JP2018515766A - ポリペプチド混合物の高速液体クロマトグラフィー分析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
グラチラマー酢酸塩は、連続性が非常に強い共重合体であり、その構造が、以下の式で示されている。
当該薬物のジェネリック医薬品メーカーは、当該薬物の固有特性のいくつかのみに基づいて、グラチラマー酢酸塩のジェネリック製剤とグラチラマー酢酸塩の対照製剤との組成差異を検討する。
グラチラマー酢酸塩は、連続性が非常に強い共重合体であるので、一種の単離方法のみで各組成を把握することが困難である。従来の分析方法では、組成間の分子量差異に基づき、サイズ排除法を用いて、簡単な単離・分析を行う(シングルピークをいくつかの組成に分けて収集した後、この組成をさらに分析する)。よって、文献に記載の方法は相対的に複雑である。それ故、グラチラマー酢酸塩の各組成を効果的に単離することができる分析方法の開発は、非常に必要である。
まず、本発明は、高速液体クロマトグラフィー法にて、グラチラマー酢酸塩に対してリニアまたは段階的な勾配溶出を行い、当該共重合体における各組成の含有量が合格するか否かを分析する方法に関する。
当該方法は、測定用グラチラマー酢酸塩溶液を調製するステップ(1)、
アニオン交換液体クロマトグラフィー、カチオン交換液体クロマトグラフィーまたは逆相液体クロマトグラフィーにて、測定用サンプルに対して勾配溶出を行うステップ(2)、及び
共重合体の各組成に対応するピーク面積を検出・分析し、コントロールと比較することで、測定用サンプルにおける各組成の含有量の範囲が合格するか否かを確認するステップ(3)を含む。
ステップ(2)における、前記溶出の勾配、及び前記アニオン交換液体クロマトグラフィーのクロマトグラフィー条件は、以下の通りである。
クロマトカラムは、カルボキシル基を結合するポリスチレン-ジビニルベンゼン粒子(粒子径:1.7μm〜10μm)を充填材とし、
移動相Aは、トリス(ヒドロキシ)アミノメタン塩酸塩10mM〜50mMを含み、且つNaOH溶液でpH 10〜12に調整された溶液であり、
移動相Bは、トリス(ヒドロキシ)アミノメタン塩酸塩10mM〜50mM、塩化ナトリウム0.5M〜1.5Mを含み、且つ塩酸溶液でpH 8〜10に調整された溶液であり、
注入量は5μL〜50μL、サンプルの濃度は1mg/ml〜20mg/ml、流速は0.5mL/min〜1.5mL/min、溶出時間は50〜250minである。
溶出の勾配としては、異なる形態を有する溶出の勾配を採用して溶出を行い、クロマトカラムの温度が25℃〜50℃である。
前記溶出の勾配は、全溶出時間をN(2≦N≦20、好ましくは5≦N≦15、より好ましくは8≦N≦12、最も好ましくはN=10である)等分として、順に勾配溶出を行い、第1分段〜第N-1分段の勾配において、移動相Aの割合を100%から徐々に50%まで低下させ、移動相Bの割合を0から徐々に50%まで向上させ、第N分段の移動相Aの割合は100%であり、移動相Bの割合は0である。
ステップ(2)における、前記カチオン交換液体クロマトグラフィーのクロマトグラフィー条件は、以下の通りである。
クロマトカラムは、第三級アミン基を結合するポリスチレン-ジビニルベンゼン粒子(粒子径:1.7μm〜10μm)を充填材とし、
移動相A は、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸 10mM〜50mM、EDTA 0.5mM〜5mMを含み、且つNaOH溶液でpH 4〜6に調整された溶液であり、
移動相B は、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸10mM〜50mM、EDTA 0.5mM〜5mM、NaCl 1M〜2.5Mを含み、且つNaOH溶液でpH 5〜7に調整された溶液であり、
注入量は5μL〜50μL、サンプルの濃度は 1mg/ml〜20mg/ml、流速は0.5mL/min〜1.5mL/min、溶出時間は 50〜250minである。
溶出の勾配としては、異なる形態を有する溶出の勾配を採用して溶出を行い、クロマトカラムの温度は25℃〜50℃である。
前記溶出の勾配は、全溶出時間をN(2≦N≦20、5≦N≦15が好ましく、8≦N≦12がより好ましく、N=10が最も好ましい)等分として、順に勾配溶出を行い、第1分段〜第N-1分段の勾配において、移動相Aの割合を100%から徐々に0%まで低下させ、移動相Bの割合を0から徐々に100%まで向上させ、第N分段の移動相Aの割合は90%であり、移動相Bの割合は10%である。
