CN107810276B

CN107810276B - 检测染色体畸变的方法

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Publication number: CN107810276B
Application number: CN201680034524.XA
Authority: CN
Inventors: 皮尔·马格拉夫-罗加拉; 斯文·豪克
Original assignee: ZYTOVISION GmbH
Current assignee: ZYTOVISION GmbH
Priority date: 2015-06-23
Filing date: 2016-06-23
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2036-06-23
Also published as: KR20180009763A; CN108467884A; PT3314010T; JP2019213537A; PL3314010T3; EP3109324B1; US11174508B2; EP3314010A1; KR102190401B1; EP3109324A1; JP2018517436A; ES2836134T3; DK3109324T5; CN113667722A; ES2702603T3; DK3314010T3; EP3314010B1; CN107810276A; WO2016207325A1; JP6630823B2

Abstract

本发明涉及一种鉴定染色体畸变，特别是染色体结构和/或数目畸变，且优选染色体结构畸变的方法，所述方法是利用原位杂交，通过检测生物样品中，优选一个或多个细胞中和/或一个或多个细胞核中的染色体和/或DNA区域。

Description

检测染色体畸变的方法

背景技术

本发明涉及染色体异常(chromosome anomalies)或染色体畸变(chromosomeaberrations)检测方法的技术领域。

具体地，本发明涉及一种通过原位杂交检测染色体畸变的方法。此外，本发明涉及一种适用于检测染色体畸变的组合物及其根据本发明的用途。本发明的另一个目的为提供标记有检测标记的位点特异性杂交探针的应用。最后，本发明的一个目的是提供一种用于检测染色体畸变的试剂盒。

许多肿瘤疾病是基于染色体结构和数目变异，如易位、倒位、片段重复、缺失、插入、复制、非整倍体和扩增。这些变化的检测作为预测、预后或鉴别诊断指标，通常通过原位杂交(ISH)进行。

原位杂交是基于核酸单链特别是DNA单链的互补碱基的杂交或配对，使得样品中特别是组织或细胞制剂中的特异性核酸序列可被检测。为此目的，将直接或间接标记的合成产生的探针与样品的核酸单链杂交并随后检测。

为了检测目的，可以使用荧光标记的核酸片段或荧光标记的杂交探针(荧光ISH(FISH))。此外，可以使用抗原标记的探针，特别是半抗原标记的探针，其随后利用抗体通过显色反应可见，使得光学显微镜分析可以进行((亮场ISH(BrISH))、显色ISH(CISH)、银ISH(SISH))。

FISH的优点为可以同时检测多个基因组区域，以便彼此区分。为此目的，针对不同基因组区域或对其特异的核酸片段由不同的荧光染料进行标记或偶联，在每种情况下，每种荧光染料在吸附光谱和/或发射光谱方面彼此不同。如果这种包含分离的不同单个探针的多色探针用于中期染色体制剂或间期细胞核制剂，可以通过使用特定的显微镜滤光片来分别描绘各个颜色，其将精确定义的光波长范围导入制剂以激发染料，并且还将由染料发射的精确定义的光波长范围导入评估器(称为单带通滤波器组)。此外，还存在允许同时描绘不同荧光染料和由此描述多个核酸片段的滤波器和滤波器组。在两种不同的荧光染料的情况下，例如，一种称为双带通滤波器组。

然而，由于每个特定探针检测的每个基因组区域只能使用一个标记，对于同时描述设置了明确的限定。此外，染料的吸收和发射范围通常彼此靠近，使得它们不能通过显微镜过滤器组彼此分离。由于这些原因，通常在FISH中仅同时分析两种颜色(橙色/红色和绿色)或三种颜色(橙色/红色和绿色同时或与蓝色核反颜色(DAPI)一起)。与FISH可以描述的大致相同的限定也适用于BrISH。这里，现有技术的状态为使用通常选自生物素、二硝基苯(DNP)和地高辛组的两种半抗原，以及两种抗体偶联的酶，通常为碱性磷酸酶和过氧化物酶。

所述同时描述或分析的限制对于用于检测染色体结构和数目畸变的探针的组成(组成)或配位有决定性的影响，其可用于诊断细胞位于间期的肿瘤，仅用所谓的位点特异性探针进行，其中有时，所谓的重复序列探针也被用于检测染色体数目突变。

位点特异性探针被认为是处理染色体中选定DNA片段的探针，并被称为基因特异探针或“单拷贝”探针，所述DNA片段通常为单个基因或相邻基因，大小总共高达约1000kb。重复序列特异性探针是处理重复序列并因此处理大小为多个1000kb的区域的探针。例如，这些探针还包括着丝粒探针或α-卫星探针。

关于易位和倒位的检测，基本上有两种决定性的技术和潜在的探针组成或探针组成：一方面，融合信号(称为双色双融合方法)(WO 02/093130 A2)的发生及另一方面融合信号的分离(称为双色-断裂-分离或双色分离方法)的原理。在以下这两个原理的表示和衍生信号模式中，必须注意的是，正常细胞通常是二倍体，即每个等位基因重复存在。由于通常两个等位基因中只有一个受到异常的影响，所以在各种情况下，不受异常影响的等位基因的正常信号与异常信号一起也是可见的。为了更好地理解，正常信号的信号图像在下文中不会总是被明确描述。

在双色双融合方法中，染色体的第一断裂点的区域位于相同颜色(例如橙色)的核酸片段的近端和远端侧面，且第二断裂点的区域，即相互易位伴侣，位于第二个颜色(例如绿色)的核酸片段的近端和远端侧面。在这方面，正常情况，即在两个易位伴侣的区域中没有染色体断裂，以绿色和空间上分开的橙色信号为特征。

在相互易位的情况下，断裂发生在两个易位伴侣的断裂点区域内，并且一个易位伴侣的近端区与另一易位伴侣的远端区融合，反之亦然。由于不同的有色信号经常重叠，因此出现两个绿色/橙色信号对(也称作融合信号)。该探针技术的缺点在于，仅当两个易位伴侣的断裂点位于相应标记的核酸片段的区域中时才发生融合信号。在易位仅涉及两个伴侣之一的情况下，不会出现融合信号。在这方面，仅形成附加信号，其具有由易位影响的伴侣的特征的信号的颜色。这意味着如果易位的断裂点位于用绿色荧光染料标记的核酸覆盖的区域中，则会发生附加的绿色信号。该探针组合物的缺点为仅在相同的易位或倒位的两个断裂点区域用两种颜色标记时使用，因此仅能检测到特异性的易位或倒位。

在双色-断裂-分离方法的情况下，断裂点的区域位于不同的标记或着色的核酸片段(如远端橙色、近端绿色)的近端和远端侧面。在这方面，正常情况，即在该区域没有染色体断裂，以融合信号为特征。在异常情况下，即如果在探针片段之间发生染色体断裂，信号几乎无法在空间上彼此分离。因此，正常情况与异常情况之间的差异的特征在于不同有色信号之间的距离。关于参与易位伴侣的声明不适合用这种方法。它只允许发生特异性染色体重排的结论。该探针组合物的缺点为仅使用单个断裂点区域，因此仅使用两种颜色检测一个特异性的易位或倒位。

至于缺失、非整倍体和扩增而言，通常仅使用一种与位点特异性探针有关的决定性技术和潜在的探针组成。然而，在某些情况下，位点特异性探针也用被称为重复序列特异性探针，如着丝粒探针或α卫星探针增补：由缺失、非整倍体和扩增的发生而产生的信号的增益或损失的检测原理通常用所谓的双色探针方法进行。在这个原理中，以及下面将要描述的原理以及从其中得出的信号图像中，必须注意的是，正常细胞通常是二倍体，即每个等位基因重复存在。

在双色探针方法中，两个不同的染色体区域用不同的标记或着色的核酸片段(例如，基因组区域1或目标区域1着橙色、基因组区域2或目标区域2着绿色)标记。正常情况，即没有这些区域的增益或损失，以两个橙色和两个绿色信号为特征。在异常情况下，即当发生目标区域1和/或2中的基因组区域的增益或损失时，在损失的情况下可以看到更少的绿色和/或橙色信号，在增益的情况下可以看到更多的信号。在强基因扩增或基因组区域扩增的情况下，可以看到许多附加信号，其也可以被描绘为簇。

因此，使用上述标准方法和标准组合物和用两种标准信号或两种标准颜色，在结构变化的情况下每种方法只能检测到一个(可能的)异常，在染色体数目变异的情况下每种方法最多检测到两个(可能的)异常。

除了上面列出的两个双色应用外，三色，很少有四色，更少有五色探针也用于FISH分析。根据定义，同时使用至少三种不同配体或荧光染料(无反色)来标记探针的方法为多色FISH方法(mFISH方法)。在这方面，不仅使用明显更强的标准荧光颜色橙色/红色和绿色，而且还使用可用的较弱的颜色例如金或金/黄或金色、红色或蓝色。因此，通常，例如四色FISH探针仅用于缺失或扩增的检测，因为在这里，通常有可能落后于用于扩增蓝色和金色的颜色强度的重复序列，例如，在探针的标记的情况下。这些方法描述于EP 1 035 215 B1，WO 2007/028031 A1和EP 0 549 709B1等中。

此外，在现有技术中，描述了三重FISH方法，其用于解决不同易位事件的检测，其可以在染色体区域中相互聚集(即涉及不同的基因，其位于彼此附近)。在这方面，在每种情况下，仅分析两种颜色用于相应的信号图案的评估，其中每种情况都检测到单个异常，第三种颜色不起作用。在每种情况下，使用三种不同的位点特异性探针，其标记有不同的标记。

就使用两种以上颜色的亮场(BrISH)而言，在这方面的现有技术中，描述了进行显色三重原位杂交，总的来说，其目的在于三种重复的染色体区域的检测。根据现有技术的现状，只有当使用两种半抗原和由此的两种染料时，通过BrISH检测易位。在专利申请WO2012/150022 A1中，描述了一种方法，其公开了通过BrISH方法使用三种不同的探针，使用三种标记生物素、地高辛和DNP，其导致三种不同的颜色，用于检测倒位。

WO 2005/111235 A2描述了一种包括使用三种颜色用于检测目的的方法。然而，由探针的第三标记标记的染色体区域不直接受到变化的影响，因此在染色体结构改变的情况下，第一融合信号被消除，使得新的分裂信号和新的融合信号发生。该方法使用每个只标记一个标记的探针。此外，通过该方法，仅能检测由探针预先确定的一种可能的易位。

WO 02/093130 A3公开了一种用于检测染色体易位的方法，其使用两个或另外四个标记或染料，其位于参与易位的两个断裂点的远端和近端的侧面。该方法不具有检测多于在侧面为探针的断裂点区域中的一种易位的可能性。

总的来说，因此可以发现，利用现有技术已知的方法，不可能通过原位杂交同时或同步有效地检测存在于细胞或组织中的多种染色体畸变。

目前已知，仅在用于检测在人类中具有约50Mbp至250Mbp或更大染色体区域的大小的全染色体如染色体臂的方法的情况下，使用所谓的“全染色体涂染探针”(WCP)或“部分染色体涂染探针”(PCP)，在原位杂交范围内同时分配(simultaneous assignment)或同时分配(assignment at the same time)定义的DNA或染色体区域。使用基础技术，例如mFISH(多重FISH)，SKY-FISH(光谱核型分析)，多色FISH，COBRA-FISH(组合二进制比标记FISH)或24色FISH，可以使用大约四到七种不同的荧光染料来标记和区分总共二十四种不同的“染色体涂染探针”。在类似的方法中，所有染色体的染色体-臂-特异性探针可以以不同的方式标记，即所谓的42色FISH。然而，上述方法仅适用于处于中期的细胞。上述方法是可能的，因为只有中期中的基因组/染色体区域可以用其中使用的探针进行评估，至少基本上染色体材料不重叠。对间期细胞的分析，其通常需要对实体肿瘤的遗传物质进行分析，使用这种方法是不可能的。此外，由于它们涉及大的区域，因此可以相对容易地检测在这方面使用的探针。这些分析的评估不能手动进行，即在荧光显微镜上观察信号，而是仅以计算机基础的方式，使用合适的评估软件。

与染色体结构和数目突变或异常有关特别是与现有技术中已知的方法和探针组合物相关，与肿瘤或癌症疾病相关的用于BrISH和FISH的方法和探针组合物，与某些缺点相关。例如，没有位点特异性探针和方法的组合物，其允许可靠、简单且快速地检测和辨别多种潜在不同的染色体结构和/或数目突变或异常。

特别是在染色体结构变异的情况下，同时分析(simultaneous analysis)或同时分析(analysis at the same time)相互独立的多种不同的染色体突变，即不交换任何染色体材料或不是相互的，是完全不可能的，或者只能在极度困难的情况下，特别是在基础的断裂-分离方法中。

因此，本发明基于提供适合于染色体突变或染色体畸变的检测和分析的方法或组合物的任务，避免了如上所述的现有技术的缺点，至少是很大程度上避免或至少弱化了上述缺点。

特别地，本发明基于提供使得能够可靠地和同时检测彼此不同的多个染色体畸变的方法的任务，特别是彼此独立的(即不相互关联)的染色体畸变，特别是在一种方法中。以相同的方式，本发明基于提供一种方法的任务，此外其还可使分配染色体畸变至特定染色体区域或DNA区域成为可能。

