CN107533031B

CN107533031B - 自上而下蛋白质鉴定方法

Info

Publication number: CN107533031B
Application number: CN201680022534.1A
Authority: CN
Inventors: 马场崇
Original assignee: DH Technologies Development Pte Ltd
Current assignee: DH Technologies Development Pte Ltd
Priority date: 2015-05-13
Filing date: 2016-05-10
Publication date: 2020-09-29
Anticipated expiration: 2036-05-10
Also published as: EP3295179A1; CN107533031A; EP3295179A4; JP2018517125A; EP3295179B1; JP6833714B2; US20180095092A1; WO2016181299A1

Abstract

本文描述的系统及方法可提供使用ExD对样本中蛋白质或肽的“自上而下”质谱分析，在某些方面，此经由将所述样本直接输注到所述离子源而不进行在线LC分离同时对由不纯样本所产生的所述ExD谱中的模糊度进行去卷积而进行。举例来说，根据本教示的各种方面的方法及系统可在ExD之后利用电荷还原物种中的图案来使所述ExD碎片与其前体离子相关，以便更加确信地鉴定所检测的产物离子所源自的所述前体离子。

Description

自上而下蛋白质鉴定方法

相关申请案

本申请案要求2015年5月13日申请的序列号为62/161,129的美国临时申请案的优先权的权益，所述临时申请案的全部内容以引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及质谱法，且更特定来说涉及在肽的质谱分析中利用电子捕获解离(ECD)的方法及设备。

背景技术

质谱法(MS)是用于确定具有定量应用及定性应用两者的测试物质的元素组成的分析技术。举例来说，MS可用于鉴定未知化合物及/或通过观察其碎片化来确定特定化合物的结构。最近，MS在蛋白质组学中起着越来越重要的作用，这归因于MS策略在表征及鉴定肽及蛋白质方面的速度、特异性及敏感性。

在基于MS的蛋白质组学中表征蛋白质的一个策略是“自下而上”的方法，其中在将肽碎片进行MS分析(MS¹)或汇接MS/MS分析(MS²)之前对所关注的蛋白质进行酶消化(例如，经由胰蛋白酶、LysC等)及一或多个分离(例如，多维LC)。在“自下而上”MS²工作流程中，碰撞诱导解离(CID)通常用于将在第一MS阶段中选择的前体肽碎片进一步解离成产物离子碎片。接着可从产物离子碎片的质量推导出前体肽离子的氨基酸序列。在CID中，离子化前体离子与惰性中性气体及/或氮分子之间的能量碰撞振动并最终解离(裂解)主链酰胺键，借此产生b型(N-末端)及y-型(C-末端)产物离子。通过鉴定若干产物离子肽，可确定原始蛋白质(例如，通过参考蛋白质或基因组数据库中的已知序列)。然而，因为CID反应通常仅在最弱的肽酰胺键处发生，所以沿肽主链的不完全碎片化可使得肽序列的完全重建变得困难。对蛋白质组学中使用CID的另一个关键限制是在解离期间翻译后修饰(PTM)的损失。通常仅弱结合到肽主链的PTM(例如，磷酸化或硫酸化的官能团)可在碎片化期间从肽剥离，借此防止MS²谱中PTM的检测及表征。

与上述“自下而上”方法相反，替代的基于MS的蛋白质组学策略利用其中使完整蛋白质在质谱仪中进行解离的“自上而下”分析。虽然常规CID通常解离太少的位点而无法提供完整信息来表征完整蛋白质的完整氨基酸序列，但电子捕获解离(ECD)及电子转移解离(ETD)(统称为“ExD”)被认为是CID的可行替代方案以用于完整蛋白质的“自上而下”测序，这归因于ExD的更加完整的肽主链的碎片化。举例来说，ECD利用前体离子及低能电子之间的离子相互作用，其导致通过多电荷前体捕获电子，此迅速诱导N-αC键的更广泛的裂解以主要产生c-型(N-末端)及z-型(C-末端)产物离子。另一方面，ETD使试剂离子与具有相反电荷的多电荷前体离子反应以将电子转移到其上。因为基于ExD的解离的能量通常不(或更少)贯穿前体肽而分布，所以弱结合的PTM更可能保持附接到肽，以用于在第二MS分析中的随后检测。然而，“自上而下”方法的一个可能的障碍是MS²谱的复杂性及难以确定多电荷产物离子的质量，其可在其电荷状态下变化达到其多电荷前体离子的电荷状态。由于由产物离子之间的电荷状态的变化引起的“自上而下”MS²谱的解释的模糊性，一些“自上而下”方法进一步利用通过气相离子-离子相互作用的电荷状态操控来将产物离子剥离为单电荷状态，例如经由质子转移反应。此外，虽然ECD已经在已知纯化蛋白质的“自上而下”分析中得到证实，但现实世界应用涉及复杂的未知样本，这可能在MS¹或MS²谱的分析中添加进一步的模糊性。因为这些复杂样本通常需要进行在线LC分离以消除来自其它分析物的干扰，所以积累时间相对于LC时间尺度可能过短而无法在高效ECD之后获得足够强度的产物离子。

因此，仍然需要用于利用ExD的蛋白质的质谱分析的改进的方法及设备，其不一定依赖于复杂样本的多维在线分离。

发明内容

根据申请人的教示的各个方面，本文描述的方法及设备可提供使用ExD的样本中蛋白质或肽的“自上而下”质谱分析，在某些方面，经由将所述样本直接输注到所述离子源而不进行在线LC分离，同时对所述ExD谱中的模糊度进行去卷积。举例来说，根据本教示的各个方面的方法及系统可在ExD之后利用电荷还原物种中的图案以将所述ExD碎片与其前体离子相关，以便更加自信地鉴定所检测的产物离子自其产生的所述前体离子。在某些方面，本文描述的方法及系统还可使得能够基于仍在ExD谱中产生相同氨基酸序列的前体离子的分子量的偏差来表征PTM。在各个方面，本文描述的示范性方法及系统借此可使得能够对含有完整的所关注的蛋白质(并且在一些情况下是其它干扰性分析物)的输注样本进行ExD-MS分析，以便于使得能够对完整蛋白质的重新测序，而不会如基于CID的蛋白质组学策略那样丢失PTM信息。

根据申请人的教示的各个方面，提供一种处理样本的方法，其包括：利用离子源从含有至少一个肽(例如，具有大于20个氨基酸并可能具有生物功能、消化蛋白质碎片的较大的肽)或蛋白质(例如，通常大于100个氨基酸并且通常展现3D结构及生物功能，例如，完整的未消化的蛋白质，例如抗体)的样本溶液产生多个前体肽或蛋白质离子(“前体离子”)，并使用多个m/z隔离窗(例如，质量范围的窄子范围)扫描所述前体肽或蛋白质离子的质量范围)。可使所述m/z隔离窗中的每一个内的所述前体离子进行ExD反应，检测到从所述ExD反应中的每一个产生的产物离子，以便于产生对应于所述m/z隔离窗中的每一个的多个ExD谱，其中对应于所述m/z隔离窗中的第一m/z隔离窗的至少第一ExD谱展现一或多个ExD碎片离子及在所述第一m/z隔离窗内的所述前体离子的一或多个电荷还原物种。所述方法可进一步包括至少部分基于所述第一m/z隔离窗内的前体离子的所述一或多个物种的m/z及所述前体离子的所述一或多个电荷还原物种的m/z而确定针对所述第一m/z隔离窗内的所述前体离子的一或多个物种的前体电荷状态及分子量。通过非限制性实例的方式，所述m/z隔离窗中的每一个可为窄m/z窗(例如，约1Da)，这取决于用于扫描重量范围的质量分析器(例如，四极质量过滤器)的配置。虽然可在样本溶液离子化之前使用一或多个样本制备步骤(例如，LC分离、电泳、二硫键还原等)以减少样本内的其它分析物对所关注的肽的MS分析的干扰，根据本教示的各个方面的方法可包括经由直接输注将样本溶液引入离子源(例如，无需在线LC分离)。

