JP2018516277A - 薬物送達用架橋ヒアルロン酸及びそれを用いた医薬製剤 - Google Patents

Abstract

ヒアルロン酸と抗腫瘍剤を含む水溶性ゲル高分子マトリックスが記載されている。抗腫瘍剤は共有結合及び／又は非共有結合の少なくとも一方によってヒアルロン酸と架橋しており、これによって抗腫瘍剤の水溶性が改善されている。薬物動態研究によって、抗腫瘍剤は高いＣｍａｘ（最大血漿中薬物濃度）値及び高いＴｍａｘ（Ｃｍａｘ到達時間）値を示すことが分かった。【選択図】図１９

Description

関連出願の相互参照

本願は、２０１５年５月２９日出願の米国特許仮出願第６２／１６８，４１１号の利益を主張するものである。該仮出願の内容を本願の一部を構成するものとしてここに援用する。

本開示は、広くは癌治療用ドラッグデリバリー担体（以下、薬物送達媒体と称する）、その製造プロセス及びそれを用いた医薬製剤に関する。より詳細には、本開示は、抗癌剤を送達するための架橋ヒアルロン酸、その調製方法及びそれを用いた医薬製剤に関するが、これらに限定されない。該抗癌剤はヒアルロン酸と架橋することができる。

ヒアルロン酸（ＨＡ）は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびβ−グルクロン酸からなる、天然由来のポリアニオン性非硫酸化グリコサミノグリカンである。ヒアルロン酸は、多くの脊椎動物の結合組織（特に皮膚や関節）の細胞間マトリックスに存在し、そこでは保護的役割、構造を安定させる役割及び衝撃を吸収する役割を果たす。ヒアルロン酸は天然状態では高溶解性であり、酵素的代謝及びフリーラジカル代謝によって迅速な代謝回転を示す。

ＨＡは独特の粘弾性を有すると共に、生体適合性及び非免疫原性を有するため、多くの臨床用途に用いられているが、その例としては、関節炎における滑液の補給や眼科手術における外科的助剤、手術創の治癒や再生を促進することが挙げられる。さらに最近では、ＨＡは様々な投与経路（例えば、経眼投与や経鼻投与、経肺投与、非経口投与、局所投与）用の薬物送達剤として検討されている。

有効成分の放出制御によって患者に薬物を送達することは、数十年にも亘って研究の盛んな分野であり、高分子科学における最近の多くの開発や、より不安定な医薬剤（例えば、低分子薬物や核酸、タンパク質、ペプチドなど）を送達する必要性によって奨励されている。生分解性粒子は、低分子薬物、タンパク質薬物、ペプチド薬物及び核酸の投与に用いる徐放性媒体として開発されている。通常、薬物は生分解性及び生体適合性の高分子マトリックスにカプセル化される。高分子が分解する際、及び／又は薬物が高分子から拡散する際に薬物は体内に放出される。このような粒子を調製するのに用いる通常の高分子としては、ポリ（グリコリド−ｃｏ−ラクチド）（ＰＬＧＡ）等のポリエステルやポリグルコール酸、ポリ−ｐ−ヒドロキシ酪酸、ポリアクリル酸エステルが挙げられる。このような粒子は、薬物を体内分解から保護するというさらなる利点を有する。このような粒子は、そのサイズや組成、送達する薬物にもよるが、利用し得るいずれの経路によっても個体に投与することができる。

生体適合性が特に重要となるのは、薬物の標的送達に徐放性媒体を用いる場合、特に、該媒体の滞留時間が送達薬物の臨床有効性よりも遥かに長い場合である。放出制御技術によって薬物の作用を延長し、治療指数を改善することができるため、当然のことながら放出制御技術は、作用時間を長くするという課題に対して有用である。

本開示は、広くは癌治療用のヒアルロン酸ベースの薬物送達媒体に関する。薬物送達媒体には、共有結合、イオン結合及び／又は静電結合によってヒアルロン酸と架橋した抗癌薬／抗腫瘍薬を含むことができる。これによって、該薬物が治療剤だけでなく架橋剤として作用し二重の目的を果たす、架橋ヒアルロン酸マトリックスを得ることができる。理論によって拘束されることを望むものではないが、本開示を通して非限定的実施形態に記載及び説明するように、このような薬物送達媒体によって次のような様々な利益を得ることができる。（１）薬物の溶解性及び安定性の向上、（２）癌細胞の病理活性（例えば、癌細胞内のＣＤ４４の過剰発現）を示す細胞に対する薬物送達媒体の標的特異性及び／又は選択性の向上、及び／又は（３）薬物投与量の減少。換言すれば、本薬物送達媒体は薬物を安定化及び可溶化しながら、抗癌薬が健康組織に通常もたらす重篤で有害な副作用を抑制することができる。これは薬物の投与量を減少させることで行うことができ、その結果、癌治療の費用対効果を上げながら、抗癌薬に通常伴う潜在的副作用を軽減することができる。

したがって、本開示はその一実施形態において、広くは所望の細胞又は組織に特異的な対象とする薬物を送達するための送達系に関する。

本開示は、癌治療用薬物送達媒体としての架橋ヒアルロン酸に関する。一実施形態においては、生物活性化合物を用いてヒアルロン酸を架橋する。さらなる実施形態においては、生物活性化合物は予防剤及び／又は治療剤である。さらなる実施形態においては、生物活性化合物は抗腫瘍剤である。

本開示はその一実施形態において、癌治療用薬物送達媒体内に封入又はカプセル化された薬物を含む医薬製剤に関する。さらなる実施形態においては、薬物は抗腫瘍剤等の低分子化合物である。さらなる実施形態においては、抗腫瘍化合物は、アザシチジン、イマチニブ、レナリドミド、エトポシド、トポテカン、イリノテカン、レトロゾール、ラロキシフェン、シクロホスファミド、メクロレタミン、カルバジルキノン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、ニムスチン、カルムスチン、プロカルバジン、ダカルバジン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、５−フルオロウラシル、フトラフル、フロクスウリジン、シタラビン、アンシタビン、ドキシフルリジン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシン、クロモマイシンＡ３、シネルビン（cinelbin）Ａ、アクラシノマイシンＡ、アドリアマイシン、ペプロマイシン、シスプラチン、ミトキサントロン、エピルビシン、ピラルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、カルボプラチン、リン酸エストラムスチン、ミトタン、ポルフィリン、パクリタキセル及びドセタキセルからなる群から選択される少なくとも１種とすることができる。さらに他の態様においては、これらの抗腫瘍化合物のいずれの組み合わせも本開示の薬物送達媒体に配合することができる。さらなる実施形態においては、抗腫瘍化合物はホウ素含有化合物とすることができる。ホウ素含有化合物は、メルカプトウンデカヒドロドデカボレート（ＢＳＨ）又はｐ−ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）とすることができる。本開示のさらなる実施形態においては、ホウ素含有化合物を含む医薬製剤をホウ素中性子捕獲治療（ＢＮＣＴ）に用いることができる。

一実施形態においては、医薬製剤を肉腫及び癌腫から選択される１種の治療に用いることができる。肉腫及び癌腫の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の医薬製剤は、卵巣癌や乳癌等の肉腫及び上皮癌にも適用することができる。

本開示はその一実施形態において、作用の延長をもたらす架橋ヒアルロン酸を含む組成物に関する。

本開示はその一実施形態において、抗腫瘍剤等の低分子化合物によってヒアルロン酸が架橋しているヒアルロン酸組成物に関する。

本開示はその一実施形態において、ヒアルロン酸との共有相互作用、イオン相互作用及び／又は静電相互作用（例えば、Ｈ結合）の少なくとも１種をもたらす１種以上の抗腫瘍剤によってヒアルロン酸が架橋しているヒアルロン酸組成物に関する。本開示の一実施形態においては、抗腫瘍剤は、ヒアルロン酸との共有相互作用、イオン相互作用及び／又は静電相互作用（例えば、Ｈ結合）の少なくとも１種をもたらす１種以上の官能基を含む。そのような官能基の非限定的な例としては、アミン基や水酸基、カルボニル含有官能基が挙げられる。

本開示はその一実施形態において、ヒアルロン酸との非共有相互作用をもたらす抗腫瘍剤によってヒアルロン酸が架橋しているヒアルロン酸組成物に関する。

本開示はその一実施形態において、所望の細胞又は組織に対して生物活性化合物を標的送達するのに用いる架橋ヒアルロン酸組成物に関する。一実施形態においては、生物活性化合物は抗腫瘍剤である。

本開示はその一実施形態において、癌治療に用いる架橋ヒアルロン酸組成物に関する。治療する癌の種類によって、ヒアルロン酸マトリックス内にカプセル化する生物活性化合物が決まる。癌の非限定的な例としては、肉腫や癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない。架橋ヒアルロン酸組成物は、卵巣癌や乳癌等の肉腫及び上皮癌の治療にも用いられる。

対象薬物のインビボ挙動を制御し、細胞や組織等の標的へ該薬物を効率良く、特異的にかつ容易に送達するヒアルロン酸組成物に対する強い要望がある。

本開示はその一実施形態において、架橋ヒアルロン酸を製造するためのプロセスに関し、該プロセスは、ヒアルロン酸を少なくとも１種の生物活性化合物と混合して混合物を得ることと、混合物を押出機内に供給して架橋ヒアルロン酸を得ることを含む。一実施形態においては、生物活性化合物は抗腫瘍剤である。

本開示はその一実施形態において、癌を治療するための方法に関し、該方法は、架橋ヒアルロン酸を含む組成物を治療を必要とする被験体に投与することを含む。癌の非限定的な例としては、肉腫や癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫が挙げられると共に、卵巣癌や乳癌等の肉腫及び上皮癌が挙げられるが、これらに限定されない。

本開示はその一実施形態において、健康な細胞／臓器に対する有害な副作用を抑制し、治療活性を延長し、有効性を改善する癌薬物治療用のヒアルロン酸組成物に関する。

本開示はその一実施形態において、分子量が１０，０００Ｄａ〜７，０００，０００Ｄａのヒアルロン酸と抗腫瘍剤とを含む水溶性ゲル高分子マトリックスに関する。抗腫瘍剤は高分子マトリックスと架橋している。この高分子マトリックスとの架橋によって、抗腫瘍剤の水溶性は抗腫瘍剤自体に比べて改善されている。本開示の一態様においては、水溶性ゲル高分子マトリックスの抗腫瘍剤は高いＣ_ｍａｘ（最大血漿中薬物濃度）値及び高いＴ_ｍａｘ（Ｃ_ｍａｘ到達時間）値を示す。本開示の一態様においては、抗腫瘍剤は共有結合及び／又は静電結合の少なくとも一方によって架橋している。本開示の一態様においては、架橋は押出プロセスによってなされる。

