JP2018517125A - トップダウンタンパク質同定方法 - Google Patents

Abstract

本明細書に説明されるシステムおよび方法は、いくつかの側面では、不純サンプルによって生成されるＥｘＤスペクトルの曖昧性をデコンボリューションしながら、オンラインＬＣ分離を伴わずにイオン源へのサンプルの直接注入を介して、ＥｘＤを使用するサンプル中のタンパク質またはペプチドの「トップダウン」質量分光分析を提供することができる。例えば、本教示の種々の側面による方法およびシステムは、検出された生成イオンが生じた前駆体イオンをより確信を持って同定するために、ＥｘＤ断片をそれらの前駆体イオンと相関させるように、ＥｘＤ後の荷電低減種におけるパターンを利用することができる。

Description

（関連出願）
本願は、２０１５年５月１３日に出願された米国仮出願第６２／１６１，１２９号からの優先権の利益を主張するものであり、該米国仮出願の全体の内容は、参照により本明細書中に援用される。

（分野）
本発明は、質量分析に関し、より具体的には、ペプチドの質量分光分析で電子捕獲解離（ＥＣＤ）を利用する方法および装置に関する。

（イントロダクション）
質量分析（ＭＳ）は、定量的および定性的用途の両方を有する、試験物質の元素組成を判定するための分析技法である。例えば、ＭＳは、未知の化合物を同定し、および／またはその断片化を観察することによって特定の化合物の構造を判定するために使用されることができる。近年、ＭＳは、ペプチドおよびタンパク質を特性評価して同定することのＭＳ方略の速力、特異性、ならびに感度に起因して、プロテオミクスにおいてますます重要な役割を果たしている。

ＭＳベースのプロテオミクスにおいてタンパク質を特性評価することの１つの方略は、ペプチド断片にＭＳ分析（ＭＳ^１）またはタンデムＭＳ／ＭＳ分析（ＭＳ^２）を受けさせることに先立って、着目タンパク質が（例えば、トリプシン、ＬｙｓＣ等を介した）酵素消化および１つまたはそれを上回る分離（例えば、多次元ＬＣ）を受ける、「ボトムアップ」アプローチである。「ボトムアップ」ＭＳ^２ワークフローでは、衝突誘起解離（ＣＩＤ）が、典型的には、第１のＭＳ段階で選択される前駆体ペプチド断片を生成イオン断片にさらに解離するために利用される。次いで、前駆体ペプチドイオンのアミノ酸配列が、生成イオン断片の質量から推定されることができる。ＣＩＤでは、イオン化前駆体イオンと不活性中性ガスおよび／または窒素分子との間のエネルギー衝突が、骨格アミド結合を振動させて最終的に解離（開裂）し、それによって、ｂ型（Ｎ末端）およびｙ型（Ｃ末端）生成イオンを生じさせる。生成イオンペプチドのうちのいくつかを同定することによって、元のタンパク質が（例えば、タンパク質またはゲノムデータベース内の既知の配列を参照することによって）判定されることができる。しかしながら、ＣＩＤ反応が、概して、最も弱いペプチドアミド結合のみにおいて起こるため、ペプチド骨格に沿った不完全な断片化は、ペプチド配列の完全な再構成を困難にし得る。プロテオミクスにおけるＣＩＤの使用への別の主要な制限は、解離中の翻訳後修飾（ＰＴＭ）の損失である。多くの場合、ペプチド骨格に弱く結合されるにすぎない、ＰＴＭ（例えば、リン酸化または硫酸化官能基）は、断片化中にペプチドから引き離され得、それによって、ＭＳ^２スペクトル内のＰＴＭの検出および特性評価を妨げる。

上記で説明される「ボトムアップ」アプローチとは対照的に、代替的なＭＳベースのプロテオミクス方略は、無傷のタンパク質が質量分析計内で解離を受ける、「トップダウン」分析を利用する。従来のＣＩＤは、概して、過剰に少ない部位を解離するため、完全な情報を提供して無傷のタンパク質のアミノ酸配列全体を特性評価することができないが、電子捕獲解離（ＥＣＤ）および電子移動解離（ＥＴＤ）（集合的に「ＥｘＤ」）は、ＥｘＤのペプチド骨格のより完全な断片化に起因して、無傷のタンパク質の「トップダウン」シークエンシングのためのＣＩＤに対する実行可能な代替物と見なされる。ＥＣＤは、例えば、ｃ型（Ｎ末端）およびｚ型（Ｃ末端）生成イオンを主に生じさせるように、Ｎ−αＣ結合のより広範な開裂を迅速に誘発する、多重荷電前駆体による電子の捕獲につながる、前駆体イオンと低エネルギー電子との間のイオン相互作用を利用する。一方で、ＥＴＤは、そこに電子を移動させるように、試薬イオンを反対電荷の多重荷電前駆体イオンと反応させる。ＥｘＤベースの解離のエネルギーが、典型的には、前駆体ペプチドの全体を通して分配されない（またはあまり分配されない）ため、弱く結合されたＰＴＭは、第２のＭＳ分析における後続の検出のために、ペプチドに付着したままである可能性が高い。しかしながら、「トップダウン」アプローチの１つの可能性として考えられる障害は、ＭＳ^２スペクトルの複雑性、およびそれらの荷電状態がそれらの多重荷電前駆体イオンの状態まで変動し得る、多重荷電生成イオンの質量を判定することの困難である。生成イオンの間の荷電状態の変動によって引き起こされる、「トップダウン」ＭＳ^２スペクトルの解釈の曖昧性により、いくつかの「トップダウン」アプローチはさらに、例えば、プロトン移動反応を介して、生成イオンを引き離して単一荷電状態にするために、気相イオン・イオン相互作用を通した荷電状態操作を利用する。また、ＥＣＤは、既知の精製タンパク質の「トップダウン」分析で実証されているが、現実世界の用途は、ＭＳ^１またはＭＳ^２スペクトルの分析においてさらなる曖昧性を追加し得る、複雑な未知のサンプルを伴う。これらの複雑なサンプルが、典型的には、他の被分析物からの干渉を排除するようにオンラインＬＣ分離を受けるであろうため、蓄積時間は、ＬＣ時間尺度に対して過剰に短いため高度に効率的なＥＣＤ後に生成イオンの十分な強度を取得することができない場合がある。

したがって、複雑なサンプルの多次元オンライン分離に必ずしも依拠しない、ＥｘＤを利用するタンパク質の質量分光分析のための改良型方法および装置の必要性が残っている。

本出願者の教示の種々の側面によると、本明細書に説明される方法および装置は、いくつかの側面では、ＥｘＤスペクトルの曖昧性をデコンボリューションしながら、オンラインＬＣ分離を伴わずにイオン源へのサンプルの直接注入を介して、ＥｘＤを使用するサンプル中のタンパク質またはペプチドの「トップダウン」質量分光分析を提供することができる。例えば、本教示の種々の側面による方法およびシステムは、検出された生成イオンが生じた前駆体イオンをより確信を持って同定するために、ＥｘＤ断片をそれらの前駆体イオンと相関させるように、ＥｘＤ後の荷電低減種におけるパターンを利用することができる。いくつかの側面では、本明細書に説明される方法およびシステムはまた、それでもなお、ＥｘＤスペクトル内で同一のアミノ酸配列をもたらす、前駆体イオンの分子量の偏差に基づいて、ＰＴＭの特性評価を可能にすることもできる。種々の側面では、本明細書に説明される例示的方法およびシステムは、それによって、ＣＩＤベースのプロテオミクス方略のようなＰＴＭ情報の損失を伴わずに、完全なタンパク質のデノボシークエンシングを可能にするよう、無傷の着目タンパク質（およびある場合には他の干渉被分析物）を含有する、注入されたサンプルのＥｘＤ−ＭＳ分析を可能にすることができる。

本出願者の教示の種々の側面によると、イオン源を利用し、少なくとも１つのペプチド（例えば、２０個を上回るアミノ酸を有し、おそらく、生物学的機能を有する、大型ペプチド、すなわち、消化されたタンパク質の断片）またはタンパク質（例えば、典型的には、１００個を上回るアミノ酸であり、概して、３Ｄ構造および生物学的機能を提示する、例えば、抗体等の無傷の消化されていないタンパク質）を含有するサンプル溶液から、複数の前駆体ペプチドまたはタンパク質イオン（「前駆体イオン」）を生成するステップと、複数のｍ／ｚ単離窓を使用して、前駆体ペプチドまたはタンパク質イオンの質量範囲（例えば、質量範囲の狭い下位範囲）をスキャンするステップとを含む、サンプルを処理する方法が提供される。ｍ／ｚ単離窓のそれぞれの内側の前駆体イオンは、ＥｘＤ反応を受けることができ、ＥｘＤ反応のそれぞれに起因する生成イオンは、ｍ／ｚ単離窓のそれぞれに対応する複数のＥｘＤスペクトルを生成するよう検出され、少なくとも、ｍ／ｚ単離窓のうちの第１のｍ／ｚ単離窓に対応する第１のＥｘＤスペクトルは、１つまたはそれを上回るＥｘＤ断片イオンおよび第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンの１つまたはそれを上回る荷電低減種を提示する。本方法はさらに、少なくとも部分的に、第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種のｍ／ｚおよび前駆体イオンの１つまたはそれを上回る荷電低減種のｍ／ｚに基づいて、第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの該１つまたはそれを上回る種の前駆体荷電状態ならびに分子量を判定するステップを含むことができる。非限定的実施例として、ｍ／ｚ単離窓はそれぞれ、質量範囲をスキャンするために利用される質量分析器（例えば、四重極質量フィルタ）の構成に応じて、狭いｍ／ｚ窓（例えば、約１Ｄａ）であることができる。１つまたはそれを上回るサンプル調製ステップ（例えば、ＬＣ分離、電気泳動、ジスルフィド結合低減等）が、着目ペプチドのＭＳ分析上のサンプル内の他の被分析物の干渉を低減させるために、サンプル溶液のイオン化に先立って使用されることができるが、本教示の種々の側面による方法は、（例えば、オンラインＬＣ分離を伴わずに）直接注入を介して、サンプル溶液をイオン源に導入するステップを含むことができる。