在本文描述的方法的一些方面中，对应于所述第一m/z隔离窗的所述第一ExD谱可展现第一电荷还原物种，其中所述第一m/z隔离窗内的前体离子的第一物种的所述前体电荷状态可被确定为随所述第一带电还原物种的所述m/z及前体离子的所述第一物种的所述m/z而变化。另外，在一些方面中，所述第一m/z隔离窗内的前体离子的所述第一物种的分子量可被确定为随所确定的前体电荷状态及前体离子的所述第一物种的所述m/z而变化。在一些相关方面，所述第一ExD谱(即，对应于所述第一m/z隔离窗的所述ExD谱)也可展现第二带电还原物种，且所述方法可进一步包括确定所述第二电荷还原物种是表示所述第一带电还原物种的多重还原物种还是所述第一m/z隔离窗内的前体离子的第二物种的带电还原物种。替代地或另外，当所述第一ExD谱展现第二带电还原物种时，根据本教示的方法可在一些方面中确定所述第二电荷还原物种是表示所述第一带电还原物种的双重还原物种还是所述第一m/z隔离窗内的蛋白质或肽前体离子的第二物种的带电还原物种(例如，与肽前体离子的所述第一物种具有不同氨基酸序列的肽)。

在各个方面中，当所述第一ExD谱展现在所述第一m/z隔离窗内的前体离子的第二物种的第二带电还原物种(例如，与前体离子的所述第一物种具有不同氨基酸序列的肽)时，所述方法还可包括确定前体电荷状态并将各种电荷状态的碎片彼此分离以进行更确定的分析。举例来说，根据本教示的各个方面，本文所描述的方法还可利用跨越质量范围的所述ExD谱中的图案(例如，由对应于不同m/z隔离窗的ExD反应产生的电荷还原物种的身份的图案)来关联及/或对所述ExD谱去卷积，以帮助鉴定所检测的ExD碎片离子自其产生的前体离子的物种。在一些方面中，举例来说，所述方法还可包括确定针对所述m/z隔离窗中的每一个内的前体离子的一或多个物种中的每一个的前体电荷状态及分子量；跨越所述质量范围针对展现类似分子量的前体离子的一或多个物种的所述前体电荷状态中的每一个而确定前体电荷状态图案；以及将对应于每一相应m/z隔离窗的所述ExD谱中的所述一或多个ExD碎片离子与针对在所述相应m/z隔离窗处的前体离子的所述一或多个物种中的每一个的所述前体电荷状态图案相关。通过实例的方式，可从所选择的m/z隔离窗中的每一个处的前体离子的所述一或多个物种中的每一个的相对丰度来确定所述前体电荷状态图案。在一些方面，举例来说，可从对应于所选择的m/z隔离窗中的每一个的所述ExD谱中的前体离子的所述一或多个物种中的每一个的单个带电还原物种的相对强度来确定所述前体电荷状态图案。

根据申请人的教示的各个方面，所述方法可进一步包括通过参考所述前体电荷状态图案来产生针对从前体离子的所述一或多个物种选择的第一物种的ExD谱，其中针对所述前体离子的所述所选择的第一物种的所述ExD谱中的ExD碎片离子峰值之间的质量差指示所述前体离子的所述所选择的第一物种中的一或多个氨基酸(所谓的重新测序)。在相关方面，所述方法可进一步包括至少部分重建所述前体离子的所述所选择的第一物种中的所述氨基酸序列(例如，基于与所述前体离子的所述所选择的第一物种相关的所述ExD碎片离子的身份)。另外在一些方面中，可将所述前体离子的所述所选择的第一物种的部分经重建的氨基酸序列与已知肽序列的数据库进行比较(例如，经由同源性搜索)，以鉴定样本内含有的肽或蛋白质。

在各个示范性方面中，所述方法可进一步包括比较对应于跨越所述质量范围的所选择的m/z隔离窗口的多个所述ExD碎片离子谱，其中针对具有类似分子量的前体离子的多个物种的类似ExD碎片离子图案可指示存在对类似肽氨基酸序列的不同的翻译后修饰。也就是说，可假设展现类似碎片化图案的前体离子的各种物种之前的分子量的小差异在其PTM(具有相同或大体上相同的氨基酸主链)方面有所不同，而不是具有大体上不同的氨基酸序列的肽。

根据申请人的教示的各个方面，提供一种质谱仪系统，其包括：离子源，其经配置以从含有至少一个肽或蛋白质的样本溶液产生多个前体肽或蛋白质离子；质量分析器(例如，四极质量过滤器)，其经配置以从所述离子源接收所述多个前体离子；ExD反应池，其经配置以接收从所述质量分析器发射的离子，并使所述前体离子进行ExD反应；及检测器或质量分析器(例如，用于质量选择性检测所述前体肽离子及碎片离子以及由所述ExD反应产生的带电还原物种)。所述系统还可包括控制器，其经配置以使用多个m/z隔离窗将所述前体离子的质量范围扫描到所述ExD反应池，以便于使所述m/z隔离窗中的每一个内的所述前体离子进行ExD反应；产生从对应于所述m/z隔离窗中的每一个的所述ExD反应所产生的产物离子的多个ExD谱，其中对应于第一m/z隔离窗的至少第一ExD谱展现一或多个ExD碎片离子及所述第一m/z隔离窗内的所述前体离子的一或多个电荷还原物种；以及至少部分基于所述第一m/z隔离窗内的前体离子的所述一或多个物种的m/z及所述前体离子的所述一或多个电荷还原物种(例如，所述前体肽离子的单个带电还原物种)的m/z而确定针对所述第一m/z隔离窗内的所述前体离子的一或多个物种的前体电荷状态及分子量。在各个方面中，所述系统可进一步包括用于将所述样本溶液直接输注到所述离子源的泵。在一些方面中，所述m/z隔离窗中可具有约1Da的范围。

