centromérica para o cromossomo 8 e, opcionalmente, um anticorpo anti-a-metilacil-CoA racemase (AMACR); ou (iii) uma sonda lócus específica para o homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), uma sonda centromérica para o cromossomo 10, uma sonda centromérica para o cromossomo 8, uma sonda lócus específica para MYC e, opcionalmente, um anticorpo anti-a-metilacil-CoA racemase (AMACR); e (b) instruções para diagnosticar câncer de próstata em um paciente.

4. Método de detectar câncer de próstata em um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:

(a) contatar uma amostra de células da próstata do paciente sob condições de hibridização com pelo menos uma de uma sonda centromérica para o cromossomo 10, uma sonda centromérica para o cromossomo 7, uma sonda centromérica para o cromossomo 8, uma sonda lócus específica para MYC, uma sonda lócus específica para lipoproteína lipase (LPL), uma sonda lócus específica para o homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), ou uma combinação das mesmas;

(b) determinar a presença de perdas e/ou ganhos cromossômicos para detectar câncer de próstata.

5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra de células da próstata é uma seção da próstata do paciente.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a seção é fixada em formalina e embutida em parafina e colocada sobre uma lâmina de microscópio.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que, antes de determinar a presença de anormalidades cromossômicas, o método compreende ainda avaliar morfologicamente a seção e identificar pelo menos uma ROI de tumor, pelo menos uma ROI benigna, ou pelo menos uma ROI de tumor e

4/5 pelo menos uma ROI benigna.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que, antes de determinar a presença de anormalidades cromossômicas, o método compreende ainda avaliar a seção por imunofluorescência e identificar pelo menos uma ROI de tumor.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que avaliar a seção por imunofluorescência compreende contatar a seção com um anticorpo anti-a-metilacil-CoA racemase (AMACR) marcado de modo detectável e detectar a superexpressão da AMACR, em que a superexpressão da AMACR em uma região da seção indica a presença de uma ROI de tumor.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que, antes de avaliar a seção por imunofluorescência, o método compreende ainda tratar a seção com recuperação de epítopo induzida por calor.

11. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende determinar as anormalidades cromossômicas em uma ROI de tumor.

12. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende determinar as anormalidades cromossômicas em uma ROI benigna adjacente a uma ROI de tumor.

13. Conjunto de sondas marcadas de modo detectável, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos uma de uma sonda centromérica para o cromossomo 10, uma sonda centromérica para o cromossomo 7, uma sonda centromérica para o cromossomo 8, uma sonda lócus específica para MYC, uma sonda lócus específica para lipoproteína lipase (LPL), uma sonda lócus específica para o homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), ou uma combinação das mesmas, em que o conjunto de sondas, opcionalmente, compreende ainda em um anticorpo anti-a-metilacil-CoA racemase (AMACR), o qual pode ser marcado de modo

5/5 detectável.

14. Kit, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:

(a) um conjunto de sondas marcadas de modo detectável que capacita a diagnose de câncer de próstata em um paciente, em que o conjunto de sondas marcadas de modo detectável compreende pelo menos uma de uma sonda centromérica para o cromossomo 10, uma sonda centromérica para o cromossomo 7, uma sonda centromérica para o cromossomo 8, uma sonda lócus específica para MYC, uma sonda lócus específica para lipoproteína lipase (LPL), uma sonda lócus específica para o homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), ou uma combinação das mesmas e, em que o conjunto de sondas, opcionalmente, compreende ainda em um anticorpo anti-a-metilacil-CoA racemase (AMACR), o qual pode ser marcado de modo detectável; e (b) instruções para diagnosticar câncer de próstata em um paciente.