クロマトカラムは、C18、C12、C8、C4を結合するシリカ粒子(粒子径:1.7μm〜10μm)を充填材とし、
移動相Aは、アセトニトリルであり、移動相Bは、硫酸アンモニウム30mM〜80mMを含み、リン酸溶液でpH 2〜3に調整された溶液、または0.1%トリフルオロ酢酸溶液であり、
注入量は5μL〜50μL、サンプルの濃度は1mg/ml〜20mg/ml、流速は0.5mL/min〜1.5mL/min、溶出時間は50〜250minである。
溶出の勾配としては、異なる形態を有する溶出の勾配を採用して溶出を行い、クロマトカラムの温度が25〜50℃である。
前記溶出の勾配は、全溶出時間をN(2≦N≦20、好ましくは5≦N≦15、より好ましくは8≦N≦12、最も好ましくはN=10である)等分として、順に勾配溶出を行い、第1分段〜第N-1分段の勾配において、移動相Aの割合を5%から徐々に40%まで向上させ、移動相Bの割合を、95%から徐々に60%まで低下させ、第N分段の移動相Aの割合は5%であり、移動相Bの割合は、95%である。
蛍光検出器を採用する場合、その励起波長は、230nmであり、放射波長は、300nmである。
ウォーターズ2695HPLC装置および2475蛍光多波長検出器(励起波長(Ex):230nm、放射波長(Em):300nm、クロマトカラムのサイズ:長さ150mm、直径4.6mm、クロマトカラム充填材:ポリスチレン-ジビニルベンゼン粒子(粒子径:3μm)を用いる。移動相Aは、NaOH溶液でpH11.2に調整された、20mMトリス(ヒドロキシ)アミノメタン塩酸塩である。移動相Bは、NaCl 1Mを含み、塩酸溶液でpH9.8に調整された、20Mmのトリス(ヒドロキシ)アミノメタン塩酸塩である。下記の表1に従い、移動相AおよびBの割合を設定する。市販のグラチラマー酢酸塩(以下、コントロールという)および試作のサンプルグラチラマー酢酸塩(以下、試作サンプルという)にそれぞれ移動相を加え、溶解して、1mLあたり約20mgの溶液を調製し、測定に提供する。注入量25μL、流速0.8mL/min、クロマトカラム温度30℃という条件を採用する。各組成の割合を表2に示す。あるサンプルのクロマトグラフィー分析グラフを図1-1に示す。
ウォーターズ2695HPLC 装置および2475蛍光多波長検出器(励起波長(Ex):230nm、放射波長(Em):300nm、クロマトカラムのサイズ:長さ150mm、直径4.6mm、クロマトカラム充填材:ポリスチレン-ジビニルベンゼン粒子(粒子径:5μm))を使用する。移動相Aは、NaOH溶液でpH10に調整された、10mM トリス(ヒドロキシ)アミノメタン塩酸塩である。移動相Bは、1.5M NaClを含み、塩酸溶液でpH8に調整された、10mM トリス(ヒドロキシ)アミノメタン塩酸塩である。表1に従い、移動相AおよびBの割合を設定する。コントロールまたは試作サンプルにそれぞれ移動相を加え、溶解して、1mLあたり約20mgの溶液を調製し、測定に提供する。注入量15μL、流速0.5mL/min、クロマトカラムの温度25℃という条件を採用する。あるサンプルのクロマトグラフィー分析グラフを図1-2に示す。
ウォーターズ2695 HPLC 装置および2489UV多波長検出器(波長:275nm、クロマトカラムのサイズ:長さ150mm、直径4.6mm、クロマトカラム充填材:ポリスチレン-ジビニルベンゼン粒子(粒子径:10μm))を使用する。移動相Aは、NaOH溶液でpH12に調整された、50mMのトリス(ヒドロキシ)アミノメタン塩酸塩である。移動相Bは、NaCl 0.5Mを含み、塩酸溶液でpH10に調整された、50mMのトリス(ヒドロキシ)アミノメタン塩酸塩である。表1に従い、移動相AおよびBの割合を設定する。コントロールまたは試作サンプルにそれぞれ移動相を加え、溶解して、1mLあたり約10mgの溶液を調製し、測定に提供する。注入量50μL、流速1.5mL/min、クロマトカラムの温度50℃という条件を採用する。あるサンプルのクロマトグラフィー分析グラフを図1-3に示す。
ウォーターズ2695HPLC 装置および2489UV多波長検出器(波長:275nm、クロマトカラムのサイズ:長さ150mm、直径4.6mm、クロマトカラム充填材:ポリスチレン-ジビニルベンゼン粒子(粒子径:3μm))を使用する。移動相Aは、NaOH溶液でpH10に調整された、30mMのトリス(ヒドロキシ)アミノメタン塩酸塩である。移動相Bは、NaCl 1Mを含み、塩酸溶液でpH8に調整された、30mMのトリス(ヒドロキシ)アミノメタン塩酸塩である。下記の表3に従い、移動相AおよびBの割合を設定する。コントロールまたは試作サンプルにそれぞれ移動相を加え、溶解して、1mLあたり約20mgの溶液を調製し、測定に提供する。注入量25μL、流速0.8mL/min、クロマトカラムの温度40℃という条件を採用する。あるサンプルのクロマトグラフィー分析グラフを図1-4に示す。