本明細書に説明される方法のいくつかの側面では、第１のｍ／ｚ単離窓に対応する第１のＥｘＤスペクトルは、第１の荷電低減種を提示することができ、第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの第１の種の前駆体荷電状態は、第１の荷電低減種のｍ／ｚおよび前駆体イオンのうちの第１の種のｍ／ｚの関数として判定されることができる。加えて、いくつかの側面では、第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの第１の種の分子量は、前駆体イオンのうちの第１の種の判定された前駆体荷電状態およびｍ／ｚの関数として判定されることができる。いくつかの関連側面では、第１のＥｘＤスペクトル（すなわち、第１のｍ／ｚ単離窓に対応するＥｘＤスペクトル）はまた、第２の荷電低減種を提示することもでき、本方法はさらに、第２の荷電低減種が第１の荷電低減種の多重低減種または第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの第２の種の荷電低減種を表すかどうかを判定するステップを含むことができる。代替として、または加えて、第１のＥｘＤスペクトルが第２の荷電低減種を提示するとき、本教示による方法は、いくつかの側面では、第２の荷電低減種が、第１の荷電低減種の二重低減種または第１のｍ／ｚ単離窓内のタンパク質もしくはペプチド前駆体イオンのうちの第２の種（例えば、ペプチド前駆体イオンのうちの第１の種と異なるアミノ酸配列のペプチド）の荷電低減種を表すかどうかを判定することができる。

種々の側面では、第１のＥｘＤスペクトルが、第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの第２の種（例えば、前駆体イオンのうちの第１の種と異なるアミノ酸配列のペプチド）の第２の荷電低減種を表すとき、本方法はまた、前駆体荷電状態を判定するステップと、より決定的な分析のために相互から種々の荷電状態の断片を分離するステップとを含むことができる。例えば、本教示の種々の側面によると、本明細書に説明される方法はまた、ＥｘＤスペクトルを相関させ、および／またはデコンボリューションして、検出されたＥｘＤ断片イオンが生じた前駆体イオンの種を同定することに役立つために、質量範囲にわたってＥｘＤスペクトル内のパターン（例えば、異なるｍ／ｚ単離窓に対応するＥｘＤ反応に起因する、荷電低減種の同一性におけるパターン）を利用することもできる。いくつかの側面では、例えば、本方法はまた、ｍ／ｚ単離窓のそれぞれの内側の前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種のそれぞれの前駆体荷電状態および分子量を判定するステップと、質量範囲にわたって類似分子量を提示する前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種の前駆体荷電状態のそれぞれの前駆体荷電状態パターンを判定するステップと、各個別のｍ／ｚ単離窓に対応するＥｘＤスペクトル内の１つまたはそれを上回るＥｘＤ断片イオンを、個別のｍ／ｚ単離窓における前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種のそれぞれの前駆体荷電状態パターンと相関させるステップとを含むこともできる。一例として、前駆体荷電状態パターンは、選択されたｍ／ｚ単離窓のそれぞれにおける前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種のそれぞれの相対存在量から判定されることができる。いくつかの側面では、例えば、前駆体荷電状態パターンは、選択されたｍ／ｚ単離窓のそれぞれに対応する、ＥｘＤスペクトル内の前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種のそれぞれの単独荷電低減種の相対強度から判定されることができる。

本出願者の教示の種々の側面によると、本方法はさらに、前駆体荷電状態パターンを参照することによって、前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種から選択される第１の種のＥｘＤスペクトルを生成するステップを含むことができ、前駆体イオンのうちの選択された第１の種のＥｘＤスペクトル内のＥｘＤ断片イオンピークの間の質量の差は、前駆体イオンのうちの選択された第１の種の中の１つまたはそれを上回るアミノ酸を示す（いわゆるデノボシークエンシング）。関連側面では、本方法はさらに、（例えば、前駆体イオンのうちの選択された第１の種と相関性があるＥｘＤ断片イオンの同一性に基づいて）前駆体イオンのうちの選択された第１の種の中のアミノ酸配列を少なくとも部分的に再構成するステップを含むことができる。加えて、いくつかの側面では、前駆体イオンのうちの選択された第１の種の部分的に再構成されたアミノ酸配列は、サンプル内に含有されるペプチドまたはタンパク質を同定するように、（例えば、相同性検索を介して）既知のペプチド配列のデータベースと比較されることができる。

種々の例示的側面では、本方法はさらに、質量範囲にわたって選択されたｍ／ｚ単離窓に対応する複数のＥｘＤ断片イオンスペクトルを比較するステップを含むことができ、類似分子量の前駆体イオンのうちの複数の種の類似ＥｘＤ断片イオンパターンは、類似ペプチドアミノ酸配列上の異なる翻訳後修飾の存在を示すことができる。すなわち、類似断片化パターンを提示する前駆体イオンの種々の種の間の分子量のわずかな差は、実質的に異なるアミノ酸配列のペプチドではないが、（同一または実質的に同一のアミノ酸骨格を伴って）それらのＰＴＭが異なると仮定されることができる。

本出願者の教示の種々の側面によると、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を含有するサンプル溶液から複数の前駆体ペプチドまたはタンパク質イオンを生成するように構成される、イオン源と、イオン源から複数の前駆体イオンを受容するように構成される、質量分析器（例えば、四重極質量フィルタ）と、質量分析器から透過させられるイオンを受容し、前駆体イオンにＥｘＤ反応を受けさせるように構成される、ＥｘＤ反応セルと、（例えば、前駆体ペプチドイオンおよび断片イオンならびにＥｘＤ反応によって生成される荷電低減種を質量選択的に検出するための）検出器または質量分析器とを備える、質量分析計システムが提供される。本システムはまた、ｍ／ｚ単離窓のそれぞれの内側の前駆体イオンにＥｘＤ反応を受けさせるよう、ＥｘＤ反応セルへの複数のｍ／ｚ単離窓を使用して、前駆体イオンの質量範囲をスキャンすることと、ｍ／ｚ単離窓のそれぞれに対応する、ＥｘＤ反応に起因する生成イオンの複数のＥｘＤスペクトルを生成することであって、少なくとも、第１のｍ／ｚ単離窓に対応する第１のＥｘＤスペクトルは、１つまたはそれを上回るＥｘＤ断片イオンおよび第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンの１つまたはそれを上回る荷電低減種を提示する、ことと、少なくとも部分的に、第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種のｍ／ｚおよび前駆体イオンの１つまたはそれを上回る荷電低減種（例えば、前駆体ペプチドイオンの単独荷電低減種）のｍ／ｚに基づいて、第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの該１つまたはそれを上回る種の前駆体荷電状態ならびに分子量を判定することとを行うように構成される、コントローラを備えることもできる。種々の側面では、本システムはさらに、イオン源へのサンプル溶液の直接注入のためのポンプを備えることができる。いくつかの側面では、ｍ／ｚ単離窓は、約１Ｄａの範囲を有することができる。

いくつかの側面では、以下の付加的プロセスのうちの１つまたはそれを上回るものは、データ収集のために上記で説明される同一のコントローラを使用して、またはオフラインデータ処理として別のプロセッサ（すなわち、コンピュータ）を使用して、行われることができる。本教示の種々の側面によると、第１のｍ／ｚ単離窓に対応する第１のＥｘＤスペクトルは、第１の荷電低減種を提示することができ、第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体ペプチドまたはタンパク質イオンのうちの第１の種の前駆体荷電状態は、第１の荷電低減種のｍ／ｚおよび前駆体ペプチドまたはタンパク質イオンのうちの第１の種のｍ／ｚの関数として判定され、第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体ペプチドまたはタンパク質イオンのうちの第１の種の分子量は、前駆体ペプチドまたはタンパク質イオンのうちの第１の種の前駆体荷電状態およびｍ／ｚの関数として判定される。いくつかの関連側面では、第１のＥｘＤスペクトルはまた、第２の荷電低減種も提示することができ、コントローラはさらに、第２の荷電低減種が第１の荷電低減種の多重低減種または第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体ペプチドまたはタンパク質イオンのうちの第２の種の荷電低減種を表すかどうかを判定するように構成されることができる。