本開示はその一実施形態において、分子量が１０，０００Ｄａ〜７，０００，０００Ｄａのヒアルロン酸と抗腫瘍剤とを含む医薬送達媒体に関する。抗腫瘍剤はヒアルロン酸と架橋して水溶性ゲル高分子マトリックスを形成している。この高分子マトリックスとの架橋によって、抗腫瘍剤の水溶性は抗腫瘍剤自体に比べて改善されている。本開示の一態様においては、医薬送達媒体の抗腫瘍剤は高いＣ_ｍａｘ（最大血漿中薬物濃度）値及び高いＴ_ｍａｘ（Ｃ_ｍａｘ到達時間）値を示す。本開示の一態様においては、抗腫瘍剤は共有結合及び／又は静電結合の少なくとも一方によって架橋している。本開示の一態様においては、架橋は押出プロセスによってなされる。

本開示はその一実施形態において、架橋ヒアルロン酸マトリックスを調製するためのプロセスに関する。該プロセスは、ヒアルロン酸を押出して押出ヒアルロン酸を得ることと、押出ヒアルロン酸を抗腫瘍剤と混合して混合物を得ることと、混合物を押出して架橋ヒアルロン酸マトリックスを得ることとを含むことができる。

本開示に関連して、実施形態１〜３０も開示される。実施形態１は、分子量が１０，０００Ｄａ〜７，０００，０００Ｄａのヒアルロン酸と抗腫瘍剤とを含む水溶性ゲル高分子マトリックスであり、抗腫瘍剤は高分子マトリックスと架橋しており、高分子マトリックスによって抗腫瘍剤の水溶性が改善されている。実施形態２は実施形態１の水溶性ゲル高分子マトリックスであり、抗腫瘍剤は共有結合及び／又は静電結合の少なくとも一方によって架橋している。実施形態３は実施形態２の水溶性ゲル高分子マトリックスであり、抗腫瘍剤は静電結合によって架橋しており、静電結合は水素結合である。実施形態４は実施形態３の水溶性ゲル高分子マトリックスであり、抗腫瘍剤は共有結合によって架橋している。実施形態５は実施形態１〜４のいずれか一実施形態の水溶性ゲル高分子マトリックスであり、抗腫瘍剤は、アザシチジン、イマチニブ、レナリドミド、エトポシド、トポテカン、イリノテカン、レトロゾール、ラロキシフェン、シクロホスファミド、メクロレタミン、カルバジルキノン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、ニムスチン、カルムスチン、プロカルバジン、ダカルバジン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、５−フルオロウラシル、フトラフル、フロクスウリジン、シタラビン、アンシタビン、ドキシフルリジン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシン、クロモマイシンＡ３、シネルビンＡ、アクラシノマイシンＡ、アドリアマイシン、ペプロマイシン、シスプラチン、ミトキサントロン、エピルビシン、ピラルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、カルボプラチン、リン酸エストラムスチン、ミトタン、ポルフィリン、パクリタキセル及びドセタキセルから選択される。実施形態６は実施形態１〜５のいずれか一実施形態の水溶性ゲル高分子マトリックスであり、ヒアルロン酸の抗腫瘍剤に対する比率は約２０：１〜約２：１である。実施形態７は実施形態６の水溶性ゲル高分子マトリックスであり、ヒアルロン酸の抗腫瘍剤に対する比率は約１０：１〜約２：１である。実施形態８は実施形態７の水溶性ゲル高分子マトリックスであり、ヒアルロン酸の抗腫瘍剤に対する比率は約５：１〜約２：１である。実施形態９は実施形態１〜８のいずれか一実施形態の水溶性ゲル高分子マトリックスであり、架橋は押出プロセスによってなされる。実施形態１０は実施形態１〜９のいずれか一実施形態の水溶性ゲル高分子マトリックスであり、抗腫瘍剤は高いＣ_ｍａｘ（最大血漿中薬物濃度）値及び高いＴ_ｍａｘ（Ｃ_ｍａｘ到達時間）値を示す。

実施形態１１は、分子量が１０，０００Ｄａ〜７，０００，０００Ｄａのヒアルロン酸と抗腫瘍剤とを含む医薬送達媒体であり、抗腫瘍剤はヒアルロン酸と架橋して水溶性ゲル高分子マトリックスを形成しており、該高分子マトリックスによって抗腫瘍剤の水溶性が改善されている。実施形態１２は実施形態１１の医薬送達媒体であり、抗腫瘍剤は共有結合及び／又は静電結合の少なくとも一方によって架橋している。実施形態１３は実施形態１２の医薬送達媒体であり、抗腫瘍剤は静電結合によって架橋しており、静電結合は水素結合である。実施形態１４は実施形態１２の医薬送達媒体であり、抗腫瘍剤は共有結合によって架橋している。実施形態１５は実施形態１１〜１４のいずれか一実施形態の医薬送達媒体であり、抗腫瘍剤は、アザシチジン、イマチニブ、レナリドミド、エトポシド、トポテカン、イリノテカン、レトロゾール、ラロキシフェン、シクロホスファミド、メクロレタミン、カルバジルキノン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、ニムスチン、カルムスチン、プロカルバジン、ダカルバジン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、５−フルオロウラシル、フトラフル、フロクスウリジン、シタラビン、アンシタビン、ドキシフルリジン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシン、クロモマイシンＡ３、シネルビンＡ、アクラシノマイシンＡ、アドリアマイシン、ペプロマイシン、シスプラチン、ミトキサントロン、エピルビシン、ピラルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、カルボプラチン、リン酸エストラムスチン、ミトタン、ポルフィリン、パクリタキセル及びドセタキセルから選択される。実施形態１６は実施形態１１〜１５のいずれか一実施形態の医薬送達媒体であり、ヒアルロン酸の抗腫瘍剤に対する比率は約２０：１〜約２：１である。実施形態１７は実施形態１６の医薬送達媒体であり、ヒアルロン酸の抗腫瘍剤に対する比率は約１０：１〜約２：１である。実施形態１８は実施形態１７の医薬送達媒体であり、ヒアルロン酸の抗腫瘍剤に対する比率は約５：１〜約２：１である。実施形態１９は実施形態１１〜１８のいずれか一実施形態の医薬送達媒体であり、架橋は押出プロセスによってなされる。実施形態２０は実施形態１１〜１９のいずれか一実施形態の医薬送達媒体であり、抗腫瘍剤は高いＣ_ｍａｘ（最大血漿中薬物濃度）値及び高いＴ_ｍａｘ（Ｃ_ｍａｘ到達時間）値を示す。

実施形態２１は、架橋ヒアルロン酸マトリックスを調製するためのプロセスであり、ヒアルロン酸を押出して押出ヒアルロン酸を得ることと、押出ヒアルロン酸を抗腫瘍剤と混合して混合物を得ることと、混合物を押出して架橋ヒアルロン酸マトリックスを得ることとを含む。実施形態２２は実施形態２１のプロセスであり、架橋ヒアルロン酸マトリックスをさらなるヒアルロン酸と混合して押出すことをさらに含む。実施形態２３は実施形態２１又は２２のプロセスであり、ヒアルロン酸は分子量が１０，０００Ｄａ〜７，０００，０００Ｄａである。実施形態２４は実施形態２１〜２３のいずれか一実施形態のプロセスであり、抗腫瘍剤は、アザシチジン、イマチニブ、レナリドミド、エトポシド、トポテカン、イリノテカン、レトロゾール、ラロキシフェン、シクロホスファミド、メクロレタミン、カルバジルキノン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、ニムスチン、カルムスチン、プロカルバジン、ダカルバジン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、５−フルオロウラシル、フトラフル、フロクスウリジン、シタラビン、アンシタビン、ドキシフルリジン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシン、クロモマイシンＡ３、シネルビンＡ、アクラシノマイシンＡ、アドリアマイシン、ペプロマイシン、シスプラチン、ミトキサントロン、エピルビシン、ピラルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、カルボプラチン、リン酸エストラムスチン、ミトタン、ポルフィリン、パクリタキセル及びドセタキセルから選択される。実施形態２５は実施形態２１〜２４のいずれか一実施形態のプロセスであり、ヒアルロン酸の抗腫瘍剤に対する比率は約２０：１〜約２：１である。実施形態２６は実施形態２５のプロセスであり、ヒアルロン酸の抗腫瘍剤に対する比率は約１０：１〜約２：１である。実施形態２７は実施形態２６のプロセスであり、ヒアルロン酸の抗腫瘍剤に対する比率は約５：１〜約２：１である。実施形態２８は実施形態２１〜２７のいずれか一実施形態のプロセスであり、抗腫瘍剤は共有結合及び／又は静電結合によって架橋する。実施形態２９は実施形態２８のプロセスであり、抗腫瘍剤は静電結合によって架橋し、静電結合は水素結合である。実施形態３０は実施形態２９のプロセスであり、抗腫瘍剤は共有結合によって架橋する。