ウォーターズ2695 HPLC 装置および2475蛍光多波長検出器(励起波長(Ex):230nm、放射波長(Em):300nm、クロマトカラムのサイズ:長さ150mm、直径4.6mm、クロマトカラム充填材:ポリスチレン-ジビニルベンゼン粒子(粒子径:3μm))を使用する。移動相Aは、NaOH溶液でpH11.2に調整された、20mMのトリス(ヒドロキシ)アミノメタン塩酸塩である。移動相Bは、NaCl 1Mを含み、塩酸溶液でpH9.8に調整された、20mMのトリス(ヒドロキシ)アミノメタン塩酸塩である。下記の表4に従い、移動相AおよびBの割合を設定する。コントロールまたは試作サンプルに移動相を加え、溶解し、1mLあたり約20mgの溶液を調製し、測定に提供する。注入量25μL、流速1mL/min、クロマトカラムの温度30℃という条件を採用する。あるサンプルのクロマトグラフィー分析グラフを図1-5に示す。これからわかったように、当該溶出条件では、効果的にサンプルの組成を単離することができない。
ウォーターズ2695HPLC装置および2489UV多波長検出器(励起波長:275nm、クロマトカラムのサイズ:長さ150mm、直径4.6mm、クロマトカラム充填材:ポリスチレン-ジビニルベンゼン粒子(粒子径:3μm))を使用する。移動相Aは、NaOH溶液でpH11.2に調整された、20mMのトリス(ヒドロキシ)アミノメタン塩酸塩である。移動相Bは、NaCl 1Mを含み、塩酸溶液でpH9.8に調整された、20mMのトリス(ヒドロキシ)アミノメタン塩酸塩である。下記の表4に従い、移動相AおよびBの割合を設定する。コントロールおよび試作サンプルにそれぞれ移動相を加え、溶解して、1mLあたり約20mgの溶液を調製し、測定に提供する。注入量25μL、流速0.8mL/min、クロマトカラムの温度30℃という条件を採用する。それの各組成の割合を表6に示す。
実施例7
ウォーターズ2695HPLC 装置および2475蛍光多波長検出器(励起波長(Ex):230nm、放射波長(Em):300nm、クロマトカラムのサイズ:長さ250mm、直径4.6mm、クロマトカラム充填材:第三級アミンを結合するポリスチレン-ジビニルベンゼン粒子(粒子径:5μm))を使用する。移動相Aは、1mM EDTAを含み、NaOH溶液でpH5.2に調整された、20mMの2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸である。移動相Bは、EDTA 2mM、NaCl 2Mを含み、NaOH溶液でpH5.8に調整された、20mMの2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸である。下記の表7に従い、移動相AおよびBの割合を設定する。コントロールまたは試作サンプルに移動相を加え、溶解して、1mLあたり約20mgの溶液を調製し、測定に提供する。注入量25μL、流速1mL/min、クロマトカラムの温度30℃という条件を採用する。あるサンプルのクロマトグラフィー分析グラフを図2-1に示す。
ウォーターズ2695HPLC 装置および2489UV多波長検出器(波長:275nm、クロマトカラムのサイズ:長さ250mm、直径4.6mm、クロマトカラム充填材:第三級アミン基を結合するポリスチレン-ジビニルベンゼン粒子(粒子径:10μm))を使用する。移動相Aは、EDTA 0.5mMを含み、NaOH溶液でpH4に調整された、10mMの2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸である。移動相Bは、EDTA 5mM、NaCl 2Mを含み、NaOH溶液でpH7に調整された、10mMの2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸である。表7に従い、移動相AおよびBの割合を設定する。コントロールまたは試作サンプルに移動相を加え、溶解し、1mLあたり約20mgの溶液を調製し、測定に提供する。注入量15μL、流速1mL/min、クロマトカラムの温度25℃という条件を採用する。あるサンプルのクロマトグラフィー分析グラフを図2-2に示す。