いくつかの側面では、コントローラはさらに、ｍ／ｚ単離窓のそれぞれの内側の前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種のそれぞれの前駆体荷電状態および分子量を判定し、質量範囲にわたって類似分子量を提示する前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種の前駆体荷電状態のそれぞれの前駆体荷電状態パターンを判定し、各個別のｍ／ｚ単離窓に対応するＥｘＤスペクトル内の１つまたはそれを上回るＥｘＤ断片イオンを、個別のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種のそれぞれの前駆体荷電状態パターンと相関させるように構成されることができる。一例として、前駆体荷電状態パターンは、ｍ／ｚ単離窓のそれぞれの内側の前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種のそれぞれの相対存在量に基づいて、コントローラによって判定されることができる。いくつかの側面では、例えば、前駆体荷電状態パターンは、ｍ／ｚ単離窓のそれぞれに対応するＥｘＤスペクトル内の前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種のそれぞれの単独荷電低減種の強度に基づいて、コントローラによって判定されることができる。

本教示の種々の側面によると、本システムは、サンプル中に存在するペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列を特性評価するために使用されることができる。一例として、コントローラは、前駆体イオンのうちの第１の種のｍ／ｚ単離窓に対応するＥｘＤスペクトル内のＥｘＤ断片イオンピークの間の質量の差に基づいて、前駆体イオンのうちの選択された第１の種の中の１つまたはそれを上回るアミノ酸を判定するように構成されることができる。加えて、いくつかの側面では、コントローラはさらに、前駆体イオンのうちの選択された第１の種の中のアミノ酸配列を少なくとも部分的に再構成するように構成されることができる。関連側面では、コントローラはさらに、前駆体イオンのうちの選択された第１の種の部分的に再構成されたアミノ酸配列を、既知のペプチドまたはタンパク質配列のデータベースと比較し（例えば、相同性検索）、前駆体イオンを形成するようにイオン化されたサンプルからのペプチドまたはタンパク質イオンを同定するように構成されることができる。

種々の側面では、コントローラはさらに、選択されたｍ／ｚ単離窓に対応する複数のＥｘＤ断片イオンスペクトルを比較するように構成されることができ、類似分子量の前駆体イオンのうちの複数の種の類似ＥｘＤ断片イオンパターンは、類似アミノ酸配列上の異なる翻訳後修飾の存在を示す。

本出願者の教示のこれらおよび他の特徴が、本明細書に記載される。

本発明の前述および他の目的ならびに利点は、付随の図面を参照して、以下のさらなる説明からより完全に理解されるであろう。当業者は、以下で説明される図面が、例証目的のためにすぎないことを理解するであろう。図面は、いかようにも本出願者の教示の範囲を限定することを意図していない。

図１は、本出願者の教示の種々の実施形態の一側面による、例示的ＭＳ−ＥＣＤシステムを概略図で図示する。 図２は、本出願者の教示の種々の実施形態の一側面による、図１のシステムを用いて行われることができるサンプル分析の例示的方法を概略図で図示する。 図３は、図１および２の例示的方法に従って取得された例示的ＭＳ調査スキャンを描写する。 図４は、図２の方法に従って取得された９８１ｍ／ｚのｍ／ｚ単離窓の例示的ＥＣＤスペクトルを描写する。 図５は、複数のｍ／ｚ単離窓にわたる複数のＥＣＤスペクトルに対応するヒートマップを描写する。 図６は、図４のＥＣＤと図５のヒートマップとの間の対応と、図２の種々の側面による、１つまたはそれを上回る前駆体イオンの荷電状態および分子量の判定とを明示的に描写する。 図７は、図２の種々の側面による、１つまたはそれを上回る前駆体イオンの荷電状態および分子量の判定を明示的に描写する。 図８は、図２の種々の側面による、図５のヒートマップを使用する荷電状態パターンおよび断片化パターンの判定を概略的に描写する。 図９は、図２の種々の側面による、複数のＥＣＤスペクトルの例示的相関を概略的に描写する。 図１０は、図２の種々の側面による、デコンボリューションされたＥＣＤスペクトルに基づくタンパク質の例示的アミノ酸シークエンシングおよび同定を概略的に描写する。 図１１は、図２の種々の側面による、デコンボリューションされたＥＣＤスペクトルの例示的アミノ酸シークエンシングを概略的に描写する。

明確にするために、以下の議論は、そうすることが便宜的または適切であれば、ある具体的詳細を省略しながら、本出願者の教示の実施形態の種々の側面を詳説するであろうことが理解されるであろう。例えば、代替実施形態における同類または類似特徴の議論は、多少短縮され得る。周知の着想または概念もまた、簡潔にするために、さらに詳細に議論されない場合がある。当業者は、本出願者の教示のいくつかの実施形態が、実施形態の徹底的な理解を提供するためのみに本明細書に記載される、具体的に説明される詳細のうちのあるものを全ての実装では要求しない場合があることを認識するであろう。同様に、説明される実施形態は、本開示の範囲から逸脱することなく、一般的な常識に従った改変または変動の影響を受けやすくあり得ることが明白となるであろう。以下の実施形態の詳細な説明は、いかなる様式でも本出願者の教示の範囲を限定すると見なされるものではない。

本明細書で使用されるような「約」および「実質的に同一」という用語は、例えば、現実世界での測定または取扱手順を通して、これらの手順における不慮の誤差を通して、電気的要素の製造の差異／欠陥を通して、電気損失を通して、起こり得る数量の変動、ならびにそのような変動が従来技術によって実践される既知の値を包含しない限り、同等であるものとして当業者によって認識されるであろう変動を指す。典型的には、「約」という用語は、記述された値の１／１０、例えば、±１０％だけ、記述される値または値の範囲を上回る、または下回ることを意味する。例えば、約＋３Ｖ ＤＣの電圧を要素に印加することは、＋２．７Ｖ ＤＣ〜＋３．３Ｖ ＤＣの電圧を意味することができる。同様に、値が「実質的に」同一と言われる場合、値は、最大５％だけ異なり得る。「約」または「実質的に」同一という用語によって修飾されるかどうかにかかわらず、請求項に記載される定量的値は、記載された値の均等物、例えば、起こり得るが、当業者によって均等物であると認識されるであろう、そのような値の数量の変動を含む。

本出願者の教示の種々の側面によると、本明細書に説明される方法およびシステムは、従来の「トップダウン」ＥｘＤベースのプロテオミクス方略に起因する、複雑なＥｘＤスペクトルの分析と関連付けられる曖昧性に対処することができる。実際に、そのような複雑性により、「トップダウン」分析の従来の方略は、典型的には、精製サンプルを利用し、および／またはサンプル内の他の被分析物からの干渉を排除するよう、質量分光分析に先立って、１つもしくはそれを上回る時間がかかる複雑なサンプル調製ステップを介して、サンプルを精製する。したがって、ＥｘＤは、既知の精製サンプルの「トップダウン」分析の有望性を示しているが、ＭＳシステム内の着目被分析物の蓄積時間が、ＬＣ時間尺度に対して過剰に短いため、ＥｘＤによって生成される多数の生成イオンの十分な強度を取得することができない場合があるため、本技法は、特に、オンラインＬＣ分離が使用されるときに、複雑なサンプルを分析する際に不十分であり得る。本教示の種々の側面では、本明細書に説明される方法およびシステムは、ＥｘＤ反応で前駆体イオンから生成される荷電低減種においてパターンを判定して利用することによって、検出されたＥｘＤ断片イオンおよびそれが生じた前駆体イオンをより確信を持って相関させるために有用であり得る。加えて、または代替として、本教示の種々の側面による方法およびシステムはまた、前駆体ペプチドの分子量の判定された偏差にもかかわらず、ＥｘＤ断片化プロファイルの類似性に基づいて、ＰＴＭの特性評価を可能にすることもできる。種々の側面では、本明細書に説明される例示的方法およびシステムはまた、ＣＩＤベースのプロテオミクス方略のようなＰＴＭ情報の損失を伴わずに、無傷の着目タンパク質（およびある場合には他の干渉被分析物）を含有する（すなわち、オンラインＬＣ分離を伴わない）注入されたサンプルのＥｘＤベースの分析および／または完全なタンパク質のデノボシークエンシングを可能にすることもできる。

本明細書に説明されるシステム、デバイス、および方法は、描写されるものよりも少ない、多い、または異なる構成要素を伴う、多くの異なる質量分析計システムと併せて使用されることができるが、本教示に従って使用するための例示的質量分析計システム１００が、図１で概略的に図示されている。図１で描写される例示的実施形態に示されるように、質量分析計システム１００は、概して、サンプル源１０２と、イオン源１０４と、第１の質量分析器１０６と、ＥｘＤ反応セル１０８と、質量選択的検出器１１０とを備える。示されるように、システム１００は、加えて、その動作を制御するよう、例えば、別様に本明細書で議論されるような、かつ概して当技術分野で公知であり、本教示に従って修正されるような、１つもしくはそれを上回るＲＦ／ＤＣ電圧の印加を介して、質量分析器１０６およびＥｘＤ反応セル１０８を通したイオンの透過ならびにその内側のイオンの操作を制御するよう、および／または本明細書に説明される種々の例示的側面に従って検出器１１０によって生成されるデータの操作／解釈を制御するよう、第１の質量分析器１０６、ＥｘＤ反応セル１０８、および検出器１１０のうちの１つもしくはそれを上回るものに動作可能に結合されるコントローラ１１２を含むことができる。コントローラ１１２は、単一の構成要素として描写されているが、（ローカルまたは遠隔であるかにかかわらず）１つまたはそれを上回るコントローラは、本明細書に説明される方法のうちのいずれかに従って質量分析計システムを動作させるように構成され得ることが理解されるであろう。実際に、１つまたはそれを上回るコントローラは、ハードウェアもしくはソフトウェア形態を成してもよく、例えば、コントローラ１１２は、別様に本明細書に説明されるように質量分析計を動作させるように実行され得る、その中に記憶されたコンピュータプログラムを有する、好適にプログラムされたコンピュータの形態を成してもよい。実際に、１つまたはそれを上回るコントローラと関連付けられる種々のソフトウェアモジュールは、全て非限定的実施例として、ＭＳ調査スキャンを取得する、ｍ／ｚ単離窓に従って前駆体イオンをスキャンする、前駆体イオンにＥｘＤ反応を受けさせる、検出器によって生成されたデータを受信する、データを分析する（例えば、ピークを同定する）、データ（断片化データ、ＥｘＤスペクトル、アミノ酸配列を含む）を出力する、相同性検索を行う、またはその実施を指図するプログラム可能命令を実行することができる。