在一些方面中，可使用上述用于数据采集的相同控制器或使用另一个处理器(即，计算机)作为离线数据处理来执行以下额外过程中的一或多个。根据本教示的各个方面，对应于所述第一m/z隔离窗的所述第一ExD谱可展现第一电荷还原物种，其中所述第一m/z隔离窗内的前体肽或蛋白质离子的第一物种的所述前体电荷状态被确定为随所述第一带电还原物种的所述m/z及前体肽或蛋白质离子的所述第一物种的所述m/z而变化，且其中所述第一m/z隔离窗内的前体肽或蛋白质离子的所述第一物种的所述分子量被确定为随所述前体电荷状态及前体肽或蛋白质离子的所述第一物种的所述m/z而变化。在一些相关方面中，所述第一ExD谱还可展现第二带电还原物种，其中所述控制器可进一步经配置以确定所述第二电荷还原物种是表示所述第一带电还原物种的多重还原物种还是所述第一m/z隔离窗内的前体肽或蛋白质离子的第二物种的带电还原物种。

在一些方面中，所述控制器可进一步经配置以确定针对所述m/z隔离窗中的每一个内的前体离子的一或多个物种中的每一个的前体电荷状态及分子量；跨越所述质量范围针对展现类似分子量的前体离子的一或多个物种的所述前体电荷状态中的每一个而确定前体电荷状态图案；以及将对应于每一相应m/z隔离窗的所述ExD谱中的所述一或多个ExD碎片离子与针对所述相应m/z隔离窗内的前体离子的所述一或多个物种中的每一个的所述前体电荷状态图案相关。通过实例的方式，可基于所述m/z隔离窗口中的每一个内的前体离子的所述一或多个物种中的每一个的相对丰度而由所述控制器来确定所述前体电荷状态图案。在一些方面中，举例来说，可基于对应于所述m/z隔离窗中的每一个的所述ExD谱中的前体离子的所述一或多个物种中的每一个的单个带电还原物种的强度而由所述控制器来确定所述前体电荷状态图案。

根据本教示的各个方面，所述系统可用于表征所述样本中存在的肽或蛋白质的氨基酸序列。通过实例的方式，所述控制器可经配置以基于对应于前体离子的所述第一物种的所述m/z隔离窗的所述ExD谱中的ExD碎片离子峰值之间的质量差来确定所述前体离子的所选择的第一物种中的一或多个氨基酸。另外，在一些方面中，所述控制器可进一步经配置以在所述前体离子的所述所选择的第一物种中至少部分重建所述氨基酸序列。在相关方面中，所述控制器可经进一步配置以将所述前体离子的所述所选择的第一物种的部分经重建的氨基酸序列与已知肽或蛋白质序列的数据库进行比较(例如，同源性搜索)，以鉴定来自样本的经离子化以形成所述前体离子的肽或蛋白质。

在各个方面中，所述控制器可经进一步配置以比较对应于所选择的m/z隔离窗的多个所述ExD碎片离子谱，其中针对具有类似分子量的前体离子的多个物种的类似ExD碎片离子图案指示存在对类似氨基酸序列的不同的翻译后修饰。

本文阐述申请人的教示的这些及其它特征。

附图说明

参考附图，将从以下进一步的描述更全面地了解本发明的前述及其它目的及优点。所属领域的技术人员将理解，下文描述的图式仅用于说明目的。并不希望图式以任何方式限制申请人的教示的范围。

图1以示意图说明根据申请人的教示的各个实施例的一个方面的示范性MS-ECD系统。

图2以示意图说明根据申请人的教示的各个实施例的一个方面的可用图1的系统执行的样本分析的示范性方法。

图3描绘根据图1及2的示范性方法获得的示范性MS测量扫描。

图4描绘根据图2的方法获得的981m/z的m/z隔离窗的示范性ECD谱。

图5描绘对应于跨越多个m/z隔离窗的多个ECD谱的热图。

图6论证地描绘图4的ECD与图5的热图之间的对应关系，并根据图2的各个方面确定一或多个前体离子的电荷状态及分子量。

图7论证地描绘根据图2的各个方面的一或多个前体离子的电荷状态及分子量的确定。

图8论证地描绘根据图2的各个方面的使用图5的热图来确定电荷状态图案及碎片化图案。

图9示意性地描绘根据图2的各个方面多个ECD谱的示范性关联。

图10示意性地描绘根据图2的各个方面基于去卷积ECD谱的示范性氨基酸测序及蛋白质鉴定。

图11示意性地描绘根据图2的各个方面的去卷积ECD谱的示范性氨基酸测序。

具体实施方式

应了解，为清楚起见，以下论述将解释申请人的教示的实施例的各个方面，同时在任何方便或适当的情况下省略某些特定细节。举例来说，在替代实施例中对相似或类似特征的论述可略微缩短。为简洁起见，也不更详细论述众所周知的想法或概念。所属领域的技术人员将认识到，申请人的教示的一些实施例可能不需要每一个实施方案中的某些具体描述的细节，本文对所述细节进行阐述仅用以提供对实施例的透彻理解。类似地，显而易见的是，在不脱离本公开的范围的情况下，所描述的实施例可能容易根据通用知识进行改变或变化。实施例的以下详细描述不应被认为以任何方式限制申请人的教示的范围。

本文所使用的术语“约”及“大体上相同”是指可例如通过下列情况发生的数值数量中的变化：通过在真实世界中测量或处置程序；通过这些程序中的无意错误；通过电元件制造中的差异/故障；通过电损失；以及所属领域的技术人员将认为是等效的变化，只要此类变化不涵盖现有技术实践的已知值。通常，术语“约”意味着大于或小于由所陈述值的1/10所陈述的值或值的范围，例如±10％。例如，向元件施加约+3V DC的电压可意味着电压介于+2.7V DC与+3.3V DC之间。类似地，在值被认为是“大体上相同”的情况下，值可相差高达5％。无论是否由术语“约”或“大体上”相同来修饰，在权利要求书中列举的定量值包含所列举的值的等效物，例如，可发生此类值的数值数量的变化，但将被所属领域的技术人员认为是等效物。

根据申请人教示的各个方面，本文描述的方法及系统可解决与源自常规“自上而下”基于ExD的蛋白质组学策略的复杂ExD谱分析相关联的模糊性。实际上，由于此复杂性，常规的“自上而下”分析通常在质谱分析之前经由一或多个耗时、复杂的样本制备步骤来利用纯化样本及/或对所述样本进行纯化，以便于消除来自样本内的其它分析物的干扰。因此，虽然ExD已经在已知的纯化样本的“自上而下”分析中展示出希望，但所述技术在分析复杂样本时可能不足够，特别是当使用在线LC分离用作MS系统内所关注的分析物的积累时间时相对于LC时间尺度可能过短，以至于无法获得由ExD产生的大量产物离子的足够强度。在本教示的各个方面，本文描述的方法及系统可用于通过确定及利用从ExD反应中的前体离子产生的电荷还原物种中的图案而更加自信地将所检测到的ExD碎片离子与从其产生的前体离子相关。另外或替代地，尽管确定在前体肽的分子量中存在偏差，但根据本发明教示的各个方面的方法及系统也可使得能够基于ExD碎片化分布中的类似性来表征PTM。在各个方面，本文描述的示范性方法及系统还可使含有完整的所关注的蛋白质(以及在某些情况下是其它干扰性分析物)的输注样本的基于ExD的分析(即，无需在线LC分离)及/或完整蛋白质的重新测序成为可能，而不损失如基于CID的蛋白质组学策略中的PTM信息。