ウォーターズ2695HPLC装置および2475蛍光多波長検出器(励起波長(Ex):230nm、放射波長(Em):300nm、クロマトカラムのサイズ:長さ250mm、直径4.6mm、クロマトカラム充填材:第三級アミン基を結合するポリスチレン-ジビニルベンゼン粒子(粒子径:5μm))を使用する。移動相Aは、EDTA 1mMを含み、NaOH溶液でpH6に調整された、50mMの2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸である。移動相Bは、EDTA 2mM、NaCl 2Mを含み、NaOH溶液でpH5に調整された、50mMの2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸である。表7に従い、移動相AおよびBの割合を設定する。コントロールまたは試作サンプルに移動相を加え、溶解し、1mLあたり約10mgの溶液を調製し、測定に提供する。注入量50μL、流速1mL/min、クロマトカラムの温度30℃という条件を採用する。あるサンプルのクロマトグラフィー分析グラフを図2-3に示す。
ウォーターズ2695HPLC 装置および2475蛍光多波長検出器を使用する(励起波長(Ex):230nm、放射波長(Em):300nm、クロマトカラムのサイズ:長さ250mm、直径4.6mm、クロマトカラム充填材:第三級アミン基を結合するポリスチレン-ジビニルベンゼン粒子(粒子径:5μm))。移動相Aは、EDTA 1mMを含み、NaOH溶液でpH5.2に調整された、20mMの2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸である。移動相Bは、EDTA 2mM、NaCl 2Mを含み、NaOH溶液でpH5.8に調整された、20mMの2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸である。下記の表9に従い、移動相AおよびBの割合を設定する。コントロールまたは試作サンプルに移動相を加え、溶解して、1mLあたり約20mgの溶液を調製し、測定に提供する。注入量25μL、流速1mL/min、クロマトカラムの温度30℃という条件を採用する。あるサンプルのクロマトグラフィー分析グラフを図2-4に示す。これから分かったように、当該溶出条件では効果的にサンプルの組成を単離することができない。
表9:実施例10の移動相AおよびBの割合
ウォーターズ2695HPLC装置および2489UV多波長検出器(波長:275nm、クロマトカラムのサイズ:長さ250mm、直径4.6mm、クロマトカラム充填材:第三級アミン基を結合するポリスチレン-ジビニルベンゼン粒子(粒子径:5μm))を使用する。移動相Aは、EDTA 3mMを含み、NaOH溶液でpH5に調整された、30mMの2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸である。移動相Bは、EDTA 2mM、NaCl 2Mを含み、NaOH溶液でpH6に調整された、10mMの2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸である。下記の表10に従い、移動相AおよびBの割合を設定する。コントロールまたは試作サンプルに、移動相を加え、溶解し、1mLあたり約20mgの溶液を調製し、測定に提供する。注入量25μL、流速1mL/min、クロマトカラムの温度35℃という条件を採用する。それの各組成の割合を表11に示す。
実施例12
アジレント1260HPLC 装置およびUV多波長検出器(検出波長:275nm、クロマトカラムのサイズ:長さ250mm、直径4.6mm、クロマトカラム充填材:C18リガンドを結合するシリカマトリックスの粒子(粒子径:3μm))を使用する。移動相Aはアセトニトリルである。移動相Bは、リン酸溶液でpH2.5に調整された、50mMの硫酸アンモニウム溶液である。表12に従い、移動相AおよびBの割合を設定する。コントロールおよび試作サンプルにそれぞれ移動相を加え、溶解して、1mLあたり約20mgの移動相を調製し、測定に提供する。注入量25μL、流速1mL/min、クロマトカラムの温度30℃という条件を採用する。コントロールと試作サンプルの各組成との比較・分析結果を下記の表13に示す。あるサンプルのクロマトグラフィー分析グラフを図3-1に示す。