サンプル源１０２は、種々の構成を有するが、概して、サンプル（例えば、タンパク質またはペプチドを含有する、もしくは含有する疑いがある溶液）を含有し、および／またはそれによるイオン化のためにイオン源１０４に導入するように構成される。当業者によって理解されるであろうように、イオン源１０４は、種々の液体サンプル源に流体的に結合され、（例えば、１つまたはそれを上回る導管、チャネル、管類、パイプ、毛細管等を通して）そこから液体サンプルを受容することができる。非限定的実施例として、サンプル源１０２は、分析されるサンプルのリザーバ、またはそれを通してサンプルが注入され得る入力ポートを備えることができる。いくつかの側面では、例えば、サンプル源は、サンプルをイオン源１０４に連続的に流入させるための注入ポンプ（例えば、シリンジポンプ）を備えることができる。代替として、また、非限定的実施例として、分析される液体サンプルは、オンライン液体クロマトグラフィカラムからの溶離液の形態であることができるが、好ましい実施形態では、１つまたはそれを上回るサンプル調製ステップ（例えば、多次元ＬＣ分離、電気泳動、ジスルフィド結合低減等）が、オフラインで行われることができる。実際に、別様に本明細書で議論されるように、本方法およびシステムのいくつかの例示的実施形態は、いくつかの複雑なサンプルのためのサンプル調製ステップの削減および／またはオンライン分離技法の排除を可能にすることができる。

イオン源１０４は、種々の構成を有することができるが、概して、サンプル源１０２のサンプル内のペプチドおよび／またはタンパク質からイオンを生成するように構成される。一例示的側面では、イオン源１０４は、少なくとも部分的にイオン化チャンバの中へ延在する出口端で終端するサンプル源１０４と直接または間接的に流体連通する導管を含むことができる。液体サンプルが（例えば、複数の微液滴として）出口端からイオン化チャンバの中へ放出されると、微液滴内に含有されるペプチドおよび／またはタンパク質は、イオン源１０４によってイオン化される（すなわち、帯電させられる）ことができる。液滴内の液体（例えば、溶媒）が蒸発すると、タンパク質またはペプチドイオンは、放出され、質量分析器１０６への透過のための開口に向かって、かつそれを通して引き込まれることができる。当技術分野で公知であり、本明細書の教示に従って修正される、いくつかの異なるデバイスは、イオン源１０４として利用され得ることが理解されるであろう。非限定的実施例として、イオン源１０４は、エレクトロスプレーイオン化デバイス、噴霧器支援エレクトロスプレーデバイス、化学イオン化デバイス、噴霧器支援微粒化デバイス、光イオン化デバイス、レーザイオン化デバイス、サーモスプレーイオン化デバイス、およびソニックスプレーイオン化デバイスであることができる。

質量分析器１０６は、種々の構成を有することができるが、概して、イオン源１０４によって生成されるサンプルイオンを処理する（例えば、濾過する、スキャンする、捕捉する）ように構成される。非限定的実施例として、質量分析器１０６は、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれ、本教示の種々の側面に従って修正される、Ｊａｍｅｓ Ｗ． ＨａｇｅｒおよびＪ． Ｃ． Ｙｖｅｓ Ｌｅ Ｂｌａｎｃによる著作であり、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（２００３； １７： １０５６−１０６４）で発表された、「Ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｏｎ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａ Ｑ−ｑ−Ｑ_{ｌｉｎｅａｒ} ｉｏｎ ｔｒａｐ （Ｑ ＴＲＡＰ（Ｒ）） ｍａｓｓｓ ｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ」と題された論文で概して説明されるような、四重極ロッドセット（例えば、ＱＴＲＡＰ（Ｒ） Ｑ−ｑ−Ｑハイブリッド線形イオントラップ質量分析計内のＱ１）であることができる。種々の側面では、質量分析器１０６は、それを通した透過のための着目イオンの範囲を選択するように操作され得る、従来の透過ＲＦ／ＤＣ四重極質量フィルタとして操作されることができる。一例として、四重極ロッドセットＱ１は、質量分解モードで動作するために好適なＲＦ／ＤＣ電圧を提供されることができる。当業者によって理解されるであろうように、Ｑ１の物理的および電気的性質を考慮して、印加されたＲＦおよびＤＣ電圧のパラメータは、Ｑ１が、複数のｍ／ｚ単離窓にわたって走査され得る、ｍ／ｚ通過帯域を有する四重極電場を確立するように選択されることができる。すなわち、各ｍ／ｚ単離窓において、通過帯域内に入るｍ／ｚ比を有するイオンが、大部分が平静な四重極電場を横断することができる一方で、通過帯域外になるｍ／ｚ比を有するイオンは、四重極電場によって軌道減衰に陥り、したがって、四重極ロッドセットＱ１を横断することを妨げられる。当業者によって理解されるであろうように、質量分析計システム１００は、加えて、そこから上流（例えば、ＲＦ単独集束イオンガイドＱ０、微分移動度フィルタ（ＤＭＳ））もしくは下流（例えば、Ｑ３）に１つまたはそれを上回る付加的要素を含むことができる。また、システム内にいくつかのイオン光学要素があってもよいことも当業者に明白となるであろう。

図１に示されるように、例示的質量分析計システム１００は、加えて、ＥｘＤ反応セル１０８を含み、その内側で、質量分析器１０６によって透過させられる前駆体ペプチドまたはタンパク質イオンは、非限定的実施例として、電子捕獲反応（すなわち、ＥＴＤ反応セル）または電子移動反応（すなわち、ＥＴＤ反応セル）を受けることができる。当技術分野で公知であり、本明細書の教示に従って修正される、任意のＥｘＤまたはイオン・イオン反応デバイスは、ＥｘＤセル１０８として利用され得ることが理解されるであろう。非限定的実施例として、ＥｘＤセル１０８は、フーリエ変換質量分析計（ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）、ＲＦ四重極イオントラップ（例えば、Ｑ−ｑ−Ｑ三連四重極質量分析計内のＱ２）（例えば、Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ． Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｒａｄｉｏ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｉｏｎ Ｔｒａｐ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ２００４， Ａｕｇ． １； ７６（１５）： ４２６３−６）、および米国特許第６，９９５，３６６号、第７，１４５，１３９号、および第７，７７５，０３４号を参照）、オービトラップ型デバイス（例えば、米国特許第７，７１４，２８３号を参照）、またはクロス型イオン・イオン反応デバイス（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４１９１８２１号）であることができ、ＥｘＤデバイスを説明する上記の例示的参考文献のそれぞれの教示は、参照することによってその全体として組み込まれる。

ＥＣＤ反応は、通常、奇数の電子とラジカル種を形成するように自由電子と相互作用する、多重プロトン化分子Ｍを伴う。
ＥＣＤとは対照的に、ＥＴＤは、代わりに、電荷移動反応における電子ドナーとして、前駆体イオン（例えば、アントラセンまたはフルオランテンのラジカル多環芳香族アニオン）と反対電荷の試薬イオン（例えば、Ａ⁻、試薬アニオン）を採用する。
電子を前駆体カチオンの不完全な分子軌道に追加することは、解離閾値を超えるために十分である場合、電子受容体イオンの断片化を引き起こす、結合エネルギーを放出する。しかしながら、ＥＣＤまたはＥＴＤのいずれかの場合では、電子を受容する全ての前駆体イオンが、必ずしも解離するわけではない。むしろ、多くの場合において、開裂した断片イオンに加えて、ＥｘＤ反応は、加えて、前駆体イオンの１つまたはそれを上回る荷電低減種（例えば、単独荷電低減種［Ｍ＋ｎＨ］^{（ｎ−１）＋}、二重荷電低減種［Ｍ＋ｎＨ］^{（ｎ−２）＋}、三重荷電低減種［Ｍ＋ｎＨ］^{（ｎ−３）＋}等）を産生する。

図１に示されるように、いったん各ｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンがＥｘＤセル１０８内で反応させられると、生成イオン（荷電低減種および断片イオンを含む）は、検出器１１０によるＥｘＤ生成イオンの検出に先立って、さらなる分析のために、１つまたはそれを上回る質量分析器に移動させられることができる。一例として、ＥｘＤセル１０８と検出器１１０との間に配置される質量分析器は、例えば、そこから生成イオンをスキャンするために、飛行時間（ＴＯＦ）質量分析モジュール、四重極質量分析モジュール、線形イオントラップ（ＬＩＴ）モジュール、および同等物を含むが、それらに限定されない、任意の好適な質量分析計モジュールを備えることができる。いずれにしても、複数のｍ／ｚ単離窓のそれぞれに対応するＥｘＤスペクトルは、検出器１１０による生成イオンの検出に基づいて獲得されることができる。実際に、検出器１１０は、種々の構成を有することができるが、概して、質量分析器１０６および／またはＥｘＤセル１０８によって透過させられるイオンを検出するように構成される。一例として、検出器（例えば、電子増倍管、マルチチャネルプレート、または他のイオン電流測定デバイス）は、質量分析器１０６およびＥｘＤセル１０８を通して透過させられるイオンを検出するために効果的であり得る。検出されたイオンデータは、メモリに記憶され、コンピュータまたはコンピュータソフトウェアによって分析されることができる。