本開示の上述の及び他の利点や特徴は、添付図面を参照しつつ、例として挙げた以下の非制限的な実施形態により明らかになるであろう。

添付図面は以下の通りである。

アザシチジン（ビダーザ（商標））を含むヒアルロン酸組成物のＭＭ．１Ｓ細胞株に対する作用を示す（２日間のインキュベーション後）。ＮＣ：陰性対照（ヒアルロン酸）、ＰＣ：陽性対照（薬物単独）、ＡＢＰ：薬物−ＨＡ複合体、Ｍｉｘ：機械的混合物（押出なし）。 アザシチジンを含むヒアルロン酸組成物のＭＭ．１Ｓ細胞株に対する作用を示す（３日間のインキュベーション後）。ＮＣ：陰性対照（ヒアルロン酸）、ＰＣ：陽性対照（薬物単独）、ＡＢＰ：薬物−ＨＡ複合体、Ｍｉｘ：機械的混合物（押出なし）。 イマチニブ（グリベック（商標））を含むヒアルロン酸組成物のＫ−５６２細胞株に対する作用を示す（２日間のインキュベーション後）。ＮＣ：陰性対照（ヒアルロン酸）、ＰＣ：陽性対照（薬物単独）、ＡＢＰ：薬物−ＨＡ複合体、Ｍｉｘ：機械的混合物（押出なし）。 イマチニブを含むヒアルロン酸組成物のＫ−５６２細胞株に対する作用を示す（３日間のインキュベーション後）。ＮＣ：陰性対照（ヒアルロン酸）、ＰＣ：陽性対照（薬物単独）、ＡＢＰ：薬物−ＨＡ複合体、Ｍｉｘ：機械的混合物（押出なし）。 レナリドミド（レブラミド（商標））を含むヒアルロン酸組成物のＭＭ．１Ｓ細胞株に対する作用を示す（２日間のインキュベーション後）。ＮＣ：陰性対照（ヒアルロン酸）、ＰＣ：陽性対照（薬物単独）、ＡＢＰ：薬物−ＨＡ複合体、Ｍｉｘ：機械的混合物（押出なし）。 レナリドミドを含むヒアルロン酸組成物のＭＭ．１Ｓ細胞株に対する作用を示す（３日間のインキュベーション後）。ＮＣ：陰性対照（ヒアルロン酸）、ＰＣ：陽性対照（薬物単独）、ＡＢＰ：薬物−ＨＡ複合体、Ｍｉｘ：機械的混合物（押出なし）。 エトポシド（エトポフォス（商標））を含むヒアルロン酸組成物のＨＬ−６０細胞株に対する作用を示す（２日間のインキュベーション後）。ＮＣ：陰性対照（ヒアルロン酸）、ＰＣ：陽性対照（薬物単独）、ＡＢＰ：薬物−ＨＡ複合体、Ｍｉｘ：機械的混合物（押出なし）。 エトポシドを含むヒアルロン酸組成物のＨＬ−６０細胞株に対する作用を示す（３日間のインキュベーション後）。ＮＣ：陰性対照（ヒアルロン酸）、ＰＣ：陽性対照（薬物単独）、ＡＢＰ：薬物−ＨＡ複合体、Ｍｉｘ：機械的混合物（押出なし）。 トポテカン（ハイカムチン（商標））を含むヒアルロン酸組成物のＨＣＴ−１１６細胞株に対する作用を示す（２日間のインキュベーション後）。ＮＣ：陰性対照（ヒアルロン酸）、ＰＣ：陽性対照（薬物単独）、ＡＢＰ：薬物−ＨＡ複合体、Ｍｉｘ：機械的混合物（押出なし）。 トポテカンを含むヒアルロン酸組成物のＨＣＴ−１１６細胞株に対する作用を示す（３日間のインキュベーション後）。ＮＣ：陰性対照（ヒアルロン酸）、ＰＣ：陽性対照（薬物単独）、ＡＢＰ：薬物−ＨＡ複合体、Ｍｉｘ：機械的混合物（押出なし）。 イリノテカン（カンプトサー（商標））を含むヒアルロン酸組成物のＨＣＴ−１１６細胞株に対する作用を示す（２日間のインキュベーション後）。ＮＣ：陰性対照（ヒアルロン酸）、ＰＣ：陽性対照（薬物単独）、ＡＢＰ：薬物−ＨＡ複合体、Ｍｉｘ：機械的混合物（押出なし）。 イリノテカンを含むヒアルロン酸組成物のＨＣＴ−１１６細胞株に対する作用を示す（３日間のインキュベーション後）。ＮＣ：陰性対照（ヒアルロン酸）、ＰＣ：陽性対照（薬物単独）、ＡＢＰ：薬物−ＨＡ複合体、Ｍｉｘ：機械的混合物（押出なし）。 レトロゾール（フェマーラ（商標））を含むヒアルロン酸組成物のＭＣＦ−７細胞株に対する作用を示す（２日間のインキュベーション後）。ＮＣ：陰性対照（ヒアルロン酸）、ＰＣ：陽性対照（薬物単独）、ＡＢＰ：薬物−ＨＡ複合体、Ｍｉｘ：機械的混合物（押出なし）。 レトロゾールを含むヒアルロン酸組成物のＭＣＦ−７細胞株に対する作用を示す（３日間のインキュベーション後）。ＮＣ：陰性対照（ヒアルロン酸）、ＰＣ：陽性対照（薬物単独）、ＡＢＰ：薬物−ＨＡ複合体、Ｍｉｘ：機械的混合物（押出なし）。 ラロキシフェン（エビスタ（商標））を含むヒアルロン酸組成物のＭＣＦ−７細胞株に対する作用を示す（２日間のインキュベーション後）。ＮＣ：陰性対照（ヒアルロン酸）、ＰＣ：陽性対照（薬物単独）、ＡＢＰ：薬物−ＨＡ複合体、Ｍｉｘ：機械的混合物（押出なし）。 ラロキシフェンを含むヒアルロン酸組成物のＭＣＦ−７細胞株に対する作用を示す（３日間のインキュベーション後）。ＮＣ：陰性対照（ヒアルロン酸）、ＰＣ：陽性対照（薬物単独）、ＡＢＰ：薬物−ＨＡ複合体、Ｍｉｘ：機械的混合物（押出なし）。 腫瘍導入から０〜６０日後の媒体群と処理動物における経時的な平均腫瘍体積を示す。エストロゲンを補充しないヒト胸部ＭＣＦ−７癌腫瘍モデルの場合の媒体群と処理マウスにおける経時的な腫瘍体積を各処理群の平均腫瘍体積として表す。 腫瘍導入から０〜４９日後の媒体群と処理動物における経時的な平均腫瘍体積を示す。エストロゲンを補充したヒト胸部ＭＣＦ−７癌腫瘍モデルの場合の媒体群と処理マウスにおける経時的な腫瘍体積を各処理群の平均腫瘍体積として表す。 薬物単独（５ｍｇ／ｋｇ）及びＨＡ−レトロゾール複合体（薬物２ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇ相当）を経口投与した後のラット血漿中レトロゾールの薬物動態を示す。 薬物単独（５０ｍｇ／ｋｇ）及びＨＡ−ラロキシフェン複合体（薬物５０ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇ相当）を経口投与した後のラット血漿中ラロキシフェンの薬物動態を示す。

用語集

本開示に用いられる用語及び表現が明確かつ着実に理解できるように、幾つかの定義を以下に記載する。また、特に明記しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的用語及び科学的用語は、本明細書が関する技術分野の当業者が通常理解するものと同様の意味を有する。

単語「a」又は「an」は、請求項及び／又は明細書で用語「含む（comprising）」と共に用いた場合には「一の（one）」を意味し得るが、内容が特に明記されない限り、「一以上」、「少なくとも一の」及び「一又は一を超える」の意味とも一致する。同様に、単語「別の（another）」は、内容が特に明記されない限り、少なくとも第２又はそれ以上を意味し得る。

本明細書及び請求項で用いられる次の単語、「含む（comprising）及びその任意の形態（例えば、compriseやcomprises）」、「有する（having）及びその任意の形態（例えば、haveやhas）」、「含む（including）及びその任意の形態（例えば、includeやincludes）」又は「含む（containing）及びその任意の形態（例えば、containやcontains）」は包含的又はオープンエンド型であり、追加的で列挙されていない要素やプロセス工程を排除するものではない。

本明細書及び請求項で用いられる「からなる（consisting）」という単語及びその派生語は、記載されている特徴、要素、成分、群、整数及び／又は工程の存在を意味し、かつ、記載されていない他の特徴、要素、成分、群、整数及び／又は工程の存在を排除するクローズエンド型の用語であるものとする。

本明細書で用いられる「から本質的になる」という用語は、記載されている特徴、要素、成分、群、整数及び／又は工程の存在を意味すると共に、これらの特徴、要素、成分、群、整数及び／又は工程の基本的かつ新規な特性に対して実質的に影響を及ぼさないものを意味するものとする。非限定的な一態様においては、本開示の基本的かつ新規な特性は、抗腫瘍剤のヒアルロン酸との架橋であり、これによって抗腫瘍剤の水溶性を改善／向上させることができる。

本明細書で用いられる「約」、「実質的に」及び「およそ」という用語は、修飾される用語の最終的な結果が大幅に変化しないような、合理的な偏差の幅を意味する。これらの程度を表す用語は、この偏差が修飾する言葉の意味を否定しない場合には、修飾される用語の少なくとも±１％の偏差を含むものと解釈されるべきである。

本明細書で用いられる「押出機」という用語は、従来のいずれの１軸又は２軸押出装置をも意味するものとする。

押出機における「滞留時間」という用語は、材料が押出機内を供給口から金型まで通過するのにかかる時間を意味する。滞留時間は、着色剤を含む少量の材料を供給口に投入することによって測定する。着色剤がバレルに入った時にクロノメータを起動させ、金型出口で着色が観察された時にクロノメータを停止させる。

「押出物温度」という用語は、複数ある金型開口部の１個に差し込まれた携帯熱電対で測定された押出機の金型出口における材料の温度を意味する。

本明細書で用いられる「癌」という用語は、その通常の意味を有し、異常細胞が制御なしに分裂する疾患の総称である。癌細胞は近くの組織に侵入し、血流やリンパ系を経由して体内の他の部分に伝播する。癌には主にいくつかの種類があるが、例えば、癌腫は皮膚又は内臓を覆う組織で始まる癌である。肉腫は骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管又は他の結合組織や支持組織で始まる癌である。白血病は、造血組織（例えば、骨髄）で始まり、多数の異常な血液細胞が産生して血流に入る癌である。リンパ腫は免疫系の細胞で始まる癌である。

本明細書で用いられる「有効量」及び「治療有効量」という用語は、研究者、獣医、医師又は他の臨床医が求める組織系、動物又はヒトにおける所望の治療効果、生物学的又は医学的反応（例えば、治療対象の疾患や障害の症状の軽減）をもたらすのに有効な、本開示の化合物又は組成物を含む化合物、物質又は組成物の量を意味する。

本明細書で用いられる「医薬的に許容し得る」という表現は、正当な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又は他の問題や合併症を引き起こさずにヒトや動物の組織に接触させて用いるのに適した、妥当なリスク対効果比に見合う化合物、物質、組成物及び／又は剤形を意味する。

本明細書で用いられる「低分子」という表現は、天然由来であろうと人工的に作出した（例えば、化学合成によって）ものであろうと、比較的分子量が低く、タンパク質、ポリペプチド又は核酸ではない有機化合物及びその塩を意味する。通常、低分子は分子量が約１５００ｇ／モル未満である。また、低分子は通常、複数の炭素−炭素結合を有する。既知の天然由来低分子としては、ペニシリン、エリスロマイシン、タキソールおよびラパマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。既知の合成低分子としては、アンピシリン、メチシリン、スルファメトキサゾールおよびスルホンアミドが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で用いられる「安定化する」という用語は、化合物を一定の状態に維持し、ある状態から他の状態に変動することを予防する又は遅延させることを包含する。