发明内容

为了完成上述任务，本发明提出一种根据权利要求1的方法；在这方面，进一步优良的实施例是从属权利要求的目的。

此外，本发明的目的是提供一种根据这方面的独立权利要求的检测染色体畸变的组合物，或一种用于预防或治疗性治疗或与染色体畸变相关的疾病的诊断或预后的组合物。

本发明的另一个目的是提供一种本发明根据这方面的独立权利要求的组合物的用途。

此外，根据这方面的独立权利要求，本发明涉及至少两个，特别是至少三个，优选至少四个位点特异性杂交探针的用途，该探针彼此不同。

此外，根据这方面的独立权利要求，本发明的目的是提供至少一个标记有至少两个检测标记的位点特异性杂交探针的用途。

最后，本发明的目的是提供一种用于检测染色体畸变的试剂盒或试剂盒部件或成套试剂盒；此外，优良特性是这方面的从属权利要求的目的。

应当理解，在下文中，仅结合本发明的一个方面描述的特殊配置、实施例等，也可以参照本发明的其它方面同样应用，而不必明确提及。

此外，必须注意的是，对于所有相关或百分比数量信息，特别是重量相关量信息，本领域技术人员在本发明的范围内以这样的方式选择该信息：各成分、活性物质、添加剂或辅助物质等的总量总是达到100％或100wt-％。然而，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。

此外，在不脱离本发明的范围的情况下，根据应用或个别情况，本领域技术人员可以偏离下列数值、范围或数量信息。

此外，本发明同样适用于使用标准化或明确指示的确定方法，或者替代地，使用本领域技术人员熟知的确定方法，可以从根本上确定或建立下面所示的所有参数信息等。

为了完成上述任务，根据本发明的第一方面，本发明提出了一种通过原位杂交和通过检测生物样品中，优选一个或多个细胞中和/或一个或多个细胞核(cell nucleus/nuclei)中的染色体区域和/或DNA区域，检测染色体畸变，特别是染色体结构和/或数目畸变，优选染色体结构畸变的方法，其中所述原位杂交以间期/原位杂交形式进行，其中所述原位杂交用至少四个彼此不同的位点特异性杂交探针进行，每个探针标记有第一检测标记，其中特别是用于产生至少一个混合信号，所述位点特异性杂交探针中的至少一个标记有至少一个另外的检测标记，所述另外的检测标记不同于第一检测标记，根据相应的位点特异性杂交探针产生信号图像，且其中利用所述信号图像识别存在的染色体畸变和/或将其分配至染色体区域和/或DNA区域。

换句话说，本发明基于通过间期/原位杂交产生的信号图像中的混合信号的目标产生，允许同时检测(simultaneous detection)或同时检测(detection at the sametime)多个染色体畸变及将他们分配至被测染色体区域或DNA区域的基本原理，所述多个染色体畸变在生物样品中彼此不同，特别是彼此独立，即不是相互的染色体畸变。

因此，特别地，在本发明的范围内，所述染色体畸变是彼此独立的染色体畸变。也就是说，根据本发明，可以提供所述染色体畸变相互独立。同样，可以提供所述染色体畸变不是相互的。

根据本发明的一个具体实施方式，进一步优选的是，所述染色体畸变不与相互的或相互依赖的染色体畸变相连或与之相关联。

本发明以非限制性方式与下面讨论的多种优点和特征相关联，并且应当作为本发明专利性的指示而被评估。

在本发明的范围内，可以以完全令人惊讶的方式提供一种用于检测染色体畸变的方法，在间期/原位杂交的范围内，其一方面允许清楚地检测多种可能的染色体结构或数目畸变，并且另一方面，在单个杂交方法中，其允许明确地区分这些染色体畸变或将检测到的染色体畸变清楚地分配地至特定染色体区域或DNA区域。特别是，所述染色体畸变可以是彼此独立的染色体畸变，它们不相互依赖且不是相互的。这在现有技术中迄今为止不可能的，特别是在间期/原位杂交的范围内。

因此，利用本发明所述方法，可以以明显更快更高效的方式，分析样品，特别是待检测染色体畸变的生物样品，例如组织片段，特别是肿瘤组织，因为单个样本可以同时检测，换句话说，在一种方法中，彼此不同的多个染色体畸变可以同时检测。此外，检测到的任何染色体畸变可以分配至限定的或特定的DNA区域或染色体区域。

此外，使用本发明所述方法，可以显著降低检测染色体畸变所需的样品量。这对于出于检查目的去除组织的背景是特别有利的，特别是与癌症疾病的诊断或识别或进一步分析相关，通常通过细针穿刺活检进行，同时，只允许采取有限的样本量，而开放的活组织检查，其也需要使用更大量的组织，也越来越少地进行。

此外，由于本发明所述方法的高效率，减少了用于进行原位杂交的所需材料如酶、荧光染料等(其中一些可能是成本密集型)的量，因此该方法在经济和生态方面也是很有优势的。

为了更好地理解本发明，根据本发明的方法的核心术语和名称将定义如下：

根据本发明，术语染色体畸变(chromosome aberrations)，同义地也称为染色体异常(chromosome anomalies)，被特别理解为意指染色体结构和数目畸变。在染色体结构畸变的情况下，染色体的结构存在变化，因此也称为染色体突变。特别是，这可能涉及到倒位、易位、缺失、片段重复、插入、重复或扩增。相反，染色体数目畸变导致染色体数量的变化。同义，使用术语基因组突变。在染色体数目畸变或基因组突变的情况下，这些可能特别涉及非整倍体或多倍体。根据本发明所述的方法特别适用于染色体结构畸变检测。

根据本发明使用的原位杂交是基于核酸单链，特别是DNA单链的互补碱基的杂交或配对，使得可以在样品例如组织或细胞制剂中检测特异性核酸序列。在原位杂交的范围内，直接或间接标记的合成产生的特别是位点特异性杂交探针与样品的核酸单链杂交，并随后检测。

从根本上讲，原位杂交可以在被检细胞或细胞核的细胞周期的不同阶段发生或进行，并且在中期当染色体以缩合状态存在时进行这一过程，或者在间期当染色体以浓缩状态存在时，已经建立起来。根据原位杂交的目的(goal)或目的(purpose)，在中期，特别是在检测实体瘤细胞染色体畸变方面并不总是可以将其在缩合染色体上进行。根据本发明，因此提供用于在间期的细胞或细胞核上进行原位杂交。

在本发明的范围内，位点特异性杂交探针被理解为与特定染色体区域或DNA区域或DNA材料的某个染色体区域或DNA区域或待测样品中遗传物质互补的探针。通常，根据本发明使用的杂交探针是基于核酸或核酸片段的，并且能够与待测染色体区域或DNA区域特异性结合或杂交。待测染色体区域或DNA区域可以具有可变长度。特别是，可以提供待测染色体区域或DNA区域全部或部分包含单个(single)或单个(individual)基因。同样，也可以提供待测染色体区域或DNA区域全部或部分包含多个基因，优选相邻基因，优选两个基因。

至于杂交探针的配置，根据本发明，具体而言，特别地可以提供，位点特异性杂交探针是基于多个，特别是多个核酸片段(同义的也是探针片段)的，其全部被称为位点特异性杂交探针。此外，尽管不太优选，位点特异性杂交探针仅基于单个核酸片段或由单个核酸片段形成是可能的。

在本发明范围内，检测标记是指与核酸或核酸片段偶联用于测定或检测目的的材料或物质。合适的检测标记的选择在本领域技术人员的基本能力内，并且在这一点上不需要任何进一步的解释。标记有检测标记的核酸片段，通过原位杂交与待测定或检测的DNA片段或染色体片段结合或杂交，可以通过本领域技术人员已知的适于直接或间接使用的检测标记的方法来检测，例如通过荧光显微镜检查，或特别是在通过酶反应染料底物进行酶反应或可视化之后，通过亮视野显微镜检查。特别地，在原位杂交的范围内，通过位点特异性杂交探针处的检测标记产生信号图像，该信号图像作为检查样品可能的染色体畸变的基础。

此外，根据本发明使用的术语“检测标记”在下文中涉及检测标记的种类或类型，而不涉及检测标记分子的数量，即诸如“至少一种检测标记”是指某一类型的检测标记或检测标记的具体选择。因此，术语“多重检测标记”也涉及不同类型的检测标记的选择，它们彼此不同，而不涉及使用的检测标记分子的数量。对于本领域技术人员显而易见的是，在标记杂交探针的范围内，这些通常与多于一个的检测标记分子偶联。

因此，根据本发明使用的位点特异性杂交探针，特别是探针片段或核酸片段，与样品中遗传物质的选定DNA区或染色体区特异性杂交，并且基于偶联检测标记，在原位杂交的范围内，产生信号图像。在本发明的范围内，基于用检测标记标记的位点特异性杂交探针，信号图像被理解为通过原位杂交产生的所有信号的总和。

就此而言，令人吃惊地发现，在本发明的范围内，可以通过在信号图像中用至少两个彼此不同的检测标记来标记位点特异性杂交探针来产生良好可检测的混合信号，其可以很好地与其它信号进行区分，该信号允许对被测DNA区域或染色体区域发生的染色体畸变进行分配。因此，在本发明意义上的混合信号是由至少两个而且由彼此不同并位于位点特异性杂交探针上的多个检测标记产生的信号。由于混合信号由位点特异性杂交探针的至少两种特别是多种检测标记产生，所以即使在染色体畸变的情况下这些在原位杂交的信号图像中也是可见的，甚至在染色体畸变的情况下继续存在。下面将详细说明用于产生混合信号的位点特异性杂交探针的可能实施方案或配置。

下面将详细描述根据本发明所述方法的优选实施例：

根据本发明的第一实施例，可以提供所使用的位点特异性杂交探针的第一检测标记在每种情况下是相同的。根据本发明的第二个同样优选的实施例，可以提供使用的位点特异性杂交探针在每种情况下用彼此不同的第一检测标记进行标记。

换句话说，根据本发明，可以提供所使用的位点特异性杂交探针-简单地作为例子而不是限制性的-具有相同的荧光染料或相同的半抗原，例如作为第一检测标记。

同样，所使用的位点特异性杂交探针可以具有彼此不同的荧光染料，彼此不同的半抗原等来作为第一检测标记，在每种情况下，再次作为例子而不是限制性的。已经证明使用彼此不同的第一检测标记进行标记是有利的，特别是对于跟随染色体断裂(例如易位或倒位)一起的染色体畸变的检测。

至于染色体畸变检测，根据本发明，进一步而言，根据本发明，优选从样品中的多个可能的染色体畸变中检测和/或确定至少一个，特别是多个彼此不同的染色体畸变。

同样地，可以提供在多个可能的染色体畸变之间，特别是同时在样本中检测到至少两个，特别是多个彼此不同的染色体畸变。

根据本发明的另一优选实施例，可以提供根据本发明所述方法作为用于同时检测多个彼此不同的染色体畸变的多重方法。

因此，与现有技术中已知的通过原位杂交检测染色体畸变的方法相比，根据本发明的方法的一个特别的优点-上文已阐述过-在于这样的事实，现在，特别是基于间期细胞或细胞核的样品可以以单一杂交方法同步或同时检测多种可能的染色体畸变，并将这些异常分配到特定的DNA区域或染色体区域。

在这一点上，特别可以通过至少一个混合信号，特别是多个混合信号，在信号图像中鉴定染色体畸变，并将其分配给待测染色体区域和/或DNA区域。在这方面，作为示例，特别参考图7，其中可以看到根据本发明的以扩增形式存在的染色体畸变的检测。根据图7，检查了四个不同的染色体区域，其中使用四个彼此不同的杂交探针，其中三个标记有用于产生特定混合信号的至少一个另外的检测标记(参见图7a)。在具有特定混合信号的四个染色体区域中的三个标记的基础上，在每种情况下，通过信号图像中被测染色体区域的扩增产生的“簇”可以分配给杂交探针或被测染色体区域(参见图7b)。

根据本发明，因此可以特别地提供，用至少一个另外的检测标记以这种方式来标记另外的位点特异性杂交探针，使得用至少一个另外的检测标记标记的位点特异性杂交探针产生信号图像中的混合信号在每种情况下彼此不同。

同样地，可以提供-特别是对于不是由染色体断裂导致的染色体畸变(例如扩增或缺失)的染色体畸变的检测-可以用至少一个另外的检测标记对另外的位点特异性杂交探针进行标记以使得通过标记有至少一个另外的检测标记的每个位点特异性杂交探针在信号图像中产生针对于染色体区域和/或DNA区域的混合信号的方式进行。因此，在本发明的范围内，优选的是，通过特异性位点杂交探针检测到的各个区域可以被分配给信号图像内的特定信号，特别是混合信号。

此外，根据本发明，优选地，如果用至少一个另外的检测标记标记另外的位点特异性杂交探针，则使用特定的混合信号，以将信号图像中待测的每个染色体畸变分配至被测染色体区域和/或DNA区域。

关于标记有至少一个另外的检测标记的位点特异性杂交探针的数目，该数目是可变的，并且特别取决于待检测或待检查的染色体畸变的数量：

根据本发明，优选的是，至少两个，特别是至少三个，优选至少四个，优选至少五个，特别优选至少六个，非常特别优选至少七个另外的位点特异性杂交探针用至少一个与第一检测标记不同的检测标记标记。同样，通过至少两个，特别是至少三个，优选至少四个，优选至少五个，特别优选至少六个，非常特别优选至少七个另外的位点特异性杂交探针，可以提供在信号图像中产生针对于染色体区域和/或DNA区域的混合信号。

上述过程的方法，特别适用于检测不是由染色体断裂导致的染色体畸变(例如扩增或缺失)的情况。基于标记有至少一个另外的检测标记的杂交探针的数量的增加，优选多个检测标记，探针产生单个混合信号，在每种情况下，同时待检测或测定的染色体畸变的数目因此也会增加。

根据本发明的另一个具体实施例，还可以检测由染色体断裂(例如易位或倒位)引起的染色体畸变，并将其分配到特定的染色体区域或DNA区域：

根据本发明的该实施例，可以提供两个位点特异性杂交探针在每种情况下均位于染色体片段(特别是断裂点区域)侧面，其中位于染色体片段(特别是断裂点区域)侧面的位点特异性杂交探针，被标记为彼此不同的检测标记，使得通过位于染色体片段(特别是断裂点区域)侧面的位点特异性杂交探针在每种情况下在信号图像中产生融合信号，特别是在不存在染色体畸变的情况下。