アジレント1260HPLC 装置およびUV多波長検出器を使用する(検出波長:275nm、クロマトカラムのサイズ:長さ250mm、直径4.6mm、クロマトカラム充填材:C8リガンドを結合するシリカマトリックスの粒子(粒子径:10μm))。移動相Aは、アセトニトリルである。移動相Bは、0.1%トリフルオロ酢酸溶液である。表12に従い、移動相AおよびBの割合を設定する。コントロールと試作サンプルに移動相を加え、溶解して、1mLあたり約10mgの移動相を調製し、測定に提供する。注入量50μL、流速1mL/min、クロマトカラムの温度50℃という条件を採用する。あるサンプルクロマトグラフィー分析グラフを図3-2に示す。
アジレント1260HPLC 装置とUV多波長検出器を使用する(検出波長:275nm、クロマトカラムのサイズ:長さ250mm、直径4.6mm、クロマトカラム充填材:C4リガンドを結合するシリカマトリックスの粒子(粒子径:3μm))。移動相Aはアセトニトリルである。移動相Bはリン酸溶液でpH2に調整された、30mMの硫酸アンモニウム溶液である。表12に従い、移動相AおよびBの割合を設定する。コントロールまたは試作サンプルに移動相を加え、溶解して、1mLあたり約20mgの移動相を調製し、測定に提供する。注入量15μL、流速0.5mL/min、クロマトカラムの温度25℃という条件を採用する。あるサンプルのクロマトグラフィー分析グラフを図3-3に示す。
アジレント1260 HPLC装置およびUV多波長検出器を使用する(検出波長:275nm、クロマトカラムのサイズ:長さ250mm、直径4.6mm、クロマトカラム充填材:C4リガンドを結合するシリカマトリックスの粒子(粒子径:3μm))。移動相Aはアセトニトリルである。移動相Bは、リン酸溶液でpH3に調整された、80mMの硫酸アンモニウム溶液である。表12に従い、移動相AおよびBの割合を設定する。コントロールまたは試作サンプルに、移動相を加え、溶解して、1mLあたり約20mgの溶液を調製し、測定に提供する。注入量25μL、流速0.5mL/min、クロマトカラムの温度50℃という条件を採用する。あるサンプルのクロマトグラフィー分析グラフを図3-4に示す。
ウォーターズ2695HPLC 装置および2475蛍光多波長検出器を使用する(励起波長(Ex):230nm、放射波長(Em):300nm、クロマトカラムのサイズ:長さ250mm、直径4.6mm、クロマトカラム充填材:C18リガンドを結合するシリカマトリックスの粒子(粒子径:3μm))。移動相Aはアセトニトリルである。移動相Bは0.1%のトリフルオロ酢酸溶液である。下記の表14に従い、移動相AおよびBの割合を設定する。コントロールまたは試作サンプルに、移動相を加え、溶解して、1mLあたり約20mgの溶液を調製し、測定に提供する。注入量50μL、流速1mL/min、クロマトカラムの温度30℃という条件を採用する。あるサンプルのクロマトグラフィー分析グラフを図3-5に示す。これから、従来の方法では試作サンプルにおける各成分を全く単離することができないと分かった。
ウォーターズ2695HPLC 装置および2475蛍光多波長検出器(励起波長(Ex):230nm、放射波長(Em):300nm、クロマトカラムのサイズ:長さ250mm、直径4.6mm、クロマトカラム充填材:C18リガンドを結合するシリカマトリックスの粒子(粒子径:3μm))を使用する。移動相Aは、アセトニトリルである。移動相Bは、0.1%トリフルオロ酢酸溶液である。下記の表15に従い、移動相AおよびBの割合を設定する。コントロールまたは試作サンプルに移動相を加え、溶解して、1mLあたり約20mgの溶液を調製し、測定に提供する。注入量50μL、流速1.5mL/min、クロマトカラムの温度30℃という条件を採用する。各組成の割合を表16に示す。
なお、上記の実施例は、当業者による本発明の実質の理解を支援するためのみに用いられるものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
Claims (5)
- 高速液体クロマトグラフィーにて、グラチラマー酢酸塩に対してリニア的または段階的な勾配溶出を行い、当該共重合体における各組成の含有量が合格するか否かを分析する方法であって、
測定用グラチラマー酢酸塩溶液を調製するステップ(1)、
アニオン交換液体クロマトグラフィー、カチオン交換液体クロマトグラフィーまたは逆相液体クロマトグラフィーにて、測定用サンプルに対して勾配溶出を行うステップ(2)、及び
共重合体の各組成に対応するピーク面積を検出・分析し、コントロールと比較することで、測定用サンプルにおける各組成の含有量の範囲が合格するか否かを確認するステップ(3)を含むことを特徴とする方法。 - ステップ(2)における前記アニオン交換液体クロマトグラフィーのクロマトグラフィー条件は、