本明細書で用いられる「生物活性」という用語は、生物学的機能を媒介する能力を意味する。

本明細書で用いられる「架橋剤」という用語は、共有結合及び／又は非共有結合の少なくとも一方によってヒアルロン酸と反応し得る化学剤を網羅する。非共有結合の非限定的な例としては、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、およびファン・デル・ワールス力（分散引力、双極子間相互作用及び双極子誘起相互作用）が挙げられる。本開示の一実施形態においては、架橋剤は抗腫瘍剤である。

本明細書で用いられる「架橋」という用語は、架橋剤によって共有結合及び／又は非共有結合されたヒアルロン酸の２個以上の高分子鎖を意味するものとする。このような架橋は、１個の高分子鎖内又は２個以上の鎖間でラクトン形成、無水物形成又はエステル形成をもたらす分子間脱水や分子内脱水とは区別される。しかし、本明細書に記載の組成物内で分子内架橋が起こり得ることも考慮される。架橋剤は、２個以上の分子（すなわち、ヒアルロン酸鎖）間で共有結合及び／又は非共有結合を形成する少なくとも２個の官能基を含む。本開示の一態様においては、架橋剤は、架橋が進行するようにヒアルロン酸の官能基に相補的な官能基を含む。本開示の一実施形態においては、架橋剤は抗腫瘍剤である。

本明細書で用いられる「被験体」という用語は、ヒト又は動物を意味する。通常、動物は、霊長類や齧歯類、家畜、狩猟動物等の脊椎動物である。本明細書で用いられる「患者」、「個体」及び「被験体」という用語は互いに交換可能である。

本明細書で用いられる「持続性作用」という用語は、長時間作用型の組成物、すなわち、放出される薬物（例えば、抗腫瘍剤）自体の通常の放出時間よりも放出時間を長くさせるような薬物動態特性を有する組成物を意味する。

本明細書で用いられる「薬理学的に許容し得る担体」という用語は、「薬理学的担体」と同義であり、ヒトを含む被験体に投与した際に長期間（持続性）の悪影響を実質的に及ぼさないいずれの担体をも意味し、「薬理学的に許容し得る媒体、安定剤、希釈剤、添加剤、補助剤又は賦形剤」等の用語を包含する。様々な薬学的に許容し得る担体のいずれも用いられ、その例としては水性媒体、例えば、水、生理食塩水、グリシン等が挙げられるが、これらに限定されない。

本開示の組成物

本開示のヒアルロン酸は低分子化合物と架橋している。架橋によって、低分子化合物の可溶性は該化合物自体の可溶性と比べて改善されている。さらに、ヒアルロン酸の架橋によって、水溶性が非常に良好なゲル構造が得られると共に、低分子化合物の耐分解性が改善される。一実施形態においては、架橋剤は抗腫瘍剤（本開示を通して「抗腫瘍剤」と「抗癌剤」は互いに交換可能である）等の低分子化合物である。さらなる実施形態においては、抗腫瘍剤は、アザシチジン、イマチニブ、レナリドミド、エトポシド、トポテカン、イリノテカン、レトロゾール、ラロキシフェン、シクロホスファミド、メクロレタミン、カルバジルキノン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、ニムスチン、カルムスチン、プロカルバジン、ダカルバジン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、５−フルオロウラシル、フトラフル、フロクスウリジン、シタラビン、アンシタビン、ドキシフルリジン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシン、クロモマイシンＡ３、シネルビンＡ、アクラシノマイシンＡ、アドリアマイシン、ペプロマイシン、シスプラチン、ミトキサントロン、エピルビシン、ピラルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、カルボプラチン、リン酸エストラムスチン、ミトタン、ポルフィリン、パクリタキセル及びドセタキセルからなる群から選択される少なくとも１種とすることができる。さらなる実施形態においては、抗腫瘍剤はホウ素含有化合物とすることができる。ホウ素含有化合物は、メルカプトウンデカヒドロドデカボレート（ＢＳＨ）又はｐ−ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）とすることができる。本開示のさらなる実施形態においては、ホウ素含有化合物を含む医薬製剤をホウ素中性子捕獲治療（ＢＮＣＴ）に用いることができる。

本開示のさらなる実施形態においては、追加量の抗腫瘍剤の存在下で架橋を行い、抗腫瘍剤が架橋ヒアルロン酸ネットワーク内に捕捉され又は含浸されるようになる。架橋ヒアルロン酸ネットワークは、抗腫瘍剤等の有効成分の生物学的利用能を延長させる媒体としての役割を果たす。本開示の一実施形態においては、架橋ヒアルロン酸は押出によって得られる。重合や高分子修飾、高分子ブレントの相溶化等のプロセスに連続反応器として押出機を用いることは、注目度が高まっている技術である。反応性押出の場合、押出機内で、例えば、重合、グラフト、共重合体形成、分子ネットワーク形成、架橋、機能化および制御分解を含むいくつかの有機反応を行うことができる。本開示の一実施形態においては、共回転インターメッシュ２軸押出機（ＴＳＥ）を用いることができる。連続反応器として押出機を用いる上での一利点は、押出プロセスが実質的に固体化学プロセスであることにある。したがって、押出プロセスでは実際に溶媒を必要とせず、押出プロセスでは通常、反応副生成物が少なく、所望の生成物の収率が良く、不溶性で熱不安定性出発原料から固体生成物を得ることができる。

本開示の一実施形態においては、必要に応じて抗腫瘍剤を他の薬物（又は３種、４種、５種、６種又はそれ以上の薬物）と適切に組み合わせて、癌治療用の１種の薬物送達媒体に配合することができる。他の薬物としては、他の抗腫瘍剤や中枢神経系薬（例えば、全身麻酔薬、睡眠剤／鎮痛剤、抗不安薬等）、末梢神経薬（例えば、骨格筋弛緩薬、鎮痙剤等）、循環器系作用薬（例えば、強心剤、抗不整脈剤、利尿剤、血圧降下剤、血管収縮剤、血管拡張剤、脂質降下薬、他の循環器系作用薬）、呼吸器系作用薬（例えば、呼吸刺激剤、鎮咳剤、去痰剤、鎮咳去痰剤、気管支拡張剤等）、消化薬（例えば、制吐薬、整腸薬、胃消化薬、制酸薬、他の消化薬等）、ホルモン剤（例えば、脳下垂体ホルモン、唾液腺ホルモン、甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン、タンパク質同化ステロイドホルモン、副腎ホルモン、男性ホルモン、混合ホルモン、他のホルモン等）、ビタミン製剤（例えば、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、混合ビタミン、他のビタミン等）、アレルギー薬（例えば、抗ヒスタミン薬）、抗菌薬（例えば、グラム陽性細菌やグラム陰性細菌に作用する薬物）、抗ウイルス薬が挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態においては、本開示にかかる組成物中に存在するヒアルロン酸の総量は、組成物の約５０．０％〜約９９．５％ｗ／ｗの範囲とすることができる。一実施形態においては、ヒアルロン酸の総量は組成物の約６０．０％〜約９０．０％ｗ／ｗの範囲とすることができる。さらなる実施形態においては、ヒアルロン酸の総量は組成物の約７０．０％〜約８０．０％ｗ／ｗの範囲とすることができる。

一実施形態においては、本開示にかかる組成物中に存在する抗腫瘍剤の総量は、組成物の約０．５％〜約５０．０％ｗ／ｗの範囲とすることができる。一実施形態においては、抗腫瘍剤の総量は組成物の約１０％〜約４０％ｗ／ｗの範囲とすることができる。さらなる実施形態においては、抗腫瘍剤の総量は組成物の約２０％〜約３０％ｗ／ｗの範囲とすることができる。

ＣＤ４４は多くの哺乳動物細胞型で発現する。ＣＤ４４は広く分布している細胞表面糖タンパク質であり、その主要リガンドはヒアルロン酸（ＨＡ）と特定されている。ＣＤ４４は、細胞増殖、細胞分化、細胞遊走、血管新生、サイトカイン、ケモカイン及び対応受容体に対する増殖因子の提示、細胞膜におけるプロテアーゼのドッキング及び細胞生存のシグナル伝達に関与している。これらの生物学的特性は全て、正常細胞の生理的活性にとって必須であるが、癌細胞の病理的活性にも関連する。動物における実験から、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びＣＤ４４溶解性タンパク質によるＣＤ４４の標的化によって、各種腫瘍の悪性活性が顕著に低下することが分かっており、抗ＣＤ４４剤の治療可能性が強調されている。ＣＤ４４及びその変異体は通常、様々な癌細胞株で過剰発現するため、本開示のヒアルロン酸組成物によって、所望の細胞又は組織に特異的な対象薬物を送達するための適切な送達系が構成されると推測される。

一実施形態においては、本開示の架橋ヒアルロン酸組成物は、細胞／罹患臓器が有する特定の標的部位に選択的に結合する。本開示の架橋ヒアルロン酸組成物は、標的特異性を有し、規定の細胞集団／臓器に対する選択性が高い。本開示の一実施形態においては、標的部位はＣＤ４４である。上述の薬物の多くはある程度の有効性を示すが、正常細胞と比べて腫瘍細胞に対する選択性が欠如しており、重篤な副作用を引き起こすことが多い。さらに、薬物耐性の出現が多くの癌の治療において重大な問題となる。癌化学治療における中心課題は、健康な組織に対する抗癌薬の重篤で有害な副作用である。常に、副作用のために投与量の減少、治療の遅延又は治療の中断が余儀なくされる。本開示のヒアルロン酸組成物によって、正常で健康な細胞による活性薬物の取込みが抑制される一方、癌細胞又は癌組織における薬物の流入及び保持が高まる。さらに、本開示のヒアルロン酸組成物の標的送達によって、活性薬物の生物学的利用能が向上する一方、その効果が組成物からの徐放によって最大限に高められる。

本開示の一実施形態においては、ヒアルロン酸は標的結合特異的であり、薬物送達媒体を標的／腫瘍部位に向ける。一旦標的に結合すれば、薬物はゆっくりと放出され、標的／腫瘍部位に取り込まれる。細胞毒性薬の分子内放出は、細胞酵素（好ましくは腫瘍細胞内で発現する酵素）によってなされる。