さらに、描写されていないが、質量分析計システム１００は、質量分析計システム１００の種々の要素内および要素間で好適な真空または真空差を提供するように、任意の好適な数の真空ポンプを備えることができる。例えば、真空差は、概して、質量分析器１０６が真空下にある間に、イオン源１０４が大気圧で維持されることができるように、イオン源１０４と質量分析器１０６との間に印加される。また、描写されていないが、質量分析計システム１００はさらに、本教示による質量分析計システム１００の動作を可能にするために、任意の好適な数のコネクタ、電源、ＲＦ（高周波）電源、ＤＣ（直流）電源、ガス源、および任意の他の好適な構成要素を備え得ることが理解されるであろう。

ここで図２を参照すると、本教示の種々の側面による、図１の質量分析計システムを操作するための例示的方法が描写されている。ステップ２０１に示されるように、方法２００は、ペプチドまたはタンパク質を含有するサンプルをサンプル源１０２からイオン源１０４に送達することによって始まることができ、それによって、サンプルは、ステップ２０２に示されるようにイオン化される。いったんペプチドまたはタンパク質がイオン化されると、いくつかの側面では、ＭＳ調査スキャンが、ステップ２０３に示されるように取得されることができる。一例として、質量分析計システム１００は、質量分析器が広範囲のｍ／ｚにわたってスキャンする質量フィルタモードで質量分析器１０６を操作することによって、またはＥｘＤセル１０８が透過モードである（すなわち、ペプチドまたはタンパク質イオンが、電子をそこに移動させることなくＥｘＤセル１０８を通って流動する）間に、検出器１１０として使用されるＴＯＦ質量分析計の場合に非質量選択的透過モードで質量分析器１０６を操作することによって、調査スキャンスペクトルもしくはＭＳスペクトルを取得することができる。このようにして、検出器１１０は、おそらく、本教示に従ってさらなる分析のために選択され得る、種々のピークを同定するように、広い質量範囲内の全ての前駆体イオンを検出することができる。例えば、ここで図３を参照すると、精製されていない炭酸脱水酵素を含有するサンプル（ならびに他のペプチドおよびタンパク質）がエレクトロスプレーイオン源によってイオン化され、次いで、イオンがＴＯＦ質量分析器によって検出された、ＭＳ調査スキャンが描写されている。本実施例では、さらなる分析のために選択されている、約９５０〜約１０００Ｄａの範囲が、拡大図で示されている。図３に示されるように、これらの範囲はそれぞれ、それぞれが所与のｍ／ｚで重複する異なる種からの複数のタンパク質またはペプチドイオンの存在に起因し得る、複数のピークを提示する。

いくつかの側面では、特定の着目質量範囲（例えば、９５０〜１０００Ｄａ）は、例えば、ＭＳ調査スキャンおよび着目タンパク質イオンの起こり得るｍ／ｚのアプリオリな知識に基づくことができ、質量分析器１０６は、ステップ２０４で、ＥｘＤセル１０８への質量範囲を横断して複数のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンをスキャンする帯域通過を反復して提供するよう、操作されることができる。ｍ／ｚ単離窓は、種々の狭い幅（例えば、５Ｄａ未満、約２〜５Ｄａ、約１Ｄａ）を有することができ、ステップ２０５で、ＥｘＤセル１０８内の十分な蓄積／反応時間を可能にするように、種々の速度でスキャンされることができる。種々の実施形態では、例えば、質量分析器１０６は、公称上同一のｍ／ｚを伴う前駆体ペプチドまたはタンパク質イオンのみが、ＥｘＤセルの中へ透過させられるように、約１Ｄａのｍ／ｚ単離窓幅において操作されることができる。サンプル源１０２がイオン源１０４へのサンプルの直接注入を利用する場合において、したがって、前駆体イオンの数量は、オンラインＬＣ分離を利用するフロントエンド分離方略の場合のように、ＬＣ溶出時間（例えば、特定のタンパク質またはペプチドが溶出されるであろう、ＬＣ中の滞留時間窓）によって制約されないであろうことを理解されたい。したがって、各ｍ／ｚ単離窓のための蓄積／反応時間は、溶出時間から独立して選択され、例えば、ｍ／ｚ単離窓内の十分な前駆体イオンが、ＥｘＤ反応に起因する種々の生成イオンの検出可能な強度を提供するためにＥｘＤセル１０８内で反応させられ得るように、選択されることができる。種々の実施形態では、各ｍ／ｚ単離窓の前駆体スキャンは、非限定的実施例として、５分を上回る透過持続時間を有することができる。さらに、システム１００が、代わりに、広い質量範囲にわたって全ての前駆体イオンのＥｘＤスペクトルを獲得し得るため、着目下位範囲を選択するステップはもちろんのこと、ステップ２０３のように調査スキャンを取得するステップは、必要ではあり得ないことが理解されるであろう。これは、着目質量範囲が広いときに、ＥｘＤによるさらなる分析のためにいずれの前駆体イオンを選択するかについて、いかなる決定も排除し得るが、有意量のサンプルが要求され得るため、そのようなプロセスは、時間がかかって非効率的であり得る。

ステップ２０５では、次いで、ＥｘＤセル１０８へスキャンされるｍ／ｚ単離窓内のイオンは、（例えば、ＥｘＤセル１０８内で捕捉される、またはそれを通して透過させられる電子もしくは試薬イオンとの相互作用を介して）ＥｘＤ反応を受け、それによって、（上記で議論されるような）ＥｘＤ断片イオンおよび荷電低減種を含む、生成イオンの形成をもたらす。ステップ２０６では、次いで、ＥｘＤ生成イオン（および任意の残存前駆体イオン）は、ステップ２０６のように各ｍ／ｚ単離窓のＥｘＤスペクトルを生成するよう、検出器１１０によって検出されることができる。例えば、ここで図４を参照すると、質量分析器１０６が、９８１ｍ／ｚ（約１Ｄａのｍ／ｚ単離窓幅）の前駆体イオンを（６分のスペクトル蓄積のために）ＥＣＤ能力を伴う四重極ＴＯＦ質量分析計内の電子と反応させ、生成イオンが、検出器１１０としてのＴＯＦ分析器によって検出される、ＥＣＤスペクトルが描写されている。図４に示されるように、ＥＣＤ反応後に検出される最も強力なピークは、９８１ｍ／ｚにおける未反応前駆体イオンであり、ならびに種々の他のピークが、より低いおよび高いｍ／ｚの両方の生成イオンを表す。第１のｍ／ｚ単離のためのＥｘＤ反応生成物の検出に応じて、次いで、次のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンは、任意の数のｍ／ｚ単離窓に関して、ＥｘＤ反応セルの中へスキャンされること等ができる。

そのような様式で、ＥｘＤスペクトルは、図５に示されるように、複数のＥｘＤ反応によって生成される約１００〜１３００Ｄａのｍ／ｚの検出された生成イオンの強度（より暗い／赤い＝より強力）を示すように、９５０〜１０００Ｄａの例示的着目質量範囲にわたって前駆体スキャンからの複数のＥｘＤスペクトルを組み合わせる、ヒートマップによって表され得る、ｍ／ｚ単離窓毎に取得されることができ、ヒートマップ内の各水平線は、１Ｄａの幅を有する、異なるｍ／ｚ単離窓を表す。概して、図５のヒートマップを調べると、ＭＳ調査スキャン内の主要なピークに対応する特定のｍ／ｚ単離窓の生成イオンの平均強度は、概して、より高いことが観察されるであろう。すなわち、前駆体イオン（強力なより暗い／赤い線）が、１ｍ／ｚ増分で９５０〜１０００Ｄａのｍ／ｚの範囲にわたってスキャンされると、ヒートマップは、ＭＳスペクトルの主要なピークに交差する水平点線に沿って、増加した平均強度を示す（図３のＭＳスペクトルは、前駆体スキャンとＭＳ調査スキャンとの間の本対応を実証するように反転および回転させられている）。図６はさらに、図５のヒートマップと各ｍ／ｚ単離窓のＥＣＤスペクトルとの間の対応を実証する。図６に示されるように、図４のＥＣＤスペクトルの差込図を水平点線に沿った生成イオンの強度と比較することによって、ヒートマップは、９８１Ｄａのｍ／ｚを有する前駆体イオンのＥＣＤ反応に起因する生成イオンの強度を示す。一例として、９８１Ｄａにおける前駆体イオンに対応する水平線における図６のヒートマップは、約７９２Ｄａ、約９８１Ｄａ（すなわち、前駆体イオン）、約１０４７Ｄａ、約１１２２Ｄａ、および約１２０８Ｄａのｍ／ｚにおける生成イオンの増加した強度を描写する。