在这方面，“侧面(flank)”优选是指最接近染色体片段或断裂点区域的杂交探针的特异末端与距离染色体片段或断裂点区域具有0至1Mbp距离的碱基杂交，特别是距离为0至500kb，优选距离为0至100kb，优选距离为0至10,000bp，特别优选距离为0至1,000bp。

换句话说，根据本发明的该实施例，提供了待测DNA区域或染色体区域相对于特定的选定染色体片段，特别是潜在断裂点区域位于染色体的远端和近端。在这方面，特别可以提供使用至少一个标记有不同于第一检测标记的检测标记的另外的杂交探针来检测位于远端的或位于近端的染色体片段。

在本发明的范围内，断裂点区域被理解为可受染色体断裂影响的染色体区域。作为染色体断裂的结果，可能会出现基于结构重排的染色体畸变，特别是易位或倒位。染色体畸变已知为许多疾病，其中在每种情况下，异常是疾病特异性的，并且基于染色体断裂，特别是易位或倒位。使用根据本发明所述方法，可以在样品的遗传物质，特别是组织样品中检查多个，特别是已知的断裂点区域以获得染色体畸变的存在。

在根据本发明的该实施例中，因此通过在断裂点区域侧面的两个位点特异性杂交探针产生融合信号，在每种情况下，基于第一和第二位点特异性杂交探针的两个检测标记相互不同，特别是在没有染色体畸变的情况下产生该信号。

与由上述已经描述的由位点特异性杂交探针的不同检测标记产生的混合信号相反，通过位点特异性杂交探针产生融合信号，所述探针是彼此不同的，它们彼此紧邻地存在，与样品中的遗传物质或DNA杂交。

换句话说，在根据本发明的方法的范围内，产生融合信号，对于在侧面断裂点处不存在染色体畸变的情况，所使用的位点特异性杂交探针与样品中的遗传物质或DNA在紧邻处进行杂交。相反，如果在该区域存在着染色体畸变，则所使用的位点特异性杂交探针不再能够基于DNA片段的结构重排而在紧邻附近结合。代替融合信号，在信号图像中检测出优选的彼此不同的两个单独信号(同义的“分割信号”)。

此外，标记有与第一检测标记不同的至少一个另外的检测标记的杂交探针基于相应杂交探针的第一检测标记和至少一个另外的检测标记产生混合信号。因此，在不存在染色体畸变的情况下，这些可以与染色体片段，特别是断裂点区域侧面的第二杂交探针在信号图谱中形成混合信号和融合信号。在染色体畸变的情况下，相反，基于在正常细胞或正常细胞核中的染色体片段，特别是断裂点区域侧面的杂交探针，其中一个探针被标记有至少一个另外的检测标记，在信号图像中产生单个信号以及伴随有混合信号的单个信号。

在本发明的范围内，因此可以根据标记有至少一个另外的检测标记的位点特异性杂交探针，将所述混合信号定义的染色体畸变分配到断裂点区域或被测染色体区域或DNA区域。

因此，根据本发明，优选的是，在每种情况下，标记有至少一个与第一检测标记不同的另外的检测标记的杂交探针与染色体片段，特别是断裂点区域侧面的第二位点特异性杂交探针一起，在信号图像中产生混合信号和融合信号，特别是在不存在染色体畸变的情况下。

此外，可以提供标记有至少一个与第一检测标记不同的另外的检测标记的杂交探针和位于染色体片段，特别是断裂点区域侧面的第二位点特异性杂交探针在信号图像中产生单个信号，在每一种情况下。特别地，其中标记有至少一个另外的检测标记的杂交探针还在信号图像中产生混合信号，特别是在存在染色体畸变的情况下。

特别是，在本发明的方法的范围内，可以提供的是在信号图像中，通过混合信号将染色体畸变分配给被测染色体区域和/或DNA区域和/或染色体片段，特别是断裂点区域。

根据本发明所述方法的该优选实施例，因此可以通过间期/原位杂交同时描绘或标记单个样品中的一系列潜在断裂点区域。对于在标记的断裂点处没有发生染色体畸变的情况，信号图像中产生融合信号，而单个信号或分离信号的出现表示染色体畸变的存在。基于附加产生的混合信号，可以将异常单信号或分离信号分配给特定杂交探针，因此分配至特定的断裂点区域(参见图1)。

特别地，在本发明的范围内，提供的是使用至少六个，优选至少八个，优选至少十个，特别优选至少十二个，甚至更优选至少十四个不同位点特异性杂交探针，其中每种情况下，两个位点特异性杂交探针均位于染色体片段特别是断裂点区域侧面，并且使用至多二十四个不同位点特异性杂交探针，其中在每种情况下两个位点特异性杂交探针位于染色体片段特别是断裂点区域侧面。

此外，根据本发明，优选地，如果使用至少一个与第一检测标记不同的另外的检测标记来标记另外的位点特异性杂交探针，则以每个侧面的染色体片段，特别是断裂点区域和/或每个待测染色体区域和/或DNA区域可以使用融合信号和混合信号在信号图像中识别和/或分配。

在这方面，根据本发明，特别优选的是，在每个情况下，如果待测的第一断裂点区域侧面有两个杂交探针，其仅有一个检测标记，该断裂点区域只能通过融合信号或两个单个信号或分离信号在信号图像中可见。相反，通过使信号图像中具有至少一个另外的检测标记的两个侧面杂交探针中的至少一个进行标记，将特定或单独的混合信号分配给待测的每个另外的断裂点区域，使得在信号图像中，可以以可区分的方式总共描绘多个染色体区域或DNA区域，特别是断裂点区域。

根据本发明所述方法的特别优选的实施例，可以提供

(a)标记有检测标记A的第一位点特异性杂交探针和标记有检测标记B的第二位点特异性杂交探针位于第一染色体片段(特别是第一断裂点区域)侧面，并在通过原位杂交生成的信号图像中产生融合信号A-B，

(b)2至12的另外的位点特异性杂交探针位于多达六个另外的染色体片段，特别是断裂点区域的侧面，其中，在每种情况下，位于染色体片段(特别是断裂点区域)侧面的两个位点特异性杂交探针中的一个标记有检测标记A，且在每种情况下，位于染色体片段(特别是断裂点区域)侧面的两个位点特异性杂交探针中的一个标记有检测标记B，使得位于染色体片段(特别是断裂点区域)侧面的位点特异性杂交探针在通过原位杂交产生的信号图像中产生融合信号A-B，和

(c)至少一个，优选多个位点特异性杂交探针标记有至少一个另外的检测标记X，使得标记有至少一个另外的检测标记的位点特异性杂交探针在通过原位杂交产生的信号图像中产生融合信号和混合信号A-B/X，

其中通过原位杂交产生的融合信号和混合信号A-B/X在染色体畸变的情况下变为混合信号A/X和/或B/X，和/或

其中，在染色体畸变的情况下，在通过原位杂交产生的信号图像中，融合信号A-B变为单个信号A和/或B，使得利用原位杂交产生的信号图像，染色体畸变被分配至染色体区域和/或DNA区域和/或染色体片段，特别是断裂点区域，其侧面为两个位点特异性杂交探针。

此外，就上述实施例提供的检测标记X而言，可以通过单个检测标记，特别是检测标记X1来形成。

此外，可以提供检测标记X由多个彼此不同的检测标记形成，优选地选自检测标记X₁、X₂、......和/或X_n，其中指数“n”表示1至20，特别是1至10，优选1至5的自然整数。在这方面，还可以提供检测标记X₁、X₂、......和/或X_n用于产生彼此不同的混合信号，特别是具有不同比例的特定混合信号。

根据另一实施例，检测标记X也可以由多个彼此不同的检测标记形成，优选地选自检测标记X₁、X₂、X₃、X₄、X₅和/或X₆。在这方面，优选地，检测标记X₁、X₂、X₃、X₄、X₅和/或X₆用于产生彼此不同的混合信号，特别是具有不同比例的特定混合信号。

因此，在本发明的范围内，令人惊奇的是，即使基于几个单独的检测标记，也可以产生多个混合信号，为了产生混合信号，具有至少一个另外的检测标记的位点特异性杂交探针用彼此不同的多个检测标记进行标记，以产生混合信号。

特别地，根据本发明，提供的是，为了在位点特异性杂交探针的标记范围内产生混合信号，在各种情况下，使用彼此不同的(量)比例的多个，特别是二至六个彼此不同的检测标记。作为一个例子-绝对不是限制性的-位点特异性杂交探针可以具有三个另外的检测标记-除了第一检测标记之外，其中在这方面，参考三个另外的检测标记，第一检测标记的总计为20％，第二检测标记的总计为60％，第三检测标记的总计为20％。

根据本发明的另一个实施例，还可以提供

(b)标记有检测标记A的第三位点特异性杂交探针和标记有检测标记B的第四位点特异性杂交探针位于第二染色体片段(特别是第二断裂点区域)侧面，并在通过原位杂交生成的信号图像中产生融合信号A-B，以及

(c)用另外的检测标记X₁标记第三位点特异性杂交探针和/或第四位点特异性杂交探针，并且在通过原位杂交产生的信号图像中产生融合信号和混合信号A-B/X₁，

其中在信号图像中，通过单个信号A和/或B识别第一染色体片段，特别是第一断裂点区域，的染色体畸变和/或，其中通过混合信号A/X₁和/或B/X₁识别第二染色体片段，特别是第二断裂点区域，的染色体畸变，和/或，将其分配至第二染色体片段，特别是第二断裂点区域。

关于通过在原位杂交产生的信号图像中分析染色体畸变的步骤的方法，已经证明有效，特别是如果在第一步骤中，检测和/或分析由第一检测标记产生的融合信号，并且在随后的步骤中，在发生单个信号的情况下，进行检测和/或分析混合信号及其对被测染色体区域和/或DNA区域的分配。

特别地，这可以包括以下步骤，首先，在分析信号图像期间，使用滤波器，借助于该滤波器，只有由第一检测标记产生的信号，即融合信号或潜在的单个信号是可见的。由于需要进一步分析的染色体畸变仅在信号图像中出现单个信号时存在，基于此的混合信号-结合信号图像中的融合信号或单个信号的位置-染色体畸变可以分配给特定的染色体区域或DNA区域，特别是可通过使用一个不同的滤波器，特别是一个适合描述混合信号的滤波器来描述。

此外，根据本发明所述方法的具体实施例，可以通过计算机辅助分析来进行信号图像的检测。如果用于产生混合信号，杂交探针被标记有多于至少一个另外的检测标记，优选至少两个另外的，优选多个另外的以彼此的不同或限定的比例的检测标记，这是特别有利的。计算机辅助分析还可以基于潜在颜色成分或颜色的测量来区分混合信号，其在荧光显微镜下观察时，用肉眼无法区分彼此。

根据本发明，因此特别提供的是，使用多达二十四个位点特异性杂交探针进行易位或倒位的检测，其中在每种情况下，两个位点特异性杂交探针位于相应断裂点区域的远端和近端侧面，以及这些探针对的单个位点特异性杂交探针同时用另外的检测标记进行标记。因此，优选地，可以通过一种方法检查多达十二个不同的断裂点区域，使用多达十二种不同的断裂-分离方法，来描述多达十二种易位或倒位。通过识别探针对的分离或探针对的融合信号的分离以及使用各自的混合颜色或混合信号来进行特异性易位的检测。

还可以使用多达二十四个位点特异性杂交探针检测易位和倒位，其中在每种情况下，两个探针位于远端和近端的相应断裂点区域侧面，并且这些探针对在每种情况下用相同的标记A和B标记，其中在每种情况下，一个探针用标记A标记，另一个探针用标记B标记，并且这些探针对的单个探针同时用另外的检测标记X标记。通过在染色体畸变的情况下将特定融合信号和混合信号A-B/X变为新的分离的混合信号A/X和/或B/X来进行特异性易位和/或倒位的检测。在这方面，在一个探针对的情况下也可以不使用另外的标记X，从而在基础异常的情况下，通常的单独的信号A和/或B仅发生在该探针对上。

因此，这是第一次，在对多种不同的潜在可检测的结构染色体突变的第一次分析中，仅使用信号A和B，使用特定的滤波器系统，例如，信号A和B的双重滤波器，其仅使信号A和B可见，而非另外的标记X可见，可以首先快速说明融合信号A-B是否发生断裂分离，及，通常，是否存在易位或倒位。只有在发生单独信号A和/或B的情况下，才会对混合信号进行评估，同时伴随着标记X，从而进行潜在易位的明确分配。

在下文中，还将描述根据本发明所述方法的进一步的特征或实施例的可能性，其类似地应用于如上所述的根据本发明所述方法的所有可能的实施例：

关于在每种情况下用单个位点特异性杂交探针检测单个染色体区域或DNA区域，在本发明的范围内，其优选地具有小于5Mbp，特别是小于2Mbp，优选小于1Mbp，优选小于750kbp，特别优选小于500kbp的长度。同样，可以提供的是，由单一位点特异性杂交探针检测的染色体区域和/或DNA区域具有至少500bp，特别是至少1kbp，优选至少5kbp，优选至少10kbp的长度。最后，也可以提供的是，由单个位点特异性杂交探针检测的染色体区域和/或DNA区域的长度在500bp至5Mbp之间的范围内，特别是在1kbp至2Mbp的范围内，优选在5kbp至1Mbp的范围内，优选在10kbp至750kbp的范围内，特别优选在10kbp至500kbp的范围内。

此外，就根据本发明使用的位点特异性杂交探针的另外的实施例而言，这些优选以核酸片段的形式存在，特别是多核苷酸、经修饰多核苷酸、经修饰核酸片段、寡核苷酸和/或寡核苷酸的形式。具体地，就经修饰核酸片段而言，这些可以特别地为锁核酸(LNA)或肽核酸(PNA)。