尽管本文所描述的系统、装置及方法可与具有比所描绘的更少、更多或不同的组件的许多不同质谱仪系统结合使用，但图1中示意性地说明根据本教示所使用的示范性质谱仪系统100。如在图1中所描绘的示范性实施例中所展示，质谱仪系统100通常包括样本源102、离子源104、第一质量分析器106、ExD反应池108及质量选择检测器110。如所展示，系统100可另外包含控制器112，其可操作地耦合到第一质量分析器106、ExD反应池108及检测器110中的一或多个，以便于控制其操作，例如以经由如本文以其它方式论述并如通常在所属领域中已知且根据本教示修改的一或多个RF/DC电压的施加而控制离子通过的发射，及质量分析器106及ExD反应池108内的离子操控，及/或根据本文所描述的各个示范性方面控制由检测器110产生的数据的操控/解译。应了解，尽管控制器112被描绘为单个组件，但一或多个控制器(无论是本地的还是远程的)可经配置以致使质谱仪系统根据本文描述的任何方法来操作。实际上，一或多个控制器可呈硬件或软件形式，举例来说，控制器112可呈合适编程的计算机的形式，其中存储有计算机程序，所述计算机程序可被执行以致使质谱仪如本文描述的其它方式操作。实际上，与一或多个控制器相关联的各种软件模块可执行可编程指令以获得MS测量扫描，根据m/z隔离窗扫描前体离子，使前体离子进行ExD反应，接收由检测器产生的数据，分析数据(例如，鉴定峰值)，输出数据(包含碎片化数据、ExD谱，氨基酸序列)，并执行或指导同源性搜索的表现，以上所有都以非限性实例的方式。

样本源102具有各种配置，但通常经配置以含有及/或引入样本(例如，含有或怀疑含有蛋白质或肽的溶液)到离子源104，从而进行离子化。如所属领域的技术人员将了解，离子源104可流体地耦合到各种液体样本源并从各种液体样本源接收液体样本(例如，通过一或多个导管、通道、管子、管道、毛细管等)。通过非限制性实例的方式，样本源102可包括待分析的样本的储存器，或可通过其将样本注入的输入端口。在一些方面中，举例来说，样本源可包括用于使样本连续流入离子源104中的输注泵(例如，注射泵)。替代地，也通过非限制性实例的方式，待分析的液体样本可呈来自在线液相色谱柱的洗脱液的形式，但在优选实施例中，可离线执行一或多个样本制备步骤(例如，多维LC分离、电泳、二硫键还原等)。实际上，如本文以其它方式论述，本发明方法及系统的一些示范性实施例可使样本制备步骤减少及/或消除一些复杂样本的在线分离技术。

离子源104可具有各种配置，但通常经配置以从样本源102的样本内的肽及/蛋白质产生离子。在一个示范性方面中，离子源104可包含与样本源104直接或间接流体连通的导管，其终止于至少部分延伸到离子化腔室中的出口端。当液体样本从出口端排出到离子化腔室(例如，作为多个微滴)时，微滴内含有的肽及/或蛋白质可由离子源104离子化(即带电)。当液滴内的液体(例如，溶剂)蒸发时，蛋白质或肽离子可被释放并且被拉向并通过孔隙以发射到质量分析器106。应了解，所属领域中已知的且根据本文中的教示修改的许多不同装置可用作离子源104。通过非限制性实例的方式，离子源104可为电喷射离子化装置、喷雾器辅助电喷射装置、化学离子化装置、喷雾器辅助雾化装置、光离子化装置、激光离子化装置、热喷射离子化装置及声波喷射离子化装置。

质量分析器106可具有各种配置，但通常经配置以处理(例如，过滤、扫描、截留)由离子源104产生的样本离子。通过非限制性实例的方式，质量分析器106可为四极杆组，例如，

Q-q-Q混合线性离子阱质谱仪中的Q1，如一般在标题为“使用Q-q-Q_linear离子阱(Q

)质谱仪的产物离子扫描(Product ion scanning using a Q-q-Q_linear iontrap(Q

)mass spectrometer)”中所描述的，所述文献作者为詹姆斯W.海格(JamesW.Hager)及J.C伊夫勒布朗(J.C Yves Le Blanc)并发表在质谱分析法中的快速通信(Rapid Communications in Mass Spectrometry)(2003；17：1056-1064)中，其全部内容特此以引用的方式并入，并根据本教示的各个方面进行修改。在各个方面，质量分析器106可作为常规发射RF/DC四极质量过滤器进行操作，其可经操作以选择通过其发射的所关注的离子的范围。通过实例的方式，可向四极杆组Q1提供适合于在质量分辨模式下操作的RF/DC电压。如所属领域的技术人员将了解，考虑到Q1的物理及电性质，可选择施加的RF及DC电压的参数，使得Q1建立具有m/z通带的四极场，其可跨越多个m/z隔离窗而被扫描。也就是说，在每一m/z隔离窗处，具有落入通带内的m/z比率的离子可横越四极场而大部分不受扰动，而具有落在通带外的m/z比率的离子被四极场退化为轨道衰减，且因此防止横越四极杆组Q1。如所属领域的技术人员将了解，质谱仪系统100可另外包含其一或多个额外上游元件(例如，仅RF聚焦离子引导件Q0，差分迁移过滤器(DMS))或下游元件(例如，Q3)。对于所属领域的技术人员来说将显而易见的是，系统中可能存在许多离子光学元件。

如图1中所展示，示范性质谱仪系统100另外包含ExD反应池108，在ExD反应池108内，由质量分析器106发射的前体肽或蛋白质离子可进行电子捕获反应(即，ETD反应池)或电子转移反应(即，ETD反应池)，通过非限制性实例的方式。将了解，所属领域已知并根据本文的教示进行修改的任何ExD或离子-离子反应装置可用作ExD池108。通过非限制性实例的方式，ExD池108可为傅立叶变换质谱仪(FT-ICR-MS)、RF四极离子阱(例如Q-q-Q三重四极质谱仪内的Q2)(参见例如巴巴(Baba)等人的射频离子阱中的电子捕获解离(ElectronCapture Dissociation in a Radio Frequency Ion Trap)Anal.Chem.2004年8月1日；76(15)：4263-6及第6,995,366号、第7,145,139号及第7,775,034号美国专利)、轨道阱型装置(参见例如第7,714,283号美国专利)或交叉型离子-离子反应装置(例如，第WO2014191821号PCT公开案)，上文描述ExD装置的示范性参考文献中的每一个的教示的全部内容以引用的方式并入。

ECD反应通常涉及与自由电子相互作用以形成具有奇数个电子的自由基物种的多重质子化分子M：

[M+nH]ⁿ⁺+e^-→[M+nH]^(n-1)+·→ECD碎片

与ECD相反，ETD反而在电荷转移反应中采用与作为电子供体的前体离子(例如，蒽或荧蒽的自由基多芳族阴离子)具有相反电荷的试剂离子(例如，A^-，试剂阴离子)：

[M+nH]ⁿ⁺+A^-→[M+nH]^(n-1)+·→ETD碎片

向前体阳离子的不完全分子轨道添加电子释放结合能，如果足够超过解离阈值，那么其会导致电子受体离子的碎片化。然而，在ECD或ETD的情况下，并非接受电子的所有前体离子必然解离。而是在许多情况下，除裂解的碎片离子之外，ExD反应另外产生前体离子的一或多个电荷还原物种(例如，单电荷还原物种[M+nH]^(n-1)+、双电荷还原物种[M+nH]^(n-2)+、三电荷还原物种[M+nH]^(n-3)+等)。