本開示の用途及び方法

図１〜１６に示すように、アザシチジン（ＨＡ−アザシチジン（９：１ ｗ／ｗ）、図１及び２）、イマチニブ（ＨＡ−イマチニブ（９：１ ｗ／ｗ）、図３及び４）、レナリドミド（ＨＡ−レナリドミド（９：１ ｗ／ｗ）、図５及び６）、エトポシド（ＨＡ−エトポシド（９：１ ｗ／ｗ）、図７及び８）、トポテカン（ＨＡ−トポテカン（９：１ ｗ／ｗ）、図９及び１０）、イリノテカン（ＨＡ−イリノテカン（９：１ ｗ／ｗ）、図１１及び１２）、レトロゾール（ＨＡ−レトロゾール（９：１ ｗ／ｗ）、図１３及び１４）及びラロキシフェン（ＨＡ−ラロキシフェン（９：１ ｗ／ｗ）、図１５及び１６）の各種癌細胞株に対する作用について研究した。ヒアルロン酸−薬物組成物は全て押出プロセスを用いて調製した。約２日間又は３日間曝露した後の顕性細胞毒性作用によって活性を測定した。陰性対照のヒアルロン酸（ＨＡ）は、１６種のプレートのいずれにおいても、最大１０μｇ／ｍＬの用量では顕性細胞毒性を示さなかった。ＨＡは一般に安全と見なされているため、活性（細胞毒性）の上昇は予想されておらず、何も観察されなかった。しかし、ＨＡ複合化分子（例えば、架橋分子）は、非ＣＤ４４陽性細胞よりも高い親和性でＣＤ４４陽性細胞を標的にするため、正常細胞と癌細胞の混合集団において高い効力をもたらし得ることが分かっている。

図３〜４及び９〜１０に示すように、ＨＡ−イマチニブ複合体及びＨＡ−トポテカン複合体は、用量及び時間依存的に癌細胞株に対してインビトロ細胞毒性及び有効性を示した。ＨＡ−アザシチジン複合体についても同様の観察がなされたが、用量は高かった（図１〜２）。ＨＡ−レナリドミド複合体（図５〜６）はＭＭ．１Ｓ細胞に対して阻害活性を殆ど示さないか、又は全く示さなかった。陽性対照及び親ＡＰＩはＨＬ−６０細胞において３日間強力な細胞毒性及び阻害活性を示したが、ＨＡ−エトポシド複合体は活性を殆ど示さなかった。

本開示の一実施形態においては、架橋ヒアルロン酸は薬物送達プラットフォームとしての役割を果たす。本開示のさらなる実施形態においては、ヒアルロン酸によって抗腫瘍剤の水溶性を改善するマトリックスが得られる。本開示の一実施形態においては、ヒアルロン酸は共有相互作用、イオン相互作用及び／又は静電相互作用（例えば、Ｈ結合）の少なくとも１種によって薬物（例えば、抗腫瘍剤）と架橋している。架橋によって抗腫瘍剤の安定化作用がもたらされ、抗腫瘍剤の生物学的利用能が向上すると共にその溶解性が改善されるようになる。

生物学的利用能が非常に低く溶解性が低い薬物が数多く存在する。水に対する親和性が高いため、ＨＡで有機分子（例えば、薬物）を複合化すると、水溶性が非常に高いゲルが形成される。本開示はその一態様において、水溶性が高いＨＡ−薬物複合体に関する。親薬物単独の場合と比べ、このような複合体によって薬物に高い生物学的利用能が付与されると推測される。薬物がＨＡ−薬物複合体の形態であれば、薬物濃度（すなわち、投与量）を低くすることができ、その結果、実際の毒性や副作用が抑制される一方、薬物の有効性は低下しないことがさらに推測される。

ＨＡはそのタンパク質受容体ＣＤ４４に対する親和性が高いため、ＣＤ４４の過剰発現が腫瘍細胞で観察されるという理由から、ＨＡ−薬物複合体によって薬物（例えば、抗腫瘍剤）を腫瘍組織や臓器に標的送達することができると推測される。また、標的送達の場合、薬物の有効性が向上するというさらなる利点が得られる。

数種類のＨＡ−薬物複合体（ＨＡ−イリノテカン、ＨＡ−ラロキシフェン及びＨＡ−レトロゾール）を調製し、その研究を行った。イリノテカンは良好な水溶性を示すが、ラロキシフェンとレトロゾールはいずれも水溶性が非常に低い。本研究時には、Ｃ_ｍａｘ（最大血漿中薬物濃度）値及びＴ_ｍａｘ（Ｃ_ｍａｘ到達時間）値を測定した。イリノテカンの場合、ＨＡ−イリノテカン複合体は親薬物に対して何ら有意な改善を示さなかった。これは、イリノテカンの良好な水溶性（２５ｍｇ／ｍＬ）を考慮すれば驚くべきことではなかった。しかし、ラロキシフェンの場合、ＨＡ−ラロキシフェン複合体は、複合化していない薬物と比べてＣ_ｍａｘ値及びＴ_ｍａｘ値の両方について有意な改善が示された（すなわち、Ｃ_ｍａｘ（μＭ）０．１９及びＴ_ｍａｘ（ｈ）４．５（表７Ａ）に対しＣ_ｍａｘ（μＭ）０．８４及びＴ_ｍａｘ（ｈ）３．５（表６Ａ））。レトロゾールの場合にも同様の観察がなされ、複合化していない薬物と比べてＣ_ｍａｘ値及びＴ_ｍａｘ値の両方について有意な改善が示された（すなわち、Ｃ_ｍａｘ（μＭ）４．２４及びＴ_ｍａｘ（ｈ）４．５（表９Ａ）に対しＣ_ｍａｘ（μＭ）１１．３８及びＴ_ｍａｘ（ｈ）２．３（表８Ａ））。濃度（ｎｇ／ｍＬ）に対しても同様の観察がなされた（表６Ｂ対７Ｂ、及び表８Ｂ対９Ｂ）。

実験

本開示にかかる各種架橋ヒアルロン酸組成物の調製について説明する複数の実施例を以下に記載する。以下の非限定的な実施例は本開示を説明するものである。

ＨＡ−薬物複合体を調製するための基本手順

本開示の一実施形態においては、ＨＡ−薬物複合体（重量比で９：１）を反応性押出プロセスによって調製した。反応性押出プロセスでは、薬物がＨＡマトリックスと架橋する。

ヒアルロン酸を、押出機通過させて押出後ヒアルロン酸を得た。次に一定量の押出後ヒアルロン酸を薬物と混合させ（１：１）、その後、メカニカルミキサで約２時間さらに混合させた。次に、得られた組成物を、押出機通過させた。本開示のいくつかの実施形態では、組成物を２回以上押出機を通過させた。次に、得られた押出組成物をさらなる押出後ヒアルロン酸とメカニカルミキサで約２時間混合させた。最後に、組成物をさらなる押出に供した。

経口投与後の血漿中薬物濃度の定量化

ラロキシフェン、レトロゾール及びイリノテカンとその代謝物ＳＮ−３８の血漿中薬物濃度を雄性ＳＤラットへの経口投与後に定量化した。ラロキシフェンをＨＡ複合体［ＨＡ−ラロキシフェン（ＨＡ−Ｒ）］として又はＨＡなし［ラロキシフェン（Ｒ）］で５０ｍｇ／ｋｇ（薬物単独、ＨＣｌ塩）投与し、その薬物動態パラメータを評価した。レトロゾールをＨＡ複合体［ＨＡ−レトロゾール（ＨＡ−Ｌ）］として又はＨＡなし［レトロゾール（Ｌ）］で５ｍｇ／ｋｇ（薬物単独、遊離塩基）投与し、その薬物動態パラメータを評価した。イリノテカンをＨＡ複合体［ＨＡ−イリノテカン（ＨＡ−Ｉ）］として又はＨＡなし［イリノテカン（Ｉ）］で５０ｍｇ／ｋｇ（薬物単独、ＨＣｌ塩）投与し、その薬物動態パラメータを評価した。定量化は、高速勾配を用いた短いＬＣカラムで選択的ＭＲＭモードによって行った。

材料

ＳＤラット血漿Ｋ２−ＥＤＴＡをバイオリクラメーションＩＶＴ（米国、メリーランド州ボルチモア）から購入した。

装置

化学天秤メトラー・トレド（モデルＡＴ２０１）、エッペンドルフ微量遠心機（モデル５４２４）、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ ＡＢ／ＳＣＩＥＸ ４０００ ＱＴＲＡＰ（オートサンプラーＧ１３６７Ａ、カラムヒータＧ１３１６Ａ及びバイナリポンプＧ１３１２Ａからなるアジレント１１００シリーズＨＰＬＣシステム）、ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル、ＡＣＳグレードのギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びギ酸（９８％）はフィッシャー・サイエンティフィック社から入手した。ミリポア社（米国、マサチューセッツ州ベッドフォード）から入手したミリ−ＱシンセシスＡ１０超純水システムで水を精製した。

動物及びサンプリングプロトコル

インビボプロトコル

ラロキシフェンの場合、雄性ＳＤラットの１群（６匹）にＨＡ−ラロキシフェン（ＨＡ−Ｒ）を５００ｍｇ／ｋｇ（薬物単独（ＨＣｌ塩）の５０ｍｇ／ｋｇに相当）経口投与し、別の１群（６匹）にラロキシフェンを５０ｍｇ／ｋｇ経口投与した。

レトロゾールの場合、雄性ＳＤラットの１群（６匹）にＨＡ−レトロゾール（ＨＡ−Ｌ）を５０ｍｇ／ｋｇ（薬物単独の５．０ｍｇ／ｋｇに相当）経口投与し、別の１群（６匹）にレトロゾールを５．０ｍｇ／ｋｇ経口投与した。

イリノテカンの場合、雄性ＳＤラットの１群（６匹）にＨＡ−イリノテカン（ＨＡ−Ｉ）を５００ｍｇ／ｋｇ（薬物単独（ＨＣｌ塩）の５０ｍｇ／ｋｇに相当）経口投与し、別の１群（６匹）にイリノテカンを５０ｍｇ／ｋｇ経口投与した。

０分、３０分、１時間、３時間、６時間、２４時間、３０時間及び４８時間で血液サンプルを採取した。遠心分離後に全ての血漿サンプルを採取し、−８０℃で凍結させた。血漿をドライアイス上でバイオファーマシー社のプラットフォームに移し、抽出及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行うまで−８０℃で保持した（表１）。

表１：雄性ＳＤラットにおける研究の概要

サンプル分析

イリノテカン及びＳＮ−３８

血漿チューブを氷上で解凍し、調製時に氷上で保持した。血漿サンプルをボルテックス混合し、４０μＬをエッペンドルフチューブにピペット注入した。１０μＬの２Ｍ ＮａＦ水溶液を迅速に添加して血漿エステラーゼによるイリノテカンの分解を最小限に抑えた。１００μＬの内部標準（ＳＮ−２２、０．５μＭアセトニトリル溶液）を添加してタンパク質を沈殿させた。チューブをボルテックス混合し、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次に、４０μＬの上清をＨＰＬＣ９６ウェルプレートに移し、２倍体積の５ｍＭ ギ酸アンモニウム含有水（ｐＨ４．０）と混合した。検量線の作成はブランクＳＤラット血漿で１０μＭ〜０．００２μＭの段階希釈によって行った。標準血漿サンプルは上述のように処理した。