また、本教示の種々の側面によると、ＥＣＤスペクトルはさらに、ｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのＥＣＤ反応に起因する生成イオンの特定の側面を判定するように、（例えば、コントローラ１１２によって）分析されることができる。第１に、上記のように、電子が前駆体イオンによって受容されるＥｘＤ反応は、電子受容体の断片化（すなわち、ペプチド骨格のアミド結合に沿ったタンパク質またはペプチド前駆体イオンの開裂）をもたらすことができるが、ＥｘＤ反応のエネルギーは、前駆体イオンの１つまたはそれを上回る荷電低減種が生じるように、断片化を引き起こすためには不十分であり得る。すなわち、電子の追加は、（そこからのペプチドの開裂の欠如に起因して）前駆体イオンの質量を実質的に変化させることなく、ペプチドまたはタンパク質前駆体イオンに対して減少した電荷を提示する、荷電低減種（ＣＲＳ）を生成することができる。したがって、所与のｍ／ｚの前駆体イオン（すなわち、［Ｍ＋ｎＨ］^ｎ＋）毎に、荷電低減種（例えば、単独荷電低減種［Ｍ＋ｎＨ］^{（ｎ−１）＋}および二重荷電低減種［Ｍ＋ｎＨ］^{（ｎ−２）＋}）が、前駆体イオンに対してより高いｍ／ｚにおいてＥｘＤスペクトル内で出現するであろう
図６を参照すると、例えば、約１０４７Ｄａ、約１１２２Ｄａ、および約１２０８Ｄａにおける観察されたピークが、おそらく、９８１ｍ／ｚにおいて１つまたはそれを上回る前駆体イオンのこれらの荷電低減種を表す一方で、代わりに、ＥＣＤスペクトル内の他のより小さい（あまり強力ではない）ピークは、前駆体イオンに対してより高いｍ／ｚおよびより低いｍ／ｚの両方の断片イオンを表すことが理解されるであろう。

実際に、本教示の種々の側面によると、図２のステップ２０７では、前駆体イオンより大きいｍ／ｚを有する、ＥｘＤ生成イオンスペクトル内の主要なピーク（すなわち、起こり得るＣＲＳ）は、前駆体荷電状態（すなわち、前駆体イオンの電荷、［Ｍ＋ｎＨ］^ｎ＋の中のｎ）および／またはＣＲＳが導出された前駆体イオンの（例えば、原始質量単位もしくはａｍｕにおける）前駆体分子量を判定するように分析されることができる。非限定的実施例として、９８１ｍ／ｚ前駆体イオンの荷電状態は、以下のように、第１の観察されたＣＲＳのｍ／ｚと前駆体イオンの９８１ｍ／ｚとの間の差の関数として判定されることができる。
式中、Ｚ_１、９８１ｍ／ｚにおける前駆体イオンのうちの１つの種の荷電状態であり、Ｙ_１は、第１のＣＲＳのｍ／ｚ（すなわち、１０４６．９７１４２Ｄａ）であり、Ｘは、前駆体イオンのうちの第１の種のｍ／ｚ（すなわち、９８１．５１５０２）である。上記の例示的関数に基づいて、前駆体荷電状態は、１６＋（すなわち、ｎ＝［Ｍ＋１６Ｈ］^１６＋の中の１６）であると判定される。

同様に、ＣＲＳが導出された前駆体イオンの前駆体分子量（すなわち、ｍ／ｚの中のｍ）は、例えば、判定された前駆体荷電状態およびその９８１ｍ／ｚを踏まえて、ステップ２０７で判定されることができる。一例として、９８１ｍ／ｚ前駆体イオンの分子量（Ｍ_１）は、以下の関数によって約１５７００ａｍｕであると判定されることができる。
式中、ｍ_Ｈは、水素の原子質量である。

図６に示されるように、９８１ｍ／ｚにおけるＥｘＤスペクトルはまた、同一前駆体イオンの多重低減種
を表し得る、または代替として、９８１Ｄａのｍ／ｚも提示する、異なる前駆体イオンの単独荷電低減種を表し得る、付加的ＣＲＳも提示する。例えば、約１１２２ＤａにおけるＣＲＳが導出されるイオンの荷電状態が、第１のＣＲＳの状態に合致することが確認される場合（すなわち、前駆体がＺ_１＝１６＋を有する場合、１０４６．９７１４２Ｄａにおける第１のＣＲＳは、（Ｚ_１−１）＝１５＋の荷電状態を提示するであろう）、約１１２２Ｄａにおける第２のＣＲＳは、前駆体イオンの二重ＣＲＳであることが判定されることができる。例えば、（１１２１．７６６４５ｍ／ｚにおける）第２のＣＲＳが、以下の関数によって、（Ｙ_１＝１０４６．９７１４２Ｄａにおける）第１のＣＲＳの二重低減種を表すかどうかが判定されることができる。
式中、Ｙ_２は、第２の荷電低減種のｍ／ｚ（すなわち、１１２１．７６６４５Ｄａ）である。Ｚ_２が（Ｚ_１−１）に実質的に等しい場合には、第２のＣＲＳは、第１のＣＲＳの二重低減種を表すと仮定されることができる。しかしながら、Ｚ_２≠（Ｚ_１−１）である場合には、代わりに、第２の荷電低減種が、第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの第２の種（例えば、前駆体イオンのうちの第１の種と異なるアミノ酸配列のペプチド）の荷電低減種を表す。上記の関数を利用して、９８１ｍ／ｚ前駆体のＥＣＤスペクトル内の約１１２２Ｄａにおけるピークが、約１０４７Ｄａにおける第１の単独低減ＣＲＳのものと同一の前駆体イオン
の１４＋二重低減ＣＲＳを表すことが確認された。同様に、直接先行する関数における基礎として第２のＣＲＳを利用して、約１２０８Ｄａにおけるピークが、同一前駆体イオンの１３＋三重低減ＣＲＳ
を表すことも確認された。

第２のＣＲＳが同一前駆体イオンの二重低減種を表すかどうかを判定するために利用される上記の関数は、１つの例示的方法であることが理解されるであろう。一例として、ＥｘＤスペクトルが第２のＣＲＳを提示するとき、代替として、以下の関数によって、第２のＣＲＳが二重低減種を表すかどうかが判定されることができる。
Ｍ_Ｘ＝Ｍ_１である場合には、第２のＣＲＳは、同一前駆体イオンの二重低減種を表す。しかしながら、Ｍ_Ｘ≠Ｍ_１ある場合には、代わりに、第２のＣＲＳは、ｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの第２の種
（例えば、
を有する前駆体イオンと異なるアミノ酸配列のペプチド）の荷電低減種を表す。

そのような例示的様式で、図２のステップ２０７に示されるように、ｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種の荷電状態および分子量は、したがって、各ｍ／ｚ単離窓に対応するＥｘＤスペクトル内の前駆体およびＣＲＳピークから（例えば、ピーク同定モジュールを使用するコントローラ１１２によって）判定されることができる。例えば、ここで図７を参照すると、９７５Ｄａにおけるｍ／ｚ単離窓に対応するＥＣＤスペクトルは、ＣＲＳの４つの種を描写し、それぞれ、それらが９７５Ｄａにおいて前駆体イオンのうちの同一または異なる種のＣＲＳに対応するかどうかを判定するように分析される。上記で説明される例示的関係を使用して、ＥＣＤスペクトル内の９７５Ｄａにおける前駆体ピークは、前駆体イオンのうちの２つの異なる種を表し、一方（すなわち、前駆体_１）が、３０＋の荷電状態および約２９，１００ａｍｕの分子量を提示し、他方（すなわち、前駆体_２）が、１６＋の荷電状態および約１５，５００ａｍｕの分子量を提示することが判定された。具体的には、１００６ＤａにおけるＣＲＳピークが、前駆体_１の単独荷電低減種を表すことが見出された一方で、約１０４１Ｄａ、１１２６Ｄａ、および１２００ＤａにおけるＣＲＳピークは、それぞれ、前駆体_２の単独、二重、および三重荷電低減種を表すことが判定された。

本教示の種々の側面では、（ステップ２０７で）複数のｍ／ｚ単離窓にわたって前駆体イオンの前駆体荷電状態および分子量を計算した後、図６で描写されるヒートマップはさらに、各ｍ／ｚ単離窓に対応するＥｘＤスペクトルの間の関係を判定するように分析されることができる。例えば、図８を参照すると、種々のｍ／ｚ単離窓におけるＥｘＤは、任意のパターンが、同一荷電状態および類似分子量を有する前駆体イオンに起因する断片イオンの存在下で存在するかどうかを判定するように、比較されることができる。実際に、本教示の種々の側面による方法およびシステムは、特定のＥｘＤスペクトル内で検出される断片イオンを、断片イオンが導出される前駆体イオンと相関させるために、異なるｍ／ｚ単離窓に対応するＥｘＤスペクトルにわたる実質的に同一の断片化パターンおよびＥｘＤスペクトルにわたる荷電状態パターンの存在を利用する。同一荷電状態の前駆体イオンの分子量の差は、前駆体が相互と異なることを示唆する傾向があろうが、本教示は、コンボリューションされたＥｘＤスペクトル内で観察される断片イオンを、ｍ／ｚ単離窓内のいくつかの前駆体イオンのうちの１つとより確信を持って関連付けるよう、前駆体イオンの間の分子量の差を、アミノ酸配列内のＰＴＭまたはわずかな差の存在によるものと見なす。