如图1中所展示，一旦在每一m/z隔离窗内的前体离子在ExD池108内反应，产物离子(包含电荷还原物种及碎片离子)可在由检测器110进行ExD产物离子的检测之前被转移到一或多个质量分析器以用于进一步分析。通过实例的方式，安置在ExD池108与检测器110之间的质量分析器可包括任何合适的质谱仪模块，其包含(但不限于)飞行时间(TOF)质谱分析模块、四极质谱分析模块、线性离子阱(LIT)模块及类似物，例如用于从其扫描产物离子。无论如何，可基于由检测器110对产物离子的检测来获取对应于多个m/z隔离窗中的每一个的ExD谱。实际上，检测器110可具有各种配置，但通常经配置以检测由质量分析器106及/或ExD池108发射的离子。通过实例的方式，检测器(例如，电子倍增器、多通道板或其它离子电流测量装置)可有效地检测发射通过质量分析器106及ExD池108的离子。检测到的离子数据可存储在存储器中并由计算机或计算机软件分析。

此外，虽然未描绘，但质谱仪系统100可包括任何合适数目的真空泵，以在质谱仪系统100的各种元件内及之间提供合适的真空或真空差分。举例来说，真空差分通常施加在离子源104与质量分析器106之间，使得离子源104可保持在大气压力下，同时质量分析器106处于真空中。尽管也未描绘，但将了解，质谱仪系统100可进一步包括任何合适数目的连接器、电源、RF(射频)电源、DC(直流)电源、气体源及用于使根据本教示的质谱仪系统100的操作成为可能的任何其它合适组件。

现在参考图2，图2描绘根据本教示的各个方面的用于操作图1的质谱仪系统的示范性方法。如步骤201中所展示，方法200可通过将含有肽或蛋白质的样本从样本源102递送到离子源104开始，借此样本如步骤202中所展示那样被离子化。一旦肽或蛋白质被离子化，在一些方面中，可如步骤203中所展示那样获得MS测量扫描。通过实例的方式，质谱仪系统100可通过以下方式获得测量扫描谱或MS谱：以质量过滤器模式操作质量分析器106，其中质量分析器扫描跨越宽范围的m/z；或在TOF质谱仪用作检测器110同时ExD池108处于透明模式(即肽或蛋白质离子流过ExD池108而不将电子转移到ExD池108)的情况下以非质量选择性发射模式操作质量分析器106。以此方式，检测器110可检测宽质量范围内的每一个前体离子(可能)来鉴定可选择用于根据本教示而进一步分析的各种峰值。举例来说，现在参考图3，描绘MS测量扫描，其中由电喷射离子源对含有非纯化碳酸酐酶(以及其它肽及蛋白质)的样本进行离子化，接着由TOF质量分析器检测离子。以扩展视图展示从约950到约1000Da的范围，其在此实例中已被选择用于进一步分析。如图3中所展示，这些范围中的每一个展现多个峰值，多个峰值中的每一个可归因于来自在给定m/z处重叠的不同物种的多个蛋白质或肽离子的存在。

在一些方面，所关注的特定质量范围(例如，950到1000Da)可基于(例如)MS测量扫描及所关注的蛋白质离子的可能m/z的先验知识，且质量分析器106可经操作以便于在步骤204中重复提供带通以扫描跨越质量范围到ExD池108的多个m/z隔离窗内的前体离子。m/z隔离窗可具有各种窄宽度(例如，小于5Da、约2到5Da、约1Da)，并且可以各种速率扫描以允许在步骤205中的ExD池108中的足够的积累/反应时间。在各个实施例中，举例来说，质量分析器106可在约1Da的m/z隔离窗宽度下操作，使得仅具有标称上相同m/z的前体肽或蛋白质离子被发射到ExD池中。应了解，在样本源102利用样本到离子源104的直接输注的情况下，前体离子的量将因此不受LC洗脱时间的约束(例如，在其中特定蛋白质或肽将被洗脱的LC期间的保留时间窗)，如在利用在线LC分离的前端分离策略中的情况。因而，可独立于洗脱时间来选择每一m/z隔离窗的，并且例如可选择所述积累/反应时间使得m/z隔离窗内的足够的前体离子可在ExD池108中反应以提供从ExD反应所产生的各种产物离子的可检测强度。在各个实施例中，通过非限制性实例的方式，每一m/z隔离窗的前体扫描可具有大于5分钟的发射持续时间。还将进一步了解，如在步骤203中获得测量扫描的步骤(更不用说选择所关注的子范围)可能不是必需的，这是因为系统100可替代地获取跨越宽质量范围的每一个前体离子的ExD谱。虽然这可能会消除关于选择哪些前体离子用于由ExD来进一步分析的任何决定，但当所关注的质量范围较大时，由于可能需要大量的样本，因此此过程可能是耗时且低效的。

在步骤205中，扫描到ExD池108的m/z隔离窗内的离子接着进行ExD反应(例如，经由与被截留在ExD池108内或通过ExD池108发射的电子或试剂离子的相互作用)，借此导致产物离子的形成，其包含ExD碎片离子及电荷还原物种(如上文所论述)。在步骤206中，接着可由检测器110检测ExD产物离子(及任何残余前体离子)，以便于如步骤206中那样产生针对每一m/z隔离窗的ExD谱。举例来说，现在参考图4，描绘ECD谱，其中质量分析器106将981m/z(m/z隔离窗宽度约为1Da)的前体离子与具有ECD能力(6分钟谱积累)的四极TOF质谱仪中的电子反应，其中由作为检测器110的TOF分析器来检测产物离子。如图4中所展示，在ECD反应之后检测到的最强峰值是在981m/z处的未反应的前体离子，以及表示较低m/z及较高m/z两者的产物离子的各种其它峰值。在检测到用于第一m/z隔离的ExD反应产物之后，对于任何数目的m/z隔离窗，可接着将下一个m/z隔离窗内的前体离子扫描到ExD反应池中，依此类推。

以此方式，可为m/z隔离窗中的每一个获得ExD谱(如图5中所展示)，其可通过热图来表示，所述热图组合来自跨越950到1000Da的所关注的示范性质量范围的前体扫描的多个ExD谱，以指示由多个ExD反应所产生的约100到1300Da的m/z的检测到的产物离子的强度(较暗/红＝较强)，其中热图中的每一水平线表示宽度为1Da的不同m/z隔离窗。一般来说，检验图5中的热图，将观察到，对应于MS测量扫描中的主峰值的特定m/z隔离窗的产物离子的平均强度通常较高。也就是说，当前体离子(强烈的较暗/红线)以一个m/z的增量跨越从950到1000Da的m/z范围扫描时，热图指示沿与MS谱的主峰值交叉的水平虚线的增加的平均强度(图3的MS谱翻转并旋转以证明前体扫描与MS测量扫描之间的对应关系)。图6进一步证明图5的热图与针对每一m/z隔离窗的ECD谱之间的对应关系。如图6中所展示，通过将图4的ECD谱的插图与沿水平虚线的产物离子的强度进行比较，热图指示从具有981Da的m/z的前体离子的ECD反应产生的产物离子的强度。通过实例的方式，在对应于981Da处的前体离子的水平线处的图6的热图描绘在约792Da、约981Da(即，前体离子)、约1047Da、约1122Da及约1208Da的m/z处的产物离子的增加的强度。