ラロキシフェン

血漿サンプルをボルテックス混合し、２０μＬをエッペンドルフチューブにピペット注入した。４０μＬの内部標準（ラベタロール、０．５μＭアセトニトリル溶液）を添加してタンパク質を沈殿させた。チューブをボルテックス混合し、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。４０μＬの上清をＨＰＬＣ９６ウェルプレートに移し、２倍体積の０．２％ギ酸含有水と混合した。検量線の作成はブランクＳＤラット血漿で１０μＭ〜０．００２μＭの段階希釈によって行った。標準血漿サンプルは上述のように処理した。

レトロゾール

血漿チューブを氷上で解凍した。血漿サンプルをボルテックス混合し、２０μＬをエッペンドルフチューブにピペット注入した。４０μＬのアセトニトリルを添加してタンパク質を沈殿させた。チューブをボルテックス混合し、１３，０００ｒｐｍで４．５分間遠心分離した。２０μＬの上清をＨＰＬＣ９６ウェルプレートに移し、２倍体積の５ｍＭ 酢酸アンモニウム含有水と混合した。検量線の作成はブランクＳＤラット血漿で１０μＭ〜０．００２μＭの段階希釈によって行った。標準血漿サンプルは上述のように処理した。

生物分析

クロマトグラフィーはフェノメネックス・ルナＣ８（２） ３０×２ｍｍ（５μｍ）で０．７ｍＬ／分の勾配溶出によって行った。注入体積は４μＬであった。総捕捉時間は４．５分であった。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた選択的ＭＲＭモードでサンプルを分析した。検量線及びサンプル定量化用のピーク面積比は、アナリスト・ソフトウェア（バージョン１．６．２）を用いて算出した。分析物／内部標準のピーク面積比を用い、二次加重１／ｘ回帰によって検量線を公称分析物濃度に対してプロットした。

表２：雄性ＳＤラット（群３４）にＨＡ−イリノテカンを５００ｍｇ／ｋｇ（薬物単独のＨＣｌ塩の５０ｍｇ／ｍＬに相当）経口投与した後の血漿中イリノテカン濃度（μＭ）。

表３：雄性ＳＤラット（群３４）にＨＡ−イリノテカンを５００ｍｇ／ｋｇ（薬物単独のＨＣｌ塩の５０ｍｇ／ｍＬに相当）経口投与した後の血漿中イリノテカン濃度（ｎｇ／ｍＬ）。

表４：雄性ＳＤラット（群３５）にイリノテカンを５０ｍｇ／ｋｇ（薬物単独のＨＣｌ塩）経口投与した後の血漿中イリノテカン濃度（μＭ）。

表５：雄性ＳＤラット（群３５）にイリノテカンを５０ｍｇ／ｋｇ（薬物単独のＨＣｌ塩）経口投与した後の血漿中イリノテカン濃度（ｎｇ／ｍＬ）。

表６：雄性ＳＤラット（群３４）にＨＡ−イリノテカンを５００ｍｇ／ｋｇ（薬物単独のＨＣｌ塩の５０ｍｇ／ｍＬに相当）経口投与した後の血漿中ＳＮ−３８濃度（μＭ）。

表７：雄性ＳＤラット（群３４）にＨＡ−イリノテカンを５００ｍｇ／ｋｇ（薬物単独のＨＣｌ塩の５０ｍｇ／ｍＬに相当）経口投与した後の血漿中ＳＮ−３８濃度（ｎｇ／ｍＬ）。

表８：雄性ＳＤラット（群３５）にイリノテカンを５０ｍｇ／ｋｇ（薬物単独のＨＣｌ塩）経口投与した後の血漿中ＳＮ−３８濃度（μＭ）。

表９：雄性ＳＤラット（群３０）にＨＡ−ラロキシフェンを５００／ｋｇ（薬物単独のＨＣｌ塩の５０ｍｇ／ｍＬに相当）経口投与した後の血漿中ラロキシフェン濃度（μＭ）。

表１０：雄性ＳＤラット（群３０）にＨＡ−ラロキシフェンを５００ｍｇ／ｋｇ（薬物単独のＨＣｌ塩の５０ｍｇ／ｋｇに相当）経口投与した後の血漿中ラロキシフェン濃度（ｎｇ／ｍＬ）。

表１１：雄性ＳＤラット（群３１）にラロキシフェンを５０ｍｇ／ｋｇ（薬物単独のＨＣｌ塩）経口投与した後の血漿中ラロキシフェン濃度（μＭ）。

表１２：雄性ＳＤラット（群３１）にラロキシフェンを５０ｍｇ／ｋｇ（薬物単独のＨＣｌ塩）経口投与した後の血漿中ラロキシフェン濃度（ｎｇ／ｍＬ）。

表１３：雄性ＳＤラット（群３２）にＨＡ−レトロゾールを５０ｍｇ／ｋｇ（薬物単独の５．０ｍｇ／ｋｇに相当）経口投与した後の血漿中レトロゾール濃度（μＭ）。

表１４：雄性ＳＤラット（群３２）にＨＡ−レトロゾールを５０ｍｇ／ｋｇ（薬物単独の５．０ｍｇ／ｋｇに相当）経口投与した後の血漿中レトロゾール濃度（ｎｇ／ｍＬ）。

表１５：雄性ＳＤラット（群３３）にレトロゾールを５．０ｍｇ／ｋｇ経口投与した後の血漿中レトロゾール濃度（μＭ）。

表１６：雄性ＳＤラット（群３３）に５．０ｍｇ／ｋｇ経口投与した後の血漿中レトロゾール濃度（ｎｇ／ｍＬ）。

図１９及び２０に示すように、ラロキシフェンとレトロゾールの生物学的利用能はＨＡと組み合わせた後に向上する。重要なのは、ラロキシフェンとレトロゾールの生物学的利用能が実質的に向上するという事実にも関わらず、いずれの化合物にも薬物毒性の増大が検出されなかったことである。如何なる理論によっても拘束されるものではないとはいえ、薬物成分の生物学的利用能が向上するのは、ＨＡと架橋した場合、ＨＡ−薬物複合体を投与前に水に溶解する際にコロイド状の系が生成するためであると推測される。

ヒト胸部ＭＣＦ−７細胞を有する雌性Ｃｒｌ：ＮＵ（ＮＣｒ）−ｆｏｘｎ１ ^ｎｕ ヌードマウスにＨＡ−レトロゾール複合体を４週間に亘って２０回経口投与した後の該複合体の抗腫瘍活性

ＨＡ−レトロゾール複合体（アルロン・バイオファーマ社、カナダ、ケベック州モントリオール）。ＨＡ複合物中のレトロゾール含量は１０重量％に相当する。レトロゾール（純度９８％）はＣｈｅｍＲＦラボラトリーズ社（カナダ、ケベック州モントリオール）から入手した。カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）はシグマ−アルドリッチ社（カナダ、オンタリオ州オークビル）から入手した。

レトロゾール

レトロゾール溶液を週に１回調製した。レトロゾール（１５ｍｇ）を３０．０ｍＬの注射用滅菌水で再構成し、５ｍｇ／ｋｇ（０．５ｍｇ／ｍＬ）の用量を得た。再構成溶液を１時間おきに約５分間ボルテックスし、それを約８時間行った後、室温で一晩静置させた。翌日、氷冷水で満たした水槽超音波処理装置を用いて、溶液の超音波処理を１０〜２０分間行った。溶解後、レトロゾール溶液を５個のバイアルに分割し（５日間の投与用）、４℃で保存した。

ＨＡ−レトロゾール

ＨＡ−レトロゾールの３種類の溶液、すなわち、低用量（０．０５ｍｇ／ｍＬ）、中用量（０．５ｍｇ／ｍＬ）及び高用量（５．０ｍｇ／ｍＬ）を週に１回調製した。ＨＡ−レトロゾール（１５０ｍｇ）を３０ｍＬの注射用滅菌水で再構成し、５０ｍｇ／ｋｇ（５ｍｇ／ｍＬ）の用量を得た。再構成溶液を１時間おきに約５分間ボルテックスし、それを約８時間行った後、室温で一晩静置させた。翌日、溶液を最後に約１分間ボルテックスした後、５個のバイアルに分割し（５日間の投与用）、４℃で保存した。低用量ＨＡ−レトロゾール溶液（０．５ｍｇ／ｋｇ（０．０５ｍｇ／ｍＬ））は、５ｍｇ／ｋｇ溶液を適量の注射用水で希釈（１：１０）して調製した。低用量ＨＡ−レトロゾール溶液も５個のバイアルに分割し（５回の投与用）、４℃で保存して投与に備えた。

ＣＭＣ−レトロゾール

ＣＭＣ−レトロゾール溶液を週に１回調製した。溶液の調製は次の３工程で行った。１）レトロゾール（１５ｍｇ）を３０．０ｍＬの注射用滅菌水で再構成し、５ｍｇ／ｋｇ（０．５ｍｇ／ｍＬ）の用量を得た。２）ＣＭＣ（１３５ｍｇ）をレトロゾール溶液と混合した。３）再構成溶液を１時間おきに約５分間ボルテックスし、それを約８時間行った後、室温で一晩静置させた。翌日、溶液を最後に１回ボルテックスし、氷冷水で満たした水槽超音波処理装置を用いて超音波処理を１０〜２０分間行った。溶解後、ＣＭＣ−レトロゾール溶液を５個のバイアルに分割し（５回の投与用）、４℃で保存した。用量５０ｍｇ／ｋｇのＣＭＣ−レトロゾールを得た（ＣＭＣ：４．５ｍｇ／ｍＬ＋レトロゾール：０．５ｍｇ／ｍＬ）。

腫瘍細胞株

ヒトＭＣＦ−７胸部癌細胞株をシグマ−アルドリッチ社から入手した（ＥＣＡＣＣ、ロット番号１２Ｃ００２）。

動物

７２匹の雌性Ｃｒｌ：ＮＵ（ＮＣｒ）−ｆｏｘｎ１ｎｕヌードマウス（３５〜４２日齢）をチャールズ・リバー・ラボラトリーズ社（米国、マサチューセッツ州ウィルミントン）から入手した。