根据本发明的第一实施例，还可以提供的是，每种情况下，通过覆盖待测染色体区域和/或DNA区域的单核酸片段形成位点特异性杂交探针。

根据本发明的另一个和进一步优选的实施例，还可以提供的是，在每种情况下，通过覆盖待测染色体区域和/或DNA区域的多个核酸片段(“探针片段”)形成位点特异性杂交探针。在这方面，进一步优选的是，位点特异性杂交探针的各个核酸片段(“探针片段”)的长度在5至2,000bp的范围内，特别是10至1,500bp的范围内，优选为在50至1,000bp的范围内。

此外，就通过利用具有至少一个与第一检测标记不同的另外的检测标记的位点特异性杂交探针来产生混合信号，用于实现产生混合信号目标而言，其可以不同的方式进行：

根据本发明的第一实施例，在这方面，可以提供的是，为了产生混合信号，将位点特异性杂交探针的核酸片段(“探针片段”)同第一检测标记一起，用不同于第一检测标记的另外的检测标记进行标记。因此以这种方式标记的杂交探针产生仅基于两个彼此不同的检测标记的混合信号。

此外，可以提供的是，根据本发明的另一实施例-特别是在增加特定混合信号的带宽或增加特定混合信号的数量的背景下，即可以彼此区分的信号-为了产生混合信号，位点特异性杂交探针的核酸片段(“探针片段”)同第一检测标记一起，标记有多个，特别是二到二十个，优选两个至十个，优选两个至六个不同于第一检测标记的检测标记。在这方面，特别可以提供的是，检测标记以彼此不同的量使用。

根据本发明，因此可以提供的是，为了在位点特异性杂交探针的标记范围内产生混合信号，在每种情况下以彼此不同的比例使用彼此不同的多个检测标记。例如-绝对不是限制性的，位点特异性杂交探针可以具有三个另外的检测标记-除了第一检测标记外-其中，参考三个另外的检测标记，第一检测标记的总计为20％，第二检测标记的总计为60％，及第三检测标记的总计为20％。

根据该实施例，因此可以提供的是，杂交探针具有至少两个，优选多个彼此不同的检测标记以及第一检测标记。通过使用不同比例的不同检测标记，可以总体上增加特定混合信号的数量，特别是可以彼此区分的信号，这反过来又使检测到更多的可检测的染色体畸变成为可能。

在位点特异性杂交探针的标记范围内，根据本发明可提供的是，此外，根本上，杂交特异性探针的单个核酸片段仅标记一个检测标记。在这方面，其可为第一检测标记和/或任何另外的检测标记(参见图2I))。

以不同的方式说明，因此，根据本发明，位点特异性杂交探针的核酸片段的第一部分仅用第一检测标记进行标记，并且在每种情况下，位点特异性杂交探针的核酸片段的另外部分用不同于第一检测标记的另外的检测标记进行标记。根据本发明的一个实施例，在彼此不同的杂交特异性探针的核酸片段上存在彼此不同的混合信号的检测标记，可以产生混合信号(参见图2I))。

此外，可以提供的是，杂交特异性探针的单个核酸片段用相互不同的多个检测标记进行标记，特别是其中可涉及第一检测标记和/或任何另外的检测标记(参见图2II))。

根据本发明的该实施例，因此可以提供的是，形成混合信号并且彼此不同的检测标记存在于杂交特异性探针的相同核酸片段上，或共同存在于杂交特异性探针(称为“混合探针”)的核酸片段上(参见图2II))。

此外，可以提供的是，在本发明范围内，将上述两个实施例组合以产生混合信号，即，形成混合信号的位点特异性杂交探针的一部分核酸片段仅标记一个检测标记，及该位点特异性杂交探针的另外或多个另外的部分用至少两种不同的检测标记标记。

此外，如果在用至少一个另外的检测标记标记的位点特异性杂交探针的单个杂交核酸片段之间存在最大3Mbp，特别是最大2.5Mbp，优选最大2Mbp，优选最大1Mbp，特别优选最大500kb，甚至更优选最大200kb的间距，则产生混合信号。以不同的方式说明，根据本发明，如果用至少一个另外的检测标记标记的在杂交状态下的位点特异性杂交探针的单个杂交核酸片段之间存在最大3Mbp，特别是最大2.5Mbp，优选最大2Mbp，优选最大1Mbp，特别优选最大500kb，甚至更优选最大200kb的“间隙”，则产生混合信号(参见图2III))。

因此，特别地，可以通过使用单个探针的“混合标记”产生混合信号。特别地，为了产生针对于染色体区域或基因组区段特异的混合信号，可任选地，i)探针的所有片段或任选地只有探针的单个片段用多个标记进行标记或II)相同的片段在每种情况下用不同的标记标记，或III)交替片段用不同的标记标记，因此在这里，最终也只有一个混合信号是可见的或可检测的(参见图2I至III)。

在这方面，如果在前述I)至III)中提到的单个片段或所有片段仅部分重叠，从根据本发明所述方法的意义上来说，混合标记和混合信号也可以产生。

如果标记有至少一个标记的探针的单个片段或片段组，以及标记有至少一个另外的标记的探针的其它单个片段或片段组，具有2Mbp，任选地1Mbp，任选的500kb，任选的200kb的间隔，从根据本发明所述方法的意义上来说，混合标记也可产生。

如果使用具有相同序列或几乎相同序列的两个或更多个探针，即两个或更多个探针针对相同的特定染色体区域或相同的基因组片段，但用不同的标记进行标记，其中所述探针也可以仅95％，任选地90％，任选地80％，任选地70％，任选地60％，任选地50％一致，其中差异是由于基本相似的序列的序列变异或仅由于探针的各个区域的部分重叠而产生，从根据本发明所述方法的意义上来说，混合标记和混合信号因此也可产生。

合适的检测标记的选择在本领域技术人员的基本能力范围内，并且作为用于进行原位杂交的方法的功能而发生。通常，杂交探针的直接或间接标记可以通过选择合适的检测标记进行。

在本发明的范围内，如果检测标记选自染料；染料底物；化学发光染料，特别是吖啶鎓；放射性同位素；自旋标记物；酶，特别是碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、大豆过氧化物酶和/或β-半乳糖苷酶；半抗原，特别是地高辛、生物素、2,4-二硝基苯酚、5(6)-羧基荧光素，罗丹明、溴脱氧尿苷、乙酰氨基芴、三硝基苯酚、三硝基苯酚衍生物、雌二醇和/或2,4-二硝基苯酚；量子点；珠粒；氨基己烯；芘；和/或荧光染料，特别是荧光素、荧光素衍生物、5(6)-羧基荧光素、香豆素、香豆素衍生物、罗丹明、罗丹明衍生物、四甲基罗丹明、丽丝胺、德克萨斯红、AMCA、TRITC、IR染料、Alexa染料、Dyomics染料、藻红蛋白、瀑布蓝(CascadeBlue)、俄勒冈绿488、太平洋蓝和/或罗丹明绿，则可以获得比较好的结果。

就这样进行原位杂交而言，其可以不同的方式进行。

特别是，根据原位杂交的第一优选实施例，可以提供的是，其通过直接标记杂交探针，特别是通过荧光原位杂交(FISH)进行。

同样，可以提供的是，用荧光染料(特别是可见光、红外和/或紫外发射范围，优选绿色，橙色/红色、红色、金色和/或蓝色的发射区域)标记杂交探针进行原位杂交。

根据原位杂交的另一个优选实施例，同样可以提供的是，其通过间接标记杂交探针，特别是通过亮场原位杂交(BrISH)进行。

此外，根据本发明，可以提供的是，使用半抗原，特别是生物素、地高辛和/或DNP标记杂交探针，随后通过抗体偶联的碱性磷酸酶、抗体偶联的过氧化物酶和/或抗体偶联的β-半乳糖苷酶的检测进行原位杂交。

就分析基于荧光的原位杂交而言，其优选地使用特定的单个或多个滤波器组进行，其特别地允许融合信号和混合信号的目标描绘。

此外，特别是在基于至少一个另外的检测标记的基础上产生混合信号，特别是在基于至少两个另外的，优选多个另外的具有彼此不同或限定的比例的检测标记的基础上产生混合标记，通过计算机辅助分析进行评估，是有利的。此外，还可以提供的是，特别是借助于计算机辅助分析来获得叠加图像，该图像允许联合描绘不同的单个或多个滤波器组的信号图像。

从根本上来说，可以使用根据本发明所述方法检测多种不同类型的染色体畸变。特别地，根据本发明所述方法可用于检测易位、倒位、片段重复、缺失、插入、重复、非整倍体和扩增，特别是易位和/或倒位。

在本发明所述方法的范围内，在这方面，可以提供的是，染色体畸变与疾病，特别是恶性肿瘤(malignancies)，优选癌(carcinomas)、肉瘤(sarcomas)和/或白血病(leukemias)有关。

待测潜在染色体畸变的基因优选选自：ALK、ROS1、RET、NRG1、NTRK1、CARS、EML4、FGFR2、FGFR3、KIF5B、TGF、BCR、ABL、ALK、BCL2、BCL6、BIRC3、CCND1、EGR1、ETV6、FGFR1、FGFR3、IGH、KMT2A、MYC、PML、RARA、RUNX1、RUNX1T1、EWSR1、CHOP、FUS、COL1A1、DDIT3、JAZF1、NR4A3、FOXO1、FUS、PAX3、PAX7、PDGFB、SS18、TFE3、USP6、WT1、HER2/ERBB2、FGFR1、ALK、CCND1、CDK4、CD274、PDCD1LG2、EGR1、EGFR、ESR1、ETV1、FGF3,4,19、FGFR2、FGFR3、FHIT(RCC)、KRAS、MDM2、MDM4、MET、MYB、MYC、MYCN、PIK3CA、PTEN、SMARCB1、SOX2、TERT、TOP2A、TP53、TYMS和/或VHL。

在根据本发明所述方法的范围内，如果根据本发明所述方法用于检测倒位和/或易位，则可实现特别好的结果：

在本发明的优选实施例的范围内，根据本发明所述方法用于不同的易位和/或倒位的检测，特别是在肺肿瘤中，其中特别是，基因ALK、ROS1、RET、NRG1、NTRK1、CARS、EML4、FGFR2、FGFR3、KIF5B和/或TGF受影响。

此外，可以提供的是，根据本发明所述方法用于不同的易位和/或倒位的检测，特别是在淋巴瘤和白血病中，其中特别地，基因BCR、ABL、ALK、BCL2、BCL6、BIRC3、CCND1、EGR1、ETV6、FGFR1、FGFR3、IGH、KMT2A、MYC、PML、RARA、RUNX1和/或RUNX1T1受影响。

根据本发明的另一个优选实施例，本发明所述的方法用于不同易位和/或倒位的检测，特别是在肉瘤(sarcomas)中，其中特别地，基因EWSR1、CHOP、FUS、COL1A1、DDIT3、JAZF1、NR4A3、FOXO1、FUS、PAX3、PAX7、PDGFB、SS18、TFE3、USP6和/或WT1受影响。

根据本发明，还可以提供的是，根据本发明所述方法用于检测倒位和/或易位，其中特别地，基因ALK和ROS1受影响。

此外，在本发明的范围内，如果根据本发明所述方法用于扩增和/或缺失的检测，可实现优异的结果：

为了检测扩增或缺失，可以使用多达二十四种不同的位点特异性探针，其中每个探针处理相应的基因组区域，并且其中不同探针用不同组合和比例的不同标记标记。基于信号图像中产生的混合信号，可以清楚地区分不同的位点特异性探针。因此，可以使用单一方法检查所讨论的基因组区域的多达二十四种不同的扩增事件和/或缺失事件。通过计数不同的混合信号或混合颜色来进行特异性扩增或缺失的检测。

优选地，根据本发明的方法用于检测不同的扩增和缺失，特别是在乳腺肿瘤、结肠肿瘤和肺肿瘤中，其中特别地，基因HER2/ERBB2、FGFR1、ALK、CCND1、CDK4、CD274、PDCD1LG2、EGR1、EGFR、ESR1、ETV1、FGF3,4,19、FGFR2、FGFR3、FHIT(RCC)、KRAS、MDM2、MDM4、MET、MYB、MYC、MYCN、PIK3CA、PTEN、SMARCB1、SOX2、TERT、TOP2A、TP53、TYMS和/或VHL受影响。

总的来说，在本发明的范围内，因此令人惊奇地发现，当使用具有混合标记的位点特异性探针时，混合信号可以以允许进行评估的方式被很好地检测，这些信号允许清楚地鉴定受异常影响的染色体区域。因此，根据本发明所述方法允许首次以惊人的方式检测多个不同的染色体结构和/或数目突变。其在现有技术中是不可能的。

根据本发明的第二方面，本发明的另一个目的为提供一种通过原位杂交，特别是通过检测生物样品中，优选一个或多个细胞中和/或一个或多个细胞核(cell nucleus/nuclei)中的染色体区域和/或DNA区域，特别是通过一种根据前述权利要求之一的方法，检测染色体畸变，特别是染色体结构和/或数目畸变，优选染色体结构畸变的组合物，其中该组合物包含至少两个，特别是至少三个，优选至少四个位点特异性杂交探针，所述探针彼此不同，并且均由第一检测标记标记，并且其中根据相应的位点特异性杂交探针，所述位点特异性杂交探针中的至少一个用至少一个另外的检测标记进行标记，所述另外的检测标记不同于第一检测标记。

同样的，根据本发明的这个方面，本发明的一个目的是提供一种用于预防和/或治疗性治疗和/或用于疾病的诊断和/或预后的组合物，所述疾病与染色体畸变，特别是恶性肿瘤(malignancies)，优选癌(carcinomas)、肉瘤(sarcomas)和/或白血病，特别优选肺肿瘤、淋巴瘤、白血病、肉瘤、乳腺癌和/或结肠癌有关。其中所述组合物包含彼此不同的至少两个，特别是至少三个，优选至少四个位点特异性杂交探针，并且各自标记有第一检测标记，并且其中根据相应的位点特异性杂交探针，所述位点特异性杂交探针中的至少一个标记有至少一个另外的检测标记，所述另外的检测标记不同于第一检测标记。