此外，根据本教示的各个方面，可进一步分析ECD谱(例如，通过控制器112)以确定从m/z隔离窗内的前体离子的ECD反应所产生的产物离子的特定方面。首先，如上所述，尽管在其中电子被前体离子所接受的ExD反应可导致电子受体的碎片化(即，沿肽主链的胺键的蛋白质或肽前体离子裂解)，但ExD反应能量可能不足以引起碎片化，使得产生前体离子的一或多个电荷还原物种。也就是说，电子的添加可产生电荷还原物种(CRS)，其相对于肽或蛋白质前体离子展现减少的电荷，而不显著改变前体离子的质量(归因于不会从其裂解肽)。因而，针对给定m/z的每一前体离子(即[M+nH]ⁿ⁺)，电荷还原物种(例如，单电荷还原物种[M+nH]^(n-1)+及双电荷还原物种[M+nH]^(n-2)+)将出现在相对于前体离子较高的m/z处的ExD谱中(即，相同质量(m)具有减少的电荷(z)→较高m/z)。参考图6，举例来说，应了解，在约1047Da、约1122Da及约1208Da处观察到的峰值可能表示在981m/z处的一或多个前体离子的这些电荷还原物种，而在ECD谱中的其它较小(较不强烈)峰值替代地表示相对于前体离子具有较高m/z及较低m/z两者的碎片离子。

实际上，根据本教示的各个方面，在图2的步骤207中，可分析具有大于前体离子(即可能的CRS)的m/z的ExD产物离子谱中的主要峰值，以确定前体电荷状态(即，前体离子的电荷，[M+nH]ⁿ⁺中的n)及/或从其衍生CRS的前体离子的前体分子量(例如，呈原子质量单位或者amu)。通过非限制性实例的方式，981m/z前体离子的电荷状态可确定为首先观察到的CRS的m/z与前体离子的981m/z之间的差异的函数，如下：

其中Z₁是在981m/z处的前体离子的一个物种的电荷状态，Y₁是第一CRS的m/z(即，1046.97142Da)，且X是前体离子的第一物种的m/z(即981.51502)。基于以上示范性函数，前体电荷状态被确定为16+(即，在[M+16H]¹⁶⁺中，n＝16)。

类似地，可在步骤207中确定从其衍生CRS的前体离子的前体分子量(即，m/z中的m)，例如根据所确定的前体电荷状态及其981m/z。通过实例的方式，981m/z前体离子的分子量(M₁)可通过以下函数确定为约15700amu：

M₁＝Z₁×(X-m_H)，

其中m_II是氢的原子质量。

如图6中所展示，981m/z处的ExD谱还展现额外的CRS，其可表示相同前体离子的多重还原物种(即Z₁＝16+，M₁≈15700amu)，或替代地可表示也展现981Da的m/z的不同前体离子的单电荷还原物种。举例来说，如果导出约1122Da的CRS的离子的电荷状态被证实与第一CRS的离子的电荷状态相匹配(即，其中前体具有Z₁＝16+，在1046.97142Da处的第一CRS将展现(Z₁-1)＝15+的电荷状态)，那么可确定在约1122Da处的第二CRS是前体离子的双重CRS。举例来说，可通过以下函数确定第二CRS(在1121.76645m/z处)是否表示第一CRS(在Y₁＝1046.97142Da处)的双重还原物种：

其中Y₂是第二带电还原物种的m/z(即，1121.76645Da)。如果Z₂基本上等于(Z₁-1)，那么可假设第二CRS表示第一CRS的双重还原物种。然而，如果Z₂≠(Z₁-1)，那么第二带电还原物种替代地表示第一m/z隔离窗内的前体离子的第二物种的带电还原物种(例如，与前体离子的第一物种具有不同氨基酸序列的肽)。利用以上函数，证实在981m/z前体的ECD谱中约1122Da处的峰值表示与在约1047Da处的第一单独还原CRS的前体离子相同的前体离子(即，Z₁＝16+，M₁≈15700amu)的14+双重还原CRS。同样地，使用第二CRS作为前一个函数的基数，还证实在约1208Da处的峰值表示相同前体离子的13+三重还原的CRS(即，Z₁＝16+，M₁≈15700amu)。

应了解，用于确定第二CRS是否表示相同前体离子的双重还原物种的以上函数是一个示范性方法。通过实例的方式，当ExD谱展现第二CRS时，也可替代地通过以下函数来确定第二CRS是否表示双重还原物种：

M_X＝(Z₁-1)×(X-2m_H)。

如果M_X＝M₁，那么第二CRS表示相同前体离子的双重还原物种。然而，如果M_X≠M₁，那么第二CRS替代地表示在m/z隔离窗内的前体离子的第二物种的带电还原物种(例如，与具有Z₁＝16+及M₁≈15700amu的前体离子具有不同氨基酸序列的肽)。

以此示范性方式，如图2的步骤207中所展示，因此可从对应于每一m/z隔离窗的ExD谱中的前体及CRS峰值来确定(例如，通过使用峰值鉴定模块的控制器112)针对m/z隔离窗内的前体离子的一或多个物种的电荷状态及分子量。举例来说，现在参考图7，对应于在975Da处的m/z隔离窗的ECD谱描绘CRS的四个物种，四个物种中的每一个被分析以确定其是否对应于在975Da处的前体离子的相同或不同物种的CRS。使用上述示范性关系，确定ECD谱中975Da处的前体峰值表示前体离子的两个不同物种，一个(即，前体₁)展现30+的电荷状态及约29,100amu的分子量，且另一个(即，前体₂)展现16+的电荷状态及约15,500amu的分子量。具体来说，发现在1006Da处的CRS峰代表示前体₁的单电荷还原物种，而在约1041Da、1126Da及1200Da处的CRS峰被确定分别表示前体₂的单电荷还原物种、双电荷还原物种及三电荷还原物种。

在本教示的各个方面中，在计算跨越多个m/z隔离窗的前体离子的前体电荷状态及分子量(在步骤207中)之后，可进一步分析图6中描绘的热图以确定对应于每一m/z隔离窗的ExD谱之间的关系。举例来说，参考图8，可比较各种m/z隔离窗处的ExD，以确定在从具有相同电荷状态及类似分子量的前体离子所产生的碎片离子存在的情况下是否存在任何图案。实际上，根据本教示的各个方面的方法及系统利用跨越对应于不同m/z隔离窗的ExD谱的大体上相同的碎片化图案及跨越ExD谱的电荷状态图案的存在，以将在特定ExD谱中检测到的碎片离子与从其衍生碎片离子的前体离子相关。虽然具有相同电荷状态的前体离子的分子量的差异倾向于表明前体彼此不同，但本教示将前体离子之间的分子量的差异归因于PTM的存在或氨基酸序列中的小差异，以便于更加自信地将在卷积ExD谱中观察到的碎片离子与m/z隔离窗内的若干前体离子中的一个相关联。