一例として、ｍ／ｚ単離窓にわたる類似荷電状態の前駆体イオンの間の分子量のわずかな差が、（アミノ酸配列またはそれと関連付けられるＰＴＭの軽微な差を伴うが）実質的に類似するペプチドまたはタンパク質前駆体を示すことを仮定して、関連タンパク質前駆体の荷電状態パターンは、ｍ／ｚ単離窓にわたる関連前駆体イオンの相対存在量に基づいて、ステップ２０８で判定されることができる。図８の例示的ヒートマップでは、例えば、荷電状態パターン（すなわち、ＣＲＳパターン差込図）が、質量範囲にわたって（すなわち、複数のｍ／ｚ単離窓にわたって）ステップ２０７で判定される９＋、１６＋、３０＋荷電状態前駆体毎に判定される。具体的には、本例示的な描写される実施形態では、種々の荷電状態の前駆体の荷電状態パターンは、質量範囲にわたる（すなわち、各前駆体荷電状態の単独荷電低減種に対応する点線に沿った）単独荷電低減種の強度に基づいて判定される。すなわち、ＣＲＳパターン差込図上の１６＋荷電状態パターンは、１６＋１番目のＣＲＳ（Ｚ＝１５＋）に対応する点線に沿った各ｍ／ｚ単離窓における検出された強度であり、３０＋荷電状態パターンは、３０＋１番目のＣＲＳ（Ｚ＝２９＋）に対応する点線に沿った検出された強度であり、９＋荷電状態パターンは、９＋１番目のＣＲＳ（Ｚ＝８＋）に対応する点線に沿った検出された強度である。

ステップ２０９では、本教示による方法およびシステムはまた、各荷電状態の関連前駆体イオンに対応する少なくとも部分的な断片化パターンを同定するように、異なるｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンから産生される断片イオンを比較することもできる。一例として、図８のヒートマップを具体的に参照すると、異なるｍ／ｚ単離窓内の関連前駆体イオン（すなわち、類似分子量、同一荷電状態）のＥＣＤスペクトルは、図８の垂直のボックスによって実証されるように、断片イオンのパターンの類似性を提示し得ることが観察される。一例として、１６＋断片パターンでは、ｍ／ｚ単離窓の間の断片イオンピークは、同一ｍ／ｚにおいて存在し、また、各個別のｍ／ｚ単離窓に対応するＥＣＤスペクトル内で検出されるように、１６＋の荷電状態および約１５５００〜１６０００ａｍｕの分子量を有する、前駆体の１５＋ＣＲＳの相対強度に比例して、ｍ／ｚ単離窓の間で強度が変動することが分かり得る。また、これらの類似断片化パターンは、前駆体イオンが、実質的に同一のアミノ酸配列を有する（すなわち、種々の断片イオンによって表されるアミノ酸の配列が、前駆体の間の計算された分子量の差にもかかわらず、それでもなお実質的に同一である）ことを確認することを理解されたい。

再度、図２を参照すると、ステップ２１０では、複数のＥｘＤスペクトルは、各ＥｘＤスペクトル内の検出された断片イオンが導出された、前駆体イオンを同定し、それによって、特定の前駆体イオンに対応する断片イオンを分解するように、デコンボリューションされることができる。例えば、図９で概略的に図示されるように、各ＥｘＤスペクトル内の断片イオンは、複数の前駆体荷電状態のうちの１つに起因する断片イオンのｍ／ｚを別個に同定するように、ステップ２０８で判定される荷電状態パターンおよびステップ２０９で判定される断片化パターンと相関させられることができる。本例示的実施形態では、図９ｃの相関（Ｃ３０_ｉ）は、以下のように、荷電状態パターン（図９ａ）に基づいて、図９ｂのヒートマップで描写されるＺ＝３０＋における断片ピーク数ｉ毎に判定された。
Ｉ_３０（ｍ／ｘ）は、ｍ／ｚが、図９ｂの「垂直」尺度である、スキャンされた前駆体ｍ／ｚである、正規化された３０＋荷電状態パターン（図９ａ内の線）を表し、
ｉ_３０は、正規化された３０＋荷電状態パターンの平均強度であり、
Ｆｒａｇ_ｉ（ｍ／ｚ）は、ｍ／ｚが、スキャンされた前駆体ｍ／ｚである、図９ｂ内の具体的ｍ／ｚにおける正規化されたｉ番目のピークの強度パターンであり、
ｆｒａｇ_ｉ（ｍ／ｚ）は、図９ｂ内の具体的ｍ／ｚを伴う正規化されたｉ番目のピークの平均強度である。

上記の例示的相関関数では、平均値は、選択のための閾値の判定を容易にするよう減算されることが、当業者によって理解されるであろう。例えば、相関がない場合、Ｃ３０_ｉ値は、ゼロになるはずであり、完璧に相関性がある場合、Ｃ３０_ｉ値は、１になるはずである。閾値は、約０．５に設定されることができるが、本閾値または任意の他の閾値も、本教示に従って使用されることができる（例えば、０．３）。類似相関は、同様に、前駆体荷電状態の複数の種の存在にもかかわらず、断片イオンおよびそれらが導出される前駆体イオンが同定され得る、図９ｄ（９７２Ｄａの前駆体ｍ／ｚにおける前駆体Ｚ＝３０＋の断片スペクトル）および９ｅ（９８１Ｄａの前駆体ｍ／ｚにおける前駆体Ｚ＝１６＋の断片スペクトル）の例示的なデコンボリューションされたスペクトルを生成するように、１６＋ならびに９＋荷電状態のそれぞれに関して行われることができる。さらに、上記で説明される相関は、例示的にすぎず、他の代替的な相関関数または変数が、前駆体イオンの複数の種を有するｍ／ｚ単離窓に対応する、ＥｘＤスペクトル内の断片を分離するために、本教示に従って使用され得ることを理解されたい。

ステップ２１０で、異なる前駆体イオンから産生される断片イオンの分離に応じて、本教示はまた、断片イオンが導出されたタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列のより決定的な特性評価を提供することもできる。例えば、サンプル中の炭酸脱水酵素の存在は、（ステップ２０７のように）Ｚ＝３０＋前駆体の約２９，０００ａｍｕの実験的に判定された分子量に基づいて、ならびに炭酸脱水酵素の理論的断片化に良好に対応するｃおよびｚ型断片のｍ／ｚを提示する、図９ｄのデコンボリューションされたスペクトルによる検証を通して、確認されることができる。

また、本教示による方法およびシステムは、精製されていないサンプル中の既知のタンパク質の確認および特性評価を可能にすることができるが、本教示は、加えて、タンパク質中のアミノ酸配列の少なくとも部分的な判定を通して、未知のタンパク質の同定を可能にする。一例として、１６＋前駆体に対応するタンパク質の同一性は、最初に未知であったが、図９ｅのデコンボリューションされたスペクトルは、その分離が特定のアミノ酸残基の質量に合致させられる、ピークペアの判定に基づく前駆体タンパク質内のデノボシークエンシングによる、一意のアミノ酸配列の判定を可能にすることができる。例えば、ステップ２１１では、１６＋の荷電状態（および約１５５００〜１６０００ａｍｕの実験的に判定された分子量）を有する前駆体の相関ＥＣＤスペクトルから、種々のピークは、連続アミノ酸の１つまたはそれを上回る部分的配列を同定するように比較されることができる。ステップ２１２では、例えば、図１０で描写される、判定された配列のうちの１つまたはそれを上回るものを、既知のアミノ酸配列のデータベースと比較すること（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ／ｍｓｈｏｍｅ．ｈｔｍで入手可能なＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒを介する等の相同性検索）によって、配列１７の合致は、スーパーオキシドジスムターゼ１としてサンプル中に同様に存在するタンパク質を確動的に同定する。したがって、本教示の種々の側面による方法およびシステムは、不純サンプル中に存在する既知のタンパク質のより決定的な特性評価を可能にすることができるだけではなく、他の干渉タンパク質またはペプチドの存在にもかかわらず、未知のタンパク質からのデコンボリューションされたペプチド断片のデノボシークエンシングでも使用されることができる。さらに、図１１に示されるように、Ｚ＝１６＋において潜在的前駆体としてスーパーオキシドジスムターゼ１を同定した後、ＥＣＤスペクトルは、再度、スーパーオキシドジスムターゼ１中で公知である他のアミノ酸配列が、ＥＣＤスペクトル内にも存在したことを確認するように、分析されることができる。また、図１１に示されるように、アミノ酸配列への変化（例えば、Ａｌａ１のアセチル化）はさらに、検出されたＥＣＤ断片の部分的再構成、ならびに種々のｍ／ｚ単離窓内で検出される１６＋スーパーオキシドジスムターゼ前駆体の分子量のわずかな差の存在に基づくサンプル中の種々のＰＴＭ状態の特性評価に基づいて、確認されることができる。

当業者は、日常的にすぎない実験を使用して、本明細書に説明される実施形態および実践の多くの均等物を把握する、または解明できるであろう。一例として、種々の構成要素の寸法および種々の構成要素に印加される特定の電気信号（例えば、振幅、周波数等）の明示的値は、例示的にすぎず、本教示の範囲を限定することを意図していない。したがって、本発明は、本明細書に開示される実施形態に限定されるものではないが、法の下で許可される限り広範囲に解釈されるものである、以下の請求項から理解されるものであることが理解されるであろう。