在这方面，特别可以提供的是，根据本发明所述组合物旨在或用于实施如上所述的方法。

关于本发明的这个方面的进一步细节，可以参考关于根据本发明的其它方面的上述说明，其类似地也适用于本发明的这个方面。

此外，根据本发明的第三方面，本发明的一个目的为提供一种组合物的用途，特别是如上所述的一种通过原位杂交，特别是通过检测生物样品中，优选一个或多个细胞中和/或一个或多个细胞核(cell nucleus/nuclei)中的染色体区域和/或DNA区域，特别是通过如上所述的方法，检测染色体畸变，特别是染色体结构和/或数目畸变，优选染色体结构畸变的组合物。

根据本发明的第四方面，本发明的另一个目的为提供一种至少两个，特别是至少三个，优选至少四个彼此不同且标记有第一检测标记的位点特异性杂交探针在通过原位杂交，特别是通过检测生物样品中，优选一个或多个细胞中和/或一个或多个细胞核(cellnucleus/nuclei)中的染色体区域和/或DNA区域，特别是通过如上所述的方法，检测染色体畸变，特别是染色体结构和/或数目畸变，优选染色体结构畸变中的用途，其中根据相应的位点特异性杂交探针，所述位点特异性杂交探针中的至少一个标记有至少一个另外的检测标记，所述另外的检测标记不同于第一检测标记。

同样，根据本发明的这一方面，本发明的一个目的是提供一种至少两个，特别是至少三个，优选至少四个位点特异性杂交探针用于与染色体畸变，特别是恶性肿瘤，优选癌(carcinomas)、肉瘤(sarcomas)和/或白血病，特别优选肺肿瘤、淋巴瘤、白血病、肉瘤、乳腺癌和/或结肠癌相关的疾病的诊断和/或预后中的用途，所述每个位点特异性杂交探针标记有第一检测标记，其中根据相应的位点特异性杂交探针，优选在根据本发明的先前描述的方法的范围内，所述位点特异性杂交探针中的至少一个标记有至少一个另外的检测标记，所述另外的检测标记不同于第一检测标记。

此外，根据本发明的第五方面，本发明的另一个目的为提供一种至少一个标记有至少两个检测标记的位点特异性杂交探针，以及至少一个，特别是至少两个，优选至少三个彼此不同的另外的位点特异性杂交探针，并且每个另外的位点特异性杂交探针至少具有第一检测标记，在通过原位杂交，特别是通过检测生物样品中，优选一个或多个细胞中和/或一个或多个细胞核(cell nucleus/nuclei)中的染色体区域和/或DNA区域，特别是通过如上所述的方法，检测染色体畸变，特别是染色体结构和/或数目畸变，优选染色体结构畸变中的用途。

最后，根据本发明的第六方面，本发明的一个目的为提供一种通过原位杂交，特别是通过检测生物样品中，优选一个或多个细胞中和/或一个或多个细胞核(cell nucleus/nuclei)中的染色体区域和/或DNA区域，检测染色体畸变，特别是染色体结构和/或数目畸变，优选染色体结构畸变的试剂盒或试剂盒部件或成套试剂盒，其包含至少两个，特别是至少三个，优选至少四个位点特异性杂交探针，所述位点特异性杂交探针彼此不同且均标记有第一检测标记，其中所述位点特异性杂交探针中的至少一个标记有至少一个另外的检测标记，根据相应的位点特异性杂交探针，所述另外的检测标记不同于第一检测标记，特别地，其中所述试剂盒旨在和/或用于实施上述方法。

在这方面，特别提供的是，至少两个，特别是至少三个，优选至少四个彼此不同的位点特异性杂交探针存在于共同的组合物中，特别是在如上所述的组合物中。

同样，可以提供的是，至少两个，特别是至少三个，优选至少四个彼此不同的位点特异性杂交探针彼此分开存在于分开的组合物中。

附图说明

附图简要说明

在下文中，将使用附图和示例更详细地描述本发明。附图所示：

图1：一种根据本发明用于检测两种易位的方法的示意图。

图2：一种根据本发明关于使用多个标记来描绘混合标记和混合信号的方法的示意图。

图3：使用ZytoVision股份有限公司的一种四倍FISH探针“Zytolight SPEC ALK&ROS1 Break Apart Dual-Mix NG-FISH探针”的信号图像示意图。

图4：使用ZytoVision股份有限公司的一种四倍FISH探针“Zytolight SPEC ALK&ROS1 Break Apart single-Mix NG-FISH探针”的信号图像示意图。

图5：使用ZytoVision股份有限公司的一种六倍FISH探针“Zytolight SPEC ALK&ROS1&RET Break Apart single-Mix NG-FISH探针”的信号图像示意图。

图6：使用ZytoVision股份有限公司的一种六倍FISH探针“Zytolight SPEC ALK&ROS1&RET Break Apart single-Mix II NG-FISH探针”的信号图像示意图。

图7：一种根据本发明的用于检测四种数目畸变的方法的示意图。

图8：一种根据本发明的用于检测七种易位或扩增的方法的示意图。

图9：使用ZytoVision股份有限公司的四倍FISH探针“Zytolight SPEC ALK&ROS1Break Apart single-Mix NG-FISH探针”检测6q22中ROS1区域的易位的FISH分析。

图10：使用ZytoVision股份有限公司的四倍CISH探针“ZytoDot SPEC ALK&ROS1Break Apart single-MIX NG-FISH探针”检测2p23中ALK区域的易位的CISH分析。

图11：使用ZytoVision公司的五倍探针“Zytolight SPEC ERBB2，EGFR，FGFR1，MET&SOX2 FiveCheck^TMNG-FISH探针”检测ERBB2区域的扩增的FISH分析。

附图详细说明

图1示出了一种根据本发明使用四个探针和三个标记检测两种易位的方法的示意图，其中一个探针同时标记有两个标记。其示出了在正常细胞的情况下及在2p23中ALK基因或6q22中ROS1基因中的细胞易位的情况下的信号图像。

在每种情况下，该两个断裂点区域(ALK和ROS1)的侧面分别为四倍ISH探针的标记A和B，并导致融合信号A-B。此外，ALK断裂点区域的一侧还侧标有标记C，从而得到混合标记A/C。

在正常细胞(无ALK或ROS1异常)的间期，ROS1基因位点用融合信号A-B标记，ALK基因位点用融合信号A-B标记，其伴有A/C混合信号。在受ALK易位影响的细胞的间期，受易位影响的ALK基因用一种标记B的单独信号以及一种与所述前者分离的混合信号A/C标记，受易位影响的ROS1基因用一种标记A的单独信号以及一种标记B的单独信号标记。

图2示出了一种根据本发明涉及使用多个标记来表示混合标记和混合信号的方法的示意图。为了清楚起见，仅列出两种标记。如果在下列情况下，针对于一种位点特异性探针特异且因此针对于一种染色体区域或一种基因组片段特异的混合信号可以产生：I)探针片段各自标记有不同的标记，和/或II)探针的所有片段或任选地只有探针的单个片段用多个标记进行标记，和/或III)交替片段用不同的标记标记，因此在这里最终也只有混合信号是可见的或可检测的。在这方面，根据I)至III)所述，所有或也可以仅单个片段可以叠加或可重叠(未示出)，且如果根据I)至III)所述的单个片段或片段组具有高达2Mbp的间隔，例如在所示的“间隙”中，也可能产生混合标记。

图3示出了使用来自ZytoVision公司的相应四倍FISH探针“Zytolight SPEC ALK&ROS1 Break Apart Dual-Mix NG-FISH探针”的信号图像的示意图。该探针由绿色标记的多核苷酸(在503nm处吸收和528nm处发射)，其在2p23中针对位于ALK断裂点区域近端的序列，并且在6q22中针对位于ROS1断裂点区域近端的序列，橙色标记的多核苷酸(在547nm处吸收和572nm处发射)，其在2p23中针对位于ALK断裂点区域的远端的序列，并且在6q22中针对位于ROS1断裂点区域远端的序列，以及蓝色标记的多核苷酸(在426nm处吸收和480nm处发射)，其在区域2p23中针对位于ALK断裂点区域的远端和近端的序列，组成。

当使用合适的滤波器组时，非重排ALK基因的杂交信号表现为绿色-橙色荧光融合信号，其由绿色/蓝色和橙色/蓝色荧光混合信号组成。非重排ROS1基因的杂交信号表现为绿色-橙色荧光融合信号。

在正常细胞(无ALK或ROS1异常)的间期，当使用合适的绿色-橙色双带通滤波器组时，出现四个绿色-橙色融合信号，当使用合适的单带通滤波器组时，出现两个蓝色信号，当使用合适的三带通滤波器组时，出现两个绿色-橙色融合信号和两个绿色-橙色/蓝色融合信号以及混合信号(参见图3a)。

受ALK易位影响的2p23位点以单独的绿色/蓝色混合信号和单独的橙色/蓝色混合信号为特征(参见图3b)。

受ROS1易位影响的6q22位点以单独的绿色信号和单独的橙色信号为特征(参见图3c)。

当使用合适的双带通滤波器组用于绿色和橙色信号、绿色信号以及与之分开的橙色信号时，因此首先只允许声明基本上ALK或ROS1易位是存在的。然后在包含蓝色荧光信号的情况下可以进行ALK或ROS1易位之间的诊断上可能相关的区别。如果单独的绿色信号蓝色信号(绿色/蓝色混合信号)重叠，或者如果单独的橙色信号蓝色信号(橙色/蓝色混合信号)重叠，则表示ALK易位。如果单独的绿色和橙色信号与蓝色信号不重叠，则表示ROS1易位。

图4示出了使用来自ZytoVision公司的相应的四倍FISH探针“Zytolight SPECALK&ROS1 Break Apart single-Mix NG-FISH探针”的信号图像的示意图。该探针由绿色标记的多核苷酸(在503nm处吸收和528nm处发射)，其在2p23中针对位于ALK断裂点区域近端的序列，并且在6q22中针对位于ROS1断裂点区域近端的序列，橙色标记的多核苷酸(在547nm处吸收和572nm处发射)，其在2p23中针对位于ALK断裂点区域的远端的序列，并且在6q22中针对位于ROS1断裂点区域远端的序列，以及蓝色标记的多核苷酸(在426nm处吸收和480nm处发射)，其在区域2p23中针对位于ALK断裂点区域远端的序列，组成。

当使用合适的滤波器组时，非重排ALK基因的杂交信号表现为绿色-橙色荧光融合信号，其由绿色和橙色/蓝色荧光混合信号组成。非重排ROS1基因的杂交信号表现为绿色-橙色荧光融合信号。

在正常细胞(无ALK或ROS1异常)的间期，当使用合适的绿色-橙色双带通滤波器组时，出现四个绿色-橙色融合信号，当使用合适的单带通滤波器组时，出现两个蓝色信号，以及当使用合适的三带通滤波器组时，出现两个绿色-橙色融合信号和两个绿色-橙色/蓝色融合信号以及混合信号(参见图4a)。

受ALK易位影响的2p23位点以单独的绿色信号和单独的橙/蓝混合信号为特征(参见图4b)。

受ROS1易位影响的6q22位点以单独的绿色信号和单独的橙色信号为特征(参见图4c)。

当使用合适的双带通滤波器组用于绿色和橙色信号、绿色信号以及与之分开的橙色信号时，因此首先只允许声明基本上ALK或ROS1易位是存在的。然后在包含蓝色荧光信号的情况下可以进行ALK或ROS1易位之间的诊断上可能相关的区别。如果单独的橙色信号蓝色信号(橙色/蓝色混合信号)重叠，则表示ALK易位。如果单独的橙色信号与蓝色信号不重叠，则表示ROS1易位。

图5示出了使用来自ZytoVision公司的相应的六倍FISH探针“Zytolight SPECALK&ROS1和RET Break Apart Dual-Mix NG FISH探针”的信号图像的示意图。该探针由绿色标记的多核苷酸(在503nm处吸收和528nm处发射)，其在2p23中针对位于ALK断裂点区域近端的序列，在6q22中针对位于ROS1断裂点区域近端的序列，并且在10q11中针对位于RET断裂点区域近端的序列，橙色标记的多核苷酸(在547nm吸收和572nm处发射)，其在2p23中针对位于ALK断裂点区域远端的序列，在6q22中针对位于ROS1断裂点区域远端的序列，并且在10q11中针对位于RET断裂点区域远端的序列，以及蓝色标记的多核苷酸(在426nm处吸收和480nm处发射)，其在区域2p23中针对位于ALK断裂点区域远端的序列，并且在10q11中针对位于RET断裂点区域近端的序列，组成。

当使用合适的滤波器组时，非重排ALK基因的杂交信号表现为绿色-橙色荧光融合信号，由绿色和橙色/蓝色荧光混合信号组成。非重排RET基因的杂交信号呈绿色-橙色荧光融合信号，由绿色/蓝色混合信号和橙色信号组成。非重排ROS1基因的杂交信号表现为绿色-橙色荧光融合信号。

在正常细胞(无ALK、ROS1或RET异常)的间期，当使用合适的绿色-橙色双带通滤波器组时，出现六个绿色-橙色融合信号，当使用合适的单带通滤波器组时出现四个蓝色信号，以及当使用合适的三带通滤波器组时，出现两个绿色-橙色融合信号，两个绿色-橙色/蓝色融合信号和混合信号以及两个绿色/蓝色-橙色融合信号和混合信号(参见图5a)。

受ALK易位影响的2p23位点以单独的绿色信号和单独的橙色/蓝色混合信号为特征(参见图5b)。

受ROS1易位影响的6q22位点以单独的绿色信号和单独的橙色信号为特征(参见图5c)。

受RET易位影响的10q11位点以单独的橙色信号和单独的绿色/蓝色混合信号为特征(参见图5d)。

当使用合适的双带通滤波器组用于绿色和橙色信号、绿色信号以及与之分开的橙色信号时，首先只允许声明基本上ALK、ROS1或RET易位是存在的。然后可以在包含蓝色荧光信号的情况下进行ALK、ROS1或RET易位之间的诊断上可能相关的区别。如果单独的橙色信号蓝色信号(橙色/蓝色混合信号)重叠，则表示ALK易位。如果单独的绿色信号蓝色信号(绿色/蓝色混合信号)重叠，则表示RET易位。如果单独的橙色信号和单独的绿色信号都不与蓝色信号重叠，则表示ROS1易位。