クロマトカラムは、カルボキシル基を結合するポリスチレン-ジビニルベンゼン粒子(粒子径:1.7μm〜10μm)を充填材とし、
移動相Aは、トリス(ヒドロキシ)アミノメタン塩酸塩10mM〜50mMを含み、且つNaOH溶液でpH10〜12に調整された溶液であり、
移動相Bは、トリス(ヒドロキシ)アミノメタン塩酸塩10mM〜50mM、塩化ナトリウム0.5M〜1.5Mを含み、且つ塩酸溶液でpH8〜10に調整された溶液であり、
注入量は5μL〜50μL、サンプルの濃度は1mg/ml〜20mg/ml、流速は0.5mL/min〜1.5mL/min、溶出時間は50〜250minであり、
溶出の勾配は、全溶出時間をN(2≦N≦20、好ましくは5≦N≦15、より好ましくは8≦N≦12、最も好ましくはN=10である)等分として、順に勾配溶出を行い、第1分段〜第N-1分段の勾配において、移動相Aの割合を100%から徐々に50%まで低下させ、移動相Bの割合を0から徐々に50%まで向上させ、第N分段の移動相Aの割合が100%であり、移動相Bの割合が0であり、クロマトカラムの温度が25〜50℃である
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - ステップ(2)における前記カチオン交換液体クロマトグラフィーのクロマトグラフィー条件は、
クロマトカラムは、第三級アミン基を結合するポリスチレン-ジビニルベンゼン粒子(粒子径:1.7μm〜10μm)を充填材とし、
移動相Aは、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸10mM〜50mM、EDTA0.5mM〜5mMを含み、NaOH溶液でpH4〜6に調整された溶液であり、
移動相B は、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸10mM〜50mM、EDTA 0.5mM〜5mM、NaCl 1M〜2.5Mを含み、且つNaOH溶液でpH5〜7に調整された溶液であり、
注入量は5μL〜50μL、サンプルの濃度は1mg/ml〜20mg/ml、流速は0.5mL/min〜1.5mL/min、溶出時間は50〜250minであり、
溶出の勾配は、全溶出時間をN(2≦N≦20、好ましくは5≦N≦15、より好ましくは8≦N≦12、最も好ましくはN=10である)等分として、順に勾配溶出を行い、第1分段〜第N-1分段の勾配において、移動相Aの割合を100%から徐々に0%まで低下させ、移動相Bの割合を0から徐々に100%まで向上させ、第N分段の移動相Aの割合が90%であり、移動相Bの割合が10%であり、クロマトカラムの温度が25〜50℃である
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - ステップ(2)における逆相液体クロマトグラフィーのクロマトグラフィー条件は、
クロマトカラムは、C18、C12、C8、C4を結合するシリカ粒子(粒子径:1.7μm〜10μm)を充填材とし、
移動相Aはアセトニトリルであり、
移動相Bは、硫酸アンモニウム30mM〜80mMを含み、且つリン酸溶液でpH2〜3に調整された溶液、又は0.1%トリフルオロ酢酸溶液であり、
注入量は5μL〜50μL、サンプルの濃度は1mg/ml〜20mg/ml、流速は0.5mL/min〜1.5mL/min、溶出時間は50〜250minであり、
溶出の勾配は、全溶出時間をN(2≦N≦20、好ましくは5≦N≦15、より好ましくは8≦N≦12、最も好ましくはN=10である)等分として、順に勾配溶出を行い、第1分段〜第N-1分段の勾配において、移動相Aの割合を5%から徐々に40%まで向上させ、移動相Bの割合を95%から徐々に60%まで低下させ、第N分段において移動相Aの割合が5%であり、移動相Bの割合が95%であり、クロマトカラムの温度が25℃〜50℃である
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - ステップ(3)において検出・分析は、検出波長が260nm〜280nmであるUV検出器にて行い、蛍光検出器を採用する場合、その励起波長が230nmであり、放射波長が300nmであることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
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