腫瘍接種

７２匹の雌性Ｃｒｌ：ＮＵ（ＮＣｒ）−ｆｏｘｎ１ｎｕヌードマウスの各々の左下側腹部に癌細胞を皮下投与してＭＣＦ−７腫瘍を誘発した。腫瘍細胞をマトリゲル（登録商標）（コーニング・ライフ・サイエンス社、米国、ニューヨーク州コーニング、ロット番号４２０９０１４、エンゲルブレス−ホルム−スワーム（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞が分泌したゼラチン状タンパク質混合物）中で調製して、多くの組織で見られる複雑な細胞外環境を模倣し、腫瘍増殖を促進させた（エストロゲン補充なし）。すなわち、ＭＣＦ−７細胞をトリプシン処理し、遠心し、遠心分離（４００ｇで５分間、室温）によって滅菌リン酸緩衝食塩水で１回洗浄した。トリパンブルー排除試験によって細胞を計数し、氷冷滅菌リン酸緩衝食塩水で濃度を調整して０．１ｍＬ当りのＭＣＦ−７細胞数を１×１０^７個とした。次に、細胞をマトリゲル（登録商標）と注意深く混合し（１：１）、注入するまで氷上で保持した。２５Ｇ針を用いてマウスの左下側腹部に０．２ｍＬの細胞（マウス１匹当り１×１０^７個の細胞）を皮下接種した。注入終了時に針を１８０度回転させて液体（細胞）の漏れを防いだ。トリパンブルー排除試験によって腫瘍接種終了時に細胞生存率を求めた。

試験物の投与（処理スケジュール）

投薬溶液の投与は、２０Ｇ栄養補給針を用いた経口投与（強制経口投与）によって４週間に亘って２０回行った。投薬量は０．２ｍＬ（約１０ｍＬ／ｋｇ）とした。

腫瘍導入から０〜６０日後の媒体群と処理マウスにおける経時的な平均腫瘍体積を図１７に示す。腫瘍体積の変化は少ないが、最高用量のＨＡ−レトロゾール（５０ｍｇ／ｋｇ）はヒトＭＣＦ−７胸部腫瘍に対して有意な活性を有することが分かった（ｐ＝０．０３９）（表１７）。ＨＡ−レトロゾールは５ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇでは非活性であった（それぞれｐ＝０．９１５及びｐ＝０．５７０）ため、用量依存的な関係はない。未結合レトロゾール（遊離型）も非活性であることが分かった。ＣＭＣ−レトロゾールは僅かに活性であるが、観察された活性は有意ではない（表１７）。腫瘍のないマウス（触知腫瘤なし）に至る腫瘍縮小は、未結合レトロゾール（５ｍｇ／ｋｇ）、ＨＡ−レトロゾール（５０ｍｇ／ｋｇ）、ＨＡ−レトロゾール（０．５ｍｇ／ｋｇ）及びＣＭＣ−レトロゾール（５０ｍｇ／ｋｇ）で見られた（表１８）。ＨＡ−レトロゾールを最高用量（５０ｍｇ／ｋｇ）で繰り返し経口投与した後には有意な腫瘍縮小が見られた（ｐ＝０．０３９）が、低い用量（５ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇ）では見られなかった。したがって、有意な抗腫瘍活性を示すＨＡ−レトロゾールの最小有効用量（ＭＥＤ）は５０ｍｇ／ｋｇであることが立証された。５０ｍｇ／ｋｇのＨＡ−レトロゾールは純粋なレトロゾールの用量５ｍｇ／ｋｇに相当する。純粋なレトロゾール（５ｍｇ／ｋｇ）は非活性であることが分かった一方、ＣＭＣ−レトロゾール（５０ｍｇ／ｋｇ）は僅かに活性であったが、観察された活性は有意ではない。

表１７：研究終了時（６０日目）の媒体群と処理マウスにおける平均ヒト胸部ＭＣＦ−７腫瘍体積及び統計分析（スチューデントｔ検定）。

表１８：研究終了時及び腫瘍が観察されない開始日における腫瘍のないマウス（触知腫瘤なし）の数。

１７β−エストラジオールを補給したヒト胸部ＭＣＦ−７細胞を有する雌性Ｃｒｌ：ＮＵ（ＮＣｒ）−ｆｏｘｎ１ ^ｎｕ ヌードマウスにＨＡ−ラロキシフェン複合体を４週間に亘って２０回経口投与した後の該複合体の抗腫瘍活性

ＨＡ−ラロキシフェン複合体（アルロン・バイオファーマ社、カナダ、ケベック州モントリオール）。ＨＡ複合物中のラロキシフェン含量は１０重量％に相当する。ラロキシフェン塩酸塩（純度９８％）はＣｈｅｍＲＦラボラトリーズ社（カナダ、ケベック州モントリオール）から入手した。カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）はシグマ−アルドリッチ社（カナダ、オンタリオ州オークビル）から入手した。

ラロキシフェン

ラロキシフェン溶液を週に１回調製した。ラロキシフェン（７５ｍｇ）を１５．０ｍＬの注射用滅菌水で再構成し、５０ｍｇ／ｋｇ（５．０ｍｇ／ｍＬ）の用量を得た。再構成溶液を短時間ボルテックスし、氷冷水で満たした水槽超音波処理装置を用いて超音波処理を１０〜２０分間行った。溶解後、ラロキシフェン溶液を５個のバイアルに分割し（５日間の投与用）、４℃で保存した。

ＨＡ−ラロキシフェン

ＨＡ−ラロキシフェンの３種類の溶液、すなわち、低用量（０．５ｍｇ／ｍＬ）、中用量（５．０ｍｇ／ｍＬ）及び高用量（５０．０ｍｇ／ｍＬ）を週に１回調製した。ＨＡ−ラロキシフェン（１５ｍｇ、１５０ｍｇ及び１ｇ）をそれぞれ３０ｍＬ、５０ｍＬ及び２０ｍＬの注射用滅菌水で再構成して次の用量、５ｍｇ／ｋｇ（薬物単独０．５ｍｇ／ｍＬに相当）、５０ｍｇ／ｋｇ（５．０ｍｇ／ｍＬ）及び５００ｍｇ／ｋｇ（５０ｍｇ／ｍＬ）を得た。再構成溶液を１時間おきに約５分間ボルテックスし、それを約８時間行った後、室温で一晩静置させた。翌日、溶液を約１分間ボルテックスした後、５個のバイアルに分割し（５日間の投与用）、４℃で保存した。

ＣＭＣ−ラロキシフェン

ＣＭＣ−ラロキシフェン溶液を週に１回調製した。溶液の調製は次の３工程で行った。１）ラロキシフェン（１００ｍｇ）を２０．０ｍＬの注射用滅菌水で再構成し、５０ｍｇ／ｋｇ（５．０ｍｇ／ｍＬ）の用量を得た。再構成溶液を短時間ボルテックスし、氷冷水で満たした水槽超音波処理装置を用いて超音波処理を１０〜２０分間行った。２）次に、３方ストップコックシリンジ（ＢＤ、米国、ニュージャージー州フランクリンレイクス）を用いてＣＭＣ（９００ｍｇ）をラロキシフェン溶液と混合した。３）再構成溶液を１時間おきに約５分間ボルテックスし、それを約８時間行った後、室温で一晩静置させた。翌日、溶液を最後に１回ボルテックスし、５個のバイアルに分割し（５回の投与用）、４℃で保存した。用量５００ｍｇ／ｋｇのＣＭＣ−ラロキシフェンを得た（ＣＭＣ：４５ｍｇ／ｍＬ＋ラロキシフェン：５ｍｇ／ｍＬ）。

腫瘍細胞株

ヒトＭＣＦ−７胸部癌細胞株をシグマ−アルドリッチ社から入手した（ＥＣＡＣＣ、ロット番号１２Ｃ００２）。エストロゲン依存ＭＣＦ−７腫瘍の増殖をサポートするため、腫瘍導入の１日前にマウスの腫瘍移植側とは反対側に１０Ｇトロカールを用いてイソフルラン麻酔下で０．７２ｍｇの１７β−エストラジオール６０日間放出ペレット（イノベーティブ・リサーチ社、米国、フロリダ州サラソータ）を皮下移植した。

動物

７２匹の雌性Ｃｒｌ：ＮＵ（ＮＣｒ）−ｆｏｘｎ１ｎｕヌードマウス（３５〜４２日齢）をチャールズ・リバー・ラボラトリーズ社（米国、マサチューセッツ州ウィルミントン）から入手した。

腫瘍接種

７２匹の雌性Ｃｒｌ：ＮＵ（ＮＣｒ）−ｆｏｘｎ１ｎｕヌードマウスの各々の左下側腹部に癌細胞を皮下投与してＭＣＦ−７腫瘍を誘発した。すなわち、ＭＣＦ−７細胞をトリプシン処理し、遠心し、遠心分離（４００ｇで５分間、室温）によって滅菌リン酸緩衝食塩水で１回洗浄した。トリパンブルー排除試験によって細胞を計数し、滅菌リン酸緩衝食塩水で濃度を調整して０．１ｍＬ当りのＭＣＦ−７細胞数を１×１０^７個とした。２５Ｇ針を用いてマウスの左下側腹部に０．１ｍＬの細胞（マウス１匹当り１×１０^７個の細胞）を皮下接種した。注入終了時に針を１８０度回転させて液体（細胞）の漏れを防いだ。トリパンブルー排除試験によって腫瘍接種終了時に細胞生存率を求めた。