图6示出了使用来自ZytoVision股份有限公司的相应的六倍FISH探针“ZytolightSPEC ALK&ROS1和RET Break Apart Dual-Mix II NG-FISH探针”的信号图像的示意图。该探针由绿色标记的多核苷酸(在503nm处吸收和528nm处发射)，其在2p23中针对位于ALK断裂点区域近端的序列，在6q22中针对位于ROS1断裂点区域近端的序列，并且在10q11中针对位于RET断裂点区域近端的序列，红色标记的多核苷酸(在580nm处吸收和599nm处发射)，其在2p23中针对位于ALK断裂点区域远端的序列，在6q22中针对位于ROS1断裂点区域远端的序列，并且在10q11中针对位于RET断裂点区域远端的序列，蓝色标记的多核苷酸(在426nm处吸收和480nm处发射)，其在区域2p23中针对位于ALK断裂点区域的远端的序列，以及金黄色标记的多核苷酸(在532nm处吸收和553nm处发射)，其在区域10q11中针对位于RTE断裂点区域近端的序列，组成。

当使用合适的滤波器组时，非重排ALK基因的杂交信号表现为绿色-红色荧光融合信号，由绿色和红色/蓝色荧光混合信号组成。非重排RET基因的杂交信号呈绿色-红色荧光融合信号，由绿色/金色-黄色混合信号和红色信号组成。非重排ROS1基因的杂交信号表现为绿色-红色荧光融合信号。

在正常细胞(无ALK、ROS1或RET异常)的间期，当使用合适的绿色-红色双带通滤波器组时，出现六个绿色-红色融合信号，当使用合适的单带通滤波器组时出现两个蓝色信号，并且当使用合适的单带通滤波器组时出现两个金色-黄色信号(参见图6a)。

受ALK易位影响的2p23位点以单独的绿色信号和单独的红色/蓝色混合信号为特征(参见图6b)。

受ROS1易位影响的6q22位点以单独的绿色信号和单独的红色信号为特征(参见图6c)。

受RET易位影响的10q11位点以单独的红色信号和单独的绿色/金色-黄色混合信号为特征(参见图6d)。

当使用合适的双带通滤波器组用于绿色和红色信号、绿色信号以及与之分开的红色信号时，因此首先只允许声明基本上ALK、ROS1或RET易位是存在的。然后可以在包含蓝色或金-黄色荧光信号的情况下进行ALK、ROS1或RET易位之间的诊断上可能相关的区别。如果单独的红色信号蓝色信号(红色/蓝色混合信号)重叠，则表示ALK易位。如果单独的绿色信号金色-黄色信号(绿色/金色-黄色混合信号)重叠，则表示RET易位。如果单独的红色信号和单独的绿色信号都不与蓝色或金色-黄信号重叠，则表示ROS1易位。

图7示出了一种根据本发明使用四个探针和四个标记检测四种数目畸变的方法的示意图，其中三个探针同时用两个标记标记，在每种情况下，其中用于组合的标记在这三种探针的情况下彼此不同。其示出了在正常细胞的情况下及7q31中MET基因细胞扩增的情况下的信号图像。ERBB2基因的区域17q11.2-q12用标记A覆盖，EGFR基因的区域7p12用标记A和另外的标记D覆盖，使得混合标记A/D出现，FGFR1基因的区域8p11.23-p11.22被标记A和另外的标记C覆盖，使得混合标记A/C出现，MET基因的区域7q31被标记A和另外的标记B覆盖，使得混合标记A/B出现。

在正常细胞(无ERBB2、EGFR、FGFR1或MET数目畸变)的间期，所有位点都用标记A的信号标记。标记A的信号与标记B的信号的共定位导致混合标记A/B并标记MET基因位点。因此，混合标记A/C标记FGFR1基因位点，混合标记A/D标记EGFR基因位点。ERBB2基因位点的特征在于与另一个标记不存在共定位。在具有MET基因扩增的细胞的间期中，与标记B的信号共定位的标记A的信号出现增加，因此混合标记A/B的信号出现增加。

图8示出了一种根据本发明使用14个探针和五个标记检测七种易位或扩增的方法的示意图，在每种情况下，其中一个探针同时标记有两个标记，并且量比区分每个探针的两个标记。该探针各自位于断裂点区域(“断裂点”)侧面或扩增区域(“扩增”)，及同一染色体上的另一区域(例如着丝粒区域)，如图8左上和右上部分所示。染色体的两个探针用两个不同的标记和一个相同的标记(例如探针1：25％绿色、75％蓝色和探针2：25％黄色和75％蓝色)标记。因此，每个位于断裂点区域侧面的两个探针各自在不受易位影响的细胞中产生来自三个标记的融合信号和混合信号。因此，两个探针分别对同一染色体上的扩增区域和另外的区域进行定位，因此在不受扩增影响的细胞中产生单独的混合信号(除非两个探针之间的距离很微小以至于产生融合信号和混合信号)。通过改变探针所标记的两个标记之间的量比来产生不同的混合信号，使得可以使用相同的标记以可区别的方式标记多个探针(例如，在所示的例子中，用于断裂点区域1至4的四个探针：25％至75％；50％至50％；75％至25％和100％至0％)。

在正常细胞(无易位)的间期，基因的断裂点区域由混合信号A-B和C-B标记，其组合产生A/B/C融合信号。在正常细胞(无扩增)的间期中，基因的扩增区域用混合信号A-B标记，同一染色体上的其他区域，例如着丝粒区，用混合信号C-B标记。在受易位影响的细胞的间期，受易位影响的基因由标记A-B的单独信号和与后者分开的混合信号C-B标记。在受扩增影响的细胞的间期，受扩增影响的基因由标记对的再现混合信号(例如A-B)标记。

图9示出了使用来自ZytoVision公司的四倍FISH探针“Zytolight SPEC ALK&ROS1Break Apart Single-Mix NG-FISH探针”检测6q22中ROS1区域易位的FISH分析。该探针由绿色标记的多核苷酸(在503nm处吸收和528nm处发射)，其在2p23中针对位于ALK断裂点区域近端的序列，并且在6q22中针对位于ROS1断裂点区域近端的序列，橙色标记的多核苷酸(在547nm处吸收和572nm处发射)，其在2p23中针对位于ALK断裂点区域的远端的序列，并且在6q22中针对位于ROS1断裂点区域远端的序列，以及蓝色标记的多核苷酸(在426nm处吸收和480nm处发射)，其在区域6q22中针对位于ROS1断裂点区域近端的序列，组成。

当使用合适的滤波器组时，非重排ROS1和/或ALK基因的杂交信号表现为绿色-橙色荧光融合信号，且，对于重排的ROS1和/或ALK基因，显示为单独的绿色信号和单独的橙色信号(参见图9A，其显示绿色和橙色荧光信号)。在这方面，ROS1特异性绿色信号与蓝色荧光信号共定位(参见图9B，其显示蓝色荧光信号)，使得非重排的ROS1基因由橙色和绿色/蓝色荧光混合信号组成。非重排ALK基因的杂交信号表现为绿色-橙色荧光融合信号，没有蓝色荧光信号的混合信号。受ROS1易位影响的6q22位点以单独的绿色信号和单独的橙色信号为特征(图9A和C中的箭头)。在这方面，单独的绿色信号与蓝色信号重叠。该绿色/蓝色混合信号表示受易位影响的基因的为ROS1，而不是ALK(参见图9C，其显示蓝色、绿色和橙色荧光信号)。使用合适的滤波器组，可以使信号图像容易看到。

图10示出了使用来自ZytoVision公司的四倍CISH探针“ZytoDot SPEC ALK&ROS1Break Apart Single-MIX NG-FISH探针”检测2p23中ALK区域易位的CISH分析。该探针由地高辛标记的多核苷酸，其在2p23中针对位于ALK断裂点区域近端的序列，并且在6q22中针对位于ROS1断裂点区域近端的序列，DNP标记的多核苷酸，其在2p23中针对位于ALK断裂点区域远端的序列，并且在6q22中针对位于ROS1断裂点区域远端的序列，以及生物素标记的多核苷酸，其在区域6q22中针对位于ROS1断裂点区域远端的序列，组成。通过第一(未标记)抗体(抗-DIG/抗-DNP/抗-BIO)进行标记的检测，其通过二级聚合酶缀合的抗体(HRP聚合物/AP聚合物/β-GAL)，以及底物(AP-RED/HRP-GREEN/β-GAL-BLUE)的酶反应，其导致形成强的、永久的、红色(R)、绿色(G)和蓝色(B)信号，其可以通过光学显微镜描绘，例如，使用40x干透镜。

图11示出了使用来自ZytoVision公司的五倍FISH探针“Zytolight SPEC ERBB2，EGFR，FGFR1，MET&SOX2 FiveCheck^TMNG-FISH探针”检测ERBB2区域扩增的FISH分析。该探针由绿色标记的多核苷酸(在503nm处吸收和528nm处发射)，针对ERBB2基因的区域17q11.2-q12，EGFR基因的区域7p12，FGFR1基因的区域8p11.23-p11.22，MET基因的区域7q31和SOX2基因的区域3q26.3-q27，以及蓝色标记的多核苷酸(在426nm处吸收和480nm处发射)，其针对EGFR基因和SOX2基因的区域，金色-黄色标记的多核苷酸(在532nm处吸收和553nm处发射)，其针对FGFR1基因的区域，和红色标记的多核苷酸(在580nm处吸收和599nm处发射)，其针对MET基因和SOX2基因的区域，组成。

当使用合适的单带通滤波器组时，可以看到九个单独的绿色信号和一个绿色信号簇，其占据多个单独的绿色信号的表面积(参见图11A)，四个蓝色信号(参见图11B)，两个金色-黄色信号(参见图11C)和四个红色信号(见图11D)。

图像的叠加(参见图11E)示出了单个绿色信号和绿色信号簇不与不同颜色(箭头)的信号共同定位。单个绿色信号是非扩增的ERBB2基因；绿色信号簇识别ERBB2基因扩增。共定位绿色/蓝色混合信号识别EGFR基因的两个拷贝，共定位绿色/金色-黄色混合信号识别FGFR1基因的两个拷贝，共定位绿色/红色混合信号识别MET基因的两个拷贝，以及共定位绿色/蓝色/红色混合信号识别SOX2基因的两个拷贝(参见图11E)。

具体实施方式

为了进一步说明根据本发明的方法的性质，进一步进行下述的原位杂交：

实施例1：使用ZytoVision股份有限公司的五倍FISH探针“SPEC ERBB2，EGFR，FGFR1，MET&SOX2 FiveCheck^TMNG-FISH探针”检测不同细胞类型的多重数目畸变的FISH分析

在不带有和带有先前诊断的ERBB2基因扩增的情况下，在具有3至5μm厚度的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肺癌和乳腺癌肿瘤制剂的剖面进行FISH，其被施加到镀膜玻璃载物体上并在58℃下烘烤过夜。

为了除去石蜡，将该制剂首先在70℃的加热板上加热10分钟，然后在室温(RT)下，在100％二甲苯中孵育两次，每次10分钟。随后，将该制剂通过下降的乙醇系列(一次5分钟，RT，在96％、96％、90％、70％变性乙醇中)再水化，并在超纯水中孵育(两次，每次两分钟，RT)。为了使细胞透化，随后在热预处理溶液柠檬酸(ZytoVision GmbH)中在98℃下热预处理15分钟，随后在室温下在超纯水中进一步孵育两次，每次2分钟。进行蛋白水解预处理，通过将胃蛋白溶液(Pepsin Solution，ZytoVision GmbH)滴加到该制剂上并随后在37℃的湿度箱中孵育25分钟。随后在洗涤缓冲液SSC(ZytoVision Gmb)中孵育5分钟后，将该制剂脱水(每次一分钟，各种情况下，RT，在超纯水中，70％、90％、96％乙醇)。将该制剂晾干后，通过移液管将10μl该FISH探针Zytolight SPEC ERBB2，EGFR，FGFR1，MET&SOX2 FiveCheck TMNG-FISH探针(ZytoVision GmbH)直接施用于剖面。

该探针是一种基于5个位点特异性杂交探针的混合物，其中该混合物由绿色标记的多核苷酸(在503nm处吸收和528nm处发射)，其针对ERBB2基因的区域17q11.2-q12、EGFR基因的区域7p12、FGFR1基因的区域8p11.23-p11.22、MET基因的区域7q31和SOX2基因的区域3q26.3-q27，以及蓝色标记的多核苷酸(在426nm处吸收和480nm处发射)，其针对EGFR基因和SOX2基因的区域，针对FGFR1基因区域的金色-黄色标记多核苷酸(在532nm处吸收和553nm处发射)和针对MET基因和SOX2基因的区域的红色标记的多核苷酸(在580nm处吸收和599nm处发射)组成。随后，覆上玻璃盖，去除气泡，边缘用Fixogum(Marabu)密封。在75℃的热板上将该制剂变性10分钟后，在预热的湿度箱中、37℃下进行杂交，在加热炉中过夜(约16小时)。

杂交后，除去Fixogum，将该制剂在37℃下、玻璃比色皿中的洗涤缓冲液(1x WashBuffer A，ZytoVision GmbH)中孵育3分钟。除去玻璃盖后，在37℃下、洗涤缓冲液(1x WashBuffer A，ZytoVision GmbH)中收敛洗涤两次，每次5分钟。随后，将该制剂脱水并在上升的乙醇系列中干燥，每次一分钟，(在各种情况下，RT，在70％、90％、96％中)，其中保护该制剂免受直接光照。在使用反染料(20μlDAPI DuraTect Solution(ZytoVision GmbH))后，覆上玻璃盖，去除气泡，将该制剂在室温下孵育至少30分钟，免受光照。