通过实例的方式，假设在跨越m/z隔离窗具有类似电荷状态的前体离子之间的分子量的小差异指示大体上类似的肽或蛋白质前体(尽管在氨基酸序列或与其相关联的PTM中存在微小差异)，基于跨越m/z隔离窗的相关前体离子的相对丰度，可在步骤208中确定相关蛋白质前体的电荷状态图案。在图8的示范性热图中，举例来说，针对跨越质量范围(即，跨越多个m/z隔离窗)在步骤207中确定的9+、16+、30+电荷状态前体中的每一个，确定电荷状态图案(即，CRS图案插图)。特定来说，在此所描绘的示范性实施例中，基于跨越质量范围的单电荷还原物种的强度来确定各种电荷状态的前体的电荷状态图案(即，沿对应于每一前体电荷状态的单电荷还原物种的虚线)。也就是说，CRS图案插图上的16+电荷状态图案是沿对应于16+第一CRS(Z＝15+)的虚线的每一m/z隔离窗处的检测到的强度，30+电荷状态图案是沿对应于30+第一CRS(Z＝29+)的虚线的检测到的强度，且9+电荷状态图案是沿对应于9+第一CRS(Z＝8+)的虚线的检测到的强度。

在步骤209中，根据本教示的方法及系统还可比较在不同m/z隔离窗中从前体离子产生的碎片离子，以鉴定对应于每一电荷状态的相关前体离子的至少部分碎片化图案。通过实例的方式，具体参考图8的热图，观察到不同m/z隔离窗内的相关前体离子(即，类似分子量、相同的电荷状态)的ECD谱可展现碎片离子图案的类似性，如图8的竖直方框所展示。通过实例的方式，在16+碎片图案中，可看出在m/z隔离窗之间的碎片离子峰值以相同的m/z存在，并且此外m/z隔离窗之间的强度变化与具有16+的电荷状态及约15500到16000amu的分子量的前体的15+CRS的相对强度成比例，如在对应于每一相应m/z隔离窗的ECD谱中所检测到的。此外，应了解，这些类似碎片化图案证实前体离子具有大体上相同的氨基酸序列(即，由各种碎片离子表示的氨基酸序列仍是大体上相同的，尽管在前体之间的所计算的分子量之间存在差异)。

再次参考图2，在步骤210中，可对多个ExD谱去卷积，以鉴定从其衍生每一ExD谱中的所检测到的碎片离子的前体离子，且借此分辨对应于特定前体离子的碎片离子。举例来说，如图9中示意性说明，每一ExD谱中的碎片离子可与在步骤208中确定的电荷状态图案及在步骤209中确定的碎片化图案相关，以分别鉴定从多个前体电荷状态中的一个产生的碎片离子的m/z。在此示范性实施例中，基于电荷状态图案(图9a)针对图9b的热图中所描绘的在Z＝30+处的每一碎片峰值数目i确定图9c的关联性(C30_i)，如下：

C30_i＝∑_m/z[(I₃₀(m/z)-i₃₀)×(Frag_i(m/z)-frag_i(m/z))]，

其中I₃₀(m/z)表示归一化的30+电荷状态图案(图9a中的线)，其中m/z是作为图9b的“竖直”尺度的扫描前体m/z；

其中i₃₀是归一化的30+电荷状态图案的平均强度；

其中Frag_i(m/z)是图9b中在特定m/z处归一化第i个峰值的强度图案，其中m/z是扫描前体m/z；且

其中frag_i(m/z)是图9b中具有特定m/z的归一化第i个峰值的平均强度。

所属领域的技术人员将了解，在以上示范性相关函数中，减去平均值以便于确定用于选择的阈值。举例来说，如果不存在相关性，那么C30_i值应为零，且如果完全相关，那么C30_i值应为1。阈值可设置在0.5左右，但可根据本教示使用这个或任何其它阈值(例如，0.3)。针对16+及9+电荷状态中的每一个，同样可执行类似关联以产生图9d(针对在972Da的前体m/z处的前体Z＝30+的碎片谱)及9e(针对在981Da的前体m/z处的前体Z＝16+的碎片谱)的示范性去卷积谱，其中可鉴定从其衍生的碎片离子及前体离子，尽管存在前体电荷状态的多个物种。此外，应了解，上述相关性仅为示范性的，并且根据本教示可使用其它替代相关函数或变量来分离对应于具有前体离子的多个物种的m/z隔离窗的ExD谱中的碎片。

在步骤210中分离从不同前体离子产生的碎片离子之后，本教示还可提供从其衍生碎片离子的蛋白质或肽的氨基酸序列的更确定的表征。举例来说，样本中碳酸酐酶的存在可基于以实验方式确定的Z＝30+前体的约29,000amu的分子量(如步骤207中)以及通过图9d的去卷积谱的验证来证实，其展现与碳酸酐酶的理论碎片化良好对应的m/z c-及z-型碎片。

此外，尽管根据本发明教示的方法及系统可使得能够证实及表征非纯化样本中的已知蛋白质，但本教示另外能够通过至少部分确定蛋白质中的氨基酸序列来鉴定未知蛋白质。通过实例的方式，虽然对应于16+前体的蛋白质的身份最初是未知的，但图9e的去卷积谱可使通过基于峰值对的确定的前体蛋白质内的重新测序来确定独特的氨基酸序列成为可能，峰值对的分离与特定氨基酸残基的质量相匹配。举例来说，在步骤211中，根据具有16+的电荷状态的前体的相关ECD谱(及约为15500到16000amu的以实验方式确定的分子量)，可比较各种峰值以鉴定连续氨基酸的一或多个部分序列。在步骤212中，举例来说，通过将图10中所描绘的所确定的序列中的一或多个与已知氨基酸序列的数据库进行比较(例如，例如经由可在http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm获得的ProteinProspector的同源性搜索)，序列17的匹配肯定地鉴定蛋白质也存在于如超氧化物歧化酶1的样本中。因此，根据本教示的各个方面的方法及系统不仅可使不纯样本中存在的已知蛋白质的更确定的表征成为可能，而且还可用于来自未知蛋白质的去卷积肽碎片的重新测序，尽管存在其它干扰蛋白质或肽。此外，如图11中所展示，在将超氧化物歧化酶1鉴定为在Z＝16+处的潜在前体之后，可再次分析ECD谱，以证实超氧化物歧化酶1中已知的其它氨基酸序列也存在于ECD谱中。此外，如图11中所指示，可基于检测到的ECD碎片的部分重建以及基于在各种m/z隔离窗中检测到的16+超氧化物歧化酶前体的分子量的小差异的存在的样本中的各种PTM状态的表征来进一步证实氨基酸序列的改变(例如，Ala1的乙酰化)。