試験物の投与（処理スケジュール）

投薬溶液の投与は、２０Ｇ栄養補給針を用いた経口投与（強制経口投与）によって４週間に亘って２０回行った。投薬量は０．２ｍＬ（約１０ｍＬ／ｋｇ）とした。

腫瘍導入から０〜４９日後の媒体群と処理マウスにおける経時的な平均腫瘍体積を図１８に示す。最高用量のＨＡ−ラロキシフェン（５００ｍｇ／ｋｇ）のみがヒトＭＣＦ−７胸部腫瘍に対して有意な活性を有することが分かった（ｐ＝０．０１７８）（表１９）。ＨＡ−ラロキシフェンは５０ｍｇ／ｋｇ及び５．０ｍｇ／ｋｇでは非活性であったため、用量依存的な関係はない。未結合ラロキシフェン（遊離型）も非活性であることが分かった。５００ｍｇ／ｋｇのＨＡ−ラロキシフェンで処理したマウスでは、有意な抗癌活性が見られた場合であっても腫瘍縮小は見られなかった。しかし、所定のレジメン（４週間に亘る２０回の投与）ではＨＡ−ラロキシフェンによって腫瘍増殖が遅延した（図１８）。５００ｍｇ／ｋｇのＨＡ−ラロキシフェンはヒト胸部ＭＣＦ−７腫瘍に対して高活性である。５ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇの用量では非活性であったため、有意な抗腫瘍活性を示すＨＡ−ラロキシフェンの最小有効用量（ＭＥＤ）は５００ｍｇ／ｋｇであることが立証された。５００ｍｇ／ｋｇのＨＡ−ラロキシフェンはラロキシフェンの用量５０ｍｇ／ｋｇに相当する。純粋なラロキシフェンでは腫瘍増殖が抑制されなかったが、このことは、マウスのＭＣＦ−７異種移植モデルにおいて０．３及び３．０ｍｇ／ｋｇ／日のラロキシフェンの有効性が低いことを示唆する文献データ（ブレイディ（Brady）Ｈ．、デサイ（Desai）Ｓ．、ガヨ−フン（Gayo-Fung）Ｌ.Ｍ．ら、乳癌細胞及び異種移植モデルに対するＳＰ５００２６３（新規で強力な抗エストロゲン剤）の作用、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２（２００２）１４３９−１４４２）及び１３．８ｍｇ／ｋｇ（２７μモル／ｋｇ）のラロキシフェンの有効性が低いことを示唆する文献データ（オカモトＹ．、リウ（Liu）Ｘ．、スズキＮ．ら、ラロキシフェンのプロドラッグ（ラロキシフェン二リン酸塩）の高い抗腫瘍潜在力、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １２２（２００８）２１４２−２１４７）を裏付けるものである。しかし、本研究から、ＨＡとの架橋によってラロキシフェンの生物学的利用能が向上し、ＨＡ−ラロキシフェンが活性を示す唯一の化合物であるこが実証された。最後に、５００ｍｇ／ｋｇのＨＡ−ラロキシフェンは５００ｍｇ／ｋｇのＣＭＣ−ラロキシフェンよりも強力であることが分かった。

表１９：研究終了時（４９日目）の媒体群と処理マウスにおける平均ヒト胸部ＭＣＦ−７腫瘍体積及び統計分析（スチューデントｔ検定）。

腫瘍のないマウス（触知腫瘤なし）に至る腫瘍縮小は、未結合レトロゾール（５ｍｇ／ｋｇ）、ＨＡ−レトロゾール（５０ｍｇ／ｋｇ）、ＨＡ−レトロゾール（０．５ｍｇ／ｋｇ）及びＣＭＣ−レトロゾール（５０ｍｇ／ｋｇ）で見られた（表１８）。ＨＡ−レトロゾールを最高用量（５０ｍｇ／ｋｇ）で繰り返し経口投与した後には有意な腫瘍縮小が見られた（ｐ＝０．０３９）が、低用量（５ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇ）では見られなかった。したがって、有意な抗腫瘍活性を示すＨＡ−レトロゾールの最小有効用量（ＭＥＤ）は５０ｍｇ／ｋｇであることが立証された。５０ｍｇ／ｋｇのＨＡ−レトロゾールは純粋なレトロゾールの用量５ｍｇ／ｋｇに相当する。純粋なレトロゾール（５ｍｇ／ｋｇ）は非活性であることが分かった一方、ＣＭＣ−レトロゾール（５０ｍｇ／ｋｇ）は僅かに活性であったが、観察された活性には有意差はなかった。

現在好ましいと考えられる実施例を参照しつつ本開示について説明してきたが、本開示が開示された実施例に限定されないことは理解されよう。逆に本開示は、添付された請求項の精神及び範囲内に含まれる様々な変更や均等物を網羅するものとする。

Claims (30)

1. 分子量が１０，０００Ｄａ〜７，０００，０００Ｄａのヒアルロン酸と抗腫瘍剤とを含む水溶性ゲル高分子マトリックスであって、該抗腫瘍剤は該高分子マトリックスと架橋しており、該高分子マトリックスによって抗腫瘍剤の水溶性が改善されている水溶性ゲル高分子マトリックス。
2. 抗腫瘍剤が共有結合及び／又は静電結合の少なくとも一方によって架橋している、請求項１に記載の水溶性ゲル高分子マトリックス。
3. 抗腫瘍剤が静電結合によって架橋しており、静電結合は水素結合である、請求項２に記載の水溶性ゲル高分子マトリックス。
4. 抗腫瘍剤が共有結合によって架橋している、請求項２に記載の水溶性ゲル高分子マトリックス。
5. 抗腫瘍剤が、アザシチジン、イマチニブ、レナリドミド、エトポシド、トポテカン、イリノテカン、レトロゾール、ラロキシフェン、シクロホスファミド、メクロレタミン、カルバジルキノン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、ニムスチン、カルムスチン、プロカルバジン、ダカルバジン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、５−フルオロウラシル、フトラフル、フロクスウリジン、シタラビン、アンシタビン、ドキシフルリジン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシン、クロモマイシンＡ３、シネルビンＡ、アクラシノマイシンＡ、アドリアマイシン、ペプロマイシン、シスプラチン、ミトキサントロン、エピルビシン、ピラルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、カルボプラチン、リン酸エストラムスチン、ミトタン、ポルフィリン、パクリタキセル及びドセタキセルから選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の水溶性ゲル高分子マトリックス。
6. ヒアルロン酸の抗腫瘍剤に対する比率が約２０：１〜約２：１である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の水溶性ゲル高分子マトリックス。
7. ヒアルロン酸の抗腫瘍剤に対する比率が約１０：１〜約２：１である、請求項６に記載の水溶性ゲル高分子マトリックス。
8. ヒアルロン酸の抗腫瘍剤に対する比率が約５：１〜約２：１である、請求項７に記載の水溶性ゲル高分子マトリックス。
9. 架橋は押出プロセスによってなされる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の水溶性ゲル高分子マトリックス。
10. 抗腫瘍剤が高いＣ_ｍａｘ（最大血漿中薬物濃度）値及び高いＴ_ｍａｘ（Ｃ_ｍａｘ到達時間）値を示す、請求項１〜９のいずれか１項に記載の水溶性ゲル高分子マトリックス。
11. 分子量が１０，０００Ｄａ〜７，０００，０００Ｄａのヒアルロン酸と抗腫瘍剤とを含む医薬送達媒体であって、該抗腫瘍剤はヒアルロン酸と架橋して水溶性ゲル高分子マトリックスを形成しており、該高分子マトリックスによって抗腫瘍剤の水溶性が改善されている医薬送達媒体。
12. 抗腫瘍剤が共有結合及び／又は静電結合の少なくとも一方によって架橋している、請求項１１に記載の医薬送達媒体。
13. 抗腫瘍剤が静電結合によって架橋しており、該静電結合は水素結合である、請求項１２に記載の医薬送達媒体。
14. 抗腫瘍剤が共有結合によって架橋している、請求項１２に記載の水溶性ゲル高分子マトリックス。
15. 抗腫瘍剤が、アザシチジン、イマチニブ、レナリドミド、エトポシド、トポテカン、イリノテカン、レトロゾール、ラロキシフェン、シクロホスファミド、メクロレタミン、カルバジルキノン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、ニムスチン、カルムスチン、プロカルバジン、ダカルバジン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、５−フルオロウラシル、フトラフル、フロクスウリジン、シタラビン、アンシタビン、ドキシフルリジン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシン、クロモマイシンＡ３、シネルビンＡ、アクラシノマイシンＡ、アドリアマイシン、ペプロマイシン、シスプラチン、ミトキサントロン、エピルビシン、ピラルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、カルボプラチン、リン酸エストラムスチン、ミトタン、ポルフィリン、パクリタキセル及びドセタキセルから選択される、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の医薬送達媒体。
16. ヒアルロン酸の抗腫瘍剤に対する比率が約２０：１〜約２：１である、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の医薬送達媒体。
17. ヒアルロン酸の抗腫瘍剤に対する比率が約１０：１〜約２：１である、請求項１６に記載の医薬送達媒体。
18. ヒアルロン酸の抗腫瘍剤に対する比率が約５：１〜約２：１である、請求項１７に記載の医薬送達媒体。
19. 架橋が押出プロセスによってなされる、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の医薬送達媒体。
20. 抗腫瘍剤が高いＣ_ｍａｘ（最大血漿中薬物濃度）値及び高いＴ_ｍａｘ（Ｃ_ｍａｘ到達時間）値を示す、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の医薬送達媒体。
21. 架橋ヒアルロン酸マトリックスを調製するためのプロセスであって、ヒアルロン酸を押出して押出ヒアルロン酸を得ることと、押出ヒアルロン酸を抗腫瘍剤と混合して混合物を得ることと、混合物を押出して架橋ヒアルロン酸マトリックスを得ることとを含むプロセス。
22. 架橋ヒアルロン酸マトリックスをさらなるヒアルロン酸と混合して押出すことをさらに含む、請求項２１に記載のプロセス。
23. ヒアルロン酸が分子量が１０，０００Ｄａ〜７，０００，０００Ｄａである、請求項２１又は２２に記載のプロセス。
24. 抗腫瘍剤が、アザシチジン、イマチニブ、レナリドミド、エトポシド、トポテカン、イリノテカン、レトロゾール、ラロキシフェン、シクロホスファミド、メクロレタミン、カルバジルキノン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、ニムスチン、カルムスチン、プロカルバジン、ダカルバジン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、５−フルオロウラシル、フトラフル、フロクスウリジン、シタラビン、アンシタビン、ドキシフルリジン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシン、クロモマイシンＡ３、シネルビンＡ、アクラシノマイシンＡ、アドリアマイシン、ペプロマイシン、シスプラチン、ミトキサントロン、エピルビシン、ピラルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、カルボプラチン、リン酸エストラムスチン、ミトタン、ポルフィリン、パクリタキセル及びドセタキセルから選択される、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のプロセス。
25. ヒアルロン酸の抗腫瘍剤に対する比率が約２０：１〜約２：１である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のプロセス。
26. ヒアルロン酸の抗腫瘍剤に対する比率が約１０：１〜約２：１である、請求項２５に記載のプロセス。
27. ヒアルロン酸の抗腫瘍剤に対する比率が約５：１〜約２：１である、請求項２６に記載のプロセス。
28. 抗腫瘍剤が共有結合及び／又は静電結合によって架橋する、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載のプロセス。
29. 抗腫瘍剤が静電結合によって架橋し、該静電結合は水素結合である、請求項２８に記載のプロセス。
30. 抗腫瘍剤が共有結合によって架橋する、請求項２８に記載のプロセス。