随后，使用荧光显微镜进行评估(Axio Scope.A1，照明单元HXP 120V，Carl ZeissMicroscopy GmbH)，使用合适的滤波器组(Sp.Green HC mFISH滤波器组；Sp.Red HC mFISH滤波器组；Sp.Aqua HC mFISH滤波器组；ZyGold HC mFISH滤波器组(所有AHFAnalysentechnik AG))。

在这方面，当使用绿色滤波器时，在每种情况下，在细胞核中，在无ERBB2扩增的制剂中发现10个绿色信号(或者在ERBB2扩增的情况下，更多的绿色信号，参见图11A)。使用ZyGold滤波器，每个细胞核中可见两个金色-黄色信号，在每种情况下，其空间位置与两个绿色信号的空间位置一致(如图11C所示)。使用红色滤光器，每个细胞核中可见四个红色信号，在每种情况下，其空间位置与四个绿色信号的空间位置一致(如图11D所示)。使用浅绿色过滤器，每个细胞核中可见四个浅绿色信号，在每种情况下，其空间位置与四个绿色信号的空间位置一致，并且在每种情况下，在两个信号的情况下，也与两个红色信号空间位置一致(如图11D所示)。信号图像可以解释如下：两个绿色信号在没有空间位置一致的另一种颜色的信号的情况下鉴定出二倍体细胞的两个ERBB2基因拷贝。两个绿色信号与空间位置一致的两个浅绿色信号鉴定出两个EGFR基因拷贝，两个绿色信号与空间位置一致的两个金色-黄色信号鉴定出两个FGFR1基因拷贝，两个绿色信号与空间位置一致的两个红色信号鉴定出两个MET基因拷贝，以及两个绿色信号与空间位置一致的两个红色和两个浅绿色信号鉴定出两个SOX2基因拷贝。

在具有ERBB2扩增的制剂的细胞核中，发现与上述相当的信号图像，除了九个绿色信号之外，观察到由大约十五个信号组成的绿色信号簇或信号图像，这些信号十分紧密，使得它们不能被分离(参见图11A)。该绿色信号图像没有与不同颜色的信号共定位，因此鉴定出了ERBB2基因扩增。

实施例2：使用ZytoVision股份有限公司的四倍FISH探针“Zytolight SPEC ALK&ROS1 Break Apart Single-Mix NG-FISH探针”检测不同细胞类型的ALK和ROS1区域的易位的FISH分析

在具有3至5μm厚度的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)Hela细胞系的细胞(

CCL-2^TM)、HCC78(由哥根廷的席尔德奥斯教授提供)和H3122(由哥根廷的席尔德奥斯教授提供)的剖面进行FISH，

其被施加到镀膜玻璃载物体上并在58℃下烘烤过夜

为了除去石蜡，将该制剂首先在70℃的加热板上加热10分钟，然后在室温(RT)下，在100％二甲苯中孵育两次，每次10分钟。随后，将改制剂通过下降的乙醇系列(一次5分钟，RT，在96％、96％、90％、70％变性乙醇中)再水化，并在超纯水中孵育(两次，每次两分钟，RT)。为了使细胞透化，随后在热预处理溶液柠檬酸(ZytoVision GmbH)中在98℃下热预处理15分钟，随后在室温下在超纯水中进一步孵育两次，每次2分钟。进行蛋白水解预处理，通过将胃蛋白溶液(Pepsin Solution，ZytoVision GmbH)滴加到该制剂上并随后在37℃的湿度箱中孵育15分钟。随后在洗涤缓冲液SSC(ZytoVision Gmb)中孵育5分钟后，将该制剂脱水(每次一分钟，在各种情况下，RT，在超纯水中，70％、90％、96％乙醇)。将该制备物晾干后，通过移液管将10μl该FISH探针Zytolight SPEC ALK&ROS1 Break Apart Single-MixNG-FISH Probe(ZytoVision GmbH)直接施用于剖面。

该探针是一种基于四个位点特异性杂交探针的混合物，其中该混合物由绿色标记的多核苷酸(在503nm处吸收和528nm处发射)，其在2p23中针对位于ALK断裂点区域近端的序列，并且在6q22中针对位于ROS1断裂点区域近端的序列，橙色标记的多核苷酸(在547nm处吸收和572nm处发射)，其在2p23中针对位于ALK断裂点区域的远端的序列，并且在6q22中针对位于ROS1断裂点区域远端的序列，以及在区域6q22中针对位于ROS1断裂点区域近端的序列的蓝色标记的多核苷酸(在426nm处吸收和480nm处发射)组成。随后，覆上玻璃盖，去除气泡，边缘用Fixogum(Marabu)密封。在75℃的热板上将该制剂变性10分钟后，在预热的湿度箱中、37℃下进行杂交，在加热炉中过夜(约16小时)。

杂交后，除去Fixogum，将该制剂在37℃下、玻璃比色皿中的洗涤缓冲液(1x WashBuffer A，ZytoVision GmbH)中孵育3分钟。

除去玻璃盖后，在37℃下、洗涤缓冲液(1x Wash Buffer A，ZytoVision GmbH)中收敛洗涤两次，每次5分钟。随后，将该制剂在上升的乙醇系列中脱水(一分钟，每种情况下，RT，在70％、90％、96％乙醇中)并晾干，其中保护该样品免受直接光照。在使用反染料(20μlDAPI DuraTect Solution(ZytoVision GmbH))后，覆上玻璃盖，去除气泡，将该制剂在室温下孵育至少30分钟，免受光照。

随后，使用荧光显微镜进行评估(Axio Scope.A1，照明单元HXP 120V，Carl ZeissMicroscopy GmbH)，使用合适的滤波器组(Dualband绿色/橙色-红色滤波器组，AHFAnalysentechnik；Sp.Aqua HC mFISH滤波器组，AHF Analysentechnik)。

在这方面，当使用橙色/绿色双滤波器时，在每种情况下在，在HeLa细胞系的细胞核，大多数分析的核，中发现六个橙色/绿色融合信号；没有观察到单独的绿色和/或橙色信号。使用浅绿色滤波器，在每种情况下，每个细胞核中可见三个浅绿色信号，其空间位置与融合信号的空间位置一致。与文献一致，将信号图像解释为ALK基因的三个拷贝和ROS1基因的三个拷贝。不存在ALK或ROS1易位。

在细胞系H3122的细胞核中，文献中描述了其ALK基因的易位，在大多数分析的核中，当使用橙色/绿色双重滤波器时，发现了七个橙色/绿色融合信号和一个橙色信号。当使用浅绿色滤波器时，每个细胞核中可见两个浅绿色信号，在每种情况下，其空间位置与两个融合信号的空间位置一致。将信号图像与文献一致解释为ALK基因的六个拷贝，其中一个受易位影响，以及ROS1基因的两个拷贝。

在细胞系HCC78的细胞核中，在文献中描述了其ROS1基因的易位，在大多数分析的核中，当使用橙色/绿色双重滤波器时，发现四个橙色/绿色融合信号，在每种情况下，两个单独的橙色信号和两个单独的绿色信号，即与其它绿色信号分开。当使用浅绿色滤波器时，每个细胞核中可见四个浅绿色信号，在每种情况下，其空间位置与两个融合信号和两个单独的绿色信号一致。将信号图像与文献一致解释为ROS1基因的四个拷贝，其中两个被易位影响，以及ALK基因的两个拷贝。

实施例3：使用来自ZytoVision股份有限公司的四倍FISH探针“Zytolight SPECALK&ROS1 Break Apart Single-Mix NG-FISH探针”检测6q22中的ROS1区域的易位的FISH分析

使用来自ZytoVision股份有限公司的四倍FISH探针“Zytolight SPEC ALK&ROS1Break Apart SingleMix NG-FISH探针”检测6q22中ROS1区域易位的FISH分析。该探针是一种基于四个位点特异性杂交探针的混合物，其中该混合物由绿色标记的多核苷酸(在503nm处吸收和528nm处发射)，其在2p23中针对位于ALK断裂点区域近端的序列，并且在6q22中针对位于ROS1断裂点区域近端的序列，橙色标记的多核苷酸(在547nm处吸收和572nm处发射)，其在2p23中针对位于ALK断裂点区域的远端的序列，并且在6q22中针对位于ROS1断裂点区域远端的序列，以及在区域6q22中针对位于ROS1断裂点区域近端的序列的蓝标记的多核苷酸(在426nm处吸收和480nm处发射)组成。

当使用合适的滤波器组时，非重排ROS1和/或ALK基因的杂交信号表现为绿色-橙色荧光融合信号，并且对于重排的ROS1和/或ALK基因，表现为单独的绿色和单独的橙色信号。在这方面，ROS1特异性绿色信号共同定位，具有蓝色荧光信号，使得非重排的ROS1基因由橙色和绿色/蓝色荧光混合信号组成。非重排ALK基因的杂交信号表现为绿色-橙色荧光融合信号，无蓝色荧光信号的混合信号(图9A)。受ROS1易位影响的6q22位点由独立的绿色信号和单独的橙色信号表征(图9A箭头)。

在这点上，单独的绿色信号与蓝色信号重叠(蓝色信号图9B)。该绿色/蓝色混合信号表示ROS1，而不是ALK，作为受易位影响的基因。使用合适的滤波器组可以使信号图像容易看到。

实施例4：使用来自ZytoVision股份有限公司的四倍CISH探针“ZytoDot SPECALK&ROS1 Break Apart Single-MIX NG-FISH探针”检测2p23中ALK区域的易位的CISH分析

此外，使用ZytoVision股份有限公司的四倍CISH探针“ZytoDot SPEC ALK&ROS1Break Apart SingleMIX NG-FISH探针”检测2p23中ALK区域易位的CISH分析。该探针是一种基于四个位点特异性杂交探针的混合物，其中该混合物由地高辛标记的多核苷酸，其在2p23中针对位于ALK断裂点区域近端的序列，并且在6q22中针对位于ROS1断裂点区域近端的序列，DNP标记的多核苷酸，其在2p23中针对位于ALK断裂点区域的远端的序列，并且在6q22中针对位于ROS1断裂点区域远端的序列，以及在区域6q22中针对位于ROS1断裂点区域远端的序列的生物素标记的多核苷酸组成。通过第一(未标记)抗体(抗-DIG/抗-DNP/抗-BIO)进行标记的检测，其通过二级聚合酶缀合的抗体(HRP聚合物/AP聚合物/β-GAL)，以及底物(AP-RED/HRP-GREEN/β-GAL-BLUE)的酶反应，其导致形成强的、永久的、红色、绿色和蓝色信号，其可以通过光学显微镜描绘，例如，使用40x干透镜。

无ALK或ROS1基因的重排或易位的二倍体或二体细胞核显示两个信号，每个信号由红色信号和绿色信号组成，它们紧贴在一起，使得它们不能被分离或部分重叠或混合，并对于ALK基因的两个拷贝具有特异性(图10)。此外，在每种情况下，两个信号可见，每个信号由红色信号、绿色信号和蓝色信号组成，这些信号十分贴近，使得它们不能被分离或部分重叠或混合，并对ROS1基因的两个拷贝具有特异性。

具有ALK基因重排或易位而不具备ROS1等位基因重排或易位的二倍体或二体细胞核显示红色-绿色信号，其对非重排ALK等位基因具有特异性(图10)。此外，它们显示与前者分离的单个绿色信号和单个红色信号，其特异于重新排列的ALK等位基因(图10，箭头“G”＝绿色，“R”＝红色)。此外，两个红色-绿色-蓝色信号可见，这两个信号对于ROS1基因的两个拷贝具有特异性的。

具有ROS1基因重排或易位而不具有ALK等位基因重排或易位的二倍体或二体细胞核显示出红色-绿色-蓝色信号，其对于非重排的ROS1等位基因具有特异性。此外，它们显示与前者分离的单个绿色信号和单个红色-蓝色信号，用于重排的ROS1等位基因，以及两个红绿色信号，其对于ALK基因的两个拷贝具有特异性。

实施例5：使用ZytoVision公司的五倍FISH探针“Zytolight SPEC ERBB2，EGFR，FGFR1，MET&SOX2 FiveCheck^TMNG-FISH探针”检测ERBB2区域扩增的FISH分析

最后，使用ZytoVision公司的五倍FISH探针“Zytolight SPEC ERBB2，EGFR，FGFR1，MET&SOX2 FiveCheck^TMNG-FISH探针”检测ERBB2区域扩增的FISH分析。该探针是一种基于5个位点特异性杂交探针的混合物，其中该混合物由绿色标记的多核苷酸(在503nm处吸收和528nm处发射)，其针对ERBB2基因的区域17q11.2-q12、EGFR基因的区域7p12、FGFR1基因的区域8p11.23-p11.22、MET基因的区域7q31和SOX2基因的区域3q26.3-q27，以及针对EGFR基因和SOX2基因区域的蓝色标记的多核苷酸(在426nm处吸收和480nm处发射)，针对FGFR1基因的区域的金色-黄色标记的多核苷酸(在532nm处吸收和553nm处发射)和针对MET基因和SOX2基因的区域的红色标记的多核苷酸(580nm处吸收和599nm处发射)组成。

当使用合适的单带通滤波器组时，可以看到九个单独的绿色信号和一个绿色信号簇，其占据了多个单独的绿色信号的表面积，以及四个蓝色信号，两个金色-黄色信号和四个红色信号。

图像的叠加显示，单个绿色信号以及绿色信号簇不会与其他颜色的信号共同定位。单一绿色信号涉及非扩增ERBB2基因；绿色信号簇识别出ERBB2基因扩增。共同定位绿色/蓝色混合信号鉴定了EGFR基因的两个拷贝，共定位绿色/金色-黄色混合信号鉴定了FGFR1基因的两个拷贝，共定位绿色/红色混合信号鉴定了MET基因的两个拷贝，以及共定位绿色/蓝色/红色混合信号鉴定了SOX2基因的两个拷贝。