本明細書で使用される項の見出しは、編成目的のためにすぎず、限定的として解釈されるものではない。本出願者の教示は、種々の実施形態と併せて説明されるが、本出願者の教示が、そのような実施形態に限定されることは意図されない。対照的に、本出願者の教示は、当業者によって理解されるであろうように、種々の代替物、修正、および均等物を包含する。

Claims (21)

1. イオン源を利用し、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を含有するサンプル溶液から複数の前駆体ペプチドまたはタンパク質イオンを生成するステップと、
   複数のｍ／ｚ単離窓を使用して、前駆体イオンの質量範囲をスキャンするステップと、
   前記ｍ／ｚ単離窓のそれぞれの内側の前記前駆体イオンにＥｘＤ反応を受けさせるステップと、
   前記ｍ／ｚ単離窓のそれぞれに対応する複数のＥｘＤスペクトルを生成するよう、前記ＥｘＤ反応のそれぞれに起因する生成イオンを検出するステップであって、少なくとも、第１のｍ／ｚ単離窓に対応する第１のＥｘＤスペクトルは、１つまたはそれを上回るＥｘＤ断片イオンおよび前記第１のｍ／ｚ単離窓内の前記前駆体イオンの１つまたはそれを上回る荷電低減種を提示する、ステップと、
   少なくとも部分的に、前記第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種のｍ／ｚおよび前記前駆体イオンの前記１つまたはそれを上回る荷電低減種のｍ／ｚに基づいて、前記第１のｍ／ｚ単離窓内の前記前駆体イオンのうちの前記１つまたはそれを上回る種の前駆体荷電状態ならびに分子量を判定するステップと、
   を含む、サンプルを処理する方法。
2. 直接注入を介して、前記サンプル溶液を前記イオン源に導入するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記ｍ／ｚ単離窓はそれぞれ、約１Ｄａの範囲を有する、請求項１に記載の方法。
4. 前記第１のｍ／ｚ単離窓に対応する前記第１のＥｘＤスペクトルは、第１の荷電低減種を提示し、前記第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの第１の種の前記前駆体荷電状態は、前記第１の荷電低減種の前記ｍ／ｚおよび前駆体イオンのうちの前記第１の種の前記ｍ／ｚの関数として判定される、請求項１に記載の方法。
5. 前記第１のＥｘＤスペクトルはさらに、第２の荷電低減種を提示し、前記方法はさらに、前記第２の荷電低減種が前記第１の荷電低減種の多重低減種または前記第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの第２の種の荷電低減種を表すかどうかを判定するステップを含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの前記第１の種の前記分子量は、前駆体イオンのうちの前記第１の種の前記前駆体荷電状態および前記ｍ／ｚの関数として判定される、請求項４に記載の方法。
7. 前記ｍ／ｚ単離窓のそれぞれの内側の前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種のそれぞれの前駆体荷電状態および分子量を判定するステップと、
   類似分子量を提示する前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種の前記前駆体荷電状態のそれぞれの前記質量範囲にわたって前駆体荷電状態パターンを判定するステップと、
   各個別のｍ／ｚ単離窓に対応するＥｘＤスペクトル内の前記１つまたはそれを上回るＥｘＤ断片イオンを、前記個別のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの前記１つまたはそれを上回る種のそれぞれの前記前駆体荷電状態パターンと相関させるステップと、
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記前駆体荷電状態パターンは、前記ｍ／ｚ単離窓のそれぞれの内側の前駆体イオンのうちの前記１つまたはそれを上回る種のそれぞれの相対存在量から判定される、請求項７に記載の方法。
9. 前記前駆体荷電状態パターンは、前記ｍ／ｚ単離窓のそれぞれに対応する前記ＥｘＤスペクトル内の前駆体イオンのうちの前記１つまたはそれを上回る種のそれぞれの単独荷電低減種の強度から判定される、請求項７に記載の方法。
10. 前記前駆体荷電状態パターンを参照することによって、前駆体イオンのうちの前記１つまたはそれを上回る種から選択される第１の種のＥｘＤスペクトルを生成するステップをさらに含み、前記前駆体イオンのうちの前記選択された第１の種の前記ＥｘＤスペクトル内のＥｘＤ断片イオンピークの間の質量の差は、前記前駆体イオンのうちの前記選択された第１の種の中の１つまたはそれを上回るアミノ酸を示す、請求項７に記載の方法。
11. 前記前駆体イオンのうちの前記選択された第１の種の中の前記アミノ酸配列を少なくとも部分的に再構成するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記前駆体イオンのうちの前記選択された第１の種の部分的に再構成されたアミノ酸配列を、既知のペプチドまたはタンパク質配列のデータベースと比較し、前記前駆体イオンの前記第１の種を形成するようにイオン化される前記ペプチドまたはタンパク質を同定するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. 選択されたｍ／ｚ単離窓に対応する複数の前記ＥｘＤ断片イオンスペクトルを比較するステップをさらに含み、類似分子量の前駆体イオンのうちの複数の種の類似ＥｘＤ断片イオンパターンは、類似前駆体イオン上の異なる翻訳後修飾の存在を示す、請求項７に記載の方法。
14. 少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を含有するサンプル溶液から複数の前駆体ペプチドまたはタンパク質イオンを生成するように構成される、イオン源と、
    前記イオン源から前記複数の前駆体イオンを受容するように構成される、質量分析器と、
    質量分析器から透過させられる前記前駆体イオンを受容し、前記前駆体イオンにＥｘＤ反応を受けさせるように構成される、ＥｘＤ反応セルと、
    検出器と、
    コントローラであって、前記コントローラは、
    ｍ／ｚ単離窓のそれぞれの内側の前記前駆体イオンにＥｘＤ反応を受けさせるよう、前記ＥｘＤ反応セルへの複数のｍ／ｚ単離窓を使用して、前記前駆体イオンの質量範囲をスキャンすることと、
    前記ｍ／ｚ単離窓のそれぞれに対応する、前記ＥｘＤ反応に起因する生成イオンの複数のＥｘＤスペクトルを生成することであって、少なくとも、第１のｍ／ｚ単離窓に対応する第１のＥｘＤスペクトルは、１つまたはそれを上回るＥｘＤ断片イオンおよび前記第１のｍ／ｚ単離窓内の前記前駆体イオンの１つまたはそれを上回る荷電低減種を提示する、ことと、
    少なくとも部分的に、前記第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種のｍ／ｚおよび前記前駆体イオンの前記１つまたはそれを上回る荷電低減種のｍ／ｚに基づいて、前記第１のｍ／ｚ単離窓内の前記前駆体イオンのうちの前記１つまたはそれを上回る種の前駆体荷電状態ならびに分子量を判定することと
    を行うように構成される、コントローラと、
    を備える、質量分析計システム。
15. 前記イオン源への前記サンプル溶液の直接注入のためのポンプをさらに備える、請求項１４に記載のシステム。
16. 各ｍ／ｚ単離窓は、約１Ｄａの範囲を有する、請求項１４に記載のシステム。
17. 前記第１のｍ／ｚ単離窓に対応する前記第１のＥｘＤスペクトルは、第１の荷電低減種を提示し、
    前記第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの第１の種の前記前駆体荷電状態は、前記第１の荷電低減種の前記ｍ／ｚおよび前駆体イオンのうちの前記第１の種の前記ｍ／ｚの関数として判定され、
    前記第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの前記第１の種の前記分子量は、前駆体イオンのうちの前記第１の種の前記前駆体荷電状態および前記ｍ／ｚの関数として判定される、
    請求項１４に記載のシステム。
18. 前記第１のＥｘＤスペクトルはさらに、第２の荷電低減種を提示し、前記コントローラはさらに、前記第２の荷電低減種が前記第１の荷電低減種の多重低減種または前記第１のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの第２の種の荷電低減種を表すかどうかを判定するように構成される、請求項１７に記載のシステム。
19. 前記コントローラはさらに、
    前記ｍ／ｚ単離窓のそれぞれの内側の前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種のそれぞれの前駆体荷電状態および分子量を判定することと、
    前記質量範囲にわたって、類似分子量を提示する前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種の前記前駆体荷電状態のそれぞれの前駆体荷電状態パターンを判定することと、
    各個別のｍ／ｚ単離窓に対応する前記ＥｘＤスペクトル内の前記１つまたはそれを上回るＥｘＤ断片イオンを、前記個別のｍ／ｚ単離窓内の前駆体イオンのうちの１つまたはそれを上回る種のそれぞれの前記前駆体荷電状態パターンと相関させることと
    を行うように構成される、請求項１４に記載のシステム。
20. 前記コントローラはさらに、前記ｍ／ｚ単離窓のそれぞれに対応する前記ＥｘＤスペクトル内の前駆体イオンのうちの前記１つまたはそれを上回る種のそれぞれの単独荷電低減種の強度に基づいて、前記前駆体荷電状態パターンを判定するように構成される、請求項１９に記載のシステム。
21. 前記コントローラはさらに、選択されたｍ／ｚ単離窓に対応する複数の前記ＥｘＤ断片イオンスペクトルを比較するように構成され、類似分子量の前駆体イオンのうちの複数の種の類似ＥｘＤ断片イオンパターンは、類似前駆体イオン上の異なる翻訳後修飾の存在を示す、請求項１４に記載のシステム。