仅使用常规实验，所属领域的技术人员将知道或能够确定本文描述的实施例及实践的许多等效物。通过实例的方式，各个组件的尺寸及施加到各个组件的特定电信号的确切值(例如幅值、频率等)仅仅是示范性的，且并不希望限制本教示的范围。因此，将理解，本发明不限于本文公开的实施例，而是从所附权利要求书理解，所附权利要求书将被广义地解释为法律允许的。

本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制性的。虽然结合各个实施例描述申请人的教示，但并不希望将申请人的教示限于此类实施例。相反，如由所属领域的技术人员了解，申请人的教示涵盖各种替代、修改及等效物。

Claims

1.一种处理样本的方法，其包括：

利用离子源从含有至少一个肽或蛋白质的样本溶液产生多个前体离子，其中所述前体离子包括前体肽或蛋白质离子；

使用多个m/z隔离窗扫描所述前体离子的质量范围；

使所述m/z隔离窗中的每一个内的所述前体离子进行电子捕获解离或电子转移解离ExD反应；

检测从所述ExD反应中的每一个产生的产物离子，以便于产生对应于所述m/z隔离窗中的每一个的多个ExD谱，其中对应于第一m/z隔离窗的至少第一ExD谱展现一或多个ExD碎片离子及在所述第一m/z隔离窗内的所述前体离子的一或多个电荷还原物种；

至少部分基于所述第一m/z隔离窗内的前体离子的一或多个物种的m/z及所述前体离子的所述一或多个电荷还原物种的m/z，而确定针对所述第一m/z隔离窗内的所述前体离子的所述一或多个物种的前体电荷状态及分子量；

确定所述m/z隔离窗中的每一个内的前体离子的一或多个物种中的每一个的前体电荷状态及分子量；

针对展现类似分子量的前体离子的一或多个物种的所述前体电荷状态中的每一个而确定跨越所述质量范围的前体电荷状态图案；及

将对应于每一相应m/z隔离窗的所述ExD谱中的所述一或多个ExD碎片离子与所述相应m/z隔离窗内的前体离子的所述一或多个物种中的每一个的所述前体电荷状态图案相关。

2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括经由直接输注将所述样本溶液引入所述离子源。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述m/z隔离窗中的每一个具有约1Da的范围。

4.根据权利要求1所述的方法，其中对应于所述第一m/z隔离窗的所述第一ExD谱展现第一带电还原物种，且其中所述第一m/z隔离窗内的前体离子的第一物种的所述前体电荷状态被确定为随所述第一带电还原物种的所述m/z及前体离子的所述第一物种的所述m/z而变化。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一ExD谱进一步展现第二带电还原物种，所述方法进一步包括确定所述第二带电还原物种是表示所述第一带电还原物种的多重还原物种还是所述第一m/z隔离窗内的前体离子的第二物种的带电还原物种。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一m/z隔离窗内的前体离子的所述第一物种的所述分子量被确定为随所述前体电荷状态及前体离子的所述第一物种的所述m/z而变化。

7.根据权利要求1所述的方法，其中从所述m/z隔离窗中的每一个内的前体离子的所述一或多个物种中的每一个的相对丰度来确定所述前体电荷状态图案。

8.根据权利要求1所述的方法，其中从对应于所述m/z隔离窗中的每一个的所述ExD谱中的前体离子的所述一或多个物种中的每一个的单个带电还原物种的强度来确定所述前体电荷状态图案。

9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括通过参考所述前体电荷状态图案来产生从前体离子的所述一或多个物种选择的第一物种的ExD谱，其中所选择的第一物种的所述ExD谱中的ExD碎片离子峰值之间的质量差指示所述前体离子的所述所选择的第一物种中的一或多个氨基酸。

10.根据权利要求9所述的方法，其进一步包括至少部分重建所述前体离子的所述所选择的第一物种中的所述氨基酸序列。

11.根据权利要求10所述的方法，其进一步包括将所述前体离子的所述所选择的第一物种的部分经重建的氨基酸序列与已知肽或蛋白质序列的数据库进行比较，以鉴定经离子化以形成所述前体离子的所述第一物种的所述肽或蛋白质。

12.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括比较对应于所选择的m/z隔离窗的多个所述ExD碎片离子谱，其中针对具有类似分子量的前体离子的多个物种的类似ExD碎片离子图案指示存在对类似前体离子的不同翻译后修饰。

13.一种质谱仪系统，其包括：

离子源，其经配置以从含有至少一个肽或蛋白质的样本溶液产生多个前体离子，其中所述前体离子包括前体肽或蛋白质离子；

质量分析器，其经配置以从所述离子源接收所述多个前体离子；

电子捕获解离或电子转移解离ExD反应池，其经配置以接收从所述质量分析器发射的所述前体离子，并使所述前体离子进行ExD反应；

检测器；及

控制器，其中所述控制器经配置以：

使用多个m/z隔离窗将所述前体离子的质量范围扫描到所述ExD反应池，以便于使所述m/z隔离窗中的每一个内的所述前体离子进行ExD反应；

产生从对应于所述m/z隔离窗中的每一个的所述ExD反应所产生的产物离子的多个ExD谱，其中对应于第一m/z隔离窗的至少第一ExD谱展现一或多个ExD碎片离子及所述第一m/z隔离窗内的所述前体离子的一或多个电荷还原物种；

至少部分基于所述第一m/z隔离窗内的前体离子的一或多个物种的m/z及所述前体离子的所述一或多个电荷还原物种的m/z而确定针对所述第一m/z隔离窗内的所述前体离子的所述一或多个物种的前体电荷状态及分子量；

其中所述控制器进一步经配置以：

跨越所述质量范围针对展现类似分子量的前体离子的一或多个物种的所述前体电荷状态中的每一个而确定前体电荷状态图案；以及

14.根据权利要求13所述的系统，其进一步包括用于将所述样本溶液直接输注到所述离子源的泵。

15.根据权利要求13所述的系统，其中每一m/z隔离窗具有约1Da的范围。

16.根据权利要求13所述的系统，其中对应于所述第一m/z隔离窗的所述第一ExD谱展现第一带电还原物种，

其中所述第一m/z隔离窗内的前体离子的第一物种的所述前体电荷状态被确定为随所述第一带电还原物种的所述m/z及前体离子的所述第一物种的所述m/z而变化，且

其中所述第一m/z隔离窗内的前体离子的所述第一物种的所述分子量被确定为随所述前体电荷状态及前体离子的所述第一物种的所述m/z而变化。

17.根据权利要求16所述的系统，其中所述第一ExD谱进一步展现第二带电还原物种，其中所述控制器进一步经配置以确定所述第二带电还原物种是表示所述第一带电还原物种的多重还原物种还是所述第一m/z隔离窗内的前体离子的第二物种的带电还原物种。

18.根据权利要求13所述的系统，其中所述控制器进一步经配置以基于对应于所述m/z隔离窗中的每一个的所述ExD谱中的前体离子的所述一或多个物种中的每一个的单个带电还原物种的强度来确定所述前体电荷状态图案。

19.根据权利要求13所述的系统，其中所述控制器进一步经配置以比较对应于所选择的m/z隔离窗的多个所述ExD碎片离子谱，其中针对具有类似分子量的前体离子的多个物种的类似ExD碎片离子图案指示存在对类似前体离子的不同翻译后修饰。