本发明的进一步方面

第一个方面：根据第一方面，本发明涉及一种基于直接或间接标记的核酸片段(探针)检测细胞中多个不同染色体区域或DNA区域用于检测(和区分)(多个)染色体结构和/或数目畸变的方法，其特征在于4至24个位点特异性探针各自用1至24个不同标记中的一个标记，且至少一个位点特异性探针同时还标记有至少一个另外的标记(且最多六个另外的标记)，使得通过这些混合标记产生混合信号，其中任选地，具有相同混合标记的单个探针可以通过各种标记的不同比例，借助于它们可能产生的不同混合信号来区分，使得在染色体畸变的情况下的异常信号图像可以清楚地定位至受影响的位点，即可以使用混合信号图像来识别受异常影响的位点，其中如果探针的所有片段或任选地只有单个片段a)被标记有多个标记和/或b)相同的片段用不同的标记标记和/或c)交替片段用不同的标记标记，混合信号可以产生，其中上述片段也可以在基因组区域中叠加或者也可以具有高达2Mbp的距离。

第二个方面：根据另一方面，本发明涉及一种根据第一方面的方法，其中至少两个，任选地三个，任选四个，任选五个，任选六个，任选七个，任选八个，任选九个，以及任选十个位点特异性探针同时标记有至少一个另外的标记且最多六个另外的标记，使得通过这些混合标记产生混合信号。

第三个方面：根据另一方面，本发明涉及一种根据第一方面的方法，其中至少5至24个，任选6至24个，任选7至24个以及任选8至24个位点特异性探针各自用1至24个不同标记中的一个标记。

第四个方面：根据另一方面，本发明涉及一种基于直接或间接标记的核酸片段(探针)检测细胞中多个不同染色体区域或DNA区域用于检测染色体结构畸变的方法，其特征在于

标记有标记A的第一探针(探针1)和标记有位于断裂点区域1侧面的标记B的第二探针(探针2)，该探针形成融合信号A-B，和，

根据相同的原理，2至12个另外的探针(探针3至14)位于1至6个另外的断裂点区域(断裂点区域2-7)侧面，并且在每种情况下也形成融合信号A-B，以及，

另外的探针，但是上述探针中的至少一个同时用另外的标记，特别是选自标记C至F，或任选以比例不同于彼此的标记标记，从而形成特异性融合信号和混合信号A-B/X，其中，

a)标记C和/或标记D和/或标记E和/或标记F可以具有不同的比例，在每种情况下，和b)特异性的融合信号和混合信号A-B/X在染色体畸变处发生变化，形成新的、单独的混合信号A/X或B/X，和c)任选地，另外，特异性融合信号变为新的单独信号A或B(如果没有另外的标记X用于探针对)和d)基于这些改变的信号图像，可以清楚地检测受影响的断裂点区域。

第五个方面：根据另一方面，本发明涉及一种基于直接或间接标记的核酸片段(探针)检测细胞中多个不同染色体区域或DNA区域用于检测染色体结构畸变的方法，其特征在于

标记有标记A的第一探针(探针1)和标记有位于断裂点区域1侧面的标记B的第二探针(探针2)，该探针形成融合信号A-B，和

标记有标记A的第三探针(探针3)和标记有位于断裂点区域2侧面的标记B的第四探针(探针4)也同时形成融合信号A-B，且探针3和/或4同时被另外的标记C标记，从而形成融合信号A-B/C，其中

上述信号在染色体畸变处变化，形成分离的信号A和/或B(断裂点1)或融合信号A/C和/或B/C(断裂点2)。

第六个方面：根据另一方面，本发明涉及一种根据前述方面之一的方法，其中首先，仅考虑信号A和/或B，基于使用合适的滤波器，使用标记A和/或标记B，并且仅当存在A和/或B的异常信号图像时，考虑另外的标记C至F以清楚确定受影响的染色体区域。

第七个方面：根据另一方面，本发明涉及一种根据前述方面之一的方法，其中通过位点特异性探针检测的基因组区域小于5Mbp，任选地小于2Mbp，任选地小于1Mbp，任选地小于750kb，任选地小于500kb，任选地小于250kb，任选地小于100kb，任选地小于10kb，以及任选地小于1kb。

第八个方面：根据另一方面，本发明涉及一种根据前述方面之一的方法，其中代替探针的混合标记，使用具有不同标记的多个相同的探针，其中任选地，相同的探针被认为是相同的，即使它们至少90％，任选地至少80％，任选地至少70％，任选至少60％，以及任选至少50％一致。

第九个方面：根据另一方面，本发明涉及一种根据前述方面之一的方法，其中优选地，可以在恶性肿瘤中，优选在癌中，优选在肉瘤中，优先在白血病中检测染色体畸变。

第十个方面：根据另一方面，本发明涉及一种根据前述方面之一的方法，其中所述探针是多核苷酸、经修饰多核苷酸或经修饰核酸片段或寡核苷酸或经修饰寡核苷酸。

第十一个方面：根据另一方面，本发明涉及一种根据前述方面之一的方法，其中所述标记选自染料、染料底物、化学发光染料(例如吖啶鎓)、放射性同位素、自旋标记物、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、大豆过氧化物酶和/或β-半乳糖苷酶)、半抗原(例如地高辛、生物素、5(6)羧基荧光素、罗丹明、溴脱氧尿苷、乙酰氨基芴、三硝基苯酚、三硝基苯酚衍生物、雌二醇和/或DNP)、量子点、珠粒、氨基己烯、芘和荧光染料(如荧光素、荧光素衍生物、5(6)-羧基荧光素、香豆素、香豆素衍生物、罗丹明、罗丹明衍生物、四甲基罗丹明、丽丝胺、德克萨斯红、AMCA、TRITC、IR染料、Alexa染料、Dyomics染料、藻红蛋白、俄勒冈绿488、太平洋蓝和/或罗丹明绿)。

第十二个方面：根据另一方面，本发明涉及一种根据前述方面之一的方法，其中所述方法通过FISH方法进行，使用直接内置的荧光染料用于整个可见光、红外和紫外辐射区域，优选用于绿色、橙色/红色、红色、金色和蓝色的辐射区域。

第十三个方面：根据另一方面，本发明涉及一种根据前述方面之一的方法，其中所述方法通过BrISH方法，使用与抗体偶联的碱性磷酸酶、抗体偶联的过氧化物酶和抗体偶联的β-半乳糖苷酶结合的生物素、地高辛和DNP进行。

第十四个方面：另一方面，本发明涉及一种根据前述方面之一的方法，其中检查所述基因ALK、ROS1、RET、NRG1、NTRK1、CARS、EML4、FGFR2、FGFR3、KIF5B、TGF、BCR、ABL、ALK、BCL2、BCL6、BIRC3、CCND1、EGR1、ETV6、FGFR1、FGFR3、IGH、KMT2A、MYC、PML、RARA、RUNX1、RUNX1T1、EWSR1、CHOP、FUS、COL1A1、DDIT3、JAZF1、NR4A3、FOXO1、FUS、PAX3、PAX7、PDGFB、SS18、TFE3、USP6、WT1、HER2/ERBB2、FGFR1、ALK、CCND1、CDK4、CD274、PDCD1LG2、EGR1、EGFR、ESR1、ETV1、FGF3,4,19、FGFR2、FGFR3、FHIT(RCC)、KRAS、MDM2、MDM4、MET、MYB、MYC、MYCN、PIK3CA、PTEN、SMARCB1、SOX2、TERT、TOP2A、TP53、TYMS和/或VHL的染色体畸变。

第十五个方面：根据另一方面，本发明涉及一种基于直接或间接标记的核酸片段(探针)检测细胞中多个不同染色体区域或DNA区域用于检测和区分染色体结构和/或数目畸变的制剂，

其中4至24个位点特异性探针各自用1至24个不同标记中的一个标记，和

其中至少一个位点特异性探针同时还标记有至少一个另外的标记(且最多六个另外的标记)，使得通过这些混合标记产生混合信号，其中任选地，具有相同混合标记的单个探针可以通过各种标记的不同比例，借助于它们可能产生的不同混合信号来区分，使得在染色体畸变情况下的异常信号图像可以清楚地定位至受影响的位点和/或受异常影响的位点可以用混合信号图像来识别，其中如果探针的所有片段或任选地只有单个片段a)被标记有多个标记和/或b)相同的片段用不同的标记标记和/或c)交替片段用不同的标记标记，混合信号可以产生，其中上述片段也可以在基因组区域中叠加或者也可以具有高达2Mbp的距离。

第十六个方面：根据另一方面，本发明涉及一种根据第十五方面的制剂，其中所述探针按照第1至13方面配置。

Claims

1.至少四个彼此不同的位点特异性杂交探针在制备用于通过原位杂交，通过检测生物样品中的染色体区域和/或DNA区域而检测彼此独立的至少两个染色体畸变的诊断剂中的用途，其中所述原位杂交以间期原位杂交形式进行，其中

（a）标记有检测标记A的第一位点特异性杂交探针和标记有检测标记B的第二位点特异性杂交探针位于第一染色体片段的远端和近端侧面，并在通过原位杂交生成的信号图像中产生融合信号A-B，

（b）标记有检测标记A的第三位点特异性杂交探针和标记有检测标记B的第四位点特异性杂交探针位于第二染色体片段的远端和近端侧面，并在通过原位杂交生成的信号图像中产生融合信号A-B，且

（c）所述第三位点特异性杂交探针和/或所述第四位点特异性杂交探针标记有另外的检测标记X1，并在通过原位杂交生成的信号图像中产生融合信号和混合信号A-B/X1，

其中所述另外的检测标记X1不同于所述检测标记A和B，和

其中所述杂交探针由所述检测标记直接标记，所述检测标记是荧光染料并且与探针中的核酸或核酸片段偶联，

其中混合信号是由至少两个彼此不同并位于同一位点特异性杂交探针上的检测标记产生的信号；和

其中利用所述信号图像识别存在的染色体畸变，和/或将存在的染色体畸变分配至染色体区域和/或DNA区域。

2.根据权利要求1所述的用途，其中用至少一个另外的检测标记来标记另外的位点特异性杂交探针，其中标记有另外的检测标记的位点特异性杂交探针在所述信号图像中产生混合信号，所述混合信号在每种情况下彼此不同；和

其中至少两个另外的位点特异性杂交探针用至少一个与所述检测标记A和B不同的另外的检测标记来标记，并且其中通过所述至少两个另外的位点特异性杂交探针在所述信号图像中产生针对于染色体区域和/或DNA区域的混合信号。

3.根据权利要求1所述的用途，其中使用至少六个不同的位点特异性杂交探针，其中在每种情况下，两个位点特异性杂交探针位于染色体片段的远端和近端侧面，和

其中以这样的方式用至少一个与所述检测标记A和B不同的另外的检测标记来标记另外的位点特异性杂交探针，所述方式使得在所述信号图像中，每个侧面的染色体片段，和/或每个待测染色体区域和/或DNA区域可以使用融合信号和混合信号来识别和分配。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述位点特异性杂交探针在每种情况下由覆盖待测染色体区域和/或DNA区域的多个核酸片段形成。

5.至少四个彼此不同的位点特异性杂交探针在制备用于通过原位杂交，通过检测生物样品中的染色体区域和/或DNA区域而检测彼此独立的至少两个染色体畸变的诊断剂中的用途，其中所述原位杂交以间期原位杂交形式进行，其中

（a）标记有检测标记A的第一位点特异性杂交探针和标记有检测标记B的第二位点特异性杂交探针位于染色体片段的远端和近端侧面，并在通过原位杂交生成的信号图像中产生融合信号A-B，

（b）2至12个另外的位点特异性杂交探针位于多达六个另外的染色体片段的远端和近端侧面，其中，在每种情况下，位于染色体片段的远端和近端侧面的两个位点特异性杂交探针中的一个标记有检测标记A，且在每种情况下，位于染色体片段的远端和近端侧面的两个位点特异性杂交探针中的一个标记有检测标记B，使得在每种情况下，所述位于染色体片段的远端和近端侧面的位点特异性杂交探针在通过原位杂交产生的信号图像中产生融合信号A-B，和

（c）至少一个位点特异性杂交探针标记有至少一个另外的检测标记X，使得标记有所述至少一个另外的检测标记X的位点特异性杂交探针在通过原位杂交产生的信号图像中产生融合信号和混合信号A-B/X，

其中，在通过原位杂交产生的信号图像中，所述染色体畸变处的融合信号和混合信号A-B/X变为混合信号A/X和/或B/X，和/或

其中，在通过原位杂交产生的信号图像中，所述染色体畸变处的融合信号A-B变为单个信号A和/或B，

使得使用通过原位杂交产生的信号图像，染色体畸变被分配至染色体区域和/或DNA区域和/或被分配至两个位点特异性杂交探针位于远端和近端侧面的染色体片段；

其中在第一步骤中，检测和分析由所述检测标记A和B产生的融合信号，并且在随后的步骤中，如果产生单个信号，那么进行所述混合信号的检测和分析且将其分配至被测染色体区域和/或DNA区域，并且其中通过计算机辅助分析检测所述信号图像；

其中所述至少一个另外的检测标记X不同于所述检测标记A和B；

并且其中所述杂交探针由所述检测标记直接标记，所述检测标记是荧光染料并且与探针中的核酸或核酸片段偶联。

6.根据权利要求1-5任一项所限定的至少四个彼此不同的位点特异性杂交探针在制备用于与权利要求1或5所限定的至少两个染色体畸变相关的疾病的诊断和/或预后的诊断剂中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述疾病是恶性肿瘤。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述恶性肿瘤选自肉瘤和/或白血病。

9.根据权利要求7所述的用途，其中所述恶性肿瘤选自肺肿瘤、淋巴瘤、白血病、肉瘤、乳腺癌和/或结肠癌。